HUT77262A - Új immunokontraceptív peptidek - Google Patents

Új immunokontraceptív peptidek Download PDF

Info

Publication number
HUT77262A
HUT77262A HU9701726A HU9701726A HUT77262A HU T77262 A HUT77262 A HU T77262A HU 9701726 A HU9701726 A HU 9701726A HU 9701726 A HU9701726 A HU 9701726A HU T77262 A HUT77262 A HU T77262A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
peptide
seq
antibodies
amino acid
peptides
Prior art date
Application number
HU9701726A
Other languages
English (en)
Inventor
Evert Johannes Bunschoten
Arij Jan Grootenhuis
Marcel Van Duin
Original Assignee
Akzo Nobel N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nobel N.V. filed Critical Akzo Nobel N.V.
Publication of HUT77262A publication Critical patent/HUT77262A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

A találmány tárgyát a Zóna Pellucida (átlátszó peteburok) ZP3 proteinnel szemben immunválasz előidézésére képes peptidek, a fenti peptidek alkalmazása ellenanyagok termelődésének kiváltására, az említett peptidekkel szemben immunreaktív monoklonális ellenanyagok, a fenti monoklonális ellenanyagokat termelő hibridóma sejtvonalak, a fenti peptidek vagy ellenanyagok alkalmazása kontraceptív vakcina előállítására, az említett peptideket vagy ellenanyagokat tartalmazó kontraceptív vakcinák, az említett peptidek alkalmazása mintában ZP3 proteinnel szembeni autoimmun ellenanyagok kimutatására, az említett ellenanyagokat tartalmazó diagnosztikus reagensek, valamint mintában ZP3 proteinnel szembeni autoimmun ellenanyagok kimutatására alkalmas reagenskészletek képezik.
A Zóna Pellucidának (ZP) nevezzük azt az összetett extracelluláris glikoprotein-mátrixot, amely az emlős oocitát körülveszi. Ez a mátrix az oocita érés és tüsző fejlődés korai szakaszában alakul ki, és három, nagymértékben glikozilezett proteint tartalmaz, amelyeket ZP1, ZP2 és ZP3 proteineknek nevezünk. A ZP lényeges szerepet játszik a megtermékenyítés folyamatában, hiszen az emlős ivarsejtek közti első kölcsönhatás a spermatozoonnak a ZP specifikus receptorához történő kötődésén keresztül jön létre. Egérben megállapították, hogy a ZP3 glikoprotein azonos a spermareceptorral, amelynek megfelelő komplementer proteinek találhatók a sperma membránjának felszínén [összefoglalót lásd, Wasserman: Development 108, 1. (1990)]. A ZP3 proteinnek ez a ligandum szerepe váltja ki az akroszóma reakciónak nevezett folyamatot, amely proteolitikus enzimek felszabadulásához vezet, ami lehetővé teszi a spermatozoon számára, hogy a zóna pellucidán átjusson, és az oocitát, annak plazmamembránjával történő fúzió révén megtermékenyítse.
A ZP3 glikoproteinnek a sperma-pete kölcsönhatásban játszott lényeges szerepe, valamint annak oocita-specifikus expressziója vezetett annak a lehetőségnek a felismeréséhez, hogy a ZP proteinek vonzó célantigéneket képezhetnek kontraceptív vakcinák kifejlesztése számára [lásd például, Gwatkin és mtsai.: Fért. Ster. 28, 871. (1977); Paterson és Aitken:
Curr. Opinion in Immunoi. 2, 743. (1990)]. Számos tanulmányban kimutatták, hogy emlősök sertés zóna pellucida proteinekkel történő vakcinázása az alkalmazott antigénekkel szemben magas ellenanyag-titereket eredményez, ezzel egyidejűleg, infertilitást hoz létre. In vitro vizsgálatok eredményei is alátámasztották a ZP3 proteinnel történő immunizáció kontraceptív hatását. Kimutatták, hogy anti-ZP3-specifikus ellenanyagok gátolják a hím ivarsejtek kötődését sóoldatban tárolt humán oocitákhoz [van Duin és mtsai.: Hűm. Repród. 9 (4. szuppl.), 41. (1994)], valamint megszakítják a humán in vitro fertilizáció folyamatát [Henderson és mtsai.: Gam. Rés. (1988)] .
ZP3-alapú vakcinákat nem lehet természetes ZP3 proteinek célantigénként történő alkalmazásával előállítani, mivel ez a biológiai anyag igen korlátozott mennyiségben áll rendelkezésre. Ezt a problémát a ZP proteineket kódoló gének klónozása nemrégiben megoldotta, lehetőséget teremtve rekombináns ZP3 proteinek vagy azok fragmentumainak előállítására.
Az egér ZP3-DNS klónozása és jellemzése jelentős lépés volt a fenti cél elérése szempontjából [Ringuette és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 4341. (1986); Ringuette és mtsai.:
Dev. Bioi. 127, 287. (1988)]. Leírták különböző emlősökből származó ZP3-gének klónozását, és az azoknak megfelelő ZP3 proteinek elsődleges aminosav-szekvenciáját közölték a humán
ZP3 protein [WO 90/15624 és WO 93/14786 sz. nemzetközi közzétételi iratok) a hörcsög ZP3 protein [Kinloch és mtsai.: Dev. Bioi. 142, 414. (1990)], a fehér selyemmajom ZP3 protein (WO 94/10304 sz. nemzetközi közzétételi irat), a sertés ZP3 protein (WO 93/14786 sz. nemzetközi közzétételi irat), a macska ZP3 protein (JP-A-06014784 sz. japán közzétételi irat; és WO 94/11019 sz. nemzetközi közzétételi irat), a kutya ZP3 protein (JP-A-05336974 sz. japán közzétételi irat; és WO 94/11019 sz. nemzetközi közzétételi irat), a nyúl ZP3 protein (WO 94/11019 sz. nemzetközi közzétételi irat), a szarvasmarha ZP3 protein (WO 94/11019 sz. nemzetközi közzétételi irat), valamint a cynomolgus majom ZP3 protein (WO 94/11029 sz. nemzetközi közzétételi irat) esetében. Valamennyi eddig felderített ZP3 aminosav-szekvencia erős evolúciós konzervativizmust mutatott; a kimutatható aminosav-szekvencia homológia 65 %-tól több, mint 90 %-ig terjedt. A fenti proteinek N-terminális régiói a különböző emlős fajok között kevésbé állandóak, ami a ZP3 protein eme régiójának a faj specifikus fertilizációban betöltött lehetséges szerepére utal.
Számos emlőst immunizáltak intakt ZP3 proteinnel, ami a legtöbb esetben magas anti-ZP3-titereket, és azzal együtt járó infertilitást eredményezett. A fenti vizsgálatokról beszámoló közlemények azonban azt is megemlítik, hogy következetesen petefészek működési rendellenességek figyelhetők meg, amelyek megzavart menstruációs ciklusban, a petefészek patológiás elváltozásaiban, és a különböző fejlődési stádiumoknak megfelelő tüszők - ezen belül a primordiális tüszők (őstüszők) - számának csökkenésében nyilvánulnak meg [lásd például, Skinner és mtsai.: Endocrinology 115, 2418. (1984); Upadhyay és mtsai.: Biol. Repród. 41, 665. (1989); Seghal és mtsai.: Pathology 21, 105. (1989); Dunbar és mtsai.: Fért. Ster. 52, 311. (1989); Jones és mtsai.: J. Repród. Fért. 95, 513. (1992); Mahi-Brown és mtsai.: J. Repród. Immunol. 21, 29. (1992); Paterson és mtsai.: Biol. Repród. 46, 523-534 (1992)]. Ezek a működési rendellenességek végleges sterilitáshoz vezetnek. Ez különösen ember esetében messzemenően nem kívánatos mellékhatás, mivel a ZP3 protein alapú vakcinák immunkontraceptív hatását csak a fertilitás szabályozására alkalmazzuk, és az így kiváltott infertilitásnak előnyösen vagy spontán módon vagy beavatkozás révén - reverzibilisnek kell lennie. Az intakt ZP3 protein tehát nem alkalmas biztonságos kontraceptív vakcina kifejlesztésére.
A ZP3 protein T-sejt által közvetített vagy B-sejt által közvetített imunválasz kiváltására képes antigéndeterminánsokkal rendelkezik. A válasz típusától függően, ezeket az antigén-determinánsokat T-sejtes vagy B-sejtes epitópoknak nevezzük. Egérmodellt alkalmazva kimutattuk, hogy ZP proteinekkel történő vakcinázást követően fellépő petefészekelváltozások jelentkezése T-sejtek által közve• *· · · ····· · · · • · · · · tített jelenség. A petefészek kóros elváltozása, amely petefészek-gyulladásban nyilvánul meg, egérben kiváltható kis méretű, 8 aminosavból álló, (az egér ZP3 protein 330-337. aminosav pozícióinak megfelelő) T-sejtes epitóppal végzett immunizálással. Az előbbi állatok T-sejtjeinek bejuttatása nem-immunizált állatokba ugyancsak petefészekkárosodáshoz vezetett, ami alaposan alátámasztja azt a feltételezést, hogy a T-sejtes epitópok felelősek a ZP3 proteinnel történő immunizációt követően fellépő petefészekkárosodásért [Rhim és mtsai.: J. Clin. Invest. 89, 28. (1992); Luo és mtsai.: J.
Clin. Invest. 92, 2117. (1993)].
Egy ZP3 proteinen alapuló kontraceptív vakcina megfelelő előállításához tehát igen nagy szükség van a ZP3 protein azon fragmentumaira, amelyek nem tartalmazzák a ZP3 protein patogén T-sejtes epitópjait. A találmány tárgyát képezik tehát a ZP3 protein egyetlen antigén-determinánsának megfelelő peptidek, azzal a kikötéssel, hogy az említett antigén-determináns nem vált ki patogén, T-sejt által közvetített immunválaszt.
A találmány tárgyát képezik az említett peptidek. A találmány szerinti peptidek 8-50 aminosavból álló szekvenciát tartalmaznak, és legalább tartalmazzák a PLWLLQ aminosav-szekvenciát (1. azonosítószámú szekvencia) vagy annak megfelelőit .
Közelebbről, a találmány szerinti peptidek tartalmazzák a QPLWLLQG aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia) vagy annak megfelelőit.
A találmány szerinti pepiidben a PLWLLQ aminosav-szekvencia (1. azonosítószámú szekvencia), közelebbről a
QPLWLLQG aminosav-szekvencia (2. azonosítószámú szekvencia) határoló helyei megfelelhetnek a humán ZP3 proteinben a 24-29., közelebbről a 23-30. aminosav pozíciók által alkotott régió natív határoló helyeinek, vagy megfelelhetnek valamely random aminosav-szekvencia alkotta, nem-natív határoló helyeknek.
A találmány szerinti peptidek 8-50, előnyösen 8-35, még előnyösebben 8-25 aminosavból felépülő szekvenciát tartalmaznak. Még előnyösebben, a peptidek 8-15 aminosavból felépülő aminosav-szekvenciát tartalmaznak. Különösen előnyösen, a petidek 8-12 aminosavból álló aminosav-szekvenciát tartalmaznak.
Ezenfelül a találmány tárgyához tartoznak a találmány szerinti peptidek multimerjei, például dimerjei vagy trimerjei. Ilyen multimerek több példányt tartalmaznak a specifikus PLWLLQ és/vagy QPLWLLQG aminosav-szekvenciából, amellyel szemben immunválasz váltható ki.
A leírásban a találmány szerinti peptid megfelelőinek (1) a PLWLLQ vagy QPLWLLQG aminosav-szekvenciákon belül (1. és 2. azonosítószámú szekvenciák) szubsztitúciókat vagy helyettesítéseket, inszerciókat vagy deléciókat tartalmazó peptideket; vagy (2) az említett szekvenciákból álló polimer formákat nevezünk, azzal a kikötésssel, hogy ezek a megfelelők immunreaktívak az European Collection of Animál Cell Cultures (állati eredetű sejttenyészetek európai gyűjteménye; a továbbiakban ECACC) gyűjteményében 1994. március 24-én 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt ellenanyagokkal. A szubsztitúciók vagy helyettesítések nem szükségszerűen olyan konzervatív szubsztitúciók, amelyeket az alábbi szakirodalmi hely ismertet [M.O. Dayhoff: Atlas of protein structure, 5. kötet, 3. szuppl. Natl. Biomedical Research Foundation (1978)], hanem lehetnek nem-konzervatív aminosav-szubsztitúciók is, amelyek a PLWLLQ vagy QPLWLLQG aminosav-szekvenciák (1. azonosítószámú szekvencia vagy 2. azonosítószámú szekvencia) mimitopjait eredményezik.
A leírásban mimitopnak olyan aminosav-szekvenciát nevezünk, amely az 1. vagy 2. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvenciától eltér, de amely képes más olyan ellenanyagok termelődését kiváltani, amelyek az ECACC gyűjteményében 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyagok által felismert epitópokkal megegyező epitópot ismernek fel. Ilyen mimitopok azonosítására szolgáló eljárásokat ismertet-
nek Geysen és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,
3998. (1984); J. Immunoi. Methods 134, 23 (1987)]. Ez a
technológia a technika állása szerint jól ismert, és a
reagenseket, valamint a felhasználandó anyagokat tartalmazó reagenskészletek a kereskedelemben hozzáférhetők.
Például a 8-50 aminosavból álló, és legalább a PLWFWQ (3. azonosítószámú szekvencia) vagy PMWTLQ (4. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciát tartalmazó peptidek olyan megfelelők, amelyek immunreaktívak az ECACC gyűjteményében 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyagokkal.
A találmány szerinti alkalmazható peptidek a QPLWLLQG (2. azonosítószámú szekvencia), a PQPLWLLQ (5. azonosítószámú szekvencia), PLWLLQGG (6. azonosítószámú szekvencia), az LCYPQPLWLLQGGASHPETS (7. azonosítószámú szekvencia) vagy az ADGAPMWTLQGAAGA (8. azonosítószámú szekvencia) szerinti aminosav-szekvenciákkal rendelkező peptidek vagy azok elegyei.
Kontraceptív vakcinák kifejlesztésére alkalmazható előnyös peptid a QPLWLLQG aminosav-szekvenciával (2. azonosítószámú szekvencia) rendelkező peptid.
A találmány szerinti peptidekkel történő vakcinázással kiváltott magas ellenanyag titerek észlelését követően, a petefészek működésének zavarát vagy más petefészek károsodásra utaló jelet nem észleltünk. A találmány szerinti peptidek nem váltanak ki patogén, T-sejt által közvetített immunválaszt, ezért különösen megfelelnek ZP3 proteinnel szembeni immunizálásra alkalmazott kontraceptív vakcinák kifejlesztésére.
Millar és munkatársai olyan peptidet írtak le, amely nem vált ki ZP3 proteinnel szemben patogén, T-sejt által közvetített immunválaszt [Science 246, 935. (1989)]. Millar egy kis méretű antigén-determinánst azonosított, amely az egér ZP3 protein aminosav-szekvenciájában a 336-342. aminosav pozícióknak felel meg, és amely nőstény egerek aktív immunizálását követően kontraceptív hatást hozott létre anélkül, hogy a petefészek patológiás károsodását előidézte volna. Ez a peptid azonban teljesen különbözik a találmány szerinti peptidtől. A találmány szerinti peptidek az 1. vagy 2. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciát vagy azok megfelelőjét tartalmazzák, amely megfelel a humán ZP3 protein aminosav-szekvenciájában a 24-29., közelebbről a 24-30. aminosav pozícióknak. Millar sehol sem utal a találmány szerinti peptidekre, vagy arra a tényre, hogy ilyen protein nem vált ki patogén, T-sejt által közvetített immunválaszt.
A találmány szerinti peptidek igen alkalmasak ZP3 proteinnel szembeni aktív immunizálásra alkalmazott kontraceptív vakcinák kifejlesztésére. A ZP3 proteinnel szembeni aktív immunizálásra felhasznált kontraceptív vakcinák tartalmazzák egy vagy több a találmány szerinti peptid hatékony mennyiségét, valamint egy gyógyászatilag elfogadott hordozóanyagot. A találmány szerinti vakcinák nőstény emlősnek - elsősorban humán nőnek történő adagolása - az oociták ZP3 proteinjének megfelelő antigén-determinánsával szemben immunválaszt vált ki, de nem vált ki immunválaszt a ZP3 proteinen jelenlevő többi antigén-determinánssal szemben. Tehát a találmány szerinti peptideket tartalmazó vakcinák alkalmazásával sokkal szabályozottabb immunválaszt kapunk, mint az intakt ZP3 proteinen alapuló vakcinákkal. Az így nyert ellenanyagok gátolják a hímivarsejtek kötődését az oocitához, ezáltal infertilitást eredményeznek.
A találmány szerinti peptidek alkalmazhatók továbbá ZP3 proteinnel szembeni passzív immunizálásra felhasznált kontraceptív vakcinák kifejlesztésére. ZP3 proteinnel szembeni passzív immunizálásra felhasznált kontraceptív vakcinák egy
vagy több olyan ellenanyag hatékony mennyiségét tartalmazzák, amelyet a találmány szerinti peptiddel szemben állítottunk elő, tartalmazhatnak továbbá egy gyógyászatilag elfogadott hordozóanyagot.
A ZP3 proteinnel szembeni passzív immunizálásra felhasznált kontraceptív vakcinákban különösen előnyösen alkalmazhatók azok, a találmány szerinti peptidekkel szemben előállított ellenanyagok, amelyek az 1. és/vagy 2. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciákkal immunreaktívak. A találmány szerinti peptidekkel szemben előállított ellenanyagok előnyösen monoklonális ellenanyagok.
Előnyös ellenanyagok az ECACC gyűjteményében 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyagok. A ZP3 proteinnel szembeni passzív immunizálásra felhasznált kontraceptív vakcinák kifejlesztésére még előnyösebben humán vagy humanizált monoklonális ellenanyagokat alkalmazunk.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti peptidekkel szemben előállított ellenanyagok, valamint az említett ellenanyagokat termelő sejtvonalak is.
A találmány szerinti vakcinák nőstény emlősnek, - elsősorban humán nőnek történő adagolása - a nőben homogén ellenanyag populáció létrejöttét eredményezi, amelyek immunreaktívak az 1. és/vagy 2. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciával, valamint a ZP3 protein aminosav-szekvenciájában az előbbi szekvenciáknak megfelelő, a 23-30., közelebbről a 24-29. aminosavak szerinti antigén-determinánssal, de amely ellenanyagok nem reagálnak a ZP3 proteinben található más antigén-determinánsokkal. Az ellenanyagoknak a ZP3 proteinen található megfelelő antigén-determinánsokhoz történő kötődése gátolja a hímivarsejtek kötődését az említett oocitákhoz, ezáltal infertilitást eredményez.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti peptidek alkalmazhatók reagenskészletekben, a ZP3 protein aminosav-szekvenciájában a 24-29., közelebbről a 23-30. aininosavak által képzett régiókkal szemben irányuló autoimmun ellenanyagok jelenlétének kimutatására. A fenti autoimmun ellenanyagok kimutatására, az egyéntől szérummintát veszünk, és azt egy vagy több a találmány szerinti peptiddel, valamint adott esetben, a találmány szerinti ellenanyagokat, előnyösen a találmány szerinti monoklonális ellenanyagokat tartalmazó diagnosztikus reagenssel érintkeztetjük. Amennyiben autoimmun ellenanyagok vannak jelen, azok reagálnak az említett peptidekkel. A végbemenő reakció többek között lehet agglutinációs reakció, kompetíciós reakció vagy gátlási reakció. A reakció - a végbemenő reakció típusától függően - kimutatható a találmány szerinti peptid vagy ellenanyag jelölésével, megfelelő kimutató reagens alkalmazásával.
Például egy mintában a fent említett autoimmun ellenanyagok kimutatására szolgáló gátlási reakció elvégzéséhez, az alkalmazandó reagenskészletnek tartalmaznia kell egy vagy több, szilárd hordozóhoz kötött, találmány szerinti peptidet, valamint egy a találmány szerinti jelölt monoklonális ellenanyagot vagy annak fragmentumát tartalmazó diagnosztikus reagenst. Ennek a reagensnek a szilárd hordozóhoz kötött pép13 tidhez történő kötődését a vizsgált mintában található autoimmun ellenanyagok leszorítás révén gátolhatják.
A felhasznált hordozók lehetnek például mikrokémcső vagy küvetta belső fala, cső vagy kapilláris, membrán, szűrő, tesztcsík vagy egy részecske felszíne, mint például latex részecske, vörösvérsejt, festék szol (kolloidális részecske), fém szol vagy fém vegyületek mint szol részecskék, vagy lehet hordozó protein, például szarvasmarha szérum albumin (BSA) vagy kürtőscsiga hemocianin (KHL).
A találmány szerinti peptidek vagy a diagnosztikus reagenst képező reagens ellenanyagok jelölésére felhasználható, kimutatható anyagok lehetnek többek között a következők: radioaktív izotóp, fluoreszcens vegyület, enzim, festék szol, fém szol vagy fém vegyület vagy más szol mint szol részecske.
Egy vagy több, találmány szerinti peptidet, valamint adott esetben ellenanyagokat, előnyösen a találmány szerinti monoklonális ellenanyagokat tartalmazó diagnosztikus reagenst tartalmazó reagenskészletek alkalmazhatók ZP3 proteinnel szemben irányuló autoimmun ellenanyagok következtében fellépő, nem kívánt infertilitás diagnózisára.
A fenti reagenskészletek alkalmazhatók továbbá a találmány szerinti vakcinával kezelt nőnemű emlősben az ellenanyagszintek követésére.
A találmány szerinti peptidek előállíthatok peptidszintézisre szolgáló bármely ismert szerveskémiai eljárással vagy rekombináns DNS-technikák alkalmazásával.
A peptidszintézisre szolgáló szerveskémiai eljárások szerint, a kívánt aminosavakat kondenzációs reakcióval, homogén fázisban vagy egy úgynevezett szilárd fázis alkalmazásával, egymáshoz kapcsoljuk.
A kondenzációs reakciót a következők szerint végezhetjük:
a) egy szabad karboxilcsoporttal és védett további reaktív csoportokkal rendelkező vegyületet (aminosavat, peptidet) egy kondenzálószer jelenlétében, szabad amino-csoporttal és védett további reaktív csoportokkal rendelkező vegyülettel (aminosavval, peptiddel) kondenzáltatunk;
b) egy aktivált karboxilcsoporttal és szabad vagy védett további reaktív csoportokkal rendelkező vegyületet (aminosavat, peptidet) szabad aminocsoporttal és szabad vagy védett további reaktív csoportokkal rendelkező vegyülettel (aminosavval, peptiddel) kondenzáltatunk.
A karboxilcsoportot többek között úgy aktiválhatjuk, hogy a karboxilcsoportot savhalogeniddé, -aziddá, -anhidriddé, -imidazoliddá vagy aktivált észterré, például N-hidroxi-szukcinimiddé vagy N-hidroxi-benzotriazollá vagy p-nitro-fenil-észterré alakítjuk.
A fenti kondenzációs reakció elvégzésére leggyakrabban alkalmazott eljárások: a karbodiimid-eljárás, az azid-eljárás, a kevertanhidrid-eljárás, valamint az aktivált észterek alkalmazásán alapuló eljárás, például az alábbi szakirodalmi helyen ismertetett módszer: The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 1-3. kötet, (szerk.: Gross E. és Meienhofer J.), Academic Press, Inc. (1979, 1980, 1981).
A találmány szerinti peptideknek szilárd fázis alkal15 mazásával történő előállítását ismertetik például a következő szakirodalmi helyeken: J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149. (1963); valamint Int. J. Peptide Protein Rés. 35, 160. (1990) . Az előállítandó peptid aminosavainak összekapcsolását rendszerint a karboxil-végről kezdjük. Ehhez az eljáráshoz olyan szilárd fázisra van szükség, amelyen reaktív csoportok találhatók, vagy amelyre ilyen csoportok felvihetők. Ez lehet például reaktív klór-metil-csoportokkal rendelkező, benzol-divinil-benzol-kopolimer vagy hidroxi-metil vagy amin funkciós csoportokkal reaktívvá tett, polimerizált szilárd fázis.
Különösen előnyös szilárd fázis például a p-alkoxi-benzil-alkohol töltet (4-hidroxi-metil-fenoxi-metil-kopolisztirol - 1% divinil-benzol töltet) , amelyet Wang írt le [ J. Am. Chem. Soc. 95, 1328. (1974)]. A szintézist követően a peptidek a szilárd fázisról kíméletes körülmények mellett lehasíthatók.
A kívánt aminosav-szekvencia szintézisét követően a peptidet - például trifluor-ecetsavban oldott trifluor-metánszulfonsavval vagy metánszulfonsavval - a töltetről eltávolítjuk. A peptidet a hordozóról eltávolíthatjuk továbbá átészterezéssel is, alacsony szénatomszámú alkohol, előnyösen metanol vagy etanol alkalmazásával, mely esetben közvetlenül a peptid alacsony szénatomszámú alkil-észterét kapjuk. Hasonlóképp, ammónia felhasználásával végzett lehasítás a találmány szerinti peptid amidját eredményezi.
Azokat a reaktív csoportokat, amelyek nem vesznek részt a kondenzációs reakcióban, az említettek szerint hatékonyan védhetjük olyan csoportokkal, amelyek a későbbiekben savak vagy bázisok jelenlétében vagy redukció közben történő hidrolízissel könnyen eltávolíthatók. Karboxilcsoportot hatékonyan védhetünk például metanollal, etanollal, tercier butanollal, benzil-alkohollal vagy p-nitro-benzil-alkohollal történő észterezéssel és szilárd fázishoz kötött aminokkal.
Aminocsoportok hatékony védésére alkalmazható csoportok az etoxi-karbonil-, benzil-oxi-karbonil-, t-butoxi-karbonil(t-boc-) vagy p-metoxi-benzil-oxi-karbonil-csoportok, vagy szulfonsav eredetű savas csoportok, például benzolszulfonilvagy p-toluolszulfonil-csoportok, de alkalmazhatók más csoportok is, például szubsztituált vagy nem-szubsztituált aril- vagy aralkilcsoportok, például benzil- és trifenil-metil-csoportok vagy orto-nitro-fenil-szulfenil- és 2-benzoil-1-metil-vinil-csoportok. Különösen előnyös amino-védőcsoport például a bázisszenzitív 9-fluorenil-metoxi-karbonil- (Fmoc) -csoport [Carpino és Han: J. Am. Chem. Soc. 92, 5748. (1970)].
A lehetséges védőcsoportok részletesebb ismertetését tartalmazza az alábbi szakirodalmi hely: The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 1-9. kötet, (szerk.: Gross, Udenfriend és Meienhofer), Academic Press, Inc. (1979-1987).
Védenünk kell ezenfelül a lizin ω-aminocsoportját, és tanácsos védeni az arginin guanidincsoportját. Ebben a vonatkozásban szokásosan alkalmazott védőcsoportok a lizin esetében a Boc-csoport, az arginin esetében a Pmc- vagy Pms- vagy Mbs-csoport vagy Mtr-csoport.
A védőcsoportok - az adott csoport természetétől függően - különböző ismert módszerekkel lehasíthatók, például trifluor-ecetsavval vagy óvatos redukcióval, például hidrogén és katalizátor, mint például palládium alkalmazásával, vagy jégecetben oldott HBr alkalmazásával.
Amint azt a fentiekben már említettük, a találmány szerinti peptidek hasonlóképp előállíthatok ismert rekombináns DNS-technikákkal. Ebből a célból, a találmány szerinti peptidet vagy az említett peptid multimerj ét kódoló nukleinsav-szekvenciát expressziós vektorba inszertáljuk. Alkalmas expressziós vektorok többek között a következők: plazmidok, kozmidok, vírusok és ”YAC-k (Yeast Artificial Chromosomes, mesterséges élesztő kromoszómák) , amelyek tartalmazzák a replikációhoz és expresszióhoz szükséges szabályozó régiókat. Az expressziós vektor a gazdasejtben expresszálható. Alkalmas gazdasejtek például a baktériumok, élesztősejtek és az emlős sejtek. Az ilyen módszerek a technika állása szerint jól ismertek [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, (1989)].
A találmány szerinti ellenanyagok előállíthatok ismert technikák alkalmazásával. Állatok, például egerek peptidekkel történő immunizálására szolgáló eljárások, valamint immunogén-specifikus monoklonális ellenanyagokat termelő hibridómák szelekciójára alkalmazható eljárások a technika állása szerint jól ismertek [lásd például, Coligan és mtsai. (szerk.): Current Protocols in Immunology (1992); Kohler és Milstein: Natúré 256, 495. (1975); Steenbakkers és mtsai.: Mól. Bioi. Rep. 19, 125. (1994)]. Röviden, a kiválasztott állatot több alkalommal injektáljuk egy immunogén hordozó
proteinhez, például kürtőscsiga hemocianinhez (KHL-hez) kötött peptiddel. Az immunizált állatban létrejött immunválaszt könnyen követhetjük a szérum alapján, az adott antigénnel fedett mikrotitráló lemezek alkalmazásával, míg hibridómákat úgy állíthatunk elő, hogy elektrofúziós eljárással mielomasejteket egér B-sejtekkel fuzionáltatunk, majd a célnak megfelelő szelektív anyagokat tartalmazó tápfolyadékban szelekciót végzünk.
Humanizált monoklonális ellenanyagok előállítására génsebészeti technikákat alkalmazhatunk, amelyek alkalmazásával az ellenanyagok módosíthatók vagy humanizálhatok. Például egér monoklonális ellenanyagok antigénkötő helyét tartalmazó, komplementeritást meghatározó régiók (CDR-ek) humán ellenanyag váznak megfelelő régiókba inszertálhatók, ezáltal olyan humán ellenanyagok nyerhetők, amelyekben a CDR-régiók az eredeti, egér ellenanyagból származnak. Ezt az úgynevezett CDR-átültetési (CDR-grafting) eljárást számos esetben sikeresen alkalmazták terápiás célra, például az interleukin2-receptorral szembeni ellenanyagok [Queen és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029. (1989)], az epidermális növekedési faktor receptorral szembeni [Kettleborough és mtsai.: Prot. Engin. £, 773. (1991); Carter és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22' 4285. (1989)], a karcioembrionális antigén elleni [Bosslet és mtsai.: Br. J. Cancer 65, 234. (1992)], valamint különböző vírusokkal szembeni [Tempest és mtsai.: BioTechnology 9, 266. (1991); Co és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869. (1991); Maeda és mtsai.: Humán antibodies and hybridomas 2, 124. (1991)] ellenanyagok előállítására.
A találmány szerinti monoklonális ellenanyagok előállítására alkalmazható még előnyösebb eljárás szerint, transzgenikus állatokat immunizálunk, amelyeket úgy módosítottunk, hogy teljes humán ellenanyagokat expresszáljanak. Az említett technológia alkalmazásának példáját ismertetik Green és mtsai. [Natúré Genetics 1_, 13. (1994)], valamint Lonberg és mtsai. [Natúré 368, 856. (1994)]. Az ilyen típusú transzgenikus állatoknak a találmány szerinti peptidekkel történő immunizálásával, és a fent vázolt, ismert hibridóma technikák alkalmazásával humán monoklonális ellenanyagok állíthatók elő. Az ilyen humán ellenanyagok igen előnyösen alkalmazhatók humán nő passzív immunizálására.
A találmány szerinti kontraceptív vakcinák az említett peptidek vagy ellenanyagok hatékony immunogén mennyiségét tartalmazzák, valamint tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadott hordozóanyagot. Hatékony immunogén mennyiség alatt olyan mennyiséget értünk, amely a női emlősben kontraceptív hatást létrehozó immunválasz kiváltásához elegendő. A peptid vagy ellenanyag mennyisége függ a beadás módjától, a beadás idejétől, a nő/nőstény fajától, valamint korától, általános egészségi állapotától és táplálkozásától.
Általánosságban, 1 testtömeg-kg-ra számítva 0,01-1000 pg peptidet, előnyösen 0,5-500 pg peptidet, még előnyösebben 0,1-100 pg peptidet alkalmazunk.
A gyógyászatilag elfogadott hordozóanyagok szakember számára jól ismertek, ilyenek lehetnek például a steril fiziológiás sóoldat, laktóz, szacharóz, kálcium-foszfát, zse20 latin, dextrin, agar, pektin, mogyoróolaj, olívaolaj, szezámolaj és víz.
A találmány szerinti vakcina adott esetben egy vagy több adjuvánst is tartalmazhat. Ezeket az adjuvánsokat nemspecifikus irritálószerekként alkalmazzuk, az immunválasz kiváltása és fokozása céljából. Alkalmazható adjuvánsok többek között a következők: alumínium-hidroxid, alumíniumfoszfát, amphigen, tokofenolok, monofoszfenil-lipid-A, muramil-dipeptid és szaponinok, például Quill-A. Az alkalmazott adjuváns mennyisége az adott adjuváns természetétől függ.
A találmány szerinti peptid immunogenifásának fokozására az említett peptidet immunogén hordozóproteinhez, például tetanusz toxoidhoz (TT) és KHL-hez köthetjük. A peptid hozzákapcsolását végezhetjük magán a peptiden jelen levő reaktív csoportokon keresztül, vagy ilyen reaktív csoport beiktatásával, például a peptid C-terminális végéhez kapcsolt további cisztein aminosavon keresztül.
Immunogén hordozóproteinnek nagymértékben immunogén peptideket nevezünk, amelyek képesek a gazdaszervezet immunrendszerének stimulálására, és ezáltal, a találmány szerinti peptidek immunogén hatásának fokozására. Az immunogén hordozóproteinek, mint ilyenek, funkcionálisan különböznek a fent említett, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagoktól, és nem tévesztendők össze azokkal.
A találmány szerinti vakcinák tartalmazhatnak továbbá egy vagy több stabilizálószert, például szénhidrátokat, ezen belül szorbitot, mannitot, keményítőt, szacharózt, dextrint és glükózt, tartalmazhatnak proteineket, például albumint
vagy kazeint, valamint puffereket, például alkalikus foszfatázt.
A találmány szerinti vakcinával bármely nőnemű emlős kezelhető. A találmány szerinti vakcinákat előnyösen humán nő kezelésére alkalmazzuk. Az adagolási eljárás ismert vakcinázási gyakorlatoknak megfelelően optimalizálható. Megfelelő adagolási módok a következők: intramuszkuláris (izomba adott) injektálás, szubkután (bőr alá történő) injektálás, intravénás injektálás, intraperitoneális (hasüregbe történő) injektálás, ezen felül szájon át, valamint orrspray-vel történő adagolás.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra ELISA-kísérlet eredményeit mutatja; a ZP4A jelű monoklonális ellenanyagnak különböző peptidekhez történő kötődését a 450 nm-en meghatározott fényelnyeléssel adtuk meg. A peptidek a 2., 7. és 9-11. azonosítószámú szekvencia szerinti aminosav-szekvenciákkal rendelkeztek (az ábrán 1-5.
számokkal jelölve).
A 2. ábra ELISA-kísérlet eredményeit szemlélteti, amely szerint a ZP4A jelű monoklonális ellenanyag rekombináns ZP3 proteinnel fedett mikrotitráló lemezekhez történő kötődését (az ábrán sötét karikákkal jelölve) a QPLWLLQG-peptid (2. azonosítószámú szekvencia) gátolja, míg (az ábrán háromszögekkel jelölt) kontroll peptid nem. A kísérletet duplikátumokban végeztük el, az ábrán az eredmények átlagértékeit ábrázoltuk. A kötődést 450 nm-en meghatározott fényelnyeléssel adtuk meg.
A 3. ábra a humán zóna pellucida monoklonális ellenanyagokkal végzett immunfluoreszcens festését mutatja. Az imunfestődést fotosokszorozóval meghatározott expozíciós idővel adtuk meg. A következő ellenanyagokat alkalmaztuk: 1 = NP11-1A (kontroll IgGl); 2 = ZP4A. A kísérletet triplikátumokban végeztük. Az ábrán az átlagértékeket, +/- a standard eltérést ábrázoltuk.
A 4. ábrán a humán spermatozoonok humán zóna pellucidához történő kötődésének gátlását mutatjuk be, monoklonális ellenanyagok alkalmazásával. A vizsgált ellenanyagok a következők voltak: 1 = NP11-1A (kontroll IgGl); 2 = ZP4A. Az ábrán négy humán oocitához kötődött spermatozoonok átlagos számát, +/- a standard eltérést ábrázoltuk.
Az 5. ábrán fehér selyemmajmok QPLWLLQG-peptiddel (2. azonosítószámú szekvencia) végzett vakcinázásával kapott eredményeket ábrázoltunk. A felső ábra az immunizálásra használt peptiddel szembeni (üres karikákkal jelölve), valamint humán rekombináns ZP3 proteinnel szembeni (sötét karikákkal jelölve) ellenanyag titereket szemlélteti, az első oltást (P) és az első emlékeztető immunizálást (B) követően. Az alsó ábra egy szemléltetésül kiválasztott, normális petefészekfunkcióval rendelkező állatban a vakcinázást megelőzően és azt követően mutatja a plazmabeli progeszteron szintek ciklikus változását, amelyet radioimmun viszgálattal határoztunk meg.
A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy ·a« · 9 ·· igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Szintetikus peptideket állítottunk elő szilárd fázisú szintézissel, Fields és Noble eljárása szerint [Int. J. Pept. Prot. Rés. 35, 160. (1990)], majd azokat glutáraldehid alkalmazásával szarvasmarha szérum albuminhoz (BSA) kapcsoltuk. Röviden ismertetve úgy jártunk el, hogy 100 μΐ peptidet (1 mg/ml) 25 μΐ BSA-oldattal elegyítettünk (12 mg/ml), majd ehhez 25 μΐ, 60 mmól/1 glutáraldehidet adtunk. Miután az elegyet 1 órán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk, 15 μΐ, 0,5 mól/1 glicint (pH=8,0) adtunk hozzá, majd 30 percig, szobahőmérsékleten történő inkubálást követően a konjugált protein frakciót kromatográfiával tisztítottuk (PDlO-oszlopok, Pharmacia). A konjugált peptideket 0,05 mól/1 nátriumkarbonát/bikarbonát pufferben (coating fedő puffer, pH=9,6) 1 ug/ml koncentrációig tovább hígítottuk, polisztirol mikrotitráló lemezek egyes rekeszeibe 100 μΐ-t adtunk, és fedés céljából, egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ily módon, a 2. és 7. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvenciákkal rendelkező két peptidet, valamint a 9-11. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvenciákkal rendelkező három kontroll peptidet állítottunk elő. A peptidek immuneljárással történő kimutatását 1 pg/ml, az ECACC gyűjteményében 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyaggal (a továbbiakban ZP4A-mAb), PBST-pufferben (0,05 % Tween-20detergenst tartalmazó foszfát-pufférés fiziológiás sóoldat24 bán, pH=7,5) 1 órán át történő inkubálással végeztük. Miután a lemezeket PBST-pufferrel háromszor mostuk, 1 órán át 100 μΐ/rekesz, PBST-pufferben 1:5000 arányban hígított, kecskében termelt, tormaperoxidázzal (HRP) konjugált, anti-egér IgG ellenanyaggal inkubáltuk. PBST-pufferrel végzett egyszeri, majd vízzel történő kétszeri mosást követően a lemezekhez 100 μΐ/rekesz tetrametil-benzidin (TMB) szubsztrát puffért adtunk, és szobahőmérsékleten, 15-30 percig inkubáltuk. A színreakciót 100 μΐ, 4 n kénsavval (H2SO4) állítottuk le. A rekeszek fényelnyelését 450 nm-en határoztuk meg. Az 1. ábrán szemléltetett eredmények szerint, a ZP4A-mAb specifikusan felismeri a találmány szerinti peptideket (1. és 2 peptideket), míg a kontroll peptidek (3-5. peptidek) esetében nem volt kötődés megfigyelhető.
2. példa
Polisztirol mikrotitráló lemezeket rekombináns humán
ZP3 proteint termelő, kínai hörcsög petefészek sejtekből származó [van Duin és mtsai.: Bioi. Repród., közlésre elfogadva (1994)], szérum mentes sejt felülúszóval fedtünk. Ebből a célból, a tenyésztő folyadékot fedő pufferben (lásd az 1. példát) 1:10 arányban hígítottuk, és a lemezeket egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk (100 μΐ/rekesz). Miután a lemezeket PBST-pufferrel háromszor mostuk, majd ZP4A-mAb (1 pg/ml) és a ”QPLWLLQG-peptid (2. azonosítószámú szekvencia), valamint kontroll peptid különböző koncentrációinak jelenlétében inkubáltuk.
A kötődött ZP4A monoklonális ellenanyag immun-eljá25 rással történő kimutatását úgy végeztük, hogy a lemezeket 1 órán át, 100 μΐ/rekesz, PBST-pufferben 1:5000 arányban hígított, kecskében termelt, tormaperoxidázzal (HRP) konjugált, anti-egér IgG ellenanyaggal inkubáltuk. PBST-pufferrel végzett egyszeri, majd vízzel történő kétszeri mosást követően a lemezekhez 100 μΐ/rekesz TMB-szubsztrát puffért adtunk, és 15-30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A színreakciót 100 μΐ, 4 n kénsav (H2SO4) hozzáadásával állítottuk le. A duplikátum rekeszek fényelnyelését 450 nm-en határoztuk meg.
Az eredményeket a 2. ábrán foglaltuk össze, ezek szerint, a találmány szerinti peptid kompetitív módon gátolta a ZP4A-mAb kötődését humán rekombináns ZP3 proteinhez, míg az ilyen kötődést kontroll peptid nem gátolta. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a ZP4A-mAb által felismert epitóp mind a rekombináns ZP3 proteinen, mind a találmány szerinti peptiden jelen van, mivel a találmány szerinti peptiddel szemben termelt ellenanyagok képesek a ZP3 proteinen található, megfelelő antigén-determinánssal reagálni.
3. példa
Humán oociták in vitro fertilizációs programokból származtak Röviden ismertetve úgy jártunk el, hogy az osztódás hiánya alapján meghatározva nem fertilizálódott oocitákat oocitatároló oldatban tároltuk (OSS, 20 mmól/1 HEPES; 1,5 mól/1 MgCl2 x 6H2O; 0,1 % dextrán; 10 % glicerin; 0,1% polivinil-pirrolidon; pH=7,2-7,4), és további felhasználásig 4 °C-on tároltuk. Humán pete-fluoreszcens vizsgálati eljárásokban (hEFA) történő felhasználásukat megelőzően, az oocitá26 kát, azaz zóna pellucidákat mikropipettával három csepp, egyenként 250 μΐ PBS-EFA-pufferben mostuk [PBS; 0,5 % szarvasmarha szérum albumin (BSA); 1 % polivinil-pirrolidon-40; 100 egység/ml penicillin; 100 μΐ/ml streptomycin]. Annak vizsgálatára, hogy a ZP4A-mAb specifikusan felismeri-e a mátrixban a humán zóna pellucida ZP1 és ZP2 molekuláival együtt előforduló ZP3 proteint, az oocitákat 25-30 μΐ PBSEFA-puffer cseppekben, 1 órán át, 37 °C-on, 100 pg/ml ellenanyaggal inkubáltunk nedveskamrában (3.ábra, 2. minta). Az aspecifikus kötődés meghatározására az oocitákat a fentivel megegyező körülmények mellett, NP11-A1 monoklonális ellenanyaggal inkubáltuk (3. ábra, 1. minta), amely egy hasonló izotípushoz tartozó semleges ellenanyag. Az oocitákat 250 μΐ PBS-EFA-pufferben, egyenként 5-10 percig háromszor mostuk, mielőtt azokat 25-30 μΐ, FITC-vel (fluoreszcein-izotiocianáttal) konjugált, nyúlban termelt anti-egér immunglobulint tartalmazó PBS-EFA-pufferben inkubáltuk (1:100 arányú hígítás, 1 órán át, 37 °C-on, nedveskamrában) . Az oocitákat újból 250 μΐ PBS-EFA-puffér cseppben, egyenként 5-10 percig, három alkalommal mostuk, majd 250 μΐ fakulást gátló oldatba helyeztük [Johnson J.: Immunoi. Meth. 43, 349. (1981)]. A végső analízis során a fakulás gátlására mindegyik oocitát külön tárgylemezre helyeztünk, kis vazelingyűrűvel vettünk körül, és fedőlemezzel lezártunk. Az oocitákat fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltunk. Közvetlenül azután, hogy az oocitákat fluoreszcens fénynek tettük ki, fotosokszorozót alkalmaztunk annak az expozíciós időnek a meghatározására, amelyre a fotó elkészítéséhez szükség volt. A fenti eljárás alkalmazásával, a fotosokszorozó segítségével kiszámított expozíciós idő szolgált a kötődött ellenanyag mennyiségének meghatározására. Hosszú expozíciós idők az ellenanyag-kötődés hiányára vagy korlátozott ellenanyag kötődésre utaltak, míg az oocitákhoz történő specifikus kötődés rövid expozíciós időket eredményezett .
A 3. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy humán oociták, azaz zóna pellucidák inkubálása ZP4A-mAb-val viszonylag magas szintű fluoreszcenciát eredményezett, míg az azonos izotípushoz tartozó, NP11-1A jelű kontroll monoklonális ellenanyaggal nem volt fluoreszcens festődés megfigyelhető. A fenti eredmények alapján megállapítható, hogy a ZP4A-mAb által felismert epitóp jelen van a natív, humán ZP3 proteinen.
4. példa
Humán, sóoldatban tárolt oocitákat a 3. példában ismertetettek szerint mostunk, majd háromszor egy-egy csepp, 0,3 % humán szérum albumint tartalmazó humán méhkürti tápfolyadékban [HTF-tápfolyadékban; lásd Quinn és mtsai.: Fertil. Steril. 44, 493. (1985)] mostunk. Valamennyi analízishez 4-5 humán oocitát használtunk, amelyeket 1 órán át, egyetlen csepp, a vizsgált vegyületet, azaz az analizálandó ellenanyagokat (1. minta: azonos izotípushoz tartozó, NP11-1A kontroll ellenanyag; 2. minta: ZP4A-mAb; mindkettő 250 pg/ml koncentrációban) tartalmazó, 25 pl térfogatú HTF-tápfolyadékban inkubáltunk. Az inkubálást 37 °C-on végeztük, nedveskamrában, 5 % CO2 jelenlétében. Miután az oocitákat háromszor egy-egy
csepp, 250 μΐ térfogatú HTF-tápfolyadékban mostuk, 25 μΐ térfogatban összegyűjtöttük, és 25 μΐ, mililiterenként 2xl06 Percoll-tisztított, mozgékony, előzőleg legalább három órán át 37 °C-on aktivált humán spermatozoont tartalmazó HTFtápfolyadékkal elegyítettük. Az 50 μΐ térfogatú inkubációs cseppet paraffin olajjal fedtük, és 4 órán át, 37 °C-on, 5 % C02-inkubátorban inkubáltuk. A kötődött és szabad spermasejteket dextrán gradiensen végzett centrifugálással szétválasztottuk. Az üledéket és 100 μΐ felülúszót 1 ml fixáló és festő oldattal elegyítettük [0,9 ml BWW-folyadék; lásd: Dániel J.C. jr. (szerk.) Methods of mammalian embriology,
W.H. Freeman, San Francisco, 86-116. oldal (1971); 0,1 ml %-os glutáraldehid, 1-10 μΐ, 2 mg/ml bismenzimid H33258 (Hoechst)], és egy éjszakán át, 4 °C-on inkubáltuk. Végül, az oocitákat ebből az oldatból mikroszkóp és mikropipetta segítségével összegyűjtöttük, fakulást gátló oldatban inkubáltuk, majd a 3. példában leírtak szerint tárgylemezekre vittük át. A kötődött spermatozoonok számát fluoreszcens mikroszkóppal határoztuk meg, megadtuk a fixált oociták tetején és alján, két beállított látómezőben egy-egy mm2-re eső sejtek átlagos számát.
A kísérlet eredményeit a 4. ábrán ábrázoltuk. A kontroll monoklonális ellenanyaggal szemben, a ZP4A-mAb gátolta a humán spermatozoonok kötődését a humán oocitákhoz. A találmány szerinti peptiddel szemben előállított ellenanyagok tehát reagálnak a humán oocitákon található natív zóna pellucidával, és gátolják a spermatozoonok kötődését a zóna pellucidához, ezáltal infertilitást eredményeznek.
5. példa
Nőstény fehér selyemmajmok (Callithrix jacchus) immunizálása a QPLWLLQG-peptiddel (2. azonosítószámú szekvencia).
Először, egy ciszteint kapcsoltunk a peptid C-terminális végéhez, hogy a peptidet reaktív csoporttal lássuk el. Ezen a reaktív helyen keresztül a peptidet tetanusz toxoid (TT) hordozóproteinhez kapcsoltuk, szulfo-SMCC [N-szukcinimidil-4-(maleimido-metil)-ciklohexán-l-karboxilát] alkalmazásával. Először, hozzáférhető SH-csoportokat képeztünk a peptiden úgy, hogy 6 mg 2-merkaptoetanol-amint adtunk 4 mg peptidhez, amelyet előzőleg 5 ml térfogatú, 5 mmól/1 EDTA-t tartalmazó, 0,1 mól/l foszfát pufferben (pH=6,0) oldottunk fel. Egy órán át, 37 °C-on végzett inkubálást követően a peptidet Sephadex-G-25-oszlopon végzett kromatográfiával tisztítottuk, és 4 °C-on tároltuk.
A hordozóproteint úgy aktiváltuk, hogy 4 mg mennyiséget 5 ml, 50 mmól/1 nátrium-borát pufferben (pH=7,0) feloldottunk, majd ehhez 2 mg szulfo-SMCC-t adtunk, és 1 órán át, 30 °C-on inkubáltuk. A proteint Sephadex-G-25 kromatográfiával tisztítottuk. Az aktivált hordozóproteint tartalmazó frakciókat összesítettük, és Amicon-B-15 mikrokoncentráló készülékkel 5 ml-re koncentráltuk. A konjugálás céljából a peptidet az aktivált, koncentrált TT-hez adtuk, és 20 órán át, 4 °C-on rázógépen inkubáltuk. A konjugált anyagot ezt követően 0,1 mól/l Tris-HCl, 1 mmól/1 MgCl2 (pH=7,0) pufferrel ekvilibrált Sephacryl-S-400 oszlop alkalmazásával,
ml/óra átfolyási sebesség mellett tisztítottuk.
Immunizálás: Az immunizálást megelőzően három hónappal a selyemmajmokat a szérum progeszteron szintek kéthetente történő meghatározásával a menstruációs ciklus szabályosságára és a normális petefészek működésre nézve vizsgáltuk. Első immunizálás alkalmával PBS-ben, 250 pg N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamint (MDP-t) tartalmazó, nem ulceratív (fekélyt nem okozó) Freund-féle adjuvánssal emulgeált, 200 pg konjugátumot adtunk be bőr alá (szubkután; s.c.), több helyre oltva, 0,2 ml össztérfogatban. Emlékeztető oltásokat hasonló módon végeztünk, azzal az eltéréssel, hogy az MDP-t kihagytuk.
Az immunválasz és a petefészek működés követésére, az immunizált állatoktól hetente kétszer vért vettünk, hogy az anti-PLWLLQ-peptid és anti-rekombináns-ZP3 protein ellenanyagok szintjét, valamint a szérum progeszteron szinteket meghatározzuk.
Az anti-peptid választ maleinsav-anhidriddel aktivált lemezek (Pierce) alkalmazásával mértük. A lemezeket egy éjszakán át, szobahőmérsékleten 1 ml PBS-ben (pH=8,0) oldott 5 mg peptiddel fedtük (100 pl/rekesz). Miután a peptidoldatot a rekeszekből kiráztuk, azokat 200 pl blokkoló pufferrel (PBS-ben oldott 3 % BSA, és 0,05 % Tween-20) kétszer mostuk, és 1 órán át, szobahőmérsékleten, további 200 pl blokkoló pufferrel inkubáltuk. Ezt a harmadik mosási lépést követően, a vizsgálandó minta 1/10 hígítástól 1/20480 hígításig terjedő kétszeres hígításait adtuk a lemzekhez (75 pl, 2 óra, szobahőmérsékleten) . Mosó pufferrel (PBS-ben oldott 0,1 % BSA,
0,05 % Tween-20) végzett három mosást követően valamennyi rekeszhez 100 μΐ (1/1000 arányban hígított) anti-majom HRP-konjugátumot adtunk, majd a lemezeket szobahőmérsékleten, órán át inkubáltuk. A lemezek további kezelését az
1. példában ismertettek szerint végeztük.
A humán rekombináns ZP3 protein felismerését vizsgáló ELISA-eljárásokat lényegében az 1. példában ismertettek szerint végzetük.
A selyemmajom plazma progeszteron szinteket nem-extrakciós radioimmun-vizsgálattal határoztuk meg. Valamennyi vizsgálatot triplikátumokban végeztünk; 2,5 μΐ plazmát 0,1 % zselatint tartalmazó 0,1 mól/1 foszfát-citrát pufferrel (PCB) (pH=6,0) 150 μΐ-re hígítottunk. A mintákhoz 100 μΐ, PCB-pufferben 1/10000 arányban hígított, birka anti-progeszteron ellenanyagot, valamint 100 μΐ jódozott progeszteron nyomjelzőt adtunk, majd az oldatot 3 órán át, 25 °C-on inkubáltuk. Ezt követően az elegyhez második ellenanyagként 100 μΐ, 1/64 arányban hígított, szamárban termelt anti-birka szérumot adtunk [Scottish Antibody Production Unit, (SAPU), Skócia], majd 100 μΐ, 1/3200 arányban hígított, normál birka szérumot adtunk (SAPU) , és az elegyet egy éjszakán át, 4 °C-on inkubáltuk. Végül, a mintákhoz 1 ml, 0,9 % fiziológiás sóoldatban oldott 4 % polietilén-glikolt, 0,2 % Triton-X-100 detergenst adtunk, és 1500 g-n, 30 percig, 4 °C-on centrifugáltuk. Miután a felülúszót kiöntöttük, a csöveket multigamma számlálóban (LKB) értékeltük.
Az 5. ábrán összefoglalt eredmények szerint, a találmány szerinti peptiddel történő immunizálás képes immunválasz
kiváltására. Az így kapott ellenanyagok felismerik az intakt humán ZP3 proteint, valamint a QPLWLLQG peptidet (felső ábra), míg a plazma progeszteron szintek ciklicitása normális petefészek működésre utal.
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(i) BEJELENTŐ: Akzo Nobel N.V.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Új kontraceptív peptidek (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 11 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:
(v) KOMPUTERREL OLVASHATÓ FORMA:
(vi) AKTUÁLIS BEJELENTÉSI ADATOK:
(viii) KÉPVISELŐ:
(ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:
(2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia
Pro Leu Trp Leu Leu Gin
5 (2) INFORMÁCIÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia
Gin Pro Leu Trp Leu Leu Gin Gly
5 (2) INFORMÁCIÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 6 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. szekvencia
Pro Leu Trp Phe Trp Gin
5 (2) INFORMÁCIÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. szekvencia
Pro Met Trp Thr Leu Gin
5 (2) INFORMÁCIÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. szekvencia
Pro Gin Pro Leu Trp Leu Leu Gin
5 (2) INFORMÁCIÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid • · • · (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. szekvencia
Pro Leu Trp Leu Leu Gin Gly Gly
5 (2) INFORMÁCIÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. szekvencia
Leu Cys Tyr Pro Gin Pro Leu Trp Leu Leu
1 5 10
His Pro Glu Thr Ser
20
(2) INFORMÁCIÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. szekvencia
Alá Asp Gly Alá Pro Met Trp Thr Leu Gin Gly Alá Alá Gly Alá 15 10 15 (2) INFORMÁCIÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid
(xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. szekvencia
Lys Val Thr Leu Alá Glu Gin Asp Pro Asn Glu Leu Asn Lys Alá
1 5 10 15
Cys Ser Phe Ser Lys
20
(2) INFORMÁCIÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. szekvencia
Thr Asp Asp Alá Leu Val Tyr Ser Thr Phe Leu Leu His Asp Pro 15 10 15
Arg Pro Val
Gly Asn Leu 20 (2) INFORMÁCIÓK A 11. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 18 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11. szekvencia
Pro Ser Asp 1
Thr Ser Val Val Leu Leu 5
Gly Val Gly Leu Alá 10
Val
Val Val Ser

Claims (19)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Peptid, amely 8-50 aminosavból álló aminosav-szekvenciával rendelkezi, és legalább a PLWLLQ aminosav-szekvenciát (1. azonosítószámú szekvencia) vagy annak megfelelőit tartalmazza, azzal a kikötéssel, hogy az említett megfelelők immunreaktívak az ECACC gyűjteményében, 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal· által termelt monoklonális ellenanyagokkal.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy legalább a QPLWLLQG aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia) vagy annak megfelelőit tartalmazza.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy QPLWLLQG aminosav-szekvenciával rendelkezik (2. azonosítószámú szekvencia).
  4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy PQPLWLLQ (5. azonosítószámú szekvencia), PLWLLQGG (6. azonosítószámú szekvencia) vagy
    LCYPQPLWLLQGGASHPETS (7. azonosítószámú szekvencia) aminosav-s zekvenciával rende1kez i k.
  5. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid, azzal jellemezve, hogy ADGAPMWTLQGAAGA (8. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciával rendelkezik.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptid alkalmazása ellenanyagok termelésére.
  7. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptiddel szemben előállított ellenanyag.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti ellenanyag, azzal jellemezve, hogy specifikusan képes kötődni a PLWLLQ vagy QPLWLLQG aminosav-szekvenciát tartalmazó epitóphoz.
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti ellenanyag, azzal jellemezve, hogy monoklonális ellenanyag.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti ellenanyag, azzal jellemezve, hogy az ECACC gyűjteményében, 94032402 nyilvántartási szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal termeli.
  11. 11. A 7-10. igénypont szerinti ellenanyagokat termelő sejtvonalak.
  12. 12. Hibridóma sejtvonal, amely az 94032402 nyilvántartási szám alatt van letétbe helyezve az ECACC gyűj teményében.
  13. 13. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidek és/vagy a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagok terápiás szerként történő alkalmazása.
  14. 14. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet, vagy egy vagy több, a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
  15. 15. Kontraceptív vakcina, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet, vagy egy vagy több, a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
  16. 16. Eljárás beteg szérumában autoimmun ellenanyagok kimutatására, azzal jellemezve, hogy
    a) a betegtől szérummintát veszünk;
    b) az említett mintát az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti egy vagy több peptiddel, valamint adott esetben, egy vagy több, találmány szerinti ellenanyagot tartalmazó diagnosztikus reagenssel érintkeztetjük;
    c) az említett autoimmun ellenanyag jelenlétét megfelelő kimutatási reakcióval meghatározzuk.
  17. 17. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptid és/vagy a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag diagnosztikus szerként történő alkalmazása.
  18. 18. Reagenskészlet vizsgálati mintában autoimmun ellenanyagok kimutatására, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti peptidet, valamint adott esetben, a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyagot tartalmazó diagnosztikus reagenst tartalmaz.
  19. 19. Diagnosztikus reagens, azzal jellemezve, hogy egy a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti, kimutatható anyaggal jelölt monoklonális ellenanyagot tartalmaz.
HU9701726A 1994-08-22 1995-08-18 Új immunokontraceptív peptidek HUT77262A (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94202392 1994-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77262A true HUT77262A (hu) 1998-03-02

Family

ID=8217113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701726A HUT77262A (hu) 1994-08-22 1995-08-18 Új immunokontraceptív peptidek

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0777688A1 (hu)
JP (1) JPH10505340A (hu)
KR (1) KR970705578A (hu)
CN (1) CN1158623A (hu)
AU (1) AU3471395A (hu)
BR (1) BR9508748A (hu)
CA (1) CA2198265A1 (hu)
FI (1) FI970744A (hu)
HU (1) HUT77262A (hu)
WO (1) WO1996006113A1 (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19622289A1 (de) * 1996-05-23 1997-11-27 Schering Ag Zona Pellucida Proteine zur Kontrazeption
EP0923602A4 (en) * 1996-07-03 2005-06-15 Zygam Inc IMMUNO-CONTRAZEPTIVE COMPOSITIONS CONTAINING ANTIGENS AGAINST SPERM AND METHOD OF ADMINISTRATION
US7037663B2 (en) 1998-02-19 2006-05-02 Eastern Virginia Medical School Human zona pellucida protein 3 and uses thereof
ES2234274T3 (es) 1998-02-19 2005-06-16 Eastern Virginia Medical School Proteina 3 recombinante activa de la zona pelucida humana (hzp3).
US7148021B2 (en) 2001-08-02 2006-12-12 Eastern Virginia Meical School Human zona pellucida proteins and methods of their use in diagnosing male infertility
CN101906163B (zh) * 2009-06-05 2012-06-27 上海交通大学医学院 一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4996297A (en) * 1987-10-07 1991-02-26 Zonagen, Inc. Recombinantly expressed rabbit zona pellucida polypeptides
EP0477226A4 (en) * 1989-06-12 1992-09-30 Us Health Contraceptive vaccine based on cloned zona pellucida gene
HUT64394A (en) * 1990-08-27 1993-12-28 Akzo Nv Protein of human zona pellucida zp3
JPH0614784A (ja) * 1991-11-29 1994-01-25 Tonen Corp ネコ卵透明帯ｆｚｐ−３をコードするｄｎａ、その発現ペプチド、および該ペプチド含有避妊ワクチン
JPH05176771A (ja) * 1991-11-29 1993-07-20 Tonen Corp ブタ卵透明帯ｐｚｐ−３をコードするｄｎａ
JPH05336974A (ja) * 1991-12-26 1993-12-21 Tonen Corp イヌ卵透明帯ｃｚｐ−３をコードするｄｎａ、該ｄｎａによってコードされるｃｚｐ−３関連ペプチド、および該ペプチド含有避妊ワクチン
JPH06179698A (ja) * 1992-12-15 1994-06-28 Tonen Corp ブタ卵透明帯ｐｚｐ−３関連ペプチド
JPH06217777A (ja) * 1993-01-29 1994-08-09 Tonen Corp ネコ卵透明帯ｆｚｐ２をコードするｄｎａ配列

Also Published As

Publication number Publication date
AU3471395A (en) 1996-03-14
BR9508748A (pt) 1997-08-12
WO1996006113A1 (en) 1996-02-29
FI970744A0 (fi) 1997-02-21
CN1158623A (zh) 1997-09-03
MX9701304A (es) 1998-05-31
JPH10505340A (ja) 1998-05-26
CA2198265A1 (en) 1996-02-29
KR970705578A (ko) 1997-10-09
FI970744A (fi) 1997-02-21
EP0777688A1 (en) 1997-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH03502571A (ja) 不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用
US5490981A (en) Diagnostic and therapeutic compositions and methods for lipoprotein(a)
Hinsch et al. Identification of mouse ZP3 protein in mammalian oocytes with antisera against synthetic ZP3 peptides
AU2006201502A1 (en) Sperm specific proteins
WO1991008220A1 (en) A method for the stepwise, controlled synthesis of chemical species, particularly peptides, coupled products obtained by the method and the use of these coupled products, e.g. as vaccines
US6455244B1 (en) Methods for the detection of antibodies associated with autoimmune disorders and infectious agents employing immunoretroid peptides derived from antigens associated with said disorders and agents
Troalen et al. Antigenic determinants on human choriogonadotropin alpha-subunit. II. Immunochemical mapping by a monoclonal antipeptide antibody.
EP0142345A2 (en) Anti-idiotypic vaccine employing anti-idiotypic monoclonal antibodies
CA2090486A1 (en) Human zona pellucida protein zp3
EP0369816A2 (en) Monoclonal antibodies specific for human polymorphic epithelial mucin
HUT77262A (hu) Új immunokontraceptív peptidek
EP0348725A2 (en) Species-specific epitode of chlamydia trachomatis and antibodies that recognize the same
US5496551A (en) Peptide structures, immunogens containing them and their uses in the control of fertility
JPH10509581A (ja) トロフィニンおよびトロフィニン補助タンパク質
AU2002339227B2 (en) Triple polypeptide complexes
FR2729960A1 (fr) Polypeptides mimotopes de toxoplasma gondii et applications
AU782467B2 (en) Egg specific surface proteins
Koshy et al. Antigenic determinants at the carboxy terminus of chicken egg white riboflavin carrier protein (RCP): epitope mapping and antibody-mediated pregnancy curtailment in rodents
US6455041B1 (en) Immunogenic epitopes of the human zona pellucida protein (ZP1)
MXPA97001304A (en) New immunoanticoncepti peptides
Lipkin et al. Antibody to synthetic somatostatin-28 (1-12): immunoreactivity with somatostatin in brain is dependent on orientation of immunizing peptide.
JP2001523647A (ja) 直鎖状抗原支持単位
Loke Human trophoblast antigens
US20110229909A1 (en) RHO1-Gamma Amino Butyric Acid C Receptor-Specific Antibodies
EP0764657A1 (en) Diagnostic and therapeutic compositions and methods for lipoprotein(a)

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee