DE19622289A1 - Zona Pellucida Proteine zur Kontrazeption - Google Patents

Zona Pellucida Proteine zur Kontrazeption

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DE19622289A1 DE19622289A DE19622289A DE19622289A1 DE 19622289 A1 DE19622289 A1 DE 19622289A1 DE 19622289 A DE19622289 A DE 19622289A DE 19622289 A DE19622289 A DE 19622289A DE 19622289 A1 DE19622289 A1 DE 19622289A1
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Peptiden, die von Zona Pellucida Proteinen abgeleitet sind, zur Kontrazeption und pharmazeutische Formulierungen, die diese Peptide enthalten, ohne daß diese Peptide immunisierend wirken.
Mit dem Anstieg der Weltbevölkerung wächst auch das Bedürfnis nach effizienten Methoden zur Kontrazeption. Neben den oralen Kontrazeptiva und Spermiziden stehen hier mechanische Verhütungsmittel zur Verfügung, wie zum Beispiel IUDs (intrauterine devices), Vaginalringe und Kondome. Ein weiterer Ansatz beruht darauf, die Fertilisation durch Blockieren der Ei-Spermien-Interaktion zu verhindern. Das Spermium muß die Zona Pellucida, eine extrazelluläre Matrix aus Glycoproteinen, welche den weiblichen Gameten umgibt, penetrieren (die wachsende Oocyte und das ovulierte Ei). Diese Interaktion erfolgt über ein komplexes Zusammenspiel von Liganden sowie Spermienrezeptoren auf der Seite der Eizelle beziehungsweise der Spermienoberfläche. Die Zona Pellucida der verschiedenen Säugerspezies besteht aus drei bis vier Glycoproteinen, die normalerweise als ZP1, 2 und 3 oder ZPA, B und C bezeichnet werden [Harris, J. et al: Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNA′s from variety of mammalien species: the ZPA, ZPB and ZPC gene families. DNA Sequence: 4, 361-393, (1994)]. Bei Mäusen wurde beschrieben, daß die Spermien zuerst über O- verbundene Oligosaccharidketten an ZP3 binden und die weitere Bindung wahrscheinlich durch ZP2 vermittelt wird. ZP3 scheint nicht nur die initiale Bindung des Spermiums an die Zona Pellucida zu vermitteln, sondern auch einen weiteren für die Fertilisation entscheidenden Prozeß, die Akrosomenreaktion [Dean, J.: Biology of mammalian fertilization. J. Clin. Invest.: 89, 1055-1059 (1992); Wassermann, P.M.: Regulation of fertilization by zona pellucida glycoproteins. J. Reprod. Suppl.: 42, 79-87, (1990)].
In Anbetracht der Tatsache, daß die Zona Pellucida Glycoproteine einzigartig im Ovar sind, antigene Eigenschaften aufweisen und für zirkulierende Antikörper während der intraovariellen Wachstumsphase zugänglich sind, konzentrierte sich die Forschung auf die Entwicklung von kontrazeptiven Vaccinen auf der Basis von Zona Pellucida Proteinen [Naz, R. K. et al.: Development of contraceptive vaccines for humans using antigen derived from gametes (spermatozoa and zona pelucida) and hormones (human chorionic gonadotropin): current status. Human Reprod. Update: 1, 1-18, (1995); Millar, S. E. et al.: Vaccination with zona pellucida peptides produces long-term contraception in female mice. Science: 246, 935-938, (1989)]. Ein Phänomen, welches bei der Immunisierung mit Zona Pellucida Proteinen in fast allen Tieren zu beobachten war, ist die Induktion einer Oophoritis. Die Ursache für das Auftreten einer Oophoritis konnte bisher nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Ausbildung einer Oophoritis läßt jedenfalls die längerfristige Anwendung von Zona Pellucida Proteinen beziehungsweise von von diesen Proteinen abgeleiteten Peptiden zur kontrazeptiven Immunisierung als problematisch erscheinen.
Es besteht daher ein dringendes Bedürfnis nach einem neuen Kontrazeptivum, welches die Fertilisation durch Blockieren der Ei-Spermien-Interaktion wirksam verhindert, ohne immunisierend zu wirken.
Es wurde nun gefunden, daß durch Peptide, die von Zona Pellucida Proteinen abgeleitet sind, überraschenderweise die Ei-Spermien-Interaktion verhindert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Peptiden, die von Zona Pellucida Proteinen abgeleitetet sind, zur Kontrazeption, ohne daß diese Peptide immunisierend wirken.
In einer weiteren Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Peptiden, die von Zona Pellucida Proteinen abgeleitet sind, zur Herstellung pharmazeutischer Formulierungen.
In einer bevorzugten Ausführung sind die Peptide geladen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung sind die Peptide abgeleitet von Maus oder humanen ZP1, 2 oder 3 Protein.
In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Peptide abgeleitet von Maus oder humanen ZP3 Protein.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung sind die Peptide
-RYPRQGNVSS-
-TPSPLPDPNSSPY-
-SRNRRHVTDEADVT-
-CSNSSSSQFQIHGPR-
-TRKCHSSSYLVSLPQ-
-SQFQIHGPRQ-
-TPT . . PDQNASPY-
-CGTPSHSRRQPHVMS-
-SRNRRHVTEEADVT-
-TRRCRTASHPVSASE-
-SRRQPHVMSQ-.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Peptide
-RYPRQGNVSS-
-TPT . . PDQNASPY-
-SRNRRHVTDEADVT-
-TRRCRTASHPVSASE-
-SQFQIHGPRQ-.
Die Synthese der Peptide erfolgte nach Merrifield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc.: 85, 2149 (1963)) auf einem Festphasensynthetisierer. Es wurde Fmoc Chemie verwendet (Carpino, L.A. and Han, G.Y. 1970. J. Amer. Chem. Soc. 92: 5748-5749; Carpino, L.A. and Han, G.Y. 1972. J. Org. Chem. 37: 3404-3409). Sollten die Peptide einen freien C-terminus (-OH) tragen, so wurde für die Synthese HMP-Harz (p- Hydroxymethylphenoxymethylpolystyrene Harz) verwendet. Sollte der C-terminus amidiert sein (-NH₂), so wurde Rink Amide MBHA Harz (Methylbenzhydrylamin) verwendet. Sollten die Peptide einen freien N-terminus tragen (-NH₂ bzw. H₂-), so wurde die Fmoc Gruppe von der letzten N-terminalen Aminosäure im letzten Zyklus abgespalten. Sollte dagegen der N-terminus acetyliert (Ac-) werden, so ließ man die letzte N-terminale Aminosäure nach der Fmoc Abspaltung mit Essigsäureanhydrid reagieren.
Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte für 0,1-1,5 g Peptid-Harz mit:
0,75 g Phenol,
0,25 ml Ethanoldithiol,
0,5 Thioanisol,
0,5 ml H₂O
10 ml Trifluoressigsäure
und dreistündiger Inkubation unter Rühren bei 37°C im Wasserbad.
Die Peptidisolierung erfolgte durch Fällung in 30 ml tert-Butylmethylether auf Eis und anschließender Filterung über eine Fritte mit der Porengröße G3. Die Fritte wurde mit 5 ml TFA nachgewaschen. Das Peptid-Ether Gemisch wurde für 10 Minuten, bei 5000 Umdrehungen pro Minute bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Peptidpellet in 30 ml tert-Butylmethylether resuspendiert und erneut zenrifugiert, dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Das Peptidpellet wurde unter Stickstoff getrocknet.
Durchführung der Versuche I. In vitro Fertilisation
Die in vitro Fertilisation stellt ein Testsystem dar, das eine erste Überprüfung eines kontrazeptiven Effekts von Substanzen ermöglicht. Hierbei besteht die Möglichkeit zu untersuchen, ob der kontrazeptive Effekt primär auf eine Hemmung der Spermienfunktion(en) oder auf einen inhibierenden Effekt an der Oocyte oder auf beide zuvor genannten Effekte zurückzuführen ist.
I.1. Tiermaterial
Fertile weibliche Mäuse (CB₆F₁-Stamm) im Alter von ca. 12 Wochen, fertile männliche Mäuse (CB₆F₁-Stamm) im Alter von mindestens 14 Wochen.
I.2. Vorbereitung und Durchführung
Pyrex- und Börtelflaschen werden autoklaviert.
Das Medium nach Brinster, Whitten und Wittingham (BWW9) modifiziert nach Zaneveld hergestellt:
Das Medium wird anschließend mit 0,5 M NaOH auf pH 7,4 eingestellt.
Sterile Bördelflaschen werden für 5 Minuten mit Carbogen begast und das Medium wird anschließend in diese hineinfiltriert (bei 4°C für maximal eine Woche haltbar). Für die Äquilibrierung des Öls werden 100 ml Paraffinöl (Uvasol) für 2 Stunden bei 100°C erhitzt und abschließend abgekühlt. Nach dem Abkühlen werden 20 ml BWW/0,3% BSA hinzugegeben und für 20 Minuten mit Carbogen begast. Alle zu verwendenden Instrumente werden über Nacht bei 140°C sterilisiert. Der Brutschrank wird auf 37°C, 5% Co₂ und 95% O₂ eingestellt.
Die Kulturschälchen:
  • a) für die Oocytengewinnung werden mit Carbon-begastem Parraffinöl gefüllt und bei 37°C warmgehalten.
  • b) für die Spermienkapazitation (vor der Entnahme der Tuben vorbereiten) werden 0,5 ml BWW/2% BSA auf den Boden des Schälchens pipettiert, mit äquilibriertem Öl überschichtet und bei 37°C gehalten.
  • c) für die Fertilisation (nach Entnahme der Tuben vorbereiten) werden 0,1 ml BWW/0,3% BSA entsprechend den zu testenden Konzentrationen mit oder ohne Substanz (Kontrolle) versetzt, mit äquilibriertem Öl überschichtet und bei 37°C gehalten.
I.2.1. Induktion der Superovulation
Den ca. 12 Wochen alten fertilen Mäuse werden intra pericutan 10 Injektionseinheiten PMS/0,1 ml injiziert und 54 Stunden später 10 Injektionseinheiten HCG/0,1 ml verabreicht.
I.2.2. Gewinnung der Spermien a. bei der Maus
Zur Gewinnung der Spermien wird ein Mausbock getötet und die beiden Nebenhodenschwänze werden entnommen und in die vorbereiteten Kulturschälchen [siehe oben unter b)] übertragen. Die Gewebsteile werden im Medium zerschnitten, so daß die Spermien entweichen können. Die Spermien werden für eine Stunde im Brutschrank kapazitiert. Nach Beendigung der Kapazitationszeit werden die Spermien 1 : 5 mit BWW/0,3 BSA verdünnt. Zum Zählen in der Zählkammer wird ein Aliquot 1 : 1 mit doppelt destillierten H₂O verdünnt. Die gewünschte Spermienkonzentration beträgt 40.000-80.000/0,1 ml.
b. beim Menschen
Für die Zona Bindungsversuche beim Menschen wird das Ejakulat von normozoospermiziven Samenspendern unter Verwendung von SpermFertil® Glasswolle-Säulen (Mello Ltd., FRG) präpariert. Die Filtrate wurden gewaschen und in HFT-HSA (HFT = human tubal fluid medium nach Quinn et al. supplementiert mit 10 mg/ml human serum albumin = HSA) resuspendiert.
I.2.3. Gewinnung der Oocyten a. bei der Maus
Die Tiere werden 13 Stunden nach der HCG-Injektion getötet, die Tuben werden entnommen und in die vorbereiteten Kulturschälchen [siehe oben unter a)] übertragen. Bis zur Weiterverarbeitung werden die Schälchen auf der Wärmeplatte bei 37°C gehalten. Unter dem Stereomikroskop werden die sich im Öl befindlichen Tuben auseinandergezogen. Dabei quellen die Cumuluswolken hervor, die dann in vorbereitete Mediumstropfen (pro Tropfen zwei Cumuluswolken) übertragen werden.
b. beim Menschen
Alle humanen Oocyten werden aus postmortalen Material gewonnen. Es wird stets darauf geachtet, daß alle legalen, ethischen und moralischen Richtlinien während des gesamten Vorganges streng eingehalten werden.
Wenn nicht anders erwähnt, werden die Oozyten in 36,6 mM Hepespuffer, pH 7,4, welcher 1,5 M MgCl2 und 0,1% PVP enthält, bei 4°C aufbewahrt.
I.2.4. In vitro Fertilisation
Zu den sich im Mediumstropfen befindlichen Oocyten werden 0,1 ml verdünntes Sperma definierter Konzentration gegeben und für 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C inkubiert.
I.3. Auswertung
Nach der 24stündigen Inkubation im Brutschrank werden die folgenden Parameter erfaßt:
  • a) Anzahl der gesamten Oocyten
  • b) Anzahl der geteilten Oocyten
  • c) Anzahl der ungeteilten Oocyten
  • d) Anzahl der degenerierten Oocyten.
Die Fertilisationsrate entspricht der Anzahl geteilter Oocyten pro Gesamtzahl intakter Oocyten.
II. Zona-Bindungsassay
Die Spermien und die Oocyten werden, wie bei der in vitro Fertilisation beschrieben, gewonnen.
Die wie unter I.2.3. gewonnen Oocyten werden durch eine fein ausgezogene Pasteurpipette, deren Durchmesser etwas geringer als der Durchmesser der Oocyten sein muß, mit einigen µl BWW Medium aufgenommen. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt und führt schließlich zum Platzen der Zonae pellucidae. Der cytoplasmatische Anteil der Oocyte wird freigesetzt und die isolierten Zona pellucida werden für weitere Versuche gesammelt und in 0,1 ml BWW Medium mit äquilibriertem Öl überschichtet und bei 37°C gehalten.
II.1. Zona pellucida Bindungsversuch a. bei der Maus
Die kapazitierten Mausspermien (siehe I.2.2) werden für 15 Minuten entweder mit einem Lösungsmittel oder der gewünschten Substanz präinkubiert, anschließend in einem 0,1 ml Tropfen zu den isolierten Zonae pellucidae gegeben, so daß das Inkubationsvolumen ingesamt 0,2 ml (unter Öl) beträgt. Pro Tropfen werden ca. 20 Zonae pellucidae untersucht. Die Spermienkonzentration pro Tropfen beträgt zwischen 10.000 und 30.000 pro pl. Spermien und Zonae werden für 45 Minuten im Brutschrank inkubiert (siehe Beschreibung unter I.2.). Nach der Inkubationszeit wird unter einem inversen Mikroskop die Anzahl der gebundenen Spermien pro Zona evaluiert. Die Obergrenze der noch exakt auszuzählenden Spermien beträgt unter Kontrollbedingungen 20 Spermien pro Zona pellucida.
b. beim Menschen
Die Experimente bestehen aus drei Inkubationstropfen, die 10 µl standard HTF-HSA Medium (s. o.) und 40 µl Arbeitsmedium enthalten (s. u.). Zu jedem Tropfen wurde eine bestimmte Anzahl von Oocytenn (für TEM) bzw. Hemizonae für die Bindung gegeben. Für die Bindungsexperimente wurde zu jedem Tropfen ein 10 µl Spermientropfen (50 × 10⁶/ml) hinzugegeben, mit Mineralöl überschichtet und für 4 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die statistische Auswertung erfolgte nach dem nicht-parametrischen Mann-Whitney Zwei-Proben-Test.
Zusammensetzung des Arbeitsmediums: 20 µl 5 mM NaH₂PO₄ (mit Phosphorsäure eingestellt) pH 2,5, plus 20 µl eines besonders zusammengesetzten doppelt konzentrierten HTF-HSA Mediums gemischt in einem Verhältnis von 1 : 1 (Vol/Vol).
Zusammensetzung des doppelt konz. HTF-HSA Mediums:
Applikation
Die genannten Peptide können in unterschiedlichen pharmazeutischen Produkten eingesetzt werden.
Peptide können auf invasivem Wege (intravenös., intramusculär, subcutan, subdermal) und nicht invasivem Wege (topisch, oral) verabreicht werden. Um einen anhaltenden Effekt zu erreichen, sind Langzeitanwendungsformen von besonderem Interesse.
a) Formulierung von Peptiden als Mikrokapseln
Als Mikroverkapselungsmaterial werden oft Copolymere der Milch- und Glykolsäure eingesetzt. Diese Verbindung bettet das Peptid ein. Die Mikrokapseln selbst werden in flüssigen Wachsen und Ölen wie Isopropylmyristrat oder Rizinusöl suspendiert.
b) Formulierung als Salze
Basiskationische Peptide können auch mit anionischen Polymeren, wie Polyester, Salze bilden, die wasserunlöslich sind und deshalb in wäßrigen Vehikeln suspendiert stabil sind.
c) Bioabbaubare Implantate
Die unter a) und b) genannten Materialien können auch extrudiert oder verpreßt werden. Es entstehen große Formlinge, die für einen Anwendungszeitraum von 6 Monaten bis 6 Jahren subdermale Wirkstoffdepots darstellen.
d) Liposome können ebenfalls als Träger von Peptiden dienen. Vorzugsweise ist die Hülle aus Phosphatidylcholin und Choleskol und gegebenenfalls weiterer Komponenten weitgehend undurchlässig für den Wirkstoff. Damit ist dieser optimal geschützt. Die liposomal verkapselten Peptide können sowohl inversiv als auch topisch oder oral appliziert werden.
e) TDS eignen sich in besonderer Weise für die vorgesehene Indikation. Sie werden z. B. über 7 Tage angewendet und geben den Wirkstoff konstant frei. Als Hauthaftklebstoff können alle üblichen Silikon- und Acrylatkleber eingesetzt werden. Wichtig kann der Zusatz eines üblichen Enhancer zur Überwindung der Hautbarriere sein. Das Formulierungsprinzip ist anwendbar bis zu einem Molekulargewicht von 1000 Dalten und damit für die beschriebenen Peptide besonders geeignet.
f) Schleimhautadhesive Systeme eignen sich im besonderen für die transmucosaole und transnasale Anwendung. Bekanntermaßen ist diese Barriere mit Peptiden leichter zu passieren als die Haut. Enhancer können hier zusätzlich eingesetzt werden. Als Applikationsformen kommen Pulver und Lösungen (Sprays) und Salben aller Art infrage.
g) wie schon unter f) berichtet, Peptide die Haut schwer passieren, ist im ungeladenen Zustand für kleinere Moleküle die Anwendung als Creme, Gel oder Salben möglich. Einmaldosenverpackungen sind im Zusammenhang mit sicherer Anwendung wünschenswert.
h) Geladene Peptide können mittels Iontophorese in die Haut verabreicht werden. Ein entsprechendes Device besteht aus 2 Teilen, einer Donor-Gel-Seite mit Elektrode und einem Gegenpol, wo der Wirkstoff bei angelegter Donorspannung in die Haut befördert wird.
Weitere pharmazeutische Formulierungen sind mit den üblichen Hilfs- und Trägerstoffen möglich.
Beispiele
Beispiel 1
% Inhibierung von Spermiumbindung (Maus) an die Maus Zona Pellucida
10.000 Spermien pro 0,01 ml mit 20 Spermienbindungen pro Zonae entspricht 100%
Beispiel 2
% Inhibition der Maus in vitro Fertilisation
Beispiel 3
% Inhibierung von Spermiumbindung (Human) an die humane Zona Pellucida
Die Peptide hu (141-150) und hu (327-341) lösen in kapazitierten humanen Spermien die Akrosomreaktion nicht aus.
Das Peptid hu (141-150) beeinflußt keine Parameter der Spermienbewegung.

Claims (10)

1. Verwendung von Peptiden, die von Zona Pellucida Proteinen abgeleitet sind, zur Kontrazeption, ohne daß diese Peptide immunisierend wirken.
2. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1, wobei die Peptide geladen sind.
3. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenzen von Maus oder humanen ZP1, 2 oder 3 Protein abgeleitet sind.
4. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenzen von Maus oder humanen ZP3 Protein abgeleitet sind.
5. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1 bis 3, wobei die Sequenzen
-RYPRQGNVSS-
-TPSPLPDPNSSPY-
-SRNRRHVTDEADVT-
-CSNSSSSQFQIHGPR-
-TRKCHSSSYLVSLPQ-
-SQFQIHGPRQ-
-TPT . . PDQNASPY-
-CGTPSHSRRQPHVMS-
-SRNRRHVTEEADVT-
-TRRCRTASHPVSASE-
-SRRQPHVMSQ-
sind.
6. Verwendung von Peptiden, die von Zona Pellucida Proteinen abgeleitet sind, zur Herstellung pharmazeutischer Formulierungen für die Kontrazeption, ohne daß diese Peptide immunisierend wirken.
7. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 6, wobei die Peptide geladen sind.
8. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Sequenzen von Maus oder humanen ZP1, 2 oder 3 Protein abgeleitet sind.
9. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Sequenzen von Maus oder humanen ZP3 Protein abgeleitet sind.
10. Verwendung von Peptiden nach Anspruch 6 bis 8, wobei die Sequenzen
-RYPRQGNVSS-
-TPSPLPDPNSSPY-
-SRNRRHVTDEADVT-
-CSNSSSSQFQIHGPR-
-TRKCHSSSYLVSLPQ-
-SQFQIHGPRQ-
-TPT . . PDQNASPY-
-CGTPSHSRRQPHVMS-
-SRNRRHVTEEADVT-
-TRRCRTASHPVSASE-
-SRRQPHVMSQ-
sind.
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