CN108707186B

CN108707186B - 人精子特异性抗原表位肽及其多聚体和应用

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Publication number: CN108707186B
Application number: CN201810524873.0A
Authority: CN
Inventors: 刘永明; 苏何玲; 梁斌; 谭燕莲; 黄红丽; 朱金清
Original assignee: Guilin Medical University
Current assignee: Guilin Medical University
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2038-05-28
Also published as: CN108707186A

Abstract

本发明提供了一种新的人精子特异性抗原表位肽(SSEP)，即SSEP12及其多聚体和应用。SSEP12氨基酸序列为：TRRIHRHMTIRR(Thr Arg Arg Ile His Arg His Met Thr Ile Arg Arg)。SSEP12多聚体为以多肽接头(Gly4Ser)n连接的2‑10聚体。所述SSEP12的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。SSEP12是一种新的人精子特异性表位肽，其与人抗精子抗体(AsAb)阳性血清有明显的免疫反应，可为研发高特异性AsAb检测试剂盒和避孕疫苗提供新的抗原表位。

Description

人精子特异性抗原表位肽及其多聚体和应用

技术领域

本发明涉及多肽化学、免疫学和生殖学技术领域，具体涉及一种新的由12个氨基酸残基组成的人精子特异性抗原表位肽(sperm specific epitope peptide,SSEP)及其多聚体、用该抗原表位肽或其多聚体制备的人精子特异性抗原，以及抗精子抗体(antispermantibody,AsAb)检测试剂盒和避孕疫苗。

背景技术

不孕不育问题一直是人类生殖研究中的重要课题，目前全世界近有8000万～1.1亿的不孕不育症患者，我国约占其中的6-15％。据报道(Dondero F,Lenzi A,Gandini L,Lombardo F.Immunological infertility in humans.Exp Clin Immunogenet.1993,10:65-72.)，在不明原因所导致的不孕不育症患者中，估计9％—36％存在AsAb。免疫学研究表明AsAb是导致免疫性不孕的重要原因之一，它在免疫性不孕中的作用正日益受到医学界的关注。精子作为一种自身隐蔽性抗原，当发生外伤或炎症可能会引起血睾屏障、生殖道黏膜屏障及血附睾屏障的功能或结构破坏，使精子与免疫系统中细胞相接触，引起机体产生AsAb。与精子相关的免疫性不孕不育的产生，被认为主要是由于AsAb与精子抗原结合后，影响精子运动、精子获能、精卵识别、顶体反应、穿过透明带、精卵融合等诸多方面而导致免疫性不育。体内AsAb的检测已经成为不孕不育的诊断与治疗的一个重要的临床检测项目。

目前国内外市场上，作为辅助诊断的AsAb检测试剂盒，通常以全部精子蛋白作为靶抗原来检测AsAb。已分析发现精子蛋白质组能分离出1000多个蛋白点，由于血睾屏障的存在，这些蛋白质均有可能作为自身抗原作用于机体免疫系统而产生的抗体，但这些抗体并非都与免疫性不育相关；再者，与免疫性不育相关的抗精子抗体也并不仅是由于精子蛋白抗原作用免疫系统而产生，这样不可避免地产生了较高的假阳性率和假阴性率(Francavilla F,S antucci R,Barbonetti A,et al.Naturally-occurring antispermantibodies inmen:interference with fertility and clinical implications.Anupdate.Front Biosci,2006,4(12):2890-2911.)。而且直接以天然的人精子蛋白作为包被抗原，原材料的供应必然有一定的局限性，成本也较高。因此很有必要筛选鉴定出各种与免疫性不育密切相关的、在免疫性不孕不育中起关键作用的精子抗原及其特异性抗原表位，并对各个抗原表位进行连接设计，增强表位与抗体的免疫亲和力。SSEP作为包被抗原可提高AsAb检测的特异性。多种SSEP及其多聚体作为抗原联合包被，可有效地降低AsAb检测的假阳性率和假阴性率，从而为临床诊断免疫性不孕不育提供更为可靠的依据。此外，SSEP及其多聚体可以通过基因工程大量廉价生产，降低原料成本。

另外，长期以来大量对避孕疫苗的研究主要依托于通过各种筛选策略发现新的抗原成分，以及通过动物实验研究其免疫效应和免疫避孕效应，以期望筛选出能够干预生殖、产生抗生育作用的关键成分。通过研究者的不懈努力，目前已筛选出多种精子特异性抗原成分，如VLP12、PH-20、SP17、SPAG9、FA-1、LDH-C4、P10G，Eppin、Izumo(NazR K,Packianathan J L.Antibodies to human sperm YLP12peptide that is involved inegg binding inhibit human sperm capacitation/acrosome reaction.Archives ofAndrology,2000,45(3):227-232；.Xue F,Wang L,Liu Y,et al.Vaccination with anEpitope Peptide ofIZUMO1to Induce Contraception in Female Mice.Am J ReprodImmunol,2016,75(4):474-485.)等，在动物实验研究中有部分抗原成分显示出不同程度的免疫抗生育效应，但是受孕率下降均低于70％，免疫性避孕效果未达到临床应用的要求，增加避孕疫苗的的免疫原性和有效性是当前面临的主要挑战。免疫学基础理论认为：全长蛋白并不是制备疫苗的最优选择，因为其中不仅含有与目的效应密切相关的优势中和表位，还同时存在抑制性表位、非中和性表位、自身抗原交叉反应性表位等对保护性免疫产生不利影响的因素。因此，为了提高蛋白类抗原的保护性同时减少不良反应，就必须在表位水平上进行筛选，摒除抑制性和病理性表位，保留和改善优势表位以得到更理想的疫苗成分(Zhang C,Li Y,Tang W,et al.The Relationship between B-cell Epitope andMimotope Sequences.Protein Pept Lett.2016；23(2):132-141.)。筛选精子表面特异性抗原及其抗原表位，联合人精子多表位抗原肽是研制避孕疫苗和新的免疫性不孕不育诊断试剂的主要突破方向(Cormier N,McGlone JJ,Leszyk J,Hardy DM.Immunocontraceptive target repertoire defined by systematic identification ofspermmembrane alloantigens in a single species.PLoS One.2018,13(1):e0190891.)。各种技术方法先后被应用到精子抗原及抗原表位的分离与鉴定中，比如蛋白质二维凝胶电泳、蛋白质免疫印迹、单克隆抗体技术及基因敲除技术、cDNA文库技术、合成肽法(肽序列扫描法)、化学裂解法或生物酶解法等。但至今被鉴定出的特异性的精子抗原表位只有数个，部分精子蛋白质抗原分子及其抗体均经过相应的试管内或动物体内免疫试验，证明各自的抗体在试管内或动物体内均可以造成相应影响精卵结合或不同程度的不孕不育现象(Naz RK.Vaccine for human contraception targeting sperm Izumo proteinandYLP12dodecamer peptide.Protein Science,2014,23(7):857-868.)，且部分精子抗原蛋白的氨基酸序列或基因序列已经被测定。但相对于已被鉴定分离的数十种精子抗原种类，已被鉴定出的精子抗原表位只有数个。主要的原因可能在于精子蛋白抗原分子种类及抗原表位化学组成、结构的复杂性，以及鉴定抗原表位技术的局限性。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明人利用噬菌体展示肽库技术筛选获得了3条新的候选人精子特异性抗原表位肽(candidate human sperm specific epitope peptides,CHSSEP)序列，并以多肽接头(Gly4Ser)3连接构建其3聚体。分别称为CHSSE-A、CHSSE-B、CHSSE-C、CHSSE-D、CHSSE-E和CHSSE-F。以这6条CHSSE进行体内外免疫学研究，最终筛选出CHSSE-F及其3聚体CHSSE-C，为研发高特异性AsAb检测试剂盒和避孕疫苗提供了技术支持。

本发明的第一个目的在于提供一种由12个氨基酸残基组成的人SSEP，即CHSSE-F，命名为SSEP12，或者SSEP12之间以多肽接头(如(Gly4Ser)3)连接的2-10聚体。所述SSEP12的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

需要说明的是，本发明所选用的多肽接头是(Gly4Ser)n，有相对较强的柔性和弯曲能力，不但能联接目的多肽链的N短端和C端，同时能使所联接的多肽链结合更紧密；且在人体内不易被蛋白酶所识别，其中n表示Gly4Ser重复的数目，通过改变重复数字“n”，可以调整Gly4Ser接头的长度，本发明优选多肽接头中的n为3，即(Gly4Ser)3结构，其联接的多肽结构接近多肽的原始结构；

进一步优选地，如上所述的人SSEP，其中SSEP12之间以多肽接头连接的2-5聚体。再进一步优选地，SSEP12之间以多肽接头(Gly4Ser)3连接的3聚体。(Gly4Ser)3的结构为GGGGSGGGGSGGGGS，即Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。

进一步优选地，如上所述的人精子特异性抗原表位肽，其是采用多肽固相合成法(solid phase peptide syntheesis,SPPS)合成表位多肽，采用高效液相色谱法(highperformance liquid-chromatography,HPLC)对其进行纯化。

表位肽是较小分子量的半抗原，尽管可以与免疫反应产物发生相互作用，但并不直接刺激反应，实际应用中多与载体蛋白连接形成完全抗原，刺激机体产生较强的免疫应答。本发明人以常用的BSA作为载体，EDC作为连接剂进行表位肽的偶联，初免、连续强化的方式对小鼠进行多点皮下免疫以增强表位肽免疫原性。结果显示：C表位肽及F表位肽免疫后的小鼠均产生了一定的抗体滴度，其中F表位肽抗体滴度为1:9600，持续约4周，C表位肽的抗体滴度1:19200，持续约4周，两者抗体滴度比较有显著差异性(P＜0.05)。因此，本发明的第二个目的在于提供一种人精子特异性抗原，其是通过将上述的人精子特异性抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成。

本发明的第三个目的在于提供一种人精子特异性抗体，其是由上述的人精子特异性抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

试验发现，CHSSEP-F(SSEP12)及其以(Gly4Ser)3连接的3聚体CHSSEP-C与人AsAb阳性血清有明显的免疫反应，而3聚体的CHSSEP-C免疫反应更强。CHSSEP-F及其3聚体CHSSEP-C免疫小鼠能产生特异性IgG，其中3聚体的CHSSEP-C免疫小鼠血清特异性IgG效价更高。CHSSEP-F及其3聚体CHSSEP-C免疫小鼠血清能明显抑制人精子运动，提示产生了抗人精子的AsAb。可见，CHSSEP-F是一种新的人SSEP，可为研发高特异性AsAb检测试剂盒和避孕疫苗提供新的抗原表位。因此，本发明的第四个目的在于上述人SSEP在制备特异性AsAb检测试剂盒或避孕疫苗中的应用；以及，上述的人精子特异性抗原在制备特异性AsAb检测试剂盒或避孕疫苗中的应用。

本发明还设计了抗原表位肽联合包被ELISA试剂盒，可以较为完善地检测血清中抗精子抗体，为临床诊断免疫不孕症提供更为可靠的依据。因此，本发明的第五个目的在于提供一种检测人AsAb的试剂盒，该试剂盒包含如下任一组分：

(1)人精子特异性抗原表位肽(SSEP)，该SSEP为SSEP12，或者SSEP12之间以多肽接头连接的2-10聚体，所述SSEP12的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(2)人精子特异性抗原，其是通过将(1)所述的人SSEP与载体蛋白偶联制备而成。

再者，据免疫性不孕不育病理机制，将本发明得到的与免疫性不孕不育密切相关的抗精子抗体所对应的抗原及其抗原表位，免疫目标人群使之产生相应的免疫反应，从而可以阻断受精过程，达到避孕的目的。因此，本发明的第六个目的在于提供一种避孕疫苗，该疫苗包含如下任一组分：

本发明应用Blastn和Blastp在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的核苷酸数据库(nucleotide collection)蛋白质数据库(PDB)中比对查询测序，发现并不能找到与CHSSEP-F(SSEP12)或其多聚体完全相同的氨基酸序列。

与现有技术相比，本发明涉及的CHSSEP-F(SSEP12)及其以多肽接头连接的多聚体CHSSEP-C能更好地与血清中的天然抗原结合，具有更好的特异性，其与人AsAb阳性血清有明显的免疫反应，而3聚体的CHSSEP-C免疫反应最强。CHSSEP-F(SSEP12)及其3聚体CHSSEP-C免疫小鼠能产生特异性IgG，其中3聚体的CHSSEP-C免疫小鼠血清特异性IgG效价更高。CHSSEP-F及其3聚体CHSSEP-C免疫小鼠血清能明显抑制人精子运动，提示产生了抗人的AsAb。因此，CHSSEP-F(SSEP12)是一种新的人SSEP，可为研发高特异性AsAb检测试剂盒和避孕疫苗提供新的抗原表位。

附图说明

图1为纯化后A链经HPLC纯化后检测图；

图2为纯化后B链经HPLC纯化后检测图；

图3为纯化后C链经HPLC纯化后检测图；

图4为纯化后D链经HPLC纯化后检测图；

图5为纯化后E链经HPLC纯化后检测图；

图6为纯化后F链经HPLC纯化后检测图；

图7为商品化试剂盒的ELISA检测血清标本AsAb结果，其中横坐标P/N为阳性血清OD值与阴性血清OD值之比，当P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性；

图8为斑点免疫印迹检测6条表位肽的特异性结果，其中，A：斑点免疫印迹图。B：纵坐标为相对阴性血清的倍数；

图9为各时相小鼠抗体血清滴度图(**代表P<0.01为高显著差异，*代表P<0.05为一般显著差异)；

图10为C肽组精子运动检测报告图例；

图11为F肽组精子运动检测报告图例；

图12为PBS肽组精子运动检测报告图例。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行更为详细的描述，所举试验例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1多肽的合成及纯化

利用噬菌体展示肽库技术新筛选了3条新的人精子特异性抗原表位肽序列，以及由其构建的以(Gly4Ser)3连接的三聚体人精子特异性抗原表位肽序列(表1)，委托上海生工生物工程技术服务有限公司采用多肽固相合成法(solidphase peptide syntheesis,SPPS)合成多肽，采用高效液相色谱法(high performance liquid-chromatography,HPLC)对合成多肽进行纯化。

表1修饰设计合成肽链结构

注:表1中(Gly4ser)3结构为GGGGSGGGGSGGGGS

1.1.2血清标本

阳性血清样本：婚后至少1年，年龄在20-45周岁，未采取任何避孕措施，夫妇双方均排除泌尿生殖系统器质性病变，经过临床实验室初步检验为抗精子抗体阳性的不孕不育患者血清37例(标明1-37号血清)。

阴性血清样本：婚后至少1年，年龄在20-45周岁，未采取任何避孕措施，夫妇双方均排除泌尿生殖系统器质性病变，经过临床实验室初步检验为抗精子抗体阴性的不孕不育患者血清19例(标明38-56号血清)。

以上样本均来自武汉市第三医院检验科及桂林市妇女儿童医院生殖中心检验科。

1.1.3人精子样本：

健康已生育的志愿供精者8名，禁欲2-7天，手淫法收集精液于无菌容器内，做好相应标记，室温静置30min待其完全液化，以备后续试验。样本来自武汉市第三医院检验科。

1.1.4实验动物

BALB/c雌性、雄性小鼠共34只(购自北京市实验动物中心)，体重18-22g，8-10周龄，健康有生育力。所有动物保持在室温(20-248℃)，相对湿度在50％-60％之间，每小时换气20次并在12小时光照周期下进行饲养，供应标准化的小鼠饮食。

1.2主要实验试剂及溶液配制方法

1.2.1主要实验试剂

(1)抗精子抗体(ASAb)IgG检测试剂盒(酶联免疫法)(深圳市赛尔生物技术有限公司)

(2)HRP标记山羊抗人IgG-fc二抗(北京义翘神州生物技术有限公司)

(3)0.22μmPVDF膜(北京索来宝科技有限公司)

(4)HRP标本稀释稳定剂(北京索来宝科技有限公司)

(5)BeyoECLPlusA液、B液(上海碧云天生物技术有限公司)

(6)弗氏完全佐剂(北京索来宝科技有限公司)

(7)弗氏不完全佐剂(北京索来宝科技有限公司)

(8)牛血清白蛋白(BSA)(北京索来宝科技有限公司)

(9)BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索来宝科技有限公司)

(10)鸡卵清蛋白(OVA)(北京索来宝科技有限公司)

(11)丁二酸酐(北京索来宝科技有限公司)

(12)碳化二亚胺盐酸盐(北京索来宝科技有限公司)

(13)无水乙醇(分析纯，99.9％)(北京索来宝科技有限公司)

(14)TMB显色液，P0209(上海碧云天生物技术有限公司)

(15)Tris(Angus The Dow Chemical Company)

(16)氨基酸原料:20种N-a-9-芴甲氧羰基(Fmoc)－氨基酸(上海吉尔生化公司)

(17)载体树脂:Fmoc-aa-Wang树脂(上海吉尔生化公司)

(18)偶联试剂:1-氧-3－双二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU)(上海吉尔生化公司)

(19)活化剂：1－羟基苯并三氮唑(HoBt)(上海吉尔生化公司)

(20)脱保护试剂：六氢吡啶(Hexahydropyridine)(上海吉尔生化公司)

(21)切肽试剂：三氟醋酸(TFA)(美国Fluka公司)

(22)硫代苯甲醚(Thioanisole)(上海吉尔生化公司)

(23)乙二硫醇(EDT)(上海吉尔生化公司)

(24)二异丙基乙胺(DIPEA),(美国Sigma公司)

1.2.2主要溶液配制方法

(1)PBS每升含磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，高压蒸汽灭菌，室温贮存。

(2)PBST(TBS+0.5％Tween20)，每升含：Tris 6.057g(50mmol/l)，NaCl 8.770g，Tween205ml，用去离子水溶解，调PH至7.4，容量瓶内定容至1000ml，高压蒸汽灭菌，室温密封贮存。

(3)TBS每升含Tris 6.057g(50mmol/l),NaCl 8.770g，用去离子水溶解，HCl调PH至7.5，容量瓶内定容至1000ml，高压蒸汽灭菌，室温密封贮存。

(4)TBST(TBS+0.1％Tween20)每升含：Tris 6.057g(50mmol/l)，NaCl 8.770g，Tween201ml，去离子水溶解，HCl调PH至7.5，容量瓶内定容至1000ml，高压蒸汽灭菌，室温密封贮存。

(5)封闭缓冲液100ml含NaHCO₃0.840g，BSA500mg，NaN₃20mg，去离子水溶解NaHCO₃，HCl调PH至8.6，定容至100ml后加BSA、NaN₃，过滤除菌，4℃贮存。

(6)非特异缓冲液(0.2M Glycine-HCl(pH 2.2),1mg/ml BSA)甘酸1.5g，BSA100mg，用去离子水溶解甘氨酸，HCl调节PH至2.2，定容至100ml，加入100mgBSA，过滤除菌，4℃贮存。

(7)Tris-HCl Tris 1.211g，去离子水溶解，HCl调PH至9.1，定容至10ml，高压灭菌，室温避光贮存。

(8)NaHCO₃缓冲液100ml含NaHCO₃0.840g，盐酸调PH至8.6，室温贮存。

(9)二甲基甲酰胺(DMF)的前处理：将备用的DMF放于棕色瓶中，加入分子筛保存备用。

(10)脱保护试剂的配制。用体积比为六氢吡啶:DMF＝1:4，配成20％的六氢吡啶的DMF溶液，用时新鲜配制。

(11)切肽试剂的配制。TFA:硫代苯甲醚:苯酚:乙二硫醇:双蒸水＝82.5:5:5:2.5:5(体积比)。

1.3主要实验仪器

低温高速离心机(Eppendorf型号5424R)

低温高速离心机(sigma型号3K15)

低速离心机(上海飞鸽离心机厂Anke TDL80-2B)

恒温培养箱(金坛市晶玻实验仪器厂THE-82A)

低温旋转式震荡培养(广东医疗器械厂LRH-150-Ⅱ)

全波长自动酶标(Thermo美国Thermo Scientific,1510-0079c GO)

PH测试仪(The European Technical CaramelAssociation PH700)

微孔板加热振荡器(合肥艾本森科学仪器有限公司MicBio-II)

HPLC仪器及试剂:乙睛(Acetonitrile)，HPLC grade(美国Dima公司)

WATERS高效液相仪600E(美国Millipore公司)

486紫外检测器(美国Millipore公司)

DELTAPPAKC18-300A高效液相柱(美国WATERS公司)

SP-Sepharose-FF柱层析系统(瑞典Pharmacia公司)

u-3000紫外分光光度计(日本Hitachi公司)

旋转蒸发仪(上海本波仪器有限公司)

循环式多用真空泵(中国郑州长城公司)

QT-3多功能摇床(上海琪特公司)

经人工及计算机辅助精子分析系统(CASA)(广州威尔曼公司)

1.4实验方法

1.4.1表位肽的合成与纯化

委托上海生工生物工程技术服务有限公司采用多肽固相合成法(solidphasepeptide syntheesis,SPPS)合成表位多肽，采用高效液相色谱法(high performanceliquid-chromatography,HPLC)对其进行纯化。

1.4.1.1精子抗原肽的固相合成过程

特异性精子抗原肽的选取。根据前期研究的精子肽的氨基酸序列，我们合成了6条抗原肽，具体序列如下所示：

将氨基酸用N-a-Fmoc保护起来，放入Fmoc-aa-Wang树脂中包裹起来，用TBTU/HoBt偶联法，将20％六氢吡啶的DMF溶液按照精子肽的序列，从C端-N端依次偶联起来。然后用切肽试剂TFA将合成的多肽裂解，从而脱离树脂，也将所有保护基团脱去，得到所需肽段。具体步骤如下：

1、称取Fmoc-aa-Wang树脂(依照需要量称取)，装入树脂载体中封口。用5m1DMF浸泡30min后，树脂充分溶胀，干燥。

2、脱帽：20％六氢吡啶的DMF溶液与上面的Fmoc-aa-Wang树脂反应30min，并保留DMF溶液，在紫外线下观察N-a-Fmoc的脱落情况。

3、依次用5m1DMF溶液洗3次、5m1无水乙醇洗2次，5m1DMF溶液分别洗3次，然后甩干。

4、接肽：称取4倍体积的氨基酸、4倍体积的树脂负载量的TBTU和4倍树脂负载量(mol)的HoBt，将它们溶解在5m1DMF中，再加入8倍树脂负载量(mol)的DIPEA迅速加到树脂中，混和均匀，25℃摇床上反应4h。待偶联反应完成后用5m1DMF溶液洗涤3次。

5、继续按照下述的步骤：先用脱保护试剂脱去上一个N-a-Fmoc-aa的N-a-Fmoc,(在此过程中用紫外观测N-a-Fmoc的脱落情况，了解脱保护的效率以及前面的缩合效率)，然后按步骤4中称取，重复操作步骤2和3，依次按照保护－洗涤－偶联－再洗涤的循环，重复脱，直至最后一个氨基酸偶联结束。

5、最后一步脱保护结束后，以5m1DMF溶液洗涤3次、5m1乙酸溶液洗涤3次、5m1DCM溶液洗涤3次、5m1无水甲醇洗涤3次。烘干，真空干燥器中过夜。

6、然后加入10ml的切肽试剂，摇床上面反应4h收集溶液，再用少量TFA洗涤3次，将溶液和洗液合并。将溶液上机旋转蒸发仪减压浓缩，当体积缩至约2ml时将其冷却。然后加入4℃乙醚100m1使多肽沉淀，离心收集沉淀，并用少量冷乙醚洗涤3次以便尽可能除净残余切肽试剂。真空抽干，干燥器中过夜，得到精子肽粗品。

1.4.1.2粗品肽的纯化

1、SP-Sepharose-FF柱初步分离.用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡柱,得到的粗品肽用0.1％醋酸100m1溶解，然后用10％氨水调pH至6.0。

2、将处理过的样品上柱平衡，缓冲液冲洗后再用0.3mol/LNaCl溶液500ml洗脱。流速:2ml/min,3min/管。收集、脱盐、冻干。

3、将初步分离的样品用半制备型反相C18柱进行反相高效液相色谱(RT-HPLC)法精分并鉴定，洗脱条件：0.1％TFA30％乙腈-70％水(V/V)洗脱，流速：1ml/min,检测波长：220nm。收集主峰，浓缩冻干保存。

1.4.2商品化试剂盒的ELISA检测血清标本AsAb

(1)将每个血清样本从-20°取出一管20μl放入4℃冰箱融化。试剂盒从4℃冰箱取出，平衡至室温。

(2)洗涤液的配制：在2-8℃贮存的洗涤液(浓缩)可能在瓶底形成结晶，用500ml容器将整瓶浓缩洗涤液充分溶解于480ml蒸馏水或去离子水中。

(3)血清样品的稀释(按1:101稀释)：将与待测血清样品相对应的试管作好标记，全部试管中各加入200μl的标本稀释液，精确吸取2μl的待测血清样品加入相应的管中，充分混匀。

(4)待试剂盒平衡至室温后，将所需的微孔条取出固定于板架上，编好顺序，设空白孔。

(5)各加100ul阳性、阴性对照及已稀释待测样品于相应孔中，空白孔不加，置37℃孵育30分钟；

(6)取出反应板，甩尽板中液体，用200—300μl洗涤液洗5次，每次均需在无菌无尘吸水纸上拍干；

(7)每孔加酶结合物两滴或100μl，空白孔不加，置37℃30分钟；

(8)取出反应板，甩尽板中液体，同(6)步，洗5次，每次拍干；

(9)每孔加显色液A和显色液B各一滴或各50μl，充分混匀，置37℃10分钟；

(10)每孔加终止液1滴(50μl)轻拍混匀，用酶标仪(450nm波长)以空白孔调零，测定各孔OD.值；

(11)参考值：临界值(cut off值)＝阴性对照(NC.)OD.值均值x2.1(阴性对照OD.值小于0.1时以0.1计)；

(12)结果的解释阳性对照OD.值不低于0.8且阴性对照OD.值不高于0.1时试验结果有效，否则应重新试验；

(13)结果判定：

P/N值：为阳性血清OD值与阴性血清OD值之比，当P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性如目测：在白色背景下观察各孔显色情况，有明显蓝色者为阳性(明显蓝于阴性孔)，无色者为阴性(和阴性相近)。

1.4.3斑点免疫印迹检测表位肽的特异性

选取上述检测血清标本ASAb阳性血清及阴性血清各两份，阳性标本选取P/N比值明显升高的7号及37号血清；阴性标本选取P/N比值低的38号及50号血清，应用Westernblot法检测表位肽的特异性。步骤如下：

(1)配制多肽溶液

对六个合成多肽进行精确称量，用无菌蒸馏水配置成5微克/微升的高浓度溶液备用，终浓度为2.5微克/微升。

(2)转膜和封闭

取PVDF膜用打孔器打出规则的圆片，甲醇活化2min，再用PBS漂洗平衡，备用。取96孔板，将多肽溶液置于孔中用无菌蒸馏水稀释为2.5μɡ/μL，用滤纸吸去PVDF膜上水渍，在多肽溶液中浸泡5min，取出后用PBS+5％BSA封闭1h，室温下摇床孵育

(3)漂洗

0.1％PBST漂洗PVDF膜3次，每次5分钟

(4)孵育一抗

PVDF膜在0.1％PBST稀释的AsAb阳性血清及阴性血清中，室温摇床孵育2h，，稀释比例为1：200，漂洗同上。

(5)孵育二抗

将PVDF膜置于HRP标本稀释液稀释的HRP标记山羊抗人IgG-Fc二抗溶液中，室温摇床孵育1h，稀释比例为1：5000，漂洗同上

(6)发光显影

将ECLplusA液与ECLplus B液等量混合，置于PVDF膜上，同等时间曝光，底片显影并晾干，观察反应区内的颜色强度，与非抗原和BSA包被区域相比。

(7)结果判定：

以PVDF膜片中央出现兰/紫色斑点为阳性，山羊抗人IgG斑点出现清晰的阳性反应说明实验操作正确。若山羊抗人IgG斑点出现微弱反应，则实验结果不可靠，实验必须重做。

1.4.4表位肽的动物实验

1.4.4.1表位肽的偶联

表位肽是较小分子量的半抗原，尽管可以与免疫反应产物发生相互作用，但并不直接刺激反应，是一种不充分的抗原。实际应用中多与载体蛋白连接形成完全抗原，刺激机体产生较强的免疫应答。本课题选择常用的BSA作为载体，EDC作为连接剂。具体偶联步骤如下：

(1)通过加入200μl超纯水配制10mg/ml表位肽溶液

(2)通过加入200μl超纯水配制10mg/ml载体蛋白溶液。

(3)将BSA载体蛋白溶液和表位肽溶液混匀后加入250μl偶联缓冲液(3×PBS)，配置成预反应液。

(4)将预反应液加入到10mg EDC粉末中，充分混匀。

(5)室温下反应2小时。

(6)配制PBS透析缓冲溶液，pH7.4,将制备的抗原溶液放入处理好的透析袋中，夹紧，放入透析液中，搅拌反应过夜，维持温度、pH值不变，用透析法分离纯化产品，隔5h左右换一次透析液，共换液6次，最后稀释至所需浓度后分装，于-20℃保存待用。1.4.5表位肽免疫方法

(1)动物分组：有生育能力的BALB/c雌性、雄性小鼠共34只，体重18-22g，6-8周龄，健康有生育力，随机分为3组,对照组雌雄各5只，两个实验组(标注为：实验组A、实验组B)雌雄各6只。所有实验动物的操作程序和处理都遵从中国实验动物福利和伦理。

(2)免疫方案：

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，抗原蛋白稀释到0.2mg/ml,与佐剂1:1混合用于免疫。

初次免疫：实验组A处理为50ug C肽-BSA：弗氏完全佐剂＝1：1分多点皮下注射，实验组B处理为50ug F肽-BSA：弗氏完全佐剂＝1：1分多点皮下注射；对照组用PBS加弗氏完全佐剂1:1分多点皮下注射；

再次免疫：随后4次实验组A处理为50ug C肽-BSA：弗氏不完全佐剂＝1：1分多点皮下注射，实验组B处理为50ug F肽-BSA：弗氏完全佐剂＝1：1分多点皮下注射；对照组用PBS加弗氏不完全佐剂1:1分多点皮下注射；注射时间分别为14，28，42，56，70，84天。

1.4.5.1表位肽免疫小鼠的血清滴度的检测

从初次免疫(包括免疫前血清)开始，尾静脉采血收集0，14，28，42，56，70，84天的血清。4℃放置分离血清，-20℃冻存备用；具体实验步骤如下：

1、包被：将免疫原于碳酸盐缓冲液(CB9.6，Aspen)中稀释成2ug/ml 4℃下过夜包被在96微孔板内，每孔100ul。

2、封闭：包被形成固相抗原，甩去并彻底扣干板内液体后，用封闭液2％BSA(或者2％OVA，1×PBS做溶剂)，200ul/孔，在37℃恒温培养箱内封闭2h，然后取出酶标板，甩去其中的液体，用多道移液器每孔加入200ul洗液(一般选用1×TBS，25×的洗液用去离子水稀释25倍)，静置1-2分钟再甩板，重复此洗板步骤3次，洗板完成后，用自配浸板液37℃浸板2h。

3、温育：先加入待测抗血清(一般从500倍开始倍比稀释)，100ul/孔，37℃温育1h后，甩掉酶标板孔内液体，洗板三次后拍干；然后加入酶标二抗，100ul/孔，温育40min后洗板5次(洗涤方式同封闭后)。

4、显色：洗板后立即加入单组份显色剂TMB，每孔加入100ul，盖上覆膜，放入37℃恒温箱温育(一般显色15min)。温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的抗体含量成正比。

5、终止：显色完成后，每孔依次加入50ul终止液，终止后尽快读数(波长450nm)。

6、效价判断：一般情况下OD值在2.0时候的稀释倍数即为该抗体的效价。

1.4.5.2表位肽免疫小鼠血清对人精子的抑制作用

(1)采用的血清为处死初次(抗体滴度高时)小鼠穿刺心脏所收集制备的血清；

(2)正常人精子的收集：健康已生育的志愿供精者，禁欲2-7天，手淫法收集精液于无菌容器内，置于37℃水浴中待其完全液化。经人工及计算机辅助精子分析系统(computerassisted spemanalysis，CASA)分析判定为合格精液后才进行下一步处理备用，判断标准参考第五版WHO《人类精液检查与处理实验手册》。

(3)精液处理：将精子悬液置入CO₂培养箱中，按比例分别加入0.3％HAS的EBSS液、免疫F表位肽的小鼠血清、免疫C表位肽的小鼠血清，于37℃共同孵育60min；

(4)进行CASA检测，检测指标包括精子活率、曲线速度(VCL)、直线速度(VSL)、平均路径速度(VAP)、快速前向运动精子百分比(PR％)、快速前向+慢速前向精子百分率(PR+NP)、直线性(LIN＝VSL/VCL)、前向性(STR＝VSL/VAP)；前向运动力(PR)+非前向运动力(NP)≥40％为活力正常。

2结果

2.1表位肽的合成与纯化结果

所设计多肽委托上海生工生物工程技术服务有限公司采用多肽固相合成法(solidphase peptide synthesis，SPPS)合成多肽，采用高效液相色谱法(highperformance liquid-chromatography，HPLC)对合成多肽进行纯化。质谱法测定纯化后的表位肽分子量结果与理论预测值完全一致，从而确定合成的表位肽与设计相符(图1-图6)。

2.2商品化试剂盒的ELISA检测血清标本AsAb

本实验共取56例血清样本，其中有一例发生溶血。将标本进行ELISA检测，检验55例血清，检验结果阳性血清35例，阴性血清20例。测得结果如图7所示。

2.3斑点免疫印迹检测表位肽的特异性

选取55例血清中抗精子抗体阳性及阴性血清标本各两份，阳性标本选取P/N比值明显升高的血清7及血清37；阴性标本选取P/N比值低的血清38及血清50；应用斑点免疫印迹法检测六条多肽的特异性，其中C肽、F肽对抗精子抗体的特异性明显。测得结果如图8所示。

2.4表位肽包被板的ELISA检测血清标本AsAb

分别以C肽、F肽直接包被酶标板进行测定血清标本(当P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性)，测定结果与2.2所得结果比较，各测定结果见表2、表3所示：

表2：C表位肽包被板的ELISA检测

与商品化试剂盒比较，C肽包被检测的敏感度为68.6％，特异性均为100％。两者的符合率为80％；

表3：F表位肽包被板的ELISA检测

与商品化试剂盒比较，F肽包被检测的敏感度为60％，特异性均为100％。两者的符合率为74.5％。

2.5免疫小鼠各时相血清抗体滴度的变化

表位肽免疫后的小鼠各时相的血清出现IgG抗体，抗体在初免后第10周出现高峰，C肽峰值为11346.67±965.24，F肽峰值为88324.54±665.13，滴度分析结果如图9所示。2.6免疫小鼠血清对人精子活力的抑制作用

收集正常人的精子，经处理后与各实验组的小鼠血清分别孵育60min，比较下列指标：PR(％)表示向前运动精子比率、NP(％)表示非向前运动精子比率、PR+NP(％)精子运动比率、VCL(μm/s)曲线速度、VSL(μm/s)直线速度、VAP(μm/s)平均路径速度。通过表4的统计结果可以看出，与表位肽免疫的小鼠血清孵育后，C肽、F肽对人精子活力运动相关参数较对照组均明显减少(P＜0.05)，且C表位肽的运动相关参数比率减少较F肽尤为明显(P＜0.05)。另外，精子运动检测报告检测图例如图10-12所示。

表4精子各组的运动指标

^*表示与PBS组相比有统计学差异(P＜0.05)；^#表示与C肽组和F肽相比有统计学差异(P＜0.05)。

序列表

<110> 桂林医学院

<120> 人精子特异性抗原表位肽及其多聚体和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Arg Arg Ile His Arg His Met Thr Ile Arg Arg

1 5 10

Claims

1.一种新的人精子特异性抗原表位肽(SSEP)，其特征在于，该SSEP为SSEP12，或者SSEP12之间以多肽接头连接的2-10聚体，所述SSEP12的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的人SSEP，其特征在于，所述多肽接头为(Gly4Ser)n，n＝2-9。

3.根据权利要求1所述的人精子特异性抗原表位肽，其特征在于，该抗原表位肽是SSEP12之间以多肽接头连接的2-5聚体。

4.根据权利要求1-3任一项所述的人SSEP，其特征在于，该抗原表位肽是以多肽固相合成法制备而得。

5.一种人精子特异性抗原，其是通过将权利要求1-3任一项所述的人SSEP与载体蛋白偶联制备而成。

6.一种人精子特异性抗体，其是由权利要求5所述的人精子特异性抗原制备而成的单克隆抗体或多克隆抗体。

7.权利要求1所述的人SSEP在制备特异性AsAb检测试剂盒或避孕疫苗中的应用。

8.权利要求5所述的人精子特异性抗原在制备特异性AsAb检测试剂盒或避孕疫苗中的应用。

9.一种检测人抗精子抗体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下任一组分：

(1)权利要求1所述的人SSEP；

(2)权利要求5所述的人精子特异性抗原。

10.一种避孕疫苗，其特征在于，该疫苗包含如下任一组分：

(1)权利要求1所述的人SSEP；

(2)权利要求5所述的人精子特异性抗原。