JPH05317050A - Ｐｚｐ−４遺伝子及び避妊ワクチン - Google Patents
Ｐｚｐ−４遺伝子及び避妊ワクチンInfo
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- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 避妊ワクチンとして用いることができる卵透
明帯由来のポリペプチドを遺伝子工学的に調製する手段
を提供すること。 【構成】 下記アミノ酸配列をコードするＰＺＰ−４遺
伝子を提供した。 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-
Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-Arg-Met-Val-Va
l-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu-Gly-Thr-Lys-Ile-Gln-Tyr-
Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-Glu-Met-Met-As
n-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-Asn-Leu-Thr-Leu-
Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-Arg-Val-Arg-Gl
y-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-
Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Se
r-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln-His-
Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp-Phe-Met-Ser-Va
l-Ser-Glu-Trp-Gly Ｃ側 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-
Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-Arg-Met-Val-Va
l-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu-Gly-Thr-Lys-Ile-Gln-Tyr-
Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-Glu-Met-Met-As
n-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-Asn-Leu-Thr-Leu-
Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-Arg-Val-Arg-Gl
y-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-
Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Se
r-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln-His-
Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp-Phe-Met-Ser-Ph
e-Thr-Phe-Asn-Phe Ｃ側
明帯由来のポリペプチドを遺伝子工学的に調製する手段
を提供すること。 【構成】 下記アミノ酸配列をコードするＰＺＰ−４遺
伝子を提供した。 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-
Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-Arg-Met-Val-Va
l-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu-Gly-Thr-Lys-Ile-Gln-Tyr-
Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-Glu-Met-Met-As
n-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-Asn-Leu-Thr-Leu-
Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-Arg-Val-Arg-Gl
y-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-
Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Se
r-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln-His-
Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp-Phe-Met-Ser-Va
l-Ser-Glu-Trp-Gly Ｃ側 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-
Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-Arg-Met-Val-Va
l-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu-Gly-Thr-Lys-Ile-Gln-Tyr-
Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-Glu-Met-Met-As
n-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-Asn-Leu-Thr-Leu-
Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-Arg-Val-Arg-Gl
y-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-
Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Se
r-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln-His-
Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp-Phe-Met-Ser-Ph
e-Thr-Phe-Asn-Phe Ｃ側
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ブタ卵透明帯の成分で
あるＰＺＰ−４をコードする遺伝子並びにヒト及び動物
の避妊ワクチンに関する。
あるＰＺＰ−４をコードする遺伝子並びにヒト及び動物
の避妊ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】避妊ワクチンによる避妊法は従来の避妊
法であるピル、ＩＵＤ、コンドーム、リズム法、不妊手
術等による方法とは異なり免疫学的避妊法である。従来
より、卵透明帯は避妊ワクチンのワクチン抗原に成り得
る可能性があることが知られている。すなわち、卵透明
帯をワクチン抗原として投与すると該抗原に対する抗体
が生成されることにより受精又は細胞の発育が阻害され
て避妊が可能となるものである。
法であるピル、ＩＵＤ、コンドーム、リズム法、不妊手
術等による方法とは異なり免疫学的避妊法である。従来
より、卵透明帯は避妊ワクチンのワクチン抗原に成り得
る可能性があることが知られている。すなわち、卵透明
帯をワクチン抗原として投与すると該抗原に対する抗体
が生成されることにより受精又は細胞の発育が阻害され
て避妊が可能となるものである。
【０００３】卵透明帯の中では一般的にブタの卵透明帯
がワクチン抗原として研究されている。ワクチンとして
は、ブタの卵透明帯の全成分（ＰＺＰ−１；M. W. 80 -
90K、ＰＺＰ−２；M. W. 60 - 65K、ＰＺＰ−３；M.
W. 55K 、 ＰＺＰ−４；M. W. 20 - 25K (Wassarman P
M. "ZONA PELLUCIDA GLYCOPROTEINS" Ann. Rev. Bioche
m. 1988, 57: 415 - 42))あるいはＰＺＰ−３成分のみ
を使用するものが研究されている（Sacco AG. "Zona Pe
llucida: Current Status as a CandidateAntigen for
Contraceptive Vaccine Development." AMERICAN JOURN
AL OFREPRODUCTIVE IMMUNOLOGY AND MICROBIOLOGY 198
7, 15: 122 - 130) 。
がワクチン抗原として研究されている。ワクチンとして
は、ブタの卵透明帯の全成分（ＰＺＰ−１；M. W. 80 -
90K、ＰＺＰ−２；M. W. 60 - 65K、ＰＺＰ−３；M.
W. 55K 、 ＰＺＰ−４；M. W. 20 - 25K (Wassarman P
M. "ZONA PELLUCIDA GLYCOPROTEINS" Ann. Rev. Bioche
m. 1988, 57: 415 - 42))あるいはＰＺＰ−３成分のみ
を使用するものが研究されている（Sacco AG. "Zona Pe
llucida: Current Status as a CandidateAntigen for
Contraceptive Vaccine Development." AMERICAN JOURN
AL OFREPRODUCTIVE IMMUNOLOGY AND MICROBIOLOGY 198
7, 15: 122 - 130) 。
【０００４】しかしながら、いずれにせよ卵透明帯は卵
巣中にしか存在しないために、ワクチンを生産するため
に必要な抗原を得るためには大量の卵巣を必要とし、こ
のため十分な抗原及び抗体を産生することができないと
いう問題があった。また、卵透明帯を精製する上で、他
の卵巣組織が混在することも考えられ、他の卵巣組織の
混在はこれをワクチンとして用いた場合、副作用を強く
する原因となることも考えられる。
巣中にしか存在しないために、ワクチンを生産するため
に必要な抗原を得るためには大量の卵巣を必要とし、こ
のため十分な抗原及び抗体を産生することができないと
いう問題があった。また、卵透明帯を精製する上で、他
の卵巣組織が混在することも考えられ、他の卵巣組織の
混在はこれをワクチンとして用いた場合、副作用を強く
する原因となることも考えられる。
【０００５】もし、卵透明帯又はその成分を遺伝子工学
的手段により調製することができれば、生体からの調製
によらずとも避妊ワクチンとして用いることができるポ
リペプチドを大量に調製することができ、望ましい。
的手段により調製することができれば、生体からの調製
によらずとも避妊ワクチンとして用いることができるポ
リペプチドを大量に調製することができ、望ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、避妊ワクチンとして用いることができる卵透明帯由
来のポリペプチドを遺伝子工学的に調製する手段を提供
することである。
は、避妊ワクチンとして用いることができる卵透明帯由
来のポリペプチドを遺伝子工学的に調製する手段を提供
することである。
【０００７】さらにまた、本発明の目的は、生体以外の
供給源から大量に調製することができる避妊ワクチンを
提供することである。
供給源から大量に調製することができる避妊ワクチンを
提供することである。
【０００８】本願発明者らは、先に出願した特願平３−
８２９０６号に記載したように、ブタ卵透明帯の成分で
あるＰＺＰ−４が避妊ワクチンとして有効であることを
見出した。そして、本発明において、該ＰＺＰ−４をコ
ードする遺伝子の全塩基配列及びＰＺＰ−４の全アミノ
酸配列を決定することに成功し、本発明を完成した。
８２９０６号に記載したように、ブタ卵透明帯の成分で
あるＰＺＰ−４が避妊ワクチンとして有効であることを
見出した。そして、本発明において、該ＰＺＰ−４をコ
ードする遺伝子の全塩基配列及びＰＺＰ−４の全アミノ
酸配列を決定することに成功し、本発明を完成した。
【０００９】 すなわち、本発明は、Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe- Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-Arg-Met-Val-Val-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile- Leu-Gly-Thr-Lys-Ile-Gln-Tyr-Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-Glu-Met- Met-Asn-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-Asn-Leu-Thr-Leu-Lys-Ala-Pro-Tyr- Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile- Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro- Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln-His-Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys- Asp-Phe-Met-Ser-Val-Ser-Glu-Trp-Gly Ｃ側 で示されるアミノ酸をコードするＰＺＰ−４α遺伝子を
提供する。
提供する。
【００１０】 また、本発明は、Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-Pro- Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-Arg-Met-Val-Val-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu- Gly-Thr-Lys-Ile-Gln-Tyr-Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-Glu-Met-Met- Asn-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-Asn-Leu-Thr-Leu-Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu- Ala-Cys-Thr-Lys-Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp- Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val- Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln-His-Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp- Phe-Met-Ser-Phe-Thr-Phe-Asn-Phe Ｃ側 で示されるアミノ酸配列をコードするＰＺＰ４−β遺伝
子を提供する。
子を提供する。
【００１１】さらに、本発明は、上記ＰＺＰ−４α及び
βのアミノ酸配列のうち、抗原性を有する任意の領域を
有効成分として含む避妊ワクチンを提供する。
βのアミノ酸配列のうち、抗原性を有する任意の領域を
有効成分として含む避妊ワクチンを提供する。
【００１２】さらに、本発明は、上記ＰＺＰ−４α及び
βのアミノ酸配列のうち、抗原性を有する任意の領域を
コードするＤＮＡを提供する。
βのアミノ酸配列のうち、抗原性を有する任意の領域を
コードするＤＮＡを提供する。
【００１３】さらに、本発明は、該ＤＮＡを発現し得る
発現ベクターを提供する。
発現ベクターを提供する。
【００１４】さらに、本発明は、該発現ベクターで形質
転換された細胞を提供する。
転換された細胞を提供する。
【００１５】上記した本発明の遺伝子の塩基配列は、下
記実施例において詳述するように、ブタ卵巣細胞のｃＤ
ＮＡライブラリー中のＰＺＰ−４のｃＤＮＡをＰＣＲで
増幅し、その塩基配列を決定することにより行なった。
このように決定された塩基配列に基づき、ＰＺＰ−４の
アミノ酸配列が決定された。その結果、Ｃ末端部分の５
アミノ酸が異なるＰＺＰ−４α及びＰＺＰ−４βの全ア
ミノ酸配列が決定され、その配列は上記した通りであ
る。また、下記実施例において決定されたＰＺＰ−４α
及びＰＺＰ−４βをコードする遺伝子の塩基配列は次の
とおりであった。 ＰＺＰ−４α遺伝子 5'-ATCGGCGTTAATCAACTCGTTAATACAGCATTTCCAGGTATTGTCACTTGCCATGAAAATAGAATGGTA GTGGAATTTCCAAGAATTCTTGGCACTAAGATACAGTACACCTCTGTGGTGGACCCTCTTGGTCTTGAAATG ATGAACTGTACTTATGTTCTGGACCCAGAAAACCTCACCCTGAAGGCCCCATATGAAGCCTGTACCAAAAGA GTGCGTGGCCATCACCAAATGACCATCAGACTCATAGATGACAATGCTGCTTTAAGACAAGAGGCTCTCATG TATCACATCAGCTGTCCTGTTATGGGAGCAGAAGGCCCTGATCAGCATTCGGGATCCACAATCTGCATGAAA GATTTCATGTCTGTAAGTGAATGGGGC-3' ＰＺＰ−４β遺伝子 5'-ATCGGCGTTAATCAACTCGTTAATACAGCATTTCCAGGTATTGTCACTTGCCATGAAAATAGAATGGTA GTGGAATTTCCAAGAATTCTTGGCACTAAGATACAGTACACCTCTGTGGTGGACCCTCTTGGTCTTGAAATG ATGAACTGTACTTATGTTCTGGACCCAGAAAACCTCACCCTGAAGGCCCCATATGAAGCCTGTACCAAAAGA GTGCGTGGCCATCACCAAATGACCATCAGACTCATAGATGACAATGCTGCTTTAAGACAAGAGGCTCTCATG TATCACATCAGCTGTCCTGTTATGGGAGCAGAAGGCCCTGATCAGCATTCGGGATCCACAATCTGCATGAAA GATTTCATGTCTTTTACCTTTAACTTT-3'
記実施例において詳述するように、ブタ卵巣細胞のｃＤ
ＮＡライブラリー中のＰＺＰ−４のｃＤＮＡをＰＣＲで
増幅し、その塩基配列を決定することにより行なった。
このように決定された塩基配列に基づき、ＰＺＰ−４の
アミノ酸配列が決定された。その結果、Ｃ末端部分の５
アミノ酸が異なるＰＺＰ−４α及びＰＺＰ−４βの全ア
ミノ酸配列が決定され、その配列は上記した通りであ
る。また、下記実施例において決定されたＰＺＰ−４α
及びＰＺＰ−４βをコードする遺伝子の塩基配列は次の
とおりであった。 ＰＺＰ−４α遺伝子 5'-ATCGGCGTTAATCAACTCGTTAATACAGCATTTCCAGGTATTGTCACTTGCCATGAAAATAGAATGGTA GTGGAATTTCCAAGAATTCTTGGCACTAAGATACAGTACACCTCTGTGGTGGACCCTCTTGGTCTTGAAATG ATGAACTGTACTTATGTTCTGGACCCAGAAAACCTCACCCTGAAGGCCCCATATGAAGCCTGTACCAAAAGA GTGCGTGGCCATCACCAAATGACCATCAGACTCATAGATGACAATGCTGCTTTAAGACAAGAGGCTCTCATG TATCACATCAGCTGTCCTGTTATGGGAGCAGAAGGCCCTGATCAGCATTCGGGATCCACAATCTGCATGAAA GATTTCATGTCTGTAAGTGAATGGGGC-3' ＰＺＰ−４β遺伝子 5'-ATCGGCGTTAATCAACTCGTTAATACAGCATTTCCAGGTATTGTCACTTGCCATGAAAATAGAATGGTA GTGGAATTTCCAAGAATTCTTGGCACTAAGATACAGTACACCTCTGTGGTGGACCCTCTTGGTCTTGAAATG ATGAACTGTACTTATGTTCTGGACCCAGAAAACCTCACCCTGAAGGCCCCATATGAAGCCTGTACCAAAAGA GTGCGTGGCCATCACCAAATGACCATCAGACTCATAGATGACAATGCTGCTTTAAGACAAGAGGCTCTCATG TATCACATCAGCTGTCCTGTTATGGGAGCAGAAGGCCCTGATCAGCATTCGGGATCCACAATCTGCATGAAA GATTTCATGTCTTTTACCTTTAACTTT-3'
【００１６】本発明により、ＰＺＰ−４の全アミノ酸配
列が決定されたので、避妊ワクチンとして有用なペプチ
ドが提供される。すなわち、上記ＰＺＰ−４α及びβの
アミノ酸配列のうち、抗原性を有する任意の領域から成
るペプチドは、避妊ワクチンとして有効である。なお、
本明細書において、「抗原性を有する」とは、そのペプ
チドを単独で投与した場合に該ペプチドに対する抗体の
産生を誘起できることのみならず、アルブミン等の適当
な抗原性キャリアーに該ペプチドを結合して投与した場
合に、該ペプチドをエピトープとする抗体の産生が誘起
される場合も包含する。従って、上記ＰＺＰ−４アミノ
酸配列のうち、約５個以上のアミノ酸を含む配列が避妊
ワクチンペプチドとして有効である。もっとも、他のキ
ャリアに結合する等の煩雑さを考慮すると、単独で抗体
産生誘起能を持つものが好ましく、従って、上記ＰＺＰ
−４アミノ酸配列のうち、約１０個以上、さらに好まし
くは約２０個以上のアミノ酸を含むペプチドが好まし
い。
列が決定されたので、避妊ワクチンとして有用なペプチ
ドが提供される。すなわち、上記ＰＺＰ−４α及びβの
アミノ酸配列のうち、抗原性を有する任意の領域から成
るペプチドは、避妊ワクチンとして有効である。なお、
本明細書において、「抗原性を有する」とは、そのペプ
チドを単独で投与した場合に該ペプチドに対する抗体の
産生を誘起できることのみならず、アルブミン等の適当
な抗原性キャリアーに該ペプチドを結合して投与した場
合に、該ペプチドをエピトープとする抗体の産生が誘起
される場合も包含する。従って、上記ＰＺＰ−４アミノ
酸配列のうち、約５個以上のアミノ酸を含む配列が避妊
ワクチンペプチドとして有効である。もっとも、他のキ
ャリアに結合する等の煩雑さを考慮すると、単独で抗体
産生誘起能を持つものが好ましく、従って、上記ＰＺＰ
−４アミノ酸配列のうち、約１０個以上、さらに好まし
くは約２０個以上のアミノ酸を含むペプチドが好まし
い。
【００１７】このようなペプチドは、そのアミノ酸配列
がわかっているので、例えば市販のペプチド合成機を用
いて容易に合成することができる。また、ペプチドが長
くて化学合成によることが困難な場合には、そのペプチ
ドをコードするＤＮＡを調製し、それを適当な市販の発
現用ベクターに組み込んで大腸菌等で発現させることに
より調製することができる。この場合に用いられるＤＮ
Ａは、約２００塩基以下であれば市販のＤＮＡ合成機に
より容易に合成することができるし、それより長い場合
には、ＰＺＰ−４遺伝子の全塩基配列がわかっているの
で、ブタ卵細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、
ＰＣＲ法で遺伝子を増幅させることにより、ＰＺＰ−４
遺伝子の任意の領域をクローニングすることができ、そ
れを市販の発現用ベクターに組み込んで発現することに
よりＰＺＰ−４のアミノ酸配列のうちの任意の領域を発
現させることができる。
がわかっているので、例えば市販のペプチド合成機を用
いて容易に合成することができる。また、ペプチドが長
くて化学合成によることが困難な場合には、そのペプチ
ドをコードするＤＮＡを調製し、それを適当な市販の発
現用ベクターに組み込んで大腸菌等で発現させることに
より調製することができる。この場合に用いられるＤＮ
Ａは、約２００塩基以下であれば市販のＤＮＡ合成機に
より容易に合成することができるし、それより長い場合
には、ＰＺＰ−４遺伝子の全塩基配列がわかっているの
で、ブタ卵細胞のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、
ＰＣＲ法で遺伝子を増幅させることにより、ＰＺＰ−４
遺伝子の任意の領域をクローニングすることができ、そ
れを市販の発現用ベクターに組み込んで発現することに
よりＰＺＰ−４のアミノ酸配列のうちの任意の領域を発
現させることができる。
【００１８】上述のように、本発明のワクチンは、ペプ
チド合成又は遺伝子工学的手法により製造することがで
きるが、アミノ酸の数が４０を超えると化学合成が困難
になるので遺伝子工学的手法により製造することが好ま
しい。
チド合成又は遺伝子工学的手法により製造することがで
きるが、アミノ酸の数が４０を超えると化学合成が困難
になるので遺伝子工学的手法により製造することが好ま
しい。
【００１９】遺伝子工学的手法による本発明のワクチン
の製造は、該ポリペプチドをコードする領域を含み、大
腸菌等の宿主細胞で該ポリペプチドを発現する発現ベク
ターで宿主を形質転換し、得られた形質転換株を培養
し、その培養物から上記ポリペプチドを回収することに
より行うことができる。
の製造は、該ポリペプチドをコードする領域を含み、大
腸菌等の宿主細胞で該ポリペプチドを発現する発現ベク
ターで宿主を形質転換し、得られた形質転換株を培養
し、その培養物から上記ポリペプチドを回収することに
より行うことができる。
【００２０】上記発現ベクターにおいて、本発明のポリ
ペプチドをコードする領域は、本発明のポリペプチドを
コードするものであればいかなる塩基配列を有していて
もよいが、例えば宿主として大腸菌を用いる場合には、
発現がスムーズになるよう大腸菌の使用頻度の高いコド
ンを使い、パリンドロームなどの配列を避けることが望
ましい。
ペプチドをコードする領域は、本発明のポリペプチドを
コードするものであればいかなる塩基配列を有していて
もよいが、例えば宿主として大腸菌を用いる場合には、
発現がスムーズになるよう大腸菌の使用頻度の高いコド
ンを使い、パリンドロームなどの配列を避けることが望
ましい。
【００２１】ＰＺＰ４のアミノ酸をコードする塩基配列
としては図８に示す配列が望ましい。
としては図８に示す配列が望ましい。
【００２２】上記本発明のポリペプチドコード領域の上
流には大腸菌での転写効率を高める例えばｔａｃプロモ
ーターのようなプロモーターが存在する。プロモーター
の直下流に前記本発明のポリペプチドコード領域が位置
してもよいが、後述の実施例で示すように、大腸菌マル
トース結合タンパク質あるいはＴｒｐＥタンパク質のよ
うな、大腸菌由来タンパク質をコードする領域の下流に
上記領域が位置していても良い。後者の場合には、本発
明のポリペプチドは融合タンパク質の形態として得られ
る。
流には大腸菌での転写効率を高める例えばｔａｃプロモ
ーターのようなプロモーターが存在する。プロモーター
の直下流に前記本発明のポリペプチドコード領域が位置
してもよいが、後述の実施例で示すように、大腸菌マル
トース結合タンパク質あるいはＴｒｐＥタンパク質のよ
うな、大腸菌由来タンパク質をコードする領域の下流に
上記領域が位置していても良い。後者の場合には、本発
明のポリペプチドは融合タンパク質の形態として得られ
る。
【００２３】この発明の発現ベクターは、通常の発現ベ
クターと同様、抗生物質耐性のような適当な選択マーカ
ー及び宿主内で複製するための開始点を有す。さらに、
上記本発明のポリペプチドコード領域の下流には翻訳終
結コドンが存在する。これらは例えばｐＵＣ９，ｐＢＲ
３２２その他の市販の大腸菌用ベクターを利用すること
ができる。
クターと同様、抗生物質耐性のような適当な選択マーカ
ー及び宿主内で複製するための開始点を有す。さらに、
上記本発明のポリペプチドコード領域の下流には翻訳終
結コドンが存在する。これらは例えばｐＵＣ９，ｐＢＲ
３２２その他の市販の大腸菌用ベクターを利用すること
ができる。
【００２４】上記発現ベクターは、上記した本発明のポ
リペプチドコード領域を例えばホスホアミダイト法等の
公知の合成法により作製し、さらに大腸菌内で発現する
公知の発現ベクターにクローニングすることにより作製
することできる。後述の実施例では、大腸菌のＴＧＦ−
α発現ベクター（特願昭６３−２８９０８号記載）、あ
るいは、市販の発現ベクター（ｐＭＡＬ−ｃ， Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓｓ社）にＰＺＰ４コ
ード領域をクローニングした。
リペプチドコード領域を例えばホスホアミダイト法等の
公知の合成法により作製し、さらに大腸菌内で発現する
公知の発現ベクターにクローニングすることにより作製
することできる。後述の実施例では、大腸菌のＴＧＦ−
α発現ベクター（特願昭６３−２８９０８号記載）、あ
るいは、市販の発現ベクター（ｐＭＡＬ−ｃ， Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓｓ社）にＰＺＰ４コ
ード領域をクローニングした。
【００２５】上記発現ベクターを用いた形質転換は従来
の大腸菌ベクターによる形質転換と全く同様に行なうこ
とができる。また、大腸菌の培養条件も従来と同様に行
なうことができる。
の大腸菌ベクターによる形質転換と全く同様に行なうこ
とができる。また、大腸菌の培養条件も従来と同様に行
なうことができる。
【００２６】上記ベクターで形質転換された大腸菌によ
り産生された本発明のポリペプチドは、菌体を遠心分離
等で集め、周知のリゾチーム処理及び又は超音波処理等
で菌体を破壊し、これをカラムクロマトグラフィー等に
かけることにより分離精製する事ができる。分離精製の
具体的条件は後述の実施例に詳細する。
り産生された本発明のポリペプチドは、菌体を遠心分離
等で集め、周知のリゾチーム処理及び又は超音波処理等
で菌体を破壊し、これをカラムクロマトグラフィー等に
かけることにより分離精製する事ができる。分離精製の
具体的条件は後述の実施例に詳細する。
【００２７】一般に何らかの生理活性を有するポリペプ
チドは、そのアミノ酸配列に少数のアミノ酸の付加、欠
失又は置換が起きたものであっても同様な生理活性を有
することがあることは当業者において広く認識されてい
るところである。従って、上記ＰＺＰ−４のアミノ酸配
列に少数のアミノ酸が付加され、少数のアミノ酸が欠失
し又は少数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたもの
であっても、ＰＺＰ−４と同様な避妊ワクチン抗原性を
有するものは、ＰＺＰ−４のアミノ酸配列と実質的に同
一であり、特許請求の範囲における「アミノ酸配列」と
いう語は、このような実質的に同一のアミノ酸配列をも
包含するものとして解釈されなければならない。また、
該アミノ酸配列をコードする遺伝子についても同じこと
が言える。
チドは、そのアミノ酸配列に少数のアミノ酸の付加、欠
失又は置換が起きたものであっても同様な生理活性を有
することがあることは当業者において広く認識されてい
るところである。従って、上記ＰＺＰ−４のアミノ酸配
列に少数のアミノ酸が付加され、少数のアミノ酸が欠失
し又は少数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたもの
であっても、ＰＺＰ−４と同様な避妊ワクチン抗原性を
有するものは、ＰＺＰ−４のアミノ酸配列と実質的に同
一であり、特許請求の範囲における「アミノ酸配列」と
いう語は、このような実質的に同一のアミノ酸配列をも
包含するものとして解釈されなければならない。また、
該アミノ酸配列をコードする遺伝子についても同じこと
が言える。
【００２８】本発明のワクチンは常法に基づきワクチン
に製剤することができる。例えば、ペプチドをフロイン
ド完全アジュバントに例えば１０μg/mlないし100 μg/
ml程度の濃度に懸濁することにより避妊ワクチンを製剤
することができる。
に製剤することができる。例えば、ペプチドをフロイン
ド完全アジュバントに例えば１０μg/mlないし100 μg/
ml程度の濃度に懸濁することにより避妊ワクチンを製剤
することができる。
【００２９】また、ワクチンの投与量、投与回数及び投
与時期は１０μg ないし100 μg のＰＺＰ−４を１回の
投与量とし、初回は完全フロイントアジュバントに、ま
た２回目以降は不完全フロイントアジュバントに懸濁し
て２週間ないし４週間の間隔で数回投与することによ
り、抗体を産生することが可能である。なお、投与の時
期は問わない。
与時期は１０μg ないし100 μg のＰＺＰ−４を１回の
投与量とし、初回は完全フロイントアジュバントに、ま
た２回目以降は不完全フロイントアジュバントに懸濁し
て２週間ないし４週間の間隔で数回投与することによ
り、抗体を産生することが可能である。なお、投与の時
期は問わない。
【００３０】本発明の避妊ワクチンを接種して得られる
抗体は、精子と卵との結合を妨げること及び卵巣内での
卵胞の発育を抑制することによって妊娠を防止するもの
であるから、他の作用機序に基づく避妊方法よりも安全
性が高いと考えられる。また、本発明の避妊ワクチンを
接種して誘導された抗体は、ブタのみならず、ヒト、ウ
サギ、ネコ及びイヌの卵透明帯とも交叉反応性を有する
ことから、ヒト及びこれらの動物の避妊ワクチンとして
も有効に機能するものと考えられる。特に、ヒトに関し
ては、本発明の避妊ワクチンを接種して得られた抗体に
よるヒト精子の受精阻害が確認されている。従って、本
発明の避妊ワクチンは、ヒトの避妊手段として、また、
ペット等の動物の増殖を抑制するための避妊手段として
有効に用いることができる。
抗体は、精子と卵との結合を妨げること及び卵巣内での
卵胞の発育を抑制することによって妊娠を防止するもの
であるから、他の作用機序に基づく避妊方法よりも安全
性が高いと考えられる。また、本発明の避妊ワクチンを
接種して誘導された抗体は、ブタのみならず、ヒト、ウ
サギ、ネコ及びイヌの卵透明帯とも交叉反応性を有する
ことから、ヒト及びこれらの動物の避妊ワクチンとして
も有効に機能するものと考えられる。特に、ヒトに関し
ては、本発明の避妊ワクチンを接種して得られた抗体に
よるヒト精子の受精阻害が確認されている。従って、本
発明の避妊ワクチンは、ヒトの避妊手段として、また、
ペット等の動物の増殖を抑制するための避妊手段として
有効に用いることができる。
【００３１】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００３２】実施例１ ＰＺＰ−４遺伝子のクローニング ＰＺＰ−４のアミノ酸配列全体は、次の４個の遺伝子断
片のクローニングから決定した。 ：ＰＺＰ−４のアミノ酸配列７０〜１１０番目領域遺
伝子断片のクローニング ：ＰＺＰ−４遺伝子の３’側領域のクローニング
（α：ＰＺＰ−４αのアミノ酸配列９４〜１２８番目領
域遺伝子断片のクローニング） ：ＰＺＰ−４遺伝子の３’側領域のクローニング
（β：ＰＺＰ−４βのアミノ酸配列９４〜１２８番目領
域遺伝子断片のクローニング） ：ＰＺＰ−４遺伝子の５’側領域のクローニング（Ｐ
ＺＰ−４のアミノ酸配列５３〜８６番目領域遺伝子断片
のクローニング） ：ＰＺＰ−４のアミノ酸配列１〜６１番目領域遺伝子
断片のクローニング なお、これらの断片の配置及びＰＺＰ−４遺伝子の全塩
基配列を決定するための戦略の概要を図１に示す。
片のクローニングから決定した。 ：ＰＺＰ−４のアミノ酸配列７０〜１１０番目領域遺
伝子断片のクローニング ：ＰＺＰ−４遺伝子の３’側領域のクローニング
（α：ＰＺＰ−４αのアミノ酸配列９４〜１２８番目領
域遺伝子断片のクローニング） ：ＰＺＰ−４遺伝子の３’側領域のクローニング
（β：ＰＺＰ−４βのアミノ酸配列９４〜１２８番目領
域遺伝子断片のクローニング） ：ＰＺＰ−４遺伝子の５’側領域のクローニング（Ｐ
ＺＰ−４のアミノ酸配列５３〜８６番目領域遺伝子断片
のクローニング） ：ＰＺＰ−４のアミノ酸配列１〜６１番目領域遺伝子
断片のクローニング なお、これらの断片の配置及びＰＺＰ−４遺伝子の全塩
基配列を決定するための戦略の概要を図１に示す。
【００３３】遺伝子断片のクローニングは全てＰＣＲ法
を用いて行なった。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬
（GeneAmp DNA 増幅試薬キット、Perkin Elmer Cetus社
より市販）及びＰＣＲ自動化装置（ＤＮＡサーマルサイ
クラー、Perkin Elmer Cetus社より市販）を用いて行な
った。反応条件は、(1) 熱変性ステップ：９４℃、１
分、(2) プライマーのアニーリングステップ：６０℃、
２分、(3) プライマーの伸長ステップ：７２℃、３分の
ステップを１サイクルとして３０サイクル行ない、最後
に７２℃、７分を１回行なって１回のＰＣＲを終了し
た。また、ＤＮＡプライマーは、自動ＤＮＡ合成機（Cy
clone Plus DNA Synthesizer, MilliGen/Biosearch社よ
り市販）を用いて調製した。
を用いて行なった。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬
（GeneAmp DNA 増幅試薬キット、Perkin Elmer Cetus社
より市販）及びＰＣＲ自動化装置（ＤＮＡサーマルサイ
クラー、Perkin Elmer Cetus社より市販）を用いて行な
った。反応条件は、(1) 熱変性ステップ：９４℃、１
分、(2) プライマーのアニーリングステップ：６０℃、
２分、(3) プライマーの伸長ステップ：７２℃、３分の
ステップを１サイクルとして３０サイクル行ない、最後
に７２℃、７分を１回行なって１回のＰＣＲを終了し
た。また、ＤＮＡプライマーは、自動ＤＮＡ合成機（Cy
clone Plus DNA Synthesizer, MilliGen/Biosearch社よ
り市販）を用いて調製した。
【００３４】ＰＣＲ用鋳型ＤＮＡの調製 ブタ卵巣を液体窒素下でブレンダーを用い粉状に破砕
し、これをｍＲＮＡ抽出用キット（FastTrack mRNA単離
キット、Invitrogen社製）の抽出方法に従い、ブタ卵巣
ｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成キ
ットを用いてｃＤＮＡへと変換しＰＣＲの鋳型ＤＮＡと
した。なお、ｃＤＮＡ合成の方法はクローニングした領
域により若干異なる。すなわち、アミノ酸７０〜１１０
番目領域遺伝子断片のクローニングに際しては、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製ｃＤＮＡ合成キット（オリゴｄＴ）を
用い、１本鎖ｃＤＮＡ合成のみを行ない鋳型ＤＮＡ（ｐ
ｉｇｏｖａｒｙ １ｓｔ ｃＤＮＡ）として用いた。Ｐ
ＺＰ−４の３’側領域及び５’側領域遺伝子のクローニ
ングの際は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の合成キット（オリ
ゴｄＴ）及びＰｒｏｍｅｇａ社製の合成キット（オリゴ
ｄＴ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成、その後Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａｃＤＮＡ合成キットのマニュアルに従い、合
成したｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを結
合し、ｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲＩ部位に連結し、
鋳型ＤＮＡ（Ｐｉｇ ｏｖａｒｙ ｃＤＮＡ−ｐＵＣ１
８ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｇ ｏｖａｒｙ ｃＤＮ
Ａ−ｐＵＣ１８ Ｐｒｏｍｅｇａ）として使用した。ア
ミノ酸配列１〜６１領域のクローニングに際しては、
５’−ＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’
（ＰＺＰ−４の７０〜７７アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮ
Ａ配列）をプライマーとしてＡｍｅｒｓｈａｍ社製のｃ
ＤＮＡ合成キットに従い２本鎖ｃＤＮＡを合成し、これ
を鋳型ＤＮＡ（ＰＺＰ４−ｃＤＮＡ）として使用した。
し、これをｍＲＮＡ抽出用キット（FastTrack mRNA単離
キット、Invitrogen社製）の抽出方法に従い、ブタ卵巣
ｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成キ
ットを用いてｃＤＮＡへと変換しＰＣＲの鋳型ＤＮＡと
した。なお、ｃＤＮＡ合成の方法はクローニングした領
域により若干異なる。すなわち、アミノ酸７０〜１１０
番目領域遺伝子断片のクローニングに際しては、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製ｃＤＮＡ合成キット（オリゴｄＴ）を
用い、１本鎖ｃＤＮＡ合成のみを行ない鋳型ＤＮＡ（ｐ
ｉｇｏｖａｒｙ １ｓｔ ｃＤＮＡ）として用いた。Ｐ
ＺＰ−４の３’側領域及び５’側領域遺伝子のクローニ
ングの際は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の合成キット（オリ
ゴｄＴ）及びＰｒｏｍｅｇａ社製の合成キット（オリゴ
ｄＴ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成、その後Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａｃＤＮＡ合成キットのマニュアルに従い、合
成したｃＤＮＡにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを結
合し、ｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲＩ部位に連結し、
鋳型ＤＮＡ（Ｐｉｇ ｏｖａｒｙ ｃＤＮＡ−ｐＵＣ１
８ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｇ ｏｖａｒｙ ｃＤＮ
Ａ−ｐＵＣ１８ Ｐｒｏｍｅｇａ）として使用した。ア
ミノ酸配列１〜６１領域のクローニングに際しては、
５’−ＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＴＣ−３’
（ＰＺＰ−４の７０〜７７アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮ
Ａ配列）をプライマーとしてＡｍｅｒｓｈａｍ社製のｃ
ＤＮＡ合成キットに従い２本鎖ｃＤＮＡを合成し、これ
を鋳型ＤＮＡ（ＰＺＰ４−ｃＤＮＡ）として使用した。
【００３５】アミノ酸配列７０〜１１０番目領域遺伝
子断片のクローニング（図２） ７１〜１１０番目のアミノ酸配列は、特願平３−８２９
０６に記載したように次の配列を有することが判明して
いる。 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Al a-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Al a-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln Ｃ側 このアミノ酸配列を下に次の合成ＤＮＡプライマーを作
製した。 プライマー１：５’−ＡＡＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ ＣＡ［Ｃ，Ｔ］ ＣＡ［Ｃ，Ｔ］ ＣＡ［Ｇ，Ａ］ ＡＴＧ ＡＣ−３’ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ プライマー２：５’−ＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣ［Ｇ、Ａ］ＧＣ［Ｔ、Ｃ 、Ｇ、Ａ］ＣＣＣＡＴ−３’ なお、［ ］内は混合になっていることを示す。プライ
マー１はＰＺＰ−４の７０〜７９アミノ酸配列の（＋）
ＤＮＡ配列であり、プライマー２はＰＺＰ−４の１０３
〜１１０アミノ酸配列の（−）ＤＮＡ配列である。な
お、特願平３−８２９０６号ではＬｙｓ−Ｃ処理を行な
っているのでＡｒｇのＮ側にＬｙｓを加えてプライマー
を作製した。
子断片のクローニング（図２） ７１〜１１０番目のアミノ酸配列は、特願平３−８２９
０６に記載したように次の配列を有することが判明して
いる。 Ｎ側 Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Ile-Asp-Asp-Asn-Al a-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Al a-Glu-Gly-Pro-Asp-Gln Ｃ側 このアミノ酸配列を下に次の合成ＤＮＡプライマーを作
製した。 プライマー１：５’−ＡＡＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ ＣＡ［Ｃ，Ｔ］ ＣＡ［Ｃ，Ｔ］ ＣＡ［Ｇ，Ａ］ ＡＴＧ ＡＣ−３’ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｍｅｔ プライマー２：５’−ＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣ［Ｇ、Ａ］ＧＣ［Ｔ、Ｃ 、Ｇ、Ａ］ＣＣＣＡＴ−３’ なお、［ ］内は混合になっていることを示す。プライ
マー１はＰＺＰ−４の７０〜７９アミノ酸配列の（＋）
ＤＮＡ配列であり、プライマー２はＰＺＰ−４の１０３
〜１１０アミノ酸配列の（−）ＤＮＡ配列である。な
お、特願平３−８２９０６号ではＬｙｓ−Ｃ処理を行な
っているのでＡｒｇのＮ側にＬｙｓを加えてプライマー
を作製した。
【００３６】上記したＰｉｇ ｏｖａｒｙ １ｓｔ ｃ
ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、上記プライマー１及び
プライマー２をプライマーとして用いて上記条件により
ＰＣＲを行なった。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの確認は
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で流し、エチジウ
ムブロマイド溶液でゲルを染色して行った。約１２０ｂ
ｐのＤＮＡをゲルから精製し、これを平滑末端化処理
（ＤＮＡ平滑化キット、宝酒造社製）をしてから、ｐＵ
Ｃ１１９ベクターのＳｍａＩ部位にライゲーション（Ｄ
ＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）した。その
後、コンピテント大腸菌ＪＭ１０９株を常法通りに形質
転換を行った。これを２０μｇ／ｍｌ Ｘｇａｌ、５μ
ｇ／ｍｌ ＩＰＴＧ，１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含んだＬＢプレートに撒いて増えてきた白色のコロニー
を拾い上げて小スケール培養を行った。プラスミドの調
製は、プラスミド調製用キット（QUIAGEN 社製、Ｈｉ
Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ）を用いた。精
製プラスミドは、常法通りの２本鎖ＤＮＡシークエンス
の方法に従い、アルカリ変性処理を行った後ジデオキシ
法のＤＮＡシークエンスキット（SEQUENASE VERSION2.0
7-deaza-dGTP Kit, USB社製）を用いてＤＮＡ配列を決
めた。その結果、下記塩基配列が決定され、これがコー
ドするアミノ酸配列は、上記した７０〜１１０領域のア
ミノ酸配列と一致した。 決定した７０〜１１０アミノ酸領域ＤＮＡ配列（ｐＰＺ４：７０−１１０） ５’−ＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡ ＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧ ＣＴＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧ ＣＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧ−３’
ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、上記プライマー１及び
プライマー２をプライマーとして用いて上記条件により
ＰＣＲを行なった。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの確認は
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で流し、エチジウ
ムブロマイド溶液でゲルを染色して行った。約１２０ｂ
ｐのＤＮＡをゲルから精製し、これを平滑末端化処理
（ＤＮＡ平滑化キット、宝酒造社製）をしてから、ｐＵ
Ｃ１１９ベクターのＳｍａＩ部位にライゲーション（Ｄ
ＮＡライゲーションキット、宝酒造社製）した。その
後、コンピテント大腸菌ＪＭ１０９株を常法通りに形質
転換を行った。これを２０μｇ／ｍｌ Ｘｇａｌ、５μ
ｇ／ｍｌ ＩＰＴＧ，１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含んだＬＢプレートに撒いて増えてきた白色のコロニー
を拾い上げて小スケール培養を行った。プラスミドの調
製は、プラスミド調製用キット（QUIAGEN 社製、Ｈｉ
Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ）を用いた。精
製プラスミドは、常法通りの２本鎖ＤＮＡシークエンス
の方法に従い、アルカリ変性処理を行った後ジデオキシ
法のＤＮＡシークエンスキット（SEQUENASE VERSION2.0
7-deaza-dGTP Kit, USB社製）を用いてＤＮＡ配列を決
めた。その結果、下記塩基配列が決定され、これがコー
ドするアミノ酸配列は、上記した７０〜１１０領域のア
ミノ酸配列と一致した。 決定した７０〜１１０アミノ酸領域ＤＮＡ配列（ｐＰＺ４：７０−１１０） ５’−ＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡ ＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧ ＣＴＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧ ＣＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧ−３’
【００３７】ＰＺＰ−４の３’側領域遺伝子のクロー
ニング（アミノ酸配列９４〜１２８番目領域（ＰＺＰ−
４α）遺伝子断片のクローニング（図３）） 上記のように決定された７１〜１１０番目アミノ酸コー
ド領域のＤＮＡ配列を基に次の３つのプライマーを合成
した。 プライマー３：５’−ＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣ−３ ’ プライマー４：５’−ＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＴ−３ ’ プライマー５：５’−ＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴ Ｔ−３’ なお、プライマー３は７８〜８５アミノ酸配列の（＋）
ＤＮＡ配列、プライマー４は８６〜９３アミノ酸配列の
（＋）ＤＮＡ配列、プライマー５は９４〜１０２アミノ
酸配列の（＋）ＤＮＡ配列である。さらに、ベクターｐ
ＵＣ１８上にあるＭ１３遺伝子の配列をもとに次のプラ
イマーを合成した。 プライマーＭ１３ＲＶ３３：５’−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ ＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’
ニング（アミノ酸配列９４〜１２８番目領域（ＰＺＰ−
４α）遺伝子断片のクローニング（図３）） 上記のように決定された７１〜１１０番目アミノ酸コー
ド領域のＤＮＡ配列を基に次の３つのプライマーを合成
した。 プライマー３：５’−ＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣ−３ ’ プライマー４：５’−ＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＴ−３ ’ プライマー５：５’−ＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴ Ｔ−３’ なお、プライマー３は７８〜８５アミノ酸配列の（＋）
ＤＮＡ配列、プライマー４は８６〜９３アミノ酸配列の
（＋）ＤＮＡ配列、プライマー５は９４〜１０２アミノ
酸配列の（＋）ＤＮＡ配列である。さらに、ベクターｐ
ＵＣ１８上にあるＭ１３遺伝子の配列をもとに次のプラ
イマーを合成した。 プライマーＭ１３ＲＶ３３：５’−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ ＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’
【００３８】ＰＣＲを３回行った。すなわち、１回目の
ＰＣＲは、上記Ｐｉｇ ｏｖａｒｙｃＤＮＡ−ｐＵＣ１
８ Ｐｈａｒｍａｃｉａを鋳型ＤＮＡとして用い、プラ
イマー３及びプライマーＭ１３ＲＶ３３をプライマーと
して用いてＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、１回
目のＰＣＲ産物の一部を鋳型ＤＮＡとして用い、上記プ
ライマー４及びプライマーＭ１３ＲＶ３３をプライマー
として用いて行った。３回目のＰＣＲは、２回目のＰＣ
Ｒ産物の一部を鋳型ＤＮＡとして用い、プライマー５及
びプライマーＭ１３ＲＶ３３とをプライマーとして用い
てＰＣＲを実施した。
ＰＣＲは、上記Ｐｉｇ ｏｖａｒｙｃＤＮＡ−ｐＵＣ１
８ Ｐｈａｒｍａｃｉａを鋳型ＤＮＡとして用い、プラ
イマー３及びプライマーＭ１３ＲＶ３３をプライマーと
して用いてＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、１回
目のＰＣＲ産物の一部を鋳型ＤＮＡとして用い、上記プ
ライマー４及びプライマーＭ１３ＲＶ３３をプライマー
として用いて行った。３回目のＰＣＲは、２回目のＰＣ
Ｒ産物の一部を鋳型ＤＮＡとして用い、プライマー５及
びプライマーＭ１３ＲＶ３３とをプライマーとして用い
てＰＣＲを実施した。
【００３９】以上３回のＰＣＲ産物を同時に５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に流し、増幅されたＤＮＡバ
ンドを検討した。前のＰＣＲの結果と比較してプライマ
ーの長さ分だけＤＮＡの長さが減少しているバンドをゲ
ルから精製した。これをＰＺＰ４：７０−１１０領域の
遺伝子クローニングのところで述べたのと同様にしてク
ローニングし、塩基配列を決定した。このとき用いたク
ローニングベクターはｐＵＣ１９であり、宿主菌は大腸
菌ＪＭ１０９株であった。塩基配列を決定した結果、こ
のクローン（ｐＰＺ４：９４−１２８−α）内に既知の
アミノ酸配列（ＰＺＰ４：９４−１１０）が認められ、
ＰＺＰ４：９４−１２８−α領域の遺伝子配列が決定さ
れた。 決定したＰＺＰ４：９４−１２８領域−α遺伝子断片（ｐＰＺ４：９４−１２８ −α）の塩基配列 ５’−ＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧ ＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴ ＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣ− ３’
クリルアミドゲル電気泳動に流し、増幅されたＤＮＡバ
ンドを検討した。前のＰＣＲの結果と比較してプライマ
ーの長さ分だけＤＮＡの長さが減少しているバンドをゲ
ルから精製した。これをＰＺＰ４：７０−１１０領域の
遺伝子クローニングのところで述べたのと同様にしてク
ローニングし、塩基配列を決定した。このとき用いたク
ローニングベクターはｐＵＣ１９であり、宿主菌は大腸
菌ＪＭ１０９株であった。塩基配列を決定した結果、こ
のクローン（ｐＰＺ４：９４−１２８−α）内に既知の
アミノ酸配列（ＰＺＰ４：９４−１１０）が認められ、
ＰＺＰ４：９４−１２８−α領域の遺伝子配列が決定さ
れた。 決定したＰＺＰ４：９４−１２８領域−α遺伝子断片（ｐＰＺ４：９４−１２８ −α）の塩基配列 ５’−ＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧ ＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴ ＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣ− ３’
【００４０】ＰＺＰ−４の３’側領域遺伝子のクロー
ニング（アミノ酸配列９４〜１２８番目領域（ＰＺＰ−
４β）遺伝子断片のクローニング（図３）） １回目のＰＣＲの鋳型として上記Ｐｉｇ ｏｖａｒｙ
ｃＤＮＡ−ｐＵＣ１８Ｐｒｏｍｅｇａを用い、形質転換
の宿主として大腸菌ＤＨ５αを用い、ベクターとしてｐ
ＵＣ１１を用いたことを除きＰＺＰ−４αのアミノ酸配
列９４〜１２８番目領域遺伝子断片のクローニングと同
様にして塩基配列を決定した。その結果、このクローン
（ｐＰＺ４：９４−１２８−β）内に既知のアミノ酸配
列（ＰＺＰ４ ９４−１１０）が認められ、ＰＺＰ４：
９４−１２８−β領域の遺伝子配列が決定された。 決定したＰＺＰ４：９４−１２８領域−β遺伝子断片（ｐＰＺ４：９４−１２８ −α）の塩基配列 ５’−ＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣ ＴＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴ −３’
ニング（アミノ酸配列９４〜１２８番目領域（ＰＺＰ−
４β）遺伝子断片のクローニング（図３）） １回目のＰＣＲの鋳型として上記Ｐｉｇ ｏｖａｒｙ
ｃＤＮＡ−ｐＵＣ１８Ｐｒｏｍｅｇａを用い、形質転換
の宿主として大腸菌ＤＨ５αを用い、ベクターとしてｐ
ＵＣ１１を用いたことを除きＰＺＰ−４αのアミノ酸配
列９４〜１２８番目領域遺伝子断片のクローニングと同
様にして塩基配列を決定した。その結果、このクローン
（ｐＰＺ４：９４−１２８−β）内に既知のアミノ酸配
列（ＰＺＰ４ ９４−１１０）が認められ、ＰＺＰ４：
９４−１２８−β領域の遺伝子配列が決定された。 決定したＰＺＰ４：９４−１２８領域−β遺伝子断片（ｐＰＺ４：９４−１２８ −α）の塩基配列 ５’−ＣＴＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣ ＴＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴ −３’
【００４１】ＰＺＰ−４の５’側領域遺伝子のクロー
ニング（アミノ酸配列５３〜８６番目領域遺伝子断片の
クローニング（図４）） ＰＺＰ４：７０−１１０領域の遺伝子配列より次のプラ
イマーを合成した。 プライマー６：５’−ＣＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＡＴＡＣＡ Ｔ−３’ プライマー７：５’−ＧＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣ−３ ’ プライマー８：５’−ＡＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＴＣＡ Ｔ−３’ なお、プライマー６はＰＺＰ−４の９５〜１０３番目の
アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮＡ配列であり、プライマー
７はＰＺＰ−４の８７−９４番目のアミノ酸配列の
（−）鎖ＤＮＡ配列であり、プライマー８はＰＺＰ−４
の７８−８６アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮＡ配列であ
る。
ニング（アミノ酸配列５３〜８６番目領域遺伝子断片の
クローニング（図４）） ＰＺＰ４：７０−１１０領域の遺伝子配列より次のプラ
イマーを合成した。 プライマー６：５’−ＣＡＴＡＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＡＴＡＣＡ Ｔ−３’ プライマー７：５’−ＧＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣ−３ ’ プライマー８：５’−ＡＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＴＣＡ Ｔ−３’ なお、プライマー６はＰＺＰ−４の９５〜１０３番目の
アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮＡ配列であり、プライマー
７はＰＺＰ−４の８７−９４番目のアミノ酸配列の
（−）鎖ＤＮＡ配列であり、プライマー８はＰＺＰ−４
の７８−８６アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮＡ配列であ
る。
【００４２】ＰＣＲを３回行った。すなわち、１回目の
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてＰｉｇｏｖａｒｙ ｃＤＮ
Ａ−ｐＵＣ１８（Pharmacia)を用い、プライマーとして
プライマー６及び上記プライマーＭ１３ＲＶ３をプライ
マーとして用いて行った。２回目のＰＣＲは、鋳型ＤＮ
Ａとして１回目のＰＣＲ産物の一部を用い、プライマー
７及びプライマーＭ１３ＲＶ３３とをプライマーとして
用いて行った。３回目のＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとして２
回目のＰＣＲ産物の一部を用い、プライマー８及びプラ
イマーＭ１３ＲＶ３３をプライマーとして用いてＰＣＲ
を行った。
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてＰｉｇｏｖａｒｙ ｃＤＮ
Ａ−ｐＵＣ１８（Pharmacia)を用い、プライマーとして
プライマー６及び上記プライマーＭ１３ＲＶ３をプライ
マーとして用いて行った。２回目のＰＣＲは、鋳型ＤＮ
Ａとして１回目のＰＣＲ産物の一部を用い、プライマー
７及びプライマーＭ１３ＲＶ３３とをプライマーとして
用いて行った。３回目のＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとして２
回目のＰＣＲ産物の一部を用い、プライマー８及びプラ
イマーＭ１３ＲＶ３３をプライマーとして用いてＰＣＲ
を行った。
【００４３】上記３回のＰＣＲ産物を電気泳動に流し、
ＰＺＰ４：９４−１２８領域遺伝子をクローニングした
時と同様、プライマーの長さ分だけ減少しているＤＮＡ
をクローニング（ｐＰＺ４：５３−８６）し、塩基配列
を決定した。このとき形質転換に用いた宿主は大腸菌Ｄ
Ｈ５αであり、ベクターはｐＵＣ１９であった。塩基配
列決定の結果、このクローン（ｐＰＺ４：５３−８６）
内に既知のアミノ酸配列（ＰＺＰ４：７０−８６）が認
められ、ＰＺＰ４：５３−８６領域の遺伝子配列が決定
された。 決定したＰＺＰ４：５３−８６領域遺伝子断片（ｐＰＺ４：５３−８６）の塩基 配列 ５’−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＧＣＧＧＣ ＣＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣ ＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＡＴ ＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡ−３’
ＰＺＰ４：９４−１２８領域遺伝子をクローニングした
時と同様、プライマーの長さ分だけ減少しているＤＮＡ
をクローニング（ｐＰＺ４：５３−８６）し、塩基配列
を決定した。このとき形質転換に用いた宿主は大腸菌Ｄ
Ｈ５αであり、ベクターはｐＵＣ１９であった。塩基配
列決定の結果、このクローン（ｐＰＺ４：５３−８６）
内に既知のアミノ酸配列（ＰＺＰ４：７０−８６）が認
められ、ＰＺＰ４：５３−８６領域の遺伝子配列が決定
された。 決定したＰＺＰ４：５３−８６領域遺伝子断片（ｐＰＺ４：５３−８６）の塩基 配列 ５’−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＧＣＧＧＣ ＣＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣ ＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＡＡＡＧＡＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＡＴ ＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡ−３’
【００４４】アミノ酸配列１〜６１番目領域遺伝子断
片のクローニング（図５） Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌの方法に準じた方法（特願平３−８
２９０６号）によりＰＺＰ−４をブタ卵巣より分離精製
し、アミノ酸シークエンサー（Applied Biosystem 477
A) を使って、そのＮ末端領域のアミノ酸配列（１〜２
１）を決定した。 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-Pro-Gly-Ile-Val-Thr- ( )-His-Glu-Asn-Arg Ｃ側
片のクローニング（図５） Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌの方法に準じた方法（特願平３−８
２９０６号）によりＰＺＰ−４をブタ卵巣より分離精製
し、アミノ酸シークエンサー（Applied Biosystem 477
A) を使って、そのＮ末端領域のアミノ酸配列（１〜２
１）を決定した。 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-Asn-Thr-Ala-Phe-Pro-Gly-Ile-Val-Thr- ( )-His-Glu-Asn-Arg Ｃ側
【００４５】この配列をもとに次の合成ＤＮＡプライマ
ーを作製した。 プライマー１２：５’−ＡＴＣＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡ Ｃ［Ｃ，Ａ］ＧＣ［Ｇ，Ｔ，Ｃ，Ａ］ＴＴ［Ｃ，Ｔ］ＣＣ−３’ このプライマー１２はＰＺＰ−４の１〜１２アミノ酸配
列の（＋）鎖ＤＮＡである。
ーを作製した。 プライマー１２：５’−ＡＴＣＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡ Ｃ［Ｃ，Ａ］ＧＣ［Ｇ，Ｔ，Ｃ，Ａ］ＴＴ［Ｃ，Ｔ］ＣＣ−３’ このプライマー１２はＰＺＰ−４の１〜１２アミノ酸配
列の（＋）鎖ＤＮＡである。
【００４６】また、上記のように決定したＰＺＰ４：５
３−８６領域の遺伝子配列から次の３つの合成プライマ
ーを作製した。 プライマー９：５’−ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＴＣＴＴＴＴ−３ ’ プライマー１０：５’−ＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＧＣＣＴＴ− ３’ プライマー１１：５’−ＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧ− ３’ プライマー９はＰＺＰ−４の７０〜７７アミノ酸配列の
（−）鎖ＤＮＡ配列であり、プライマー１０はＰＺＰ−
４の６２〜６９アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮＡ配列であ
り、プライマー１１はＰＺＰ−４の５４〜６１アミノ酸
配列の（−）鎖ＤＮＡ配列である。
３−８６領域の遺伝子配列から次の３つの合成プライマ
ーを作製した。 プライマー９：５’−ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＣＡＣＴＣＴＴＴＴ−３ ’ プライマー１０：５’−ＧＧＴＡＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＧＣＣＴＴ− ３’ プライマー１１：５’−ＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧ− ３’ プライマー９はＰＺＰ−４の７０〜７７アミノ酸配列の
（−）鎖ＤＮＡ配列であり、プライマー１０はＰＺＰ−
４の６２〜６９アミノ酸配列の（−）鎖ＤＮＡ配列であ
り、プライマー１１はＰＺＰ−４の５４〜６１アミノ酸
配列の（−）鎖ＤＮＡ配列である。
【００４７】３回のＰＣＲを行った。１回目のＰＣＲ
は、ＰＺＰ４−ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、プラ
イマー９及びプライマー１２をプライマーとして用いて
行った。２回目のＰＣＲは１回目のＰＣＲ産物の一部を
鋳型ＤＮＡとして用い、プライマー１０及びプライマー
１２をプライマーとして用いて行った。３回目のＰＣＲ
は、２回目のＰＣＲ産物の一部を鋳型ＤＮＡとして用
い、プライマー１１及びプライマー１２をプライマーと
して用いて行った。
は、ＰＺＰ４−ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、プラ
イマー９及びプライマー１２をプライマーとして用いて
行った。２回目のＰＣＲは１回目のＰＣＲ産物の一部を
鋳型ＤＮＡとして用い、プライマー１０及びプライマー
１２をプライマーとして用いて行った。３回目のＰＣＲ
は、２回目のＰＣＲ産物の一部を鋳型ＤＮＡとして用
い、プライマー１１及びプライマー１２をプライマーと
して用いて行った。
【００４８】上記３回のＰＣＲ産物を電気泳動に流し、
ＰＺＰ４：９４−１２８領域遺伝子をクローニングした
時と同様、プライマーの長さ分だけ減少しているＤＮＡ
をクローニングし、塩基配列を決定した。このとき形質
転換に用いた宿主は大腸菌ＤＨ５αであり、ベクターは
ｐＵＣ１１９であった。塩基配列決定の結果、このクロ
ーン（ｐＰＺ４：１−６１）内に先に決定したアミノ酸
配列（ＰＺＰ４：１−２１）を認めた。 決定したＰＺＰ４：１−６１領域遺伝子断片（ｐＰＺ４：１−６１）の塩基配列 ５’−ＡＴＣＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴ ＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＧＴ ＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＴＡＡＧＡＴＡＣＡ ＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＴ ＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴ ＣＡＣＣ−３’
ＰＺＰ４：９４−１２８領域遺伝子をクローニングした
時と同様、プライマーの長さ分だけ減少しているＤＮＡ
をクローニングし、塩基配列を決定した。このとき形質
転換に用いた宿主は大腸菌ＤＨ５αであり、ベクターは
ｐＵＣ１１９であった。塩基配列決定の結果、このクロ
ーン（ｐＰＺ４：１−６１）内に先に決定したアミノ酸
配列（ＰＺＰ４：１−２１）を認めた。 決定したＰＺＰ４：１−６１領域遺伝子断片（ｐＰＺ４：１−６１）の塩基配列 ５’−ＡＴＣＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＡＧＣＡＴＴＴ ＣＣＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＧＴ ＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＣＴＡＡＧＡＴＡＣＡ ＧＴＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＴ ＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴ ＣＡＣＣ−３’
【００４９】以上クローニングした５つのＰＺＰ−４遺
伝子断片の配列をつなぎ合わせることにより、ＰＺＰ−
４の全遺伝子配列及びそれがコードするアミノ酸配列を
決定した。これらは上記した通りである。
伝子断片の配列をつなぎ合わせることにより、ＰＺＰ−
４の全遺伝子配列及びそれがコードするアミノ酸配列を
決定した。これらは上記した通りである。
【００５０】ＰＺＰ−４α及びＰＺＰ−４βの疎水性、
親水性領域の予想をＨｏｏｐ−Ｗｏｏｄｓの方法を用い
て行なった。ＰＺＰ−４αについての結果を図６に、Ｐ
ＺＰ−４βについての結果を図７に示す。通常、抗原物
質の抗原エピトープは水と非常によく接している親水ア
ミノ酸残基の集まった領域と考えられている。ＰＺＰ−
４の場合、アミノ酸１９番目、２５番目、５６番目、７
０番目、８５番目、９０番目、１１０番目、１２０番目
領域等に親水性領域の存在が予想されるので、同時にこ
れらの領域での抗原エピトープの存在も予想される。
親水性領域の予想をＨｏｏｐ−Ｗｏｏｄｓの方法を用い
て行なった。ＰＺＰ−４αについての結果を図６に、Ｐ
ＺＰ−４βについての結果を図７に示す。通常、抗原物
質の抗原エピトープは水と非常によく接している親水ア
ミノ酸残基の集まった領域と考えられている。ＰＺＰ−
４の場合、アミノ酸１９番目、２５番目、５６番目、７
０番目、８５番目、９０番目、１１０番目、１２０番目
領域等に親水性領域の存在が予想されるので、同時にこ
れらの領域での抗原エピトープの存在も予想される。
【００５１】実施例２ （１）クローニングベクターの構築 図８に示す通り、ＰＺＰ４遺伝子を約６０塩基対から成
るＤＮＡフラグメントに分割し、それぞれをホスホアミ
ダイト法により合成した。合成したフラグメントを逆層
クロマトグラフィーにより精製し、Ｔ４リガーゼによる
酵素反応によりＰＺＰ４遺伝子を得た。
るＤＮＡフラグメントに分割し、それぞれをホスホアミ
ダイト法により合成した。合成したフラグメントを逆層
クロマトグラフィーにより精製し、Ｔ４リガーゼによる
酵素反応によりＰＺＰ４遺伝子を得た。
【００５２】得られた遺伝子は５´及び３´未満はＡが
制限酵素ＥｃｏＲＩ部位及びＳａｌＩ部位を持ち、Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したクローニングベクターｐ
ＵＣ９に挿入した。これを用い大腸菌ＪＭ１０７株を形
質転換し、４０μｇ／ｍｌのアンピシリン、ＩＰＴＧ及
びＸ−ｇａｌ存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補株を
得た。
制限酵素ＥｃｏＲＩ部位及びＳａｌＩ部位を持ち、Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳａｌＩで消化したクローニングベクターｐ
ＵＣ９に挿入した。これを用い大腸菌ＪＭ１０７株を形
質転換し、４０μｇ／ｍｌのアンピシリン、ＩＰＴＧ及
びＸ−ｇａｌ存在下、Ｌ培地にて一晩培養し、候補株を
得た。
【００５３】得られた候補株よりプラスミドを抽出した
後、サンガー法により挿入遺伝子の塩基配列を調べ、設
計した通りの遺伝子配列を持つことを確認した。この目
的とするＰＺＰ４を含むクローニングベクターをもつ菌
をｐＵＣ−ＰＺＰ４／ＪＭ１０７と命名した。
後、サンガー法により挿入遺伝子の塩基配列を調べ、設
計した通りの遺伝子配列を持つことを確認した。この目
的とするＰＺＰ４を含むクローニングベクターをもつ菌
をｐＵＣ−ＰＺＰ４／ＪＭ１０７と命名した。
【００５４】（２）発現ベクターの構築（図９） ｐＵＣ−ＰＺＰ／ＪＭ１０７株より得られたプラスミド
を制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化し、約４２０塩
基対のＰＺＰ４遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化した発現ベクターｐＡＴ−Ｔ
ｒｐＥ−ＴＧＦ−αの大断片とＴ４リガーゼを用いて結
合した。これを用い大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、
４００μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下、Ｌ培地にて一
晩培養し、候補株を得、これをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲ
Ｐ（３１−９８）／ＨＢ１０１株とした。
を制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化し、約４２０塩
基対のＰＺＰ４遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化した発現ベクターｐＡＴ−Ｔ
ｒｐＥ−ＴＧＦ−αの大断片とＴ４リガーゼを用いて結
合した。これを用い大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、
４００μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下、Ｌ培地にて一
晩培養し、候補株を得、これをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲ
Ｐ（３１−９８）／ＨＢ１０１株とした。
【００５５】ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲＰ（３１−９８）
／ＨＢ１０１株より得られたプラスミドを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶ，ＳａｌＩで消化し、約４１０塩基対のＰＺＰ４
遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素ＳｔｕＩ，Ｓａｌ
Ｉで消化した発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）大断片とＴ４リガーゼ
を用いて結合した。これを用い大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換し、４００μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下、Ｌ
培地にて一晩培養し、候補株を得、これをｐＭＡＬ−Ｐ
ＺＰ４／ＨＢ１０１株とした。上記操作を図９に示す。
／ＨＢ１０１株より得られたプラスミドを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶ，ＳａｌＩで消化し、約４１０塩基対のＰＺＰ４
遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素ＳｔｕＩ，Ｓａｌ
Ｉで消化した発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）大断片とＴ４リガーゼ
を用いて結合した。これを用い大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換し、４００μｇ／ｍｌのアンピシリン存在下、Ｌ
培地にて一晩培養し、候補株を得、これをｐＭＡＬ−Ｐ
ＺＰ４／ＨＢ１０１株とした。上記操作を図９に示す。
【００５６】（３）発現蛋白質の精製（図１０、１１） 構築した発現ベクターを含む上記ｐＭＡＬ−ＰＺＰ４／
ＨＢ１０１株について培養を行ない、組換えタンパク質
の発現を調べた。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲＰ（３１−９
８）／ＨＢ１０１を４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む１００ｍｌのＬ培地中で一夜培養した後、２０ｍｌを
２ｇのグルコースを含むＲｉｃｈ培地１リットル（１リ
ットル中、トリプトン１０ｇ、酵素抽出物５ｇ、塩化ナ
トリウム５ｇ）に接種し、３７℃で培養し、６００ｎｍ
における吸光度が０．４になるまで培養したところでＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を
最終濃度０．３ｍＭになるように加え、さらに３時間培
養を継続した後、遠心分離により２ｇの菌体を集めた。
集めた菌体をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（リン酸塩１０
ｍＭ、塩化ナトリウム３０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．
２５％、β−ＭＥ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ １０ｍＭ、ＥＧ
ＴＡ １０ｍＭ）に懸濁し、凍結融解をおこなった後、
超音波処理を行ない菌体を粉砕した。遠心操作により可
溶性画分を集め、アミロース樹脂を担体とするアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーを行なった。用いたカ
ラム緩衝液の組成は、リン酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化
ナトリウム０．５Ｍ、アジド１ｍｌ、β−ＭＥ １０ｍ
Ｍ、ＥＧＴＡ １ｍＭであった。目的物を含む溶出液を
水に透析し、制限プロテアーゼＦａｃｔｏｒＸａ用の緩
衝液（Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ２０ｍＭ、塩化ナトリウム１０
０ｍＭ、塩化カルシウム２ｍＭ、アジド１ｍＭ）によ
り、融合蛋白質であるマルトース結合タンパク質の切断
をおこなった。その後、反応液を逆層ＨＰＬＣにより分
離精製し、目的とするＰＺＰ４蛋白質を得た。ＨＰＬＣ
の条件は、カラムとして東ソー社製のＯＤＳ１２０Ｔカ
ラム（内径７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）を用い、溶離液とし
ては、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ液）と６０％アセトニ
トリル／Ａ液（Ｂ液）のＢ液０％から８０％までの直線
勾配（３０分）を用い、流速は３ｍｌ／分、測定波長は
２２０ｎｍであった。ピークが２つ得られたが、後のピ
ークがＰＺＰ４のピークであった。このものは、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一の物質である
ことを確認した。上記操作を図１０及び図１１に示す。
ＨＢ１０１株について培養を行ない、組換えタンパク質
の発現を調べた。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲＰ（３１−９
８）／ＨＢ１０１を４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む１００ｍｌのＬ培地中で一夜培養した後、２０ｍｌを
２ｇのグルコースを含むＲｉｃｈ培地１リットル（１リ
ットル中、トリプトン１０ｇ、酵素抽出物５ｇ、塩化ナ
トリウム５ｇ）に接種し、３７℃で培養し、６００ｎｍ
における吸光度が０．４になるまで培養したところでＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を
最終濃度０．３ｍＭになるように加え、さらに３時間培
養を継続した後、遠心分離により２ｇの菌体を集めた。
集めた菌体をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（リン酸塩１０
ｍＭ、塩化ナトリウム３０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．
２５％、β−ＭＥ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ １０ｍＭ、ＥＧ
ＴＡ １０ｍＭ）に懸濁し、凍結融解をおこなった後、
超音波処理を行ない菌体を粉砕した。遠心操作により可
溶性画分を集め、アミロース樹脂を担体とするアフィニ
ティーカラムクロマトグラフィーを行なった。用いたカ
ラム緩衝液の組成は、リン酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化
ナトリウム０．５Ｍ、アジド１ｍｌ、β−ＭＥ １０ｍ
Ｍ、ＥＧＴＡ １ｍＭであった。目的物を含む溶出液を
水に透析し、制限プロテアーゼＦａｃｔｏｒＸａ用の緩
衝液（Ｔｒｉｓ・Ｃｌ ２０ｍＭ、塩化ナトリウム１０
０ｍＭ、塩化カルシウム２ｍＭ、アジド１ｍＭ）によ
り、融合蛋白質であるマルトース結合タンパク質の切断
をおこなった。その後、反応液を逆層ＨＰＬＣにより分
離精製し、目的とするＰＺＰ４蛋白質を得た。ＨＰＬＣ
の条件は、カラムとして東ソー社製のＯＤＳ１２０Ｔカ
ラム（内径７．８ｍｍｘ３０ｃｍ）を用い、溶離液とし
ては、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ液）と６０％アセトニ
トリル／Ａ液（Ｂ液）のＢ液０％から８０％までの直線
勾配（３０分）を用い、流速は３ｍｌ／分、測定波長は
２２０ｎｍであった。ピークが２つ得られたが、後のピ
ークがＰＺＰ４のピークであった。このものは、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一の物質である
ことを確認した。上記操作を図１０及び図１１に示す。
【００５７】実施例３ 組み替え型ＰＺＰ４蛋白質の抗原性の確認 実施例２において作製された組み替え型ＰＺＰ４抗原蛋
白質が天然型ＰＺＰ４抗原蛋白質と同様な抗原活性を保
持できているか否かをウェスタンブロット法を用いて検
討した。
白質が天然型ＰＺＰ４抗原蛋白質と同様な抗原活性を保
持できているか否かをウェスタンブロット法を用いて検
討した。
【００５８】組み替え型ＰＺＰ４抗原蛋白質を発現して
いる大腸菌を実施例２で述べたように培養後集菌した。
この一部をLammli法のサンプルバッファー（還元条件）
に可溶化し、１８％のポリアクリルアミドゲルで常法ど
おりＳＤＳ電気泳動を実施。泳動終了後、市販のエレク
トロトランスファー装置を用いて常法どおりにアクリル
アミドゲルより蛋白質をニトロセルロースフィルターに
転写した。転写終了後、このフィルターを２％スキムミ
ルク−ＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．１４
Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）
に浸しブロッキング、ＰＺＰ４以外の蛋白質を発現して
いる同じ大腸菌で大腸菌に対する抗体の吸収処理をし
た、モノクロナール抗体５Ｈ４（平成２年特許願第２５
３０３１号記載のＭｏＡｂ５Ｈ４）および天然型ＰＺＰ
４で作製された抗ＰＺＰ４血清（１０００倍希釈したも
の Ａｎｔｉ−ＰＺＰ４）に浸し４℃で一晩反応させ
た。ネガティブコントロールとして同じＩｇＧで他の抗
原に対するモノクロナール抗体２Ｆ１０（ＭｏＡｂ２Ｆ
１０）と正常マウス血清（ＮＭＳ）を同様に用いた。反
応終了後、フィルターをＴＢＳＴに浸し３回の洗浄操作
後、市販のアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ
抗体と反応させた。反応終了後ＴＢＳＴで３回洗浄後、
通常どおりにＮＢＴ，ＢＣＩＰで発色させた。結果が図
１２、１３である。ＭｏＡｂ５Ｈ４および抗ＰＺＰ４血
清にのみ発色が認められる。この結果は、本発明の配列
が、一般にＰＺＰ４といわれている蛋白質の配列として
正しいということ及び大腸菌で人工的に作らせたこの組
み替え型ＰＺＰ４蛋白質が天然型ＰＺＰ４蛋白質と同様
な抗原活性を持っているということを意味している。
いる大腸菌を実施例２で述べたように培養後集菌した。
この一部をLammli法のサンプルバッファー（還元条件）
に可溶化し、１８％のポリアクリルアミドゲルで常法ど
おりＳＤＳ電気泳動を実施。泳動終了後、市販のエレク
トロトランスファー装置を用いて常法どおりにアクリル
アミドゲルより蛋白質をニトロセルロースフィルターに
転写した。転写終了後、このフィルターを２％スキムミ
ルク−ＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．１４
Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）
に浸しブロッキング、ＰＺＰ４以外の蛋白質を発現して
いる同じ大腸菌で大腸菌に対する抗体の吸収処理をし
た、モノクロナール抗体５Ｈ４（平成２年特許願第２５
３０３１号記載のＭｏＡｂ５Ｈ４）および天然型ＰＺＰ
４で作製された抗ＰＺＰ４血清（１０００倍希釈したも
の Ａｎｔｉ−ＰＺＰ４）に浸し４℃で一晩反応させ
た。ネガティブコントロールとして同じＩｇＧで他の抗
原に対するモノクロナール抗体２Ｆ１０（ＭｏＡｂ２Ｆ
１０）と正常マウス血清（ＮＭＳ）を同様に用いた。反
応終了後、フィルターをＴＢＳＴに浸し３回の洗浄操作
後、市販のアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ
抗体と反応させた。反応終了後ＴＢＳＴで３回洗浄後、
通常どおりにＮＢＴ，ＢＣＩＰで発色させた。結果が図
１２、１３である。ＭｏＡｂ５Ｈ４および抗ＰＺＰ４血
清にのみ発色が認められる。この結果は、本発明の配列
が、一般にＰＺＰ４といわれている蛋白質の配列として
正しいということ及び大腸菌で人工的に作らせたこの組
み替え型ＰＺＰ４蛋白質が天然型ＰＺＰ４蛋白質と同様
な抗原活性を持っているということを意味している。
【００５９】本発明により、避妊ワクチンのワクチン抗
原として、今まで知られていた天然型の卵透明帯だけで
なく今請求のように遺伝子工学的に大腸菌等で作らせた
組み替え型のＰＺＰ４蛋白質も抗原として使うことが出
来るようになった。
原として、今まで知られていた天然型の卵透明帯だけで
なく今請求のように遺伝子工学的に大腸菌等で作らせた
組み替え型のＰＺＰ４蛋白質も抗原として使うことが出
来るようになった。
【００６０】実施例４ 実施例２と同様に図１４及び図１５（図１５は図１４の
配列の続きを示す）に示す配列を有するＤＮＡを作製
し、ＰＺＰ−４αの遺伝子を得た。このＰＺＰ−４αの
遺伝子は、５’、３’末端に制限酵素ＳｔｕＩ、Ｘｂａ
Ｉ部位を持つのでＳｔｕＩ、ＸｂａＩで消化し、同じ制
限酵素で消化した発現ベクターｐＭＡＬ−ｃにＴ４リガ
ーゼを用いて挿入した。これを大腸菌ＪＭ１０９株に形
質転換して、実施例２と同様にしてＰＺＰ−４α発現候
補株を得た。得られた候補株は培養して、実施例３と同
様にしてその発現を確認することができた。
配列の続きを示す）に示す配列を有するＤＮＡを作製
し、ＰＺＰ−４αの遺伝子を得た。このＰＺＰ−４αの
遺伝子は、５’、３’末端に制限酵素ＳｔｕＩ、Ｘｂａ
Ｉ部位を持つのでＳｔｕＩ、ＸｂａＩで消化し、同じ制
限酵素で消化した発現ベクターｐＭＡＬ−ｃにＴ４リガ
ーゼを用いて挿入した。これを大腸菌ＪＭ１０９株に形
質転換して、実施例２と同様にしてＰＺＰ−４α発現候
補株を得た。得られた候補株は培養して、実施例３と同
様にしてその発現を確認することができた。
【００６１】
【発明の効果】本発明により、避妊ワクチンとして有効
なＰＺＰ−４をコードする遺伝子が提供され、その塩基
配列が決定され、さらにＰＺＰ−４の全アミノ酸配列が
決定された。これにより、ＰＺＰ−４を遺伝子工学的に
大量に調製できるようになった。さらに、本発明のＰＺ
Ｐ−４遺伝子はブタ由来であるが、それに対する抗体が
ヒト、イヌ、ネコ等の他の動物の卵子とも交差反応性を
有することから、卵透明帯遺伝子は各種動物においてか
なりの相同性を有しているものと推定される。従って、
本発明により提供されたＰＺＰ−４遺伝子の配列を基
に、これら他種動物の卵透明帯遺伝子をクローニングで
きる可能性が高く、それによって、ブタのＰＺＰ−４ペ
プチドだけでなくてヒト、イヌ、ネコ等の避妊ワクチン
抗原として各動物種にとってより有効な避妊ワクチンを
開発する道も開かれた。また、本発明により、ＰＺＰ−
４の全アミノ酸配列が明らかになったので、避妊ワクチ
ンとして用いることができる種々のペプチドが提供され
た。
なＰＺＰ−４をコードする遺伝子が提供され、その塩基
配列が決定され、さらにＰＺＰ−４の全アミノ酸配列が
決定された。これにより、ＰＺＰ−４を遺伝子工学的に
大量に調製できるようになった。さらに、本発明のＰＺ
Ｐ−４遺伝子はブタ由来であるが、それに対する抗体が
ヒト、イヌ、ネコ等の他の動物の卵子とも交差反応性を
有することから、卵透明帯遺伝子は各種動物においてか
なりの相同性を有しているものと推定される。従って、
本発明により提供されたＰＺＰ−４遺伝子の配列を基
に、これら他種動物の卵透明帯遺伝子をクローニングで
きる可能性が高く、それによって、ブタのＰＺＰ−４ペ
プチドだけでなくてヒト、イヌ、ネコ等の避妊ワクチン
抗原として各動物種にとってより有効な避妊ワクチンを
開発する道も開かれた。また、本発明により、ＰＺＰ−
４の全アミノ酸配列が明らかになったので、避妊ワクチ
ンとして用いることができる種々のペプチドが提供され
た。
【図１】ＰＺＰ−４遺伝子の全塩基配列を決定するため
にクローニングした各断片の配置及びＰＺＰ−４遺伝子
の全塩基配列を決定するための戦略の概要を示す図
にクローニングした各断片の配置及びＰＺＰ−４遺伝子
の全塩基配列を決定するための戦略の概要を示す図
【図２】ＰＺＰ−４のアミノ酸配列７０〜１１０番目領
域遺伝子断片のクローニング方法を示す図
域遺伝子断片のクローニング方法を示す図
【図３】ＰＺＰ−４α及びβのアミノ酸配列９４〜１２
８番目領域遺伝子断片のクローニング方法を示す図
８番目領域遺伝子断片のクローニング方法を示す図
【図４】ＰＺＰ−４のアミノ酸配列５３〜８６番目領域
遺伝子断片のクローニング方法を示す図
遺伝子断片のクローニング方法を示す図
【図５】ＰＺＰ−４のアミノ酸配列１〜６１番目領域遺
伝子断片のクローニング方法を示す図
伝子断片のクローニング方法を示す図
【図６】ＰＺＰ−４αについてのＨｏｏｐ−Ｗｏｏｄｓ
の方法による分析結果を示す図
の方法による分析結果を示す図
【図７】ＰＺＰ−４βについてのＨｏｏｐ−Ｗｏｏｄｓ
の方法による分析結果を示す図
の方法による分析結果を示す図
【図８】大腸菌に発現させた、ＰＺＰ４コードＤＮＡの
配列及びそのアミノ酸配列を示す図
配列及びそのアミノ酸配列を示す図
【図９】実施例における本発明の発現ベクターの構築を
示す図
示す図
【図１０】実施例における形質転換株の培養及びポリペ
プチドの抽出工程を示す図
プチドの抽出工程を示す図
【図１１】実施例におけるポリペプチドの精製工程を示
す図
す図
【図１２】実施例で得られたポリペプチドの抗体との反
応性を示す電気泳動図
応性を示す電気泳動図
【図１３】実施例で得られたポリペプチドの抗体との反
応性を示す電気泳動図
応性を示す電気泳動図
【図１４】大腸菌に発現させた、ＰＺＰ４コードＤＮＡ
の配列及びそのアミノ酸配列を示す図
の配列及びそのアミノ酸配列を示す図
【図１５】図１４に示すＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の
続きを示す図
続きを示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 杉本 正信 埼玉県志木市館２−４−４−301
Claims (8)
- 【請求項１】 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-As
n-Thr-Ala-Phe-Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-
Arg-Met-Val-Val-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu-Gly-Thr-Ly
s-Ile-Gln-Tyr-Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-
Glu-Met-Met-Asn-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-As
n-Leu-Thr-Leu-Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-
Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Il
e-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-
Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pr
o-Asp-Gln-His-Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp-
Phe-Met-Ser-Val-Ser-Glu-Trp-Gly Ｃ側 で示されるアミノ酸配列をコードするＰＺＰ４−α遺伝
子。 - 【請求項２】 Ｎ側 Ile-Gly-Val-Asn-Gln-Leu-Val-As
n-Thr-Ala-Phe-Pro-Gly-Ile-Val-Thr-Cys-His-Glu-Asn-
Arg-Met-Val-Val-Glu-Phe-Pro-Arg-Ile-Leu-Gly-Thr-Ly
s-Ile-Gln-Tyr-Thr-Ser-Val-Val-Asp-Pro-Leu-Gly-Leu-
Glu-Met-Met-Asn-Cys-Thr-Tyr-Val-Leu-Asp-Pro-Glu-As
n-Leu-Thr-Leu-Lys-Ala-Pro-Tyr-Glu-Ala-Cys-Thr-Lys-
Arg-Val-Arg-Gly-His-His-Gln-Met-Thr-Ile-Arg-Leu-Il
e-Asp-Asp-Asn-Ala-Ala-Leu-Arg-Gln-Glu-Ala-Leu-Met-
Tyr-His-Ile-Ser-Cys-Pro-Val-Met-Gly-Ala-Glu-Gly-Pr
o-Asp-Gln-His-Ser-Gly-Ser-Thr-Ile-Cys-Met-Lys-Asp-
Phe-Met-Ser-Phe-Thr-Phe-Asn-Phe Ｃ側 で示されるアミノ酸配列をコードするＰＺＰ４−β遺伝
子。 - 【請求項３】 5'-ATCGGCGTTAATCAACTCGTTAATACAGCATTT
CCAGGTATTGTCACTTGCCATGAAAATAGAATGGTAGTGGAATTTCCAAG
AATTCTTGGCACTAAGATACAGTACACCTCTGTGGTGGACCCTCTTGGTC
TTGAAATGATGAACTGTACTTATGTTCTGGACCCAGAAAACCTCACCCTG
AAGGCCCCATATGAAGCCTGTACCAAAAGAGTGCGTGGCCATCACCAAAT
GACCATCAGACTCATAGATGACAATGCTGCTTTAAGACAAGAGGCTCTCA
TGTATCACATCAGCTGTCCTGTTATGGGAGCAGAAGGCCCTGATCAGCAT
TCGGGATCCACAATCTGCATGAAAGATTTCATGTCTGTAAGTGAATGGGG
C-3' で示される塩基配列を有する請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項４】 5'-ATCGGCGTTAATCAACTCGTTAATACAGCATTT
CCAGGTATTGTCACTTGCCATGAAAATAGAATGGTAGTGGAATTTCCAAG
AATTCTTGGCACTAAGATACAGTACACCTCTGTGGTGGACCCTCTTGGTC
TTGAAATGATGAACTGTACTTATGTTCTGGACCCAGAAAACCTCACCCTG
AAGGCCCCATATGAAGCCTGTACCAAAAGAGTGCGTGGCCATCACCAAAT
GACCATCAGACTCATAGATGACAATGCTGCTTTAAGACAAGAGGCTCTCA
TGTATCACATCAGCTGTCCTGTTATGGGAGCAGAAGGCCCTGATCAGCAT
TCGGGATCCACAATCTGCATGAAAGATTTCATGTCTTTTACCTTTAACTT
T-3' で示される塩基配列を有する請求項２記載の遺伝子。 - 【請求項５】 請求項１又は２に示されるアミノ酸配列
のうち、抗原性を有する任意の領域を有効成分として含
む避妊ワクチン。 - 【請求項６】 請求項１又は２に示されるアミノ酸配列
のうち、抗原性を有する任意の領域をコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項７】 請求項６記載のＤＮＡを発現し得る発現
ベクター。 - 【請求項８】 請求項７記載の発現ベクターで形質転換
された細胞。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4021818A JPH05317050A (ja) | 1992-01-10 | 1992-01-10 | Ｐｚｐ−４遺伝子及び避妊ワクチン |
| EP19920302415 EP0550946A3 (en) | 1992-01-10 | 1992-03-20 | Genes encoding porcine zona pellucida protein pzp-4, expression thereof and contraceptive vaccines comprising expressed (poly)peptides |
| US07/855,411 US5348866A (en) | 1992-01-10 | 1992-03-20 | Genes encoding porcine zona pellucida protein PZP-4, expression thereof and contraceptive vaccines comprising expressed (poly) peptides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4021818A JPH05317050A (ja) | 1992-01-10 | 1992-01-10 | Ｐｚｐ−４遺伝子及び避妊ワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05317050A true JPH05317050A (ja) | 1993-12-03 |
Family
ID=12065643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4021818A Pending JPH05317050A (ja) | 1992-01-10 | 1992-01-10 | Ｐｚｐ−４遺伝子及び避妊ワクチン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5348866A (ja) |
| EP (1) | EP0550946A3 (ja) |
| JP (1) | JPH05317050A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4996297A (en) * | 1987-10-07 | 1991-02-26 | Zonagen, Inc. | Recombinantly expressed rabbit zona pellucida polypeptides |
| WO1994011019A1 (en) * | 1992-11-09 | 1994-05-26 | Zonagen, Inc. | Materials and methods for immunocontraception |
| AU735248B2 (en) * | 1997-07-31 | 2001-07-05 | Landcare Research New Zealand Limited | Marsupial contraceptive vaccine |
| US6455041B1 (en) | 1998-11-17 | 2002-09-24 | Bonita S. Dunbar | Immunogenic epitopes of the human zona pellucida protein (ZP1) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0788396B2 (ja) * | 1986-12-12 | 1995-09-27 | 晋三 礒島 | ブタ卵透明帯抗原 |
| US4996297A (en) * | 1987-10-07 | 1991-02-26 | Zonagen, Inc. | Recombinantly expressed rabbit zona pellucida polypeptides |
| JP2759466B2 (ja) * | 1988-12-09 | 1998-05-28 | 晋三 礒島 | ブタ・ヒト卵透明帯共通抗原に対するモノクローナル抗体及びその作製方法 |
| JPH05500654A (ja) * | 1989-06-12 | 1993-02-12 | アメリカ合衆国 | クローン化透明帯遺伝子を基本とする避妊ワクチン |
-
1992
- 1992-01-10 JP JP4021818A patent/JPH05317050A/ja active Pending
- 1992-03-20 US US07/855,411 patent/US5348866A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-20 EP EP19920302415 patent/EP0550946A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5348866A (en) | 1994-09-20 |
| EP0550946A2 (en) | 1993-07-14 |
| EP0550946A3 (en) | 1993-08-18 |
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