JP2000511162A - 避妊のための透明帯タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は，透明帯タンパク質から誘導されたペプチドの、避妊のための使用、及びこのペプチドを含有し、そのぺプチドが免疫的に作用しないような医薬製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 避妊のための透明帯タンパク質 この発明は，透明帯タンパク質から誘導されたペプチドの、避妊のための使用 、及びこのペプチドを含有し、そのペプチドが免疫的に作用しないような医薬製 剤に関する。 世界人口の増加につれて避妊を効果的に行なう要望も発生する。経口避妊薬、 殺精子剤のほかに、例えば、ここでＩＵＤ（子宮内避妊器具）、膣リング及びコ ンドームなどの機械的避妊方法が使用される。さらにほかの試みが基にしている ことは、卵子・精子の相互作用を遮断することによる受精の抑制である。精子は 、透明帯を貫通しなければならず、透明帯は、糖タンパク質から構成される細胞 外マトリックスで、女性の配偶子（成長する卵母細胞及び排卵性卵子）を取り巻 く。この相互作用は、リガンドと精子受容体との複合体形成作用を経て、卵細胞 乃至は精子表面サイドで発生する。種々の哺乳動物種の透明帯は、３〜４個の糖 タンパク質から構成され、通常は、ＺＰ１、２及び３、又はＺＰＡ、ＺＰＢ及び ＺＰＣのように表記される[Harris，J．et al:Cloning and characterization o f zona pellucida genes and cDNA's from variety of mammalien species:the ZAP,ZPB and ZPC gene families．DNA Sequence:4，361-393，(1994)]。マウス についての記載であるが、精子は、まずＯ結合オリゴ糖鎖を通してＺＰ３に結合 し、さらにその先の結合は、多分、ＺＰ２によって媒介される。ＺＰ３は、透明 帯への精子の最初の結合を媒介するばかりでなく、さらに受精に決定的なプロセ スである先体反応をも媒介するように見える[Dean，J:Biology of mam-malian f ertilization，J.Clin.Invest.:89，1055-105 9(1992);Wassermann,P.M.:Regulation of fertilization by zona pellucida gl ycoproteins，J.Reprod.Suppl.:42，79-87，(1990)]。 透明帯糖タンパク質は、卵巣だけに存在して、抗原性を有し、卵巣内の増殖期 の間に循環する抗体に接近できることを考慮して、研究は、透明帯タンパク質を 基にする避妊ワクチンの開発に集中される[Naz，R.K．et al.:Devel-opment of contraceptive vaccines of humans using antigen derived from gametes（spe rmatozoa and zona pellucida）and hormones(human chorionicgonadotropin):c urrent status，Human Reprod.Update:1，1-18，(1995);Millar，S．E．et al.: Vaccination with zona pellucida peptides produces long-term contraceptio n in female mice．Science:246，935-938，(1989)]。透明帯タンパク質による 免疫で、殆どすべての動物でみられた現象は、卵巣炎の誘発である。この卵巣炎 の発生については、従来、その原因が完全に解明されていなかった。いずれにし ても卵巣炎が起こることには、透明帯タンパク質乃至はこのタンパク質から誘導 されたペプチドを、避妊の免疫のために長期間服用することに問題があるように みえる。 従って、卵子・精子の相互作用を遮断することにより、免疫的に作用しないよ うな、効果的に受精を抑制する新規な避妊薬が緊急に要望されている。 ここに発見されたことは、透明帯タンパク質から誘導されたペプチドにより、 卵子・精子の相互作用が抑制されることである。 この発明は、透明帯タンパク質から誘導されたペプチドを、該ペプチドが免疫 的に作用しないようにして、避妊用に使用することに関する。 さらに好ましい態様において、この発明は、透明帯タンパク質か ら誘導されたペプチドの、医薬製剤を製造するための使用に関する。 さらに好ましい態様において、ペプチドは、マウス又はヒトのＺＰ１、２又は ３タンパク質から誘導される。 とくに好ましい態様において、ペプチドは、マウス又はヒトのＺＰ３タンパク 質から誘導される。 さらに特別に好ましい態様において、ペプチドは、 −ＲＹＰＲＱＧＮＶＳＳ− −ＴＰＳＰＬＰＤＰＮＳＳＰＹ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＤＥＡＤＶＴ− −ＣＳＮＳＳＳＳＱＦＱＩＨＧＰＲ− −ＴＲＫＣＨＳＳＳＹＬＶＳＬＰＱ− −ＳＱＦＱＩＨＧＰＲＱ− −ＴＰＴ..ＰＤＱＮＡＳＰＹ− −ＣＧＴＰＳＨＳＲＲＱＰＨＶＭＳ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＥＥＡＤＶＴ− −ＴＲＲＣＲＴＡＳＨＰＶＳＡＳＥ− −ＳＲＲＱＰＨＶＭＳＱ− である。 さらに好ましい実施形態では、ペプチドは、 −ＲＹＰＲＱＧＮＶＳＳ− −ＴＰＴ..ＰＤＱＮＡＳＰＹ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＤＥＡＤＶＴ− −ＴＲＲＣＲＴＡＳＨＰＶＳＡＳＥ− −ＳＱＦＱＩＨＧＰＲＱ− である。 ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ合成戦略［Carpino，L.A．and Han， G.Y．(1970)J.Amer.Chem.Soc．92:5748-5749;Carpino，L.A．and Han，G.Y．(19 72)J.Org.Chem．37:3404-3409］に基づいて、固相担体［Merrifie1d，R.B.，(19 63)J.Amer.Chem.Soc．85，2149]の上で自動ペプチド合成機を用いて行なう。ペ プチドに遊離のＣ−末端基（ＣＯＯＨ）がある場合には、合成は、ＨＭＰ樹脂を 使用して行なわれた［Wang，S.W.，(1973)J.Am.Chem.Soc．95，1328］。Ｃ−末 端基がアミド化（ＣＯＮＨ₂）されている場合には、合成は、ＲＩＮＫアミド樹 脂を使用して行なわれた[Rink，H.，(1987)Tetrahedron Lett．28，3787]。ペプ チドのＮ末端に遊離のアミノ基（Ｈ₂Ｎ−）がある場合には、最後の合成サイク ルでＦｍｏｃ保護基が脱離された。これに反してＮ末端がアセチル化（Ａｃ−） されている場合には、Ｆｍｏｃ開裂後に、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基を、無水酢 酸と反応させた。 保護基の脱離は、0.1〜1.5ｇのペプチド樹脂について 0.75g フェノール、 0.25ml エタンジチオール、 0.5 チオアニソール、 0.5ml 水、 10ml トリフルオロ酢酸 を加え、３７℃の水浴で攪拌しながら３時間インキュベートして行なう。 ペプチドの分離を行なうには、冷却（氷浴）しながらｔ−ブチルメチルエーテ ルを用いて沈澱させ、引き続いて遠心するか、又はエーテルで沈澱させて真空中 で回転し、引き続いて濾過した。乾燥後、ペプチドを、必要に応じてＨＰＬＣに かけて精製した。試験の実施 1. 体外受精 体外受精による試験システムを作ることにより、物質の有する避妊薬効果につ いて、先ず最初の試験を行なうことが可能になる。ここで次のような試験が可能 になる：それは、避妊薬効果が、主として精子機能の抑制、もしくは卵母細胞に おける抑制効果、又はここに挙げた２つ効果に帰せられるか、を試す試験である 。1.1 動物 令が約１２週の受胎力を有する雌のマウス（CB₆F₁系統）、令が少なくとも１ ４週の受胎力を有する雄のマウス（CB₆F₁系統）。1.2 準備及び実施 パイレックスフラスコ及びビン型フラスコを、オートクレーブ処理する。 Brinster，Whitten及びWittingham（ＢＷＷｙ）による媒質は、Zaneveldによ る修飾を用いて製造する。 引き続いて媒質に0.5M NaOHを加えてｐＨを7.4に調節する。 殺菌したビン型フラスコに５分問、カルボーゲンガスを通じ、引き続いて媒質 を、これに濾過して入れる（４℃において最大１週間 保存可能）。オイルの平衡のために、パラフィン油（Uvasol）100mlを、２時間 、１００℃に加熱して、続いて冷却する。冷却後、ＢＷＷ／0.3％ＢＳＡの20ml を加え、２０分間、カルボーゲンガスを通じる。 使用する器具は、すべて一夜、１４０℃において殺菌する。人口孵化器の設置 は、３７℃において、５％ＣＯ₂及び９５％Ｏ₂のもとに行なう。 培養シャーレ： ａ）卵母細胞の産出のために、炭素ガスを通じたパラフィン油で満たし、３７ ℃に加温して保つ。 ｂ）精子の受精能獲得（試験管採取前の準備）のために、ＢＷＷ／２％ＢＳＡ の0.5mlを、シャーレの底にピペットで移し、平衡用のオイル層で覆って３７℃ に保つ。 ｃ）受精（試験管採取前の準備）のために、ＢＷＷ／0.3％ＢＳＡの0.1m1を、 相当する試験濃度が得られるように、物質の有り、又は無し（コントロール）の もとに移し、平衡用のオイル層で覆って３７℃に保つ。1.2.1 過剰排卵の誘発 約１２週を経過した生殖能をもつマウスの皮膚膜内に、１０注射単位のＰＭＳ ／0.1mlを注射してから５４時間後に１０注射単位のＨＣＧ／0.1mlを投与する。1.2.2 精子の産出 ａ．マウスの場合 精子の産出のためにマウスボックを殺して、両方の精巣上体尾を採取して予め 準備しておいた培養シャーレに移す［上のｂ）参照］。組織部を媒質中で切断す ると精子が抽出される。精子を人工孵化器に入れて１時間キャパシテートする。 キャパシテーション処理時 間の終了後に、精子を、ＢＷＷ／0.3ＢＳＡを用いて１：５になるように稀釈す る。計算板で計数するために２回蒸留水で稀釈して分取を１：１にする。所望さ れる精子濃度は、40 000〜80 000/0.1mlである。ｂ．ヒトの場合 ヒトの透明帯が有する結合能を試験するときに、ホルモ運動精子をもつ精液提 供者の精液が、SpermFertil(商標)ガラスファイバーカラム（Mello Ltd，FRG） を用いて準備される。濾過液を、洗浄してから、ＨＦＴ−ＨＳＴ（ＨＦＴ＝Qinn らによるヒト卵管液媒質は、10mg/mlのヒト血清アルブミン＝ＨＳＡで補充され る）の中に入れて再懸濁した。1.2.3 卵母細胞の産出 ａ．マウスの場合 ＨＣＧ注射の１３時間後に動物を殺し、チューブを除去して、予め準備してお いた培養シャーレに移す［上のａ）参照］。次の作業までシャーレを３７℃の温 プレート上に保つ。立体顕微鏡で観察しながらオイル中にあるチューブを引き離 す。ここに卵丘雲が表れ、次に準備した媒質液滴（１滴あたり２つの卵丘雲）に 移される。ｂ．ヒトの場合 ヒトの卵母細胞は、すべて死後の体から採取する。ここで常に注意を喚起し、 作業のすべてにわたり、適法、倫理及び道徳に関するあらゆる基準を、厳しく遵 守しなければならない。 ほかに説明がない場合には、卵母細胞の保存は、ｐＨ7.4のＨＥＰＥＳ緩衝液3 6.6mMに1.5MのMgCl₂及び0.1％PVPを加えて４℃において行なう。1.2.4 体外受精 媒質液滴に含まれる卵母細胞に対して、定められた濃度に稀釈さ れた精子0.1mlを加えて、２４時間、人工孵化器内で３７℃においてインキュベ ートする。1.3 評価 人工孵化器において２４時間インキュベートした後に、次のパラメータを求め る： ａ）卵母細胞の全数 ｂ）分裂した卵母細胞数 ｃ）分裂していない卵母細胞数 ｄ）退化した卵母細胞数 受精率は、健全な卵母細胞の全数あたりについて、分裂した卵母細胞数に相当 する。II ．透明帯結合能検定 精子と卵母細胞は、体外受精の項に記したように準備する。 1.2.3項のようにして得られた卵母細胞を、細く引き伸ばされたパスツールピ ペットを用いて、数μｌのＢＷＷ媒質液と共に採取すが、ピペットの直径は、卵 母細胞の直径よりも幾分細くしなければならない。この過程を何回も繰り返すと 、遂には透明帯が裂ける。卵母細胞の細胞質部分を分離し、分離された透明帯は 、次の試験のために集められ、そしてＢＷＷ媒質液0.1mlの中で平衡用のオイル 層をかけて３７℃に保つ。II.1 ．透明帯結合能検定 ａ．マウスの場合 キャパシテーションにより受精能を得たマウス精子（1.2.2参照）に、溶媒又 は所望される物質を加えて１５分間の前段インキュベーションを行い、引き続い て0.1mlの液滴の中で、分離した透明帯にマウス精子が加えられると、インキュ ベーション容積は、全部で0.2ml（オイルのもとで）になる。液滴あたりの精子 濃度は、 μｌあたり10 000〜30 000個である。精子と卵母細胞を、４５分間、人工孵化器 内でインキュベートする（1.2の記述参照）。インキュベートが終了した時点で 倒立顕微鏡を使用して、結合した透明帯あたりの精子数を評価する。まだ正確に 計数すべき精子の上限は、制御条件のもとで透明帯あたり２０精子である。ｂ．ヒトの場合 試験は、インキュベートした３液滴からなり、ＨＴＦ−ＨＳＡ媒質（s.o.）10 μｌ及び作業媒質（s.u.）40μｌを含有する。それぞれの液滴には、一定数の卵 母細胞（ＴＥＭ使用）乃至は半透明帯が、結合のために加えられた。結合実験用 として、それぞれの液滴に精子液滴（50×10⁶/m1）10μｌを加え、鉱油の層をか けて４時間、３７℃において５％ＣＯ₂中でインキュベートする。統計的評価に は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック式の２試料母集団検定法を用いた 。作業媒質は、５mMのNaH₂PO₄20μｌ（リン酸でｐＨ2.5に調節）に、とくに２倍 の濃度にしたＨＴＦ−ＨＳＡ媒質を、１：１（容積比）にように混合して構成し た。 ２倍の濃度にしたＨＴＦ−ＨＳＡ媒質の成分： 応用 上に挙げたペプチドは、種々の薬剤製品に使用することができる 。 ペプチドは、侵入性経路（静脈注、筋肉内、皮膚下、真皮下）及び非侵入性経 路（局所、経口）を経て投与することができる。持続効果を得るためには、長期 用の投与形態に特別の関心がもたれる。 ａ）マイクロカプセルとしてのペプチド製剤 マイクロカプセル用素材として乳酸とグリコール酸のコポリマーが、しばしば 使用される。これらの化合物は、ペプチドを封入する。マイクロカプセル自体は 、液状のワックス、イソプロピルミリストラート又はひまし油などのオイルの中 に懸濁される。 ｂ）塩としての製剤 塩基性カチオンのペプチドは、ポリエステルなどのアニオン性ポリマーとも塩 を形成するが、この塩は、水に溶けないために、水性の賦形剤のなかで安定に懸 濁される。 ｃ）生分解性植込み錠 ａ）及びｂ）に挙げた物質は、押出し又は加圧により成形することもできる。 大型のブリケットが生成して、これは６カ月から６年の投与期間にわたり皮下に 活性物質を放出するデポー製剤になる。 ｄ）リポソームは、同様にペプチド担体として使用される。ホスファチジルコ リンとコレスコルからなり、そして必要な場合には、ほかの成分を含む皮膜は、 活性物質に対する透過性が著しく悪い。従って活性物質は、最高度に保護される ことになる。リポソームでカプセル化したペプチドは、侵入用にも、局所用にも 、また経口用としても投与することができる。 ｅ）ＴＤＳは、とくに予め考慮される適応症に適している。これらは、例えば 、７日にわたって投与すると、活性物質が一定な割合で放出される。皮膚接合剤 としては、通常のシリコーン粘着剤及びアクリレート粘着剤が使用される。皮膚 障害を克服するために通常 のエンハンサーを加えることが重要である。製剤における原理は、分子量が１０ ００ダルトンまで適用されが、記載のペプチドが、とくに適している。 ｆ）粘膜粘着性システムは、とくに経粘膜及び経鼻による投与に適している。 よく知られているように、ペプチドは、この障壁を皮膚よりも容易に通過する。 エンハンサーは、ここで添加剤として使用することができる。投与形態としては 、粉末、溶液（スプレイ）及び諸種の軟膏が考慮される。 ｇ）すでにｆ）で述べたように、ペプチドは、皮膚の通過性がよくないので、 帯電がない状態では、微小分子に対してクリーム、ゲル又は軟膏として使用する ことが可能である。１回用量に包装することが、安全適用との関連において望ま しい。 ｈ）帯電性のペプチドは、イオン導入法によって皮膚に投与することができる 。これに相当する装置は、２つの部分、すなわち電極つきのドナー・ゲル側面及 び対極から構成され、ここで活性物質は、印加されたドナー電圧のもとで皮膚内 に移送される。 そのほか医薬製剤には、通常使用される助剤物質及び担体物質を加えることが 可能である。実施例 実施例１ マウス透明帯への精子結合（マウス）の抑制（％） 0.01mlあたり10 000個の精子からの、透明帯あたり２０精子の結合が100％に 相当する。実施例２ 体外受精におけるマウスの抑制（％） 実施例３ ヒト透明帯への精子結合（ヒト）の抑制（％） ペプチドhu（141-150）及びhu（327-341）は、受精能を獲得したヒト精子にお いて先体反応を誘発しない。 ペプチドhu（141-150）は、精子の運動因子に影響を与えない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1． 透明帯タンパク質から誘導されたペプチドの、そのペプチドが免疫的に 作用しないような、避妊のための使用。 2．配列が、マウス又はヒトのＺＰ１、２もしくは３タンパク質から誘導され た請求項１記載のペプチドの使用。 3． 配列が、マウス又はヒトのＺＰ３タンパク質から誘導された請求項１記 載のペプチドの使用。 4． 配列が、 −ＲＹＰＲＱＧＮＶＳＳ− −ＴＰＳＰＬＰＤＰＮＳＳＰＹ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＤＥＡＤＶＴ− −ＣＳＮＳＳＳＳＱＦＱＩＨＧＰＲ− −ＴＲＫＣＨＳＳＳＹＬＶＳＬＰＱ− −ＳＱＦＱＩＨＧＰＲＱ− −ＴＰＴ..ＰＤＱＮＡＳＰＹ− −ＣＧＴＰＳＨＳＲＲＱＰＨＶＭＳ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＥＥＡＤＶＴ− −ＴＲＲＣＲＴＡＳＨＰＶＳＡＳＥ− −ＳＲＲＱＰＨＶＭＳＱ− である請求項１〜３記載のペプチドの使用。 5． 透明帯タンパク質から誘導されたペプチドの、そのペプチドが免疫的に 作用しないような、避妊のための医薬製剤を製造するための使用。 6．配列が、マウス又はヒトのＺＰ１、２もしくは３タンパク質から誘導され た請求項５記載のペプチドの使用。 7． 配列が、マウス又はヒトのＺＰ３タンパク質から誘導された 請求項５記載のペプチドの使用。 8． 配列が、 −ＲＹＰＲＱＧＮＶＳＳ− −ＴＰＳＰＬＰＤＰＮＳＳＰＹ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＤＥＡＤＶＴ− −ＣＳＮＳＳＳＳＱＦＱＩＨＧＰＲ− −ＴＲＫＣＨＳＳＳＹＬＶＳＬＰＱ− −ＳＱＦＱＩＨＧＰＲＱ− −ＴＰＴ..ＰＤＱＮＡＳＰＹ− −ＣＧＴＰＳＨＳＲＲＱＰＨＶＭＳ− −ＳＲＮＲＲＨＶＴＥＥＡＤＶＴ− −ＴＲＲＣＲＴＡＳＨＰＶＳＡＳＥ− −ＳＲＲＱＰＨＶＭＳＱ− である請求項５〜７記載のペプチドの使用。