JPH05336974A - イヌ卵透明帯ｃｚｐ−３をコードするｄｎａ、該ｄｎａによってコードされるｃｚｐ−３関連ペプチド、および該ペプチド含有避妊ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 イヌ卵透明帯ＣＺＰ−３蛋白質アミノ酸配列
をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを発現させて得られる
ＣＺＰ−３関連組換えペプチドの製造方法、該ＤＮＡに
よってコードされるＣＺＰ−３関連ペプチド、このペプ
チドを含有するイヌ避妊ワクチン、及び該ワクチンによ
るイヌの避妊方法。 【効果】 ＣＺＰ−３関連ペプチドはイヌ避妊又は不妊
用のワクチン抗原として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イヌ卵透明帯ＣＺＰ−
３蛋白質アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、このＤＮＡ
の発現によるＣＺＰ−３組換えペプチドの製造方法に関
する。本発明はまた、該ＤＮＡによってコード化される
ＣＺＰ−３関連ペプチドに関する。本発明はさらに、該
ペプチドを含有するイヌの避妊ワクチン及び該ワクチン
によるイヌの避妊方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の卵透明帯（zona pellucida）
は、卵母細胞を取り囲む細胞外マトリックスであり、通
常、ＺＰ−１、ＺＰ−２、ＺＰ−３、ＺＰ−４等のＺＰ
糖蛋白質から構成されている。これらのＺＰ糖蛋白質
は、卵母細胞の成長初期段階及び卵胞の細胞分化の初期
段階で形成され、子宮壁に着床するまでの間、卵母細胞
及び胎児を保護する役割をもつ。また、精子が卵透明帯
のＺＰ糖蛋白質に付着し、卵透明帯に侵入する受精過程
においても、これらのＺＰ糖蛋白質は重要な機能を有し
ている。特に、ＺＰ−３蛋白質は、受精過程において最
初に精子と結合することが知られている（Wassarman P.
M. “Z0NA PELLUCIDA GLYCOPROTEINS”Am.Rev. Bioche
m. 1988, 57:415-442）。

【０００３】従って、精子が結合し得るＺＰ糖蛋白質を
ブロックすることにより、受精を阻害し、その結果、避
妊又は不妊が可能となる（メルクの特開昭５３−２６３
１１号公報）。もし、ＺＰ糖蛋白質を含む卵透明帯蛋白
質をワクチン抗原として雌の哺乳動物に投与すると、該
抗原に対する抗体がｉｎ ｖｉｖｏ生成され、それがブ
ロック剤となって受精、または、卵胞の発育が阻害され
る（Skinner S. M. ら、(1984) Endocrinology 115:241
8-2432; Mahi-Brown C. A.ら(1985) Biol Reprod 32:76
1-772; Sacco A. G.ら(1987) Biol Reprod 36:481-490
）。これらの抗原はいわゆる避妊ワクチンとして知ら
れ、また、このワクチンによる避妊法は、従来の避妊法
であるピル、ＩＵＤ、コンドーム、リズム法、不妊手術
等による方法とは異なり免疫学的避妊法として知られ
る。

【０００４】避妊ワクチンとしては、例えば、特開昭５
３−２６３１１号公報（メルク）に記載の可溶化透明
帯、特表平３−５０２５７１号公報（ゾナゲン）及び
S. E. Millar ら、Science 246, 935〜938 （1989）
に記載の組換え透明帯ポリペプチド、合成ペプチドなど
が開示されている。さらにまた、ＺＰ−３蛋白質をコー
ドするＤＮＡとしては、マウス（M. J. RinguetteJら、
Dev. Biol. 127, 287〜295 (1988)）及びヒト（M.E.Ch
amberlinとJ. Dean (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 87, 6014〜6018）由来のものが報告されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ワクチン抗原として可
溶化卵透明帯を直接使用する哺乳動物の避妊法において
は、該抗原を得るために大量の卵巣を必要とする欠点が
あり、また、卵透明帯を精製するうえで他の卵巣組織が
混在し、これが副作用の原因となる可能性を有してい
る。

【０００６】これに対して、遺伝子工学技術を用いて得
られる組換え透明帯ポリペプチドを使用する避妊法は、
該ポリペプチドを高純度で且つ安価に製造することがで
きる利点をもつ。しかしながら、イヌに関しては、卵透
明帯ＺＰ蛋白質の一次構造は不明であり、免疫学的避妊
法のイヌへの応用は知られていない。そのため、現在手
術による去勢を唯一の手段とする避妊法が採用されてい
る。

【０００７】本発明者らは、イヌ卵透明帯ｃＤＮＡライ
ブラリーからＺＰ−３遺伝子を取得し、これをクローニ
ングして、該ＺＰ−３遺伝子の塩基配列及び推定アミノ
酸配列を決定した。

【０００８】従って、本発明の目的は、イヌ卵透明帯Ｃ
ＺＰ−３蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡを提供
することである。

【０００９】本発明の目的はまた、該ＤＮＡを適当な発
現系で発現させて、ＣＺＰ−３関連組換えペプチドを製
造する方法を提供することである。

【００１０】本発明の別の目的は、該ＤＮＡによってコ
ードされるＣＺＰ−３関連ペプチドを提供することであ
る。

【００１１】本発明のさらに別の目的は、該ペプチドを
含有するイヌの避妊ワクチン、及び該ワクチンによるイ
ヌの避妊方法を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１で
表わされる、イヌ卵透明帯ＣＺＰ−３蛋白質のアミノ酸
配列の全部又は一部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
を提供する。

【００１３】イヌ卵透明帯ＣＺＰ−３遺伝子のクローニ
ングは、一般的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うことが
できる。このような技術の中には、細胞又は組織からの
全ＲＮＡの抽出、オリゴ−ｄｔによるｍＲＮＡの精製、
ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、ＰＣＲ（Polymerase Cha
in Reaction ）増幅、表現型マーカーを含むベクター内
へのＤＮＡの挿入、コンピテント宿主細胞の形質転換、
コロニーライブラリーからの目的ｃＤＮＡクローンのス
クリーニング、陽性ｃＤＮＡクローンからのベクターＤ
ＮＡの単離、ＤＮＡの配列決定などが含まれる。

【００１４】具体的なＤＮＡ配列決定手順の例を以下に
示す。

【００１５】イヌ卵巣から得た全ＲＮＡを、例えばＷａ
ｒｄら（J. Virol., 9, 61 (1972)）の方法に従って抽
出する。即ち、凍結、粉砕した卵巣をホモジナイズし、
遠心した後、細胞を溶解し、遠心により核をペレット化
し、全ＲＮＡを含む上清をフェノール／クロロホルム抽
出により精製し、塩化ナトリウムの存在下水相にエタノ
ールを加えて全ＲＮＡを沈殿させる。次に、オリゴーｄ
Ｔセルロースクロマトグラフィーを用いて、全ＲＮＡ調
製物からｍＲＮＡを精製する（Oppermann ら、Virolog
y, 108, 47 (1981) ）。

【００１６】ポリ（Ａ）⁺ ｍＲＮＡに対してランダムプ
ライマー、オリゴ−ｄＴプライマー等を用いて逆転写酵
素により相補鎖ＤＮＡを伸長し、さらにＲＮＡａｓｅ
ＨによりＲＮＡを分離し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用い
て二本鎖ｃＤＮＡを合成する。

【００１７】ｃＤＮＡライブラリーを作るため、得られ
た二本鎖ｃＤＮＡの両末端にリンカーを連結して、λフ
ァージベクターに導入し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏパッ
ケージングを行い、ファージ粒子を得る。このファージ
粒子を大腸菌株に感染させ、寒天培地上に培養して、λ
ファージの溶菌プラークを形成させる。プラークをニト
ロセルロース膜に移動、固定した後、イムノスクリーニ
ング、または、ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼー
ションによりＣＺＰ−３蛋白質をコードするＤＮＡが組
み込まれたファージプラークを同定する。

【００１８】得られたファージＤＮＡを制限酵素消化
し、得られるＤＮＡ断片を同様の制限酵素部位をもつプ
ラスミドにサブクローニングする。

【００１９】得られたＣＺＰ−３蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含むプラスミドを各種の制限酵素により消化し、
各フラグメントをＭ１３ファージベクターにサブクロー
ニングする。

【００２０】得られたファージプラークから一本鎖ＤＮ
Ａを調製し、Ｍ１３ジデオキシ法により各フラグメント
の塩基配列を決定する。

【００２１】この操作段階中λファージベクターに導入
することなく、ＣＺＰ−３蛋白質をコードする遺伝子を
増幅するために、該遺伝子を含むｃＤＮＡをＰＣＲ法
（Saiki, R.K. ら(1985) Science 230, 1350-1354; Le
e, C.C.ら(1988) Science 239,1288-1291; Frohman,
M.A. ら(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-
9002 ）に掛けることができる。使用されるプライマー
は、マウス卵透明帯ＭＺＰ−３（M. J. Ringuette ら
（1988） Dev. Biol. 127, 287〜295 ）又はヒト卵透
明帯ＨＺＰ−３（M. E. Chamberlinと J. Dean (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6014〜6018）の公知の
遺伝子配列に基づいて推定され、作製し得る。上述の手
順により、全長イヌ卵透明帯ＣＺＰ−３蛋白質をコード
するＤＮＡ配列が決定された。このＤＮＡ配列は、配列
番号１に示される１３２２ bp のヌクレオチド配列から
成り、そのうちＣＺＰ−３リーディングフレームはヌク
レオチド番号３２から１３０９までの１２７８ bp で構
成される。このＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列
も同様に配列番号１に示されており、Ｍｅｔ¹ ………Ｇ
ｌｎ⁴²⁶ の４２６アミノ酸から構成される。

【００２２】本発明のＤＮＡの具体例は、配列番号１に
示されるヌクレオチド番号３２〜１３０９の塩基配列の
全部又は一部（例えば、ヌクレオチド３４７〜１１３
５）から成るＤＮＡである。その他の例として、配列番
号１の配列中、アミノ酸の遺伝暗号の縮重に基づく対応
する全ての塩基を含む全ての可能なヌクレオチド配列が
挙げられる。これらのヌクレオチドも、本発明の一部を
構成するものである。

【００２３】図１に、本発明のイヌ卵透明帯ＣＺＰ−３
関連ペプチドの推定アミノ酸配列を、M. J. Ringuette
ら（Dev. Biol. 127, 287〜295 ）の報告したマウス卵
透明帯ＭＺＰ−３蛋白質の推定アミノ酸配列と比較して
示しているが、両アミノ酸配列の相同性は６４．８％で
あった。

【００２４】本発明はまた、配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列の全部又は一部を有するイヌ卵透明帯ＣＺＰ−
３関連ペプチドを提供する。本発明のペプチドは非天然
由来のもの即ち組換え型又は化学合成型である。

【００２５】本明細書中、「全部又は一部を有する」と
は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の全部又はその
部分配列（すなわち、抗原性を有するペプチド断片配
列）自体からなるペプチド及び少なくともこれらの配列
を含有するペプチドを意味する。また、「組換え型」と
は、遺伝子組換え技術を使用してＣＺＰ−３コーディン
グＤＮＡ配列を適切な組換え宿主中で発現させて得られ
るＣＺＰ−３関連ペプチドを指し、また、「化学合成
型」とは、一般的なペプチド合成技術を使用して化学的
に合成されたＣＺＰ−３関連ペプチドを指す。

【００２６】本発明の組換え型ペプチドの製造方法は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の全部若しくは一部
をコードするヌクレオチド配列から成るＤＮＡ又は該ヌ
クレオチド配列を含むＤＮＡを複製可能な適切な発現ベ
クターに組み込む工程、得られた発現ベクターで適切な
宿主を形質転換する工程、得られた形質転換体を適切な
培地中で培養し、前記ＤＮＡを発現させる工程、及び得
られた組換え型ペプチドを回収する工程、を包含する。

【００２７】上記方法も本発明の範囲内である。

【００２８】本発明の実施態様により、形質転換体の例
としては大腸菌株ｐＭＡＬ−ｃ−ＣＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１
０９があり、この形質転換菌によって産生される組換え
ペプチドは、配列番号１に示されるＡｓｎ¹⁰⁶ ………Ｌ
ｅｕ³⁶⁸ のアミノ酸配列を含むペプチド（組換え型ＣＺ
Ｐ３₂₆₃ と称する）である。

【００２９】本明細書中「ペプチド」なる用語は、短鎖
及び長鎖ペプチドの両方を意味する。ここで、長鎖ペプ
チドは蛋白質をも包含する。

【００３０】本発明のＤＮＡを発現させるためのベクタ
ーは、ファージ又はプラスミドであり、通常、複製部位
と選択マーカー配列を含む。複製部位は、形質転換され
る宿主細胞に適合するプロモーター、ターミネーター、
複製起点、リボソーム結合部位などの配列を適宜含み得
る。特に、プロモーターとしては、原核生物を宿主とす
る場合には常用のｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモー
ター、バクテリオファージλプロモーター等が、酵母を
宿主とする場合にはアルコールデヒドロゲナーゼや解糖
系酵素類に対するプロモーター等が、動物細胞を宿主と
する場合にはＳＶ４０ウイルスプロモーターのようなウ
イルスプロモーター等が挙げられる。また、選択マーカ
ー配列としては、アンピシリン、テトラサイクリン耐性
遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が常用される。

【００３１】発現すべき外来遺伝子は、プロモーターの
下流に挿入される。

【００３２】宿主細胞は、原核及び真核生物の両方を使
用し得る。原核生物には、大腸菌、枯草菌、放線菌等の
細菌類が含まれ、また、真核生物には、酵母、昆虫細
胞、植物細胞、動物細胞等が含まれる。これらの宿主細
胞は、対象とするペプチドの糖鎖構造の有無に応じて適
宜選択され、一般に、糖鎖を含むペプチドを合成したい
場合には、真核生物が利用される。しかし、その糖鎖構
造は、必要な免疫能が達成される限り、対象とする天然
ペプチドと必ずしも一致していなくてもよい。

【００３３】あるいは、本発明のペプチドは化学的ペプ
チド合成によっても作り得る。ペプチド合成に関して
は、生化学実験講座１タンパク質の化学ＩＶ−化学修飾
とペプチド合成−第 205〜495 頁、1977年（日本生化学
会編）に記載の技術等が適用可能である。

【００３４】本発明方法で得られるＣＺＰ−３関連ペプ
チドは、避妊ワクチン抗原として雌イヌに投与したとき
に、ｉｎ ｖｉｖｏでイヌ卵透明帯ＣＺＰ−３糖蛋白質
に結合して精子の結合、または、卵胞の発育を阻止する
ことが可能な該ペプチドに対する抗体を生成するもので
あればよい。従って、このような機能を損わない範囲で
置換、欠失、付加、リン酸化や硫酸化のような修飾等の
改変を前記ペプチドに施してもよい。この改変は、遺伝
子レベル、ペプチドレベルの両方で実施し得る。

【００３５】ＣＺＰ−３関連ペプチドは、前述したよう
に、マウス由来のＭＺＰ−３と高い相同性をもつことが
判明している。マウスについて、S. E. Millar（Scienc
e 246, 935〜938 ；I. J. Eastら（1985）Dev. Biol.
109, 268 ）らは、ＭＺＰ−３アミノ酸配列中（図３）
Ｐｈｅ³³⁶ ………Ａｒｇ³⁴² の１６アミノ酸から成るペ
プチドに貝由来の蛋白質ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemoc
yanin ）を結合したものを雌マウスに免疫することによ
ってその雌マウスを不妊することができることを報告し
ている。本発明者らは、本発明の組換えペプチドの避妊
ワクチン抗原としての有効性の確認のために、シュミレ
ーションとしてＭＺＰ−３抗原によるマウスの避妊実験
を利用する方法を取った。具体的には、免疫抗原として
組換え型ＣＺＰ３₂₆₃ に対応する組換え型ＭＺＰ３
_107-369 （図１のマウスＺＰ３配列Ａｓｐ¹⁰⁷ ………Ｌ
ｅｕ³⁶⁹ を含有する発現ペプチド）を遺伝子工学的に作
製し、得られたＭＺＰ３_107-369 蛋白質を雌マウスに免
疫し、避妊の有効性を調査した。S.E.Millarらと同様
に、免疫感作されたマウスでは、非常に有効な避妊結果
が得られることが判明した（図６）。この結果は、イヌ
においても対応するイヌのＺＰ３抗原（ＣＺＰ３）をワ
クチン抗原として用いれば、イヌにおいても同様な避妊
のコントロールが可能なことを示している。

【００３６】従って、本発明はさらに、本発明に係る前
記定義の組換えペプチドを有効量含有するイヌの避妊ワ
クチンを提供する。

【００３７】ワクチンは、精製組換えペプチドの他に、
通常、必要に応じて水酸化アルミニウム、リン酸カルシ
ウム、ムラミルジペプチド、Freundの完全又は不完全ア
ジュバント等のアジュバント、油類及び適切な希釈剤を
含み、溶液、乳濁又は懸濁形態で処方され得る。低アミ
ノ酸数の抗原ペプチドの場合には、免疫能を高めるため
にＫＬＨのような異種蛋白質を結合してもよい。

【００３８】また、別の種類のワクチン抗原としては、
ＣＺＰ−３組換えペプチド中のＣＺＰ−３精子結合領域
関連エピトープ、または、卵胞の発育抑制を招くような
抗体を誘導するエピトープに対するポリクローナル又は
モノクローナル抗体の抗イディオタイプ抗体が挙げられ
る。これらの抗体は常法に従って調製し得る。

【００３９】本発明はまた、前記ワクチンを雌イヌに投
与し免疫感作することを包含するイヌの避妊方法を提供
する。

【００４０】投与量、投与方法等のワクチン接種条件は
特に限定されないが、好適には、投与量は、注射による
場合、数ｍｇ〜数十ｍｇＣＺＰ３抗原／イヌであり、ま
た投与経路は、非経口投与、特に皮下、皮内、腹腔内又
は筋肉内注射が好ましい。免疫レジメンとしては、一般
に妊娠能力のある雌イヌに有効量のＣＺＰ３抗原を含む
ワクチンを接種後、約２週間置きに数回免疫する方法が
とられる。このとき、初回免疫感作の場合には、通常、
ワクチン調製物中にフロインド完全アジュバント等のア
ジュバントを含有させるのがよい。

【００４１】

【実施例】本発明を以下の非限定的実施例によりさらに
詳細に説明する。

【００４２】実施例１ イヌ卵透明帯ｃＤＮＡライブラリーの作製 ：イヌ卵巣１
ｇを液体窒素中で凍結した後、ブレンダーを用いて粉末
状に粉砕した。これを、市販のｍＲＮＡ抽出用キット
（FastTrack mRNA ISOLATION KIT, Invitrogen）の指示
された抽出方法に従って、イヌ卵巣ｍＲＮＡを調製し
た。具体的には、凍結粉末状の卵巣１ｇに対しキット中
のＬｙｓｉｓ溶液１０mlを加えＤｏｕｎｃｅ Ｈｏｍｏ
ｇｅｎｉｚｅｒでホモジナイズ（１０−１２ストロー
ク）する。これをさらに１８Ｇの注射筒を通過させた後
４５℃で２時間ゆっくりと振盪させる。インキュベーシ
ョン終了後４０００×ｇ，１０分間遠心し、沈殿をとら
ないように注意して上清を回収する。この上清に０．５
Ｍとなるように５ＭＮａＣｌ溶液を加え、混合後生じた
白沈殿を２１Ｇの注射筒に通して切断する。これに、別
途にキット内のＢｉｎｄｉｎｇ溶液で調製してあるオリ
ゴｄＴセルロース５０mgを加え室温で１時間転倒混和し
て反応させる。反応終了後２０００×ｇ，１０分間遠心
しオリゴｄＴセルロースを回収する。このセルロースペ
レットを再度２０mlのＢｉｎｄｉｎｇ溶液に懸濁させて
洗う。この操作を３回繰り返してオリゴｄＴセルロース
を洗浄する。こうして洗浄の終了したセルロースをキッ
トについているスピンカラムにつめる。このスピンカラ
ムにつめた段階でさらにＢｉｎｄｉｎｇ溶液で洗い、ス
ピンカラムを２０００×ｇ，１０秒間遠心し回収溶液の
ＯＤ₂₈₀ が０．０５以下になるまで繰り返し洗う。洗浄
終了後Ｂｉｎｄｉｎｇ溶液を遠心除去し、キット内の溶
出溶液０．２mlを加えてセルロースペレットを十分に懸
濁させる。２０００×ｇ，１０秒間遠心し溶出液を回収
する、再びこのセルロースペレットに０．１５mlの溶出
溶液を加え再度懸濁後２０００×ｇ，１分間遠心して完
全に溶出液をセルロースペレットより回収する。この２
回の溶出操作で０．３５mlの回収液が得られる。これに
キットについている２Ｍ酢酸ナトリウム溶液を０．１５
容加え、さらに１００％エタノールを２．５容追加して
混合後、−７０℃に凍るまで放置する。凍結後１６００
０×ｇ，１５分間遠心しｍＲＮＡを回収する。冷７０％
エタノールで２回ｍＲＮＡペレットを洗浄、真空エバポ
レーターで乾燥させた後、適当量の滅菌水に溶解する。
一部を適当に希釈してＯＤ_320-230 間のスキャンニング
を行ないＯＤ₂₆₀ の吸光度値よりｍＲＮＡ量を算出す
る。こうして１ｇの卵巣より７．７μｇのｍＲＮＡを精
製した。取り扱う試薬、器具等はすべてＲＮａｓｅによ
る分解を防ぐための処理を施しておいた。

【００４３】次に、得られたｍＲＮＡを、Gubler & Hof
fman法に基づいた市販のｃＤＮＡ合成キット（Promega
Oligo-dT）を用いて、メーカーの指示に従ってｃＤＮＡ
に変換し、ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。具体的には、
ｍＲＮＡ１μｇをオリゴｄＴプライマー０．５μｇと混
合後７０℃、５分間インキュベートし、その後室温に戻
しこれにキットのファーストストランド合成試薬（ファ
ーストストランドバッファー，ジチオスレイトール溶
液，デオキシヌクレオシド三リン酸混液，リボヌクレア
ーゼインヒビター溶液，ピロリン酸ナトリウム溶液，Ａ
ＭＶ逆転写酵素）を加え、４２℃，１時間反応した。次
にキットのセカンドストランド合成試薬（セカンドスト
ランドバッファー，ジチオスレイトール，ＮＡＤ溶液，
ＤＮＡポリメラーゼＩ，ＲＮａｓｅＨ，リガーゼ）を追
加して１４℃，２時間反応させた。反応終了後、７０
℃，１０分間の加温処理をした後、氷冷しさらにこれに
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼＩを加え３７℃，１０分間反応
させ、０．２Ｍ ＥＤＴＡで反応を終了させた。こうし
て作製したｃＤＮＡを次のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使
用する。

【００４４】得られた鋳型ＤＮＡを増幅するために、市
販のＰＣＲキット試薬（GeneAmp DNA Amplification Re
agent Kit, Perkin Elmer Cetus ）及びＰＣＲ自動化装
置（DNA Thermal Cycler, Perkin Elmer Cetus）を用い
て、メーカーの指示に従ってＰＣＲ反応を実施した。反
応条件は次のとおりである。１）熱変性ステップ：９４
℃，１分間、２）プライマーのアニーリングステップ：
６０℃，２分間、３）プライマーの伸長ステップ：７２
℃，３分間から成る３つのステップを１サイクルとして
合計３０サイクル行った後、７２℃，７分間のプライマ
ーの伸長ステップを１回行って１ラウンドのＰＣＲを終
了した。

【００４５】このとき使用したプライマーは、マウス卵
透明帯由来ＭＺＰ−３（M. J. Chamberlinら(1988) De
v. Biol. 127, 287〜295 ）及びヒト卵透明帯由来Ｈ
ＺＰ−３（M. E. ChamberlinとJ. Dean (1990) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 87, 6014〜6018）の遺伝子配列か
ら推定した、

【００４６】

【表１】 プライマー１： ５’ＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴ３’ プライマー２： ５’ＡＧＧＡＡ［Ｇ，Ｔ］ＡＴＣＡＧ［Ｇ，Ｔ］ＧＧＣＣＣ［Ｃ，Ｔ］ＡＣ ［Ｇ，Ａ］ＧＴＧＡＣＡＴＣ［Ｔ，Ａ］ＧＣＴＴＣ３’ （但し、［］はミックスを表わす。） である。

【００４７】増幅生成物を、０．８％アガロースゲル電
気泳動に掛け、エチジウムブロマイド染色により約８０
０ｂｐ程度のＤＮＡが増幅されているのを確認した。こ
のＤＮＡをゲルから市販のＤＮＡ抽出キット（GENECLEA
N II, BIO101）を用いて、メーカーの指示に従って精製
し、市販のベクターへサブクローニングを行なった。

【００４８】ＣＺＰ−３₂₆₃ ｃＤＮＡの配列決定 得られたｃＤＮＡを DNA Blunting Kit （TAKARA）を用
いて、メーカーの指示に従って平滑末端化し、ＤＮＡラ
イゲーションキット（TAKARA）を用いてｐＵＣ１１９ベ
クターのＳｍａＩ部位に連結した。その後、コンピテン
トセルＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに常法に従って形質転換
した。形質転換株を、２０μｇ／mlのＸｇａｌ，１００
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ−プレートに播いて
増えてきた白色のコロニーを拾い上げた後、培養培地
（アンピシリン−ＬＢ培地）中で小スケール培養を行っ
た。

【００４９】市販のプラスミド調製用キット（QIAGEN H
i Purity Plasmid Kit, QIAGEN）を用いて、メーカーの
指示に従ってプラスミドを回収し、常用の二本鎖ＤＮＡ
シークエンス法に従ってアルカリ変性処理を行った後、
ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシークエンスキット（SEQU
ENSE VERSION 2.07-deaza-dGTP Kit, USB ）を用いてＣ
ＺＰ−３₂₆₃ ｃＤＮＡの塩基配列及び推定アミノ酸配列
を決定した。決定されたこれらの配列はともに、配列表
中配列番号１に示した。得られたＣＺＰ−３遺伝子は、
２６３アミノ酸をコードする７８９ bp のヌクレオチド
配列（ヌクレオチド番号３４７〜１１３５；ＣＺＰ３
₂₆₃ 遺伝子）から成るものであった。

【００５０】イヌ卵透明帯−３（ＣＺＰ３）全遺伝子配
列の決定 さらにＣＺＰ３のクローニングを進めることによって全
ＣＺＰ３の遺伝子配列およびアミノ酸配列を明らかにし
た。

【００５１】（１）３’側領域のクローニング 次の４個のプライマーとイヌ卵巣ｃＤＮＡを用いてＣＺ
Ｐ３の残り３’側遺伝子をクローニングし配列を決定し
た。

【００５２】ＣＺＰ３₂₆₃ の配列より次のプライマー
３，４，５を、又ｍＲＮＡのポリＡ配列よりプライマー
６を自動ＤＮＡ合成機を用いて作製した。

【００５３】

【表２】 上述の方法で抽出したｍＲＮＡは、マウス卵巣ｃＤＮＡ
合成のときと同様にＰｈａｒｍａｃｉａ ｃＤＮＡ合成
キットを用い、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡ
へと変換した。このイヌ卵巣ｃＤＮＡを鋳型に使いＰＣ
Ｒを実施した。ＰＣＲは GeneAmp DNA Amplification R
eagent Kit（Perkin Elmer Cetus）およびDNA Thermal
Cycler（Perkin Elmer Cetus）を用いた。

【００５４】

【表３】 １回目のＰＣＲ−プライマー：３および６； 鋳型ＤＮＡ：イヌ卵巣ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−２分，３０回； ７２℃−５分，１回 ２回目のＰＣＲ−プライマー：４および６； 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−２分，３０回； ７２℃−５分，１回 ３回目のＰＣＲ−プライマー：５および６； 鋳型ＤＮＡ：２回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：２回目ＰＣＲ条件と同じ ３回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲルにて電気
泳動を行ない増幅されたＤＮＡバンドをエチジウムブロ
マイド染色で確認する。その結果３回目のＰＣＲ産物に
３００ bp 程度のバンドが検出された。この３回目のＰ
ＣＲ産物をエタノール沈澱後、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消
化した後低融点アガロースゲルにて電気泳動を行ない、
ゲルより目的の３００ bp のＤＮＡをＧＥＮＥＣＬＥＡ
Ｎ II （ＢＩＯ １０１）を用いて精製した。この精製
したＤＮＡをあらかじめ同じＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消
化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲーションキット
（宝酒造）をもちいて連結させた。大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換を行なった後、アンピシリン含有ＬＢプレート
に播き、生えてきた形質転換株を拾い上げる。これを５
ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地で培養しプラスミドを精
製（ＱＩＡＧＥＮＨｉ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ
Ｋｉｔ）した。精製したプラスミドはその一部をＥｃ
ｏＲＩ，ＳａｌＩ消化して目的サイズのＤＮＡが組み込
まれていることを確認した後、残りを遺伝子配列決定の
ため通常の２本鎖シークエンスに用いた。シークエンス
はプラスミドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖法のＤ
ＮＡシークエンスキット（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲ
ＳＩＯＮ ２．０７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ Ｋｉｔ，
ＵＳＢ）を用いて決定した。その結果以下の配列が決定
された。

【００５５】

【表４】 ５’ＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＣ ＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＧＡＧＧＧＧＴＣＡＡ ＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＡＧＧＣＣ ＴＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＧ ＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＣ ＡＣＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡＡ ＴＡＡＡ ＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ３’ （下線部は、配列番号１に示されるヌクレオチド１１３６〜１３０９に相当する 。） （２）５’側領域のクローニング ＣＺＰ３の５’側領域は前記のＣＺＰ３₂₆₃ の配列をも
とにしてｃＤＮＡを作製し、これを鋳型としてＰＣＲを
行ないクローニングした（Michael A. Frohman, Michae
l K. Dush, and Gail R. Martin (1988) Proc. Natl. A
cad. Sci USA 85, 8998-9002. Osamu Ohara, Robert L.
Dorit, and Walter Gilbert (1989) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86, 5673-5677) 。

【００５６】ＣＺＰ３₂₆₃ の配列より次の３個のプライ
マーを合成した。

【００５７】

【表５】 プライマー７をもとにしてイヌ卵巣ｍＲＮＡより一本鎖
ｃＤＮＡを作製した。１本鎖ｃＤＮＡの合成は RiboClo
ne cDNA Systhesis System (Promega)を使用した。具体
的には、０．５μｇのイヌ卵巣ｍＲＮＡに０．５μｇの
プライマー７を加え７０℃で５分間保温後室温にゆっく
りと戻す。つづいて10×first strand buffer, 100mM D
DT, 10mM dNTP mix, RNasin ribonuclease inhibitor,
40mM Napyrophosphate, reverse transcriptaseを加え
て４２℃で１時間保温して１本鎖ｃＤＮＡを合成する。
反応終了後１回フェノール／クロロホルム抽出を行ない
その上清をＴＥ（10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA ）で
あらかじめ平衡化してあるスパンカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）にかける。回収液はエタ沈メイト（ニッポンジ
ーン）とともにエタノール沈澱させる。次に合成した１
本鎖ｃＤＮＡの３’側にポリＡを付加する反応を行なっ
た。具体的には、沈澱させた１本鎖ｃＤＮＡを乾燥後、
水に溶解し９４℃で２分処理後氷上で急冷し、これにｄ
ＡＴＰと５×tailing Buffer, terminal deoxynucleoti
dyl-transferase （Bethesda Research Laboratories）
を加えて３７℃で１０分間，６５℃、１５分間反応させ
る。これにＴＥを加えて希釈してＰＣＲの鋳型ＤＮＡ
（５’ＣＺＰ３−ｃＤＮＡ）とした。

【００５８】

【表６】 １回目ＰＣＲ−プライマー：８および６； 鋳型ＤＮＡ：５’ＣＺＰ３ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−２分，３０回； ７２℃，５分 ２回目ＰＣＲ−プライマー：９および６； 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−２分，３０回； ７２℃，５分 ２回目のＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲルにて電
気泳動を行なった。エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色した。その結果５００ bp 程度のＤＮＡバンドが検出
された。この５００ bp のＤＮＡをｐＵＣ１８のＥｃｏ
ＲＩ，ＳａｌＩにサブクローニングするために、ＰＣＲ
産物からクロロホルムでミネラルオイルを取り除き、エ
タノール沈澱させた。沈澱は乾燥後水に溶解した後Ｅｃ
ｏＲＩ，ＳａｌＩ消化した。反応終了後２％低融点アガ
ロースゲル電気泳動で分離し目的の５００ bp のバンド
を切り出しＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）
を用いてゲルより抽出した。これをあらかじめＥｃｏＲ
Ｉ，ＳａｌＩで消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライ
ゲーションキット（宝酒造）を用いて連結させた。これ
を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換させ、アンピシリン含有
ＬＢプレートに播き、生えてきたコロニーは拾い上げて
５ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ＱＵＩＡ
ＧＥＮ，Ｈｉ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ
を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドは
その一部をＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消化して目的サイズの
ＤＮＡが組み込まれていることを確認した後、残りは通
常の２本鎖シークエンスに用いた。シークエンスはプラ
スミドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシ
ークエンスキット（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯ
Ｎ ２．０７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ Ｋｉｔ， ＵＳ
Ｂ）を用いて決定した。その結果以下の配列が決定され
た。

【００５９】

【表７】 ５’ＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＴＧ ＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣ ＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣ ＴＧＧＣＣＡＡＣＴＧＡＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＴＴＧＡＣＡＴＣＴＡＧＧ ＣＣＣＣＣＡＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧ ＧＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＧＧＧ ＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡ ＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＴ ＧＡＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＴ ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣ ＡＡＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧ ＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣ３’ （下線部は、配列番号１に示されるヌクレオチド３２〜３４６に相当する。） 以上、先に示したＣＺＰ３₂₆₃ 配列とさらに決定したＣ
ＺＰ３の３’側および５’側領域の２つの配列から以下
の配列表の配列番号１に示されるイヌ卵透明帯−３（Ｃ
ＺＰ３）の全塩基配列（１３２２ bp ）、全アミノ酸配
列（４２６個）が明らかとなった。

【００６０】実施例２ 発現ベクターの構築 市販の発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ（New England Biolab
s ，これは目的とする蛋白質をマルトース結合蛋白質と
の融合型で発現させるベクターである。）のＥｃｏＲＩ
サイト、ＳａｌＩサイトにＣＺＰ３₂₆₃ 遺伝子（配列番
号１に示されるヌクレオチド番号３４７から１１３５ま
での配列を有する）を挿入して発現ベクターを構築す
る。そのために、ＣＺＰ３₂₆₃ 遺伝子の５’側にＥｃｏ
ＲＩサイトを３’側には停止コドン（ＴＡＡ）とＳａｌ
Ｉサイトを次のように作製した（図２）。

【００６１】自動ＤＮＡ合成機を用いてＥｃｏＲＩサイ
トおよび停止コドン，ＳａｌＩサイトを持つ次の２個の
プライマーを合成した。

【００６２】

【表８】 このプライマーと先のＣＺＰ３₂₆₃ 遺伝子のシークエン
スに用いたプラスミドを鋳型ＤＮＡとして GeneAmp DNA
Amplification Reagent Kit（Perkin Elmer Cetus）お
よびDNA Thermal Cycler（Perkin Elmer Cetus）を用い
てＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction ）を実施した。
反応条件は、９４℃−３０秒，５５℃−１分，７２℃−
２分を１サイクルとし、これを４０サイクル実施後７２
℃−７分を１回追加する。反応終了後、当量のクロロホ
ルムを加えてミネラルオイルを反応溶液より除去し、こ
れに１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）
と３倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡをエタノール
沈澱させた。沈澱ＤＮＡは乾燥後、適量の水に溶解させ
たＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで完全に消化させた。これ
を低融点アガロースゲル電気泳動に流し８００ bp 程度
のＤＮＡを切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出はＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）を用いた。この
ＤＮＡを先にＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化して同様にア
ガロースゲルより精製してあるｐＭＡＬ−ｃベクターの
大断片にライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結
させ、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換させた。これを、ア
ンピシリン含有ＬＢプレートに播き、生えてきたコロニ
ーを２ｍｌ培養しＱＩＡＧＥＮＨｉ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でプラスミドを
精製した。精製したプラスミドはＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ
消化して目的のＣＺＰ３₂₆₃ 断片が組み込まれているこ
とを確認した。得られた形質転換株はｐＭＡＬ−ｃ−Ｃ
ＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１０９と命名する。

【００６３】組換え型ＣＺＰ３₂₆₃ 蛋白質の発現確認 組換え型ＣＺＰ３₂₆₃ 蛋白質の発現確認は抗ＰＺＰ３血
清を使ったウェスタンブロット法で行なった。

【００６４】構築した発現ベクターを含む上記ｐＭＡＬ
−ｃ−ＣＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１０９株を２mlＬＢ−アンピ
シリン培地で培養し吸光度が６００ｎｍ＝０．４となっ
たところでＩＰＴＧ（ isopropyl−β−Ｄ−thiogalact
oside ）を終濃度０．３ｍＭになるように加え、さらに
３時間培養をつづけた後遠心分離により菌体を集めた。
この菌体を少量の水に懸濁後その一部をＬａｅｍｍｌｉ
法のサンプルバッファー（還元条件）に可溶化しポリア
クリルアミドゲルにて常法どおりにＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を実施した。泳動終了後、市販の
エレクトロトランスファー装置を使って蛋白質をポリア
クリルアミドゲルよりニトロセルロースフィルターに転
写した。このフィルターを２％スキムミルク−ＴＢＳＴ
（10mM Tris-HClpH7.5, 0.14M NaCl, 0.1% Tween20）に
浸しブロッキング後、５００倍希釈した抗ＰＺＰ３血清
（天然のブタ卵透明帯−３画分をマウスに免疫しウェス
タンブロット法によるブタ卵透明帯−３画分と特異的に
反応することが確認されている血清。大腸菌に対する抗
体は吸収処理で取り除いてあり、イヌ卵透明帯と反応す
ることも凍結切片での間接蛍光抗体法によって確認でき
ているもの）と４℃で一晩反応させた。ネガティブコン
トロールとして正常マウス血清を同様に用いる。反応終
了後ＴＢＳＴで３回洗浄した後、１０００倍希釈した市
販のアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ
＋Ａ）抗体と反応させた。反応終了後ＴＢＳＴで３回洗
浄、通常どおりＮＢＴ（nitro blue tetrazolium），Ｂ
ＣＩＰ（bromochloroindoly phosphate ）で発色した。
図３に示すとおり抗ＰＺＰ３血清とは反応するが正常血
清とは反応しない発色が認められた。これより組換え型
ＣＺＰ３₂₆₃ 蛋白質の発現が確認された。

【００６５】実施例３ 組換え型ＣＺＰ３₂₆₃ 抗原の避妊ワクチン効果の検討 遺伝子工学的に作製した組換え型ＣＺＰ３₂₆₃ 蛋白質の
避妊ワクチン抗原として有効性を確認するためにシュミ
レーションとしてマウスを用いて避妊ワクチン実験を行
ないその効果を確認した。そのために組換え型ＣＺＰ３
₂₆₃ と同領域の組換え型ＭＺＰ３_107-369 を作製した。

【００６６】（１）ＭＺＰ３_107-369 遺伝子のクローニ
ングおよびその発現 ＣＺＰ３₂₆₃ 遺伝子に対応するＭＺＰ３_107-369 遺伝子
は以下のようにしてクローニングした。

【００６７】マウス卵巣ｍＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社のｍＲＮＡ抽出キット（FastTrack mRNA ISOLATI
ON KIT）を用いて抽出した。具体的には、凍結したマウ
ス卵巣Ｉｇに対してＬｙｓｉｓ溶液１０ｍｌを加えDoun
ce Homogenizerでホモジナイス（１０−１２ストロー
ク）する。これらをさらに１８Ｇの注射筒を通し細断し
た後４５℃で２時間ゆっくりと振盪させる。インキュベ
ーション後４０００×ｇ、１０分間遠心し、沈澱をとら
ないように注意して上清を回収する。この上清に０．５
Ｍとなるように５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加え、混合後生じ
た白沈澱を２１Ｇの注射筒を通して細断する。これに、
別途にキット中のＢｉｎｄｉｎｇ溶液で調製しておいた
オリゴｄＴセルロース５０ｍｇを加え室温で１時間転倒
混和させる。反応終了後２０００×ｇ，１０分間遠心し
オリゴｄＴセルロースを回収する。このセルロースペレ
ットを再度２０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ溶液に懸濁させた
後２０００×ｇ，１０分間遠心しオリゴｄＴセルロース
を回収する。この洗浄操作を３回くり返す。こうして洗
浄したオリゴｄＴセルロースをキットに備え付けのスピ
ンカラムに詰める。このスピンカラムに詰め込んだ段階
のオリゴｄＴセルロースをさらにＢｉｎｄｉｎｇ溶液で
洗い、スピンカラムを２０００×ｇ，１０分間遠心し溶
液を回収する。この回収溶液のＯＤ₂₆₀ が０．０５以下
となるまで繰り返し洗浄操作を行なう。洗浄が終了した
らキット中のＥｌｕｔｉｏｎ溶液０．２ｍｌを加えオリ
ゴｄＴセルロースを十分に懸濁させる。そして２０００
×ｇ，１０秒間遠心して溶出液を回収する。再度０．１
５ｍｌのＥｌｕｔｉｏｎ溶液をオリゴｄＴセルロースペ
レットに加えて懸濁させた後溶出液を回収する。この２
回の操作で得られた０．３５ｍｌの回収液にキット内の
２Ｍ酢酸ナトリウムを０．１５倍容量を加え、１００％
エノタールをさらに２．５倍容量混合後−７０℃で凍ら
せてｍＲＮＡを沈澱させる。１６０００×ｇ，１５分間
遠心して沈澱を回収する。冷７０％エノタールで２回沈
澱を洗い、真空エバポレーターで乾燥させた後、適当量
の滅菌水に溶解する。一部を適当に希釈してＯＤ
_320-230 間のスキャンニングを行ないＯＤ₂₆₀ の吸光度
値よりｍＲＮＡ量を算出する。こうして１ｇの卵巣より
１９．２μｇのｍＲＮＡを精製した。なお使用する試
薬、器具類はすべてＲＮａｓｅによる分解を防ぐための
処理を施してある。

【００６８】次にこの得られたｍＲＮＡをＧｕｌｅｒ
＆ Ｈｏｆｆｍａｎ（Gubler, U. and Hoffman, B., GE
NE 25, 263(1983)法に基づいたＰｈａｒｍａｃｉａ ｃ
ＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡへ変換した。具体的
には５μｇのｍＲＮＡを２０μｌを滅菌水に溶かし、７
０℃で１０分間インキュベート後氷中で急冷する。これ
にＤＴＴ（Dithiothreitol）を１μｌ加えた後、１st s
trand mix に移してピペットでゆっくり混合、３７℃、
１時間反応させる。これをＭＺＰ３_107-369 遺伝子クロ
ーニングの為の鋳型ＤＮＡとした。ＣＺＰ３₂₆₃ の発現
ベクター遺伝子の作製に使用したプライマー１，２をこ
のＭＺＰ３_107-369 発現遺伝子の作製にも使用した。具
体的には、上記１st strand mix ４μｌとプライマー
１，２を用いて同条件でＰＣＲを実施した。その結果増
幅させたＭＺＰ３_107-369 （図４）をＣＺＰ３₂₆₃ の時
と同様に、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ消化して同じくｐＭＡ
Ｌ−ｃベクターのＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩサイトに組み込
んだ。ＣＺＰ３₂₆₁ の時と同様にしてＪＭ１０９に形質
転換して形質転換株（ｐＭＡＬ−ｃ−ＭＺＰ３_107-369
／ＪＭ１０９）を得た。ＣＺＰ３₂₆₃ 蛋白質の発現確認
のときと同様に候補株を培養し、抗ＰＺＰ３血清でのウ
ェスタンブロット法でＭＺＰ３_107-369 の発現を確認し
た。

【００６９】（２）発現ＭＺＰ３_107-369 蛋白質の精製 ＭＺＰ３_107-369 発現株を４０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む１００ｍｌのＬＢ培地で一夜培養した後、その
２０ｍｌを２ｇのグルコースを含むＲｉｃｈ培地１Ｌに
接種し、６００ｎｍにおける吸光度が０．４となるまで
培養したところでＩＰＴＧを終濃度０．３ｍＭになるよ
うに加え、さらに３時間培養を継続した後、遠心分離に
より菌体を回収した。集めた菌体はＬｙｓｉｓ溶液（10
mM Na₂HPO₄ , 30mM NaCl, 0.25% Tween 20, 10mM β-m
ercaptoethanol, 10mM EDTA pH8.0, 10mM EGTA pH7.0,
1mM PMSF）に５ｇ菌体／Ｌとなるように懸濁し、１ｍｇ
／ｍｌリゾチームを加えて氷中で３０分間インキュベー
ト後、超音波処理を行ない菌体を粉砕した。さらに５Ｍ
ＮａＣｌを０．５Ｍになるように添加し９０００×
ｇ，３０分間遠心して上清を回収した。この上清をカラ
ム溶液（10mM sodium phosphate pH7.2, 0.5M NaCl, 1m
M sodium azide, 10mM β-mercaptoethanol, 1mM EGTA
pH7.0）＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０で５倍に希釈し、
別途にカラム溶液で平衡化してあるアミロースレジン−
アフィニティーカラムに吸着させた。３倍容量のカラム
容器＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０、続いて５倍容量のカ
ラム溶液でアミロースレジンを洗浄後、溶出溶液（カラ
ム溶液＋10mM maltose, 10mMβ-mercaptoethanol, 1mM
EGTA pH7.0）で溶出させＯＤ₂₈₀ の吸収で蛋白画分を集
めた。集めた蛋白画分は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液に
透析後、セントリプレップ１０（ＡＭＩＣＯＮ）を使っ
て濃縮した。図５は、アフィニティ精製したＭＺＰ３
_107-369 融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで流した後ＣＢ
Ｂ染色したものである。こうして調製したＭＺＰ３
_107-369 融合蛋白質を以下で述べるマウス避妊ワクチン
実験のワクチン抗原として用い抗原の有効性を確認し
た。

【００７０】（３）マウス避妊ワクチン実験 ６匹の雌マウス（６週齢）にＭＺＰ３_107-369 融合蛋白
質５０μｇ／マウスをフロインド完全アジュバントを用
い腹腔に投与し、２週間後にフロインド不完全アジュバ
ントを用いて２回目の免疫を同様に行った。以後２週間
置きに免疫を行ない、免疫後１週間後に眼より採血を行
ない、血液中の抗体産生を調べた。マウス卵透明帯と反
応する抗体の産生の確認には、マウス卵巣の凍結切片を
間接蛍光抗体法を用いて染色した。具体的にはマウス卵
巣の凍結切片を作製、作製した卵巣組織切片は１０％馬
血清でブロッキングした後に適当に希釈したマウス血清
と４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後ＦＩＴＣ
標識抗マウスＩｇ（Ｇ，Ｍ，Ａ）抗体と反応させた。反
応終了後３回洗浄した後蛍光顕微鏡を用いて卵巣中の卵
透明帯が染まっているかを調べた。その結果、３回目の
免疫血清あたりから蛍光発色が認められ始め抗体の産生
が確認された。総計６回の免疫を実施した。６回目の採
血終了後雄マウスと同居を開始した。その後妊娠が確認
されるまで常時同居を継続させ妊娠するか否かを検討し
た。又、膣プラークによって交尾の確認も行なった。比
較として融合蛋白部分だけを同様に免疫した群（対照
群）を作製した。

【００７１】その結果を図６に示した。ＭＺＰ３
_107-369 融合蛋白の免疫によって抗体価の強さには若干
のばらつきが認められるが、免疫した雌マウス６匹すべ
てにおいて自己の卵透明帯と反応する抗体が誘導され
た。対照群では検出されなかった。対照群は雄と同居後
２カ月以内に５匹すべてに子供が生まれた。一方、免疫
群は同居後５カ月経過して初めて一匹のマウスに子供が
生まれただけで残りの５匹のマウスには子供が生まれて
いない。また、対照群の平均産子数は４．８であるのに
対し免疫群のそれは１．０である。これらの結果は組換
え型ＭＺＰ３_107-369 抗原ワクチンが雌マウスの避妊に
関し明らかに有効であることを示しており、またこのワ
クチンによって誘導される不妊は永久的なものではなく
可逆的なものであることも示している。この避妊ワクチ
ンは免疫によって誘導する自己の卵透明帯抗体の量をな
んらかの方法（抗原量、抗原の質、免疫回数、免疫方法
等）でコントロールすることによって不妊（避妊期間、
子供数等）をコントロールすることが可能である。

【００７２】この結果はイヌにおいても対応するイヌの
ＺＰ３抗原（ＣＺＰ３）をワクチン抗原として用いれば
イヌにおいても同様な避妊のコントロールが可能なこと
を立証するものである。

【００７３】

【発明の効果】イヌ卵透明帯ＣＺＰ−３蛋白質アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を発現させて得られるＣＺ
Ｐ−３関連組換えペプチドは、イヌ避妊又は不妊用のワ
クチン抗原として有用である。

【００７４】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１３２２ bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起 源： 生物名：イヌ 組織の種類：卵巣 配列： GGTTACCAGT GGGAGTGACT GGAGGAGCT ATG GGG CTG AGC TAT GGA ATT 50 Met Gly Leu Ser Tyr Gly Ile 1 5 TTC ATC TGT TTT CTG CTC CTG GGA GGC ATG GAG CTG TGC TGC CCC CAG 98 Phe Ile Cys Phe Leu Leu Leu Gly Gly Met Glu Leu Cys Cys Pro Gln 10 15 20 ACC ATC TGG CCA ACT GAG ACC TAC TAC CCA TTG ACA TCT AGG CCC CCA 146 Thr Ile Trp Pro Thr Glu Thr Tyr Tyr Pro Leu Thr Ser Arg Pro Pro 25 30 35 GTA ATG GTG GAC TGT CTG GAG TCC CAG CTG GTG GTC ACT GTC AGC AAA 194 Val Met Val Asp Cys Leu Glu Ser Gln Leu Val Val Thr Val Ser Lys 40 45 50 55 GAC CTT TTT GGT ACT GGG AAG CTC ATC AGG CCA GCA GAC CTC ACC CTG 242 Asp Leu Phe Gly Thr Gly Lys Leu Ile Arg Pro Ala Asp Leu Thr Leu 60 65 70 GGT CCA GAG AAC TGT GAG CCC CTG GTC TCC ATG GAC ACG GAT GAT GTG 290 Gly Pro Glu Asn Cys Glu Pro Leu Val Ser Met Asp Thr Asp Asp Val 75 80 85 GTC AGG TTT GAG GTT GGG CTG CAC GAG TGT GGC AGC AGG GTG CAG GTG 338 Val Arg Phe Glu Val Gly Leu His Glu Cys Gly Ser Arg Val Gln Val 90 95 100 ACT GAC AAT GCT CTG GTG TAC AGC ACC TTC CTG ATC CAC AGC CCC CGC 386 Thr Asp Asn Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe Leu Ile His Ser Pro Arg 105 110 115 CCT GCG GGC AAC CTG TCC ATC CTG AGA ACT AAT CGT GCC GAG GTT CCC 434 Pro Ala Gly Asn Leu Ser Ile Leu Arg Thr Asn Arg Ala Glu Val Pro 120 125 130 135 ATC GAG TGC CAC TAC CCC AGG CAC AGC AAT GTG AGC AGC CAG GCC ATC 482 Ile Glu Cys His Tyr Pro Arg His Ser Asn Val Ser Ser Gln Ala Ile 140 145 150 CTG CCC ACT TGG GTC GCC TTC AGG ACC ACA ATG CTC TTC GAG GAG AAG 530 Leu Pro Thr Trp Val Ala Phe Arg Thr Thr Met Leu Phe Glu Glu Lys 155 150 165 CTA GTT TTC TCT CTC CGC CTA ATG GAG GAG GAC TGG GGC TCC GAG AAG 578 Leu Val Phe Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu Asp Trp Gly Ser Glu Lys 170 175 180 CAA TCC CCC ACA TTC CAG CTG GGA GAC ATA GCC CAC CTC CAG GCT GAA 626 Gln Ser Pro Thr Phe Gln Leu Gly Asp Ile Ala His Leu Gln Ala Glu 185 190 195 GTC CAC ACT GGC AGC CAT ATG CCA CTG CGA CTT TTT GTG GAC CAC TGT 674 Val His Thr Gly Ser His Met Pro Leu Arg Leu Phe Val Asp His Cys 200 205 210 215 GTG GCC ACG CTG ACA CCA GAT CGG AAT GCC TTC CCT CAT CAC AAA ATT 722 Val Ala Thr Leu Thr Pro Asp Arg Asn Ala Phe Pro His His Lys Ile 220 225 230 GTG GAC TTC CAT GGC TGT CTT GTG GAT GGT CTC TAC AAT TCC TCT TCA 770 Val Asp Phe His Gly Cys Leu Val Asp Gly Leu Tyr Asn Ser Ser Ser 235 240 245 GCC TTC AAA GCC CCC AGA CCC AGG CCA GAG ACT CTT CAG TTC ACA GTG 818 Ala Phe Lys Ala Pro Arg Pro Arg Pro Glu Thr Leu Gln Phe Thr Val 250 255 260 GAT GTT TTC CAC TTT GCT AAG GAC TCA AGA AAC ACG ATC TAT ATC ACC 866 Asp Val Phe His Phe Ala Lys Asp Ser Arg Asn Thr Ile Tyr Ile Thr 265 270 275 TGC CAT CTG AAG GTC ACT CCG GCT GAC CGA GTC CCA GAC CAG CTA AAC 914 Cys His Leu Lys Val Thr Pro Ala Asp Arg Val Pro Asp Gln Leu Asn 280 285 290 295 AAA GCT TGT TCC TTC ATC AAG TCT ACC AAG AGG TCC TAC CCT GTA GAA 962 Lys Ala Cys Ser Phe Ile Lys Ser Thr Lys Arg Ser Tyr Pro Val Glu 300 305 310 GGC TCG GCT GAT ATT TGT CGC TGT TGT AAC AAA GGC AGC TGT GGC CTT 1010 Gly Ser Ala Asp Ile Cys Arg Cys Cys Asn Lys Gly Ser Cys Gly Leu 315 320 325 CCA GGC CGG TCC AGG AGG CTG TCC CAC CTA GAG AGA GGG TGG CGC AAG 1058 Pro Gly Arg Ser Arg Arg Leu Ser His Leu Glu Arg Gly Trp Arg Lys 330 335 340 TCT GTT TCC CAC ACT AGA AAT CGC AGG CAC GTG ACT GAA GAA GCA GAT 1106 Ser Val Ser His Thr Arg Asn Arg Arg His Val Thr Glu Glu Ala Asp 345 350 355 ATC ACC GTG GGG CCT CTG ATC TTC CTG GGA AAG GCT AGT GAT CAT GGT 1154 Ile Thr Val Gly Pro Leu Ile Phe Leu Gly Lys Ala Ser Asp His Gly 360 365 370 375 ATA GAG GGG TCA ACC TCT CCT CAC ACC TCT GTG ATG TTG GGC TTA GGC 1202 Ile Glu Gly Ser Thr Ser Pro His Thr Ser Val Met Leu Gly Leu Gly 380 385 390 CTG GCC ACG GTG GTA TCC CTG ACT CTA GCT ACC ATT GTC CTG GTC CTT 1250 Leu Ala Thr Val Val Ser Leu Thr Leu Ala Thr Ile Val Leu Val Leu 395 400 405 GCC AAG AGG CAT CGT ACT GCT TCC CAC CCT GTG ATA TGC CCT GCA TCT 1298 Ala Lys Arg His Arg Thr Ala Ser His Pro Val Ile Cys Pro Ala Ser 410 415 420 GTC TCC CAA TAAAAGAATA AGC 1320 Val Ser Gln 425

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、遺伝子工学手法により決定されたマ
ウス及びイヌ卵透明帯ＺＰ−３の推定アミノ酸配列の比
較を示す。

【図２】この図は、発現用イヌ卵透明帯ＣＺＰ３₂₆₃ 遺
伝子配列をアミノ酸配列と共に示す。

【図３】この図は、組換え型ＣＺＰ３₂₆₃ 抗原の発現を
確認したウェスタンブロット写真である。レーン１は分
子量マーカー、レーン２と７はｐＭＡＬ−ｃ−ＣＺＰ３
₂₆₃ ／ＪＭ１０９−＃２、レーン３と８はｐＭＡＬ−ｃ
−ＣＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１０９−＃７、レーン４と９はｐ
ＭＡＬ−ｃ−ＣＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１０９−＃１２、レー
ン５と１０はｐＭＡＬ−ｃ−ＣＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１０９
−＃１４、レーン６はｐＭＡＬ−ｃ／ＪＭ１０９であ
る。

【図４】この図は、発現用マウス卵透明帯ＭＺＰ３
_107-369 遺伝子配列をアミノ酸配列と共に示す。

【図５】この図は、アフィニティー精製した組換え型Ｍ
ＺＰ３_107-369 融合蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動結果を示す写真である。レーン１は分子
量マーカー、レーン２は該融合蛋白質を示す。

【図６】この図は、組換え型ＭＺＰ３_107-369 抗原を免
疫した又は免疫しないマウスの不妊期間及び産子数を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 鈴木 正則 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるイヌ卵透明帯ＣＺ
   Ｐ−３蛋白質アミノ酸配列の全部又は一部をコードする
   塩基配列を含むＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記塩基配列が、配列番号１に示される
   ヌクレオチド番号３２〜１３０９の塩基配列の全部又は
   一部である請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 前記塩基配列が、配列番号１に示される
   ヌクレオチド番号３４７〜１１３５の配列から成る請求
   項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１に示されるイヌ卵透明帯ＣＺ
   Ｐ−３蛋白質アミノ酸配列の全部又は一部を含む組換え
   ペプチドの製造方法であって、請求項１、２又は３記載
   のＤＮＡを複製可能な適切な発現ベクターに組み込み、
   得られた発現ベクターで適切な宿主を形質転換し、得ら
   れた形質転換体を適切な培地中で培養し、前記ＤＮＡを
   発現させ、及び得られた組換えペプチドを回収する、こ
   とを包含する方法。
5. 【請求項５】 前記形質転換体が、大腸菌株ｐＭＡＬ−
   ｃ−ＣＺＰ３₂₆₃ ／ＪＭ１０９である請求項４記載の方
   法。
6. 【請求項６】 配列番号１に示されるアミノ酸配列の全
   部又は一部を有するイヌ卵透明帯ＣＺＰ−３関連ペプチ
   ド。
7. 【請求項７】 配列番号１に示されるアミノ酸番号１０
   ６〜３６８のアミノ酸配列を有する請求項６記載のペプ
   チド。
8. 【請求項８】 請求項６又は７のいずれか一項に記載の
   ペプチドを有効量含有するイヌの避妊ワクチン。
9. 【請求項９】 請求項８記載のワクチンを雌イヌに投与
   し免疫感作することを包含するイヌの避妊方法。