JP2001514743A

JP2001514743A - 細胞表面タンパク質に対するワクチンの製造方法

Info

Publication number: JP2001514743A
Application number: JP53675398A
Authority: JP
Inventors: シー．ハール，ジョン; ナービー−ハンセン，ソーレン; フリッキンガー，チャールズ，ジェー．
Original assignee: University of Virginia Patent Foundation
Current assignee: University of Virginia Patent Foundation
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2001-09-11
Also published as: AU743703B2; HUP0002281A3; BR9807774A; IL131297A0; KR20000075624A; WO1998036771A1; AU6656398A; EP0986398A4; CA2282859A1; EP0986398A1; HUP0002281A2; PL335483A1

Abstract

(57)【要約】ウイルス、バクテリア、又は細胞の表面に露出したタンパク質のレパートリーを同定する方法、及びそのタンパク質に対するワクチンの調製。本発明方法は、膜表面のタンパク質を方向性のある（vectorially）標識をし；標識した膜表面タンパク質を二次元ゲル電気泳動によって単離し；単離した膜表面タンパク質の配列を決定することを含む。更に本発明は、ウイルス、バクテリア、又は細胞に対するワクチンの製造方法、不妊の検出方法、避妊薬の製造方法を提供すると共に、本発明方法によって製造されるワクチン及び避妊薬をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞表面タンパク質に対するワクチンの製造方法政府による支援本発明の一部は国立衛生研究所の認可第ＮＩＨＨＤ２９０９９号及びＰ３０ −２８９３４号の支援を受けたものである。本発明において政府は一定の権利を有する。発明の背景発明の属する分野本発明は、一般に、細胞表面に露出したタンパク質のレパートリーを同定する方法、及びそのタンパク質に対するワクチンの調製に関する。より詳細には、本発明は、ヒト精虫（精子）の表面に存在するタンパク質のレパートリーを同定する方法、その方法によって同定した該タンパク質、及び該タンパク質から得た避妊ワクチンの製造に関する。発明の背景の説明生体はその表面を通じて外界と相互作用する。免疫系において、抗体が仲介する免疫応答やＴ細胞が仲介する免疫応答は、細胞及びウィルス表面に存在するエピトープに対して起こる。生体の表面分子を同定し、単離し、遺伝子的に操作する方法は、ワクチン開発の手段を提供する。なぜなら、免疫応答は細胞／ウィルス表面を指向するからである。哺乳類の精子は高度に分化した細胞である。精子は、空間的及び時間的に組織化されて一つの細胞連合体に到る複雑な変化系の生成物であって、この変化系は精上皮サイクルとして知られている（１）。精子形成の過程で、丸型の未分化精原細胞が精母細胞及び精細胞を経てかなり非対称な運動型精子へと転換するが、ヒトの場合、精細胞の分化だけで１２ステップあることが確認されている（２）。この様な多数回に亘る分化の結果、精子は多くの点で普通の細胞とは異なったものとなる。精子の核クロマチンは、ＲＮＡ合成において高度に濃縮され不活性となり、精子頭部の先体、外層を構成する高密度繊維及び尾部のリブ状束繊維等の特有な細胞質成分が現れる。顕微鏡下で直ちに判明するものではないが、精子形質膜も精子形成の過程で広汎な分化過程を経る。凍結割断試験片（４）及び、精子膜成分分布の違いについての免疫細胞化学的研究（５）が示すように、異なる膜ドメインが精子表面上に形成される（３）。更に精子表面は、精上皮を離れた後でも静的ではない。すなわち、精巣上体で更に成熟し、これに続く受精能獲得と雌性生殖管での先体反応の結果、精子成分は変性及び再分布する（６、７）。精子が精巣から輸卵管へ進む場合、雄性及び雌性の生殖管において、精子はその表面を通して外界と相互作用する。最も重要なことは、精子の形質膜が卵子外皮と接触することであるが、先体の赤道セグメント上の膜が卵子細胞膜との融合の開始部分であると考えられている（８）。最近、チョン・スー（Chong Xu）ら（２６）によって、窒素キャビテーション、分画遠心分離及びＩＥＦ／ＰＡＧＥ電気泳動によって単離したヒト精子膜小胞（ベシクル）から６４種の形質膜銀染色タンパク質が洗浄剤(detergent)によって抽出し得ることが報告された。しかしながら、精子表面タンパク質の分析における窒素キャビテーション方法の欠点は、充分な開始原料を得るために採取したサンプルを数週間に亘ってプールする必要があることである。更に、キャビテーション法によって得られる「膜」タンパク質が、形質膜のみに由来するものであるかどうか不確実である（２０）。従来、ヒト精子タンパク質の研究において二次元電気泳動が実施されてきたが（１８〜２６）、これまで報告されたタンパク質パターン同士の整合性をとることは、手続きが標準化されていないために難しい。ヒト精子表面タンパク質の全体をカタログ化することは、入手可能なデータが（１）分解能、（２）再現性、（３）ｐＨ範囲、（４）表面標識方法の特異性又は（５）形質膜精製工程のうち一以上の項目において制限をうけていたため妨げられていた。細胞表面タンパク質を分析するための従来法には上述のような欠点があるため、一般に細胞表面タンパク質、特に精子表面タンパク質に関し、分析、同定、特徴づけ、単離及びカタログ化のそれぞれに対して標準化された方法が必要であることは明らかである。発明の要旨すなわち、本発明の一目的は、次の各ステップ：ａ．膜表面のタンパク質を方向性のある（vectorially）標識をし、ｂ．標識した膜表面タンパク質を二次元ゲル電気泳動によって単離し、ｃ．単離した膜表面タンパク質の配列を決定する、を含む膜表面タンパク質の新規な分析方法を提供することである。本発明の更なる目的は、次の各ステップ：ａ．膜表面のタンパク質を方向性のある（vectorially）標識をし、ｂ．標識した膜表面タンパク質を二次元ゲル電気泳動によって単離し、ｃ．単離した膜表面タンパク質の配列を決定し、ｄ．膜表面タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ｅ．ステップ（ｄ）で単離したＤＮＡを用いて膜表面タンパク質を組換によって生成する、を含む膜表面タンパク質に対するワクチンの製造方法を提供することである。本発明の更なる目的は、次の各ステップ：ａ．上記方法で得た膜表面タンパク質を標識し、ｂ．標識した膜表面タンパク質と不妊の有無の診断対象の患者から得た血清とを反応させ、ｃ．血清に存在する抗体と標識した膜表面タンパク質との複合体の生成を検出する、を含む不妊診断方法を提供することである。本発明の更なる目的は、上記方法により製造したワクチンを提供することである。本発明の更なる目的は、上記方法により製造した細胞表面タンパク質を含む診断テストキットを提供することである。本発明の更なる目的は、上記方法により製造した精子細胞表面タンパク質を、患者の卵子の受精を防ぐのに充分な量において当該患者に対し投与することを含む、当該患者に避妊を誘発させる方法を提供することである。本発明の更なる目的は、上記方法により製造した組換タンパク質を哺乳動物に投与し、哺乳動物内で産生した当該組換タンパク質に対する抗体を単離することを含む、避妊薬の製造方法を提供することである。本発明の更なる目的は、上記方法により製造した避妊薬を提供することである。上述の及びその他の目的、長所及び特長は以下の記載から明らかであって、本発明の本質は、以下に記載する本発明の好ましい態様の詳細な説明及び添付クレームを参照することにより、一層明確に理解されるであろう。図面の簡単な説明下に記載する発明の詳細な説明と添付の図面とを合せて考慮することにより本発明の理解が進むにつれ、本発明のより完全な評価及び本発明に付随する多くの長所は容易に理解されるであろう。図１は、銀染色したヒト精子［Ａ＆Ｂ］及び溶解（lysis）バッファーＡに可溶化した無精子症の患者から得た精漿タンパク質［Ｃ＆Ｄ］の二次元ゲル電気泳動分析結果を示す（方法を参照）。タンパク質はＩＥＦ／ＰＡＧＥ（Ａ＆Ｃ）及びＮＥＰＨＧＥ／ＰＡＧＥ（Ｂ＆Ｄ）によって分離し、その結果、約１３００の精子タンパク質スポットの分解能を得た。一次元ゲルのｐＨ勾配を図上部に示す。二つの一次元技法間でｐＨ領域が重なっている点に注意。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはゲルの底部をアノードに設定して実施した。分子量（×１０^-3）を、左マージンに示す。液化精漿においては高分子量タンパク質は比較的少ないが（Ｃ＆Ｄ）、明らかに２０ｋＤａ未満に多数のタンパク質スポットがある。Ｄにおいて、精漿タンパク質の分解パターンは、塩基性タンパク質間に走る斜めの跡によってたどることができる（水平方向矢印）。精漿及び精子タンパク質パターンをコンピュータで比較し、９種類の類似型共移動（co-migrating）タンパク質を同定した（黒白の矢印）。Ａ及びＣにおける白の矢印はアルブミンの位置を示すが、これは明らかに精子表面に付着している。図２は、３人の健康な若い男性から得た精子中の３９．５ｋＤａタンパク質の量変化を示す。この３種類のサンプルに対して、同じバッファータンク内での同時電気泳動分離を含む同一の処理を行った。図２は３種類のＩＥＦ／ＰＡＧＥゲルの拡大図である。銀染色した３９．５ｋＤａタンパク質密度の推定比は、矢印で示した様に、０．４１２（Ａの場合）から３．７０３（Ｃの場合）まで変化した。このような濃度変化は表面タンパク質においても見られる（図７参照）。図３はヒト精子タンパク質中への放射性ヨウ素取込みについての経時的研究である。同じドナーから採取してパーコールで処理した３０×１０⁶個の精子の４種類の分割量を放射性標識した（一分割量につき、ダルベッコＰＢＳ４ｍＬ中で１０ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳと１５０μＣｉのＮａ¹²⁵Ｉを使用）。このヨウ素取込みは、ピペッティングによって触媒ビーズから細胞を除去することにより、５、１０、１５及び２０分後に停止した。精子は遠心分離によってペレット化し、ヨウ素の取込まれた量は、ガンマカウンターでのカウントによって反応バッファー中のヨウ素量と比較した。図４は、溶解バッファーＡ中で抽出した標識精子タンパク質について、前処理を行わなかったもの（Ａ）と方向性のある（vectorially）標識をした後にパーコール密度遠心分離を実施したもの（Ｂ）との比較を示す。標識されたタンパク質の数は、第二パーコール分離を実施した精子サンプルで減少する（Ｂ）。パネルＡにおいて、標識されたタンパク質は多形先体内タンパク質ＳＰ−１０（水平方向の矢じり部分）及びアクチン（白い矢印）を含んでおり、細胞質成分の標識が起こったことを示している。（ＳＰ−１０の免疫ブロットについては図６を参照。）これに対し、対照の細胞質マーカーは標識されなかった（パネルＢ）。この様に、表面標識に続いてパーコール遠心分離を行うことは、表面タンパク質のみの分析を確実にするために重要であると考えられる。図５は、方向性のある（vectorially）ヨウ素化をしたヒト精子タンパク質の二次元ＩＥＦ−ＰＡＧＥを示し、モノクローナル抗体と反応したウェスタンブロットと細胞質成分との対を示している。単一ドナーから得た精子は放射性ヨウ素化し、パーコール遠心分離に付し、非還元条件下（Ａ＆Ｂ）又は還元剤の存在下（１００ｍＭＤＴＴ）（Ｃ＆Ｄ）でバッファーＡで可溶化した。２８％ｐＨ３ −３．５、２０％ｐＨ５−７、７％ｐＨ７−９、及び４５％ｐＨ３．５−１０のアンフォリン組成物を使用し、酸性タンパク質の分解能を高めた。Ａ：ＮＣ膜上に固定化した未還元タンパク質のオートラジオグラム。放射性ヨウ素化パターンにおけるアクチンの位置を矢印で示す。Ｂ：オートラジオグラフィーを行う前に、アクチンに対するｍＡｂでインキュベートしたＡ中のタンパク質のウェスタンブロット。アクチンの４種類のアイソフォームは、予想分子量４３ｋＤａ、ｐＩ値５．１−５．２で分解した。ＢＩ中、オートラジオグラムは対応する免疫ブロットの上部に置いた。広かった領域は、単量体アクチンがヨウ素化されなかったことを明らかに示している。Ｂ１及びＢ２において、水平方向の矢印は５１及び５２ｋＤａの２種類のタンパク質の位置を示しており、免疫学的にアクチンと交差反応している。これらのタンパク質は１：３０００に希釈された抗体の使用において非常にわずかに染色された（図５Ｂ参照）が、抗体を１：１５００希釈で使用した場合、染色はより明確であった（挿入Ｂ２参照）。Ｃ：ＮＣ膜上に固定化した還元タンパク質のオートラジオグラム。水平方向の矢印は、Ｓ−Ｓ結合によって安定化した高分子量複合体に関与する数種の豊富なタンパク質の位置を示す。Ｄ：オートラジオグラフィーを行う前に、β−チューブリンに対してｍＡｂでインキュベートしたＣのウェスタンブロット。ＤＴＴ存在下で精子タンパク質を抽出した後、少なくとも７種類のβ−チューブリンのアイソフォームが予想分子量５７ｋＤａ、ｐＩ値４．６−５．４で免疫染色された。オートラジオグラム中のβ−チューブリンの位置は図５Ｃの垂直方向の矢印によって示す。オートラジオグラム上で、β−チューブリンのアイソフォームの位置が周辺のヨウ素化されたタンパク質からの発光によって覆われたものもあるが、β−チューブリン自体は上記手続きにおいて放射性ヨウ素化されなかった。図６は反射吸光度（reflected absorbance）によるタンパク質イメージングを示し、これによって多形先体内タンパク質ＳＰ−１０が方向性のある（vectoria lly）ヨウ素化をされていないことがわかる。放射性標識したタンパク質をＮＰ −４０及び尿素で可溶化し、ＩＥＦ／ＰＡＧＥで分離し、ＮＣペーパーに転写（ transfer）し、ｍＡｂＭＨＳ１０でインキュベートした。ＤＡＢ基質で呈色発生（colorometric development）させた後、ＳＰ−１０免疫反応生成物を、イメージ増強スクリーンからの反射率によってオートラジオグラム上でイメージ化し［Ｂ］、ＳＰ−１０フォームの正確な位置を影として可視化した。ＳＰ−１０の特性パターン（高分子量体が低分子量体に比べてより酸性である）は公表されたデータ（３２、３３）に合致する。ＳＰ−１０はヨウ素化される可能性のある３個のチロシン残基及び１２個のヒスチジン残基を有する（３２）が、先体反応精子が標識後のパーコール勾配遠心分離によって除去される限り、先体内タンパク質ＳＰ−１０は放射性ヨウ素化タンパク質としては検出されなかった。図７は、２人のドナーから得たヒト精子タンパク質について、二次元電気泳動及びＮＣ膜への転写（transfer）を行った後、方向性のある（vectorially）標識をしたヒト精子タンパク質のオートラジオグラムを比較しており、この図により、ドナー間でヨウ素化されたタンパク質のパターンについて総体的に高い再現性が得られることがわかった。各ドナーから得た同数の放射性ヨウ素化細胞を可溶化し、同量の可溶化物についてＩＥＦ／ＰＡＧＥ（Ａ＆Ｃ）及びＮＥＰＨＧＥ／ＰＡＧＥ（Ｂ＆Ｄ）を行った。８９−＞９５ｋＤａグループ等のヨウ素化された表面タンパク質（垂直方向の矢印で示す）は相対濃度において変化を示したが、これはオートラジオグラム上の全タンパク質の全密度に対し積分した光密度により判断した。図８は、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン標識ヒト精子タンパク質の二次元ゲル電気泳動分析結果を示す。これは、該タンパク質をＮＰ−４０及び尿素で可溶化し、ＩＥＦ／ＰＡＧＥ（Ａ、Ｃ及びＥ）又はＮＥＰＨＧＥ／ＰＡＧＥ（Ｂ、Ｄ及びＦ）によって分離し、ＮＣ膜へ転写（transfer）したものである。Ａ及びＢ：ＡＰコンジュゲートアビジンでインキュベート後、ビオチン化した精子タンパク質をＥＣＬによって可視化した。Ｃ及びＤ：ＡＰ−アビジンだけでインキュベートした非ビオチン化精子タンパク質は、５種類の内因性アビジン結合タンパク質（ＭＷ：７７ｋＤａ、ｐＩ：６−６．５）を示した（Ｃ中の垂直方向の矢印参照）。表面ビオチン化パターンにおける、これら内因性アビジン結合タンパク質の位置は、Ａ中の同様の矢印によって示される。Ｅ及びＦ：ＮＣペーパーに転写（transf er）後、コロイド金で染色したビオチン化精子タンパク質。Ｅ中の当タンパク質はポリクローナル抗血清Ｒ−１０でインキュベートし、精子表面ヒアルロニダーゼである組換マカク(macaque)ＰＨ−２０に対し樹立した。見かけ分子量か５３ｋＤａである３つのＰＨ−２０タンパク質スポットが免疫標識された（Ｅ中の上方向を示す矢印参照）。６５ｋＤａの抗原（ゲルの酸性末端）もウサギ免疫前血清で染色された。上記３つの５３ｋＤａのスポットはビオチンで標識され（Ａ中の同様の矢印参照）、ＰＨ２０の３つのフォームは表面ビオチン化が容易に行えることを示した。Ｆ中では、ＰＨ２０の免疫前血清を使用した。白抜き矢印は、ＮＥＰＨＧＥゲル上の塩基性５３ｋＤａフォームの位置を示す。ＰＨ２０の５３ｋＤａフォームは免疫染色されなかった。図９は、溶解バッファーＢ（ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＵＲＥＡ）中で可溶化したビオチン化ヒト精子タンパク質の二次元ゲル電気泳動分析結果を示す。Ａ及びＢ：銀染色によって可視化したタンパク質。Ｃ及びＤ：ＮＣペーパーにエレクロトランスファー後、ＡＰ−アビジン及びＥＣＬを用いて可視化したビオチン化タンパク質。Ｅ：ｍＡｂＴＵ２７を用いたインキュベーションにより検出したβ− チューブリンの位置を示す免疫ブロット。銀染色及びビオチン化した２−Ｄパターンにおけるβ−チューブリンの位置（Ａ＆Ｃ）を同一の下向矢印によって示す。図９Ａにおいて白抜き矢印によって示す高分子量複合体は、ｍＡｂを用いた免疫ブロット法によってα−チューブリンを含むことが判明した。α及びβ−チューブリンはどちらもビオチン化されなかった。Ｆ：ｍＡｂＳ６９によって検出された繊維状シース（fibrous sheath）抗原を示す免疫ブロット。銀染色及びビオチン化した２−Ｄパターンにおける繊維状シース（fibrous sheath）成分の位置を、Ｂ及びＤ中の同様の斜方向矢印によって示す。この繊維状シース（fibrou s sheath）タンパク質はビオチン標識されなかった。Ｇ及びＨ：精子表面ヒアルロニダーゼＰＨ２０の免疫ブロット。ＰＨ２０の２種類のアイソタイプは免疫染色された（６４ｋＤａ及び５３ｋＤａ）。大きく拡大すると、５３ｋＤａフォームは５つのアイソフォームに分解できた。ＰＨ２０の５３ｋＤａ成分の内、最も酸性度の高いアイソフォームで最も強いビオチン化が起こった。６５ｋＤａの弱い免疫反応性スポット（図９Ｇ中の上方向を指した斜矢印の先端、及び図８Ａ＆Ｅの矢印によって示されている）はウサギ免疫前対照にも存在した（データは示さず）。図１０は、チロシン残基においてリン酸化された精子タンパク質を示す、ｍＡｂＲＣ−２０を用いた免疫ブロットである。新鮮なヒト精子は溶解バッファーＡ中で可溶化され、ＩＥＦＦＰＡＧＥによって分離された後、ＰＶＤＦ膜に転写（transfer）された。優性なホスホタンパク質はＭＷが８９〜９５ｋＤａであり、ｐＩは５．５〜５．８であった。染色の弱いタンパク質も幾つか見られた。矢印は、方向性のある（vectorially）標識をしたホスホタンパク質の５つのグループを示す（表１参照）。図１１は、ＮＰ−４０／尿素可溶化後、銀染色によって検出した１３９７のヒト精子タンパク質のコンピュータ合成イメージを示す。表面ヨウ素化及び表面ビオチン化の両者によって標識した９８のタンパク質の内、９４のタンパク質は銀染色タンパク質と合致し、これらを丸で囲んで示す。これらのタンパク質の特性については、表１に示す。この表１を精子表面インデックスとする。図１２は、相補的及び逆相補的なオリゴヌクレオチドの設計用に選択した精子タンパク質（６３ｋＤａ、ｐＩ：４．３）について、エドマン分解及びタンデム型質量分析計によって得たアミノ酸マイクロ配列データを示す（配列番号：１６ −１８、１２、１９−２０）。このマイクロ配列情報から変性オリゴヌクレオチドプライマーのプールを合成し、ＰＣＲを開始した（図１３参照）。図１３は、マイクロ配列データが６３ｋＤａ、ｐＩ：４．３であるタンパク質に由来する変性オリゴヌクレオチドを用いてヒト精巣ＲＮＡを増幅した結果得られたPCR産物が、約４００ｂｐの単一で突出したＰＣＲ産物であることを示す。図１４は、最適化した変性プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによってもたらされたクローンから得たＤＮＡ配列を示す。各数字は、配列化したクローン及びカルレティキュリン（Calreticulin）遺伝子における塩基対の位置を示す。（ｃ）はＲＴ−ＰＣＲクローン（配列番号：２５）を示し、（Ｈ）はゲンバンク（GenB ank）から得たヒトカルレティキュリンｃＤＮＡ（配列番号：２６）を示す。図１５は、ヒト精子表面タンパク質Ｉ−２３、及び相補的並びに逆相補的オリゴヌクレオチドからタンデム型質量分析計によって得られたマイクロ配列を示す（配列番号：２７−４０）。図１６は、精子表面タンパク質Ｉ−２３の一部をコードするＤＮＡ配列を示す（配列番号：４１）。このＤＮＡ配列は、図１５に示したマイクロ配列に基づいて合成した変性プライマーのプールを用いて、ヒト精巣ＤＮＡを増幅したPCR産物の配列決定を行うことによって得たものである。図１７は、等電点範囲３．５−＞６．５における、９６７の銀染色ヒト精子タンパク質のエンサイクロペディアであり、これは、レーザースキャニング及び、一次元が等電点電気泳動である２−Ｄエレクトロフォログラムのコンピュータデジタル化によって得た。図１８は、等電点範囲６．５−＞１０．５における、４３５の銀染色ヒト精子タンパク質のエンサイクロペディアであり、これは、レーザースキャニング及び、一次元が非平衡ｐＨ勾配電気泳動である２−Ｄエレクトロフォログラムのデジタル化によって得た。発明を実施するための最良の形態本発明においては、当業者の技術の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、タンパク質化学及び組換ＤＮＡ法が利用されるであろう。このような方法は以下の文献にて充分に説明されている。サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：ラボラトリーマニュアル」（１９８９）；「分子生物学における現行プロトコル」Ｉ〜ＩＩＩ巻［アウスベル（Ausubel），Ｒ．Ｍ．編（１９９４）］；「細胞生物学：ラボラトリーハンドブック」Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．セリス（Celis）編（１９９４）］；「免疫学における現行プロトコル」Ｉ〜ＩＩＩ巻［コリガン（Coligan），Ｊ．Ｅ．編（１９９４）］；「オリゴヌクレオチド合成」（Ｍ．Ｊ．ゲイト（Gait）編（１９８４））；「核酸ハイブリダイゼーション」［Ｂ．Ｄ．ヘイムズ（Hames）＆Ｓ．Ｊ．ヒギンズ（Higgins）編（１９８５）］；「転写及び翻訳」［Ｂ．Ｄ．ヘイムズ（Hames）＆Ｓ．Ｊ．ヒギンズ（Hig gins）編（１９８４）］；「動物細胞培養」［Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Freshn ey）編（１９８６）］；「固定化細胞及び酵素」［ＩＲＬＰｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．パーバル（Perbal）、「分子クローニングへの実用ガイド」（１９８４）。従って、本明細書に現れるタームについては以下のように定義する。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的ユニットとして機能する（すなわち、それ自身のコントロールによって複製が可能である）遺伝的成分である（例、プラスミド、染色体、ウィルス）。「ベクター」はプラスミド、ファージ又はコスミド等のレプリコンの一種である。このベクターに他のＤＮＡセグメントが付着し、その結果、付着したセグメントの複製が起こる。「ＤＮＡ分子」はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）のポリマー体を指し、一本鎖又は二重らせんの形をとる。このタームは分子の一次構造及び二次構造のみについて用い、特定の三次構造に限定されるものではない。従ってこのタームは、就く直鎖ＤＮＡ分子（例、制限フラグメント）、ウィルス、プラスミド及び染色体に存在する二本鎖のＤＮＡ分子を包含する。本明細書においては、ある特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について説明する際、塩基配列の記載は、ＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向に向かう従来の方法に従っている（すなわち、鎖はｍＲＮＡと相同の配列を有する）。「複製の起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。ＤＮＡの「コード化配列」は、適切な調節配列のコントロール下に置かれた時、インビボでポリペプチドに転写及び翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列を指す。コード化配列の両境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンとする。コード化配列は、原核性配列、真核性ｍＲＮＡから得たｃＤＮＡ、真核性（例、哺乳類）ＤＮＡから得たゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列をも含むが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列は、通常コード化配列に対し３’に位置する。転写及び翻訳コントロール配列は、宿主細胞においてコード化配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列であり、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等が挙げられる。「プロモーター配列」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼを結合させ、また下流（３’方向）側のコード化配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明においては、プロモーター配列はその３’末端において転写開始サイトによって区切られ、バックグラウンドを超える検出可能レベルで転写を開始するのに必要な塩基又は成分の最小数を含むように上流（５’方向）方向に伸びる。プロモーター配列内には、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）のほかに転写開始サイト（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングで簡便に画定される）が見出される。真核性プロモーターは常にとは限らないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含んでいることが多い。原核性プロモーターは、−１０及び−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルガーノ配列を含んでいる。「発現コントロール配列」は、他のＤＮＡ配列の転写及び翻訳をコントロールし調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード化配列をｍＲＮＡに転写し、引き続きコード化配列によってコードされたタンパク質に翻訳されるとき、コード化配列は細胞内の転写及び翻訳コントロール配列の「コントロール下」にある。「シグナル配列」はコード化配列の前に含まれる。この配列は、宿主細胞と連絡してポリペプチドを宿主細胞表面に向けさせたりポリペプチドを培地中に分泌させるようにするシグナルペプチド（ポリペプチドのＮ−末端）をコードする。このシグナルペプチドはタンパク質が宿主細胞を離れる前に、宿主細胞によって切り離される。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に生来備わっている種々のタンパク質に関連して見出すことができる。本明細書で使用するターム、本発明のプローブについて「オリゴヌクレオチド」とは、二以上の、好ましくは三を超えるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは多くの因子によって異なり、またこれら多くの因子はオリゴヌクレオチドの最終的機能及び用途によって決まる。本明細書における「プライマー」とはオリゴヌクレオチドを指し、これは精製された制限分解物中におけるもののように自然に生ずるものであっても、合成によって生成されるものであってもよく、プライマー伸長産物（これは核酸鎖に対して相補的である）か誘導される条件下（即ちＤＮＡポリメラーゼ等の誘発剤とヌクレオチドの存在下、適切な温度及びｐＨ条件下）で合成開始点として作用することができる。プライマーは一本鎖又は二本鎖であってよいが、誘発剤の存在下で所望の伸長産物の合成を開始させるためには充分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは多くの要因、例えば温度、プライマーの原料及び使用する方法によって決まる。例えば診断用途に応用する場合、標的配列の複雑さにもよるが、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜２５若しくはそれ以上のヌクレオチド（もちろんそれより少ないこともある）を含む。本発明において、プライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の種々異なる鎖と「実質的に」相補的である様に選択される。このことは、各プライマーが各鎖とハイブリダイズするよう、充分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に付着していても、プライマー配列の残りの部分が鎖に対して相補的であれば問題ない。あるいは、ブライマー配列が、ハイブリダイズする相手の鎖の配列に対して充分に相補的で且つこれによって伸長産物合成のためのテンプレートが形成されるのであれば、非相補的な塩基又はより長い配列が該プライマー中に散在していてもよい。本明細書において、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」はいずれも細菌性酵素であり、各酵素はそれぞれ特定のヌクレオチド配列若しくはその付近において二本鎖ＤＮＡを切断する。外因性のＤＮＡ又は異種のＤＮＡが細胞内に導入された場合、この様なＤＮＡによって細胞は「形質転換」される。形質転換ＤＮＡは、該細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に組み込まれる（共有結合する）場合も組み込まれない場合もある。例えば、原核生物、イースト菌及び哺乳類細胞の場合、形質転換ＤＮＡは、プラスミド等のエピソームエレメント上に保持される。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれ、染色体の複製によって娘細胞に受け継がれていく細胞である。この安定性は、形質転換ＤＮＡを有する娘細胞の個体群を含む細胞系又はクローンを形成する真核細胞の能力によって示される。「クローン」とは、単一細胞又は共通祖先から有糸分裂によって派生した細胞の個体群をいい、「細胞系」とは、何世代にも亘ってインビトロで安定に成長することができる一次細胞（primary cell）のクローンをいう。２つのＤＮＡ配列が「実質的に相同」であるのは、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは約８０％、より好ましくは約９０又は９５％）がＤＮＡ配列の決まった長さを超えて合致している場合である。実質的に相同な配列は、配列データバンクとして利用可能な標準ソフトウェアを用いて配列を比較する方法、又はサザンハイブリダイゼーションを、用いる特定のシステムに対して定められた厳しい条件下で実施すること等、によって同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の決定は、当業者の技能の範囲内の事項である。マニアティス（Maniatis）ら、前掲書；ＤＮＡクローニング、Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ、前掲；核酸ハイブリダイゼーション、前掲、を参照されたい。２つのアミノ酸配列が「実質的に相同」であるとは、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは約８０％、より好ましくは約９０又は９５％）が同一であるか、又は保存的置換（conservative substitution）を示している場合をいう。ＤＮＡ構築物の「異種」領域とは、より大きいＤＮＡ分子内において同定可能なＤＮＡセグメントであって且つ天然界では当該「より大きいＤＮＡ分子」には見出せないものである。従って、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常、ソース生物のゲノムにおいて哺乳類のゲノムＤＮＡに隣接（fl ank）しないＤＮＡによって隣接（flank）される。異種コード配列の他の例は、天然ではコード配列自身が見出せないような構築物である（例、ゲノムのコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ、又は野生型遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立（アレル）バリエーション又は天然に起こる突然変異は、本明細書で定義したようなＤＮＡの異種領域の原因とはならない。「抗体」はいずれの免疫グロブリンでもよく、特異的なエピトープと結合する各種抗体及びそのフラグメントを含む。このタームはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びキメラ抗体を含むが、キメラ抗体の詳細については、米国特許第４，８１６，３９７号及び第４，８１６，５６７号に記載されている。「抗体結合部位」とは、重鎖可変、軽鎖可変、及び超可変部からなり抗原と特異的に結合する抗体分子の構造部分である。本明細書において様々な文法表現で用いられている「抗体分子」という語句は、完全な免疫グロブリン分子、及びある免疫グロブリン分子中の免疫学的活性部分の両方を指す。抗体分子の例としては、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、及びパラトープを含む免疫グロブリン分子の一部分でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、及びＦ（ｖ）として知られる部分が挙げられるが、これらの部分は本明細書に記載の診断及び治療方法への使用において好適である。抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）₂部分は、公知の方法によって、それぞれパパイン及びペプシンのタンパク分解反応によって実質的に完全な抗体分子上に調製される。例えば、テオフィロポーロス（Theofilopolous）らによる米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体分子部分も良く知られており、これはＦ（ａｂ’）₂部分から生成されるが、２本の重鎖部分を結ぶジスルフィド結合をメルカプトエタノールで還元し、得られたタンパク質メルカプタンをイオドアセトアミド等の試薬でアルキル化することによって得られる。本発明においては、完全な抗体分子を含む抗体が好ましい。様々な文法表現で用いられている「モノクローナル抗体」という語句は、ある特定の抗原と免疫反応可能な抗体結合部位を一種類のみ有する抗体を指す。すなわち、モノクローナル抗体は、通常、免疫反応する相手の抗原に対し単一の結合性を示す。従って、モノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含んでもよいが、各部位は異なる抗原に対し免疫特異性である（例：二特異性（キメラ）モノクローナル抗体）。「医薬として許容される」という語句は、生理学的に許容でき、通常、ヒトに投与した際に胃痛（gastric upset）、めまい等のアレルギー又は同様の不適な反応を起こさない分子及び組成物を指す。本明細書における「治療的有効量」という語句は、標的細胞マスのＳフェーズ活性の臨床的に重大な変化や、血圧、熱、白血球数の上昇等の病理学的様相を防ぐのに充分な量、あるいは好ましくは３０％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは９０％減少させるのに充分な量を意味する。発現コントロール配列がＤＮＡ配列の転写及び翻訳をコントロールし調節する場合、ＤＮＡ配列は「オペラティブにリンクされている」。「オペラティブにリンクされている」とは、発現されるＤＮＡ配列の前に適当な開始シグナル（例、ＡＴＧ）を有することを含み、また、発現コントロール配列のコントロール下でのＤＮＡ配列の発現、及びＤＮＡ配列によってコードされた所望の産物の生成を許容するために正しいリーディングフレームを維持することをも含む。組換ＤＮＡ分子へ挿入される遺伝子が適当な開始シグナルを含んでいない場合には、開始シグナルをその遺伝子の前に挿入することができる。「標準ハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーション及び洗浄において、５×ＳＳＣ及び６５℃という条件に実質上等しい塩と温度の条件を指す。しかし、当業者であれば、「標準ハイブリダイゼーション条件」かバッファー中のナトリウム及びマグネシウム濃度、ヌクレオチド配列の長さ及び濃度、ミスマッチ率、ホルムアミドの割合等の特定の条件に左右されることは認識しているであろう。また、「標準ハイブリダイゼーション条件」を決めるうえで重要なことは、ハイブリダイゼーションを行う２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ− ＤＮＡ、又はＲＮＡ−ＤＮＡの内どの組み合わせであるかということである。この標準ハイブリダイゼーション条件は、公知の処方（通常ハイブリダイゼーションは、予想若しくは測定したＴｍよりも１０〜２０℃低い温度で、またもし必要であれば、より厳しい条件洗浄を繰り返して行われる）に従って、当業者により容易に決定される。精子表面分子についての詳しい知識は、分化及び成熟の複雑なプロセスの理解を助けるうえで役に立つばかりでなく、細胞膜が精子の機能に関し非常に重要であることから有用である。本発明の方法における、方向性を有する（vectorial）標識化と洗浄剤による可溶化を組み合わせることにより、細胞、バクテリア又はウィルスの分析が比較的少量で実施でき、また、単一の個体またはサンプルにおける（生理学的又は実験的に誘導された）特定のタンパク質パターンの日々の変化の研究が可能である。更に、方向性を有する（vectorial）標識化によって、形質膜タンパク質のエクソフェイシャル定位（exofacial orientation）に関する情報が提供されるが、この情報は窒素キャビテーション法のみでは得ることができない。最初に、酸性、中性及び塩基性のヒト精子タンパク質を単一の方法で分析し、表面露出タンパク質の標識化については２つの方法を比較する。膜表面タンパク質、特にヒト精子タンパク質については多くの２−Ｄデータベースが構築できる。精子細胞膜の組成に対する幅広い理解を早速利用する道として、避妊ワクチンの設計が挙げられる。生物学的標的の表面上の抗体及びＴ細胞メディエーターにアクセス可能な分子に関する知識によって、ワクチンの開発に対する合理的な基礎が築かれる。精子抗原に基づく避妊ワクチンの場合、精子を凝集し、固定化し、溶解するため、又受精過程で起こる事象をブロックする表面接触可能なタンパク質と相互作用させるために、免疫応答が要請される。もし雌性が子宮頚部、子宮、輸卵管からの分泌物中で、精子表面タンパク質に対する抗体を産生すれば、雌性生殖管を通る精子の進行は、幾つかの解剖学的レベルで阻止される。精子に基づく理想的な避妊ワクチンには、内部先体膜（この膜は先体反応の後、精子頭部を覆う制限膜を形成するものである）をはじめとして、頭部、中片、尾部等、精子原形質細胞の全ての主要ドメインから派生した精子抗原の混合物が含まれていると想像される（９）。精子機能をブロックするモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を利用して、形質膜及び内部先体膜上の精子ワクチン免疫原の候補が幾つか同定されている（１０）とはいえ、未だにヒト精子表面免疫原としての可能性を有する物質のフルレンジでの幅広い分析は、これまで実施されていない。オファレル（O'Farrell）の開発した二次元ゲル電気泳動（１１、１２）（この文献全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）をコンピュータ化ゲル解析と組み合わせて使用して、複雑なポリペプチド混合物を分析することができる。専門コンピュータソフトによって二次元ゲルの定量分析が容易になり、各種コンピュータイメージの比較が可能となり、また、実験操作及び環境刺激の変更によって生じるタンパク質パターン変化の詳細な記述も可能となる（１３−１７）。本発明においては、まず方向性を有する（vectorlal）標識化によって主要な表面タンパク質を同定し、その後、洗浄剤による抽出、２次元電気泳動及びコンピュータイメージ解析を行う。この方法を用いて得た情報から、細胞表面タンパク質エンサイクロペディアインデックス、膜表面タンパク質エンサイクロペディア、又は精子タンパク質エンサイクロペディアが得られ、これによって、各種タンパク質（全部で１３９７の精子タンパク質）に対して番号を割り当て、その座標（Ｍｒ及びｐＩ）を定義し、他の全てのたんぱく質に対する相対染色強度値である「積分強度（integrated intensity）」をリスト化する。細胞及び微生物膜は、洗浄剤による処理、乳鉢及び乳棒を用いた破壊、及び超音波処理等、当技術分野で公知の方法のいずれかを用いて破壊することができる。洗浄剤は、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−４０）、ＴＷＥＥＮ、ＳＤＳ等を含んでもよい。また、尿素、及びその他の変性剤も使用できる。標識化には表面タンパク質の標識に適した標識物質を用いる。例えば、標識としてヨウ素（Ｉ¹²⁵）やビオチンを用いることができる。配列決定等の更なる分析に付される「主要な標的(prime targets)」は、好ましくは、一以上の方法を用いて標識したタンパク質である。二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動によるタンパク質の分離は、当業界において公知である。分離用２−Ｄゲルに付し、ゲル分析で同定されたスポットから相当量（配列決定可能な量）のタンパク質を得る。必要であれば、一次元のアンフォリン濃度を変えることによってタンパク質の電気泳動分離を実施できるが、これにより２−Ｄマップの制限領域を拡大し、２ −Ｄゲルフォーマット全体を満たすことができる。この方法によって、所定のｐＩ及びＭｒスペクトル領域内でタンパク質の分離度が大きくなり、多数のタンパク質が集まった領域での分解能が高くなり、また、より多くのタンパク質をロードできるため収率を最適化できる。タンパク質の染色には、各タンパク質の特性及びその後の用途に応じて、ポンソー、クーマシー、銀又は金を用いることができる。タンパク質は、２−Ｄゲルで電気泳動を実施した後、膜サポート上で電気ブロットを行うか、あるいはトリプシン又はリシルペプチダーゼを用いてアクリルアミドゲル内で消化してペプチドとし、その後エドマン分解又はタンデム型質量分析を実施する。表面タンパク質のデータベースは、将来細胞膜タンパク質解析を実施する際のレファレンス、及びマイクロシークェンシングや抗体の産生を行う際の標的選択用ガイドとして使用できる。マイクロシークェンシングの候補である抗原は、不妊血清又は精管切除血清と反応する抗原を含む。別の主なマイクロシークェンシングの候補は、精子凝集抗原１［ＳＡＧＡ−１］である。ＭＥＳ−８ｍＡｂはヒト精液中の精子を１００％凝集し、子宮頚部粘液への精子浸透を妨害し、ヒト精子によるハムスター卵子への浸透を阻害し、インビトロで同種精子を用いたマウス卵子の受精を阻害し、ヒト精子とヒト透明帯との結合を７０％阻害する。ＳＡＧＡ−１抗原は精子表面全体に存在する。アフィニティー精製法も、比較的量の少ない所望のタンパク質を富化するために使用できる。洗浄・採取した細胞、バクテリア又はウィルスは、還元性ジスルフィドを有するビオチン化プローブ（ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンあるいはＮＨＳＯイミノビオチン）で方向性のある（vectorially）標識が可能である。タンパク質は非還元条件下で可溶化させ、ビオチン化表面複合体は固定化ストレプトアビジンでコーティングしたビーズを用いて沈殿させる。沈殿したタンパク質は洗浄後、還元によって溶出し、二次元電気泳動によって分析することができる。このアフィニティービーズ法で富化したビオチン化表面タンパク質のマイクロシークェンシングは、逆相ＨＰＬＣ分離後、高密度に充填した分離用２次元ゲルで実施できる。タンパク質スポットの配列決定は公知の方法で行う。好ましくは、この配列決定はエドマン分解及び質量分析、好ましくはタンデム型質量分析（ＴＭＳ）によって行う。ＰＶＤＦ膜のクーマシー染色タンパク質のスポットはブロットカートリッジにロードし、配列解析を行う。内部配列を得るために、タンパク質をゲル内でリシルエンドペプチダーゼ又はその他のプロテアーゼで消化した後、得られたペプチドをカラム、特に直径１ｍｍのＣ１８カラムで抽出・分離する。分離したペプチドの質量及び純度は、ＦｉｎｎｉｇａｎレーザーＭＡＴを用いたイオン化飛行時間型質量分析及びマトリックス支援レーザーデソープションによって決定する。分離された所望のペプチドを含む溶液は、ポリブレンコーティング後に条件サイクル（condition cycle）を行ったグラスファイバーフィルターに塗布する。このペプチドのＮＨ−末端アミノ酸配列はタンパク質シークェンサーによって決定する。タンパク質全体(intact proteins)を、２０〜３０サイクルのエドマン分解に付し、一方、内部ペプチドの配列決定を質量分析で得た質量を基に適当な限り進める。シークェンシングには標準的なエドマン化学手法を用いる。まず、ＮＨ−末端アミノ酸をフェニルイソチオシアネートを用いて誘導体化し、次にトリフルオロ酢酸で切断してアニリノチオゾリノンアミノ酸を得た後、酸を用いてフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に転換する。このＰＴＨアミノ酸は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１４０ＨＰＬＣを用いて、特にＰＴＨアミノ酸分析用に最適化した直径２ｍｍのＣ１８カラムを用いて、同定及び定量することができる。高感度の内部配列決定はタンデム型質量分析によって実施できる。タンパク質スポットはポリアクリルアミドゲル内で還元及びアルキル化し、重炭酸アンモニウム中でプロテアーゼ（特にトリプシン）による処理を行う。この方法で生成したペプチドは、５０％アセトニトリル／５％ギ酸溶液を用いてアクリルアミドゲルから抽出し、得られた抽出物はほぼ乾固するまで濃縮して再形成（好ましくは１％酢酸中で）する。このペプチドはＬＣ−エレクトロスプレー質量分析システムで分析できるが、特に、ＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴＴＳＱ７０００エレクトロスプレーイオン化タンデム型四重極質量分析計に接続した７５ｇｍｉ．ｄ．キャピラリーＨＰＬＣカラムを用いることができる。結果をペプチドの分子量を決定するために解析し、得られたデータは、特定ペプチドの衝突活性解離（coll isionally activated dissociaion）（ＣＡＤ）解析用タンデム型質量分析計の再プログラムに用いる。ＣＡＤ実験では、第一の質量分析計で所定ヘイズ比（ｍ／ｚ）のイオンを質量によって選択する。このプロセスでは、分子量に基づいてシークェンシング用ペプチドを選択し、他の全てのペプチドは効率よく排除する。選択されたペプチドは、アルゴン原子との衝突によってフラグメント化し、このフラグメント化反応で得た生成物について、タンデム型質量分析システムにおける第二の質量分析計によって質量分析を行う。この方法によって、ペプチドのアミノ酸配列からＣＡＤマススペクトルを得る。このプロセスはコンピュータコントロール下で繰り返され、消化分解物中の各ペプチドについて配列データを得る。質量分析による配列決定は高感度であり、１〜１０ピコモルの開始材料を含んだサンプルから内部配列を得ることができる。タンデム型質量分析計の第一マスフィルターを使用することにより、タンパク質の分解によってもたらされる各種ペプチドを分離することができ、これによってエドマンシークェンシング法では純粋なペプチドを得るのに必要であったクロマトグラフィー工程が不要となる。しかし、エドマンシークェンシングでは完全タンパク質のＮ末端（ＮＴＨ末端がブロックされていない場合）からデータを得ることが可能で、３０種類、またある場合にはそれ以上のアミノ酸残基を得ることができる。質量分析シークェンシングに比較すると感度は低いが、エドマン分解では質量分析計に比べて長いペプチドの配列決定が可能であり、質量分析計では区別できなかったロイシンとイソロイシンとが容易に区別できる。エドマン法では分析機器に導入する前にペプチドの精製を行わないため、２次元電気泳動調製によってタンパク質の分離及び濃縮を注意深く行う必要がある。エドマン法では、オリゴヌクレオチドの設計に必要とされる充分な長さの内部配列を得るために、１０〜１５ピコモルの開始材料が必要である。しかし、充分に長いタンパク質の長いアミノ末端配列解析には２ピコモルの材料で充分である。得られたアミノ酸配列情報から、オリゴヌクレオチドを設計することができる。好ましくは、アミノ酸配列の全ての可能なコドンの組み合わせを示すオリゴヌクレオチドを変性（あるいは、コドンの第三位置にイノシンを使用）し、このようなオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡコード化膜表面タンパク質を含むライブラリーとのハイブリダイゼーション、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）好ましくはＲＴ−ＰＣＲによる増幅によって、クローニングに使用できる。２種類の固定プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲアプローチは、ＰＣＲプロトコルの容易さ及び速さという利点を有する。しかし、遺伝コードが変性するため、公知のアミノ酸に基づいてオリゴヌクレオチドを選択する場合、所定のアミノ酸配列に相当するプローブを数多く合成する必要がある。各タンパク質からは、長さにおいて７以上の残基を持ったアミノ酸配列が少なくとも２種類必要である。［しかし、２種類の配列が得られなかった場合、１種類の配列は５’及び３’ＲＡＣＥと共に使用できる。］ＰＣＲ用プライマーの最適な長さは２０〜３０のヌクレオチドである。当然の事ながら、長さが少なくとも２０塩基であるプライマーを２種類設計するためには、少なくとも７つの隣接したアミノ酸からなる明確な配列を、所定タンパク質の一次構造の内少なくとも２箇所から得なければならない。ファクターの組み合わせは、各オリゴヌクレオチドの正確な組成を検出する際、及び所定のアミノ酸配列の中の標的となる部位を選択する際に考慮しなければならない。ファクターの例として、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量、配列決定された信頼しうるアミノ酸残基の数、及びオリゴヌクレオチド・プールに固有の融解点等がある。最適な長さである２０〜３０塩基内でオリゴヌクレオチドを生成するためには、最小でも少なくとも７アミノ酸からなるストレッチをマイクロシークェンシングによって得る必要がある。長いアミノ酸配列が得られれば、最適なオリゴヌクレオチドが設計できる機会は増える。適切な長さのｃＤＮＡフラグメントのＲＴ−ＰＣＲを容易にするため、Ｎ末端及び内部タンパク質配列又は２つの内部アミノ酸配列によって、オリゴヌクレオチドプールがＲＮＡの分離された領域から生成し増幅される。プローブは次のように各種方法に使用できる。１）二組の固定化したオリゴヌクレオチドをＲＴ−ＰＣＲ反応に付してｃＤＮＡフラグメントを増幅し、引き続き、このｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして充分な長さのｃＤＮＡを得る。２）一組以上のオリゴヌクレオチド・セットを用いてＰＣＲ−ＲＡＣＥ反応物を固定化して３’又は５’ｃＤＮＡフラグメントを増幅し、これをｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用する。３）ＰＣＲとＰＣＲ−ＲＡＣＥの組み合わせを用い、別々のＰＣＲ反応で得た配列を接合することにより完全長のｃＤＮＡを得る。４）オリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡライブラリーを直接スクリーニングする。１つのアミノ酸配列が未知のタンパク質から得られた場合、単一の「固定（an choring）」最適化オリゴヌクレオチドプールを改変ＲＡＣＥプロトコルで用いて、既知の配列から上流側又は下流側の３’又は５’配列のいずれかを派生させることができる。この方法では、単一の内部アミノ酸配列は、提案されたセンス鎖（５’−ＲＡＣＥ）又はアンチセンス鎖（３’−ＲＡＣＥ）のいずれかに対して、逆相補的オリゴヌクレオチドを設計するのに使用できる。増幅反応のアンカリングのための第二のオリゴヌクレオチドは、市販されているｃＤＮＡライブラリーの５’又は３’末端に置かれたリンカーの既知の配列から得られる。この方法は現在キットの形で入手できる（マラソン−レディー（Marathon-Ready）ｃＤＮＡＳ^TM；クローンテック（Clonetech））。好適なｃＤＮＡライブラリーの例として、１）５’−Ｓｔｒｅｔｃｈ（クローンテック（Clonetech））、２）λ−ｚａｐ、及び３）λ−ｇｔ１１ＣＤＮＡライブラリーが挙げられる。これら３つのライブラリーは、各種精巣タンパク質の完全長ＯＲＦを回収するために使用されてきた。増幅したｃＤＮＡプローブを用いてライブラリーをプローブする方法はよく知られている。すなわち、取扱説明書に従って、オリゴヌクレオチドの末端を（λ−³²Ｐ）−ｒＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、精製してハイブリダイゼーションに使用する。ポジティブ対照として、ノーザンブロットを最初にプローブし、PCR産物が全ＲＮＡ内での特定のｍＲＮＡメッセージを認識するかどうか確認できる。５’ −ＳｔｒｅｔｃｈｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（Clonetech））は、取扱説明書に従って１５０ｍｍの寒天上に置き、ＭＳＩフィルター（フィッシャー（Fisher））を用いてデュープリケート(in duplicate)にリフトする。このフィルターをＵＶ架橋させ、標準液中で一晩プリハイブリダイズ及びハイブリダイズさせる。フィルターをＸ−ｒａｙフィルムに露出し、得られたポジティブクローンをデュープリケート・フィルター(duplicate filters)から同定し、偽陽性（false positive）を除去する。このフィルムを、もとの培養プレートに再配置し、コアを抜きとる。一次プラークは、プレート上の全てのプラークがポジティブとなるまで、再プレーティング及び再スクリーニングする。精製時の各ステップにおいてファージのサンプルは−２０℃に保たなければならない。クローンは一旦単離された後、ＰＣＲにより増幅するが、その際、ライブラリー作製時に利用したクローニング部位に隣接したファージ配列に対して製作したプライマーを用いる。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡインサートは酵素で制限されることができ、得られたフラグメントを分離し、アガロースゲル上にサイズに従って並べる。別々のクローンについて制限分析を行うと似たサイズのフラグメントが得られるが、このことから変性オリゴヌクレオチドが同一のクローンを認識したことが確認される。変性オリゴヌクレオチドを用いたｃＤＮＡライブラリーの直接スクリーニングは実施できるが、通常は、ＰＣＲを基にしたアプローチが行われていない場合にのみ実施される。末端を³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチドの混合物は、アミノ酸マイクロシークェンスをコード化した系統学的にバイアスされたコドンに基づいて選択できる。オリゴヌクレオチドは上記パラメータに従って設計されるが、その際、縮重度がなるべく低い（＜３００）プールとすることに重点を置く。ポジティブな結果は、１７オリゴマーのオリゴヌクレオチド・プールから得られている。オリゴヌクレオチド・プールがこのカットオフに比べて大きい場合には、全ての組み合わせの可能性を有する多数のプールを使用できる。主コントロール試験は、まず最初にポリ−（Ａ）^-ｍＲＮＡを含むノーザンブロットに対して末端標識プールをハイブリダイズし、洗浄及びＸ−ｒａｙフィルムへの露出の際にポジティブバンドを得るようなハイブリダイズ条件を決定する。一旦ハイブリダイズ条件及び洗浄の条件（塩及び温度）が決まったら、上記のｃＤＮＡライブラリーを二重に(in duplicate)プレートアウトし、アウスベル（Ausubel）が提案した様な条件で、標識オリゴヌクレオチドプールを用いてリフトし、プローブする。二つ(duplicate)のリフト間で比較を行い、偽陽性のものを排除し、二次及び三次のスクリーニングを行い、提案されたクローンの純度及び正確さを確かめる。可能であれば、同様のライブラリーリフトを、未知のタンパク質の別領域に由来する第二のオリゴヌクレオチド混合物を用いた再スクリーニングに付す。あるいは、膜表面タンパク質に対する抗体を発現ライブラリーのスクリーニングに使用できる。単特異性抗血清を、２次元ゲルから単離したタンパク質スポットに対して生成することができる。その際、二つのアプローチがとられる。１）動物を、標準筋内免疫法に従って完全フロイントアジュバント中で乳化したアクリルアミドゲルのコアを含むタンパク質で免疫する。２）トランスファーされた特定の精子タンパク質を含むニトロセルロースの細片を完全フロイントアジュバントに浸した後、皮下または腹腔内に移植する。これらの方法によって生成した単特異性血清の分割量をウェスタンブロッティングに付し、終点タイターを決定し、所望のタンパク質プロットに対する特異性を確認する。もし抗血清のタイターが低い場合には、特定のタンパク質バンド又はタンパク質スポットから得たニトロセルロース結合タンパク質を使用したオルムステッド（Olmstead）法を用いて、抗体をアフィニティー精製して抗体富化溶液を作製することができる。発現ライブラリーは、両方向（６Ｘヌクレオチドプロービングに用いた密度）で３つ全てのリーディングフレームを占める程の充分な数にプレーティングし、１０ｍＭＩＰＴＧ含侵フィルターで誘発する前に３〜４時間３７℃で成長させ、４２℃でインキュベートする。Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質との反応性を除去するため、同一動物から得た単特異性血清及び免疫前血清に一晩に二回、４℃で臭化シアン活性セファロースに結合したＥ．ｃｏｌｉを吸収させる。制限分析による最大インサートを含むｃＤＮＡ保有ファージクローンがプラスミドに転換される。長いストレッチを正確に配列決定するために必要な高度に精製されたプラスミドＤＮＡは、大規模培養（≧１００ｍＬ）によるプラスミド保有バクテリアの増幅、及びこれに続く標準方法によるＣｓＣｌ平衡遠心分離によって調製される。クローニング部位をブラケットするプラスミド配列に対する標準プライマーを作製し、配列決定に用いる。配列決定は、好ましくはシークェナーゼ（Sequenase）（キットを用いたチェーンターミネーター法によって行う。配列化は両方向に進み、新しいｃＤＮＡ特異プライマーが内部配列に対して作製され、配列化は配列が重複するまで続く。あるいは、四色シークェンシングを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｒｉｓｍ３７７自動化ＤＮＡシークェンサーを用いて行うことができる。オープンリーディングフレームは、推定開始サイト同様コンピュータ解析によって求め、クローンが充分な長さであるかどうか決定する。更に、マイクロシークェンシングによって得たもとのアミノ酸配列も同定されなければならない。仮に、この配列がｃＤＮＡクローンの「二重固定(doubleanchored)」ＲＴ−ＰＣＲ派生を許容する程度にもたらされない場合は、オリゴ−ｄ（Ｔ）を第二の「固定(anchoring)」オリゴヌクレオチドとして使用できる。時として、圧縮(compression)によってクローン領域があいまいな結果となる場合もある。この場合には、３７℃ではなく７２℃でシークェンシング反応が実施可能なＴａｑＴｒａｃｋ（ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて解読可能な配列を得ることができる。反応段階時に温度が高いと、通常、どの潜在的一本鎖領域にも信頼度の高い融解が起き、信頼できる明確な配列が得られる。配列は遺伝子データバンクとの比較により、公知のタンパク質に対する同一性又は相同性を調査することができる。ヒト及び霊長類モデルにおける推定上の抗原の組織特異性を評価するため、主要なサル及びヒトの器官から得たＲＮＡのノーザンブロット解析を行うことができる。−７０℃で貯蔵した各種組織から全ＲＮＡを単離することができる。オリゴ−ｄ（Ｔ）クロマトグラフィーによって、全ＲＮＡからポリ（Ａ＋）ＲＮＡを精製する。ＲＮＡをエタノール沈降で濃縮した後、無菌蒸留水（１０５ｍＬ）中で再懸濁を行う。各サンプル中のポリＡ＋ＲＮＡ量は２６０ｎｍにおける光学密度［ＯＤ１．０＝４０ｍｇ／ｍＬ］の読み取りによって定量化できる。各組織から得た試験用の等量のポリＡ＋ＲＮＡサンプル（例、２ｍｇ）は、変性アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離し、分離されたＲＮＡはナイロンに転写（ transferred）した。ナイロンを２ＸＳＳＣ中で５分間すすいだ後、ＵＶ光を用いてＲＮＡをナイロンに架橋させた。このナイロンをプレハイブリダイズさせ、次いで１０ｍｇ／ｍＬの³²Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを含む新鮮なハイブリダイゼーションバッファー中で、一晩６５℃にてハイブリダイズする。プローブは、検討下の抗原用ｃＤＮＡ又はβ−アクチン若しくはシクロフィリンのコントロールプローブで構成されているであろう。このプローブは、プロトコル及びプロメガ社から購入したキットを用いたランダムプライミングによって標識することができる。必要となれば、低ストリンジェンシー及び高ストリンジェンシー条件の両方とも試験しなければならない。オートラジオグラフは、増感スクリーンを用いて露出する。テストプローブを用いたハイブリダイゼーションに引き続き、ナイロンブロットを剥し、コントロールの内の一種（β−アクチン又はシクロフィリン）を用いて再プローブし、ＲＮＡが等しくロードされていることを確認する。抗原の組織特異性は、逆転写された各組織から得たＲＮＡ、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅して得られるｃＤＮＡを用いても評価することができる。目的のＲＮＡに特異的な各プライマー（それぞれ翻訳の開始箇所及び終止箇所に亘ってマッピング）を用いることができる。ポジティブコントロールには、β−アクチン特異プライマーを使用できるが、これはβ−アクチンｃＤＮＡの保存領域に基づいて選択され、介在配列の１９８のヌクレオチドによって分離される。臭化エチジウムを用いて染色した後、PCR産物を可視化し、そのサイズを推定する。ＲＣＲ生成物が実際に目的の物質に相当するかどうかは、検討下にある抗原に特異的なｃＤＮＡを用いたサザンブロットによるハイブリダイゼーションによって確認する。抗原の組織特異性は、免疫組織化学的な研究、好ましくはアフィニティー精製抗体を用いた別の方法によっても評価することができる。各種パラフィン包埋組織を収集しバンクとして保持することができる。タンパク質は、パラフィン包埋セクションの免疫ペルオキシダーゼ標識によってこの組織バンク中に局在させることができる。組織は、１０％中性バッファーホルマリン（Ｓｉｇｍａ）を用いて数時間固定する。この組織はエタノール系列溶媒に通して脱水し、パラフィンに包埋し、切断し、スライド上に載置する。使用する前に、各セクションは脱脂し、再び水分補給し、０．２５％過酸化水素水で処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする。非特異性タンパク質結合部位は、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）含有ＰＢＳ中でスライドをインキュベートすることによってブロックできる。スライドは、組換タンパク質に対して樹立したアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体、又は、ＰＢＳ−ＮＧＳで希釈し、洗浄し、その後ＰＢＳ−ＮＧＳ中でペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ／ＩｇＭを用いてインキュベートしたコントロール免疫前血清のいずれかを用いてインキュベートした。スライドはＰＢＳで洗浄し、免疫反応性タンパク質はＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）、又は金増強染色を用いて染色し、可視化した。青又は黒の沈殿物の存在は、免疫反応性タンパク質の存在を示す。現在までに行われた精子表面タンパク質のマイクロシークェンス解析において、熱ショックタンパク質９０アルファに対する相同性（８２％）、ガストリン結合タンパク質に対する相同性（９４．７％）、ヒトカルレティキュリンに対する相同性（１５のアミノ酸で１００％）、マウス繊維状シースタンパク質に対する相同性（６４％）、及び血清アミロイド成分前駆体に対する相同性が見出された。マイクロシークェンシングを行ったタンパク質の約４０％が新規であることが判明した。表Ｉは新規精子表面タンパク質のコーディネートを示す。本発明の方法によって同定した膜表面タンパク質は、診断用途及び治療用途の両者に用いられる。細胞又は他の標的と膜表面タンパク質の結合を減少させたい場合又は阻害させたい場合に、膜表面タンパク質に対する抗体を含む適当な阻害剤を導入し、膜表面タンパク質とリガンド又は当タンパク質レセプターとの相互作用をブロックすることができる。本発明の膜表面タンパク質に対して擬態（mimicry）若しくは拮抗（antagonis m）を示す剤、あるいは該タンパク質の生成を制御する剤は、好適な担体を用い、標的細胞、バクテリア又はウィルスの存在に関連する医学的に好ましくない状態（adverse medical condition）を経験した患者に対しその治療用に各種手段によって投与するのに効果的な強度で医薬組成物に調製することができる。各種投与方法を用いることができるが、その中でも皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、及びカテーテル法等の非経口投与方法が適している。膜表面タンパク質又はそのサブユニットの平均量は異なり、特に有資格の医師又は獣医師の推薦及び処方箋に拠るべきである。好適な実施態様においては、本発明は、精子細胞と卵子との相互作用を阻害するか、精子の女性生殖道内の通過を阻害するか、あるいは、精子を固定化するために膜表面タンパク質又はその抗体を投与することに関し、言い換えれば避妊薬に関する。本発明の膜表面タンパク質及びポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体を含む抗体は、一定の診断用途を有し、例えば、バクテリア又はウィルス感染、精子細胞に対する免疫等の状態を検出し測定する目的に利用される。例えば、膜表面タンパク質又はそのサブユニットは、それら自身のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を各種細胞媒体中で作製する場合に使用されるが、これは例えば、融合マウス脾臓リンパ球及び骨髄腫細胞を用いたハイブリドーマ法等の各種公知の方法によって行われる。同様に、本発明の膜表面タンパク質の活性を模倣し拮抗する小さな分子が、発見され若しくは合成されてもよく、また診断用及び／又は治療用プロトコルに使用されてもよい。全タンパク質に対するポリクローナル抗体の生成に代わるものとして、充分なアミノ酸配列をマイクロシークェンシングから得ることができ、合成ペプチド免疫原の開発が可能である。これらペプチド免疫原は免疫避妊薬として使用できる。あるいは、仮に目的のタンパク質のクローニングがＲＴ−ＰＣＲ、又はオリゴヌクレオチドや上記で調製したポリクローナル抗体を用いた直接ライブラリープロービングを用いて達成されなかった場合には、抗ペプチド抗血清をキメラペプチドに対し生成することができる。この戦略において、アミノ酸配列は、介在リンカー（ＧＰＳＬ）（配列番号：２）を用いて破傷風トキソイドから得た乱雑Ｔ細胞エピトープ（ＶＤＤＡＬＲＮＳＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶ）（配列番号：１）と接合（conjugate）することができる。抗ペプチド抗血清は、続いてｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングに使用できる。組換抗原に対するポリクローナル抗体の産生は、雌性ニュージーランド白ウサギに、完全フロイントアジュバント（一回）及び不完全フロイントアジュバント（５回）を用いて組換抗原を投与する（約５００μｇ）（３週間間隔で計６回注射を実施）。血清は、第二回目の注射後、一週間毎に得ることができる。アフィニティー精製抗体の産生において、臭化シアン活性セファロース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、ＳｔＬｏｕｉｓＭＯ）を精製組換抗原の固定化相として使用できる。ポリクローナル抗体を、抗原アフィニティーカラムに注入し（pumped over）、抗体と結合する。結合した抗体は溶出し、各フラクションをＵＶ吸光度によってモニターする。各フラクションをプールし、抗ウサギＩｇ試薬を用いてブロッティングすれば、どのバンド位置が精製Ｉｇであるかがわかる。精製ＩｇＧのＥＬＩＳＡ終点滴定を、一定量の組換抗原に対する同一タンパク質濃度にて数バッチ行うことができ、これによって抗原結合の保持が示される。精子抗原の研究において、組換精子抗原に対するアフィニティー精製抗体を、精子膜抽出物をロードした２次元ゲルのウェスタンブロットと免疫反応させることができる。精子機能アッセイを実施し、組換抗原に対するアフィニティー精製抗体が精子表面上の生(native)の抗原に対し反応するか、また、精子の機能に影響を与えるかを評価することができる。これらアッセイには免疫蛍光による精子上抗原の局在化、ＦＡＣＳによる表面位置の確認、精子／卵子の試験［精子浸透アッセイ］、精子／帯相互作用試験［ヘミ−ゾナ（Hemi-zona）アッセイ］、精子凝集試験、及び精子固定化試験を含まれる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体を生成する一般的な方法はよく知られている。不死の抗体生成細胞系は、腫瘍ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン・バーウィルスを用いた形質移入等の融合以外の方法によっても生成することができる。例えば以下の参考文献が挙げられる。Ｍ．シュライアー（Schreier）ら、「ハイブリドーマテクニック」（１９８０）；ハンマーリング（Hammerling）ら、「モノクローナル抗体及びＴ細胞ハイブリドーマ」（１９８１）；ケネット（Kennett）ら、「モノクローナル抗体」（１９８０）。更に以下の米国特許も挙げられる。米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４５１，５７０号、第４，４６６，９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９１，６３２号、第４，４９３，８９０号。膜表面ペプチドに対して生成したモノクローナル抗体のパネルは、各種特性、すなわち、アイソタイプ、エピトープ、アフィニティー等によってスクリーニングすることができる。特に所望されるモノクローナル抗体は、膜表面タンパク質又はそのサブユニットの活性を中和する抗体である。高アフィニティー抗体も、生の(native)又は組換による膜表面タンパク質の免疫アフィニティー精製が可能な場合には有用である。好ましくは、本発明の診断方法に用いる抗体はアフィニティー精製ポリクローナル抗体である。更に好ましくは、本発明の診断方法に用いる抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。更に、本発明において用いられる抗体分子として好ましいのは、全抗体分子の内のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦ（ｖ）部分の形態である。前の部分で提案したように、本発明の診断方法は、膜表面タンパク質に対する結合パートナー（抗体、好ましくはアフィニティー精製ポリクローナル抗体、更に好ましくはｍＡｂ等）の効果量を含んだアッセイ手段によって細胞サンプル、血清サンプル又は媒体を検査することを含む。更に、本発明において用いられる抗体分子として好ましいのは、全抗体分子の内のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦ（ｖ）部分の形状（form）である。前述したように、この方法によって恩恵を受けることのできる患者には、バクテリア又はウィルス感染に苦しんでいる患者、又は避妊を望んでいる患者が含まれる。膜表面タンパク質を単離する方法、抗体を誘発する方法、及び抗体能力を決定し、最適化して標的細胞の検査を補助する方法は公知である。ポリクローナル抗ポリペプチド抗体の生成方法は公知である。例えば、ネスター（Nestor）らの米国特許第４，４９３，７９５号が挙げられる。モノクローナル抗体、特に有用な抗体分子のＦａｂ及び／又はＦ（ａｂ’）₂部分を含む抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。この技術は「抗体−ラボラトリーマニュアル」、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、ニューヨーク（１９８８）に記載されているが、これを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。すなわち、モノクローナル抗体組成物が産生したものからハイブリドーマを形成するために、骨髄腫（ミエローマ）又は他の自己永久化（self-perpe tuating）細胞系を、膜表面タンパク質若しくはその結合部分を用いて高度免疫した哺乳動物の脾臓から得たリンパ球と融合する。スプレノサイト（splenocytes）は通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を用いて骨髄腫細胞と融合する。融合ハイブリッドはＨＡＴに対する感度によって選択する。本発明を実施する上で有用なモノクローナル抗体生成ハイブリドーマは、膜表面タンパク質との免疫反応能力及び特異的な感染活性又は標的細胞の受精を阻害する能力によって同定される。本発明を実施するうえで有用なモノクローナル抗体は、適切な抗原特異性を有する抗体分子を分泌するハイブリドーマを含む栄養培地を用いた、モノクローナルハイブリドーマ培養の開始によって産生できる。この培養は、各条件下でハイブリドーマが抗体分子を培地中に分泌するのに充分な時間保持される。引き続き抗体含有培地を採取し、抗体分子を更に公知の方法で単離できる。これら組成物の調製に有用な培地は、公知であって市販されており、合成培養培地、近交マウス等を含む。典型的な合成培地は、４．５ｍｇ／Ｌのグルコース、２０ｍｍのグルタミン及び２０％のウシ胎児血清で補足したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；ダルベッコ（Dulbecco）ら、Ｖｉｒｏｌ．８：３９６（１９５９））である。典型的な近交系マウスはＢａｌｂ／ｃである。モノクローナル抗体の作製方法もまた公知である。（ニーマン（Niman）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９−４９５３（１９８３）を参照。）一般に、膜表面タンパク質又はペプチドアナログは、単独で若しくはモノクローナル抗体を生成する前記過程における免疫原として免疫原生担体と接合して用いる。ハイブリドーマは、膜表面タンパク質と免疫反応する抗体を生成する能力についてスクリーニングする。本発明は、更に本発明の治療的方法を実施するうえで有用な治療用組成物を目的とする。本発明の治療用組成物は、医薬として許容される賦形剤（担体）及び一以上の膜表面タンパク質（すなわち、細胞、バクテリア又はウィルスの膜表面タンパク質）、特に当タンパク質の精子抗原ポリペプチド又は当タンパク質のフラグメント（これは本明細書において有効成分と言及されているもの）を含む混合物である。好ましい実施態様において、当組成物は精子抗原又は受胎阻害可能なこの抗原の混合物を含む。有効成分としてポリペプチド、アナログ又は活性フラグメントを含む治療用組成物の調製は公知である。一般的に、このような組成物は、注射可能な様に溶液又は懸濁液として調製するが、注射前の溶液又は懸濁液に適した固状物も調製できる。調製の際には乳化も行われる。治療用有効成分は、医薬として許容され有効成分と適合する賦形剤と混合することが多い。好適な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びこれらの混合物等がある。更に必要であれば、当組成物は保湿剤又は乳化剤、及び／又は有効成分の効果を高めるｐＨ緩衝液等の補助剤を少量含んでもよい。ポリペプチド、アナログ又は活性フラグメントは、医薬として許容される中和塩の形状で治療用組成物に製剤することができる。医薬として許容される塩は、酸添加塩（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、これは塩酸又はリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマンデル酸等の有機酸を用いて形成する。遊離カルボキシル基から形成される塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカイン等の有機塩基から派生する。治療用ポリペプチド、アナログ、又は活性フラグメント含有組成物は、従来、静脈内投与、例えば単位投与量の注射によって投与されてきた。本発明の治療用組成物に関して用いられるターム「単位用量(unit dose)」とは、ヒトに対して単回で用いる量として適した物理的に離散した単位（physically discrete unit s）を指し、各単位は、必要希釈剤（すなわち、担体又は賦形剤）に関連して、所望の治療効果が得られる様計算された所定量の活性物質を含む。本発明組成物は、投与剤形に適した方法で治療的有効量を投与される。投与量は治療対象、有効成分を用いる対象の免疫システム能力、及び所望の結合能力の程度によって異なる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断によって異なり、各個人に特有なものである。しかしながら、適切な投与量は、一日あたり各個人の体重１ｋｇにつき有効成分にして約０．１〜２０ｍｇ、好ましくは約０．５〜１０ｍｇ、更に好ましくは１〜数ｍｇであり、投与経路によって異なる。初回投与及びブースターショット（booster shot）についての適切な投薬計画も異なるが、典型的には、初回投与の後、１時間以上の間隔をおいて注射又はその他の方法によって投与を繰り返す。あるいは、血液中１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するのに充分な連続的静脈内注入を行っても良い。本発明の治療用組成物は更に、膜表面タンパク質に対する拮抗薬又は抗体の有効量、及び有効成分（抗生物質及びステロイド）の一以上の成分の有効量を含んでもよい。本発明の他の特徴は、標識、解析及び配列決定後に得たＤＮＡ配列によってコードしたタンパク質の発現である。当技術分野で良く知られているように、ＤＮＡ配列の発現は、ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター中の発現コントロール配列に対しオペラティブにリンクさせ、その発現ベクターを用いて適当な単細胞宿主を転換することで達成される。本発明ＤＮＡ配列の発現コントロール配列に対するこの様なオペラティブな結合には、当然の事ながら、もしすでにＤＮＡ配列の一部となっていない場合には、ＤＮＡ配列の上流側の正確なリーディングフレーム内に開始コドンであるＡＴＧを提供することが含まれる。各種宿主／発現ベクターの組み合わせを、本発明のＤＮＡ配列の発現に使用できる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体及びＤＮＡ配列のセグメントによって構成される。好適なベクターとして、ＳＶ４０の誘導体、及び公知の細菌性プラスミド（例、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドコルＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢｑ及びそれらの誘導体、ＲＰ４等プラスミド）、ファージＤＮＡＳ（例、ファージλの多数誘導体（例、ＮＭ９８９））、他のファージＤＮＡ（例、Ｍ１３）及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ、２μプラスミド又はその誘導体等のイーストプラスミド、昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター、ファージＤＮＡ又は他の発現コントロール配列を使用できるように変性されたプラスミド等のプラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター等が挙げられる。各種発現コントロール配列（その配列にオペラティブにリンクされたＤＮＡ配列の発現をコントロールする配列）は上記ベクター内で使用され、本発明のＤＮＡ配列を発現する。この様な有用な発現コントロール配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ又はアデノウィルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ＬＴＲシステム、ファージλの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質のコントロール領域、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼ（例、Ｐｈｏ５）のプロモーター、イーストα交配因子のプロモーター、及び原核細胞又は真核細胞又はそれらのウィルスの遺伝子の発現をコントロールするものとして知られている他の配列、及びこれらの各種組み合わせが含まれる。各種単細胞宿主細胞もまた、本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これら宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの株等の公知の真核及び原核宿主、及びイースト等の菌類、及びＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、及びＬ−Ｍ細胞等の動物細胞、アフリカミドリザルの腎臓細胞（例、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、及びＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例、Ｓｆ９）及び組織培養におけるヒト細胞及び植物細胞が含まれる。必ずしも、全てのベクター、発現コントロール配列及び宿主が本発明のＤＮＡの発現に対して同等に機能しないことは理解されるであろう。また、同様の発現システムに対しても全ての宿主が同等には機能しないであろう。しかし、当業者であれば、過度の実験を行わなくても、適切なベクター、発現コントロール配列及び宿主を選択することができ、本発明の趣旨を逸脱せずに所望の発現を得ることができるであろう。例えば、ベクターを選択する際、ベクターは宿主内で機能できなければならないため宿主の選択を考慮しなければならない。また、ベクターのコピー数、コピー数をコントロールする能力、及び抗生物質マーカー等のベクターによってコード化された他のタンパク質の発現も考慮しなければならない。発現コントロール配列を選択する際、通常各種因子が考慮される。この因子には、例えば、システムの相対強度、コントロール性、及び発現される特定のＤＮＡ又は遺伝子（特に潜在二次構造に関して）に対する適合性が含まれる。好適な単細胞宿主は、選択したベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を正しく折りたたむ(fold)能力、発酵の必要事項、また、発現されるＤＮＡ配列によってコードされた生成物の宿主に対する毒性、及び発現生成物の精製が容易であることを考慮に入れて選択される。以上の因子及び他の因子を考慮に入れて、当業者であれば、発酵又は大規模動物培養において、本発明のＤＮＡ配列によってコードしたタンパク質を発現する、ベクター／発現コントロール配列／宿主の各種組み合わせを構築することができるであろう。ｃＤＮＡは、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中でバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーターシステムのコントロール下でクローン化される。もしあれば、内因性シグナルペプチドの代わりに、細菌性シグナルｐｅｌＢ配列を用いることができる。ｐＥＴベクターにおける発現において、ａ）異種遺伝子がイン・フレームでｐｅｌＢ配列と５’末端で融合する（生成タンパク質の細胞周辺腔への輸送を容易にするため）こと、及びｂ）異種遺伝子がイン・フレームで６つのヒスチジンのストレッチ（ｈｉｓ−ｔａｇ）と３’末端で融合する（固定化イオンアフィニティークロマトグラフィーによる精製用アンカーを提供するため）ことは重要である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング戦略は、充分な長さのタンパク質が必要な時にいつでも発現されるような遺伝子発現用構築物の形成に使用できる。インサートは配列決定によって確認できる。抗原コード化領域を有するクローンは、３７℃でアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）添加３Ｘテリフィックブロス（terrific broth）中で生育できる。細胞のＡ₆₀₀が０．６に到達した場合、０．４ｍＭのＩＰＴＧの添加によって培養を誘発できる。ネガティブコントロールとして、宿主細胞培養を同様の方法で処理することができる。発現されたタンパク質の収穫時期を最適化するために、構築物についてＥ．ｃｏｌｉ内誘発の経時的解析を行うことができる。組換構築物の大規模作製にあたっては、１４リットルの培養をニューブルンスウィック（New Brunswick）ＭＬ４１０ファーメンター内で育成することができる。カルボキシル末端の６つのヒスチジン残基は、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ^TM金属キレート化樹脂を用いたプロセス精製方法を容易にする。単離した組換抗原の最終純度を確認するため、精製した生成物の濃度を変えて負荷したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにクーマシーブルー［アミノブラック］及び銀染色を施すことができる。組換タンパク質に対して生成されたアフィニティー精製抗体は、２次元免疫ブロット上で試験し、当初選択された同一のタンパク質スポットが免疫反応的であるかどうか決定し、これによって所望のｃＤＮＡを得たという付加的［免疫学的同一性の］証明を与える。これらの抗体が免疫蛍光及びＦＡＣＳにおいて精子表面と結合するかどうか調べ、各種インビトロアッセイにおいてこれら抗体のタンパク質機能への影響を評価することによって、細胞又はウィルス表面を介した所定のタンパク質に対する機能上の役割を確認することができる。本発明の範囲内で得られたタンパク質のヌクレチド配列から更に膜表面タンパク質アナログを調製することも企図される。フラグメント等のアナログは例えば、ゲル分析で分離した物質のペプシン消化によって作製し、又は組換手法で作製する。突然変異タンパク質等の他のアナログは、コード化配列の標準的な部位特異的突然変異誘発によって生成される。上述したように、膜表面タンパク質をコードするＤＮＡ配列はクローン化でなく合成によって調製できる。ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計することができる。一般に、ＤＮＡ配列が発現に用いられる場合、所期の宿主に対して最適なコドンを選択する。完全配列は、標準方法により調製したオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることによって構築され、完全なコード化配列へと組立てられる。エッジ（Edge）、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；ナンベアー（Nambair）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）；ジェイ（Jay）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５９：６３１１（１９８４）等を参照。合成ＤＮＡ配列によって、膜表面タンパク質アナログ又は「突然変異タンパク質」を発現する遺伝子の構築が容易になった。また、ＤＮＡコード化突然変異タンパク質は、生来の遺伝子又はｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって生成可能であり、突然変異タンパク質は、従来のポリペプチド合成によって直接生成できる。本発明は、翻訳段階で膜表面タンパク質発現の阻害に用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの調製にまで適用できる。このアプローチはアンチセンス核酸及びリボザイムを用いて、特異的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するものであり、この阻害はアンチセンス核酸によるｍＲＮＡのマスキングか、又はリボザイムによるｍＲＮＡの切断によって行われる。アンチセンス核酸は、特異ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。（ワイントローブ（Weintraub）、１９９０；マーカス− セクラ（Marcus-Sekura）、１９８８を参照。）細胞内で、アンチセンス核酸はｍＲＮＡとハイブリッド化し、二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖体においてｍＲＮＡを翻訳しない。従って、アンチセンス核酸はｍＲＮＡのタンパク質への発現を阻害する。ＡＵＧ開始コドンに対してハイブリッド化する約１５のヌクレオチド及び分子からなるオリゴマーは特に効果的であるが、これは合成が容易であり、細胞内に導入する場合、大型分子に比べて問題が少ないためである。アンチセンス法は、インビトロで多数の遺伝子発現の阻害に使用されてきた（マーカス−セクラ（Marcus-Sekura）、１９８８；ハンバー（Hambor）ら、１９８８）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと幾分類似した方法で一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、あるｍＲＮＡがそれ自身のイントロンの切除能力を有するという観察から見出された。このＲＮＡのヌクレオチド配列を改変することによって、研究者らは、ＲＮＡ分子内の特異ヌクレオチド配列を認識しそれを切断する分子の設計をすることができるようになった（セック（Cech）、１９９８）。リボザイムは配列特異的であるため、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活性化する。研究者らは、二種類のリボザイム、即ちテトラヒメナ(Tetrahymena)型及び「ハンマーヘッド」型を同定した（ハッセルホッフ（Hasselhof）及びガーラック（Gerlach）、１９８８）。テトラヒメナ型リボザイムは４つの塩基配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」型は１１〜１８の塩基配列を認識する。認識配列が長くなるほど、標的ｍＲＮＡ種においてより排他的になる。従って、特異ｍＲＮＡ種の不活性化に関しては、ハンマーヘッド型リボザイムの方がテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、１８の塩基認識配列がより短い認識配列よりも好ましい。本明細書に記述したＤＮＡ配列は、この様に膜表面タンパク質とそのリガンドに対するアンチセンス分子、及び膜表面タンパク質とそのリガンドについてのｍＲＮＡを切断するリボザイムの調製に使用される。本発明は更に、各種診療用途に関するものであり、膜表面タンパク質に結合する能力又はそのタンパク質の結合に匹敵する能力に基づいて、特定細胞又は病原菌又はそれに対する（すなわち、患者の血清内）抗体の存在を検出する方法を含む。前述した様に、本発明の膜表面タンパク質は、各種公知技術によってそれ自身に対する抗体を産生するために使用でき、この抗体は単離可能で、特定標的細胞又は病原菌の存在確認試験に使用できる。この抗体は、細胞表面タンパク質、特に精子タンパク質の分析に使用され、特性化精子凝集、精子固定化、表面免疫蛍光、ＦＡＣＳ分析、精子浸透アッセイ、ヘミゾナ（hemi-zona）アッセイ及び２−Ｄ表面マップの局在化に使用される。前で詳細に述べた様に、抗体は周知のハイブリドーマ技法を含む標準法で作製し、単離できる。簡便のため、本明細書では、膜表面タンパク質に対する抗体をＡｂ₁とし、他の種で産生した抗体をＡｂ₂とする。膜表面タンパク質のレパートリーを含む細胞又は病原菌の確認は、この確認に適用される通常の免疫学的手順によって実施可能であり、数々の有用な手順が知られている。特に有用な３つの手順では、検出可能な標識で標識した表面タンパク質、検出可能な標識で標識した抗体Ａｂ₁、又は検出可能な標識で標識した抗体Ａｂ₂のいずれかを用いる。この手順は下に示す式によってまとめることができる。尚、式中、アスタリスク（＊）は粒子が標識されていることを示し、「ＭＳＰ」は膜表面タンパク質をさす。Ａ．ＭＳＰ^*＋Ａｂ₁＝ＭＳＰ^*Ａｂ₁ Ｂ．ＭＳＰ＋Ａｂ^*＝ＭＳＰＡｂ₁ ^* Ｃ．ＭＳＰ＋Ａｂ₁＋Ａｂ₂ ^*＝ＭＳＰＡｂ₁Ａｂ₂ ^* 以上の手順及びその応用は、当業者にとってすべて良く知られているものであり、よって本発明の範囲内で使用できる。手順Ａの「競合的」手続き手順は、米国特許第３，６５４，０９０号及び第３，８５０，７５２号に記載されている。手順Ｃの「サンドイッチ」手順は米国特許第ＲＥ３１，００６号及び第４，０１６，０４３号に記載されている。もう一つの手順は、「二重抗体」又は「ＤＡＳＰ」手順として知られている。各例において、膜表面タンパク質は一以上の抗体又は結合パートナーと複合体を形成し、複合体のーメンバーは検出可能な標識で標識する。複合体が形成されたという事実及び必要であれば複合体の量は標識検出に適用可能な公知の方法で決定できる。上記のことからわかるように、Ａｂ₂の特性はＡｂ₁と反応するということである。これは、一つの哺乳類動物種で産生したＡｂ₁が、他の種において抗体Ａｂ₁ を産生する抗原として使用されたという理由による。例えば、Ａｂ₂はウサギ抗体を抗原として用い、ヤギの体内で産生する。従って、Ａｂ₂はヤギの体内で産生した抗ウサギ抗体である。本明細書の記述及び請求項の目的において、Ａｂ₁ は一次抗体又は抗膜表面タンパク質抗体を意味し、Ａｂ₂は二次抗体又は抗Ａｂ₁抗体を意味する。これらの研究に最も日常的に使用される標識は、放射性物質、酵素、及び紫外線その他に暴露した時に蛍光を発する化学物質である。多くの蛍光物質が知られており、標識として使用できる。例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー及びルシファーイェローが挙げられる。特に言及される検出材料はヤギの体内で産生し、イソチオシアネートを介してフルオレセインと結合させた抗ウサギ抗体である。膜表面タンパク質及びその結合パートナーは、放射性物質又は酵素を用いて標識できる。放射性標識は現在利用可能なカウント方法によって検出できる。好適な同位元素は、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹ Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ及び¹⁸⁶Ｒｅから選択される。酵素標識も同様に有用であり、現在使用されている比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流滴定法又はガス分析法によって検出できる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等の架橋分子との反応によって選択された粒子と結合される。この手続きに使用できる酵素の多くは公知であり、使用できる。好適な酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号及び第４，０１６，０４３号はオールタネート(alternate)標識物質及び方法を開示するものものの例として言及される。本発明の更なる実施態様において、医療専門家による使用に適した市販用試験キットを提供し、疑わしい標的細胞上膜表面タンパク質レパートリーの存在の有無を決定する。上記の試験技法に従って、このようなキット中の一範疇のものは、少なくとも標識済膜表面タンパク質又はその結合パートナー（例、それらに特異的な抗体）及び、「競合性」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」等の指示書（当然の事なから、選択する方法によって異なる）を含む。このキットには更に、バッファー、安定剤等の補助試薬も含まれる。すなわち、細胞又は病原菌の存在に対する細胞の存在又は能力を示すために提供される試験キットは以下のものを含む。（ａ）本発明の膜表面タンパク質又はそれと特異的に結合するパートナーを検出可能な標識に対し直接的に又は非直接的に結合して得た、少なくとも一つの標識済免疫化学的反応性を有する成分の所定量、（ｂ）他の試薬類、及び（ｃ）前記キットの使用説明書。更に詳細には、本発明の診断用キットは以下のものを含む。（ａ）一般にはイムノソルベントを形成するように固相と結合された、あるいは、適切なタグ又は複数の最終製品等（又はその結合パートナー）と結合された、上述の膜表面タンパク質（又は結合パートナー）の所定量、（ｂ）必要であれば、他の試薬類、及び（ｃ）前記試験キットの使用説明書。更には、本発明の試験キットは、上記の目的のために提供及び使用され、所定のプロトコル（例、「競合性」、「サンドイッチ」、「二重抗体」等）に従って操作を行い、以下のものを含む。（ａ）本発明膜表面タンパク質と検出可能標識とのカップリングによって得た標識済成分、（ｂ）少なくとも一つはリガンド又は固定化リガンドであり、そのリガンドが以下の群から選択される様な、一以上の追加免疫化学的試薬類、（ｉ）標識済成分（ａ）と結合可能なリガンド、（ｉｉ）標識済成分（ａ）の結合パートナーと結合可能なリガンド、（ｉｉｉ）決定される少なくとも一つの成分と結合可能なリガンド、（ｉｖ）決定される少なくとも一つの成分の結合パートナーの内の少なくとも一つと結合可能なリガンド、及び（ｃ）本発明の膜表面タンパク質とその特異的結合パートナー間での免疫化学的反応によって得た一以上の成分を検出、及び／又は決定するためのプロトコルを実施するための指示書。上記に従って、本発明膜表面タンパク質の結合や活性を変化させる効果を有する、医薬となりうる物質をスクリーニングするためのアッセイシステムが提供される。膜表面タンパク質を試験システムに導入し、また、該医薬候補の物質も得られた細胞培養中に導入し、その後培養物を試験して、細胞の活性又は結合の変化を観察し、その変化がその医薬だけの添加によるものか又は公知の膜表面タンパク質の添加量の効果によるものかを観察する。好適なアッセイは、精子運動性アッセイ又はインビトロ受精を含む。更に、好適な動物モデルは、特に受精能試験にはマウス及びマカクを含む。本発明の膜表面タンパク質は、ワクチンとして、又は精子抗原の場合には避妊薬としても使用される。一旦、数種の独立した(unique)精巣特異的精子表面免疫原が同定された場合、この免疫原は、選別（triage）システムを用い、避妊進展パスウェイをスムーズに効率よく移行する。候補分子は、少なくとも一つの機能試験において、表面局在、精巣特異性及び活性の厳密な規準（strict criteria）に適合しなければならない。ｃＤＮＡがクローン化され配列決定されたタンパク質は、組織特異性について試験を行う。精巣特異的である場合には、組換タンパク質として発現し、その組換タンパク質に対する抗体が産生する。この抗体は、機能アッセイにおいて免疫原性エピトープの表面局在及び生物学的効果の確認に使用される。方向性を有する（vectorial）標識方法によってヒト精子表面タンパク質上に露出していることが重ねて示されたタンパク質には、不妊血清によって定義された同種抗原、精管切除した男性から得た血清によって定義された自己抗原、及び精子凝集を誘発する抗原がある。これらのタンパク質は免疫避妊用候補である。自己免疫の合併症を避けるために特に重要なことは、免疫避妊生起用に選択された分子が組織特異性を示すこと、すなわち、所期の標的組織、精巣及び精子内のみで発現することがである。後に行う毒性的及び奇形学的安全性研究時よりも、痘苗原発見フェーズで組織特異性を扱うのが賢明である。この戦略は、組織内に広く分布した免疫原に関して時間及び資源の不必要な消費を最小限に抑え、これによって、免疫病理学の誘発が可能である。避妊ワクチンを用いた免疫について起こり得る合併症には、１）急速な過敏症及びアナフィラキシー応答、２）遅延過敏症応答、及び３）自己免疫応答及び免疫体の内因性抗原との免疫反応による自己免疫疾患が含まれる。これら懸念の多くは、精巣及び精子に特異的な非交叉免疫原の選択によって取り除くことができる。本発明避妊用免疫原の組織特異性を免疫組織化学的なノーザン技法及びＲＴ−ＰＣＲによって研究することによって、重要且つ支持的な証拠が提供される。ノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡレベルでの組織特異性を立証するものであるが、別の無関係な分子に存在するかもしれない（構造的折りたたみ(folding)又は別タイプの分子類似性（mimicry）のため）選択された痘苗原に存在するエピトープを検出することはできないかもしれない。従って、免疫組織化学的試験は、分子学的方法を補完し、一次アミノ酸配列の比較のみに基づいては予想できなかった交叉反応性エピトープを明らかにするものである。ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的方法を組み合わせることによって、自己免疫疾患をもたらす危険性の少ない配偶子特異性抗原を同定することができる。この組み合わせは、所定のタンパク質が最初に発現する精子形成段階に関する情報を提供し、得られた精巣特異的遺伝子が減数分裂前後で活性であるという洞察を与える。この様な知識は、転写調節の研究における減数分裂後の遺伝子の同定、精子形成を調節する手段をみいだすために採り得るルート、及び男性用避妊薬の開発と密接に関係している。候補精子免疫原の免疫原性及び授精能試験を進めるため、この免疫原の相同体をマウス及びサルにおいてクローン化し、組換タンパク質を発現させ精製する。サル及びマウスの相同体は、以前に文献で報告された精巣ライブラリーを用いてクローン化できる。［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：５３１１−５３１５（１９８４）；Ｍｏｌ．Ｒｅｐｄ．Ｄｅｖ．３４：１４０ −１４８（１９９３）］雌性Ｂ６ＡＦ１マウス（６〜８週令）は、約２０μｇの同種組換免疫原を用いて免疫感作することができる。免疫原は同量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いて乳化可能であり、最終的に１００μＬの容量にする。対照群の動物にはＰＢＳ／ＣＦＡを投与する。各動物の尾の根元２箇所に注射する。不完全フロイントアジュバントにおける２〜３回のブースター免疫感作は、２週間間隔で実施できる。血液は尾からの瀉血によって、免疫感作前、免疫感作後２週間目、及び各ブースト後７〜１０日目に採取する。血清は、標的としての精子抽出物及び組換免疫原を用いたＥＬＩＳＡによって抗体に対しアッセイする。血清は更に、マウス精子の免疫蛍光分析及び精子抽出物の免疫ブロット分析によって、生(native)のタンパク質に対する反応性に関し試験する。組換免疫原を用いた最終ブーストの一週間後に、各雌性マウスを、生殖能を有することを確認済みの雄性マウスと共に継続的にハウスに入れる。各雌性マウスについては、交尾が行われたことを示す膣栓の存在を毎朝確認する。雄性マウスの導入後１５日目に雌性マウスを殺し胎児の数をカウントする。マカクに対しても、スクアレン−アラセルＡに溶解した５００μｇの同種組換免疫原を筋注することができ、引き続き２００μｇの同種組換免疫原又は対照スクアレンを用いたブースター免疫感作を３週間間隔で行う。血清、子宮頚部粘液、及び輸卵管液（oviductal fluid）（外科的に移植した輸卵管カニューレを介して）は、免疫感作前、及び一週間間隔で採取する。抗体は、組換免疫原及び生 (native)の精子抽出物標的の両方についてＥＬＩＳＡによって評価できる。上記血清は更に、サル及びヒトの精子及び精子抽出物を用いた免疫ブロット及び免疫蛍光分析によって、生タンパク質に対する反応性についての試験が可能である。上記血清は更に、精子機能試験を示す能力についての試験が可能である。精子表面と交差反応し、少なくとも一つの機能試験を阻害する組換免疫原に対して高い抗体価を引き出す免疫原については、稔性試験を行う。稔性試験では、マカクを用い、上記のように組換免疫原（動物個体数１５）又は対照スクアレン（動物個体数１５）で免疫感作する。血清は、免疫感作前、及び一週間間隔で採取する。抗体は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタン及び免疫蛍光分析によって評価する。最後の免疫感作に続いて、各雌性サンプルは、予定排卵３日前から始まるサイクルの妊性期間に、妊性のある雄性マカクと５日間共棲させる。最初の免疫感作後の第３サイクルで交配が始まり、その後９サイクル間、又は妊娠が確認されるまで続く。妊娠は、抗プロゲステロン剤であるサルプロストン（ sulprostone）の投与によって中断させる。毎日観察して、妊娠第６週以前の中絶を検出する。妊性試験において、ワクチン投与サンプル及び対照サンプル間での妊性率の有意性試験は、主にノンパラメトリック無作為法によるものである。フィッシャーの検定（Fisher's exact test）及び二項比率に基づく試験が実施できる。更に、ワクチン投与グループ及び対照グループにおける妊性及び不妊性サンプル数の有意差は、従来のχ二乗分析によって決定できる。妊娠までの時間は、生存曲線のノンパラメトリック比較、マンテル−ヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）試験、各種確率モデル及び比例危険回帰（proportional hazards regre ssion）モデルを含む各種生命表方法を用いて分析できる。同様の方法は、抗体価と妊性に対する時間の結果との関係を調べるのに使用できる。研究結果次第で、例えば、ワクチン投与妊性サンプルの抗精子抗体レベルとワクチン投与不妊性サンプルのそれとの比較が有用であることが証明される。あるいは、異なる期間で妊性になったサンプルの抗精子抗体レベルが比較される。継続的に結果を与えるグループ応答には、ノンパラメトリックのウィルコックス・ランク・サム（Ｗｉｌｃｏｘｒａｎｋｓｕｍ）検定及び通常の２サンプル間ｔ−検定を用い、２種類のサンプル間の比較を行うことができる。場合によっては、データに重み付けを行ったりデータ変換を行った上で回帰モデル（分散及び共分散解析を含む）を解析し、モデル適合性を改善して統計的評価及び推測を最適化する。マウス又はサルを免疫感作さることによって高度な不妊性がもたらされれば、この結果は免疫原の継続調査を正当化する。霊長類における有効性が高いということは、ヒト免疫原がヒト免疫原性試験の処方において有用であることを示す（フェーズＩ）。妊性に対する効果が中程度である場合、当免疫原をマルチデターミナントな避妊ワクチン調製物の一成分として含有させることが正当化される。またもし免疫原が効果を示さない場合、この結果によって、１）当免疫原を更なる研究の対象からはずすか、又は２）雌性生殖道においてより高くより持続的な抗体価を誘発する別のデリバリーシステムについて当免疫原を再試験すること、を考えるべきである。実験グループにおいて、所定の免疫原に対して７５％以上の不妊性が得られた場合、二つのオプションが考えられる。すなわち、１）不妊動物との交配を続け、可逆性／不妊継続性研究を始める、または２）組織病理学的検討を実施する。後者が選択された場合、妊性試験の終結時にワクチン投与雌性サンプルから組織を得て、固定液に浸漬する。標準的なホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋及びＨ＆Ｅ染色は、小脳、大脳（前頭及び側頭領域）、脳幹、心筋、背部大動脈、骨格筋、膵臓、脾臓、レター、副腎、胃、胆嚢、十二指腸、空腸、結腸、腎臓、膀胱、卵巣、子宮、乳腺、臍帯及び耳下腺について実施できる。精子抗原に対する効果的な避妊ワクチンには、雌性生殖道における最大抗体価を引き出す免疫応答が要求される。精子抗原ＳＰ−１０を用いた全身免疫感作は輸卵管液においてＩｇＧ抗体応答を誘起し、子宮頚部内免疫感作は別の効果的な免疫経路をもたらす。全身免疫感作だけでは免疫原生試験時に生殖道液において充分量の抗精子抗体が得られない場合、雌性マカク生殖道液内でＩｇＡ及びＩｇＧ抗体量を選択的に増加させる子宮頚部内免疫感作を含む免疫感作レジメンを試験できる。ここまで本発明を一般的に述べてきたが、具体的実施例を参照することによって更なる理解を得ることができよう。ただし、これらの実施例は本明細書においては説明の目的のみで提供するものであり、特に断らない限り本発明を限定するものではない。実施例実験手順材料過硫酸アンモニウム塩、ＢＳＡ、クエン酸、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）ジエタノールアミン、グリセロール、尿素（シグマ・ウルトラ：Sigma Ultra）、トリズマ・ベース（Trizma Base）、ノニデットＰ４０（Noni det P40）、ＣＨＡＰＳ、ＰＤＡ（Ｎ，Ｎ'-ジアクリロイルピペラジン）、ＤＴＴ、ヨードアセトアミド、ロイペプチンおよびペプスタチンＡをシグマ（Sigma ）社から入手した。ＥＤＴＡは、Ｊ．Ｔ．ベーカー（Baker）社から購入した。硝酸銀はマリンクロット・ケミカル（Mallinckrodt Chemicals）社から購入した。重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウム（すべてＡＣＳグレード）はフィッシャー（Fisher）社から購入した。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、超高純度）、グリシン（電気泳動グレード）、およびリン酸ナトリウムはＩＣＮ社から入手した。２Ｄ電気泳動用のパーコール（Percoll）、ｐＨ３．５−５、ｐＨ５−７、ｐＨ７−９およびｐＨ３．５−１０の両性電解質（Ampholines）、ｐＨ６．５−９、ｐＨ５−８、およびｐＨ８−１０．５のファーマライト（Pharmalyte）ならびにカルバミル化検定キットはファルマシア・バイオテック（Pharmacia Biotech）社から購入した。ウエスタン・ブロット分析用の増幅化学発光（ＥＣＬ）キットは、（ペルオキシダーゼ接合物の検出用は）アマーシャム（Amersham）社から、また（アルカリ性ホスファターゼ接合物の検出用は）トロピックス（Tropix）社から入手した。ブロットしたタンパク質を染色するためのプロトゴールド（Protogold）はゴールドマーク（Goldmark）社から購入した。ＴＬＣＫ（Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン）およびＴＥＭＥＤはベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）社から購入した。レクチン接合物はベクター（Vector）社から購入した。キャリアを含まないＮａ¹²⁵Iはアマーシャム（Amersham）社から購入した。増幅用スクリーンＮＥＦ−４９０とＮＥＦ−４９１はデュポン（Du Pont）社から購入した。ＨＲＰ接合アビジンと２−ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準はバイオラッド（BIO-RAD）社から入手した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、ヨード・ビーズ（Iodo-Beads）とＡＰ接合アビジンはピアース（Pierce）社から購入した。ウエスタン・ブロットで使用したすべての２次抗体はジャクソン・イムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch Lab．）研究所から入手した。実施例１精子の調製精液試料を健常青年からマスターベーションにより入手した。正常な精子パラメータ（２８）を有する射精液だけを本研究に使用した。個々の精液サンプルを室温で液化（通常、１／２から３時間）し、パーコール密度勾配遠心分離によって成熟精子を、精漿、未成熟胚細胞、および非精子細胞（大部分は白血球細胞と上皮細胞）から分離した。液化した精液を、ハムのＦ−１０培地中で調製した８０％（１ｍの下層）と５５％（２ｍＬの上層）の等張性パーコール(Percoll)溶液からなる２層のパーコール密度勾配に注意深くかけた。室温で１８分間、３００×ｇの遠心分離を行なった後、８０％層の下部の精子ペレットを集め、４５０×ｇの遠心分離によりハムのＦ−１０培地中で３回洗浄した。最後の遠心分離の前に細胞数を計測し、ペレットはベクトル標識付けに使用した。光学顕微鏡を使用して運動能力のある成熟精子が濃縮されていることを確認し、すべてのサンプルが＞９０％の運動性を示したことを確認した。実施例２精漿（Seminal plasma）の分析精管切除した二人の検体からの精漿サンプルを２Ｄゲル電気泳動により分析した。集めたサンプルを室温で液化し、顕微鏡により精子あるいは未成熟胚細胞が存在しないことを確認し、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して非胚細胞および前立腺結晶を除去し、アリコート（等分標本）を−７０℃で次に使用するまで保存した。実施例３放射ヨウ素化パーコールで精製した精子をハムのＦ−１０培地中に懸濁させ、最終濃度を２０×１０⁶／ｍＬとした。洗浄したヨード・ビーズ（精子８×１０⁶ごとに１ビーズ）と、担体を含まないＮａ¹²⁵Ｉ（１０⁶精子当たり１０ｕＣｉ）をサンプルに加えた。放射標識はサンプルを振動テーブル上で２０℃で１０分間インキュベートして行なった。ピペット操作により細胞をヨード・ビーズから離し、直ちに２回目のパーコール密度勾配遠心分離に付した後、ハムのＦ−１０培地中で３回洗浄した。最終洗浄前に細胞数を計測し、得られたペレットを精子タンパク質の抽出（下記参照）に供した。オートラジオグラフィ（放射写真撮影）は、構成物を順番に並べたサンドイッチ、すなわち、増幅用スクリーン、ブロット、２層フィルムおよび増幅用スクリーンのサンドイッチ、を使用して行なった。Ｘ線フィルムは常法通り３週間曝露した。実施例４ビオチン化パーコールで精製した精子を、３ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（〜５ｍＭ）を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁させ、最終濃度を５０ ×１０⁶精子／ｍＬとした。サンプルを振動テーブル上で３７℃で１０分間インキュベートして精子表面をビオチン化した。次にこの精子を２回目のパーコール密度勾配遠心分離にかけた後、ハムのＦ−１０培地中で３回洗浄した。最終洗浄前に細胞数を計測し、得られたペレットは溶解用または−７０℃の保存用とした。ビオチン化タンパク質の検出を最適化するための予備検討を行なった結果、ＮＣ膜への電気的転写後のビオチン化精子タンパク質の検出手順を以下の通りとすることとした：２Ｄウエスタン・ブロットをｐＨ７．４のＰＢＳで２回洗浄し、ニトロセルロース膜上の余剰の結合部位を、５％のゼラチンと０．１％のツイーン２０（Tween 20）を含むＰＢＳ中で１時間、２０℃でインキュベートすることにより遮断した（２９）。次いでこれをＰＢＳ中で５分間洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ接合アビジン（０．５％のゼラチンと０．０１％のツイーン２０を含む２５０ｍＬのＰＢＳ中に５０μＬ）で１時間、２０℃でインキュベートした。ＣＳＰＤを基質とするアルカリ性ホスファターゼの化学発光検出を製造会社（トロピックス：TROPIX）の指示に基づいて行なった。ＡＰの比色検出を、前述（１７）の通りＢＣＩＰとＮＢＴを基質に用いて実施した。５人のドナーのサンプル（放射ヨウ素化で調べた４人のドナーのうちの２サンプルを含む）を、この方向性を有する標識技法により調べた。実施例５溶解手順精子を常法通り、２％（v/v）ＮＰ−４０；９．８Ｍ尿素；１００ｍＭＤＴＴ；２％（v/v）両性電解質、ｐＨ３．５−１０；ならびにプロテアーゼ・インヒビターとして２ｍＭＰＭＳＦ、５ｍＭヨードアセトアミド、５ｍＭＥＤＴＡ、３ｍｇ／ｍＬＴＬＣＫ、１．４６μＭペプスタチンＡおよび２．１μＭロイペプチンを包含する細胞溶解緩衝液（Ａ）中に溶解させた。１ｍＬ当たり５×１０⁸個の細胞を、４℃で６０分間、一定の振動を与えて溶解させた。不溶性物質を１０，０００×ｇで２分間遠心分離して除去し、上清を１次電気泳動測定にかけた。精管切除検体からの凍結精漿サンプルに、上述のプロテアーゼ・インヒビターを含む４倍量の細胞溶解緩衝液Ａを加えて解凍した。その他の実験では、２％（w/v）ＳＤＳ、３％（w/v）ＣＨＡＰＳ、７．２Ｍ尿素、１００ｍＭＤＴＴ、ｐＨ３．５−１０の４％両性電解質ならぴにプロテアーゼ・インヒビターを含むアニオン性／両性溶解緩衝液（Ｂ）［ホックストラッサー（Hochstrasser）（３０）による］を使用した。溶解は２２℃で４５分間行ない、精子濃度は１ｍＬ当たり３．５×１０⁸であった。サンプルはＤＮＡの変性を少なくするために、５分ごとにマイクロ遠心分離管を逆さまにすることにより撹拌した。なぜならば、ＳＤＳや還元剤の存在下での振とうや加熱は、核エンベロープの溶解と超らせんＤＮＡの展開を引き起こすからである（ナービー−ハンセン［Naaby-Hansen］およびベジェラム［Bjerrum］による未発表の試験結果）。タンパク質濃度は，製造会社の指示に基づいてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準に用いて、ピアースのバイオシンコニン酸法（Pierce biocinchoninic ac id method）を利用して測定した。実施例６電気泳動等電点電気泳動（ＩＥＦ）を、１５×０．１５ｃｍのアクリルアミド・ロッド中で、ホックストラッサー（Hochstrasser）ら（３０）またはセルズ（Cells）ら（１６）によるゲル組成物のいずれかを用いて実施した。担体の両性組成物は１ロッド当たり、２０％がｐＨ５−７、２０％がｐＨ７−９、６０％がｐＨ３．５−１０；または２８％がｐＨ３．５−５、２０％がｐＨ５−７、７％がｐＨ７ −９、４５％がｐＨ３．５−１０のものとした。１ロッド当たり６５μＬの精子抽出物（タンパク質約０．１５ｍｇ）または３５μＬの精漿サンプル（タンパク質約０．１５ｍｇ）を使用した。チューブにはサンプルを、５％ＮＰ−４０、１％両性電解質ｐＨ３．５−１０、８Ｍ尿素および１００ｍＭＤＴＴを含む緩衝液と共に静かに流し込んで充填した。フォーカシング（濃縮分離）は、２００Ｖで２時間、５００Ｖで５時間、８００Ｖで４時間、１２００Ｖで６時間および２０００Ｖで３時間の電圧ステップで、合計１９，３００ボルト-時間行なった。非平衡ｐＨ勾配電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）を、セリス（Celis）らに記載のゲル組成物（１６）を使用して、１４×０．１５ｃｍのアクリルアミド・ロッドで実施した。担体の両性電解質組成は、３７％ｐＨ５−８、１３％ｐＨ６．５−９、３７％ｐＨ８−１０．５および１３％ｐＨ３．５−１０とした。１ロッド当たり５５μＬ（タンパク質約０．１３ｍｇ）の精子抽出物、または３０μＬの精漿サンプル（タンパク質約０．１３ｍｇ）を適用した。これらのタンパク質濃度は、ホックストラッサーのプロトコルを使用したＩＥＦゲル上でわずかに高い濃度で達成されるものと同様のスポット・サイズをＮＥＰＨＧＥゲル上で示した。電気泳動は４００ボルトで１１時間、および６００ボルトで９時間の合計９８００ボルト-時間実施した。二次元ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、プロティーンII ｘｉマルチセル装置（バイオラッド）中で直線勾配ゲル（Ｔ＝７．５−１５％または９−１５％）を使用した厚さ０．１５ｃｍ、１６×１６ｃｍまたは１６×２０ｃｍのスラブ・ゲル中で実施した。銀染色はホックストラッサーら（３０）の方法に基づいて実施した。ニトロセルロース膜への電気的転写は前述（２３）のように行った。ＰＶＤＦ膜（穴サイズ０．２μｍ、ピアース）への電気的転写はマツダイラ（Matsudaira：３２）（１０ｍＭ３-［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ１１）のトランスファー・バッファー組成物を使用してヘリツェル（Herizel：３１）らに記載の方法で実施した。通常は、同じ電力源に接続した３つのトランスブロット・セル（バイオラッド）を使用して、一定電流０．５Ａを２時間かけて、６個の２−Ｄゲルを同時に転写させた。実施例７イムノブロッティング分析２−Ｄ分離ポリペプチド電気泳動転写の後、固定化膜をＰＢＳｐＨ７．４中で５分間２回洗浄し、過剰結合部位を、５％ドライミルクと０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳｐＨ７．４中で、室温で３０分間インキュベートしてブロックした。２−Ｄブロットを１００ｍＬの一次抗体とともに一定の緩やかな振動下で、２２℃で２時間、または４℃で一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した：抗アクチン（マウスｍＡｂクローンＣ４、ベーリンガー・マンハイム、０．３μｇ／ｍＬ）、抗−β−チュービュリン（マウスｍＡｂＴｕ２７ＢＣ、ハイブリドーマ上清、バージニア大学ロバート・ブラッドグッド博士（Dr．Robert B loodgood）から寄贈、稀釈１：５）、抗−α−チュービュリン（マウスｍＡｂ、クローンＤＭ−１Ａ、シグマ、稀釈１：１０，０００）、抗−ＳＰ−１０（マウスＡｂＭＨＳ−１０、稀釈１：５，０００）、抗繊維質鞘タンパク質（マウスｍＡｂＳ６９、ブリティッシュ・コロンビア州、バンクーバー大学Ｃ．Ｇ．リー博士（Dr．C．G．Lee）から寄贈、稀釈１：１，０００）ならびに抗−ＰＨ−２０（ウサギポリクローナルＡｂＲ−１０、ＵＣデービスのポール・プリマコフ博士（Dr．Paul Primakoff）より寄贈、稀釈１：３，０００）。二次酵素接合抗体（ヤギ抗マウスＩｇおよびヤギ抗ウサギＩｇ）をＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０に１：５０００稀釈し、ブロットを２０℃で１．５時間インキュベートした。これら二次抗体はいずれもブロットしたヒト精子タンパク質には結合しなかった。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合物は、基質としてＤＡＢを使用した比色法により視覚化、または製造会社（アマーシャム社）のプロトコルを使用したＥＣＬにより視覚化した。リン酸化チロシン残基を検出するために、ｍＡｂＲＣ−２０（トランスダクション・ラボラトリーズ：Transduction Laboratories）を使用した。ブロットは１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣｌ、０．１％ツイン２０の中に入れた１％ＢＳＡ中で、７℃で２０分間インキュベートしてブロックした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合ｍＡｂＲＣ−２０は上記緩衝液中で１：２５００に稀釈し、ブロットを３７℃で２０分間インキュベートし、ＥＣＬにより結合を検出した。複合２−Ｄタンパク質パターン中の免疫反応性抗原の正確な場所を同定するために、いくつかの実験では抗体インキュベーションの前に、プロトゴールド（ゴールドマーク・バイオロジカルス）を用いた金染色を行った。製造会社のプロトコルに、０．０５％ツイン２０中で３０分間、膜のブロッキングを行う修正を加えて行なった。推奨の０．３％ツイーン２０の代わりに用いたこの濃度のツイーン２０は、ポリペプチドの密度の高い領域において融合染色パターンの少ない明確なスポット分解能が得られた。実施例８ゲル・スキャンニングとコンピュータ解析染色したゲルを湿った状態で高解像度のコダック（Kodak）・カメラを使用して走査し、情報をＳＵＮコンピュータでデジタル化した。オートラジオグラフィと化学発光実験のＸ線フィルムをコダック・カメラまたはホーテック（Howtek）・スキャンマスター３＋レーザー・スキャナーのいずれかを用いて走査した。得られた２−Ｄ映像をバイオイメージ・プログラム（Bioimage program）“２−Ｄアナライザ”を用いて解析した。この方法を最適化するために、４０名のドナーからの精液サンプルを５００以上の２−Ｄゲル中で解析した。信頼性の高いプロトコルを確立した後、８名のドナーからの精液サンプルを２−Ｄゲルで繰り返し解析し、人為的なスポットが目録データに含まれる可能性を減らすためにタンパク質パターンを比較した。２回以上の解析で表れた各ドナーのスポットを有効とみなした。可能な限り多くの参照スポット（銀染色ゲルの場合はソフトウェアにより最大１００）をオペレーターの手によりマッチさせた後、異なるゲル映像のスポット・マッチングをコンピューター・プログラムにより行った。未知のスポットの等電点と分子量は同時移動の内部標準の場所をベースとしてコンピュータ・プログラムによって内挿し、さらに分子量の結果を片対数プロットから計算して手作業で確認した。内部標準（バイオラッド）は、鶏卵白コナルブミンタイプＩ、ＭＷ７６，０００、ｐＩ６．０、６．３および６．６；ウシ血清アルブミン、ＭＷ６６，２００、ｐＩ５．４、５．５および５．６；ウシ筋肉アクチン、ＭＷ４３，０００、ｐＩ５．０および５．１；ウサギ筋肉グリセルアルデヒド−３ −ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ＭＷ３６，０００、ｐＩ８．３および８．５；ウシ炭酸脱水酵素、ＭＷ３１，０００、ｐ１５．９および６．０；大豆トリプシンインヒビター、ＭＷ２１，５００、ｐＩ４．５；ならびにウママイオグロビン、ＭＷ１７，５００、ｐＩ７．０とした。カルバミル化クレアチンホスホキナーゼ（ＭＷ４０，０００および見掛けｐＩ範囲４．９−７．１）およびカルバミル化ＧＡＰＤＨ（ＭＷ３６，０００および見掛けｐＩ範囲４．７− ８．３（ファルマシア））をｐＩマーカーとして使用した。結果ノニオン系洗浄剤／尿素溶解ヒト精子タンパク質の銀染色２−Ｄゲル（２０× １６ｃｍ）は１３９７の異なるタンパク質スポットを分離した（ＩＥＦ／ＰＡＧＥによる９６３とＮＥＰＨＧＥ／ＰＡＧＥによる４３４（図ＩＡおよびＢ））。１３９７のタンパク質の内の１３４５は少なくとも二人のドナーからのサンプル中に同定された。アニオン系／両性溶解緩衝液を精子の溶解に使用した場合には１１９１のタンパク質（ＩＥＦ／ＰＡＧＥによる８３８とＮＥＰＨＧＥ／ＰＡＧＥによる３５３）か分離された（図９ＡおよびＢ）。タンパク質パターンは極めて再現性が高かったが、ドナー間には僅かな変動が認められた。たとえば、図２は３人のドナー間に見られる３９．５ｋＤａの出現量(abundance)の違いを示している。ヒト精子タンパク質の２−Ｄパターンは、ヒト精漿（ＨＳＰ）タンパク質の２ −Ｄパターンと著しく異なる（図１）。３００より多い精漿タンパク質が２−Ｄ電気泳動分離の後銀染色をすることにより視覚化された（図１、ＣおよびＤ）。精子タンパク質と同時移動した精漿ポリペプチドは、精子タンパク質、精漿タンパク質、または両者の混合物を含む銀染色ゲルをコンピュータでマッチングすることにより同定されたが、これによって精密な比較が可能となった。この方法によって、ＭＷが２０ｋＤａ以上の９種のタンパク質が精漿由来の精子被覆タンパク質として同定された（図１の矢印で示されている）。これら９種類のタンパク質はすべて放射化ヨウ素またはビオチンあるいはその両方により方向性のある標識をされた（図７、８および１１）。一般的に、分子量が２０ｋＤａ未満の精漿からの精子被覆タンパク質の同定は、精漿の劣化物が多いために困難であった。特にアルカリ性ｐＨ範囲では難しい（図１Ｄ）が、これはエドワーズ（Edwards ）らの観察と符合する（３３）。一つの実験において、１時間後に採集した精子を含む銀染色ゲルを、３時間液化させた同一サンプルからのタンパク質を含むゲルと比較した。タンパク質パターンの顕著な差異は検出されず、液化後の精漿酵素によって精子表面タンパク質の顕著な変化は誘発されないことが示された（データは示されない。）。実施例９ヒト精子表面タンパク質の放射ヨウ素化ヒト精子タンパク質中への¹²⁵Ｉ取り込みの動態を、ヨウ素化ビーズ触媒を使用または使用せずに調べた。最適反応時間は１０分間であったが、それ以降は精子ペレット中への放射化ヨウ素の取り込み率は低下し、表面に到達可能なフェノール類が飽和したことを示している（図３）。触媒作用のあるＮ−クロロベンゼンスルフォアミド被覆ビーズなしの場合、１％未満の¹²⁵Ｉが細胞中に取り込まれた。ビーズの濃度が高くなるほど放射化ヨウ素は高い割合で取り込まれたが、ビーズを多く使用すると膜破壊、内部タンパク質標準の放射標識が漸増し、また精子の運動性を減退させた。したがって酸化ビーズの数を８×１０⁶精子当たり１ビーズに減らした。これによって放射化ヨウ素の取り込みはそれ以前のビーズ／細胞比の場合と比較して５０％減ったが、標識後の精子運動性は保存された。放射ヨウ素化が精子表面だけに起こっているかどうかを調べるために、細胞骨格とアクロソーム内部タンパク質に対する抗体で免疫染色したニトロセルロースまたはＰＶＤＦブロットでオートラジオグラフィを実施した（図４、５および６）。損傷またはアクロソーム反応細胞をこの分析から除外するために、精子母集団を放射ヨウ素化した後直ちにパーコール密度勾配遠心分離によって分離した。パーコール密度勾配遠心分離をしたヨウ素化精子（図４Ｂ）と、しなかったヨウ素化精子（図４Ａ）の比較では、２回目の密度勾配遠心分離を行った精子抽出物は標識タンパク質が少なかったものの、個々のタンパク質は高い解像度を示し、また細胞内対照マーカータンパク質（アクロソームタンパク質、ＳＰ−１０、図４および６；アクチン、図４および５；繊維質鞘成分、図９；ならびにチューブリン、図５）は標識されなかった。このことは修正放射ヨウ素化法が表面特異性を有していることを強く裏付けるものである。還元剤の存在下および非存在下における放射ヨウ素化精子抽出物を比較した場合、いくつかの表面タンパク質が高分子量複合体に含まれ、鎖内ジスルフィド架橋によって安定化されていることが確認された（図５）。４人のドナーからの精子サンプルを、放射ヨウ素化、標識後のパーコール密度勾配分離、ならびにＮＰ−４０と尿素による抽出をした後に分析した。放射ヨウ素化タンパク質のパターンは、２人のドナーの比較（図７Ａ＋Ｂと７Ｃ＋Ｄ）からも明らかな通り、ドナー間での再現性は極めて高かった。４人のドナーからのゲルのコンピュータ映像解析では、１８１の精子表面タンパク質（ＩＥＦ／ＰＡＧＥによる１０３と、ＮＥＰＨＧＥ／ＰＡＧＥによる７８）で、５から１５０Ｋｄの間のＭｒとｐＨ４から１１の範囲のｐＩを有するものは一律に放射ヨウ素化されたことを示している。ドナー間の僅かな変動は、電荷ならびにいくつかの標識タンパク質の相対濃度において認められたが、これは、たとえば、図７の矢印で示されている９０−９５Ｋｄタンパク質複合体のように、光学密度から推測される通りであった。実験ごとの再現性が高いレベルにあることは、さらに図４と７のヨウ素化タンパク質を比較することによっても明らかである。実施例１０ヒト精子表面タンパク質のビオチン化スルホン化したＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを用いて１０、２０、３０および４５分間インキュベートした精子サンブルからのビオチン化タンパク質の２−ＤパターンをＥＣＬ検出法を用いて比較した（データは示さない）。１０分または２０分間ビオチンに曝露した後に標識されたタンパク質の数には差違は認められなかった。しかしなから、インキュベーション時間か長く（３０−４５分）なると、細胞骨格およびアクロソーム内タンパク質の標識が漸増した。したかってそれ以後の研究では、ビオチン化時間を１０分間とした。残留ビオチンと反応させるために（多くのビオチン化プロトコルで推奨されているように）最初の洗浄緩衝液に１％ウシ血清アルブミンを添加すると、大量のビオチン化ＢＳＡが精子表面に付着するため、精子サンプルは標識付けの後パーコール密度勾配遠心分離にかけた。図８ＡおよびＢはノニオン系溶解緩衝液Ａによって可溶化されたビオチン化精子タンパク質を含む二次元ゲルの化学発光フィルムを示す。５人のドナーのビオチン化精子サンプルをＩＥＦおよひＮＥＰＨＧＥで分離し、映像をコンピュータ解析により比較した。２２８のビオチン化タンパク質スポットで、Ｍｒが５から１２０Ｋｄ、ｐＨが４から１０の範囲のものが分離され、目録化された。興味深いことに、ビオチン化されていない精子タンパク質をＡＰ−アビジンだけを対照としてインキュベートした場合（図８Ｃおよび８Ｄ）、Ｍｒが７６ｋＤａでｐＩが６から６．５の５つの精子タンパク質の一群が標識アビジンに結合した。これらの内因性アビジン結合性タンパク質の性質は現在研究が進められている。ＡＰ−アビジンへの事前曝露無しに対照ブロットを現像した場合、これらのタンパク質やその他のタンパク質中には内因性アルカリホスファターゼ活性は全く検出されなかった（データは示さない）。アニオン系／両性溶解緩衝液Ｂを使用して精子タンパク質を抽出した場合（図９ＡおよびＢ）、２０８のビオチン化タンパク質を分離することができた（図９ＣおよびＤ）。非イオン系洗浄剤を用いた抽出によって得られたパターンからは、ビオチンパターン中にいくつかのタンパク質コンステレーションが認められた。（図９Ｃおよび９Ｄを図８Ａおよび８Ｂと比較されたい）。精子表面のビオチン化および抽出法の特異性を証明するために、対照細胞骨格タンパク質を免疫局在化させ、それらのビオチン化状態をＥＣＬフィルムと比較することにより調べた。内部対照のアクチン、チューブリン、繊維質鞘成分またはＳＰ−１０のいずれもビオチン化されなかった（図９）。既知の細胞骨格タンパク質の結果とは対照的に、図９ＧおよびＨのイムノブロットはＳＤＳ／ＣＨＡＰＳ抽出およびポリクローナルウサギ抗血清Ｒ−１０によるイムノブロッティング後の精子表面ヒアルロニダーゼＰＨ−２０の位置を示している。ＰＨ−２０の６４および５３ｋＤａの２つの分子量型がＳＤＳ／ＣＨＡＰＳにより抽出されている（図９ＧおよびＨの矢印）。この５３ｋＤａ抗原はＮＰ−４０／尿素による溶解後に３つのアイソフォームに分離され（図８Ｅ）、またＳＤＳ／ＣＨＡＰＳ／尿素による溶解後に５つのアイソフォームに分解することができた（図９Ｇ）。銀染色しビオチン化した２−Ｄパターン中のＰＨ−２０抗原の正確な位置が図９Ａおよび９Ｃに示されている。既知の表面タンパク質であるＰＨ−２０のビオチン化（３４）は、標識手法の表面特異性に関する正の対照として役立つ。実施例１１チロシン残基上でリン酸化された表面タンパク質の実証抗リン酸チロシンＭａｂであるＲＣ−２０は、新鮮な射精精子からのリン酸タンパク質に結合した（図１０）。チロシン残基中で最も激しくリン酸化されたタンパク質は８９−９５Ｋｄａの分子量を有していた（図１０Ａの矢印）。コンピュータ解析によって表面タンパク質の５つのグループがチロシン残基中でリン酸化されたことが解明された。これらグループの２２のタンパク質アイソフォームが表IIIに星印で示されている。実施例１２２−Ｄ結果のコンピュータ解析図１１はＮＰ−４０と尿素で溶解した後銀染色して視覚化したヒト精子タンパク質のコンピュータ映像を示す。表面ヨウ素化と表面ビオチン化の両方で標識した９８のタンパク質のうち、銀染色タンパク質とマッチした９４種を、図１１に丸印で囲んで示した。二重標識表面タンパク質のＭｒ、Ｐｉおよび（ガウスの定量による）相対出現量の記録を表IIIに示した。弱い信号と強い信号の両方を最適の状態で確実に検出できるようにするために、さまざまな時間で標識タンパク質のブロットを曝露した。標識タンパク質と未標識タンパク質の間の移動の違いが分析に影響を及ぼさないようにするために、オートラジオグラムとビオチンＥＣＬフィルムを対応する銀染色ゲルまたは金染色ブロットとマッチさせた。次いでこれらの複合映像を未標識タンパク質の銀染色ゲルの複合映像とマッチさせた。本発明は、ＮＰ−４０／尿素で溶解した１３９７のタンパク質と、ＳＤＳ／ＣＨＡＰＳ／尿素処理により分離した１１９１のタンパク質を含む総合的な２−Ｄゲル・データベースを確立することにより、膜タンパク質、特にヒト精子の組成の理解を前進させた。このデータベースを作りあげるために、一次元電気泳動分離にＩＥＦとＮＥＰＨＧＥの両方を使用して、高い分離能を達成し、また酸性、中性およびアルカリ性の一連の精子タンパク質を検出できるように技法を発展させた。最近、１つの２−Ｄゲル中で６８０種のヒト精子タンパク質を分離したことが報告されており（２６）、一方本発明では１つのゲル中で１０００種以上のタンパク質スポットを分離する条件を使用した。この分離能の改善は、精子の精製および溶解方法の改良、両性組成物の調整、ならびにＩＥＦとＮＥＰＨＧＥの走査時間と電圧ステッピング（段階的昇圧）の最適化によって達成された（方法の項参照）。特に、ＮＥＰＨＧＥにおける昇圧はＳＤＳ／ＣＨＡＰＳ溶解タンパク質の分離能に対して顕著な効果があり、短い分離時間(focusing time)と低い電圧を使用した場合よりも水平縞が少なくなった。本発明の方法で採用した２種類の溶解緩衝液により溶解した一連の精子タンパク質群の比較では重要な差違が認められた。たとえば、いくつかの細胞骨格成分の溶解を達成するためにはアニオン系／両性／尿素溶解緩衝液が必要とされた。さらに、この抽出方法では精子表面のヒアルロニダーゼＰＨ−２０の５つの５３ｋＤａアイソフォームを分離できたが、一方ノニオン系／尿素溶解緩衝液を使用した場合は３種類の５３ｋＤａＰＨ−２０アイソフォームだけしか分離できなかった。それでも、非イオン系／尿素溶解法は、精漿膜を細胞骨格構造の汚染を少なくして溶解することができ、また最も信頼性の高いｐＩ測定ができることから（たとえは、図５および９のβ−チューブリンの移動を比較されたい）、本研究の方法として選択した。８人のドナーの異なる精子サンプルを代表する４４の銀染色ゲルを“２−Ｄアナライザ”ソフトウェアにより解析した。いくつかのタンパク質の出現量（abun dance）および／または電気泳動の移動には個体間で僅かな変動が認められた。遺伝子発現、遺伝子の不均度および翻訳後変性の違いはこれらの差異が原因と考えられる。後者の例としては、ＭＷが８９−９５ｋＤａの表面タンパク質の異種グループ中のチロシン残基中のリン酸化である。同程度のサイズのチロシン−リン酸化タンパク質がヒトＺＰ−３により刺激されるタンパク質キナーゼ活性を有すること（３５）が最近示されており、このタンパク質が透明帯の結合およびアクロソーム反応の開始に関与することが示唆されている。リン酸化とグリコシル化の差異が電気泳動的移動で見られるある種の個体間の差異の原因と考えられるが、差異の特質と機能的重要性に関する完全な結論を出すには、受精能獲得期間中の表面変化に関する分析、炭水化物側鎮分析、タンパク質マイクロシークェンシングおよびｃＤＮＡクローニングなど、さらなる研究が必要である。精巣上体、前立腺、精嚢の分泌物由来の“精子被覆”タンパク質が射精精子の表面に接着することは公知である（３６、３７）。いくつかの精漿タンパク質の移動は２−Ｄゲル中の精子タンパク質のそれと似ており、また９種の精子表面タンパク質は精漿起源のものであることが確認された。本発明では、これら表面タンパク質の起源を確認するために、液化しない精漿タンパク質の分析（３３、３８）、異なる洗浄および採集方法、精巣上体液と精子の分析、電気泳動分離タンパク質のマイクロシークェンシングなどの追加分析も実施した。２−Ｄパターン中のいくつかのタンパク質スポットが、免疫ブロッティングまたは同時移動分析（たとえば、アルブミンと炭酸脱水酵素）により同定された。精子タンパク質に対する免疫試薬を調製することにより、精子表面タンパク質エンサイクロペディア中の多くのタンパク質を免疫ブロッティングにより同定することができる。精子データベースとその他の２−Ｄゲルタンパク質データベースを比較することにより、いくつかの精子タンパク質も暫定的に同定されている（１６、３９）。さらに、選択されたある種の表面タンパク質は２−Ｄゲル電気泳動、エドマン分解およびタンデム質量分析による精製の後、マイクロシークェンスすることができる。この方法により従来知られていなかったタンパク質配列が解明されている（ナービー−ハンセンら、準備中）。このように、精子タンパク質エンサイクロペディアの継続的な更新を、精子タンパク質の分子同定の理解度の進展をモニタしたり、特性付けをしなければならないタンパク質のガイドとして利用することができる。膜タンパク質のデータベースはまた、染色体および／または配偶子形成に影響を及ぼす臨床的、遺伝的および毒性的疾患の研究にも有用である。１８１種の放射ヨウ素化精子タンパク質スポットが、ＮＰ−４０／尿素溶解後に分離され、また２２８種のタンパク質が表面ビオチン化により標識された。９８種のタンパク質がこの両方の技法により標識された。放射ヨウ素化とビオチン化での異なる結果に対する１つの説明は、異なるアミノ酸残基が標識試薬の標的になった、ということである。放射ヨウ素化においては、標識はチロシン残基に対してカチオン性の１２５−ヨードが電気親和的に添加されることで起き、その他のフェノール類、ヒスチジンおよびトリプトファンに対しては少ない（４０）のに対し、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンは一次アミングループ（groups）と反応する（たとえば、リシン残基または遊離アミノ基が炭水化物または脂質と反応）（４１）。さらに、炭水化物側鎖によるステアリン妨害は、ビオチン化またはアビジン結合によるその後の検出に干渉する。もし精子中のタンパク質の６０％だけが前述の体細胞の場合（４２）のように銀染色で検出されると仮定すれば、約２３００種の精子タンパク質が導き出されると推定される。この推定数は同様の分離手段により体細胞中に認められる［³⁵Ｓ］メチオニン標識タンパク質の数（＞３０００）とほほ同じである（１６、３９）。したがって、１つまたはもう１つの方法により標識された３１１種の表面タンパク質は、全精子タンパク質の約１２％に当たることになる。ヨウ素化およびビオチン化で標識された９８種のタンパク質は、マイクロシークェンスを行なうための主要候補となり得るタンパク質サブセットを構成することになる。放射ヨウ素またはビオチンによる細胞表面タンパク質の標識法の基本的な問題点としては：（１）表面特異性を確立すること（たとえば、細胞質成分に対しては僅かまたは全く標識しない）；および（２）表面到達可能残基に対する十分な特異的標識を達成すること（４３、４４）がある。表面特異性標識は、ポリスチレン・ビーズ（ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ）上で酸化剤としてＮ−クロロベンゼンスルフォンアミドを用いるヨウ素による方法、およびスルフォン化Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミドエステル系のビオチンを使用する方法（４１、４６、４７）が報告されている。本発明の方法においては、既知の細胞内タンパク質であるアクチン、チューブリン、繊維質鞘、ならびに細胞内タンパク質ＳＰ−１０は、すべて２つの方法によって標識できなかったが、表面特異性を確実に解析するために標識手法の後にパーコール密度勾配遠心分離をすることにより損傷した細胞とアクロソーム反応細胞を除去することが重要である。実施例１３溶解バッファーＡ［ＮＰ−４０／尿素］及び２３×２３ｃｍゲルを用いたプレパラティブ二次元ゲル電気泳動によって、見かけの質量６３ｋＤａ及び等電点４．３を有する精子タンパク質を他のタンパク質より分離した。得られたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、その膜をクーマシーブルーで染色した。目的のタンパク質スポットをエドマンマイクロシークェンシングのために切り出した。６０ｋＤａのタンパク質のスポットを、微小スケイプル（scaple）を用いてプレパラティブアクリルアミドゲルから直接くり貫き、タンパク質を次のように分解して質量スペクトルに付した。マイクロシークェンシングを二方法、即ちエドマン分解とタンデム型質量スペクトロメトリーで行った。エドマン分解アプライドバイオシステム４７０Ａタンパク質シークェンサーを製造者のスペックに従って操作し、ＰＶＤＦ膜用のカートリッジとサイクルを用いＰＶＤＦ膜上のタンパク質スポットを配列決定した。質量スペクトル分析余分なポリアクリルアミドを最小限にするために可能なかぎり注意深く上記ゲルからスポットを切り出し、多数の小片に分割した。小片は５００μＬの５０％メタノールで一夜かけ、洗浄し脱色した。これらゲル片をアセトニトリル中で脱水し、１０ｍＭジチオールスレイトールを０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムに溶解した溶液５０μＬ中で再水和し、５５℃において一時間還元した。ＤＴＴ溶液を除去した試料は、５０ｍＭヨードアセタミド／０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液５０μＬ中、暗所、室温下一時間アルキル化した。試薬を除去し、ゲル片を１００μＬの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムで洗浄し、１００μＬのアセトニトリル中で５分間脱水した。アセトニトリルを除去し、ゲル片を１００μＬの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムで再水和した。ゲル片を１００μＬのアセトニトリル中で脱水し、アセトニトリルを除去し、真空遠心分離により完全に乾燥させた。得られたゲル片を、１２．５ｎｇ／μＬトリプシン［自己消化妨害］を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに溶解した溶液中で再水和し、氷上で４５分間培養した。過剰のトリプシン溶液を除去し、２０μＬの５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを添加した。試料を３７℃で一夜消化し、生成したペプチドを、２００μＬの５０％アセトニトリル／５％ギ酸でポリアクリルアミドから二回抽出した。これら抽出物を合一し、２０μＬより少なくなるまで蒸発させ、ＬＣ−ＭＳ分析に供した。ＬＣ−ＭＳシステムはフィニンガン（Finningan）−ＭＡＴＴＳＱ７０００システムで構成され、エレクトロスプレーイオン源が１０ｃｍ×７５μｍｉｄポロス（POROS）ＩＯＲＣ逆相キャピラリーカラムに連結している。体積１μＬの抽出物を注入し、流量０．６μＬ／ｍｉｎのアセトニトリル／０．１M酢酸のグラジエントでペプチドをカラムより溶出さた。エレクトロスプレーイオン源は、４．５ｋＶで作動し、最適感度に必要なように１．２μＬ／ｍｉｎの７０％メタノール／３０％水／０．１２５％酢酸の同軸の保護（sheath）液流量及び同軸窒素流量が調節される。キャピラリーＬＣエレクトロスプレー質量スペクトロメトリーで消化を分析し、消化物中に含まれるペプチドの分子量を測定した。検出されたペプチドのペプチド配列は、アルゴンを衝突ガスとするＬＣエレクトロスプレータンデム型質量スペクトロメトリーを用い、衝突活性解離により決定した。結果エドマン分解エドマン分解で、１５Ｎ末端アミノ酸を決定した。得られた配列、ＥＰＡＶＹＦＫＥＱＦＬＤＧＤＧ（配列番号：３）は１００％ヒトカルレティキュリン（ＧｅｎＰｅｐ．登録番号Ｍ８４７３９）と同一であることが判明した。質量スペクトロメトリーＬＣ−ＭＳ分析により決定した分子量及び消化物中ペプチドのＬＣ−タンデム型ＭＳにより決定したアミノ酸配列を表１に示す。９種のペプチドが認められ、うち６種について配列情報を得た。ＣＡＤスペクトル情報（ＭＳＴａｇ）及び部分ペプチド配列（ＢＬＡＳＴ）をデーターベース検索して、これらペプチドのうちの５種がヒトカルレティキュリンの配列であることが確認された（表２）。縮重オリゴヌクレオチドの設計縮重オリゴヌクレオチドの設計のテンプレートとして二種のペプチド配列を選択した。即ち、ペプチド配列＃１−ＥＰＡＶＹＦＫＥＱＦＬＤ（配列番号：５）。及びペプチド配列＃２−ＫＶＨＶＩＦＮＹＫ（配列番号１１）。図１２参照。図１２は、相補及び逆相補オリゴヌクレオチドの設計のために選択された６３ｋＤａ、ｐＩ４．３の精子タンパク質のエドマン分解及びタンデム型質量スペクトロメトリーにより得られたアミノ酸マイクロ配列データを表す。このマイクロ配列情報から、縮重オリゴヌクレオチドプライマーのプールを合成しＰＲＣを開始した［図１３参照］。タンパク質配列＃１及びそのセンス−オリゴヌクレオチドを以下に示す（配列番号：１６〜１８）。タンパク質配列＃２及びそのセンス−オリゴヌクレオチドを以下に示す（配列番号：１２、１９、２０）。遺伝暗号の縮重のため、最適コドン用法（Ｌａｔｈｅ、１９８５）を用いて「最適化オリゴヌクレオチド」を設計した。計画されるオリゴヌクレオチド中のＧ −Ｃ含有率、配列決定される信頼できるアミノ酸残基の数及び特異的オリゴヌクレオチドプールの溶融温度に固有な溶融温度に依存して、設計検討のための付加的パラメータは、以下の三つであった。即ち、Ａ）最小の縮重を有するタンパク質配列区域を用いてオリゴヌクレオチド設計の複雑性を減少させた；Ｂ）全ての妥当な配列の順列をカバーするために縮重オリゴヌクレオチドを作成した，Ｃ）長さ２０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを作成した（アウスベルら、１９９６）。タンパク質配列＃１−（ＥＰＡＶＹＦＫＥＱＦＬＤＧＤ）（配列番号：２１）は、可能なオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＡ（Ａ／Ｇ）−ＣＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）−ＧＣ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）−ＧＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）−ＴＡ（Ｔ／Ｃ）−ＴＴ（Ｔ／Ｃ）−ＡＡ（Ａ／Ｇ）−ＧＡ（Ａ／Ｇ）−ＣＡ（Ａ／Ｇ）− ＴＴ（Ｔ／Ｃ）−ＣＴ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）あるいは（配列番号：１７）ＴＴ（Ａ／Ｇ）−ＧＡ（Ｔ／Ｃ）−ＧＧ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）−ＧＡ（Ｔ／Ｃ）−３’（配列番号：２２）を生じた。最適化コドン、用法及びほかに上記のパラメータを適用して最終的なオリゴヌクレオチド配列として、５’−ＧＣ（Ｔ／Ｃ）−ＧＣ（Ｃ／Ｇ）−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＧ−ＧＡＧ−ＣＡＧ−ＴＴＣ−ＣＴ−３’（配列番号：２３）を誘導した。同様に、タンパク質配列＃２（ＫＶＨＶ（Ｉ／Ｌ）ＦＮＹＫ）（配列番号：７）を最適化し、逆相補を起こすと、オリゴヌクレオチド配列、５’−ＣＴＴ−ＧＴＡ−ＧＴＴ−ＧＡＡ−ＧＡＴ−ＣＡＣ−（Ａ／Ｇ）ＴＧ−ＣＡＣ−ＣＴ−３’（配列番号：２４）を生じた。オリゴヌクレオチドプローブは、ヴァージニア大学コアグループ施設により作製された。縮重オリゴヌクレオチドのプールを用いるＲＴ−ＰＣＲ−クローニング。０．５μｇオリゴ−ｄ（Ｔ）_12-18ＲＮＡとジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＨ₂Ｏとの反応液（２０μＬ）中で０．０５μｇのポリ−（Ａ）⁺ＲＮＡを逆転写し、６５℃で１０分間加熱してＰＣＲクローニングを行った。続いて、２μＬの１０ＸＲＴバッファー、０．５μＬの胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（３６Ｕ／μＬ；プロメガ社）、１μＬの１０ｍＭ４ｄＮＴＰｓ及び１μＬのＡＭＶ逆トランスクリプターゼ（２３Ｕ／μＬ；ストラタジーン社、Stratagene）を添加し、攪拌し、さらに混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。８０μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏを添加した後、１μＬアリコートのｃＤＮＡ溶液を、Ｔａｑポリメラーゼ製造者（プロメガ又はパーキンエルマー）に指定されるように４０サイクル（９４℃４５秒、３８／４４／５０／５６℃４５秒、７２℃２分）増幅した。ＰＣＲ生成物は、反応アリコートを１ＸのＴＡＥ（４０ｍＭトリスーアセテート、１ｍＭＥＤＴＡ））バッファー溶液の２．４％アガロースゲル中で電気泳動させ、特定フラグメントを回収することにより、分離及び単離した。沈殿を計測した後、ＰＣＲフラグメントを、製造者（ストラタジーン、Stratagene）のインストラクションに従いｐＣＲスクリプトベクターにライゲートし、さらに配列決定した。縮重最適化オリゴヌクレオチドは、ヒト精巣ポリー（Ａ）⁺ＲＮＡを逆転写して製造した精巣ｃＤＮＡとのＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応をアガロースゲル［図１３］上で分析したところ、アニール温度３８、４４及び５０℃における反応（図１３、レーン５、８、１１）により、同温度で行ったネガティブ対照（図１３、レーン３、４、６、７、９、１０、１２、１３）に対し約４００ｂｐｓ泳動した単一の優勢なＰＣＲ生成物が示された。４００ｂｐバンドを電気的に溶出し、ｐＣＲスクリプトベクターにクローニングし、配列決定し、且つコンピュータで分析した結果、このバンドの配列は体性カルレティキュリンｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号＃ｍ８４７３９）と同一であり、従ってオリゴヌクレオチドプライマーを誘導した２−Ｄゲルスポットはカルレティキュリンの精巣形態（図１４）であることが判明した。図１４は、最適化縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより誘導されたクローンより得られたＤＮＡ配列（配列番号：２５）を示す。図中、数字は配列化クローン及びカルレティキュリン遺伝子中の塩基対の位置を示し、（ｃ）はＲＴ− ＰＣＲクローン（配列番号．２５）を示し、（Ｈ）はＧｅｎＢａｎｋより得られたヒトカルレティキュリンｃＤＮＡ（配列番号：２６）を示す。本実施例は、２−Ｄゲルタンパク質スポットのマイクロシークェンシングにより得られるアミノ酸配列データを用いるヒト精巣ｃＤＮＡの単離の成功を示している。実施例１４溶解バッファーＡ［ＮＰ−４０／尿素］及び２３×２３ｃｍゲルを用いたプレパラティブ二次元ゲル電気泳動によって、精子表面エンサイクロペディア｛インデックス｝［表３］にあり、見かけの質量５４ｋＤａ及び等電点５．３を有する精子タンパク質Ｉ−２３、を他のタンパク質より分離した。このタンパク質を二重ベクトル的にラベルした細胞表面分子の一例として選択した。Ｉ−２３タンパク質のスポットを、微小スケイプル（scaple）を用いてプレパラティブアクリルアミドゲルから直接くり貫き、タンパク質をアクリルアミドゲル中で消化し、実施例１３記載のようなタンデム型質量スペクトロメトリーに付した。図１５は、精子表面タンパク質Ｉ−２３のタンデム型質量スペクトロメトリーにより誘導されたタンパク質マイクロ配列を示す。図１５は、精子表面インデックス中のタンパク質Ｉ−２３より得られたマイクロ配列を示す。Ａ）において、配列はＣＡＤ分析とＮ‐末端誘導体のＣＡＤ分析とのコンパイレーションである。Ｘは低エネルギーＣＡＤで区別できないＩ又はＬを、（−）は更なる分析が必要な未知アミノ酸を、（Ｙ／Ｚ）は、更なる分析が必要で、その位置において交代可能な二種のアミノ酸を表す。小文字は配列の一次帰属をあらわす。Ｂ）は、相補的及び逆相補的オリゴヌクレオチドの設計である。Ａ）ペプチド配列（配列番号：２７〜３５）。ペプチド＃１−ＳＰＸＸＳＸＫペプチド＃７−ＶＴＮＳＴＧＧＳｐｘｋペプチド＃２−ＸＱＡＮＮＡ--Ｋペプチド＃８−解釈不能ペプチド＃３−ＶＡＴＥＦＡＦＲペプチド＃９−--ＰＥＶＤ--ｔＲペプチド＃４−--ＸＳＸＮＸＲペプチド＃１０−解釈不能ペプチド＃５−--ＳＭＸＸＤＴＫペプチド＃１１−--ＱＡＥＮＡ---Ｋペプチド＃６−ＭＥＴ(x/n)(e/q)ＸＤＲＢ）タンパク質配列＃３：センスーオリゴヌクレオチドを示す（配列番号：２９、３６、３７）。タンパク質配列＃７：センス−オリゴヌクレオチドを示す（配列番号：３８〜４０）。ＲＴ−ＰＣＲを実施例１３記載のように行い、生成物を実施例１３に示すようなアガロースゲル上で分析した。主なＰＣＲ生成物は約１０００ｂｐであった。これをｐＣＲスクリプトベクターにクローニングし、配列決定した。この新規精子表面タンパク質の配列を図１６に示す。図１６は、精子表面タンパク質Ｉ−２３の最適化縮重プライマーを用いたＲＴ −ＰＣＲにより誘導されたクローンから得られた１０１１ｂｐＤＮＡ配列（配列番号：４１）を示す。本実施例は、２−Ｄゲル上の二重ラベル細胞表面タンパク質から始まり、マイクロシークェンシング、最適化オリゴヌクレオチド設計及びＲＴ−ＰＣＲへ続く、新規細胞表面痘苗原（vaccinogen）のｃＤＮＡの同定・単離プロセスを示す。従って、この組合せプロセスは、任意の生物学的ターゲットに関する表面抗原及び精子に対するワクチン設計の合理的手順を創造し、抗体の固定化及び凝集を惹起し得る関連する表面抗原に対する避妊ワクチンへの道を開くものである。以上の開示、及び特に実験手順と検討に関する文献のリストを以下に示す。これらの文献の全体を、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。以上本発明を詳細に説明したか、当業者であれば本発明に対しその趣旨を逸脱することなく多くの変更や修正を加えることができることが明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/28 Ｃ０７Ｋ 14/28 14/705 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 27/26 ３１５ＨＧ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ナービー−ハンセン，ソーレンアメリカ合衆国 22908 バージニア州, シャーロッツビル，メディカルセンターボックス 439，ユニバーシティオブバージニア (72)発明者フリッキンガー，チャールズ，ジェー. アメリカ合衆国 22908 バージニア州, シャーロッツビル，メディカルセンターボックス 439，ユニバーシティオブバージニア

Claims

【特許請求の範囲】１．膜表面タンパク質の分析方法であって、次の各ステップ：ａ．膜表面のタンパク質を方向性のある（vectorially）標識をし、ｂ．標識した膜表面タンパク質を二次元ゲル電気泳動によって単離し、ｃ．単離した膜表面タンパク質の配列を決定する、を含む方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記膜がウィルス、バクテリア、又は細胞表面に存在する方法。３．請求項２に記載の方法であって、前記膜が精子細胞表面に存在する方法。４．請求項１に記載の方法であって、膜タンパク質がヨウ素、ビオチン又はそれらの混合物で標識される方法。５．膜表面タンパク質に対するワクチンの製造方法であって、次の各ステップ：ａ．膜表面のタンパク質を方向性のある（vectorially）標識をし、ｂ．標識した膜表面タンパク質を二次元ゲル電気泳動によって単離し、ｃ．単離した膜表面タンパク質の配列を決定し、ｄ．膜表面タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ｅ．ステップ（ｄ）で単離したＤＮＡをペプチド免疫原として用いて膜表面タンパク質を組換によって生成する、を含む方法。６．請求項５に記載の方法であって、前記膜がウィルス、マイクロバクテリア、又は細胞表面に存在する方法。７．請求項５に記載の方法であって、前記膜が精子細胞表面に存在する方法。８．請求項５に記載の方法であって、膜タンパク質はヨウ素、ビオチン又はそれらの混合物で標識される方法。９．不妊診断方法であって、次の各ステップ：ａ．請求項５に記載の方法で得た膜表面タンパク質を標識し、ｂ．標識した膜表面タンパク質と不妊の有無の診断対象の患者から得た血清とを反応させ、ｃ．血清に存在する抗体と標識した膜表面タンパク質との複合体の生成を検出する、を含む方法。１０．請求項５に記載の方法で生成された細胞表面タンパク質を含む診断テストキット。１１．請求項５に記載の方法により製造した細胞表面タンパク質を、患者の卵子の受精を防ぐのに充分な量において当該患者に対し投与することを含む、当該患者に避妊を誘発させる方法。１２．請求項５に記載の方法により製造した組換タンパク質を哺乳動物に投与し、哺乳動物内で産生した当該組換タンパク質に対する抗体を単離することを含む、避妊薬の製造方法。１３．請求項１２に記載の方法により製造した避妊薬。１４．請求項２に記載の方法により製造したワクチン。