JP2935846B2 - 不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用 - Google Patents

不妊と避妊のための透明帯抗原と抗体の調製法及び使用

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Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、個体（individuals）の避妊又は不妊のた
めの透明帯（ZP）抗原及びモノ（単）クローン抗体につ
いての製法及び使用に関する。本発明は免疫学的避妊に
も関する。より具体的には、本発明は、組換えDNA技術
によって作られた透明帯（zona pellucida）抗原を用い
て避妊しないように個体に自働的又は活性的（activel
y）免疫を与え、又は透明帯抗原に抗する又は反する作
用を行なうようにモノクローン抗体を作り個体に受動的
（passively）免疫を与える免疫学的避妊に関する。更
に、本発明はZP抗原に擬態（mimic）する抗遺伝型又は
反遺伝型（anti−idiotype）のモノクローン抗体を用い
て、妊娠しないように個体に自働免疫を与える技術に関
する。
本発明は、更に又、透明帯抗体に反する作用又は抗す
る作用をする、モノクローンの抗透明帯抗体又は反透明
帯抗体（anti−zona pellucide antibody）、かかる抗
体をエクスプレス（express）する新規なハイブリドー
マ細胞、並びにかかるハイブリッド細胞（交雑細胞）及
び反透明帯抗体（抗透明帯抗体）を作る方法に関する。
［背景技術の簡単な説明］ 透明帯の細胞外の複合的な糖タンパク質基質であっ
て、哺乳動物の卵母細胞を取り囲んでいる。この基質
は、卵母細胞の成長初期段階、及び卵胞（濾胞）の細胞
分化の初期段階で形成され、子宮壁に着床するまでの
間、卵母細胞及び胎児を保護する役割を果たす（Cambri
dge Univ.Press、ケンブリッジ、英国（1982）、オース
チン他、「哺乳類の生殖：生殖細胞と受精」）。更に、
受精は精子が最初に透明帯に固着し透明帯に侵入するの
であるから、透明帯は受精過程で重要な役割を果たす。
卵母細胞の透明帯に結合した後、精子は透明帯に侵入し
なければならない。精子が透明帯へ侵入できるのは、お
そらく、アクロシンのような精子酵素によって、透明帯
要素が限定された範囲で加水分解されるためと考えられ
る（Ann.Rev.Biochem.43:777（1974）、マクローリー
他;Biol.Reprod.32:619（1985）、ダンバー他）;Gam.Re
s.1:65,1978、スタンバウ）。透明帯は、受精した後、
無傷状態が維持されるため、胎児がうまく成育し、卵管
中で胎児の融合が防止される（Science 138:594,1962、
ミンツ）。
最後に、透明帯は多数の精子が受精するのを阻止する
役割を果たす。哺乳類の中には、受精すると、透明帯に
結合する精子を変質させ、タンパク質分解消化に抵抗す
るものもある（J.Exp.Biol.33:358,1956、オースチン及
びブレイドン）。
人間に近い霊長類及び人間を含むその他の種（sepcie
s）と比べて、齧歯類の透明帯の場合、その特性は、主
として生物学的、形態学的、生理学的及び免疫化学的に
変わる。これについては、Academic Press,pp.139（198
3）ニューヨーク，ダンバー「受精のメカニズムのコン
トロール（J.Hartmann,ed.）」;Oxford Univ.Press,pp.
505（1983）、ロンドン、ダンバー「生殖免疫における
国際会議（Wegmann and Gill III,eds.）」;Modern Cel
l Biology 3（Satir,ed.）Alan R.Liss,pp.77（198
4）、ニューヨーク、ダンバー他、等を参照することが
できる。哺乳類の透明帯は、主要な糖タンパク質が、限
られた数から構成されるけれども（Dev.Biol.76:185（1
980）、ブレイル他;Biol.Reprod.24:1111（1981），ダ
ンバー他;Biol.Reprod.（1987）ティモンス及びダンバ
ー）、種が異なれば、透明帯の構造的及び機能的な関係
は変動する。
精子による卵母細胞の受精を抑制したり、受精卵の着
床を防止したり、又は卵巣の発育を防止するワクチンを
作り出すのに必要な抗原及び抗体を相当量作るための材
料（物質）が十分でないため、免疫避妊を有効にしかも
経済的に行なうことはできなかった。初期の免疫避妊法
は、ほとんどうまく行かなかった。この方法は、絨毛性
生殖腺刺激ホルモン（hCG）や濾胞成熟ホルモンのよう
に自然発生の循環ペプチドを使用していた（Plenum Pre
ss（G.P.Talwan）,1986 ニューヨーク、グリフィン
「避妊の免疫考察及び受精率の促進」）。通常、免疫避
妊において「循環（circulating）」抗原に抵抗する抗
体を用いると、免疫複合体が組織を損傷するという好ま
しくない問題が生じる。さらに、「循環」抗原を用いて
免疫を与えても、受精抑制効果があまりないこともわか
った。
免疫学をベースにした避妊方法は、一般的に利用され
ている外科的不妊法又は受胎調節ピル（人間及びペット
の場合）よりも望ましい。ピルの場合、一定間隔で購入
し服用せねばならないため、薬代に絶えずコストがかか
り、また、その効果もほんの一時的なものにすぎない。
このため、安全で、信頼性が高く、しかも経済的にも安
価に提供され、一時的又は永久的に個体の避妊を行なえ
る抗原が要請されている。
［発明の概要］ 本発明者は、免疫学的に不妊又は避妊させるために、
清浄化又は純化（purified）された透明帯抗原を用いる
ことに着目した。透明帯抗原を用いて免疫性を与えるこ
とは、他の免疫学的避妊法よりも明らかに利点がある。
透明帯抗原による免疫は、だ胎作用によるのではなく、
受精を抑制するのである。この免疫避妊法は、人間にと
って特に好ましい。さらに、この方法は卵巣の濾胞の発
育を抑えて、永久的に不妊とするようにもできる。ペッ
トやその他動物をこのように永久的に不妊とする場合に
も、非外科的で行なうことができるので、これまでのよ
うな外科手術による危険性を伴ったり、費用がかかるこ
ともない。
透明帯のタンパク質免疫避妊におけるその他の利点と
して、数リットルの透明帯で受精を阻止できることが挙
げられる。これは、免疫避妊抗体の作用がその部位で局
部的に特有の性質を発揮すること、及び受精を阻止しよ
うとする個体中での透明帯タンパク質の自然発生量を限
定することによるものである。帯層抗原の組織特性に関
するこれまでの研究は、卵巣についてのものであり、抗
原は循環しない。これに対して、ホルモンタンパク質は
個体の中を循環して、はるかに高いレベルで生じる。ま
た、循環する抗原のレベルは個体の生理学的な状態によ
ってもおおいに変動する。
さらに、精子抗原の免疫避妊を有効ならしめるために
必要な精子抗原のレベルは、腟管及び子宮腔の精子量に
よって変化する。
種々の動物のZPタンパク質は、免疫学的に交叉反応性
（crossreactive）であるため、避妊させたい動物の免
疫抗原を発育させる必要性はない。
本発明の１つの目的は、免疫学的な方法で効果的に避
妊させる方法を提供することにある。この方法によれ
ば、１回（又は最少）の投与を行なうだけですむから、
医師（人間の場合）又は獣医（動物の場合）に絶えずか
かわる必要はなくなる。また、永久的に不妊又は去勢
（ペットの場合に望ましい）とすることもできるし、一
時的に不妊（人間や飼育ペットの場合に望ましい）とす
ることもできる。
また、免疫避妊に使用するための透明帯抗原及び抗体
の供給が限られていることが、従来法の不利な点の１つ
であった。これに対し、本発明は、免疫避妊を行なうた
めの透明帯抗原及び抗体は、組換えDNA技術によって作
られた透明帯抗原、モノクローン透明帯抗原及びZP反遺
伝型抗体のように、入手源がきわめて豊富である。抗原
及び抗体は、組換えDNA技術及びハイブリドーマ技術を
用いて多量に作ることができるため、コストが安いとい
う追加の利点がある。
本発明は抗原の調製、及び透明帯抗原中に見い出され
るエピトープの決定因子と反応する抗体を誘発（induc
e）させるために動物に免疫を与える方法に関する。本
発明は、さらにまた、モノクローンの反透明帯抗体、か
かる抗体をエクスプレスする新規なハイブリドーマ細
胞、並びにかかるハイブリッド細胞及び反透明帯抗体を
作る方法に関する。さらに、本発明は反遺伝型透明帯の
モノクローン抗体、及び該抗体の使用による自働又は活
性免疫避妊に関するものである。
個体の抗原（例えば、糖タンパク質（glycoprotei
n））は、多くの抗原決定因子、即ち「エピトープ」を
有していてもよく、この因子は抗体によって認識（reco
gnize）される。エピトープには、アミノ酸配列、炭水
化物残分、配座（conformational）又は「形状（shap
e）」の決定要素、或は２つの異なる分子又はペプチド
が相互作用する部位が含まれる。透明帯構造の糖タンパ
ク質には、これら種類の決定要素がすべて含まれる（Bi
o.Repro.30:445（1984），ドレルとダンバー:Biol.Repr
o.36:1275（1987），ティモス）。
本発明の第１の実施例では、組換えDNA技術を用いる
ことにより、透明帯タンパク質抗原のポリペプチド部を
含む抗原を作るものである。本発明のタンパク質の実施
例では、透明帯タンパク質のポリペプチド決定因子部を
含む抗原を、組換えDNA技術を用いて作るものである。
なお、これらの組換えポリペプチド、及びその同族体
（analogs）は、ここではこれらを総合的に、組換え透
明帯タンパク質と称するものとする。
「透明帯（zona pellucida）タンパク質」の用語に
は、天然的に自然発生する透明帯タンパク質、組換えに
よる透明帯タンパク質及びその同族体と、同じアミノ酸
配列をもったポリペプチドを含むものとする。「同族
体」という用語には、ポリペプチドが透明帯タンパク質
の抗原的及び生物学的活性が実質的に同じならば、１種
又は２種以上のアミノ酸の添加、削除又は置換による透
明帯タンパク質とは異なるタンパク質又はポリペプチド
を含むものとする。これらの同族体は、透明帯タンパク
質の選択された決定因子の部位を含んでいる。これらの
抗原剤を用いて、動物を免疫し、抗体を作ることができ
る。
本発明にあっては、本発明の抗原剤（抗原調製物）及
び免疫反応高揚要素を有する薬組成物も又、薬学的に適
当なキャリヤと共に、本発明に包含されるものである。
このように、一実施例において、本発明は、透明帯タン
パク質又はそのパーツのアミノ酸配列を含むほぼ純化さ
れたポリペプチド、透明帯タンパク質の暗号をもったDN
A配列を含むエクスプレッション運搬体（expression ve
hicles）、かかるエクスプレッション運搬体で改質した
宿主、宿主中に透明帯タンパク質を作る方法、及び透明
帯の組換えタンパク質を有する薬組成物で動物に免疫性
を与えることにより動物の体内に透明帯抗原に対する抗
体の生成を誘発する方法を包含するものである。
他の実施例において、本発明はモノクローンの反透明
帯抗体、かかる抗体をエクスプレスする新規なハイブリ
ドーマ細胞、及びかかるモノクローン抗体を用いて免疫
学的に避妊する方法を含むものである。
免疫性がもたらされたドナー（donors）からの骨髄腫
細胞と脾臓細胞を融合することにより、均質な（homoge
neous）抗体を得ることに成功した。このようにして、
遺伝学的に安定なハイブリドーマ細胞であって、悪性腫
瘍及び特異性ビールス及びそれらの抗原決定因子に抗す
るモノクローン抗体を大量に作ることができるハイブリ
ドーマ細胞の連続的な細胞系統（cell lines）を開発し
た。
コプロウスキー及びその他の物に付与された米国特許
第4172124号には、悪性腫瘍に特異性（specificity）を
示す抗体は、体細胞ハイブリッドによって、ヒポキサン
チン燐リボスチルトランスフェラーゼが欠乏する悪性腫
瘍と、先に腫瘍細胞が注入された動物から得た脾臓又は
リンパ細胞との間に作られることが記載されている。さ
らにまた、コプロウスキー及びその他の物に付与された
米国特許第4196265号には、遺伝学的に安定な融合細胞
ハイブリッドであって、特定のビールス及びそれらの抗
原決定因子に抗するモノクローン抗体を大量に作ること
ができるハイブリッドの連続的な細胞系統を作ることが
できることが記載されている。
このような細胞融合技術を用いることにより、反透明
帯抗体、例えば免疫避妊抗体を、安定して供給すること
ができ、信頼性も高い。
個体の免疫は活性的（自働的）又は受動的に行なうこ
とができる。「活性（自働）免疫」という用語は、抗原
又は免疫原（immunogen）が個体に投与され、個体の免
疫系統が抗原に抗する個体を作ることを意味する。免疫
抗原は、個体が抗体を作ることのできるものであればど
んな物質を用いることもできる。本発明にあっては、個
体を避妊又は不妊とするために、個体を自働免疫するた
めに有効な抗原には、グリコシル化（glycosylated）し
ているか否かに拘らず、組換えによって作られたZP抗原
（rZP）と、反遺伝型ZP抗体が含まれる。「受動免疫」
という用語は、個体の外部のインビトロで作られた抗体
が、免疫避妊のために個体に投与されることを意味す
る。本発明のZPモノクローン抗体は、個体に投与される
と、このような受動免疫を作り出す。
モノクローン抗体でZP抗原に受動免疫することによ
り、一時的（望ましくは数か月間）に不妊状態となる。
反ZPモノクローン抗体は、透明帯に結合又は侵入する精
子に干渉することにより、受精を抑制するもので、この
とき卵巣機能に悪影響を及ぼすことはない。このよう
に、本発明の免疫避妊方法は、透明帯抗原に反作用する
モノクローン抗体を投与することにより受動的に行なう
ことができるし、或いは組換えDNA技術により作られた
透明帯抗原又は反遺伝型モノクローン抗体を投与するこ
とにより自働的に行なうこともできる。
均質な抗体（例えば、モノクローンの抗体）を抗原と
して用いるとき、分子の部分は、免疫をもった宿主が応
答し、抗原決定因子として認識される。抗原性決定因子
を認識する均質抗体の特有の組合せ部位は「遺伝型」と
称される。このため、抗体のこれらの部位に抗して作ら
れた抗体は、「抗遺伝型又は反遺伝型」と称される。こ
れらの抗体は「内部像（internal images）」を有して
もよく、もとのインミュノジェンに擬態する活性を有す
ることもできる（Proc.Soc.Natl.Acad.Sci.（USA）75:2
443（1978），セージ，ケイとピーターソンP.A.:Proc.S
oc.Natl.Acad.Sci.（USA）77:7385（1980），シュライ
バー他）。
モノクローン抗体（PSI）は、第８図に示すように、
精子が透明帯の表面に結合するのを抑制するZPの炭水化
物成分を認識する。PSIのモノクローン抗体は、反遺伝
型抗体を作るための免疫原として用いることができる。
抗体は免疫学的に不妊又は避妊とするために用いること
ができる。
モノクローンの反透明帯抗体に結合する決定因子は、
クローン化し、組換えDNA技術を用いて改質（modify）
することにより、ZP抗原性決定因子に抗する「単一鎖抗
体」を作ることができる（Proc.Acad.Sci.USA 81:3273
（1984），キャビリー他;Nucleic Acids Research 12:3
791（1984），ボス他）。
［図面の簡単な説明］ 第１図は2D−PAGEゲル免疫ブロット法により、ライブ
ラリのスクリーニングを行なうために用いられた抗体認
識ZP抗原を表わしている。
第２図はブタZPタンパク質とラビットZPタンパク質の
Ｎ−ターミナルアミノ酸配列を示している。
第３図はλgt11ベクターであって、ZPのcDNAをクロー
ン化することを目的としてエクスプレッションライブラ
リを発展させるために用いられるベクターの制限エンド
ヌクレアーゼの分割マップ（cleavage map）を示てい
る。
第４図はZP抗原をエクスプレスする３つのクローンの
DNA配列を示している。
第５図は卵巣にZP RNAは存在するが、その他の組織に
は存在しないことを表わしたノーザンブロット分析を示
している。
第６図はクローンP1からのλgt11DNAのSDS−PAGE免疫
ブロットを示している。
第７図はラビットの卵巣機能に対する活性免疫の結果
を示している。
第８図は精子がZPに血清結合するのを、モノクローン
抗体が抑制することを示している。
［望ましい実施例の簡単な説明］ その最も基本的なレベルにおいて、発明は、透明帯抗
原を遺伝学的に設計調製することを明らかにすると共
に、受精、着床（implantation）、卵胞の発育及びそれ
に引き続く卵巣のホルモン形成機能を防止することを目
的として、動物の免疫系統を刺激し、透明帯抗原に対す
る抗体の形成を誘発させるために前記の抗原を利用する
方法を明らかにするものである。
発明者は、組換えDNA技術を用いて、透明帯抗原をコ
ード化したcDNAを作る方法を考案した。ZP cDNAは、エ
クスプレッションベクターλgt11の中に挿入される。こ
のエクスプレッションベクターを用いて大腸菌（Ｅ．co
li．）を形質変換（transform）させる。クローンをエ
クスプレスするZPタンパク質又はその決定因子は、ZP抗
体結合によって識別される。一本鎖ファージから分離し
たDNAを、ZP抗原をエクスプレスするために、DNAのコピ
ー（転写物）及びcDNAを作り出すための鋳型（templat
e）として用いる。ZP DNA配列をコード化したλgt11フ
ァージDNAを、pEXベクターの中に挿入する。pEXを用い
て、DNAがエクスプレスされる細菌宿主に形質転換さ
せ、免疫避妊に使用できるZP抗原を大量に作るものであ
る。
親和純化した（affinity purified）ZP抗体でλgt11
圧出ライブラリをスクリーニングすることによって選択
された３つの9cDNAエクスプレッションクローンの部分
的DNA配列を求めるのに、M13クローン化法（Proc.Acad.
Sci.USA 74:5463（1977），サンガー他）が用いられて
いた。すなわち、クローン法はジデオキシ連鎖停止反応
法であって、透明帯DNAは糸状（filamentous）のバクテ
リオファージM13の中にクローンが形成される。
透明帯の遺伝子が、原子核をもつ宿主大腸菌の中でエ
クスプレスされると、作り出されるポリペプチドはグリ
コシド化（glycosylated）していない。このため、主な
ブタのZPポリペプチドの分子重量は、約35、55及び80Kd
である。また、主なラビットのZPポリペプチドの分子重
量は、50、75、85Kd（第１表）であり、グリコシル化し
た分子（第１表）に対して観察される値よりも低い。例
えば、原核生物の中で、透明帯ポリペプチドの暗号をも
つ透明帯DNAから生産された透明帯タンパク質は、「rZ
P」又は「組換え透明帯タンパク質」として称される。
更に、透明帯タンパク質の暗号をもつ遺伝子が真核生物
の中で作られると、タンパク質はグリコスチル化され、
このグリコスチル化したタンパク質は「rgZP」と称され
る。「免疫学的に関連ある抗原」とは、透明帯タンパク
質に対して、重要なゲノム相同関係を有する抗原を意味
しており、これらのDNAによってエクスプレスされた生
産物は、免疫学的に交叉反応性をもち意義のあるレベル
を示す。このような免疫学的に関連ある抗原の例とし
て、自然発生するZP抗原よりも多少のアミノ酸を含むポ
リペプチドが挙げられる。これは、透明帯ポリペプチド
と免疫学的又は生物学的に重要な性質である交叉反応性
を有している。
本発明の中で使用される「宿主」には、原核生物だけ
ではなく、植物細胞及び動物細胞と同じように、酵母
（イースト）及び糸状の菌類をも含むものとする。
「原核生物」には、透明帯をエクスプレスするための
DNA又はrZPタンパク質で形質転換され得る細菌をすべて
含むものとする。
「真核生物」には、透明帯をエクスプレスするための
DNA又はrZPタンパク質で形質転換され得る酵母、菌類、
動物細胞及び植物細胞のすべてを含むののとする。
透明帯タンパク質のDNAは、どんな哺乳類からでも得
ることができる。糖タンパク質の遺伝子配列が原核有機
体又は真核有機体の中でエクスプレスされることが必要
とされるすべてである。透明帯DNAの配列が、哺乳動物
類（例えば、ブタ、ラビット、イヌ、ネコ又は人間等）
の間で免疫学的に交叉反応性を有することが特に望まし
い。
いわゆる当業者であれば周知のどんな技術を用いて宿
主を変化する場合にも、透明帯タンパク質の暗号をもつ
組換えDNA分子を使用することができる。なお、原核生
物の交換のためには、透明帯の暗号をもった配列を含む
ベクターを使用することが特に望ましい。
本発明の透明帯組換えタンパク質（rZP）は、自然発
生、すなわち天然の透明帯タンパク質のアミノ酸配列と
比較して、その端部側面（flanking ends）において多
少のアミノ酸を有することができる。
「実質的にピュア（substantially pure）」という用
語を、本発明の透明帯タンパク質に適用する場合、ポリ
ペプチドは、その天然の状態で透明帯タンパク質と正常
な関連性を有したり、定常的に増殖可能な電気泳動又は
クロマトグラフ応答、溶離プロフィール（elution prof
iles）、及び抗原活性を呈する、といったその他の卵巣
タンパク質を含まないことを意味する。「実質的にピュ
ア」という用語は、透明帯タンパク質とその他化合物と
の人工又は合成混合物を排除するものではない。
融合によって、リンク作用する遺伝子を作り、これら
遺伝子を細菌の中にエクスプレスする方法は知られてお
り、例えば米国特許第4366246号に開示されている。こ
こに記載した遺伝子の製造及び方法は、原核生物又は真
核生物宿主中の透明帯タンパク質のエクスプレスを行な
うために利用することができる。
原核生物の宿主は、グラム陰性細菌又はグラム陽性細
菌でもよく、例えば、大腸菌、S.Tymphimurium、セラチ
ア属マルセッセン、枯草菌が挙げられる。
真核生物の宿主は、ピチアパストリス（Pichia pasto
ris）又は哺乳類の細胞のような酵母でもよい。
一般的には、エクスプレッションベクターは、挿入さ
れたDNA断片の転写を効率良く行なわせるためのプロモ
ータ配列を含んでおり、そのベクターが宿主と共に使用
される。エクスプレッションベクターは、通常、複製
（replication）の原体（origin）、プロモータ、ター
ミネータを含み、さらに、トランスフォームすなわち形
質転換された細胞の中で表現選択を行なう能力のある特
異遺伝子を含んでいる。トランスフォームされた宿主
は、当該分野で知られた手段により、発酵及び培養させ
ることにより、最適な細胞に成長させることができる。
本発明で使用することができるプロモータの例とし
て、rec A 、trp、lac、tac、及びバクテリオファージ
ラムダpR又はpLが挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。本発明で使用することができるプラスミド
又はバクテリオファージの例として、モニアティス他に
よる「Molecular Cloning」（コールド スプリング
ハーバー ラボラトリーズ,1982年）の中に揚げられた
ものが挙げられるが、いわゆる当業者であればこれ以外
にも適当なものを用いることができる。
本発明は、前述した方法によって変質させた（modifi
ed）どんな宿主に対しても、また当業者であれば一般的
に知っている方法によって変質させたどんな宿主に対し
ても適用することができ、透明帯タンパク質の遺伝子を
エクスプレスする原核生物又は真核生物を産生できる。
なお、当業者が知っている方法として、例えば、溶原性
ファージを用いて遺伝性物質をトランスファーする方法
が挙げられる。
遺伝子は、その鋳型または伝令RNAを通じて、特異ペ
プチドに対して特徴的なアミノ酸配列を暗号化したDNA
配列である。cDNAという用語には、介在配列が除去され
た遺伝子を含むものとする。rDNAという用語は、cDNA又
はゲノムのDNA配列を試験官内（インビトロ）でスプラ
イシングして組み換えられた分子を意味する。
クローンを作る運搬体、すなわちクローニング運搬体
は、ブラスミド又はファージDNA又は、宿主細胞内で複
製することができるその他のDNAであり、１つ又は少数
のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられ
る。その部位にて、かかるDNA配列等は、DNAの本質的生
物学的機能を損なうことなく、決定因子が備わるように
切り取ることができる。また、運搬体には、形質変換さ
れた細胞の識別に使用される適当なマーカーを含んでい
る。マーカーは、例えばテトラサイクリン抵抗体又はア
ンピリシン抵抗体が挙げられる。「ベクター」の用語
は、クローニング運搬体として使用することもある。
エクスプレッション運搬体は、クローニング運搬体と
同様な運搬体であるが、通常の場合、制御配列のコント
ロールを受けながら、宿主の中で構造遺伝子をエクスプ
レスする能力を有する。
透明帯タンパク質を透明帯ゲノムで形質変換した宿主
は、透明帯ポリペプチド及びタンパク質の製造に特に有
用であり、動物の免疫に使用することができる。既に説
明したように、透明帯タンパク質のゲノムがバクテリア
内でエクスプレスされると、グリコシレーションは起こ
らない。このため、全長組換え透明帯タンパク質の分子
重量は、天然又は自生の分子よりも小さい（第１表参
照）。
組換え透明帯タンパク質は、透明帯タンパク質のアミ
ノ酸配列全体でもよいし、特異な決定因子だけでもよ
い。透明帯組換えタンパク質で免疫を与えられた動物は
抗体を作り、この抗体が組換えポリペプチド又は天然ポ
リペプチドに存在するエピトーブに結合する。このよう
に、透明帯を含有する組換えタンパク質を商業的規模で
作ることができる。
本発明で使用される「免疫学的な有効量」とは、動物
の中で透明帯エピトープに結合する抗体を作るのに必要
な透明帯抗原の量を表わすものとする。
「個体」という用語は、一切の動物を含むが、望まし
くは哺乳動物、最も望ましくな、ネコ、イヌ、ウシ又は
人間を含むものとする。
本発明の透明帯組換えタンパク質は、動物の免疫系統
を感作（sensitize）するのに特に有効である。このた
め、その１つの結果として、透明帯に存在するエピトー
プと反応する抗体が作られる。
個体の免疫は自働的又は受動的に行なうことができ
る。「自働（活性）免疫」という用語は、抗原又は免疫
原が個体に投与され、個体の免疫系統が抗原に抗する個
体を作ることを意味する。免疫抗原は、個体が抗体を作
ることのできるものであればどんな物質を用いることも
できる。本発明にあっては、個体を避妊又は不妊とする
ために、個体を自働免疫するために有効な抗原には、グ
リコシド結合しているか否かに拘らず、組換えによって
作られたZP抗原（rZP）と、反遺伝型ZP抗体が含まれ
る。
「受動免疫」という用語は、個体の外部のインビトロ
で作られた抗体が、免疫避妊のために個体に投与される
ことを意味する。本発明のZPモノクローン抗体は、個体
に投与されると、このような受動免疫が作られる。
個体が卵巣の熟成前にZP抗原又は反遺伝型抗体で免疫
が与えられると、卵巣の発育は著しく阻止され、取戻し
不可能な永久不妊にすることができる。この方法によっ
て、免疫を与えて動物を避妊させることができ、特にネ
コやイヌのような生殖させたくないペットなどの動物に
適用することが望ましい。このようなZP免疫避妊法の場
合、コストが高くて潜在的な危険を伴う外科的処置は不
要となる。
免疫避妊には、他の種に対しても免疫学的に交叉反応
する透明帯ペプチドが望ましい。ブタ又はラビットの卵
巣から得た透明帯を暗号化したDNAが望ましい。
他の実施例において、本発明は透明帯のモノクローン
抗体をエクスプレスする新規な連続ハイブリドーマ細胞
系統を明らかにし、さらに抗体の製造にかかる細胞系統
の使用、及びかかる細胞系統の製造を明らかにする。本
発明は、さらに受動避妊に使用される反透明帯抗体を大
量に獲得する方法を明らかにする。
本発明によれば、反透明帯抗体をエクスプレスする新
規な連続ハイブリドーマ細胞系を得るには、透明帯タン
パク質、望ましくは透明帯の組換えタンパク質、最も望
ましくは天然の透明帯抗原で動物に免疫を与え、抗体生
産細胞の間に、融合したハイブリッド細胞を免疫が与え
られた動物及び骨髄腫細胞から形成し、ハイブリッドの
クローンを作り、反透明帯抗体をエクスプレスするクロ
ーンを選択することにより行なわれる。より具体的に
は、マウスその他の動物に、精製した透明帯抗原が注入
され、動物の脾の抗体生産細胞は、癌型のマウス細胞又
は骨髄腫の細胞と融合される。そのような抗体を生産す
る細胞のクローンは、連続細胞系統として選択され、成
長する。これから、大量の反透明帯抗体をを得ることが
できる。
或は又、クローンのハイブリッド細胞を、組織適合性
（histocompatable）のある動物の中に注入して増殖さ
せ、高レベルの反透明帯抗体を作ることができる。細胞
は、動物の腹水症流動体（ascites fluid）から再生（r
ecover）できる。
このように、本発明は、免疫避妊に使用される反透明
帯抗体を、かなり大きな規模で、高い信頼性をもってし
かも安定して供給することを可能ならしめるものであ
る。
「免疫避妊」という用語は、免疫学的介在法によって
もたらされるものであって、後で受精可能な一時的避
妊、再び受精ができない永久避妊、又は不妊を含むもの
である。
本発明は、一時的な不妊症をもたらすために行なう受
動免疫のためのモノクローンZP抗体の使用、又は作働免
疫のための天然抗原（Immunological Rev.94:25,1986,
アーランジャー他）の構造に擬態する反遺伝型抗体の使
用を含むものである。
透明帯組換えタンパク質とモノクローン抗体への投与
は、注入、長いインプラントを用いる方法（long relea
se implants）、迅速注入（rapid infusion）、静脈又
は鼻腔からの吸収（absorption）、皮膚吸収等の非経口
的投与、及び経口投与により行なうことができる。非経
口投与の調製物として、無菌又は水性又は非水性溶液、
懸濁液及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶剤の例
として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、オルーブ油の如き野菜油、オレイン酸エチルの如き
注入可能な有機エステル等が挙げられる。閉鎖包帯（oc
clusive dressings）用キャリヤを用いて、皮膚の浸透
性を高め、抗原の吸収を高めることができる。経口投与
するときの液体の形態は、一般的には、液体の投与形態
を含んだリポソーム溶液である。液体投与の適当な形態
として、エマルジョン、懸濁液、溶液、シロップ、及び
エリキシル等を挙げることができる。なお、これらに
は、例えば清浄水のように、当該分野で一般的に知られ
ている不活性の希釈剤が含まれる。不活性の希釈剤の他
に、補助薬すなわちアジュバント（adjuvants）、湿潤
剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味剤及び香料等も更に
含めることができる。
本発明にかかる透明帯の組換えタンパク質を含有する
抗原性調製物の場合も、アジュバントを含めることがで
きる。アジュバントは、特異な免疫応答を非特異的に促
進するために使用される物質である。通常の場合、アジ
ュバントと抗原は、免疫系統に与えられる前に混合され
るか、又は別個に与えられる。但し、免疫をもたせるべ
き動物の同じ部位に与えられる。アジュバントは、それ
らの組成に応じて、幾つかのグループをばらばらに（lo
osely）分割される。これらのグループには、油アジュ
バント（フロイントの完全アジュバント及び不完全アジ
ュバント）、鉱物塩（例えば、AlK（SO4）２、AlNa（SO
4）２、AlNH4（SO4）、シリカ、アラム、Al（OH）３、C
a3（PO4）２、カオリン及びカーボン）、ポリヌクレオ
チド（例えば、ポリIC酸及びポリAU酸）、及び天然物質
（例えば、結核菌からのワックスＤの他、コリネバクテ
リウムパルブム（Corynebacterium parvum）の中に見
い出される物質、百日咳菌及びブルセラ属の一部）が含
まれる。
本発明にかかる透明帯抗原の調製物を動物の体内で使
用することにより、透明帯のエピトープ決定因子に結合
する抗体を作ることができる。透明帯に対する抗体の生
産を向上させる上で特に有用な方法は、先ず動物に、本
発明にかかる透明帯の抗原性調製物で第１の免疫を与
え、その後、第２の免疫を与える方法である。
最初の免疫は、動物の年齢が重要なものとなる。永久
的に免疫避妊又は不妊とするには、動物の青春期が始ま
る２〜３か月前の年齢の時に免疫を与えるのが最も望ま
しい。この時が、卵巣の成熟に最も著しく干渉するから
である。受精を回復ならしめるように避妊するには、卵
巣の濾胞が発達した後でエクスプレスしたZP抗原を用い
ればよい。
動物に免疫が与えられたか否かは、透明帯抗原に対す
る動物の免疫状態を判断することによって知る方法があ
る。この評価は、本発明にかかる透明帯の組換えタンパ
ク質を免疫検定（immunoassay）を用いて、透明帯に対
する抗体を検出することができる。免疫検定として、例
えばELISA検定（Biol.Reprod.30:445,1984、ドレルとダ
ンバー）が知られている。その場合において、透明帯に
対する個体抗体のタイター（titer）が十分に高い時、
すなわち、確実に免疫がもたらせれて妊娠を予防できる
時を判断することが可能である。
多くの免疫養生法（immunization regimen）が利用さ
れるとき、免疫法のタイミングによって異なる多くの技
術がある。本発明にかかる抗原性調製物を２回以上用い
ることが可能であり、これによって、免疫が与えられた
動物によってエクスプレスされた免疫グロブリンのレパ
ートリーのエクスプレッションのレベルを高め、多様性
（diversity）を増すことができる。複数免疫法による
場合、一般的には、１〜６か月間の間隔があけられる。
動物に投与された透明帯の組換えタンパク質の適量
は、年齢、状態によっても異なる。また、免疫の目的が
避妊するためか、または卵巣を去勢するためかによって
も異なるし、それ以外のその他の要因によっても異な
る。しかし、当該分野の専門家であれば、投与すべき量
は容易に確認できるし、調節することもできる。
本発明にかかる抗原性調製物の投与は、１回でもよい
し、複数回でもよい。透明帯抗原の投与量は、１回につ
き、0.01〜5g/mlの範囲で変えることができる。なお、
より望ましくは、0.05〜1.0g/mlであり、最も望ましく
は0.1〜0.5g/mlである。
本発明の概要を説明したが、以下の具体的の実施例を
参照することにより、本発明をより完全に理解すること
ができる。なお、これらの実施例は、例示的なものであ
って、特に指定しない限り、本発明を限定するものと解
すべきではない。
実施例１ ZPタンパク質の分離と多クローン性抗体の調製 A.透明帯（ZP）の分離（isolation） 透明帯（ZP）を、Biol.Repr.25（２）:439（1981）に
記載されたウッド他による方法に基づいて分離した。
２つのホィール（直径10cm）を備え、50列にそろえた
カミソリ刃の間をステンレス鋼のワッシャー（2mm）で
夫々仕切った装置を用いた。２つのホィールのうち一方
は固定し、他方のホィールはチェーンを介して回転ハン
ドルに取り付けた。樹脂ガラス製タンク内に浸漬したカ
ミソリ刃のホィール間に、卵巣を落とした。なお、タン
ク内には、pH7.2の0.01Mリン酸塩緩衝液（PBS）を６リ
ットル、クエン酸ナトリウム2mM、及びEGTA2mMが入れら
れている。約300個の卵巣をカミソリ刃のホィールを通
過させた後、破裂した卵巣を樹脂ガラスのタンクの底部
の1000μｍメッシュの着脱式ナイロンスクリーン上に沈
積させた。スクリーンを取り外して卵巣を緩衝剤（buff
er）から分離し、十分に洗浄を行なって卵巣に付着した
卵母細胞を取り除いた。卵母細胞と透明帯は、次に種々
サイズのナイロンメッシュスクリーンを通し、ふるい分
けして分離した。卵母細胞は、均質化され、50ミクロン
メッシュのナイロンスクリーンを通して洗浄し、帯層を
保持した。この方法を用いたとき、８時間で約100,000
〜300,000のZPを分離することができた。
B.ZPタンパク質の清浄化（purification） 分解力（resolution）の大きい二次元のポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（PAGE）を用いて、ZPタンパク質
を清浄化（ピュア化）した。PAGEは、前述したように、
Biol.Repr.24:1111（1981）の中にダンバー他が記載し
ている。この方法は、第１の次元では等電集束法によっ
てタンパク質を分離し、第２の次元ではポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（PAGE）を用いて、硫酸ドデシルナ
トリウム（SDS）を分離する。
約30,000の帯層のペレットを、300μｌの可溶化緩衝
剤、２％のSDS、２％のβ−メルカプトエタノール、及
び１％のシクロヘキシルアミノスルホン酸（CHES）を含
み、pH9.5〜9.6の水中にて再び懸濁させた。４％PAGE
（1.8％のビスアクリルアミド交差結合剤（cross−link
er）を含む）ゲル毎に40マイクロリットル加えた。pH範
囲が3.5〜10と広いアムフォライン（ampholines）（LK
B）をPAGEゲルに添加した。ゲルは、200Vで２時間予備
集束した後、25℃、400Vにて16時間集束させた。
第２の次元のSDS PAGEに対しては、スラブゲル（slab
gel）（10−20％勾配のポリアクリルアミド及び0.8％
ビスアクリルアミド交差結合剤）を用いた。ゲルは、室
温にて染料（dye）の先端がゲルの底部に達するめで、
約３アンペアで電気泳動を行なった。タンパク質は、染
色法により、クマシーブルー又はシルバーの何れかによ
り識別することができる。ZP抗原は、グリコシレーショ
ンの進行によって、電荷及び分子重量の両方において異
質を呈する独特のタンパク質プロィールを有している。
ZP抗原は、以下に記載するように、電気泳動によってニ
トロセルロースにトランスファーした後、第１図に示す
ように、免疫ブロット（immunoblot）により識別した。
ZPタンパク質は、電気泳動によりゲルから溶離した。ZP
タンパク質のＮターミナル配列は、Meth.Enzymol.91:22
7（1983）にハンクピラー他が開示した方法により求め
た。
主なブタのZPポリペプチドの分子重量は、約35、55及
び80Kdである。また、主なラビットのZPポリペプチドの
分子重量は、50、75、85Kd（第１表）であり、グリコシ
ル化した分子（第１表）に対して観察される値よりも低
い。
実施例２ 多クローン性ZP抗体の調製 多クローン性抗体を雌ラビット又は去勢した雄ヒツジ
に、すべて熱で可溶化した300〜500μｇの透明帯（HSZ
P）（0.01Mの炭酸ナトリウムの緩衝剤中60〜65℃、pH9.
5で１〜２時間）にて、免疫を与えることによって調製
した。或はまた、2D−PAGEゲルで分離した精製ZPタンパ
ク質約50〜200μｇを用いて免疫化した。タンパク質の
すべての試料を1mlの水中で懸濁し、注入前にフロイン
トの完全アジュバントを用いて乳化した。動物の皮層内
の肩甲骨の下の多くの部位に注入し、４週間後、初期免
疫の使用量を半分のZPタンパク質を用い、フロイントの
不完全アジュバントの中でブーストした。幾つかのもの
については、フロイントの完全アジュバントを用いて毎
月、追加のブーストを行ない、より高い抗体のタイター
を得ることができた。
抗体は、酵素結合免疫検定（ELISA）法又は免疫ブロ
ット法を用いて、分析し特徴づけた。ELISA検定では、
ベクターラボラトリーから入手したベクタ染料キット
（Vecta Stain Kits）を用いて、ラビット、ヒツジ又は
マウスの免疫グロブリンを検出した。この検定のため
に、0.1MのNaCO3、pH9.0のHSZPタンパク質50−100μｇ
を96のくぼみ付滴定トレイのくぼみ内に添加した。次に
公知の方法により、キットの指示に基づいて検定を行な
った。免疫ブロット法では、前述したBiol.Repr.36:127
5にティモンズ他が開示した方法を用いて、特異なZP糖
タンパク質とペプチドの識別をした。未染色、未固定の
2D−PAGEゲルをニトロセルロース紙（Bio−Rad）のカソ
ード側に載せ、Ｅ−Ｃ電気ブロットトランスファーユニ
ットを用いて、1.3Aにて2.5時間トランスファーを行な
った。ニトロセルロース紙は次に10mMのトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（トリス）−塩水（salin
e）、pH7.2の中で、３重量％ウシ血清アルブミン（BS
A）と0.01％のアジ化ナトリウムを用いて、１晩中閉塞
（block）した。その後、トリス−塩水−アジド（BSAな
し）を２回交換して洗浄した。多クローン性血清（１−
5ml）又はモノクローン抗体の上澄（100μg/mlの免疫グ
ロブリンＧ（IgG）を、50mlのトリス−塩水−アジド（B
SA）の中で希釈し、25℃にて１晩中揺すりながら、ニト
ロセルローストランスファーで培養した。その後、トリ
ス−塩水−アジド（BSAなし）を２回交換して洗浄し
た。
次に、ニトロセルローストランスファーを、多クロー
ン性血清用125I−タンパク質Ａ又はモノクローンの上澄
用125I−ヤギ、アンチマウスIgGで培養した。50mlのト
リス−塩水−アジド中の合計106cpmを各トランスファー
に添加し、揺すりながら１晩中培養した。空気乾燥前
に、トリス−塩水−アジド（BSA）の中で十分洗浄し、
コダックXAR−５のエックス腺フィルムに露出して放射
能写真を撮影した。
抗体は、ZPタンパク質に接合したCNBr活性化セファロ
ーズ（Sepharose）を用いて親和清浄化を行なった。CNB
r活性化セファローズ4B樹脂（Phamacia）を用いて親和
カラムを調製した。樹脂は熱可溶化HSPZ又はHSRZ（ラビ
ットの熱可溶化透明帯タンパク質）のどちらか一方に結
合した。約1mg/mlのZP調製物を、前述したように、pH9.
6の可溶化緩衝剤の中で作った。ZPは、結合緩衝剤（0.1
M NaHCO3;0.5M NaCl,pH8.3）の中で懸濁させた。樹脂を
洗浄し、1mM Hclの中で膨張させ、ZPを結合緩衝剤の中
に入れる前に、結合緩衝剤で速やかに洗い落とした。緩
衝剤には、0.5NaClが含まれており、タンパク質同士の
相互反応を最少にすることができる。混合物は室温で、
約２時間ゆっくりと回転した。結合緩衝剤は未反応のZP
溶液と共に取り除き、樹脂は1Mのエタノールアミンの中
で、ゆっくりと回転しながら４℃にて１晩中培養し、残
留する活性グループを閉塞させた。次に樹脂は、1mM Na
HCO3（pH8.3,0.5M NaCl）で３回洗浄し、その後0.1Mの
アセテート緩衝剤（pH4,0.5M NaCl）で洗浄した。
抗血清は、４℃にて１晩中ゆっくりと回転しながら、
結合された樹脂で培養した。溶離を行なう前に、樹脂を
室温まで暖め、硼酸塩／塩水緩衝剤（100mM硼酸、75mM
硼酸ナトリウム、75mMNaCl、pH8.4）で十分に洗浄し、
未結合のタンパク質を完全に取り除いた。結合したIgB
の溶離は200mMのグリシン（pH2.7,0.8％NaCl）を用いて
行なった。酸のフラクションは、0.2Mのトリズマ塩基
（Trizma base）の中に直接集められ、最終溶液のトリ
ズマ：グリシンは1:2であり、pH7.5であった。この中和
作用によって、溶離して清浄度の高い抗体への損傷を最
少にすることができる。
抗体を含有したフラクションの部分標本を作り（aliq
uoted）、分析を行なうために冷凍した。免疫親和性抗
体の清浄化は一次元のSDS−PAGE分析により明らかにさ
れた。
実施例３ cDNAクローンをエクスプレスするZPタンパク質の分離 いわゆる当業者であれば、Biochem.18:5294（1979）
にチルグウィン他が開示した方法を用いて、６週のラビ
ット、12週のラビット、及び６か月以上のラビットの卵
巣からRNAを調製できることは認識できるであろう。卵
巣は多量の結合組織を含んでいるため、均質化（homoge
nization）する前に、液体窒素の中で冷凍した後、微細
な粉末に砕くのが望ましい。４〜８の卵巣を、メルカプ
トエタノールの存在下にて、4Mのチオシアン酸グアニジ
ニウム（0.025Mのクエン酸ナトリウム、0.5重量％のナ
トリウム ラウリルサルコシン、pH7.0）の中で均質化
した。均質物（homogenate）は、JA−20のロータの中
で、10,000rpmにて、10℃で10分間、遠心力作用を受け
た。すべてのRNAは、塩化セシウムを通して、エタノー
ル析出又は沈降により、タンパク質から分離した。上澄
み層は、3.8g/100mlsのEDTAを（二ナトリウム塩）を含
有する5.7MのCsClであり、SW−40のロータの中で、32,0
00rpmにて、20℃で20時間遠心作用を与えた。ペレット
は、塩酸グアニジンの中で再び懸濁させた。RNAは、3M
の酢酸ナトリウム（pH5.2）0.3mlと95％エタノール2.2
容積で、沈降（precipitate）させる。−20℃にて１晩
中、培養した後、RNAは、11500rpm、−５℃、10分間の
遠心力作用により回収（recover）する。RNAは、95％エ
タノールで２回の洗浄を行ない、水中に溶解した。RNA
のリカバリーは、260/280の吸光度比率を測定すること
によりモニターされる。ポリアデニル化（polyadenylat
ed）RNAは、オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィ
ーを用いて分離した。このクロマトグラフィーは、Cold
Spring Harbor Laboratory（1982）、p.197のマニアテ
ィス他による「分子クローニング」に記載されている。
クロマトグラフィーのカラムのフラクションは、ISCO分
光光度計を用いてA260でモニターした。
細胞型の特異cDNAプローブは、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 81:2194（1984）にデービス他、及びProc.Natl.Aca
d.Sci.USA 80:1194（1983）にヤング他が記載してい
る。エクスプレッションライブラリーの調製に用いたグ
ラムgt11ベクターを第３図に示している。cDNAのライブ
ラリーを作るため、卵巣組織から分離したポリＡ−mRNA
を２マイクログラムを用いて、各cDNAを合成した。最初
の鎖のcDNAは、オリゴdTのプライミング及び逆転写酵素
（reverse transcriptase）の添加によって合成した。
逆転写酵素の添加し、43℃にて60分間、培養した後、ED
TAの添加によって反応を終了させる。試料は、フェノー
ル：クロロフォルム：イソアミル アルコール（25:24:
1）を用いて抽出する。水性相（aqueous phase）を取り
除き、有機相を1mMのEDTA（pH8.0）を含有する10mMのト
リス−HClを含む0.1M NaClで再び抽出した。水性相をプ
ールした後、DNAを2Mの酢酸アンモニウムで沈降させた
後、95％エタノールを添加した。冷凍・解凍後、溶液に
遠心作用を与え、25μｌの10mMトリス−HCl、1mM EDTA
（TE）の中で再び溶解させた。7.5Mの酢酸アンモニウム
を10マイクログラム、95％のエタノールを50μｌ、添加
する。RNA−DNAハイブリッドは大腸菌RNAase Hにより切
り開かれた（nicked）。第２の鎖（second strand）cDN
Aの合成は、大腸菌DNAポリメラーゼにより行なった。二
重鎖（double strand）cDNAは、T4DNAポリメラーゼによ
り、ブラント終端させた（blunt−ended）。cDNAは、Ec
oR Iリンカー（linkers）に結紮する前に、EcoR I部位
でメチル化した。リンクしたcDNAは、次にEcoR I酵素で
処理し、BioGel P50（BioRad）のクロマトグラフィーで
清浄化し、ここに記載した方法に基づいて、ストラテジ
ェン（Strategen）から得たλgt11の腕（arms）に結紮
した。この方法によれば、６週のラビット及び８か月ラ
ビットのライブラリに対しては約5x10個の斑が得られ、
12週ラビットのライブラリに対しては1x107個の斑が得
られた。
ライブラリをスクリーニングした場合、100mmのプレ
ートにつき5x103個の斑が得られた。次に、斑はIPTGを
含浸させたニトロセルロース紙にトランスファーされ、
プローブは、実施例２で記載の容量にて調製した抗血清
を用いた。
タンパク質配列は多くの種の中で類似しているため、
cDNAをエクスプレスするタンパク質配列を分離する必要
がある。このため、ウザギのZPタンパク質に抗する多ク
ローン性抗体が、ブタのZPカラム（実施例２の如く、臭
化シアン活性化セファローズに結合したZPタンパク質）
上で親和清浄された。0.1Mグリシン（pH2）で溶離した
抗体は、ラビットとブタのZPタンパク質に関連する抗原
を認識できるものである。
ZP抗原をエクスプレスしたλgt11−S1、λgt11−P1、
λgt11−P2及びλgt11−P3のクローンは、サブクローン
が作られた。これらのサブクローンは、サンガーのジデ
オキシ ヌクレオチド鎖ターミネーション法を用いて、
M13ファージの中でクローンを作り、cDNAの配列を形成
する（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463,1977,サンガー
他）。ZP抗原をエクスプレスする３つのcDNAクローンに
対して、この方法を用いて得られた配列を第４図に示
す。
但しP2は第４図の枠Ａ、P3は第４図の枠Ｂ又は枠Ｃで
囲んで示した。
ノーザンブロット（Northern blot）分析を用いて、
２つのcDNAクローン（P2及びP3）により認識されたZPタ
ンパク質のRNAは、卵巣に存在するが、他の組織には存
在しないことが実証された。第５図はこれらの分析の一
つを示しており、分析は、「ノーザンブロット」及び
「ドットブロット」を用いてラベル付プローブをRNA試
料に交雑させて行なったものである。すなわち、ノーザ
ンブロット分析の場合、すべてのRNA卵巣から分離する
とともに、同じように、肝臓、腎臓、脳及び筋肉を含む
他の組織とも分離した。RNAは、ホルムアルデヒドアガ
ロースゲル上で変性し、電気泳動させた。次に、アガロ
ースゲルからビオジン膜（biodyne membrane）の固形支
持体にトランスファーした。膜はトランスファーするた
めに２つの紙フィルターの間に置き、空気乾燥させ80℃
にて２時間ベイキングした。λgt11の中に挿入された特
異なZPcDNAは、EcoR Iによって消化（digest）された。
次に、挿入物は、１％の低融点アガロースの電気泳動に
より、クローニングベクターから分解（resolve）し
た。UV光の下で、挿入DNA分子は、臭化エチジウムで識
別し、放射性ラベリングのためにゲルから削り取った。
Anal.Biochem.132:6（1983）の中にファインバーグ及び
フォーゲルスタインが記載したランダム オリゴ−プラ
イミング方法によって、cDNAにラベリングを行なった。
ラベリング反応は、変性したcDNAを試剤（reagents）に
添加することにより行なった。なお、試剤には、32P−d
CTP、クレノー（krenow）断片、BSA、混合プライマー、
及びオリゴラベリング緩衝剤が含まれている。ラベリン
グされたDNAは、クロマトグラフィーによりセファデッ
クスＧ−50のカラム上にて、dCTPから分離した。DNA−R
NAの交雑は、RNAがトランスファーされたビオジン膜を
熱シール可能なポリエチレン袋の中に別々に入れた。予
備交雑（prehybridization）溶液を袋内に加え、袋は42
℃の水槽の中に１晩中浸漬した。予備交雑溶液を取り除
き、32PをラベリングしたDNAプローブを含有する交雑溶
液と交換し、42℃の水槽の中に１晩中浸漬した。最終的
に、膜は数回洗浄し、暗幕を施してＸ線フィルムに光を
当てた。フィルムは現像する前に、70℃にて48時間、光
を当てた。
実施例４ 組換えDNAによるZPタンパク質のエクスプレッション 組換えZPタンパク質（rZP）は、原核エクスプレッシ
ョン系統又は真核エクスプレッション系統の中でエクス
プレスされる。
実施例３にて調製した、組換えλgt11ファージ、λgt
11−S1、λgt11−P1、λgt11−P2及びλgt11−P3は、10
mMのMgCl2を含有するルリア ブロース（Luria Broth）
（LB）媒体内にて、32℃にて20分間、大腸菌Y1089とと
もに培養することにより、大腸菌Y1089を感染させた。
集団（colonies）は32℃にて発育させた。なお、温度敏
感性を調べるために１つの集団だけは42℃にて発育を行
なった。32℃では発育するが、42℃では発育しない集団
は、溶解性（lysogenic）であると考えられ、集団全体
の約10〜70％を占める。組換えレゾゲンの１個の集団を
分離し、これを用いてLB媒体を種類し、32℃にて発育さ
せた。O.D.600が約0.5のとき、培養温度を42℃に変更
し、さらに20分間培養した。クローンが作られた遺伝子
の転写は、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド
（IPTG）の添加によって刺激し、最終濃度を10mMとし、
37℃にて60分間培養した。形質転換した大腸菌は、遠心
作用により得ることができ、50mMトリス（Ph7.5）の中
で再び懸濁させ、冷凍した。細胞の解凍によって、細胞
溶解作用が起こり、融合ZPタンパク質を解放する。
ZP DNAで設計されるλgt11−P1及びλgt11−P3を含有
するバクテリオファージは、1987年10月８日付にて、ア
メリカ合衆国メリーランド、ロックビルにあるアメリカ
ン タイプ カルチャー コレクション（ATCC）に寄託
した。寄託番号は、40377及び40378である。寄託したバ
クテリオファージは、米国特許法及び規則に基づき、入
手できる。また、対応出願の申請がされた米国以外の国
の国民も同様に入手できる。なお、寄託したバクテリオ
ファージを入手できるからといって、本出願及びこれに
基づく分割出願等に対して付与される特許の実施権まで
与えるものでない。
他の実施例において、EMBO 3（６）:1429（1984）に
てスタンレーとルジオが開示したpEXプラスミドを用い
て、大腸菌Y1090を形質転換させることができる。pEXベ
クターは不溶解のハイブリッドタンパク質をエクスプレ
スする。バクテリオファージλ DNAの分離は、Cold Spr
ing Harbor Laboratory（1982）、p.197のマニアティス
他による「分子クローニング」に記載された方法に従っ
て、組換えλgt11ファージの上で実行できる。10mM MgC
l2、0.2％マルトース及び50μg/mlのアンピシリン（Amp
icillian）で補足した（supplemented）LB媒体の中で発
育させた大腸菌Y1090は、組換えλgt11ファージで感染
させ、37℃にて20分間培養した。感染した大腸菌は、0.
7％アガロース、MgCl2及びアンピシリンとともに、LB媒
体内のLBプレート上に載せ、43℃にて一晩中、培養し
た。ファージはSM媒体（0.02Mトリス−HCl、pH7.5;0.01
M NaCl;0.001M MgSO4・7H2O）（pH7′.5）及び１リット
ル水の0.01％ゼラチン）の中に集められ、細菌は、8,00
0xgにて、４℃で10分間遠心力作用を与えることにより
除去される。RNaseAとDNaseIは、最終濃度が１μg/mlの
ファージを含有する上澄みに添加し、37℃にて30分間培
養した。20％ポリエチレングリコール及び2M NaClを含
有するSMの等量を添加し、０℃にて１時間懸濁液を培養
し、10,000xgにて、４℃で20分間遠心作用を与える。上
澄みを除去し、ファージを含むペレットは、0.5mlM媒体
の中で再び懸濁させた。残留物を除去するため、溶液
は、8,000xgにて、４℃で２分間遠心作用を受け、５μ
ｌの10％SDSと0.5M EDTA（pH8）を上澄みに加え、68℃
にて15分間、培養した。その結果、フェノール、フェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:
1）、及びクロロホルム：イソアミルアルコール（24:
1）が抽出され、各段階で水性相を得ることができた。
等量のイソプロパノールを水性相に添加し、溶液は−70
℃にて20分間、貯蔵した。４℃で10分間遠心力作用与え
た後、ペレットは70％EtOHで洗浄し、乾燥し、50μｌの
TEの中で再び懸濁させた。EcoR Iの制限酵素の消化をお
こなった後、標準の方法により分離DNAの部分標本を作
った。消化完了後、トリス硼化物（Tris boronate）EDT
Aローディング緩衝剤（TBE）90mMトリス硼酸塩、90mM硼
酸、2mM EDTAを1:1の比率で添加し、1.4％アガロースゲ
ルに負荷した。ゲルは、キシレンシアノールの前部（fr
ont）がゲルの中程になるまで、100Vでラン（run）す
る。DNAのバンドは紫外線により視覚的に認識され、予
想サイズのバンドが除去される。TBEのエルトラップ（E
lutrap）装置の中で、電気的溶離（electroelution）を
行なう。分離したDNAフラグメントは、次に、pEXプラス
ミドの中に挿入される。
プラスミドの調製は、マニティアス（1982）の方法に
基づいて実行できる。細菌クローンを一晩中かけて発育
させた後、1.5mlの培養をエッペンドルフ管（Eppendorf
tube）の中にいれ、上澄みを吸引に取り除いた。ペレ
ットは、100μｌの氷冷溶液の中で再び懸濁させた。溶
液には50mMグルコース、10mM EDTA、25mMトリス（pH8.
0）、及び4mg/mlのリゾチーム（lysozyme）が含まれ
る。懸濁後、22℃にて20分間培養し、氷冷した0.2M NaC
l及び１％SDSを200μｌ、さらに追加した。５分間、氷
の上で培養後、150μｌの3M酢酸カリウム（pH4.8）を添
加した。溶液は氷の上で５分間培養し、その後、遠心力
作用を与え、上澄みを別の新しい間に移した。600μｌ
のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
（25:24:1）を加え、溶液を混合し、遠心作用を与えて
上澄みを節約する。次に、２容量（two volumes）の冷
たいエタノールを上澄みに添加し、上澄みを混合し、22
℃にて２分間培養する。上澄みを取り除き、ペレット
は、管を反転させて乾燥させる。ペレットは70％EtOHで
洗浄し、遠心作用を受け、再び排出する。20μg/mlのDN
ase−freeの膵臓RNaseを含有する50μｌのTE（pH8.0）
を添加し、軽く混合し、EcoR Iによる消化のための部分
標本を取り除いた。消化の分析は、アガロースゲルの電
気泳動により行なわれる。
プラスミドは、製造者が指定する条件の下に、EcoR I
（ProMega BioTech）で線状化（linearize）される。20
0ngの線状化したプラスミドDNAを、３倍（３−fold）の
モル過剰の分離cDNAに添加する。DNAはEtOHで沈降させ
られ、８μｌのTE（pH8.0）の中で再び懸濁させる。１
μｌの10x結紮66mMトリス−Cl（pH7.6）、6.6mM MgC
l2、10mMジチオテイトル、66mM ATPの緩衝剤を添加し、
その後、T4 DNAリガーゼ（ligase）を10ユニット添加し
た。混合物は、12℃にて、８時間培養する。１μｌの部
分標本を、アガロースゲルにより分析し、結紮する。2.
4μｌを用いて、CaCl2技術により、細菌の形質変換を行
なう。
組換えプラスミドを運ぶ集団は、多クローン性抗血清
で細菌をスクリーニングすることにより識別できる。形
質変換された細胞は、30℃にて20時間発育させる。ニト
ロセルロースがその上に形成され、フィルターを取り除
き、100μg Amp/mlを含有するLBメディアの中に予め浸
された3MMの紙フィルターの２層の下に集団を並べて載
せる。42℃にて２時間、培養することにより、交雑タン
パク質の転写が開始する。フィルターはTBSの中で30分
毎に３回洗浄し、２％の乾燥ミルクで補足したTBSの中
で一晩中閉塞する。フィルターは、次に親和清浄された
抗体でプローブされる。陽性集団（positive colonie
s）を32℃にて培養する。ZPタンパク質のエクスプレッ
ションは、温度を42℃に変え、２時間培養することによ
ってもたらされる。この時、組換えZPタンパク質は、す
べてのSDSが抽出されたタンパク質の約25％である。エ
クスプレスされた交雑ZPタンパク質は不溶解性であり、
従来のクロマトグラフィー法により容易に清浄化するこ
とができる。
或は又、組換えZP DNAを酵母の中に挿入することがで
きる。ピチアパストリスの如きメチル萎縮性の酵母を用
いることにより、遺伝学的に設計したタンパク質を効率
良くしかも大規模にエクスプレスすることができる（Ch
emical Week,マクグロウヒル社、（1986）エム．ブルー
ストーンとピー．サベージ）。これらの酵母は、醸造
（brew）ベースとして、メタノールを用いるもので、酵
母は、アルコール酸化酵素の助けを受けてホルムアルデ
ヒドの中に新陳代謝する。第２の酵素は、次に、ホルム
アルデヒドをジヒドロキシアセテートに変換し、次の段
階の酵母細胞の合成を行なう。cDNAは、アルコールを酸
化させる遺伝子の位置に挿入される。ZPタンパク質から
の組換えDNAは、アルコール酸化酵素遺伝子が通常存在
する部位で置換する。この部位は酵母内で変更されるた
め、メタノールに応答する。従って、エタノール又は炭
水化物への切換えを行なうだけで、挿入された遺伝子が
エクスプレスしたり、エクスプレスしないようにするこ
とができる。２つのメタノール−調節されたラックＺ
（lacZ）遺伝子は、ピチアパストリスの中でエクスプレ
スすることができる（Nucleic Acids Research 15
（９）:3859（1987），チョップ他）。
実施例５ 組換え透明帯タンパク質の清浄化 ZPタンパク質の組換えは実施例４に記載のようにして
エクスプレスされる。
λgt11組換えリゾゲンを用いて大腸菌Y1089を感染さ
せた。大腸菌は、0.2％マルトースを32℃にて補足して
最適密度（600nm）の0.5としたLB媒体の中で発育させ
た。次に培養温度を42℃に変え、その温度で20分間さら
に培養した。この培養の終りに、IPTGを添加してラック
リプレッサーを低下させた。この結果、組換えたものを
含むラックＺ方向の遺伝子がエクスプレスされる。細胞
は37〜38℃で60分間培養され、液体窒素の中で冷凍し、
解凍して細胞を溶解させる。溶解質（lysate）は、0.1M
トリス緩衝剤（pH7.5）の中に集められ、セファセル（S
ephacel）カラムを通過させた。分子重量が100Kdよりも
大きいタンパク質を含む空隙（void）の容積をもつもの
が集められた。エクスプレスされたタンパク質は、この
場合、β−ガラクトシダーゼタンパク質に融合されるた
め、このタンパク質を部分的に清浄化する迅速な方法で
あるといえる。このタンパク質フラクションは、SDS−P
AGEによって分析され、免疫ブロット法によりエクスプ
レスされた抗原を検出する。第６図はP1クローンによっ
てエクスプレスされたZP抗原融合タンパク質のSDS−PAG
Eで免疫ブロットしたものを示している。ニトロセルロ
ースのトランスファーはラビットの抗HSPZでプローブし
た。低分子重量の細菌タンパク質はたくさんのものが、
あらゆる細菌の中で認識されるが、P1挿入の場合、２つ
のレーンがZPに特異な融合タンパク質のエクスプレッシ
ョンを示す。
タンパク質は、タンパク質を細菌から抽出することに
より、pEXプラスミドから分離する。組み換えたクロ−
β−ガラクトシダーゼの交雑タンパク質は、硫酸ドデシ
ルナトリウムで抽出したタンパク質の約25％であるた
め、セファセルとイオン交換カラムにより、または電気
泳動により、沈積させることができる。このため、動物
の免疫に必要な清浄度が十分に得られるようにタンパク
質を清浄にすることができる。酵母培養媒体から分離し
た組換えタンパク質も、これらの方法によって清浄にす
ることができる。
実施例６ 透明帯の免疫 透明帯タンパク質の活性免疫又は自働免疫が、動物の
受精を抑制する上で効果のあることが見いだした。ラビ
ットに活性免疫を与えることにより、卵巣の卵胞におけ
る受精機能を損なわせ、ステロイドホルモンの生産を停
止させることができる（第７図参照）。
ZPタンパク質（300μg/0.5ml;0.1M PBS）を、0.5mlの
フロイントの完全アジュバント（CFA）の中で乳化させ
る。投与量の半分を皮内の多くの部位に投与し、残りの
半分は0.5mlPBSで乳化した0.5mlCFAのエマルジョンで注
入した。この注入により、動物は４週間後に免疫高揚作
用を受ける。この免疫作用は、最初のものと比較した場
合、最初のものがフロイントの不完全アジュバントを用
いている点を除くとその他は全く同一である。卵巣の機
能をひょかできるようにするため、動物はhCG処理を行
ない、血清プロゲステロンのレベルを判断した。各グル
ープの中で何匹かの動物を、hCGの投与後少なくとも12
時間で殺し、卵巣の重量を測定し、排卵部位を調べた。
また一方では、hCGの前に、動物にブタのFSH（Reheis C
hemical Co.,アリゾナ州フェニックス;0.5mg/1匹、毎日
２回、３日間）を与え、排卵過度にした。これらの研究
結果により、卵巣機能の変化原因は、卵胞細胞の分化の
欠乏及びステロイド生産の欠乏であることが明らかにな
った（第７図参照）。ブタのZPで免疫をもたせたラビッ
トの血清プロゲステロンのレベルを求めた。50IU hCGが
与えられた動物の応答は、プロゲステロンレベルのRIA
により求めた。テストした血清試料は、21日間定期的に
採取した。このhCG処理の後に通常の場合、偽妊娠が生
じる。各ヒストグラムは血清プロゲステロン濃度（血清
1mlにつきナノグラムのプロゲステロン）の平均±S.D.
を表わす。
パネルＡ及びＤは、前者が対照（control）動物（ア
ジュバントだけ）、後者が実験（experimented）動物
（ZPで免疫）の、夫々免疫前におけるプロゲステロンの
プロフィールを示している。Ｂ及びＥは、第１の免疫処
理後、20週間経過後の状態を示している。Ｃ及びＦは、
増強していない動物のプロゲステロンのプロフィールを
示しており、これは、第１図の免疫後、28週後にFSH/hC
G処理した後のものである。モノクローン抗体R5とR7を
受動免疫のために用いることにより、ラビットの受精率
は低下した。PSIで指定されるモノクローン抗体は、シ
ルバー染色されたブタのZPタンパク質に抗して作られ
る。なお、タンパク質は2D−PAGEにより清浄化されてい
る。
このモノクローン抗体は、ブタ血清がインビトロのぶ
たZPに固定されるのが抑制される（第８図参照）。
実施例７ 反透明帯モノクローン抗体の調製 反透明帯モノクローン抗体を生産するハイブリッド細
胞系統を調製するもので、BALB/cマウス骨髄腫細胞を、
透明帯タンパク質でプライムしたBALB/cマウスの脾臓細
胞に融合するものである。この方法では、骨髄腫細胞及
び反透明帯抗体生産細胞は、人間、イヌ、又はネコのよ
うな他の供給源を利用することができる。
A.融合のための脾臓細胞の調製 透明帯タンパク質は、卵巣又は分解度の高い2D−PAGE
による分離したものを、熱可溶化したすべてのマトリッ
クスとして清浄にするものである。透明帯抗原は、2D−
PAGE分析では、約95％ピュア（熱可溶化したZP）であ
り、シルバー染色分析では100％ピュアであった。透明
帯抗原は、フロイントの完全アジュバント約30μｇの中
で乳化させたものを、大人のBALB/c又はC57B46の雄マイ
スに皮下投与して免疫を与えるために使用される。マウ
スは２週間後、さらに不完全アジュバントのタンパク質
30μｇで、再び免疫を付与した さらに６週間経過後、20〜40μｇのタンパク質を静脈
内に投与した。２〜４日後、マイスは死亡し、脾臓細胞
の懸濁物を、Somatic Cell Genetics 3:231,1977にゲフ
ター他が開示した方法に基づいて作った。赤血球を溶解
し、NH4Cl（0.83％）の中で、40℃で15分間培養した。
得られた懸濁物は、遠心力作用（800xg）によって熱不
活性の子牛血清を通して洗浄し、その後、タンパク質な
しの媒体（RRMI 1640、7.5nM HEPESで緩衝、pH7.2）の
中で遠心力を作用させた。
B.融合するための脾臓の調製 脾臓細胞は、P3U1系統から得たが、Curr.Top.Microbi
ol.Immunal.81:1−７（1978）にイエルトン他が記載し
ているようにHPRT（E.C.2.4.2.8）が不足している。こ
の細胞をイーグルの最少必須媒体（minimum essential
medium,MEM）の中に維持した。この媒体は子牛血清10％
とウマ血清15％を含んでいる。骨髄腫細胞の成長は、ヒ
ポキサンチン−アミノペテリン−チミジン（HAT）媒体
の選択により抑制される。
C.ハイブリッドの生産 ハイブリッドの生産は、107BALB/c骨髄腫細胞と、透
明帯の免疫が与えられたBALB/c又はC57B1/6マイスから
得られた108脾臓細胞を混合することにより行なわれ
た。細胞の混合物は800xgの遠心力作用を受け、細胞
は、ゲフター他（1977）の方法に基づき、血清を含まな
い最小必須媒体（MEM）の中に希釈したポリエチレング
リコール（PEG 1000）の50％溶液の中で再び懸濁させ
た。得られたハイブリドーマ細胞は、ガルフレとミルス
タインがMeth.Enzymol.73:3,1975に記載しているよう
に、希釈剤を制限することにより、ヒポキサンチン−ア
ミノペテリン−チミジン（HAT）媒体の中にクローンを
形成した。２つのハイブリドーマ細胞系統R5とPSIを選
択した。その理由は、細胞系統R5は、多くの動物のZP抗
原のタンパク質部分を認識する抗体を作るためである。
また、PSIは、ZPの多くの種の炭水化物決定因子を認識
し、この抗体は精子がZPの表面に結合するのを抑制する
ためである（第８図参照）。
R5及びPSIで指定されるハイブリドーマ細胞系統は、1
987年10月８日付にて、アメリカ合衆国メリーランド、
ロックビルにあるアメリカン タイプ カルチャー コ
レクション（ATCC）に寄託した。寄託番号は、40377及
び40378である。寄託したバクテリオファージは、米国
特許法及び規則に基づき、入手できる。また、対応出願
の申請がされた米国以外の国の国民も同様に入手でき
る。なお、寄託したバクテリオファージを入手できるか
らといって、本出願及びこれに基づく分割出願等に対し
て付与される特許の実施権まで与えるものでない。
D.反透明帯抗体を生産するクローンのテスト リンブロ（Linbro,Flow Lab）のマイクロタイター用
の96個のくぼみ付プレートを、ラビット又はブタのZPタ
ンパク質の50〜100μｇで蔽い（coated）、20℃にて一
晩培養した。くぼみは、５％カーネーション インスタ
ントミルク（Carnation Instant Milk）及び0.085％ア
ジ化ナトリウムを含有する0.1Mトリス（pH7.5）−１％
ノンイデット（nonidet）Ｐ−40で洗浄した後、0.05ml
の培養上澄みを添加し、40℃にて培養した。上澄みはRI
A緩衝剤で３回洗浄した後に除去し、ハイブリドーマ
スクリーニング キット（Bethesda Research Labs）を
用いて抗体を検出した。非特異的結合の対照は、第２の
抗体又は培養上澄みのどちらか一方が含まれていない。
R2、R5、R7及びPSIとよばれるハイブリドーマ細胞
は、プリスタン処理した（pristane−treated）マイス
の中に腹腔内注射をすることにより、腹水症の形態とし
て発育させた（Meth.Enzymol.73（パートＢ）１（198
1）、ガルフレとミルスタイン）。腹水症の体液を採
り、これを免疫ブロット及び生物検定のためのモノクロ
ーン抗体源として用いた。
本発明を詳細に説明した。当該分野の専門家であれ
ば、添付した請求の範囲における発明の精神又は発明の
範囲から逸脱することなく変形をなすことができること
は明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 21/08 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 米国特許3992520（ＵＳ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 262，Ｎｏ．２（1987）ｐ．564−571 Ｊ．Ｒｅｐｒｏｃｅ．Ｉｍｍｕｎ ｄ．，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３（1985) ｐ．187−198 Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 98，Ｎｏ．３（1984）ｐ．795−800 Ｐｒｏｃ．Ｎｏｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．83（1986) ｐ．4341−4345 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/12 C12P 21/08 C12N 15/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (34)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第４図でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）
    として示される核酸のグループから選択された核酸の発
    現生成物を含む自然発生的でない透明帯ポリペプチド。
    但し該透明帯ポリペプチドは、天然由来の糖鎖を有しな
    い。
  2. 【請求項２】ヒト以外の哺乳類の透明帯ポリペプチドを
    コードする核酸の発現生成物からなる自然発生的でない
    透明帯ポリペプチドであって、該透明帯ポリペプチド
    は、ヒト以外の哺乳類に免疫性を与えるのに用いられる
    とき、ヒト以外の哺乳類内で免疫性を与えられたヒト以
    外の哺乳類の透明帯に結合する抗体を誘発し、核酸は、
    第４図でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示され
    る核酸のグループから選択され、透明帯ポリペプチド
    は、天然由来の糖鎖を有しない。
  3. 【請求項３】ポリペプチドは、卵巣以外の細胞内で作ら
    れる請求項１又は２のポリペプチド。
  4. 【請求項４】ヒト以外の哺乳類の透明帯に対する抗体の
    生産を誘発するのに有用な薬学的組成物であって、該薬
    学的組成物は、薬学的に許容されるキャリアー、第４図
    でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示される核酸
    のグループから選択される核酸によりコードされる免疫
    学的に効果的な量の自然発生的でない透明帯ポリペプチ
    ド及び必要に応じて含まれるアジュバントからなり、透
    明帯ポリペプチドは、天然由来の糖鎖を有しない。
  5. 【請求項５】避妊を行うのに効果的な量の自然発生的で
    ない透明帯ポリペプチド、薬学的に許容されるキャリア
    ー及び必要に応じて含まれるアジュバントからなる避妊
    的組成物であって、自然発生的でない透明帯ポリペプチ
    ドは、第４図でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として
    示される核酸のグループから選択される核酸によりコー
    ドされる透明帯ポリペプチドのグループから選択され、
    透明帯ポリペプチドは、天然由来の糖鎖を有しない。
  6. 【請求項６】ヒト以外の哺乳類において透明帯蛋白質に
    対する抗体の生産を誘発する方法であって、該方法は、
    自然発生的でない透明帯ポリペプチド及び必要に応じて
    アジュバントを用いて個体に免疫性を与えることからな
    り、自然発生的でない透明帯ポリペプチドは、第４図で
    P2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示されるDNAに
    よりコードされる透明帯ポリペプチドのグループ（及び
    選択的にアジュバント）から選択され、透明帯ポリペプ
    チドは、天然由来の糖鎖を有しない。
  7. 【請求項７】ヒト以外の哺乳類に、避妊を行うのに効果
    的な量の齧歯類以外の自然発生的でない透明帯ポリペプ
    チド及び必要に応じてアジュバントを投与し、これによ
    って、該哺乳類内で抗透明抗体を誘発することからなる
    避妊方法であって、該抗体は、哺乳類の透明帯に結合
    し、齧歯類以外の自然発生的でない透明帯ポリペプチド
    は、図４でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示さ
    れるDNAによりコードされる透明帯ポリペプチドのグル
    ープから選択され、透明帯ポリペプチドは、天然由来の
    糖鎖を有しない。
  8. 【請求項８】ヒト以外の哺乳類に、避妊を行うのに効果
    的な量の齧歯類以外の自然発生的でない透明帯ポリペプ
    チド及び必要に応じてアジュバントを投与することから
    なる避妊方法であって、齧歯類以外の自然発生的でない
    透明帯ポリペプチドは、図４でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ
    又はＣ）として示されるDNAによりコードされる透明帯
    ポリペプチドのグループから選択され、透明帯ポリペプ
    チドは、天然由来の糖鎖を有しない。
  9. 【請求項９】ヒト以外の哺乳類に、避妊を行うのに効果
    的な量の薬学的組成物を投与することからなる避妊方法
    であって、薬学的組成物は、薬学的に許容されるキャリ
    ヤー、選択的にアジュバント及び、図４でP2（枠Ａ）及
    びP3（枠Ｂ又はＣ）として示される核酸のグループから
    選択される核酸によりコードされる避妊を行うのに効果
    的な量の齧歯類以外の自然発生的でない透明帯ポリペプ
    チドからなり、透明帯ポリペプチドは、天然由来の糖鎖
    を有しない。
  10. 【請求項１０】透明帯ポリペプチドをコードするDNA、
    複製起点及び、宿主細胞内で、前記透明帯ポリペプチド
    をコードするDNAの発現を可能にするプロモーターから
    なるバクテリオファージであって、前記DNAは、図４でP
    2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示されるDNAのグ
    ループから選択される。
  11. 【請求項１１】バクテリオファージは、図４でλgt11−
    P2（枠Ａ）及びλgt11−P3（枠Ｂ又はＣ）により構成さ
    れるグループから選択される請求項10のバクテリオファ
    ージ。
  12. 【請求項１２】透明帯ポリペプチドをコードするDNA、
    複製起点及び、宿主細胞内で、前記透明帯ポリペプチド
    をコードするDNAの発現を可能にするプロモーターから
    なるプラスミドであって、前記DNAは、図４でP2（枠
    Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示されるDNAのグルー
    プから選択される。
  13. 【請求項１３】透明帯ポリペプチドをコードするDNAか
    らなるベクターであって、図４でP2（枠Ａ）及びP3（枠
    Ｂ又はＣ）として示されるDNAのグループから選択され
    るベクター。
  14. 【請求項１４】ベクターは、プラスミド、バクテリオフ
    ァージ及びコスミドにより構成されるグループから選択
    される請求項13のベクター。
  15. 【請求項１５】ベクターは、λgt11−P2（枠Ａ）及びλ
    gt11−P3（枠Ｂ又はＣ）により構成されるグループから
    選択される請求項13のベクター。
  16. 【請求項１６】図４でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）
    として示されるDNAのグループから選択されるDNAで形質
    転換された宿主細胞。
  17. 【請求項１７】宿主細胞は、原核宿主細胞である請求項
    16の宿主細胞。
  18. 【請求項１８】宿主細胞は、真核宿主細胞である請求項
    16の宿主細胞。
  19. 【請求項１９】請求項12に記載のプラスミドを有する形
    質転換された宿主細胞。
  20. 【請求項２０】請求項10又は11に記載のバクテリオファ
    ージを有する感染された宿主細胞。
  21. 【請求項２１】請求項13、14又は15の何れかに記載のベ
    クターを有する形質転換された宿主細胞。
  22. 【請求項２２】宿主細胞は、E.coli（大腸菌）である請
    求項16、17、19又は20の何れかに規定した宿主細胞。
  23. 【請求項２３】宿主細胞は、イースト細胞である請求項
    16又は18の宿主細。
  24. 【請求項２４】自然発生的でない透明帯ポリペプチドを
    生産する方法であって、 ａ）図４でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示さ
    れるDNAのグループから選択されたDNAで形質転換させる
    工程、 ｂ）形質転換された宿主内でDNAを発現させる工程及び ｃ）透明帯蛋白質を回収する工程 からなる方法。
  25. 【請求項２５】宿主は原核宿主細胞である請求項24の方
    法。
  26. 【請求項２６】宿主は真核宿主細胞である請求項24の方
    法。
  27. 【請求項２７】図４のP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）
    により構成されるグループから選択されたDNAによりコ
    ードされる透明帯抗原に特異的に結合する抗体を産出す
    る連続的細胞ライン。
  28. 【請求項２８】モノクローナル抗体を生産する方法であ
    って、 ａ）請求項27の連続的細胞ラインを組織適合動物に注入
    する工程、 ｂ）前記動物（ヒトを除く）内で腹水液の生産を可能に
    する工程及び ｃ）前記動物の腹水液からモノクローナル抗体を回収す
    る工程 からなる方法。
  29. 【請求項２９】図４でP2（枠Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）
    として示されるDNAのグループから選択されたDNAにより
    コードされる透明帯抗原に結合する抗透明帯モノクロー
    ナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、齧歯類の
    脾臓細胞の融合されたハイブリッドからなる連続的細胞
    ラインにより生産され、前記脾臓細胞は、図４でP2（枠
    Ａ）及びP3（枠Ｂ又はＣ）として示されるDNAのグルー
    プから選択されたDNAによりコードされるポリペプチド
    で免疫性を与えられた齧歯類に由来している。
  30. 【請求項３０】透明帯に特異的に結合する抗透明帯モノ
    クローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、AT
    CC HB 95 65で示される細胞ラインにより生産されてい
    る。
  31. 【請求項３１】ヒト以外の哺乳類に、避妊を行うのに効
    果的な量の請求項29に記載の抗透明帯モノクローナル抗
    体を投与する工程からなる避妊方法。
  32. 【請求項３２】ポリペプチドは、ウサギ透明帯ポリペプ
    チドを認識する抗体により認識される請求項１の透明帯
    ポリペプチド。
  33. 【請求項３３】透明帯ポリペプチドをコードする分離さ
    れた純粋なDNAであって、該DNAは、図４でP2（枠Ａ）と
    して示されるシーケンスを有している。
  34. 【請求項３４】透明帯ポリペプチドをコードする分離さ
    れた純粋なDNAであって、該DNAは、図４でP3（枠Ｂ又は
    Ｃ）として示されるシーケンスを有している。
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