JPH10501970A

JPH10501970A - 避妊ワクチン

Info

Publication number: JPH10501970A
Application number: JP8502335A
Authority: JP
Inventors: アルベス，ケネス; グプタ，サニル・ケー; ホリス，グレゴリー・フランクリン
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-06-20
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 1998-02-24
Also published as: CA2193206A1; US5935578A; EP0771212A1; US5693496A; WO1995035118A1; AU2769595A

Abstract

(57)【要約】この発明は、ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質及びマウスＰＨ３０β鎖タンパク質の中から選択された、実質的に純粋な形態の精子表面タンパク質に係わる。このようなタンパク質はヒト及びマウスそれぞれにおいて避妊ワクチンとして有用であり、また精子と卵子との相互作用及び受精を途絶させる小分子の同定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称避妊ワクチン発明の分野本発明は、受精の防止に有用である精子表面タンパク質、及び該タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。特に、マウス及びヒトＰＨ３０β鎖遺伝子のクローニング及び特性解明、並びにマウス及びヒトＰＨ３０β鎖の避妊ワクチンとしての使用を開示する。発明の背景米国で現在使用可能な家族計画法は、断種、禁断、中絶及び避妊の４種である。これら４種のバースコントロール法のうち、避妊が最も広く用いられている。避妊については米国でも世界でもかなりの需要が有るにもかかわらず、現在使用可能な方法は市場のニーズに応えていない。今日の避妊市場では経口避妊薬及び遮断法が支配的であるが、これらには重大な欠点が有る。経口避妊薬は効力が大きいが、心血管疾患及び乳癌の危険性の増大を含めた重大な副作用との関連性が報告されており、３５才を過ぎた女性には勧められない。遮断法は、安全ではあるのだが、失敗率が２０％に迫る。避妊薬をより用いやすくし、かつその効力を高め、それによって安全性、効力、利便性及び許容可能性に優れ、かつ世界中の女性及び男性にとって入手可能な避妊薬を得る必要性が明らかに存在する。従って、受精能を制御する新規な方法を見出さなければならない。雄性及び雌性動物を全精子抽出物で免役することによって不妊が惹起されることは公知である（Ｋ．Ｔｕｎｇ等，Ｊ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏｌ．１，ｐｐ．１４５−１５８，１９７９；Ａ．Ｍｅｎｇｅ等，Ｂｉｏｌ．ｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ２０，ｐｐ．９３１−９３７，１９７９）。そのうえ、自発的に抗精子抗体を産生する男性及び女性は、その他の点では健康であっても不妊である（Ｒ．Ｂｒｏｎｓｏｎ等，Ｆｅｒｔ．ａｎｄＳｔｅｒｉｌｅ４２，ｐｐ．１７１−１８３，１９８４）。決定的な精子抗原は未知であるが、上記のような観察から、避妊ワクチンの開発に精子タンパク質が有用であるかもしれないという提言がなされた。哺乳動物種では、精子タンパク質は精子を卵の透明帯に付着させる役割を有すると考えられる。ＰＨ３０タンパク質は精子と卵との結合に関与することが知られており、ＰＨ３０に結合する抗体が前記相互作用を抑制する。ＰＨ３０は精子の後頭部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒｈｅａｄ）に存在する内在性の膜タンパク質であり、精子と卵母細胞との融合を媒介する。ＰＨ３０タンパク質は、免疫学的に異なるαとβ との二つのサブユニットから成る。いずれのサブユニットもより大きい前駆体として形成され、その後最終的に、精子が授精適応性（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）となる副睾丸においてプロセシングを受ける（Ｐ．Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ等，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１０４，ｐｐ．１４１−１４９，１９８７；Ｃ．Ｐ．Ｂｌｏｂｅｌ等，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ１１１，ｐｐ．６９−７８，１９９０）。ＰＨ３０を識別するモノクローナル抗体はｉｎｖｉｔｒｏで精子と卵母細胞との融合を抑制し、このことは受精におけるＰＨ３０の重要性を示している（Ｐ．Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ等，上掲誌，１９８７）。モルモットＰＨ３０α及びβ鎖がＢｌｏｂｅｌ等によってクローン化されている。成熟ＰＨ３０α鎖は２８９アミノ酸から成り、膜貫通ドメインと、風疹ウイルスのＥ２糖タンパク質の潜在性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）融合ペプチドに類似する内在性融合ペプチド（８２〜１０２）とをコードする。モルモットＰＨ３０β鎖は３５３アミノ酸の読み取り枠を有し、やはり膜貫通ドメインをコートする（Ｃ．Ｐ．Ｂｌｏｂｅｌ等，Ｎａｔｕｒｅ３５６，ｐｐ．２４８−２５１，１９９２）。ＰＨ３０β鎖タンパク質の推定アミノ酸配列はヘビ毒中に見出される、「ディスインティグリン（ｄｉｓｉｎｔｉｇｒｉｎｓ）」と呼称される一群のタンパク質に対して有意の相同性を有する。ディスインティグリンは、「インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）」と呼称される一群のタンパク質に結合してこのタンパク質が細胞接着において正常に機能するのを妨げることが知られている（良く研究されている一例に血小板凝集が有る）。ＰＨ３０βのＮ末端の９０アミノ酸から成るインテグリン結合ディスインティグリンドメインが、卵母細胞上に存在するＰＨ３０の推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）インテグリン受容体へのＰＨ３０の結合結合を媒介すると仮定されている。マウス及びヒトのＰＨ３０β鎖遺伝子をクローン化して配列決定すれば、精子と卵との結合及び融合を制御する新規な方法が可能となろう。前記方法には、ＰＨ３０β鎖タンパク質の全体または一部に対する免疫応答を惹起すること、及びＰＨ３０β鎖タンパク質を、精子と卵との相互作用を改変する小型分子を同定する選別手段（ｓｃｒｅｅｎ）の一部として用いることが非限定的に含まれる。哺乳動物の受精は大抵の場合種特異的である。即ち、モルモット以外の種において有効な長期避妊を実現しようとすれば、当該種の受精にとって重要な精子表面タンパタ質を同定及び単離することが有用となろう。これまでは、精子の有望な付着タンパク質の生化学的同定、単離及びクローニングが行なわれなかったために、科学者はヒトその他の哺乳動物種用の有効な避妊薬を開発できなかった。発明の概要本発明は、ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質、マウスＰＨ３０β鎖タンパク質、及びヒトまたはマウスＰＨ３０β鎖タンパク質と実質的に相同のアミノ酸配列の中から選択された、実質的に純粋な形態の精子タンパク質に係わる。本発明の一実施態様において、精子タンパク質はＴＤＥでないインテグリン結合配列を有する。本発明の精子タンパク質のうちの或るものにおいては、インテグリン結合配列はＦＥＥ及びＱＤＥの中から選択される。本発明の精子タンパク質にはヒトＰＨ３０β鎖タンパク質が含まれる。この精子タンパク質の一例に、インテグリン結合配列を有し、該配列がＦＥＥである精子タンパク質が有る。本発明はその別の形態において、上記精子タンパク質または該精子タンパク質の、少なくとも１個のエピトープの構成に十分な部分をコードするＤＮＡ配列も提供する。本発明のＤＮＡ配列の一例では、上記エピトープは天然タンパク質に存在する。本発明のＤＮＡ配列の例に、ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質の全体または一部をコードするＤＮＡ配列が有る。本発明のＤＮＡ配列の更に別の例に、ヒトＰＨ３０βタンパク質の全体または一部をコードするＤＮＡが配列番号１に示したＤＮＡ配列と標準的条件下にハイブリダイズする能力によって特徴付けられることを特徴とするＤＮＡ配列が有る。本発明はその特別の形態において、治療有効量の本発明のタンパク質、または該タンパク質のセグメントと実質的に同じアミノ酸配列を有する、少なくとも１個のエピトープの構成に十分なポリペプチドと、医薬に許容可能なキャリヤとを含有する避妊薬組成物を提供する。本発明の組成物の一例では、上記エピトープは天然タンパク質に存在する。本発明の組成物の例に、タンパク質がヒトＰＨ３０β鎖タンパク質であることを特徴とする避妊薬組成物が有る。本発明の組成物の特定例に、タンパク質が組み換えＤＮＡ発現ベクターに組み込まれた、精子タンパク質の免疫原エピトープをコードする遺伝子の発現によって生産されることを特徴とする避妊薬組成物が有る。本発明はその特別の態様において、本発明のタンパタ質をコードするＤＮＡ配列が挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターの一例に、挿入されたＤＮＡ配列が配列番号１及び３のＤＮＡ配列の中から選択されたＤＮＡ配列と標準的条件下にハイブリダイズする能力によって特徴付けられることを特徴とするベクターが有る。本発明は、本発明のベクターと相容性である、前記ベクターを保持する宿主も提供する。本発明はその特定の態様において、ヒトまたはマウスＰＨ３０β鎖精子タンパク質を製造する方法も提供し、この方法はＰＨ３０β鎖ＤＮＡを有する細胞を培養するステップ、及び細胞培養物から前記精子タンパク質を回収するステップを含む。本発明の方法の一例に、ＰＨ３０β鎖タンパク質の全体または一部をコードするＤＮＡが配列番号１及び３のＤＮＡ配列の中から選択されたＤＮＡ配列と標準的条件下にハイブリダイズする能力によって特徴付けられることを特徴とする方法が有る。本発明はその特定の態様において、避妊を必要とするヒトまたはマウス被検者を避妊させる方法も提供し、この方法は前記被検者に本発明の精子タンパク質を、該精子タンパク質にｉｎｖｉｖｏで結合する抗体の刺激に有効な量で投与し、それによって精子と卵との融合を防止するか、または前記融合の融合率を実質的に低下させることを含む。本発明の避妊方法の一例に、精子タンパク質がＴＤＥでないインテグリン結合配列を有することを特徴とする方法が有る。本発明は、本発明の製造方法で製造したＰＨ３０β鎖タンパク質も提供する。本発明は、ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質をコードする、配列番号１に示したＤＮＡ配列も提供する。本発明は更に、実質的にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から成る精製及び単離されたＤＮＡ配列も提供し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列はヒトまたはマウスＰＨ３０βのアミノ酸配列に対して、精子−卵結合を開始させ、または精子−卵融合を促進する生物学的特性の保有を可能にする十分な重複性を有する。上記のような生物学的活性は、ｉｎｖｉｔｒｏ精子−卵母細胞結合／融合アッセイを用いて測定可能である（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ等，上掲誌，１９８７）。本発明の上記ＤＮＡ配列の一例に、ポリペプチドのアミノ酸配列がＴＤＥでないインテグリン結合配列を含むことを特徴とするＤＮＡ配列が有る。図面の簡単な説明図１はヒトＰＨ３０βタンパク質をコードするヒトＰＨ３０β ｃＤＮＡ遺伝子配列を、三文字コードで表わしたヒトＰＨ３０βタンパク質の推定アミノ酸配列と共に示す説明図である。図１に開示した配列に、配列番号１及び２を付す。図２はマウスＰＨ３０β ｃＤＮＡ遺伝子配列を、三文字コードで表わしたマウスＰＨ３０βタンパク質の推定アミノ酸配列と共に示す説明図である。図２に開示した配列に、配列番号３及び４を付す。図３はヒトＰＨ３０β ｃＤＮＡ配列の制限マップである。図４はマウスＰＨ３０β ｃＤＮＡ配列の制限マップである。発明の詳細な説明本発明は、受精にとって重要である精子表面タンパク質またはその一部と、避妊法でのそれらの使用とに係わる。例えば精子表面タンパタ質に対するモノクローナル抗体、または精製された当該タンパク質に対するポリクローナル抗体が精子に結合した時ｉｎｖｉｔｒｏもしくはｉｎｖｉｖｏ受精を抑制するか、またはｉｎｖｉｔｒｏ受精の任意のステップを抑制する場合、当該タンパク質は受精にとって重要である。受精過程は、２個の配偶子（精子及び卵）が結合または融合し、続いてそれらの核同士が融合して新生生物のゲノムを形成することと定義される。精子表面タンパク質は精子の原形質膜及び／または内側先体膜に存在し得る。このタンパク質は、タンパク質または糖タンパク質であり得る。免疫に用いられる単離タンパク質は表面タンパク質全体か、または表面タンパク質の（細胞外に位置する）免疫原部分を含み得る。このような精子表面タンパク質のうちの二つが、マウス及びヒトＰＨ３０β鎖精子表面タンパク質である。ＰＨ３０β遺伝子は、精子細胞の表面に存在する、受精にとって重要なタンパク質をコードする。本明細書中、「実質的に純粋」なタンパク質またはペプチドとは、そのタンパク質またはペプチドが天然に会合する他の分子を実質的に伴わないところまで精製したタンパタ質またはペプチドのことである。「実質的に純粋」という語は、本発明のペプチドが天然に会合するタンパク質またはペプチドに関して用いてあり、本発明のペプチドと、タンパク質でない医薬用キャリヤもしくは賦形剤とを混合して得られる組成物を除外することを意図していない。本明細書中、「言及中のＰＨ３０βタンパク質と実質的に相同であるアミノ酸配列」とは、言及中のＰＨ３０βタンパク質またはそのペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列のことである。例えば、或るアミノ酸配列をマウスＰＨ３０βタンパク質と整列させた時に該配列のアミノ酸残基の少なくとも７０％が前記タンパク質と同じであれば、そのアミノ酸配列はマウスＰＨ３０βタンパク質と実質的に相同である。加えて、実質的に相同であるアミノ酸配列はインテグリン結合配列を含むことが好ましい。本明細書中、「言及中のＰＨ３０βタンパク質と実質的に相同であるＤＮＡ配列」とは、言及中のＰＨ３０βタンパク質のＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％の配列相同性を有するＤＮＡ配列のことである。そのうえ、言及中のＰＨ３０βタンパク質と実質的に相同であるＤＮＡ配列は、標準的条件下に言及中のＰＨ３０βのＤＮＡ配列とハイブリダイズする能力によって特徴付けられる。標準的なハイブリダイゼーション条件は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等，“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，”ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９に述べられている。本明細書に用いた「発現ベクター」もしくは「ベクター」という語は、問題の遺伝子の発現に適するシグナルが当該ベクターに存在するようにして前記遺伝子をその中へクローン化し得るプラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、または他の分子を意味する。本明細書に用いた「エピトープ」という語は、有効な、即ち避妊を実現する免疫応答を誘起し得る最小のＰＨ３０β配列を意味する。本明細書に用いた「治療有効量」という語は、研究者または臨床医が求める生物学的または医学的応答を惹起する薬物量または医薬量を意味する。免疫原の生産及び精製避妊免疫原として用いる精子表面タンパク質を生産する好ましい一方法では組み換えＤＮＡ技術を用いる。この技術を用いて上記タンパク質を生産するためには、該タンパク質またはその免疫原部分をコードするＤＮＡを単離してクローン化しなければならない。問題の遺伝子をクローン化する試みで用い得る様々な方法は、当業者には良く知られている。しかし、せいぜい目的の単離タンパク質をもつだけのことで、上記のような試みの成功を妥当な確度で予測することはできない。後出の実施例において、本発明者は、マウス及びヒトＰＨ３０β鎖遺伝子のクローニング及び特性解明について説明する。マウス及びヒトＰＨ３０β鎖遺伝子は、モルモットＰＨ３０β鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡを用いて単離した。本発明は、精子と卵との結合並びに結合後のシグナリング及び有効な諸事象（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｅｖｅｎｔｓ）を抗ＰＨ３０特異的免疫応答で抑制することに的を絞って受精の制御に介入することを可能にする特定の配列の情報を提供する。上記のような配列は、精子と卵との相互作用に関与する卵母細胞タンパク質の単離に用いられる試薬の生成を可能にする。実施例に提示した情報は、当業者がマウスまたはヒトＰＨ３０β鎖遺伝子を単離及びクローン化することを可能にする。例えば、問題の哺乳動物（例えばマウス、ヒト）から単離した睾丸細胞もしくは精子形成細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製する。このようなライブラリーを次に、例えば標識したモルモットＰＨ３０ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする。ヒトまたはマウスＰＨ３０の全体または一部をコードするＤＮＡは、実施例１に述べたようなハイブリダイゼーション条件下に上記のようなプローブ配列とハイブリダイズする能力によって特徴付けられる。標識方法及びハイブリダイゼーションによるスクリーニング方法は当業者に良く知られている。陽性クローンを分析し、完全長ｃＤＮＡを通常の方法で構築する。クローン化した遺伝子または該遺伝子の、ＰＨ３０タンパク質の免疫原領域をコードする部分は、コーディング領域を発現ベクターに挿入して発現構築物を作製することにより発現させ得る。上記発現ベクターは多数が当業者に公知である。それらの発現ベタターは、目的の遺伝子のためのプロモーター、並びに付加的な転写及び翻訳シグナルを有する。発現ベクターは、真核宿主細胞向けのものも原核宿主細胞向けのものも広く入手可能である。ＤＮＡ発現構築物を用いて適当な宿主細胞を形質転換する。真核生物タンパク質の発現には真核生物、特に哺乳動物由来の宿主細胞をしばしば用いる。例えば、真核生物タンパク質は原核細胞において発現されると折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）の問題を生じさせる恐れが有ることが判明している。加えて、クローン化したＤＮＡから真正の生物活性な真核生物タンパク質が産生される場合には、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リン酸化、または細菌細胞では行なわれない特異的タンパク質分解切断プロセスといった翻訳後修飾が時に必要となる。このことは特に膜タンパク質の場合に該当する。精子表面タンパク質は宿主細胞の転写及び翻訳成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を用いて産生される。適当な増殖及び発現期間の経過後、宿主細胞培養物を溶解させ、溶解物から精子表面タンパク質を精製する。溶解緩衝液には典型的には、ノニオン界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤等が含まれる。精子表面タンパク質は可溶化した細胞抽出物から、超遠心、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等といった物理的及び生化学的方法によって精製及び単離し得る。あるいはまた、精子表面タンパク質を、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって単離することも可能である（Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ等，Ｂｉｏｌ．ｏｆＲｅｐｒｏｄ．３８，ｐｐ．９２１−９３４，１９８８参照）。このようなタンパク質精製方法は当業者に良く知られている。先に述べたように、精子表面タンパク質の抗原部分もしくはエピトープは完全長タンパク質と共に、免疫原として有用である。抗原フラグメントは、例えば完全長タンパク質をタンパク質分解消化し、その後所望のフラグメントを単離することによって作製し得る。あるいはまた化学合成を用い、モノマーアミノ酸残基から出発して所望のフラグメントを生成させることも可能である。ＰＨ３０タンパク質に関しては、幾つかの抗原ドメインが避妊ワクチンに好ましく用いられると考えられる。後出の実施例において詳述するように、ＰＨ３０ βサブユニットは、ディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）として知られている一群のタンパク質と比較した場合に高度に保存されたドメインを有する。このドメインと同等または実質的に同等であるペプチド（またはその一部）が、本発明の避妊方法で好ましく用いられる。上記「実質的に同等」という語は、ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも７０％がＰＨ３０βディスインテグリンドメインの対応する部分と同等であることを意味する。ディスインテグリンは例えばヘビ毒中に見出され、インテグリンとして知られている一群の血小板表面タンパク質に結合することが知られている。ディスインテグリンのインテグリンへの結合は血液凝固を抑制することが判明している。このことから類推して、ＰＨ３０βディスインテグリンドメインに対応するペプチドは精子と卵との結合及び融合において活性であると考えられる。避妊ワクチン精子表面タンパク質を生産及び精製したら、該タンパク質またはその一部を、免疫するべく被検者に投与するのに適したキャリヤと組み合わせることによってワクチンを製造し得る。免疫原が組織特異性を示すこと、即ち標的組織でのみ発現されることがワクチン開発の成功のためには必要であり、また生殖過程にとって重要であるはずである。精子でのみ発現されるＰＨ３０タンパク質が精子と卵との結合に関与し、ＰＨ３０に結合する抗体が前記のような相互作用を抑制することが知られている。ヒトＰＨ３０βのクローニング及び特性解明によって、ヒトの受精を制御するための標的としてＰＨ３０を用いる新規な方法が可能となる。ＰＨ３０βタンパク質またはペプチドは、ＰＨ３０β鎖タンパク質の全体または関連部分に対する免疫応答を惹起する抗原として直接用い得る。上記方法を試験するには、十分な量のＰＨ３０βタンパク質が入手可能でなければならない。マウス及びヒトＰＨ３０β鎖のクローニング及び配列決定によって、ＰＨ３０βタンパク質の全体または一部を組み換え技術で発現させるのに必要な情報が得られる。発現されたＰＨ３０βタンパク質をアジュバントと共に、またはアジュバント無しで用いて女性または雌のマウスを免役する。誘起された体液性免疫応答を、抗原としてＰＨ３０βを用いるアッセイによって監視する。雌性生殖器系において分泌された抗体は精子頭部に結合し、受精を途絶させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）。組み換えマウスＰＨ３０βタンパク質が入手可能となることで、ＰＨ３０に基づく特異的受精制御方法の効果、可逆性及び安全性を試験する動物モデル系が確立され得る。ワクチンは１種以上の精子表面タンパク質を含有し得る。本発明の精子表面タンパク質は、免疫系の非特異的刺激因子を含有するアジュバントと配合可能である。アジュバントを適正に用いれば、外来抗原（即ち精子表面タンパク質）に対する強い抗体応答を誘起することができる。アジュバントの作用は完全には解明されていないが、ほとんどのアジュバントは二つの成分を含む。一つは、抗原を異化作用から保護する沈着（ｄｅｐｏｓｉｔ）の形成のために用いられる物質である。沈着形成方法には、鉱油を用いる方法と水酸化アルミニウム沈澱物を用いる方法との二つが有る。フロイントアジュバントなど、アジュバントが鉱油を含有する場合は、免疫原を油中水型乳濁液中に加えて製剤化する。水酸化アルミニウム含有の場合は免疫原が予め生成した沈澱剤に吸着するか、または沈澱時に捕捉される。有効なアジュバントに必要な第二の成分は、免疫系を非特異的に刺激する物質である。前記物質は、リンフォカインとして知られる一連の様々な可溶性ペプチド因子の産生を刺激する。次いで、リンフォカインは抗原処理細胞の活性を直接刺激し、注射部位において局所的炎症反応を惹起する。リピドＡとして知られるリポ多糖成分が通常用いられる。リピドＡは、リポ多糖よりはるかに毒性の低い幾つかの合成形態及び天然形態で入手可能であるが、その場合にもなおリポ多糖分子の望ましいアジュバント特性のほとんどを保持する。リピドＡ化合物はしばしばリポソームを用いて送達される。非特異的刺激因子としてアジュバント中に通常用いられる細菌に、百日咳菌及び結核菌の２種が有る。これらの細菌は、全菌体として用いる場合は使用前に熱で殺さなければならない。百日咳菌の免疫調節媒介因子には、リポ多糖成分及び百日咳菌毒素が含まれる。百日咳菌毒素は既に精製され、市販されている。結核菌は通常、完全フロイントアジュバント中に見出される。結核菌の最も活性な成分は、幾つかの形態で入手可能なムラミルジペプチドであることが確認されている。免疫（接種及び追加免疫注射）免疫するべき被検者は、受容し得る（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）免疫系を有する任意の哺乳動物とし得る。哺乳動物被検者の例には、ヒト及び家畜（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）、並びに実験用または他の用途用の動物（例えばマウス、ラット、ウサギ等）が含まれる。最初の免疫での適正な用量を決定する際には、二つの異なる基準を考慮することが重要である。第一の基準は最強の応答を達成するための最適の用量であり、第二の基準は有用なポリクローナル抗体の産生を誘導すると考えられる最少の用量である。注射した物質の多くは、適当な標的免疫細胞に到達する前に異化され、清浄化される。この過程の効率は、ホスト因子（ｈｏｓｔｆａｃｔｏｒｓ）、注射経路、アジュバントの使用、及び注射する表面タンパク質固有の特性に応じて様々となる。即ち、免疫系に送達される有効用量は、導入量に対して僅かな関連性しか有しない恐れが有り、従って必要な用量は経験的に決定しなければならない。このような決定は当業者には容易に可能である。二次注射及び追加免疫は初回注射と同様の量でか、またはより少ない量で行ない得る。注射経路は、１）どれほどの量を送達しなければならないか、２）免疫原と共にどんな緩衝液及び他の成分を注射するか、並びに３）どれほど急速に免疫原をリンパ系または循環系内へ放出するべきか、という三つの実際的な決定によって定まる。例えば、ウサギでは大量の注射液は通常多数の皮下部位に投与する。マウスでは、大量投与は腹腔内注射でのみ可能である。注射液がアジュバントまたは粒状物質を含有する場合は、免疫原を静脈内送達するべきでない。接種材料の徐放を望む場合は、筋肉内注射または皮内注射を行なうべきである。即時放出のためには静脈内注射を用いる。一次抗体応答は、特に抗原が溶解性で容易に異化される場合はしばしば非常に弱い。そこで、最初の免疫後に二次もしくは追加注射が必要となる。初回抗原刺激を受けた被検者にタンパク質を再導入する前には間隔を置かなければならない。２週間または３週間の最短間隔が推奨されるが、より長い間隔を置くことも可能である。二次以降の注射に対する抗体応答ははるかに強くなる。抗体の力価が大きくなるが、更に重要なことには、血清中に存在する抗体の性質及び量が変化する。この変化によって高親和性抗体がもたらされる。二次、三次、及びそれ以降の注射相互の間隔は様々に設定し得るが、普通は、抗体の循環レベルが十分に低下して新たに注射された抗原の急激な清浄化を防止することが可能となるような長さに設定しなければならない。避妊の継続のためには、減少した循環抗体が次の追加刺激注射によって増加することが必要である。二次以降の注射相互の実際の間隔は種によって異なる。しかし、この間隔は当業者には、精子表面タンパク質抗体の血清中レベルを監視することによって決定可能である。別の実施態様では、精子表面タンパク質に対するアロ抗血清またはモノクローナル抗体を被検者に投与することによって避妊を達成し得る。アロ抗血清は、同じ種の別の個体において生成させてその個体の血清から単離し、受容被検者への注射に適したキャリヤ中に加えて調製する。投与用のモノクローナル抗体を調製及び配合する方法は、当業者には良く知られている。精子に対する天然抗体が女性の不妊を惹起することには有力な証拠が有る（Ｒ．Ａ．Ｂｒｏｎｓｏｎ等，ＦｅｒｔｉｌｉｔｙａｎｄＳｔｅｒｉｌｉｔｙ４２，ｐｐ．１７１−１８３，１９８４）。上記不妊は血清と相関するよりも、頸管粘液中の抗体力価と相関する（Ｇ．Ｎ．Ｃｌａｒｋ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，ｐｐ．１７９−１８１，１９８４）。不妊女性の頸管粘液中には抗精子抗体が存在し、その結果精子は頸管粘液を通過して浸透しにくくなり、かつ凝集し、それによって受精に有効な精子の数が減少する。即ち、避妊ワクチンの成否は特に、雌性生殖路（ｔｒａｃｔ）内での抗精子抗体の力価の維持を含めた粘膜性免疫応答の誘起に依存する。通常、抗原の局所適用は当該粘膜による抗体応答を刺激する有効な一手段である（Ｊ．Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，ｐｐ．２６５ −２７６，１９８７）。しかし、雌性生殖路においては局所的な粘膜性免疫は、内腔上皮の遮蔽機能と生殖路内腔からの抗原の急激な消失とに起因して無効である。粘膜性免疫応答の誘起では、粘膜表面上での抗原の安定性及び付着性が重要となる（Ｈ．Ｊ．ｄｅＡｉｚｐｕｒｕａ及びＧ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ− Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７，ｐ．４４０，１９８８）。付着性抗原は、それ自体が有効な粘膜性免疫原であることからのみでなく、他の抗原のための担体タンパク質であることからも、粘膜性免疫の成功にとって重要である。コレラ毒素は、粘膜に適用した場合に有効な免疫原であるが、他の抗原と組み合わせて適用するとアジュバントとして作用する（Ｓ．Ｊ．ＭｃＫｅｎｚｉｅ及びＪ．Ａ．Ｈａｌｓｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，ｐ．１８１８，１９８４）。有効な免疫は、粘膜表面上での抗原の安定性にも依存する。粘膜ワクチン中に用いられる多くの抗原はさほど免疫原性でなく、なぜならそれらの抗原は粘膜表面の酸性及びタンパク質分解条件下では生存し得ないからである（Ｄ．Ｔ．Ｏ ’Ｈａｇｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３，ｐ．３９３，１９９０）。ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＤＬ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ− ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ；ＤＬ−ＰＬＧ）微小球、即ち微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）担体系は粘膜性免疫に最適の系の一つである。ＤＬ−ＰＬＧ微小球は粘膜表面において抗原を保護し、また粘膜リンパ組織に取り込まれてそこで粘膜性免疫を誘導する（Ｊ．Ｈ．Ｅｌｄｒｉｄｇｅ等，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，ｐ．５９，１９８９）。リポソーム、及び不活性化された微生物も微小粒子担体として用いられる。Ａｖｒｉｄｉｎｅなどの幾つかの非経口アジュバント、リポイドアミン、及び完全フロイントアジュバント中のミコバクテリアの活性成分であるムラミルジペプチド（ＭＤＰ）も、経口粘膜アジュバントとして活性であり、粘膜性免疫を促進することが判明している（Ａ．Ｏ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＪ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌ．Ｓｏｃ．２６（ｓｕｐｐｌ．），ｐ．６６７，１９７９；Ｍ．Ａ．Ｔａｕｂｍａｎ等，Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．４０９，ｐ．６３７，１９８３）。雌性生殖路における粘膜性免疫応答の誘起は、様々なアジュバントや微小粒子担体の使用、粘膜表面の局所もしくは遠隔免疫、または非経口免疫と粘膜性免疫との組み合わせによって最適化できる。精子と卵との相互作用及び受精を途絶させる小型分子の同定へのＰＨ３０βの使用マウスとヒトとのいずれのＰＨ３０β鎖遺伝子がコードするタンパク質もヘビ毒中に見出される、ディスインテグリンと呼称される一群のタンパク質に対して有意の配列相同性を有することが比較によって判明している。ディスインテグリンはインテグリンと呼称される一群の細胞表面分子と結合し、それによって細胞接着における前記分子の正常な機能を妨げることが知られている。上記相同性に依拠すれば、卵母細胞上のＰＨ３０受容体はインテグリンであると結論することが至当である。モルモット、マウス及びヒトのＰＨ３０β鎖遺伝子のディスインテグリンドメイン配列を比較すると、その推定リガンド結合ドメイン配列に有意の相違が認められる。特に、この領域の配列は他のディスインテグリンのものとも、上記三つの種の間でも相違している。組み換えマウス及びヒトＰＨ３０βタンパク質を用いて親和性樹脂（ａｆｆｉｎｉｔｙｒｅｓｉｎｓ）を製造し、それによってマウス及びヒトＰＨ３０受容体を精製し、同定し、かつその特性を解明する。組み換えＰＨ３０βは、他の組織において発現された他のインテグリンに対するその相対親和性の測定にも、またＰＨ３０受容体のクローニングのためのリガンドとしても用いることができる。ＰＨ３０βのインテグリン認識配列は種特異的であるので、種特異的に受精を途絶させる小型分子の同定には配列情報が必要である。ＰＨ３０受容体に対し拮抗物質として作用してＰＨ３０結合を途絶させるか、または作用物質として作用して、膜貫通信号発生、卵制御顆粒放出、及び透明帯（ｚｏｎａ）反応を誘導するＰＨ３０受容体を刺激し、それによって卵を受精のための侵入不能（ｉｍｐｅｎｅｔｒａｂｌｅ）とする小型分子を同定する選別手段を、組み換えマウス及びヒトＰＨ３０βを用いて創出する。本発明を、以下の実施例において更に詳述する。実施例１マウス及びヒトＰＨ３０βをコードするＤＮＡの単離Ａ．ｃＤＮＡライブラリー平板培養 λｇｔ１１中のヒト睾丸ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）と、ＵＮＩ−ＺＡＰＸＲを用いたマウス睾丸ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）との両方から得た１００万個の独立組み換えバクテリオファージを平板培養した。プレート上にニトロセルロースフィルターを２分間置き、このフィルターを変性溶液（０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ）、中和緩衝液（ｐＨ７．５の０．５Ｍトリス、１．５ＭＮａＣｌ）及び２×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０の０．３５Ｍクエン酸ナトリウム）で各２分間処理することによってプラークを二重に写し取った。フィルターを室温で３０分間乾燥し、その後真空オーブン内で８０℃で２時間ベークした。Ｂ．プローブの作製モルモットＰＨ３０β ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）によって、９４％のコーディング配列を含む１０２０ｂｐ（塩基対）のＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ断片として単離した。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）中へサブクローン化し、配列解析によって確認した。精製した１０２０ｂｐモルモットＰＨ３０β断片のニックトランスレーションによってプローブを作製した。上記フィルターを、１０⁶ｃｐｍ（１分当たりの計数）／ｍｌの標識プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液（ｐＨ７．５の７ｍＭトリス、４０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ、０．８×Ｄｅｎｈａｒｄ液、２０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％硫酸デキストラン）中で４２℃で１５時間精査（ｐｒｏｂｅ）した。フィルターを室温で１５分掛けて２回、いずれも２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で洗浄し、その後室温で２回０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄し、次いで４２℃で３０分掛けて１回、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。このフィルターに対してＸＡＲフィルム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋＣｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を１５時間露光した。陽性プラークを１ｍｌのＳＭ（０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、２％ゼラチン、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス）中に取り、再び上述のようにスクリーニングした。４ラウンドのスクリーニング後、精製したプラークを得た。マウス睾丸ライブラリーの精製プラークを、ＥＸＡＳＳＩＴヘルパーファージ及びＳＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺ベクター中へサブクローン化した。ヒト睾丸ライブラリーの精製プラーク由来のＤＮＡを、軽量（ｌｉｇｈｔ）ＰＬＧ管を用い、かつ製造元（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）の指示に従って単離した。次に、単離したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺中に連結し、これを用いてコンピテントな大腸菌株ＨＢ１０１細胞を形質転換した。Ｃ．ＤＮＡ配列決定及び解析クローン化した挿入部分の両鎖を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を用いて配列決定した。ＦＡＳＴＡプログラム（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ）を用いてＧｅｎｅＢａｎｋ及びＥＭＢＬＤＮＡ配列データベースを検索することによって配列を解析し、ＧＡＰプログラムを用いて配列比較を行なった。Ｄ．ｃＤＮＡクローンの特性解明マウス睾丸ライブラリーを１０２０ｂｐモルモットＰＨ３０βプローブでスクリーニングして、１．７ｋｂ（キロ塩基対）のｃＤＮＡクローンを単離した。このｃＤＮＡクローンは１３７１ヌクレオチドの読み取り枠と、３２９ヌクレオチドの３′非翻訳領域とを有する。モルモット及びマウスＰＨ３０βの成熟部分同士を比較したところ、マウスＰＨ３０βクローンはモルモットＰＨ３０βに対して、ヌクレオチドレベルで最高６３％の同等性を示した。４５７アミノ酸から成る推定アミノ酸配列のアミノ末端の１０３残基はマウスＰＨ３０βの、精子成熟時に切断される前駆体領域である。アミノ酸レベルでは、成熟マウスＰＨ３０βと成熟モルモットＰＨ３０βとは５４％同等であり、その際システインは総て同じ位置を占めた。ヒト睾丸ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、１９５９ヌクレオチドの読み取り枠と、３７２ヌクレオチドの３′非翻訳領域とを有する２．３３１ｋｂのｃＤＮＡを同定した。ヒトＰＨ３０βクローンはその読み取り枠において、マウス及びモルモットＰＨ３０β遺伝子それぞれに対して６３％及び６７％同等であった。６５３アミノ酸から成る派生（ｄｅｒｉｖｅｄ）アミノ酸配列と、マウス及びモルモットＰＨ３０βとの比較は、アミノ末端の２９９アミノ酸がヒトＰＨ３０βの前駆体であり、カルボキシ末端の３５４アミノ酸がヒトＰＨ３０βの成熟部分であることを示している。成熟ヒトＰＨ３０βのアミノ酸配列は成熟モルモット及びマウスＰＨ３０βタンパク質と５４％相同であった。マウス及びヒトＰＨ３０βをモルモットＰＨ３０βディスインテグリン及びヘビ毒ディスインテグリンとタンパク質配列比較したところ、有意の相同性が示された。この解析によって構造的構成（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の類似性が明らかとなり、またマウス及びヒトＰＨ３０β中にメタロプロテアーゼドメイン及びディスインテグリンドメインが存在することが示された。マウス及びヒトＰＨ３０βのメタロプロテアーゼドメインは、モルモットＰＨ３０βのメタロプロテアーゼドメインに対しては有意の類似性を有したが、モルモットＰＨ３０αディスインテグリンまたは他のディスインテグリンのメタロプロテアーゼドメインに対してはさほどの類似性は有しなかった。亜鉛依存性メタロプロテアーゼの活性部位特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列は、ＰＨ３０αディスインテグリン及びヘビ毒ディスインテグリン、Ｊａｒａｒｈａｇｉｎ並びにＴｒｉｇｒａｍｉｎに存在する（Ｔ．Ｇ．Ｗｏｌｆｓｂｅｒｇ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，ｐｐ．１０７８３−１０７９７，１９９３）。モルモットＰＨ３０βと同様に、マウス及びヒトメタロプロテアーゼドメインは活性部位特徴配列を欠き、これらのドメインはいずれもモルモットＰＨ３０βメタロプロテアーゼ活性部位配列に対しては８０％同等であったが、モルモットＰＨ３０αメタロプロテアーゼ活性部位配列に対しては３０％しか同等でなかった。ヒトＰＨ３０βメタロプロテアーゼドメインとモルモットＰＨ３０βメタロプロテアーゼドメインとは６０％同等であった。モルモットＰＨ３０βと同様に、マウス及びヒトＰＨ３０βもディスインテグリンドメインを有する。マウスＰＨ３０βのディスインテグリンドメインは９１アミノ酸（残基１１１〜２０２）から成り、ヒトＰＨ３０βのディスインテグリンドメインは９３アミノ酸（残基２９９〜３９２）から成る。ヘビ毒のほとんどのディスインテグリンは、共通のインテグリン結合配列ＲＧＤを有する。カルボキシル末端のシステインに富むドメインに連結する、別に一群を成すヘビ毒ディスインテグリンはＲＧＤトリペプチドを欠くが、ユニークなトリペプチドと隣接システインとを有する。モルモット、マウス及びヒトＰＨ３０βタンパク質もＲＧＤトリペプチドを有せず、上記後者のディスインテグリン群の方により類似する。上記後者のヘビ毒ディスインテグリン、並びにモルモット、マウス及びヒトＰＨ３０βのディスインテグリンドメインはトリペプチド配列のカルボキシル末端に、負に荷電された残基を有する。モルモットＰＨ３０βインテグリン結合配列はＴＤＥである。当業者は、他の哺乳動物種のＰＨ３０βのインテグリン結合部位もＴＤＥであろうと考えていた。しかし、ヒト及びマウスのＰＨ３０βを単離したところ、そうではないことが判明した。意外にも、本発明者はインテグリン結合部位の重要な配列が保存されないことを発見した。モルモット、マウス及びヒトＰＨ３０βディスインテグリンドメインの比較によって、これらのドメインの推定インテグリン結合配列はそのカルボキシル末端は同じであるものの有意に変化していることが明らかとなった。ＰＨ３０βの推定インテグリン結合残基はマウスではＱＤＥ、ヒトではＦＥＥであった。インテグリン結合配列が種間でこのように相違することは意外な、驚くべき発見であった。マウス及びヒトのＰＨ３０βはいずれも、モルモットＰＨ３０βの類似領域と６０％同等である表皮成長因子様反復部分及び膜貫通ドメインを有する。実施例２マウス及びヒトＰＨ３０βの５′末端のクローニングマウス及びヒトＰＨ３０βの５′末端を、ＧｉｂｃｏＢＲＬの「ｃＤＮＡ末端急速増幅用５′ＲＡＣＥシステム」を用い、かつ製造元のプロトコルに従ってクローン化した。各鋳型に関して二つのオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴ１はアンチセンスプライマーであり、オリゴ２もアンチセンスプライマーで、オリゴ１の内側に存在し、５′末端にクローニングを容易にするＣＡＵ配列を有した。オリゴ１をマウスまたはヒト睾丸ｍＲＮＡにアニールし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ II逆転写酵素を用いてｃＤＮＡコピーを作製した。ｍＲＮＡ鋳型をＲＮアーゼＨで分解した。一本鎖ｃＤＮＡコピーをＧｌａｓｓＭＡＸＳｐｉｎカラムで精製し、その後ｄＣＴＰ及びターミナルトランスフェラーゼで３′末端にテイリングした。テイリングしたｃＤＮＡコピーを、５′ＣＡＵクローニング部位を有する提供されたアンカープライマー、及びオリゴ２を用いて増幅した。増幅系はＴａｑポリメラーゼとした。次に、増幅生成物をゲル精製し、ＵｒａｃｉｌＤＮＡＧｌｙｃｏｓｙｌａｓｅで処理し、ベクターｐＡＭＰ１中へサブクローン化し、これをコンピテントな大腸菌ＤＨ５細胞の形質転換に用いた。サブクローン化された断片を有するコロニーを同定し、該コロニーを先に述べたように配列決定した。完全長のマウスｃＤＮＡ配列、及びマウスＰＨ３０βタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号５及び６に示す。完全長のヒトｃＤＮＡ配列、及びヒトＰＨ３０βタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号７及び８に示す。ヌクレオチドレベルにおいて、完全長のヒトＰＨ３０βはマウスＰＨ３０βとは６８％、モルモットＰＨ３０βとは６８．６％同等である。マウスのＤＮＡ配列とモルモットのＤＮＡ配列とは６５．５％同等である。ヒトＰＨ３０βのアミノ酸配列は、マウスＰＨ３０βとは５８．９％、モルモットＰＨ３０βとは５６．５％同等である。アミノ酸レベルにおいて、マウスＰＨ３０βとモルモットＰＨ３０βとは５５．２％同等である。実施例３ＰＨ３０βタンパク質の投与による避妊ワクチン投与雌または雄のマウス（１回目の注射の時点で約７週齢）に下記量のＰＨ３０β を２回注射する。ｍＡｂ−アフィニティークロマトグラフィーまたは生化学的方法によって細胞系または精子から精製した組み換えまたは天然ＰＨ３０βは、ＳＤＳゲル上での精製タンパク質の銀染色を用いて測定すると９０％以上の純度を示す（即ち、検出可能な汚染物質が１０％以下しか存在しない）。雌または雄の免疫に用いる各ＰＨ３０調製物の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動及び銀染色によって確認する。アフィニティー精製したＰＨ３０βを、３ｍＭのオクチグルコシド（ＯＧ）を含有する０．３７５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に加え、これを０．３７５ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化する。各動物に、０．１ｍｌの乳濁液を背中から皮下投与し、かつ０．０５ｍｌを後肢から筋肉内投与する。約３週間後、ＰＢＳ及び３ｍＭＯＧ中の同量のＰＨ３０βを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化し、これを各動物の同一部位に注射する。対照の雌及び雄には、ＰＢＳ及び３ｍＭＯＧ並びにＣＦＡまたはＩＦＡは含有するがＰＨ３０βは含有しない注射液を同一日程で同様に注射する。注射した雌を交尾させるべく、最初の注射の約６週間後に前記雌を１０日間雄と一緒にする。各ケージに１匹の雄（１３週齢）と、１匹のＰＨ３０β免疫雌と、２〜４匹の対照注射雌とを入れる。グループ化の２４時間後から毎日、雌を膣栓に関して目視検査する。交尾開始の２週間後、雌を取り出して個別ケージに入れる。３週間後、同腹仔及び子孫を有する（ｈａｖｉｎｇｌｉｔｔｅｒｓａｎｄｐｒｏｇｅｎｙ）妊娠雌を計数する。注射した雄を交尾させるためには、最初の注射の約６週間後、注射した雄１匹ずつを２匹の雌（１０〜１３週齢）と１０日間一緒にする。その後、雌と雄とを分離し、更に３週間経過後膣栓を計数する。実施例４卵形質膜への精子融合の阻害薬としてのＰＨ３０ディスインテグリンペプチドの使用ＰＨ３０βディスインテグリンドメイン由来のペプチドを、卵形質膜への精子結合の抑制について試験する。融合抑制アッセイを次のように行なう。幼若な雌のマウス（８〜１０週齢）に、０．９％ＮａＣｌ中の５単位の妊馬血清（ＰＭＳ）を腹腔内注射する。４８時間後、マウスに０．９％ＮａＣｌ中の５単位のｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）をＩＰ注射して過剰排卵を惹起する。ｈＣＧ注射の１４〜１６時間後、排卵された卵母細胞を回収し、ヒアルロニダーゼで処理して卵丘（ｃｕｍｕｌｕｓ）細胞を除去する。プロテアーゼ混合物で透明帯を除去する。透明帯を除去した卵を培地中で、特定濃度のペプチドと共に３０分間インキュベートする（Ｂ．Ｈｏｇａｎ等，“ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇＴｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，”ｐｐ．９１−１０１，１９８６）。雄のマウスの副睾丸から採集した精子をインキュベーションによって授精可能とし（ｃａｐａｃｉｔａｔｅ）、Ｆｌｅｍｉｎｇ及びＹａｎａｇｉｍａｃｈｉが述べている（ＧａｍｅｔｅＲｅｓ．４，ｐｐ．２５３−２７３，１９８１）ように先体反応させ、これを卵に添加して１５分間インキュベートする。次に、卵を無精子培地に移して更に１時間４５分インキュベートする。その後、卵を、Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ等が述べている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４，ｐ．１４１，１９８７）ように固定して染色する。腫脹した精子頭部の総数を数える。腫脹した精子頭部は、精子と卵とが融合したことの指標である。上記のような観察に基づき、幾つかの指数が計算される。受精指数（Ｆ．Ｉ．）は腫脹頭部の総数を卵の総数で除算して算定する。受精率（Ｆ．Ｒ．）は受精した卵の比率（％）である。抑制率（％）は、実験ペプチドの受精指数を対照ペプチドの受精指数で除算して算定する。ＰＨ３０βディスインテグリンドメインは、精子と卵との融合において重要であるエピトープである。このエピトープに特異的に結合する抗体は精子と卵との融合を阻止する。実施例５精子と卵との相互作用及び受精を途絶させる小型分子の同定へのＰＨ３０βの使用Ａ．ＰＨ３０β受容体拮抗物質の同定ＰＨ３０が卵上のその受容体に結合するのを特異的に妨害する化合物の同定は、十分な量のＰＨ３０タンパタ質及び正常なヒト卵が使用可能でなかったために制限されてきた。ｒＰＨ３０βの使用可能性は、ＰＨ３０β受容体インテグリンｃＤＮＡの同定及びクローニングを容易にする。前記ＰＨ３０β受容体ｃＤＮＡを用いて組み換えＰＨ３０β受容体を生成させる。ＰＨ３０β受容体の代替源は、ＰＨ３０βのその受容体への結合に影響する物質の同定を容易にする。通常の方法を用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞を、ＰＨ３０β受容体をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトし、それによってヒトＰＨ３０β受容体インテグリンを大量に発現させる安定な形質転換細胞を生産する。このような形質転換細胞は安定した組み換えＰＨ３０β受容体源を提供し、ＰＨ３０βのその受容体への結合の特性解明に、またＰＨ３０のその受容体への結合を抑制する化合物をスクリーニングするアッセイの確立に有用である。ＰＨ３０β受容体に対する化合物の選択性を、同じβサブユニットと、近縁の α鎖とを有する他のインテグリン受容体を発現させる細胞系を用いることによって調べる。ＰＨ３０βとその受容体との相互作用を特異的に抑制する化合物を、精子−卵融合抑制アッセイ及び卵皮質（ｅｇｇｃｏｒｔｉｃａｌ）顆粒放出アッセイのような生物学的アッセイにおいて更に試験して、その受精抑制効力を測定する。Ｂ．ＰＨ３０β拮抗物質スクリーニングプロトコルＰＨ３０β受容体を発現させる細胞を抽出緩衝液（ｐＨ７．６の５０ｍＭトリス、１００ｍＭｎ−オタチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ₂及び１ｍＭＣａＣｌ₂）で処理し、溶解性物質を遠心によって分離し、−８０℃で冷凍貯蔵する。アッセイ管に１５μｌの水、８０μｌのアッセイ緩衝液（ｐＨ７．６の１２５ｍＭトリス、１８７．５ｍＭＮａＣｌ、１．２５ｍＭＣａＣｌ₂、１．２５ｍＭＭｇＣｌ₂及び１．２５％ＢＳＡ）及び５μｌの試料化合物または対照（４０μＭの冷ＰＨ３０β）を入れ、５０μｌの¹²⁵Ｉ−ＰＨ３０β（最終濃度４０ｐＭ）及び５０ μｌの細胞抽出物（最終タンパク質濃度２５０μｇ／ｍｌ）と混合する。管を室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、試料を、ＴｏｍｔｅｃＭａｃｈ II−６ｘ１６細胞回収器及び印刷フィルターマットｃａｔ．＃１２０５−４０４を用いて回収する。フィルターを乾燥し、ＬＫＢ／Ｗａｌｌａｃ β Ｐｌａｔｅカウンターで計数する。計算及び解釈：抑制率（％）＝［（ＣＰＭ平均総結合数−ＣＰＭ平均試料数）／（ＣＰＭ平均総結合数−ＣＰＭ平均陽性対照数）］×１００抑制率が６０％を上回り、かつその抑制率が用量に関連する場合、当該試料を活性と看做す。Ｃ．精子−卵母細胞融合アッセイ幼若な雌のマウス（約８〜１０週齢）に、０．９％ＮａＣｌ中の５単位の妊馬血清（ＰＭＳ）を腹腔内注射する。４８時間後、マウスに０．９％ＮａＣｌ中の５単位のｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）をＩＰ注射して過剰排卵を惹起する。ｈＣＧ注射の１４〜１６時間後、排卵された卵母細胞を回収し、ヒアルロニダーゼで処理して卵丘細胞を除去する。卵を０．１ｍｇ／ｍｌのキモトリプシンで短時間処理することによって透明帯を除去する。卵母細胞をＨｅｐｅｓ緩衝培地で洗浄し、これに蛍光染料の４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を、３７℃で３０分間インキュベートすることによって保持させた。次に、卵母細胞を培地で洗浄してｒＰＨ３０βまたは阻害薬化合物と共に３０分間インキュベートし、その後更に３０分間、カルシウムイオノフォアと共にインキュベートすることによって予め授精可能とした１×１０⁴個の精子と共にインキュベートする。インキュベーション後、卵母細胞を洗浄し、固定し、これを光学顕微鏡で検査し、細胞質中に存在する、関連する尾部を伴った蛍光腫脹精子頭部について評価する。受精率＝（融合した卵の数／試験した卵の数）×１００（結果は受精のパーセンテージで表わす）いかなる阻害薬も存在しないと、９０％を越える卵母細胞が受精する。精子− 卵母細胞融合が６０％を越える比率で抑制され、かつこの抑制が用量に関連する場合、当該化合物を活性と看做す。本発明を、その幾つかの好ましい具体例を参照して説明及び例示したが、前記具体例の様々な変更、変形及び置き換えが本発明の思想及び範囲を逸脱することなく可能であることは、当業者には理解されよう。従って、本発明は後出の請求の範囲によってのみ限定されるものとし、その際請求の範囲は合理性が保たれるかぎりは広く解釈されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者グプタ，サニル・ケーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ホリス，グレゴリー・フランクリンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質、マウスＰＨ３０β鎖タンパク質、及びヒトまたはマウスＰＨ３０β鎖タンパク質と実質的に相同のアミノ酸配列の中から選択された、実質的に純粋な形態の精子タンパク質。２．ＴＤＥでないインテグリン結合配列を有することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。３．インテグリン結合配列がＦＥＥ及びＱＤＥの中から選択されることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。４．ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。５．インテグリン結合配列を有し、該配列がＦＥＥであることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。６．請求項１に記載の精子タンパク質、または該精子タンパク質の、少なくとも１個のエピトープの構成に十分な部分、をコードするＤＮＡ配列。７．前記エピトープが天然タンパク質に存在することを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ配列。８．ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質の全体または一部をコードすることを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ配列。９．ヒトＰＨ３０βタンパク質の全体または一部をコードするＤＮＡが配列番号１に示したＤＮＡ配列と標準的条件下にハイブリダイズする能力によって特徴付けられることを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ配列。１０．治療有効量の請求項１に記載のタンパク質、または該タンパク質のセグメントと実質的に同じアミノ酸配列を有する、少なくとも１個のエピトープの構成に十分なポリペプチドと、医薬に許容可能なキャリヤとを含有する避妊薬組成物。１１．前記エピトープが天然タンパク質に存在することを特徴とする請求項１０に記載の組成物。１２．タンパク質がヒトＰＨ３０β鎖タンパク質であることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。１３．タンパク質が組み換えＤＮＡ発現ベクターに組み込まれた、精子タンパク質の免疫原エピトープをコードする遺伝子の発現によって生産されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。１４．請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入されたベクター。１５．挿入されたＤＮＡ配列が配列番号１及び３のＤＮＡ配列の中から選択されたＤＮＡ配列と標準的条件下にハイブリダイスする能力によって特徴付けられることを特徴とする請求項１４に記載のベクター。１６．請求項１４に記載のベクターと相容性である、前記ベクターを保有する宿主。１７．ヒトまたはマウスＰＨ３０β鎖精子タンパタ質を製造する方法であって、請求項６に記載のＤＮＡを有する細胞を培養するステップ、及び細胞培養物から前記精子タンパク質を回収するステップを含む方法。１８．ＰＨ３０β鎖タンパク質の全体または一部をコードするＤＮＡが配列番号１及び３のＤＮＡ配列の中から選択されたＤＮＡ配列と標準的条件下にハイブリダイズする能力によって特徴付けられることを特徴とする請求項１７に記載の方法。１９．避妊を必要とするヒトまたはマウス被検者を避妊させる方法であって、前記被検者に請求項１に記載の精子タンパク質を、該精子タンパク質にｉｎｖｉｖｏで結合する抗体の刺激に有効な量で投与することを含む方法。２０．精子タンパク質がＴＤＥでないインテグリン結合配列を有することを特徴とする請求項１９に記載の方法。２１．請求項１７に記載の方法で製造したＰＨ３０β鎖タンパク質。２２．ヒトＰＨ３０β鎖タンパク質をコードする、配列番号１に示したＤＮＡ配列。２３．実質的にポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から成る精製及び単離されたＤＮＡ配列であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列がヒトまたはマウスＰＨ３０βのアミノ酸配列に対して、精子−卵結合を開始させ、または精子−卵融合を促進する生物学的特性の保有を可能にする十分な重複性を有することを特徴とするＤＮＡ配列。２４．ポリペプチドのアミノ酸配列がＴＤＥでないインテグリン結合配列を含むことを特徴とする請求項２３に記載のＤＮＡ配列。