JPH06179698A - ブタ卵透明帯ｐｚｐ−３関連ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３関連ペプ
チドに関する。 【効果】 ＰＺＰ−３関連ペプチドはブタを含む哺乳動
物の避妊又は不妊用のワクチン抗原として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ブタ卵透明帯ＰＺＰ−
３関連ペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の卵透明帯（zona pellucida）
は、卵母細胞を取り囲む細胞外マトリックスであり、通
常、ＺＰ−１、ＺＰ−２、ＺＰ−３、ＺＰ−４等のＺＰ
糖蛋白質から構成されている。これらのＺＰ糖蛋白質
は、卵母細胞の成長初期段階及び卵胞の細胞分化の初期
段階で形成され、子宮壁に着床するまでの間、卵母細胞
及び胎児を保護する役割をもつ。また、精子が卵透明帯
のＺＰ糖蛋白質に付着し、卵透明帯に侵入する受精過程
においても、これらのＺＰ糖蛋白質は重要な機能を有し
ている。特に、ＺＰ−３蛋白質は、受精過程において最
初に精子と結合することが知られている（Wassarman P.
M. “Z0NA PELLUCIDA GLYCOPROTEINS”Am.Rev. Bioche
m. 1988, 57:415-442）。

【０００３】従って、精子が結合し得るＺＰ糖蛋白質を
ブロックすることにより、受精を阻害し、その結果、避
妊又は不妊が可能となる（メルクの特開昭５３−２６３
１１号公報；C. A. Mahi-Brownら (1985) Biol. Repro
d. 32, 761〜772; Sacco A.G.ら (1987) Biol. Repro
d. 36: 481-490; Wood, D. M.ら (1981) Biol. Reprod.
25, 439-450 ）。もし、ＺＰ糖蛋白質を含む卵透明帯
蛋白質をワクチン抗原として雌の哺乳動物に投与する
と、該抗原に対する抗体がｉｎ ｖｉｖｏ生成され、そ
れがブロック剤となって受精、または、卵胞の発育が阻
害される（SkinnerS. M. ら、(1984) Endocrinology 11
5:2418-2432; Mahi-Brown C. A.ら (1985)Biol Reprod
32:761-772; Sacco A. G. ら(1987) Biol Reprod 36:48
1-490 ）。これらの抗原はいわゆる避妊ワクチンとして
知られ、また、このワクチンによる避妊法は、従来の避
妊法であるピル、ＩＵＤ、コンドーム、リズム法、不妊
手術等による方法とは異なり免疫学的避妊法として知ら
れる。

【０００４】避妊ワクチンとしては、例えば、特開昭５
３−２６３１１号公報（メルク）に記載の可溶化透明
帯、 C. A. Mahi-Brown ら（上掲）に記載の天然ブタＺ
Ｐ−３、特表平３−５０２５７１号公報（ゾナゲン）及
び S. E. Millar ら、Science246, 935〜938 （1989）
に記載の組換え透明帯ポリペプチド、合成ペプチドなど
が開示されている。さらにまた、ＺＰ−３蛋白質をコー
ドするＤＮＡとしては、マウス（M. J. RinguetteJら、
Dev. Biol. 127, 287〜295 (1988)）及びヒト（M.E.Ch
amberlinとJ. Dean (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 87, 6014〜6018）由来のものが報告されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ワクチン抗原として可
溶化卵透明帯を直接使用する哺乳動物の避妊法において
は、該抗原を得るために大量の卵巣を必要とする欠点が
あり、また、卵透明帯を精製するうえで他の卵巣組織が
混在し、これが副作用の原因となる可能性を有してい
る。

【０００６】これに対して、遺伝子工学技術又はペプチ
ド合成技術を用いて得られる透明帯ポリペプチドを使用
する避妊法は、該ポリペプチドを高純度で且つ安価に製
造することができる利点をもつ。しかしながら、ブタに
関しては、卵透明帯ＺＰ−３蛋白質の一次構造は不明で
あり、免疫学的避妊法の応用は知られていない。そのた
め、現在手術による去勢を唯一の手段とする避妊法が採
用されている。

【０００７】本発明者らは、先に、ブタ卵透明帯ｃＤＮ
ＡライブラリーからＺＰ−３遺伝子を取得し、これをク
ローニングして、該ＺＰ−３遺伝子の塩基配列及び推定
アミノ酸配列を決定したが（本出願人により平成３年１
１月２９日に出願された特願平３−３４２３１８号）、
これらの配列は完全長ＰＺＰ−３リーディングフレーム
の５０％程度にすぎなかった。このため、完全長のＰＺ
Ｐ−３配列の決定が望まれていた。

【０００８】本発明の目的は、避妊ワクチン抗原として
有用なＰＺＰ−３関連ペプチドを提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】ブタ卵透明帯ＰＺＰ−３
遺伝子のクローニングは、一般的な組換えＤＮＡ技術を
用いて行うことができる。このような技術の中には、細
胞又は組織からの全ＲＮＡの抽出、オリゴ−ｄＴによる
ｍＲＮＡの精製、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、ＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction ）増幅、表現型マーカー
を含むベクター内へのＤＮＡの挿入、コンピテント宿主
細胞の形質転換、コロニーライブラリーからの目的ｃＤ
ＮＡクローンのスクリーニング、陽性ｃＤＮＡクローン
からのベクターＤＮＡの単離、ＤＮＡの配列決定などが
含まれる。

【００１０】具体的なＤＮＡ配列決定手順の例を以下に
示す。

【００１１】ブタ卵巣から得た全ＲＮＡを、例えばＷａ
ｒｄら（J. Virol., 9, 61 (1972)）の方法に従って抽
出する。即ち、凍結、粉砕した卵巣をホモジナイズし、
遠心した後、細胞を溶解し、遠心により核をペレット化
し、全ＲＮＡを含む上清をフェノール／クロロホルム抽
出により精製し、塩化ナトリウムの存在下水相にエタノ
ールを加えて全ＲＮＡを沈殿させる。次に、オリゴーｄ
Ｔセルロースクロマトグラフィーを用いて、全ＲＮＡ調
製物からｍＲＮＡを精製する（Oppermann ら、Virolog
y, 108, 47 (1981) ）。

【００１２】ポリ（Ａ）⁺ ｍＲＮＡに対してランダムプ
ライマー、オリゴ−ｄＴプライマー等を用いて逆転写酵
素により相補鎖ＤＮＡを伸長し、さらにＲＮＡａｓｅ
ＨによりＲＮＡを分離し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用い
て二本鎖ｃＤＮＡを合成する。

【００１３】ｃＤＮＡライブラリーを作るため、得られ
た二本鎖ｃＤＮＡの両末端にリンカーを連結して、λフ
ァージベクターに導入し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏパッ
ケージングを行い、ファージ粒子を得る。このファージ
粒子を大腸菌株に感染させ、寒天培地上に培養して、λ
ファージの溶菌プラークを形成させる。プラークをニト
ロセルロース膜に移動、固定した後、イムノスクリーニ
ング、または、ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼー
ションによりＰＺＰ−３蛋白質をコードするＤＮＡが組
み込まれたファージプラークを同定する。

【００１４】得られたファージＤＮＡを制限酵素消化
し、得られるＤＮＡ断片を同様の制限酵素部位をもつプ
ラスミドにサブクローニングする。

【００１５】得られたＰＺＰ−３蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含むプラスミドを各種の制限酵素により消化し、
各フラグメントをＭ１３ファージベクターにサブクロー
ニングする。

【００１６】得られたファージプラークから一本鎖ＤＮ
Ａを調製し、Ｍ１３ジデオキシ法により各フラグメント
の塩基配列を決定する。

【００１７】この操作段階中λファージベクターに導入
することなく、ＰＺＰ−３蛋白質をコードする遺伝子を
増幅するために、該遺伝子を含むｃＤＮＡをＰＣＲ法
（Saiki, R.K. ら(1985) Science 230, 1350-1354; Le
e, C.C.ら(1988) Science 239,1288-1291; Frohman,
M.A. ら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-
9002 ）に掛けることができる。使用されるプライマー
は、マウス卵透明帯ＭＺＰ−３（M. J. Ringuette ら
（1988） Dev. Biol. 127, 287〜295 ）又はヒト卵透
明帯ＨＺＰ−３（M. E. Chamberlinと J. Dean (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6014〜6018）の公知の
遺伝子配列に基づいて推定され、作製し得る。

【００１８】上述の手順により、完全長ブタ卵透明帯Ｐ
ＺＰ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列が決定された。
このＤＮＡ配列は、配列番号１に示される１３０８ bp
のヌクレオチド配列から成り、そのうちＰＺＰ−３リー
ディングフレームはヌクレオチド番号３３から１２９２
までの１２６０ bp で構成される。このＤＮＡ配列から
推定されるアミノ酸配列も同様に配列番号１に示されて
おり、Ｍｅｔ¹ ………Ｇｌｎ⁴²⁰ の４２０アミノ酸から
構成される。このＤＮＡ配列には、アミノ酸の遺伝暗号
の縮重に基づく対応する全ての塩基を含む全ての可能な
塩基配列が含まれる。前記特願平３−３４２３１８号に
は、配列番号１に示されるヌクレオチド番号３４８〜１
１２１の７７４ bp ヌクレオチド配列が記載されたが、
今回あらたに、この配列の３’及び５’側領域の配列が
決定された。

【００１９】従って、本発明は、配列番号１に示される
アミノ酸配列の全部又は一部を有するブタ卵透明帯ＰＺ
Ｐ−３関連ペプチドを提供する。本発明のペプチドは非
天然由来のものすなわち組換え型又は化学合成型であ
る。

【００２０】本明細書中、「全部又は一部を有する」と
は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の全部又はその
部分配列（すなわち、抗原性を有するペプチド断片配
列）自体からなるペプチド及び少なくともこれらの配列
を含有するペプチドを意味する。また、「組換え型」と
は、遺伝子組換え技術を使用してＰＺＰ−３コーディン
グＤＮＡ配列を適切な組換え宿主中で発現させて得られ
るＰＺＰ−３関連ペプチドを意味し、また、「化学合成
型」とは、一般的なペプチド合成技術を使用して化学的
に合成されたＰＺＰ−３関連ペプチドを意味する。

【００２１】本発明の組換え型ペプチドの製造方法は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の全部若しくは一部
をコードするヌクレオチド配列から成るＤＮＡ又は該ヌ
クレオチド配列を含むＤＮＡを複製可能な適切な発現ベ
クターに組み込む工程、得られた発現ベクターで適切な
宿主を形質転換する工程、得られた形質転換体を適切な
培地中で培養し、前記ＤＮＡを発現させる工程、及び得
られた組換え型ペプチドを回収する工程、を包含する。

【００２２】形質転換体の例は大腸菌株ｐＭＡＬ−ｃ−
ＰＺＰ３₂₅₈ ／ＪＭ１０９である。この場合、この形質
転換菌によって産生される組換え型ペプチドは、配列番
号１に示されるＶａｌ¹⁰⁶ ………Ｌｅｕ³⁶³ のアミノ酸
配列を含むペプチド（組換え型ＰＺＰ３₂₅₈ と称する）
である。このペプチドも本発明の範囲に含まれる。

【００２３】本明細書中「ペプチド」なる用語は、短鎖
及び長鎖ペプチドの両方を意味する。ここで、長鎖ペプ
チドは蛋白質をも包含する。

【００２４】ＰＺＰ−３ＤＮＡを発現させるためのベク
ターは、ファージ又はプラスミドであり、通常、複製部
位と選択マーカー配列を含む。複製部位は、形質転換さ
れる宿主細胞に適合するプロモーター、ターミネータ
ー、複製起点、リボソーム結合部位などの配列を適宜含
み得る。特に、プロモーターとしては、原核生物を宿主
とする場合には常用のｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロ
モーター、バクテリオファージλプロモーター等が、酵
母を宿主とする場合にはアルコールデヒドロゲナーゼや
解糖系酵素類に対するプロモーター等が、動物細胞を宿
主とする場合にはＳＶ４０ウイルスプロモーターのよう
なウイルスプロモーター等が挙げられる。また、選択マ
ーカー配列としては、アンピシリン、テトラサイクリン
耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が常用される。

【００２５】発現すべき外来遺伝子は、プロモーターの
下流に挿入される。

【００２６】宿主細胞は、原核及び真核生物の両方を使
用し得る。原核生物には、大腸菌、枯草菌、放線菌等の
細菌類が含まれ、また、真核生物には、酵母、昆虫細
胞、植物細胞、動物細胞等が含まれる。これらの宿主細
胞は、対象とするペプチドの糖鎖構造の有無に応じて適
宜選択され、一般に、糖鎖を含むペプチドを合成したい
場合には、真核生物が利用される。しかし、その糖鎖構
造は、必要な免疫能が達成される限り、対象とする天然
ペプチドと必ずしも一致していなくてもよい。

【００２７】あるいは、本発明のペプチドは化学的ペプ
チド合成によっても作り得る。ペプチド合成に関して
は、生化学実験講座１タンパク質の化学ＩＶ−化学修飾
とペプチド合成−第 205〜495 頁、1977年（日本生化学
会編）に記載の技術等が適用可能である。

【００２８】本発明方法で得られるＰＺＰ−３関連ペプ
チドは、避妊ワクチン抗原として対象動物（ブタ、ヒ
ト、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット等）に投与したと
きに、ｉｎ ｖｉｖｏで対象動物の卵透明帯ＺＰ−３糖
蛋白質に結合して精子の結合、または、卵胞の発育を阻
止することが可能な該ペプチドに対する抗体を生成する
ものであればよい。従って、このような機能を損わない
範囲で置換、欠失、付加、リン酸化や硫酸化のような修
飾等の改変を前記ペプチドに施してもよい。この改変
は、遺伝子レベル、ペプチドレベルの両方で実施し得
る。

【００２９】本発明のＰＺＰ−３の推定アミノ酸配列
を、M. E. Chamberlinら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 6014-6018) の報告しているヒト卵透明帯ＨＺＰ−
３蛋白質の推定アミノ酸配列と本出願人が出願中のイヌ
卵透明帯ＣＺＰ−３蛋白質の推定アミノ酸配列及びネコ
卵透明帯ＦＺＰ−３蛋白質の推定アミノ酸配列と比較す
ると、その相同性は高く、それぞれ７１．６％、７４．
９％及び７１．８％であることが判明した（図３，４，
５）。また、S. E. Millar（Science 246, 935〜938
；I. J. Eastら(1985) Dev. Biol. 109, 268 ）ら
は、ＭＺＰ−３アミノ酸配列中Ｐｈｅ³³⁶ ………Ａｒｇ
³⁴² の１６アミノ酸から成るペプチドに貝由来の蛋白質
ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin ）を結合したもの
を雌マウスに免疫することによってその雌マウスを不妊
にすることができることを報告しており、従って、本発
明のＰＺＰ−３関連ペプチドも雌ブタに免疫すればマウ
スの場合と同様にブタを避妊又は不妊にすることができ
ると推測される。また、天然のＰＺＰ−３を雌イヌ（C.
A.Mahi-Brownら (1985) Biol. Reprod. 32, 761〜772
）又は雌ザル（Sacco, A.G. ら (1987) Biol. Repro
d., 36, 481-490）に免疫することによってイヌ又はサ
ルが不妊となることが報告されている。このように、哺
乳動物間ではアミノ酸レベルで相同性が高く、従って、
本発明のＰＺＰ−３関連ペプチドは種々の哺乳動物例え
ばヒト及び、、特にネコ、イヌ、ウサギ、モルモット等
のペット類の避妊又は不妊にも使用できると考えられ
る。

【００３０】本発明のＰＺＰ−３関連ペプチドを避妊ワ
クチンとして使用する場合、ワクチンは、精製ペプチド
抗原の他に、通常、必要に応じて水酸化アルミニウム、
リン酸カルシウム、ムラミルジペプチド、Freundの完全
又は不完全アジュバント等のアジュバント、油類及び適
切な希釈剤を含み、溶液、乳濁又は懸濁形態で処方され
得る。低アミノ酸数の抗原ペプチドの場合には、免疫能
を高めるためにＫＬＨのような異種蛋白質を結合しても
よい。

【００３１】また、別の種類のワクチン抗原としては、
ＰＺＰ−３関連ペプチド中のＰＺＰ−３精子結合領域関
連エピトープ、または、卵胞の発育抑制を招くような抗
体を誘導するエピトープに対するポリクローナル又はモ
ノクローナル抗体の抗イディオタイプ抗体が挙げられ
る。これらの抗体は常法に従って調製し得る。

【００３２】

【実施例】本発明を以下の非限定的実施例によりさらに
詳細に説明する。

【００３３】実施例１ ブタ卵透明帯ｃＤＮＡライブラリーの作製 ：ブタ卵巣１
ｇを液体窒素中で凍結した後、ブレンダーを用いて粉末
状に粉砕した。これを、市販のｍＲＮＡ抽出用キット
（FastTrack mRNA ISOLATION KIT, Invitrogen）の指示
された抽出方法に従って、ブタ卵巣ｍＲＮＡを調製し
た。具体的には、凍結粉末状の卵巣１ｇに対しキット中
のＬｙｓｉｓ溶液１０mlを加えＤｏｕｎｃｅ Ｈｏｍｏ
ｇｅｎｉｚｅｒでホモジナイズ（１０−１２ストロー
ク）する。これをさらに１８Ｇの注射筒を通過させた後
４５℃で２時間ゆっくりと振盪させる。インキュベーシ
ョン終了後４０００×ｇ，１０分間遠心し、沈殿をとら
ないように注意して上清を回収する。この上清に０．５
Ｍとなるように５ＭＮａＣｌ溶液を加え、混合後生じた
白沈殿を２１Ｇの注射筒に通して切断する。これに、別
途にキット内のＢｉｎｄｉｎｇ溶液で調製してあるオリ
ゴｄＴセルロース５０mgを加え室温で１時間転倒混和し
て反応させる。反応終了後２０００×ｇ，１０分間遠心
しオリゴｄＴセルロースを回収する。このセルロースペ
レットを再度２０mlのＢｉｎｄｉｎｇ溶液に懸濁させて
洗う。この操作を３回繰り返してオリゴｄＴセルロース
を洗浄する。こうして洗浄の終了したセルロースをキッ
トについているスピンオカラムにつめる。このスピンオ
カラムにつめた段階でさらにＢｉｎｄｉｎｇ溶液で洗
い、スピンカラムを２０００×ｇ，１０秒間遠心し回収
溶液のＯＤ₂₈₀ が０．０５以下になるまで繰り返し洗
う。洗浄終了後Ｂｉｎｄｉｎｇ溶液を遠心除去し、キッ
ト内の溶出溶液０．２mlを加えてセルロースペレットを
十分に懸濁させる。２０００×ｇ，１０秒間遠心し溶出
液を回収する、再びこのセルロースペレットに０．１５
mlの溶出溶液を加え再度懸濁後２０００×ｇ，１分間遠
心して完全に溶出液をセルロースペレットより回収す
る。この２回の溶出操作で０．３５mlの回収液が得られ
る。これにキットについている２Ｍ酢酸ナトリウム溶液
を０．１５容加え、さらに１００％エタノールを２．５
容追加して混合後、−７０℃に凍るまで放置する。凍結
後１６０００×ｇ，１５分間遠心しｍＲＮＡを回収す
る。冷７０％エタノールで２回ｍＲＮＡペレットを洗
浄、真空エバポレーターで乾燥させた後、適当量の滅菌
水に溶解する。一部を適当に希釈してＯＤ_320-230 間の
スキャンニングを行ないＯＤ₂₆₀ の吸光度値よりｍＲＮ
Ａ量を算出する。こうして１ｇの卵巣より７．７μｇの
ｍＲＮＡを精製した。取り扱う試薬、器具等はすべてＲ
Ｎａｓｅによる分解を防ぐための処理を施しておいた。

【００３４】次に、得られたｍＲＮＡを、Gubler & Hof
fman法に基づいた市販のｃＤＮＡ合成キット（Promega
Oligo-dT）を用いて、メーカーの指示に従ってｃＤＮＡ
に変換し、ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。具体的には、
ｍＲＮＡ１μｇをｄＴプライマー０．５μｇと混合後７
０℃、５分間インキュベートし、その後室温に戻しこれ
にキットのファーストストランド合成試薬（ファースト
ストランドバッファー，ジチオスレイトール溶液，デオ
キシヌクレオシド三リン酸混液，リボヌクレアーゼイン
ヒビター溶液，ピロリン酸ナトリウム溶液，ＡＭＶ逆転
写酵素）を加え、４２℃，１時間反応した。次にキット
のセカンドストランド合成試薬（セカンドストランドバ
ッファー，ジチオスレイトール，ＮＡＤ溶液，ＤＮＡポ
リメラーゼＩ，ＲＮａｓｅＨ，リガーゼ）を追加して１
４℃，２時間反応させた。反応終了後、７０℃，１０分
間の加温処理をした後、氷冷しさらにこれにＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼＩを加え３７℃，１０分間反応させ、０．
２Ｍ ＥＤＴＡで反応を終了させた。こうして作製した
ｃＤＮＡを次のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用する。

【００３５】得られた鋳型ＤＮＡを増幅するために、市
販のＰＣＲキット試薬（GeneAmp DNA Amplification Re
agent Kit, Perkin Elmer Cetus ）及びＰＣＲ自動化装
置（DNA Thermal Cycler, Perkin Elmer Cetus）を用い
て、メーカーの指示に従ってＰＣＲ反応を実施した。反
応条件は次のとおりである。１）熱変性ステップ：９４
℃，１分間、２）プライマーのアニーリングステップ：
６０℃，２分間、３）プライマーの伸長ステップ：７２
℃，３分間から成る３つのステップを１サイクルとして
合計３０サイクル行った後、７２℃，７分間のプライマ
ーの伸長ステップを１回行って１ラウンドのＰＣＲを終
了した。

【００３６】このとき使用したプライマーは、マウス卵
透明帯由来ＭＺＰ−３（M. J. Chamberlinら(1988) De
v. Biol. 127, 287〜295 ）及びヒト卵透明帯由来Ｈ
ＺＰ−３（M. E. ChamberlinとJ. Dean (1990) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 87, 6014〜6018）の遺伝子配列か
ら推定した、

【００３７】

【表１】 プライマー１： ５’ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴ３’ プライマー２： ５’ＡＧＧＡＡ［Ｇ，Ｔ］ＡＴＣＡＧ［Ｇ，Ｔ］ＧＧＣＣＣ［Ｃ，Ｔ］ＡＣ ［Ｇ，Ａ］ＧＴＧＡＣＡＴＣ［Ｔ，Ａ］ＧＣＴＴＣ３’ （但し、［］はミックスを表わす。）である。

【００３８】増幅生成物を、０．８％アガロースゲル電
気泳動に掛け、エチジウムブロマイド染色により約８０
０ｂｐ程度のＤＮＡが増幅されているのを確認した。こ
のＤＮＡをゲルから市販のＤＮＡ抽出キット（GENECLEA
N II, BIO101）を用いて、メーカーの指示に従って精製
し、市販のベクターへサブクローニングを行なった。

【００３９】ＰＺＰ−３₂₅₈ ｃＤＮＡの配列決定 得られたｃＤＮＡを DNA Blunting Kit （TAKARA）を用
いて、メーカーの指示に従って平滑末端化し、ＤＮＡラ
イゲーションキット（TAKARA）を用いてｐＵＣ１１９ベ
クターのＳｍａＩ部位に連結した。その後、コンピテン
トセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに常法に従って形質転換
した。形質転換株を、２０μｇ／mlのＸｇａｌ，１００
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレートに播いて
増えてきた白色のコロニーを拾い上げた後、培養培地
（アンピシリン−ＬＢ培地）中で小スケール培養を行っ
た。

【００４０】市販のプラスミド調製用キット（QIAGEN H
i Purity Plasmid Kit, QIAGEN）を用いて、メーカーの
指示に従ってプラスミドを回収し、常用の二本鎖ＤＮＡ
シークエンス法に従ってアルカリ変性処理を行った後、
ジデオキシ鎖終止法のＤＮＡシークエンスキット（SEQU
ENSE VERSION 2.07-deaza-dGTP Kit, USB ）を用いてＰ
ＺＰ−３ ｃＤＮＡの塩基配列及び推定アミノ酸配列を
決定した。決定されたこれらの配列はともに、配列表中
配列番号１に示した。得られたＰＺＰ−３遺伝子は、２
５８アミノ酸をコードする７７４ bp のヌクレオチド配
列（ヌクレオチド番号３４８〜１１２１；ＰＺＰ３₂₅₈
遺伝子）から成る（本出願人による平成３年１１月２９
日出願の特願平３−３４２３１８号）。

【００４１】ブタ卵透明帯−３（ＰＺＰ−３）全遺伝子
配列の決定 さらにＰＺＰ−３のクローニングを進めることによって
全ＰＺＰ−３の遺伝子配列およびアミノ酸配列を明らか
にした。

【００４２】（１）３’側領域のクローニング 次の４個のプライマーとブタ卵巣ｃＤＮＡを用いてＰＺ
Ｐ−３の残り３’側遺伝子をクローニングし配列を決定
した。

【００４３】ＰＺＰ３₂₅₈ の配列より次のプライマー
３，４，５を、又ｍＲＮＡのポリＡ配列よりプライマー
６を自動ＤＮＡ合成機を用いて作製した。

【００４４】

【表２】 プライマー３：５’ＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＡＴＧＣＣＧ３’ プライマー４：５’ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＣＣ ^EcoRI ＣＧＣ３’ プライマー５：５’ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＣＡ ^EcoRI ＧＡＴ３’ プライマー６：５’ＡＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’ ^SalI 上述の方法で抽出したｍＲＮＡは、マウス卵巣ｃＤＮＡ
合成のときと同様にＰｈａｒｍａｃｉａ ｃＤＮＡ合成
キットを用い、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡ
へと変換した。このブタ卵巣ｃＤＮＡを鋳型に使いＰＣ
Ｒを実施した。ＰＣＲは GeneAmp DNA Amplification R
eagent Kit（Perkin Elmer Cetus）およびDNA Thermal
Cycler（Perkin Elmer Cetus）を用いた。

【００４５】

【表３】１回目のＰＣＲ−プライマー：３および６； 鋳型ＤＮＡ：ブタ卵巣ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ２回目のＰＣＲ−プライマー：４および６； 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ３回目のＰＣＲ−プライマー：５および６； 鋳型ＤＮＡ：２回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回。

【００４６】３回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロース
ゲルにて電気泳動を行ない増幅されたＤＮＡバンドをエ
チジウムブロマイド染色で確認する。その結果３回目の
ＰＣＲ産物に３００ bp 程度のバンドが検出された。こ
の３回目のＰＣＲ産物をエタノール沈澱後、ＥｃｏＲ
Ｉ，ＳａｌＩ消化した後低融点アガロースゲルにて電気
泳動を行ない、ゲルより目的の３００ bp のＤＮＡをＧ
ＥＮＥＣＬＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）を用いて精製
した。この精製したＤＮＡをあらかじめ同じＥｃｏＲ
Ｉ，ＳａｌＩで消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライ
ゲーションキット（宝酒造）をもちいて連結させた。大
腸菌ＪＭ１０９に形質転換を行なった後、アンピシリン
含有ＬＢプレートに播き、生えてきた形質転換株を拾い
上げる。これを５ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地で培養
しプラスミドを精製（ＱＩＡＧＥＮＨｉ Ｐｕｒｉｔｙ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ）した。精製したプラスミド
はその一部をＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消化して目的サイズ
のＤＮＡが組み込まれていることを確認した後、残りを
遺伝子配列決定のため通常の２本鎖シークエンスに用い
た。シークエンスはプラスミドをアルカリ処理後ジデオ
キシ終止鎖法のＤＮＡシークエンスキット（ＳＥＱＵＥ
ＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯＮ ２．０７−ｄｅａｚａ−ｄ
ＧＴＰ Ｋｉｔ，ＵＳＢ）を用いて決定した。その結果
以下の配列が決定された。

【００４７】

【表４】 ５’ＡＧＴＣＧＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＴＣＡ ＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＧＡＧＴＧ ＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＧＧＡＡＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴ ＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＡ ＣＣＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＣＡＴＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＧ ＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡ ＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＴＧ３’ （下線部は、配列番号１に示されるヌクレオチド１１２
２〜１２９２に相当する。） （２）５’側領域のクローニング ＰＺＰ３の５’側領域はＰＺＰ３₂₅₈ の配列をもとにし
てｃＤＮＡを作製し、これを鋳型としてＰＣＲを行ない
クローニングした（Michael A. Frohman, Michael K. D
ush, and Gail R. Martin (1988) Proc. Natl. Acad. S
ci USA 85, 8998-9002. Osamu Ohara, Robert L. Dori
t, and Walter Gilbert (1989) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86, 5673-5677) 。

【００４８】ＰＺＰ３₂₅₈ の配列より次の３個のプライ
マーを合成した。

【００４９】

【表５】 プライマー７：５’ＣＣＴＧＧＧＧＴＡＧＴＧＡＣＡＣＴＣＧＡＴ３’ プライマー８：５’ＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＧＴＣＣＴ３’ プライマー９：５’ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣ ^EcoRI ＴＧＣＡ３’ プライマー７をもとにしてブタ卵巣ｍＲＮＡより一本鎖
ｃＤＮＡを作製した。１本鎖ｃＤＮＡの合成は RiboClo
ne cDNA Systhesis System (Promega)を使用した。具体
的には、０．５μｇのブタ卵巣ｍＲＮＡに０．５μｇの
プライマー７を加え７０℃で５分間保温後室温にゆっく
りと戻す。つづいて10×first strand buffer, 100mM D
DT, 10mM dNTP mix, RNasin ribonuclease inhibitor,
40mM Napyrophosphate, reverse transcriptaseを加え
て４２℃で１時間保温して１本鎖ｃＤＮＡを合成する。
反応終了後１回フェノール／クロロホルム抽出を行ない
その上清をＴＥ（10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA ）で
あらかじめ平衡化してあるスパンカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）にかける。回収液はエタ沈メイト（ニッポンジ
ーン）とともにエタノール沈澱させる。次に合成した１
本鎖ｃＤＮＡの３’側にポリＡを付加する反応を行なっ
た。具体的には、沈澱させた１本鎖ｃＤＮＡを乾燥後、
水に溶解し９４℃２分処理後氷上で急冷し、これにｄＡ
ＴＰと５×tailing Buffer, terminal deoxynucleotidy
l-transferase （Bethesda ResearchLaboratories）を
加えて３７℃で１０分間，６５℃、１５分間反応させ
る。これにＴＥを加えて希釈してＰＣＲの鋳型ＤＮＡ
（５’ＣＺＰ３−ｃＤＮＡ）とした。

【００５０】

【表６】 １回目ＰＣＲ−プライマー：８および６； 鋳型ＤＮＡ：５’ＰＺＰ３ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分 ２回目ＰＣＲ−プライマー：９および６； 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分 ２回目のＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲルにて電
気泳動を行なった。エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色した。その結果５００ bp 程度のＤＮＡバンドが検出
された。この５００ bp のＤＮＡをｐＵＣ１８のＥｃｏ
ＲＩ，ＳａｌＩにサブクローニングするために、ＰＣＲ
産物からクロロホルムでミネラルオイルを取り除き、エ
タノール沈澱させた。沈澱は乾燥後水に溶解した後Ｅｃ
ｏＲＩ，ＳａｌＩ消化した。反応終了後２％低融点アガ
ロース電気泳動で分離し目的の５００ bp のバンドを切
り出しＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）を用
いてゲルより抽出した。これをあらかじめＥｃｏＲＩ，
ＳａｌＩで消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲー
ションキット（宝酒造）を用いて連結させた。これを大
腸菌ＪＭ１０９に形質転換させ、アンピシリン含有ＬＢ
プレートに播き、生えてきたコロニーは拾い上げて５ｍ
ｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ＱＵＩＡＧＥ
Ｎ，Ｈｉ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを用
いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドはその
一部をＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消化して目的サイズのＤＮ
Ａが組み込まれていることを確認した後、残りは通常の
２本鎖シークエンスに用いた。シークエンスはプラスミ
ドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシーク
エンスキット（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯＮ
２．０７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ Ｋｉｔ， ＵＳＢ）
を用いて決定した。その結果以下の配列が決定された。

【００５１】

【表７】 ５’ＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＣＣＡＴ ＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴ ＣＴＧＧＧＧＡＧＧＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣＡＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＧＴ ＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＡ ＧＣＣＡＣＣＣＡＣＣＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＡ ＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＧＧＴＡＣ ＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧ ＣＣＣＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＣ ＧＧＡＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡ ＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴ ＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＴ ＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣ３’ （下線部は、配列番号１に示されるヌクレオチド３３〜
３４７に相当する。）以上、特願平３−３４２３１８号
に記載のＰＺＰ３₂₅₈ 配列と今回あらたに決定したＰＺ
Ｐ−３の３’側および５’側領域の２つの配列から以下
の配列表の配列番号１に示されるブタ卵透明帯−３（Ｐ
ＺＰ−３）の全塩基配列（１３０８ bp ）、全アミノ酸
配列（４２０個）が明らかとなった。

【００５２】実施例２ 発現ベクターの構築 市販の発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ（New England Biolab
s ，これは目的とする蛋白質をマルトース結合蛋白質と
の融合型で発現させるベクターである。）のＥｃｏＲＩ
サイト、ＳａｌＩサイトにＰＺＰ３₂₅₈ 遺伝子（配列番
号１に示されるヌクレオチド番号３４８から１１２１ま
での配列を有する）を挿入して発現ベクターを構築す
る。そのために、ＰＺＰ３₂₅₈ 遺伝子の５’側にＥｃｏ
ＲＩサイトを３’側には停止コドン（ＴＡＡ）とＳａｌ
Ｉサイトを次のように作製した（図１）。

【００５３】自動ＤＮＡ合成機を用いてＥｃｏＲＩサイ
トおよび停止コドン，ＳａｌＩサイトを持つ次の２個の
プライマーを合成した。

【００５４】

【表８】 _EcoRI プライマー１：５’ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣ３’ プライマー２：５’ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＴＧＧ ^{SalI Stop} ３’ このプライマーと先のＰＺＰ３₂₅₈ 遺伝子のシークエン
スに用いたプラスミドを鋳型ＤＮＡとして GeneAmp DNA
Amplification Reagent Kit（Perkin Elmer Cetus）お
よびDNA Thermal Cycler（Perkin Elmer Cetus）を用い
てＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction ）を実施した。
反応条件は、９４℃−３０秒，５５℃−１分，７２℃−
２分を１サイクルとし、これを４０サイクル実施後７２
℃−７分を１回追加する。反応終了後、等量のクロロホ
ルムを加えてミネラルオイルを反応溶液より除去し、こ
れに１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）
と３倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡをエタノール
沈澱させた。沈澱ＤＮＡは乾燥後、適量の水に溶解させ
たＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで完全に消化させた。これ
を低融点アガロースゲル電気泳動に流し８００ bp 程度
のＤＮＡを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出はＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）を用いた。この
ＤＮＡを先にＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化して同様にア
ガロースゲルより精製してあるｐＭＡＬ−ｃベクターの
大断片にライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結
させ、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換させた。これを、ア
ンピシリン含有ＬＢプレートに播き、生えてきたコロニ
ーを２ｍｌ培養しＱＩＡＧＥＮＨｉ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でプラスミドを
精製した。精製したプラスミドはＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ
消化して目的のＰＺＰ３₂₅₈ 断片が組み込まれているこ
とを確認した。得られた形質転換株はｐＭＡＬ−ｃ−Ｐ
ＺＰ３₂₅₈ ／ＪＭ１０９と命名する。

【００５５】組換え型ＰＺＰ３₂₅₈ 蛋白質の発現確認 組換え型ＰＺＰ３258 蛋白質の発現確認は抗ＰＺＰ３血
清を使ったウェスタンブロット法で行なった。

【００５６】構築した発現ベクターを含む上記ｐＭＡＬ
−ｃ−ＰＺＰ３₂₅₈ ／ＪＭ１０９株を２mlＬＢ−アンピ
シリン培地で培養し吸光度が６００ｎｍ＝０．４となっ
たところでＩＰＴＧ（isopyropyl−β−Ｄ−thiogalact
oside ）を終濃度０．３ｍＭになるように加え、さらに
３時間培養をつづけた後遠心分離により菌体を集めた。
この菌体を少量の水に懸濁後その一部をＬａｅｍｍｌｉ
法のサンプルバッファー（還元条件）に可溶化しポリア
クリルアミドゲルにて常法どおりにＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を実施した。泳動終了後、市販の
エレクトロトランスファー装置を使って蛋白質をポリア
クリルアミドゲルよりニトロセルロースフィルターに転
写した。このフィルターを２％スキムミルク−ＴＢＳＴ
（10mM Tris-HClpH7.5, 0.14M NaCl, 0.1% Tween20）に
浸しブロッキング後、５００倍希釈した抗ＰＺＰ３血清
（天然のブタ卵透明帯−３画分をマウスに免疫しウェス
タンブロットによってブタ卵透明帯−３画分と特異的に
反応することが確認されている血清。大腸菌に対する抗
体は吸収処理で取り除いてあるもの）と４℃で一晩反応
させた。ネガティブコントロールとして正常マウス血清
を同様に用いる。反応終了後ＴＢＳＴで３回洗浄した
後、１０００倍希釈した市販のアルカリホスファターゼ
標識抗マウスＩｇ（Ｇ，Ｍ，Ａ）抗体と反応させた。反
応終了後ＴＢＳＴで３回洗浄、通常どおりＮＢＴ（nitr
o blue tetrazolium），ＢＣＩＰ（bromochloroindoly
phosphate ）で発色した。図２に示すとおり抗ＰＺＰ３
血清とは反応するが正常血清とは反応しない発色が認め
られた。これより組換え型ＰＺＰ３258 蛋白質の発現が
確認された。

【００５７】ＰＺＰ３遺伝子の配列に基づいて遺伝子工
学的にＰＺＰ３蛋白を作製することは可能であり、その
作製された組換え型ＰＺＰ３蛋白質も天然のＰＺＰ３蛋
白質と同様に抗原性を有していることが明らかとなっ
た。これより、人工的に合成したＰＺＰ３蛋白質が天然
のＰＺＰ３蛋白質と同様に避妊ワクチンの抗原として有
望であることが示唆される。

【００５８】

【発明の効果】本発明のブタ卵透明帯ＰＺＰ−３関連ペ
プチドは、ブタ避妊又は不妊用のワクチン抗原として有
用である。また、他の哺乳動物の卵透明帯ＺＰ−３蛋白
質と相同なアミノ酸配列を該ワクチン抗原として用いる
場合には、ブタ以外の哺乳動物の避妊又は不妊も可能と
なろう。

【００５９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３０８ bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起 源： 生物名：ブタ 組織の種類：卵巣 配列： ccactaggga ggggagtggc cttgtgagtg cc atg gcg ccg agc tgg agg ttc 53 Met Ala Pro Ser Trp Arg Phe 1 5 ttc gtc tgc ttt ctg ctc tgg gga ggt aca gag cta tgc agc ccg cag 101 Phe Val Cys Phe Leu Leu Trp Gly Gly Thr Glu Leu Cys Ser Pro Gln 10 15 20 ccc gtc tgg cag gac gaa ggc cag cgc ttg agg ccc tca aag cca ccc 149 Pro Val Trp Gln Asp Glu Gly Gln Arg Leu Arg Pro Ser Lys Pro Pro 25 30 35 acc gta atg gtg gag tgt cag gag gcc cag ctg gtg gtc att gtc agc 197 Thr Val Met Val Glu Cys Gln Glu Ala Gln Leu Val Val Ile Val Ser 40 45 50 55 aaa gac ctt ttc ggt acc ggg aag ctc atc agg cct gca gat ctc agc 245 Lys Asp Leu Phe Gly Thr Gly Lys Leu Ile Arg Pro Ala Asp Leu Ser 60 65 70 ctg ggc cct gca aag tgt gag ccg ctg gtc tct cag gac acg gac gca 293 Leu Gly Pro Ala Lys Cys Glu Pro Leu Val Ser Gln Asp Thr Asp Ala 75 80 85 gtg gtc agg ttt gag gtt ggg ctg cac gag tgt ggc agc ttg cag gtg 341 Val Val Arg Phe Glu Val Gly Leu His Glu Cys Gly Ser Leu Gln Val 90 95 100 act gat gta gct ctg gtg tac agc acc ttc ctg cgc cat gac ccc cgc 389 Thr Asp Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe Leu Arg His Asp Pro Arg 105 110 115 cct gca gga aac ctg tcc atc ctg agg acg aac cgt gcg gag gtc ccc 437 Pro Ala Gly Asn Leu Ser Ile Leu Arg Thr Asn Arg Ala Glu Val Pro 120 125 130 135 atc gag tgt cac tac ccc agg cag ggc aac gtg agc agc tgg gcc atc 485 Ile Glu Cys His Tyr Pro Arg Gln Gly Asn Val Ser Ser Trp Ala Ile 140 145 150 ctg ccc acc tgg gtg ccc ttc agg acc act ggt gtc tcc gag gag aag 533 Leu Pro Thr Trp Val Pro Phe Arg Thr Thr Gly Val Ser Glu Glu Lys 155 160 165 ctg gtg ttc tct ctg cgc ctg atg gag gaa aac tgg agc gcc gag aag 581 Leu Val Phe Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu Asn Trp Ser Ala Glu Lys 170 175 180 atg acg ccc acc ttc cag ctg gcg gac aga gcc cac ctc cag gcc caa 629 Met Thr Pro Thr Phe Gln Leu Ala Asp Arg Ala His Leu Gln Ala Gln 185 190 195 gtc cac acc ggc agc cac gtg cca ctg agg ctg ttt gtg gac cac tgt 677 Val His Thr Gly Ser His Val Pro Leu Arg Leu Phe Val Asp His Cys 200 205 210 215 gtg gcc acg ctg acg ccg gac tgg aac acc tcc ccc tct cac acc atc 725 Val Ala Thr Leu Thr Pro Asp Trp Asn Thr Ser Pro Ser His Thr Ile 220 225 230 gtg gac ttc cac ggc tgt ctc gtg gac ggt ctc act gag gcc tca tct 773 Val Asp Phe His Gly Cys Leu Val Asp Gly Leu Thr Glu Ala Ser Ser 235 240 245 gct ttc aaa gca cct aga cct gga cca gag acg ctc cag ttc acc gtg 821 Ala Phe Lys Ala Pro Arg Pro Gly Pro Glu Thr Leu Gln Phe Thr Val 250 255 260 gat gtg ttc cat ttt gct aat gat tcc aga aac acg atc tac atc acc 869 Asp Val Phe His Phe Ala Asn Asp Ser Arg Asn Thr Ile Tyr Ile Thr 265 270 275 tgc cat ctg aag gtc act ccg gct gac cga gtc ccg gac caa ctc aac 917 Cys His Leu Lys Val Thr Pro Ala Asp Arg Val Pro Asp Gln Leu Asn 280 285 290 295 aaa gcc tgt tcc ttc agc aag tcc tcc aac agg tgg tcc ccg gtg gaa 965 Lys Ala Cys Ser Phe Ser Lys Ser Ser Asn Arg Trp Ser Pro Val Glu 300 305 310 ggg cct gct gtt atc tgt cgt tgc tgt cac aag ggg cag tgt ggt acc 1013 Gly Pro Ala Val Ile Cys Arg Cys Cys His Lys Gly Gln Cys Gly Thr 315 320 325 cca agc ctt tcc agg aag ctg tct atg ccg aag aga cag tct gct ccc 1061 Pro Ser Leu Ser Arg Lys Leu Ser Met Pro Lys Arg Gln Ser Ala Pro 330 335 340 cgc agt cgc agg cac gtg aca gat gaa gca gat gtc aca gtg ggg cct 1109 Arg Ser Arg Arg His Val Thr Asp Glu Ala Asp Val Thr Val Gly Pro 345 350 355 ctg atc ttc ctg ggc aag acg agt gac cac ggt gtg gaa ggg tcc acc 1157 Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr Ser Asp His Gly Val Glu Gly Ser Thr 360 365 370 375 tcc tcc ccc acc tcg gtg atg gtg ggc ttg ggc ctg gcc acc gtg gtg 1205 Ser Ser Pro Thr Ser Val Met Val Gly Leu Gly Leu Ala Thr Val Val 380 385 390 acc ttg act ctg gct acc att gtc ctg ggt gtc gcc agg agg cgt cgg 1253 Thr Leu Thr Leu Ala Thr Ile Val Leu Gly Val Ala Arg Arg Arg Arg 395 400 405 gct gct gcc cac ctt gtg tgc ccc gtg tct gct tcc caa taaaagaaga 1302 Ala Ala Ala His Leu Val Cys Pro Val Ser Ala Ser Gln 410 415 420 aacatg 1308

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、発現用ブタ卵透明帯ＰＺＰ３₂₅₈ 遺
伝子配列をアミノ酸配列と共に示す。

【図２】この図は、組換え型ＰＺＰ３₂₅₈ 抗原の発現を
確認したウェスタンブロット写真である。レーン１は分
子量マーカー、レーン２と６はｐＭＡＬ−ｃ−ＭＺＰ３
_107-368 ／ＪＭ１０９、レーン３と７はｐＭＡＬ−ｃ−
ＰＺＰ３₂₅₈ ／ＪＭ１０９−＃４、レーン４と８はｐＭ
ＡＬ−ｃ−ＰＺＰ３₂₅₈ ／ＪＭ１０９−＃１０、レーン
５と９はｐＭＡＬ−ｃ／ＪＭ１０９である。

【図３】この図は、遺伝子工学手法により決定されたブ
タ及びヒト卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列の比較
を示す。

【図４】この図は、遺伝子工学手法により決定されたブ
タ及びイヌ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列の比較
を示す。

【図５】この図は、遺伝子工学手法により決定されたブ
タ及びネコ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列の比較
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列の全
   部又は一部を有するブタ卵透明帯ＰＺＰ−３関連ペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸番号１０
   ６〜３６３のアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプ
   チド。