JP2001504329A

JP2001504329A - ヘリコバクター・ピロリに関連する核酸およびアミノ酸配列ならびにそのワクチン組成物

Info

Publication number: JP2001504329A
Application number: JP52071098A
Authority: JP
Inventors: スミス，ダグラス; アールム，リチャード・エイ
Original assignee: アストラ・アクチエボラーグ
Priority date: 1996-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 2001-04-03
Also published as: KR20000052831A; SK34699A3; SA98180918A; PL333169A1; BR9712587A; NO991995D0; WO1998018323A1; AU734052B2; EP0973394A4; AU5093398A; AR009600A1; NZ334568A; CA2265523A1; NO991995L; IL129397A0; EP0973394A1; ID22065A; IS5005A; EE9900176A; TR199900940T2

Abstract

(57)【要約】 H.pyloriポリペプチドの組換えまたは実質的に純粋なプレパレーションが記載される。それらのポリペプチドをコードする核酸も記載される。H.pyloriポリペプチドは診断およびワクチン処方物に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクター・ピロリに関連する核酸およびアミノ酸配列ならびにそのワクチン組成物発明の背景ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）は、ヒト胃バイオプシー標本から発見され、培養された、グラム陰性、Ｓ字型、微好気性菌である（Warren ，J．R．& B．Marshall，Lancet 1：1273-1275，1983;Marshallら，Microbios L ett．25：83-88，1984）。H.pyloriは慢性胃炎および十二指腸潰瘍性疾患と密接に関連する（Rathboneら，Gut 27:635-641，1986）。しかも、非潰瘍性消化不良、胃潰瘍疾患および胃腺癌におけるH．pyloriの病因的役割を示す証拠が蓄積されている（Blaser M．J.，Trends Microbiol．1:255-260，1993）。この細菌の伝播は、経口的経路を介して起こり、感染の危険は加齢とともに増大する（Tayl or，D．N．& M．J．Blaser，Epidemiol．Rev．13：42-50，1991）。H.pyloriはヒト胃粘膜においてコロニーを形成し、通常数十年は持続する感染が確立される。H.pyloriによる感染は世界的に拡がっている。先進国の成人人口における感染率は50％を越える程度であるが、発展途上国における感染率は年齢20歳以上の成人の90％に達している（Hopkins R．J．& J．G．Morris，Am．J．Med．97：265- 277，1994）。胃環境のコロナイゼーションおよびこの病原菌の毒力に必要な細菌因子については、わずかしか分かっていない。推定される毒力因子の例には以下が包含される。すなわち、ウレアーゼ、胃酸のpHの中和にある種の役割を果たす可能性が考えられる酵素(Eatonら，Infect．Immunol．59：2470-2475，1991;Ferrero，R.L ．& A.Lee，Microb．Ecol．Hlth．Dis．4：121-134，1991;Labigneら，J．Bacte riol．173:1920-1931，1991);粘膜層を横切る移動性の原因になる細菌の鞭毛タンパク質(Hazellら，J.Inf．Dis．153:658-663，1986;Leyingら，Mol．Microbio l．6:2863- 2874，1992;Haasら，Mol．Microbiol．8:753-760，1993)；VacA、上皮細胞に細胞内液胞の形成を誘導する細菌毒素（Schmitt，W．& R.Haas,Molecular．Microb iol．12(2):307-319，1994）および数種の胃組織特異的接着（Borenら，Science 262:1892-1895，1993;Evansら，J.Bacteriol．175:674-683，1993;Falkら，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 90:2035-2039，1993）である。現在ではH．pyloriの感染をインビトロで絶滅させる多くの治療剤が存在する（Huescaら，Zb1．Bakt．280:244-252，1993;Hopkins，R．J．& J．G．Morris，前出）。しかしながら、これらの処置の多くは細菌の抵抗性、薬剤分布の変化、患者のノンコンプライアンスまたは薬剤の低い生物学的利用性のため、インビボでは至適下の効果しか示さない（Hopkins,R.J．& J.G.Morris，前出）。ビスマスを併用する抗生物質による処置は、H.pylori感染の処置のために使用される標準処方基準の一部となっている(Malfertheiner，P．& J．E．Dominguez-Munoz， Clinical Therapeutics 15 Supp．B:37-48，1993)。最近、プロトンポンプ阻害剤と単一の抗生物質の併用が十二指腸の潰瘍性疾患を改善することが明らかにされている(Malfertheiner，P．& J．E．Dominguez-Munoz，前出)。しかしながら、抗生物質を使用する方法は、これらの薬剤に抵抗性の細菌株の発生の問題がある（Hopkins，R．J．& J．G．Morris，前出）。これらの限界は、H.pylori感染をインビボにおいて撲滅する新しい、より有効な方法の必要性を示すものである。特にこの細菌による感染を防止できる新たなワクチンの設計が強く望まれる。発明の概要本発明は、生物体ヘリコバクター・ピロリ（H.pylori）からの新規な遺伝子たとえば細菌の表面タンパク質のようなポリペプチドをコードする遺伝子、および他の関連遺伝子、それらの産物ならびにそれらの使用に関する。本発明の核酸およびペプチドは、H.pyloriおよび他のヘリコバクター種の診断および処置に有用性を有する。それらはサンプル中におけるH.pylori および他のヘリコバクター種の存在の検出、ならびにH.pyloriの生活環に干渉する能力またはH.pylori感染を阻害する能力を有する化合物のスクリーニングにも使用することができる。さらに詳しくは、本発明は、H.pyloriタンパク質たとえば表面または分泌タンパク質の全コード配列もしくはそれら部分に相当する核酸の組成、H.pyloriタンパク質からのｍＲＮＡに結合することが可能でタンパク質の翻訳を遮断する核酸ならびにペプチド合成および組換えＤＮＡ技術を用いてH. pyloriタンパク質もしくはその部分を製造する方法を特徴とする。本発明はさらに、H.pylori感染を検出するためのプローブとして有用な抗体および核酸を特徴とする。加えて、ワクチン組成物ならびにH.pyloriによる感染の防御または処置方法も本発明の範囲内に包含される。図面の簡単な説明図１は、特異的なH.pylori抗原による免疫処置後のマウスの血清における抗体力価を示す棒グラフである。図２は、特異的なH.pylori抗原による免疫処置後のマウスの粘膜における抗体力価を示す棒グラフである。図３は、ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した特異的な抗原によるH.pylori感染マウスの治療的な免疫処置を示す棒グラフである。図４は、ＤＯＣ含有緩衝液に溶解した特異的な抗原によるH.pylori感染マウスの治療的な免疫処置を示す棒グラフである。図５は、５種のH.pyloriタンパク質の配列の部分におけるアミノ酸配列のアラインメントを示す（単一文字アミノ酸コードで表示；Ｎ末端からＣ末端を左から右に示す）。図６は、４種のH.pyloriタンパク質の配列の部分におけるアミノ酸配列のアラインメントを示す（単一文字アミノ酸コードで表示；Ｎ末端からＣ末端を左から右に示す）。図７は、２種のH.pyloriタンパク質の配列の部分におけるアミノ酸配列のアラインメントを示す（単一文字アミノ酸コードで表示；Ｎ末端からＣ末端を左から右に示す）。図８は、２種のH.pyloriタンパク質の配列の部分におけるアミノ酸配列のアラインメントを示す（単一文字アミノ酸コードで表示；Ｎ末端からＣ末端を左から右に示す）。発明の詳述一態様においては、本発明はSEQ ID NO：74のH.pyloriポリペプチドの組換えまたは実質的に純粋なプレパレーションを特徴とする。本発明はまたSEQ ID NO ：74のH.pyloriポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸を包含し、このような核酸はSEQ ID NO：１に含まれる。本明細書に記載の本発明のH.pyloriポリペプチド配列は配列表に含まれ、また本発明のH.pyloriポリペプチドをコードする核酸配列も配列表に含まれる。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：75のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：２のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：76のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：３のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：77のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：４のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：78のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：５のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：79のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：６のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：80のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：７のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：81のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：８のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：82のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：９のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：83のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：10のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：84のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：11のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：85のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：12のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：86のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：13のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：87のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：14のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：88のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：15のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：89のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：16のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：90のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：17のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：91のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：18のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：19のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：93のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：20のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：94のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：21のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする．他の態様においては本発明はSEQ ID NO：95のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：22のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：96のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：23のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：24のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：25のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：99のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：26のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：100のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：27のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：101のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：28のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：29のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：30のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：104のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：31のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：105のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：32のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：33のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：107のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：34のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：108のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：35のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：109のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：36のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：110のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：37のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：111のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：38のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：112のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：39のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：113のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：40のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：114のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：41のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：115のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：42のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：116のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：43のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：117のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：44のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：118のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：45のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：119のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：46のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：120のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：47のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：121のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：48のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：122のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：49のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：123のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：50のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：124のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：51のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：125のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：52のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：126のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：53のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：127のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：54のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：128のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：55のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：129のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：56のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：130のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：57のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：131のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：58のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：132のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：59のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：133のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：60のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：134のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：61のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：135のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：62のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：136のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：63のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：137のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：64のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：138のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：65のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：139のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：66のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：67のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：141のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：68のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：142のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO ：69のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：143のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：70のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：144のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：71のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：145のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：72のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。他の態様においては本発明はSEQ ID NO：146のアミノ酸配列を有するH.pylori ポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸、例えばSEQ ID NO：73のヌクレオチド配列からなる核酸を特徴とする。 H.pylori細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸が特に好ましい。このような核酸はSE Q ID NO：３、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10 、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO ：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：11、 SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：５、SEQ ID NO：６、SEQ ID NO：８、およびSEQ ID NO：21からなる群より選択される。他の実施態様においては、H.pylori細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：３、SEQ ID NO：25、およびSEQ ID NO：48からなる群より選択される核酸によってコードされるH.pylori内膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである。他の実施態様においては、H.pylori細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントはSEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35 、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO ：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：11、およびSEQ ID NO：71からなる群より選択される核酸によりコードされるH.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである。他の実施態様においては、H.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：43、SEQ ID N O：11、およびSEQ ID NO：71からなる群より選択される核酸によってコードされる、末端フェニルアラニン残基およびＣ末端チロシンクラスターを有するH.pylo riポリペプチドまたはそのフラグメントである。さらに他の実施態様においては、H.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SE Q ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19 、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO ：56、およびSEQ ID NO：58からなる群より選択される核酸によりコードされる、末端フェニルアラニン残基を有するH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントである。 H.pylori分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸が特に好ましい。このような核酸はSEQ ID NO：72 、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：２、SEQ ID NO：４、SEQ ID NO ：９、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、およびSEQ ID NO：68からなる群より選択される。 H.pylori細胞性ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸が特に好ましい。このような核酸はSEQ ID NO：1 2、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO ：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、およびSEQ ID NO：73からなる群より選択される。精製または単離されたH.pylori細胞性エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントが特に好ましく、この場合、ポリペプチドは、SEQ ID NO：76、SEQ I D NO：98、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：118、 SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO ：128、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO： 74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、S EQ ID NO：81、およびSEQ ID NO：94からなる群より選択される。他の実施態様においてはH.pylori細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントはSEQ ID NO：76、SEQ ID NO：98、およびSEQ ID NO：121からなる群より選択されるH.pylori内膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである。他の実施態様においてはH.pylori細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：1 08、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：128、SEQ I D NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131 、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID N O：84、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：90、およびSEQ ID NO：130からなる群より選択されるH.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである。他の実施態様においてはH.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID N O：84、およびSEQ ID NO：144からなる群より選択され、末端フェニルアラニン残基およびＣ末端チロシンクラスターを有するH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントである。他の実施態様においてはH.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ I D NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、 SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID N O：129、およびSEQ ID NO：131からなる群より選択され、末端フェニルアラニン残基を有するH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントである。精製または単離されたH.pylori分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントが特に好ましく、この場合、ポリペプチドは、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：105、SE Q ID NO:124、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：86 、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114 、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138 、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される。精製または単離されたH.pylori細胞性ポリペプチドまたはそのフラグメントが特に好ましく、この場合、ポリペプチドはSEQ ID NO：85、SEQ ID NO： 88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID N O：100、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、 SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、およびSEQ ID NO：146からなる群より選択される。他の態様においては、本発明は、H.pyloriポリペプチドの上に定義された群からのそれぞれのH.pyloriポリペプチドメンバーまたはこのようなメンバーをコードする核酸に関する。他の態様においては、本発明は、H.pyloriのｍＲＮＡに結合できる核酸を特徴とする。このような核酸は、H.pyloriのｍＲＮＡの翻訳を制御するアンチセンス核酸として作用することができる。さらに他の態様は、H.pylori核酸に特異的に結合できる核酸を特徴とする。これらの核酸はまた、本明細書においては補体とも呼ばれ、プローブとしておよび捕獲試薬としての有用性を有する。他の態様においては、本発明は、H.pylori核酸に相当するオープンリーディングフレームからなる発現システムを特徴とする。核酸はさらに、意図される宿主に適合性の制御配列からなる。発現システムはH.pylori核酸に相当するポリペプチドの作成に有用である。他の態様においては、本発明はH.pyloriポリペプチド製造のために発現システムでトランスフォームされた細胞を特徴とする。他の態様においては、本発明はH.pyloriポリペプチドに特異的に結合できるH. pyloriポリペプチドに対する抗体を発生させる方法を特徴とする。このような抗体はH.pylori特異的抗原の存在量および分布を評価するイムノアッセイの試薬として有用性を有する。他の態様においては、本発明はH.pyloriに対して個体を免疫処置するためのワクチンを産生させる方法を特徴とする。ワクチン接種方法には、対象を少なくとも１種の本発明のH.pyloriポリペプチド、たとえば表面もしくは分泌ポリペプチドまたはそれらの活性部分、および医薬的に許容される担体で免疫処置することが包含される。こようなワクチンは治療的および／または予防的な有用性を有する。他の態様においては、本発明は修飾された免疫原性H.pyloriポリペプチド、たとえば表面もしくは分泌ポリペプチドまたはそれらの活性部分、および医薬的に許容される担体からなるワクチンを産生させる方法を提供する。他の態様においては、本発明は、化合物、たとえばポリペプチドたとえば宿主細胞ポリペプチドのフラグメントを、H.pyloriポリペプチドを結合する能力について評価する方法を特徴とする。この方法は候補化合物をH.pyloriポリペプチドと接触させ、その化合物がH.pyloriポリペプチドを結合するかまたは相互作用するかを決定することを包含する。H.pyloriを結合する化合物はその細菌の生活環のアクティベーターまたはインヒビター候補である。これらのアッセイはインビトロまたはインビボにおいて実施することができる。他の態様においては、本発明は、化合物たとえばポリペプチドたとえば宿主細胞ポリペプチドのフラグメントを、H.pylori核酸たとえばＤＮＡまたはＲＮＡを結合する能力について評価する方法を特徴とする。この方法は、候補化合物をH. pylori核酸と接触させ、その化合物がH.pyloriポリペプチドを結合するかまたは相互作用するかを決定することを包含する。H.pyloriを結合する化合物は、その細菌の生活環のアクティベーターまたはインヒビター候補である。これらのアッセイは、インビトロまたはインビボにおいて実施することができる。本発明は、H.pyloriポリペプチド、好ましくは実質的に純粋なH.pyloriポリペプチドのプレパレーション、または組換えH.pyloriポリペプチドを特徴とする。好ましい実施態様においては、そのポリペプチドは生物活性を有し、そのポリペプチドは、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、98％または99％が同一または相同のアミノ酸配列、好ましくは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と約65％の配列同一性を有し、特に好ましくは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と約 92％〜約99％の配列同一性を有し、そのポリペプチドは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、そのポリペプチドの長さは、少なくとも５、10、20、50、100または150のアミノ酸残基、少なくとも５、好ましくは少なくとも10、さらに好ましくは少なくとも20、特に好ましくは少なくとも50、100または150の配列表に含まれる本発明の連続したアミノ酸残基を有する。さらに他の好ましい実施態様においては、配列表に含まれる本発明のH.py loriアミノ酸配列と配列同一性が約７％〜８％まで相違するアミノ酸配列も本発明に包含される。好ましい実施態様においては、H.pyloriポリペプチドは配列表に含まれる本発明の核酸または配列表に含まれる本発明の核酸と少なくとも60％、70％、80％、 90％、95％、98％もしくは99％のホモロジーを有する核酸によりコードされる。好ましい実施態様においては、対象のH.pyloriポリペプチドは配列表に含まれる本発明の配列と１、２、３、５、10またはそれ以上の残基においてアミノ酸配列が異なる。しかしながらその相違はH.pyloriポリペプチドがH.pyloriの生物活性を発揮し、たとえばH.pyloriポリペプチドは天然に存在するH.pyloriポリペプチドの生物活性を維持する。好ましい実施態様においては、ポリペプチドは、付加的なアミノ酸残基、好ましくは配列表に含まれる本発明の配列をコードするゲノムＤＮＡに対し5'または 3'のゲノムＤＮＡによってコードされている残基にリーディングフレームで融合した、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列の全配列またはフラグメントを包含する。さらに他の好ましい実施態様においては、H.pyloriポリペプチドは、第１のH. pyloriポリペプチド部分と、第２のポリペプチド部分たとえばH.pyloriに無関係なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド部分をもつ組換え融合タンパク質である。第２のポリペプチド部分は、たとえばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメインまたはポリメラーゼ活性化ドメインとすることができる。好ましい実施態様においては、融合タンパク質は二ハイブリッドアッセイに使用することができる。本発明のポリペプチドは、可変転写現象、可変ＲＮＡスプライシング現象、ならびに可変翻訳現象および可変翻訳後現象の結果として生じるポリペプチドを包含する。本発明はまた、免疫原性プレパレーション中に少なくとも１種のH.pyloriポリペプチドを含む免疫原性成分を包含し、この場合、免疫原性成分はH.pyloriポリペプチドに特異的な免疫応答、たとえば体液性応答、抗体応答または細胞応答を誘発できる。好ましい実施態様においては、免疫原性成分は配列表に含まれる本発明のポリペプチドからの少なくとも１種の抗原決定基からなる。他の態様においては、本発明は、H.pyloriポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸を提供する。好ましい実施態様においては、コードされたポリペプチドは生物活性を有し、コードされたポリペプチドは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列に対して少なくとも60％、70％、80％、90 ％、95％、98％もしくは99％が相同のアミノ酸配列を有し、コードされたポリペプチドは配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、コードされたポリペプチドの長さは少なくとも５、10、20、50、100または150のアミノ酸であり、コードされたポリペプチドは少なくとも５、好ましくは少なくとも10、さらに好ましくは少なくとも20、特に好ましくは少なくとも 50、100または150の配列表に含まれる本発明の連続したアミノ酸配列からなる。好ましい実施態様においては、本発明の核酸は配列表に含まれる核酸である。核酸は、配列表に含まれる本発明の核酸配列と少なくとも60％、70％、80％、90 ％、95％、98％もしくは99％が相同である。好ましい実施態様においては、コードされたH.pyloriポリペプチドは、配列表に含まれる本発明の配列から１、２、３、５、10またはそれ以上の残基においてアミノ酸配列が異なっている（たとえば、アミノ酸置換、少なくとも１個のアミノ酸残基の付加または欠失による）。しかしながら、その差はH.pyloriによってコードされるポリペプチドがH.pyloriの生物活性を発揮し、たとえばコードされたH.pylori酵素が天然に存在するH.pyloriの生物活性を維持するような相違である。好ましい実施態様においては、コードされたポリペプチドは、付加的なアミノ酸残基、好ましくは配列表に含まれる本発明の配列をコードするゲノムＤＮＡに対し5'または3'のゲノムＤＮＡによってコードされている残基にリーディングフレームで融合した、配列表に含まれる本発明のアミノ酸配列の全配列またはフラグメントを包含する。好ましい実施態様においては、対象のH.pylori核酸は転写調節配列、たとえば少なくとも１種の転写プロモーターまたは転写エンハンサー配列を包含し、この配列はH.pylori遺伝子配列の組換え宿主細胞内における発現に適するようにH.py lori遺伝子配列に実施可能なように連結される。さらに他の好ましい実施態様においては、本発明のH.pyloriポリペプチドをコードする核酸は、配列表に含まれる本発明の少なくとも８個の連続的ヌクレオチド、好ましくは配列表に含まれる本発明の少なくとも12個の連続的ヌクレオチド、さらに好ましくは配列表に含まれる本発明の少なくとも20個の連続的ヌクレオチド、特に好ましくは配列表に含まれる本発明の少なくとも40個の連続的ヌクレオチドに相当する核酸プローブに緊縮条件下ハイブリダイズする。好ましい実施態様においては、核酸は、配列表に含まれる本発明の配列から少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるペプチドをコードする。好ましい実施態様においては、核酸は、配列表に含まれる本発明のアミノ酸をコードする配列表に含まれる本発明のヌクレオチド配列から少なくとも１個のヌクレオチドが異なる。他の態様においては、本発明は、H.pyloriポリペプチドまたは本明細書に記載のH.pyloriポリペプチドの変異体をコードする核酸を含有するベクター；そのベクターでトランスフェクトされた宿主細胞；およびその細胞をたとえば細胞培養培地中で培養し、H.pyloriまたはH.pyloriポリペプチド変異体をたとえば細胞または細胞培養培地から単離することを含む組換えH.pyloriポリペプチドまたはH. pyloriポリペプチド変異体の製造方法を包含する。他の態様においては、本発明は、配列表に含まれる本発明の配列と少なくとも 50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％または99％のホモロジーを有する精製された組換え核酸を特徴とする。本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーを提供する。このオリゴヌクレオチドは、配列表に含まれる本発明のセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも８個の連続的ヌクレオチドに緊縮条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域、またはその天然に存在するそれらの突然変異体を包含する。好ましい実施態様においては、プローブまたはプライマーはさらにそれらに結合した標識グループを包含する。標識グループはたとえば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素および／または酵素補因子とすることができる。オリゴヌクレオチドの長さは好ましくは、少なくとも８で、10、20 、30、50、100または150ヌクレオチド未満である。本発明はまた、配列表に含まれる核酸に緊縮ハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズする核酸によってコードされる単離されたH. pyloriポリペプチドを提供する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸たとえばＲＮＡまたはＤＮＡを提供する。これには、二本鎖核酸ならびにコードおよびアンチセンス一本鎖が包含される。そのゲノム配列が配列決定されたH.pylori株はHP-J99としてAmerican Type Cu lture Collectionに寄託された（ATCC # 55679；Genome Therapeutics Corporat ion，100 Beaver Street，Waltham，MA 02154により寄託）。本発明には、対立遺伝子変異体；天然の突然変異体；誘発突然変異体；配列表に含まれる本発明のポリペプチドをコードする核酸に、高または低緊縮条件下にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質（高および低緊縮条件の定義についてはCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley & S ons，New York，1989，6.3.1-6.3.6および6.4.1-6.4.10参照，引用により本明細書に導入される）；およびH.pyloriポリペプチドに対する抗血清、特にH.pylori ポリペプチドの活性部位または結合ドメインに対する抗血清によって特異的に結合されるポリペプチドが包含される。本発明はまた、フラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメントを包含する。これらのおよび他のポリペプチドはまた、本明細書においては、H.pyloriポリペプチド類縁体または変異体としても言及される。推定される機能は表１に示すように本発明のH.pyloriポリペプチド数種について決定された。したがって特許請求されたH.pyloriポリペプチドの、これらの同定された機能および本明細書に記載の他の機能に基づく使用も本発明の範囲内に包含される。さらに、本発明には以下の表１に示されるような特徴を有するH.pyloriポリペプチド、たとえばH.pylori細胞エンベロープタンパク質、H. pylori分泌タンパク質、およびH.pylori細胞性タンパク質が包含される。これらの群のメンバーは、BLASTホモロジー検索ならびに分泌シグナルまたは膜貫通タンパク質モチーフの検索によって同定された。表１のポリペプチドと有意なホモロジーによって類似するポリペプチドは表１に示されるホモロジーの様式で分類することも考えられる。表１中、ntはヌクレオチドの配列番号を、aaはアミノ酸の配列番号を示す。定義「精製されたポリペプチド」および「単離されたポリペプチド」および「ポリペプチドの実質的に純粋なプレパレーション」なる用語は本明細書においては互いに交換可能に使用され、本明細書において用いられるように、それとともに天然に存在する他のタンパク質、脂質および核酸から分離されているという意味である。好ましくはポリペプチドはまた、その精製に使用される物質たとえば抗体またはゲルマトリックスたとえばポリアクリルアミドからも分離される。好ましくはポリペプチドは精製されたプレパレーションの乾燥重量の少なくとも10、20 、50、70、80または95％を構成する。好ましくは、プレパレーションはタンパク質の配列決定を可能にする十分なポリペプチド、少なくとも１、10または100μg のポリペプチド、少なくとも１、10または100mgのポリペプチドを含有する。さらに、本明細書において用いられる「精製されたポリペプチド」および「単離されたポリペプチド」および「ポリペプチドの実質的に純粋なプレパレーション」なる用語は、天然から得られたポリペプチドまたは本明細書に記載の組換えＤＮＡ技術により産生されたポリペプチドの両者を指して用いられる。たとえば、「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、細胞性物質またはH.pyloriタンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、またそれが化学的に合成された場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」なる用語は、タンパク質は、それが単離されたまたは組換えにより産生された細胞の細胞成分から分離されているH.pyloriタンパク質のプレパレーションを包含する。一実施態様においては「細胞性物質を実質的に含まない」なる用語は約30％（乾燥重量に対して）未満の非H.pyloriタンパク質（本明細書においては「夾雑タンパク質」ともいう）、好ましくは約20％未満の非H.pyloriタンパク質、さらに好ましくは約10％未満の非H.pyloriタンパク質、特に好ましくは約５％未満の非H.pyloriタンパク質を含有するH.pyloriタンパク質のプレパレーションを包含する。H.pyloriタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換えによって製造された場合は、それはまた培養培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培養培地の存在はタンパク質プレパレーションの容量の約20％未満、さらに好ましくは約10％未満、特に好ましくは約５％未満である。「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」なる用語は、タンパク質がそのタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されているH.pyloriタンパク質のプレパレーションを包含する。一実施態様においては「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」なる用語は約 30％（乾燥重量に対して）未満の化学的前駆体または非H.pylori化学物質、好ましくは約20％未満の化学的前駆体または非H.pylori化学物質、さらに好ましくは約10％未満の化学的前駆体または非H.pylori化学物質、特に好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非H.pylori化学物質を含有するH.pyloriタンパク質のプレパレーションを包含する。細胞の精製されたプレパレーションとは、植物または動物細胞の場合、細胞のインビトロプレパレーションを意味し、無傷の全植物または動物ではない。培養された細胞または微生物細胞の場合、それは少なくとも10％、さらに好ましくは 50％の対象細胞のプレパレーションから構成される。精製されたもしくは単離されたまたは実質的に純粋な核酸、たとえば実質的に純粋なＤＮＡ（これらの用語は本明細書においては互いに交換可能に使用される）は以下の一つまたは両者の核酸である。すなわち、核酸が由来する生物体の天然に存在するゲノム中で直接連続するコード配列の両者に（すなわち一つは5'末端に一つは3'末端に）直接連続しないか、または核酸が由来する生物体中に存在する核酸を実質的に含まない核酸である。この用語はたとえば、ベクターたとえば自動的に複製するプラスミドもしくはウイルス、あるいは原核性もしくは真核性または他のＤＮＡ配列とは独立に分離された分子（たとえばcDNA、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるゲノムDNAフラグメント）として存在するゲノムＤＮＡ内に導入された組換えＤＮＡを包含する。実質的に純粋なＤＮＡにはまた、付加的なH.py lori ＤＮＡ配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡも包含される。本明細書において使用される「コンティーグ」なる用語は、生物体のゲノム配列の連続ストレッチを表す核酸である。「オープンリーディングフレーム」は本明細書ではＯＲＦとも呼ばれ、ポリペプチドをコードする核酸の領域である。この領域はコード配列または全配列の部分を示し、停止コドンから停止コドンまたは開始コドンから停止コドンを決定することができる。本明細書において用いられる「コード配列」なる用語は、適当な調節配列の制御下に配置された場合、メッセンジャーＲＮＡへの転写および／またはポリペプチドへの翻訳を受ける核酸である。コード配列の境界は５つのプライム末端における翻訳開始コドンおよび３つのプライム末端における翻訳停止コードによって決定される。コード配列にはメッセンジャーＲＮＡ、合成ＤＮＡ、および組換え核酸配列が包含されるが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いられる核酸の「相補体」なる用語は、元の配列とのワトソン− クリック塩基対に関与するアンチパラレルまたはアンチセンス配列を意味する。「遺伝子産物」は遺伝子によって特異的にコードされるタンパク質または構造ＲＮＡである。本明細書において用いられる「プローブ」なる用語は、関心分子に特異的に結合する核酸、ペプチドまたは他の化学的実体を意味する。プローブは多くの場合、標識と結合しているかまたは標識と結合できる。標識は検出可能な化学的部分である。典型的な標識は染料、放射性同位元素、ルミネッセンスおよび化学ルミネッセンス部分、蛍光原、酵素、沈殿剤、増幅配列等からなる。同様に関心分子に特異的に結合し、このような分子を固定化する核酸、ペプチドまたは他の化学的実体は本明細書においては「捕獲リガンド」と呼ばれる。捕獲リガンドは通常、支持体たとえばニトロセルロース、ガラス、ナイロン膜、ビーズ、粒子等に結合しているかまたはそれらと結合することができる。ハイブリダイゼーションの特異性はたとえばヌクレオチドの塩基対組成ならびに反応の温度および塩濃度のような条件に依存する。これらの条件は通常の実験を用いて当業者には容易に認識できる。相同性とは２つのポリペプチドまたは２つの核酸分子の間の配列類似性または配列同一性を意味する。比較した２つの配列の両者における位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占拠されている場合、たとえば２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占められている場合、その分子はその位置において相同である。２つの配列の間のホモロジーの百分率は、２つの配列がともに有するマッチしたまたは相同の位置の数を比較した位置の数で除して100倍した関数である。たとえば２つの配列中10個の位置の６個がマッチしているかまたは相同の場合には、２つの配列は60％のホモロジーを有する。例を挙げればＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは50％のホモロジーを有する。一般に、比較は２つの配列を最大のホモロジーを与えるようにアラインして行われる。核酸の少なくとも１個の鎖が、所定の緊縮条件下に他の核酸にアニーリングできる場合、両核酸は互いにハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションの緊縮度は、（ａ）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が行われる温度、ならびに（ｂ）ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液のイオン強度および極性によって決定される。ハイブリダイゼーションには２つの核酸が相補性の配列を含有することを必要とし、しかしながら、ハイブリダイゼーションの緊縮度によってはミスマッチも許容し得る。通常、高緊縮度（たとえば、0.5×SSCの溶液中65℃）における２つの配列のハイブリダイゼーションは配列が本質的に完全に相同であることを要求する。中間の緊縮度（たとえば２×SSC、65℃）および低緊縮度（たとえば、２×SSC、55℃）の条件では、ハイブリダイズする配列の間には、相応してより低い全体的な相補性が要求される（１×SSCは、0.15Ｍ NaCl、0.015Ｍクエン酸ナトリウム）。緊縮ハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例には６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)、約45℃におけるハイブリダイゼーション、ついで0.2×SSC、0 .1％SDS、50〜65℃における１回またはそれ以上の洗浄である。ペプチド、タンパク質およびポリペプチドなる用語は本明細書においては互いに交換可能に使用される。．本明細書で用いられる「表面タンパク質」なる用語は、表面に接近可能なすべてのタンパク質、たとえば内膜および外膜タンパク質、細胞壁に接着するタンパク質ならびに分泌タンパク質を意味する。ポリペプチドは、１つ、２つおよび好ましくはそれ以上の以下の性質をもつ場合にはH.pylori生物活性を有する。それらの性質は（１）H.pylori感染の過程で発現された場合、細胞へのH.pyloriの付着を促進または誘導する；（２）H.pylo riタンパク質に特徴的な酵素活性、構造または調節機能を有する；（３）ポリペプチドをコードする遺伝子はH.pylori遺伝子における致死的突然変異をレスキューできる；（４）患者に免疫原性である。ポリペプチドは上に掲げた性質の１つを有するポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニストまたはスーパーアゴニストである場合には生物活性を有する。生物学的に活性なフラグメントまたは類縁体とは、配列表に含まれる本発明のH.pyloriポリペプチドまたは他の天然に存在するH.pyloriポリペプチドに特徴的なインビボまたはインビトロ活性、たとえば、本明細書に記載の１種または２種以上の生物活性を有するフラグメントもしくは類縁体である。インビボに存在するフラグメント、たとえば、転写後プロセッシングからまたは別のスプライシングを受けたＲＮＡの翻訳から生じるフラグメントが特に好ましい。フラグメントには未変性のまたは内因性の細胞中で発現されるフラグメントならびに発現システムたとえばＣＨＯ細胞中において作成されるフラグメントが包含される。H.pyloriポリペプチドのようなペプチドは、しばしばある範囲の生理学的性質を示すことから、またこのような性質は分子の異なる部分に起因する可能性があることから、有用なH.pyloriフラグメントまたはH.pylori類縁体は、H.pylori活性の任意の生物学的アッセイにおいて生物活性を示すフラグメントまたは類縁体である。特に好ましいフラグメントまたは類縁体はインビボまたはインビトロアッセイにおいて、10％、好ましくは40％、特に好ましくは60％、70％、80％もしくは90％またはそれ以上のH.pylori活性を有する。類縁体は天然に存在するH.pyloriポリペプチドとアミノ酸配列においてもしくは配列が関与しない様式でまたはその両者によって相違する。非配列修飾にはアセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル化の変化が包含される。好ましい類縁体には、その配列が、H.pyloriポリペプチドの生物活性を実質的に減弱させることがない１個もしくは２個以上の同類アミノ酸置換または１個もしくは２個以上の同類アミノ酸置換、欠失もしくは挿入によって野生型配列とは異なるH.pyloriポリペプチド（またはそれらの生物学的に活性なフラグメント）が包含される。同類置換には通常、あるアミノ酸の類似の特性を有する他のアミノ酸による置換、たとえばバリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン：セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンのような群内での置換が包含される。他の同類置換は以下の表を参照することができる。本発明に含まれる他の類縁体には、ペプチドの安定性を上昇させる修飾を有する類縁体がある。このような類縁体はたとえば、１個または２個以上の非ペプチド結合（ペプチド結合を置換する）をペプチド配列中に含有していてもよい。同じく、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、たとえばＤ−アミノ酸もしくは天然に存在しないまたは合成のアミノ酸たとえばβまたはγアミノ酸、および環状類縁体が包含される。本明細書において用いられる「フラグメント」なる用語は、H.pylori類縁体に適用された場合、通常その長さが少なくとも約20個の残基、より典型的には少なくとも約40個の残基、好ましくは少なくとも約60個の残基である。H.pyloriポリペプチドのフラグメントは当業者には周知の方法によって発生させることができる。H.pyloriポリペプチドの生物活性を発揮する候補フラグメントの能力は本明細書に記載するように、当業者に周知の方法によって評価することができる。ペプチドの生物活性に不要の残基または別のｍＲＮＡスプライシングもしくは別のタンパク質プロセッシング現象から生じた残基を含有するH.pyloriポリペプチドも本発明に包含される。本明細書で用いられる「免疫原性成分」とは、単独でまたはアジュバントとの組合せで、宿主動物において体液性および／または細胞免疫反応を誘発できるH. pyloriポリペプチド、その類縁体またはフラグメントのような部分である。本明細書で用いられる「抗原性成分」とは、特異的な抗体に十分高い親和性で結合して検出可能な抗原−抗体複合体を形成できるH.pyloriポリペプチド、その類縁体またはフラグメントのような部分である。本明細書で用いられる「導入遺伝子」なる用語は、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的にまたは完全に異種外来性、またはそれが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子に相同であるが、それが挿入される細胞のゲノムを変えるような方法で細胞のゲノムに挿入される（たとえば、天然の遺伝子とは異なる位置に挿入されるかまたはその挿入がノックアウトを生じる）ように設計されているかまたは挿入される、すなわち、核酸（たとえば、１種または２種以上のポリペプチドをコードする）を意味する。導入遺伝子は選択された核酸の至適発現のために必要な、選択された核酸にすべて実施可能なように連結する１種もしくは２種以上の転写調節配列および他の核酸たとえばイントロンを包含することが可能で、またエンハンサー配列を包含していてもよい。本明細書で用いられる「トランスジェニック細胞」なる用語は導入遺伝子を含有する細胞を意味する。本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」なる用語は動物の細胞の１つまたは２つ以上、好ましくは本質的にすべての細胞が導入遺伝子を含む動物を意味する。導入遺伝子は細胞に、直接的にまたは細胞の前駆体への導入により間接的に、計画的な遺伝子操作により、たとえばコンピテント細胞の形質転換方法もしくはマイクロインジェクションにより、または組換えウイルスの感染によって導入することができる。この分子は染色体内にインテグレートされてもよく、また染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。本明細書で用いられる「抗体」なる用語は、H.pyloriポリペプチドと特異的に反応するそのフラグメントを包含することを意図するものである。本明細書で用いられる「細胞特異的プロモーター」なる用語は、プロモーターとして働くＤＮＡ配列、すなわちプロモーターに実施可能なように連結した選択されたＤＮＡ配列の発現を調節し、特異的な組織細胞において選択されたＤＮＡ配列の発現を行うＤＮＡ配列を意味する。この用語はまた、ある組織での選択されたＤＮＡの発現を主として調節するが、他の組織でも発現を起こさせる、いわゆる「漏出」プロモーターも含んでいる。本明細書で用いられる「異常発現」とは非野生型パターンの遺伝子発現を意味する。それには、非野生型レベル、すなわち過剰または過少発現、遺伝子が発現する時期または段階の点で野生型とは異なる発現のパターン、たとえば所定の発生時期または段階における（野生型と比較して）増大または低減した発現、所定の細胞型または組織型における（野生型と比較して）低減した発現の点で野生型とは異なる発現パターン、発現したポリペプチドのスプライシングサイズ、アミノ酸配列、転写後修飾または生物活性の点で野生型とは異なる発現パターン、遺伝子の発現に対する環境刺激または細胞外刺激の効果の点で野生型とは異なる発現パターン、たとえば増大または低下した刺激強度の存在下における（野生型と比較して）増大または低減した発現パターンが包含される。本明細書で用いられる「宿主細胞」、および単細胞体として培養される微生物または高等真核細胞系を意味する他のこの種の用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのレシピエントになることができるかまたはレシピエントとして使用された細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。当業者には理解されるように、単一の親細胞の子孫は、偶発的または計画的な突然変異により、元の親細胞に相補的なゲノムまたは総ＤＮＡは必ずしも完全に同一ではない。本明細書で用いられる「制御配列」なる用語は、それらがライゲートされたコード配列の発現を行う宿主細胞により認識される塩基配列を有する核酸を意味する。このような制御配列の性質は宿主生物に依存して異なる。原核細胞においては、このような制御配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によってはオペレーターを包含する。真核細胞においては一般的に、このような制御配列はプロモーター、ターミネーター、および場合によりエンハンサーを包含する。制御配列なる用語は最小限、その存在が発現に必要なすべての成分を包含することを意図するものであり、その存在が有利である付加的な成分たとえばリーダー配列を包含してもよい。本明細書で用いられる「実施可能なように連結」なる用語は、それらが意図する様式で機能するように配列を接合またはライゲートすることを意味する。たとえば制御配列は、コード配列の発現が制御配列および宿主細胞に適合する条件下に達成されるように、ライゲーションによりコード配列に実施可能なように連結される。本明細書で用いられる物質の代謝とは、物質の発現、機能、作用または調節の任意の局面を意味する。物質の代謝には、その物質が他の物質において誘導する修飾たとえば物質の共有結合または非共有結合による修飾を包含する。物質の代謝にはまた、物質の分布変化が包含される。物質の代謝にはその物質が誘導する他の物質の分布変化も包含される。本明細書で用いられる「サンプル」なる用語は、生物学的サンプルたとえば個体から単離される組織または液体（それらに限定されるものではないが、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、涙液、唾液および組織切片）またはインビトロ細胞培養構成成分、ならびに環境からのサンプルを意味する。本発明の実施に際しては、特に他の指示がない限り、当業者の技術の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用技術が採用される。このような技術は、文献に完全に説明されている。たとえば、Sambrook ，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning;Laboratory Manual 2nd ed．(1989) ;DNA Cloning，Volumes I & II(D．N．Glover ed．1985);Oligonucleotide Synt hesis(M．J．Gait ed．1984);Nucleic Acid Hybridization(B．D．Hames & S．J ．Higgins ed．1984);Methods in Enzymology（Academic Press，Inc.）のシリーズ、特にVol.154 & Vol.155（Wu & Grossman ed.）およびPCR-A Practical Ap proach（McPherson，Quirke & Taylor，ed．1991）参照。 I．H.pylori の核酸の単離およびそれらの使用 H.pylori のゲノム配列本発明は、H.pyloriのゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列ライブラリーからなるH.pylo riゲノムのヌクレオチド配列を提供する。以下の詳細な記載はH.pyloriのヌクレオチド配列を提供し、またこの配列の取得方法ならびにＯＲＦおよびタンパク質コード配列の同定方法を説明する。また、開示されたH.pylori配列の使用方法たとえば診断および治療への適用方法が説明される。さらに、ライブラリーはこのおよび他のH.pylori株の医学的に重要な配列の同定および比較のためのデータベースとして使用できる。 H.pyloriのゲノム配列を決定するためには、H.pylori株（ATCC # 55679;Genom e Therapeutics Corporation，100 Beaver Street，Waltham，MA02154により寄託）からＤＮＡを単離し、噴霧により機械的に中央サイズ2kbに剪断した。ゲル電気泳動によってサイズ分画したのち、フラグメントをブラント末端化し、アダプターオリゴヌクレオチドにライゲートし、20種の異なるpMPXベクター（Riceら，abstract of Meeting of Genome Mapping and Sequencing，Cold Spring Harb or，NY，5/11-5/15，1994，p.225）にクローン化して一連の「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。ＤＮＡの配列決定はChurchら（Science 240:185，1988;米国特許4,942,124および5,149,625）により開示されたマルチプレックス配列決定操作に本質的に従い実施した。ＤＮＡをプールした培養液から抽出し、化学的または酵素的配列決定に付した。配列決定反応混合物を電気泳動により分割し、生成物をナイロン膜に移して共有結合させた。最後に膜を、異なるショットガンクローニングベクター中に存在する「タグ」配列に相補性の一連の標識オリゴヌクレオチドと順次ハイブリダイズさせた。この方法により、単一セットの配列決定反応から多数の配列を得ることができた。クローニングおよび配列決定操作はさらに詳細に実験例で説明する。この方法により得られた個々の配列の読みを、FALCON（登録商標）プログラム（Churchら，1994，Automated DNA Sequencing and Analysis，J．C．Ven tered.，Academic Press）、およびPHRAP（P．Green，Abstracts of DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop，V，Jan．1996，p.157）を用いアセンブルした。コンティーグの平均の長さは約３〜４kbであった。全H.pyloriゲノムを提供する連続した配列が得られるようにコンティーグを順番に並べるためには様々な方法が使用される。各コンティーグの末端における配列に相補性の合成オリゴヌクレオチドを設計する。これらのオリゴヌクレオチドは、たとえばλファージベクターまたはプラスミドベクター中のH.pyloriゲノムＤＮＡのライブラリーにハイブリダイズし、個々のコンティーグの間の接合領域に相当する配列を含むクローンを同定する。このようなクローンはついで鋳型ＤＮＡの単離に使用し、また同じオリゴヌクレオチドは接合部フラグメントを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてプライマーとして使用され、ついでそのヌクレオチド配列が決定される。 H.pylori配列は少なくとも180個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレーム（ORF）の存在について分析した。ＯＲＦの分析の結果は停止−停止コドンの読みに基づくので、これらのＯＲＦは、天然に存在するH.pyloriポリペプチドのＯＲＦに相当しない場合があることを理解すべきである。これらのＯＲＦは天然に存在するH.pyloriポリペプチドのタンパク質合成の開始を指示する開始コドンを含有する可能性がある。ここで与えられたＯＲＦ内のこのような開始コドンは当業者によれば同定が可能であり、得られたＯＲＦおよびコードされる H.pyloriポリペプチドは本発明の範囲内に包含される。たとえばＯＲＦには、タンパク質合成の開始シグナルの部分であるコドンたとえばＡＵＧまたはＧＵＧ（メチオニンまたはバリンをコードする）が同定可能であり、ＯＲＦは天然に存在するH.pyloriポリペプチドに相当するように修飾できる。予測されるコード領域はこのような配列のコードの可能性をプログラムGENEMARK（登録商標； Borodovsky & McIninch，Comp．Chem，17:123，1993）を用いて評価することにより定められた。他のH.pylori核酸本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用い上述のH.pylori株のＤＮＡから直接得られる。ＰＣＲに関する詳細については“PCR，A PracticalAppr oach”（McPherson，Quirke & Taylor ed.，IRL Press，Oxford，UK，1991）を参照されたい。忠実度の高いＰＣＲは発現に先立ち正確なＤＮＡコピーを確実にするのに使用することができる。さらに、増幅された産物の信頼性は慣用の配列決定法でチェックすることができる。本発明に記載された所望の配列を有するクローンは、ＰＣＲによるライブラリーのスクリーニング、または本技術分野において周知のように、ライブラリーコロニーまたはプラークのフィルターリフトへの合成オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによっても得ることができる（たとえばSambrookら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2 nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Press，NYを参照）。 H.pyloriポリペプチドをコードする核酸はまた本明細書に記載のプロトコールに従いｃＤＮＡライブラリーからも得ることができる。H.pyloriポリペプチドをコードするｃＤＮＡは適当な株から総ｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。二本鎖ｃＤＮＡは、ついで総ｍＲＮＡから調製できる。ついで、多くの既知技術のいずれかを用い、ｃＤＮＡは適当なプラスミドまたはウイルス（たとえばバクテリオファージ）ベクターに挿入することができる。H.pyloriポリペプチドをコードする遺伝子はまた、本発明によって提供されるヌクレノオチド配列情報に従い確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてクローン化することができる。本発明の核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。本発明の好ましい核酸は配列表に含まれる。本発明の核酸はまた、標準技術を用いて化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られている。たとえばペプチド合成と同様に、市販のＤＮＡ合成装置により完全に自動化されている固相合成が含まれる（たとえば、Itakuraら，米国特許4,598,049;Caruthersら，米国特許4,458,066;ならびにItakuraら，米国特許4,401,796および4,373,071参照，引用により本明細書に導入される）。本発明の特徴に従って単離または合成された核酸は、それらに限定されるものではないが、たとえばプローブ、プライマー、捕獲リガンド、アンチセンス遺伝子としてならびにそれらの配列に相当するタンパク質およびペプチドの合成のための発現系の開発に有用である。プローブ、プライマー、捕獲リガンドおよびアンチセンス剤としては、核酸は通常、配列表に含まれる本発明の核酸のすべてまたは部分（特異性および安定なハイブリダイゼーション産物の形成能力のための約20またはそれ以上のヌクレオチド）から構成される。これらの使用については以下にさらに詳細に説明する。プローブ単離された核酸または配列表に含まれる本発明の配列に従い合成された核酸は H.pyloriを特異的に検出するプローブとして使用することができる。本出願に挙げられた配列情報により、H.pyloriおよびハイブリダイゼーション条件時に遭遇すると思われる外来性核酸に関して所望の包括性と排他性を提供する20またはそれ以上のヌクレオチドの配列が同定される。さらに好ましくは、配列は、プローブと意図された標的分子間で形成されるハイブリダイゼーション産物に安定性を付与する少なくとも20〜30のヌクレオチドからなる。長さ1000ヌクレオチドを越える配列の合成は困難であるが、組換えＤＮＡ技術によって生成させることができる。当業者には、プローブとして使用する核酸がハイブリダイゼーション産物の検出を容易にする標識を提供できることは容易に理解されるであろう。単離された核酸または配列表に含まれる本発明の配列に従って合成された核酸は、本明細書に記載された適当な緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いて他のヘリコバクター種の相同性領域（特に相同の遺伝子）の検出のためのプローブとしても利用することもできる。捕獲リガンド捕獲リガンドとしての使用のためにはプローブに関して上述した方法で選択された核酸は支持体に容易に結合させることができる。核酸を支持体と結合させる方法はよく知られている。配列表に含まれる本発明の配列中の20またはそれ以上のヌクレオチドを有する核酸は、互いのおよび他の生物体の核酸からH.pylori核酸を分離するのに利用できる。配列表に含まれる本発明の配列中の20またはそれ以上のヌクレオチドを有する核酸はまた、互いのおよび他の生物体から他のヘリコバクター種を分離するのにも利用できる。好ましくは配列は、プローブと意図された標的分子間で形成されるハイブリダイゼーション産物に安定性を付与する少なくとも20個のヌクレオチドからなる。長さ1000ヌクレオチドを越える配列は合成が困難であるが、組換えＤＮＡ技術により発生させることができる。プライマー単離された核酸または本明細書に記載された配列に従って合成された核酸は、 H.pylori核酸の増幅のためのプライマーとして使用することができる。これらの核酸は他のヘリコバクター種における核酸の増幅のためのプライマーとしても使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術に関しては、配列表に含まれる本発明の≧10〜15ヌクレオチドの核酸配列は適当な酵素および試薬とともにH.pylori核酸のコピーの創成に使用することができる。さらに好ましくは、配列はプライマーと意図された標的分子間で形成されるハイブリダイゼーション産物に安定性を付与する20またはそれ以上のヌクレオチドからなる。100以上のヌクレオチドのプライマーの結合条件を特異性が得られるように制御することはさらに困難である。忠実度の高いＰＣＲは、発現の前に正確なＤＮＡコピーを確実にするのに使用することができる。さらに、増幅された産物は慣用の配列決定法でチェックすることができる。コピーは、H.pyloriおよび／または他のヘリコバクター種からの遺伝子を包含する特異的な配列を検出する診断的アッセイに使用できる。コピーはまた、本明細書にさらに詳細に説明されるように、ＰＣＲによって合成される核酸に相当するポリペプチドを生成させるためにクローニングおよび発現ベクターに導入することができる。アンチセンス核酸または本明細書に記載の配列に従って単離されたまたは合成された核酸ハイブリダイズ誘導体は、H.pylori遺伝子の発現を防止するアンチセンス剤としての有用性を有する。これらの配列はまた、他のヘリコバクター種の遺伝子の発現を防止するアンチセンス剤としての有用性も有する。一実施態様においては、核酸またはH.pylori核酸に相当する誘導体は適当な担体たとえばリポソームまたはバクテリオファージに負荷して細菌細胞中に導入される。たとえば、20個またはそれ以上のヌクレオチドを有する核酸は細菌核酸または細菌メッセンジャーＲＮＡに結合することができる。好ましくは、アンチセンス核酸は天然には存在しない核酸と細菌核酸および／または細菌メッセンジャーＲＮＡのハイブリダイゼーション産物に必要な安定性を提供する20個またはそれ以上のヌクレオチドからなる。長さ1000ヌクレオチドを越える配列を有する核酸を合成するのは困難であるが、組換えＤＮＡ技術によって生成させることができる。アンチセンス核酸をリポソームに負荷する方法については、たとえば、Pa pahadjopoulosらの1980年12月23日に付与された米国特許4,241,046に例示されているように、本技術分野において周知である。 II．H.pylori 核酸の発現単離された核酸または本明細書で記載された配列に従って合成された核酸はポリペプチドの生成に有用性を有する。配列表に例示された本発明の核酸またはH. pyloriポリペプチドの活性部分をコードする上記核酸のフラグメントは適当なベクター中へのクローン化または核酸の単離に使用することができる。単離された核酸は適当なＤＮＡリンカーと結合させ、適当なベクター中にクローン化する。特定の遺伝子またはオペロンの機能は、問題の遺伝子またはオペロンによって特定される遺伝子産物の活性が特異的に測定できる条件下に細菌株中で発現させて確認することができる。別法として遺伝子産物を、抗原、工業用試薬として、また構造研究等に使用するため、発現株中で大量に産生させる。この発現は試験する遺伝子の活性を欠く突然変異株または同じ遺伝子産物を産生しない株で行われる。これには、それらに限定されるものではないが、他のヘリコバクター株または他の細菌株たとえばE.coli、Norcardia、Corynebacterium、Campylobacter 、およびStreptomyces種が包含される。一部の場合には発現宿主は天然のヘリコバクターのプロモーターを利用するが、他の場合には遺伝子を発現生物体に由来するプロモーター配列で促進する必要がある（たとえば、E.coli内での発現には E.coli β−ガラクトシダーゼプロモーター）。天然のH.pyloriプロモーターを用いて遺伝子産物を発現させるためには以下のような操作を使用することができる。すなわち、興味のある遺伝子をその関連の天然プロモーター要素および調節配列（ＤＮＡ配列データを用いて同定）とともに含有する制限フラグメントを、宿主細胞内で機能する複製の起源および適当な選択マーカーを含有する適当な組換えプラスミド中にクローン化する。これは当業者には周知の多くの操作によって達成できる。それはプラスミドおよびクローン化するフラグメントの切断を同一の制限酵素によって実施して、２つの切片をライゲートさせて互いに結合させることができる適合性の末端を産生させることによるのが最も好ましい。組換えプラスミドはたとえばエレクトロポレーションによって宿主生物体に導入し、組換えプラスミドを含有する細胞はプラスミド上のマーカーによる選択で同定する。所望の遺伝子産物の発現はその遺伝子産物に特異的なアッセイを用いて検出する。異なるプロモーターを要求する遺伝子の場合には遺伝子の本体（コード配列）を特別に切断し、適当な発現プラスミドにクローン化する。このサブクローニングは数種の方法で実施できるが、特定のフラグメントのＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素またはエキソヌクレアーゼ処理によるクローニングに適当な末端の創成後の発現プラスミドへのライゲーションで達成するのが最も容易である。遺伝子の発現に適当な宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞とすることができる。たとえば、H.pyloriポリペプチドは細菌細胞たとえばE.coli、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、または哺乳動物細胞たとえばチャイニーズハムスター卵母細胞（CHO）中で発現させることができる。他の適当な宿主細胞は当業者には周知の通りである。真核細胞たとえば哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞における発現では、組換えペプチド産物の部分的もしくは完全なグリコシル化および／または関連の分子間もしくは分子内ジスルフィド結合鎖の形成を導くことが可能である。酵母 S.cerivisae中での発現のためのベクターの例には、pYepSecl（Baldariら，Embo J．6:229-234，1987）、pMFa（Kurjan & Herskowitz，Cell 30:933-943，1982 ）、pJRY88(Schultzら，Gene 54:113-123，1987)、pYES2（Invitrogen Corporat ion，San Diego，CA）が含まれる。培養された昆虫細胞（SF9細胞）内でのタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターにはpAcシリーズ（Smithら，Mol.Cell Biol．3:2156-2165，1983）およびpVLシリーズ(Lucklow,V.A．& Sum mers,M.D.，Virology 170:ｑ：31-39，1989)が包含される。一般には、COS細胞（Gluzman，Y.，Cell 23:175-182，1981）がpCDM8（Aruffo，A & Seed，B.，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 84:8573-8577，1987）のようなベクターとともに、哺乳動物細胞における一過性の増幅／発現に用いられ、一方、CHO（dhfr^- Chinese H amster Ovary）細胞は、pMT2PC（Kaufmanら，EMBO J．6:187-195，1987）のようなベクターとともに哺乳動物細胞における安定な増幅／発現に使用される。ベクターＤＮＡは、慣用技術たとえばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン誘導トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって哺乳動物の細胞に導入できる。宿主細胞の形質転換に適当な方法はSambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Edition，Co ld Spring Harbor Laboratory Press，1989）および他の実験用テキストに見出すことができる。原核細胞における発現は融合または非融合誘導性発現ベクターを用いてE.coli 内で行われることが最も多い。融合ベクターは通常、発現される標的遺伝子に多数のNH₂末端アミノ酸を付加する。これらのNH₂末端アミノ酸はレポーター基と呼ばれることが多い。このようなレポーター基は、通常２つの目的で有用である。すなわち、１）標的組換えタンパク質の溶解度を上昇させ、２）親和性精製におけるリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精製を補助する。多くの場合、融合発現ベクター中では、蛋白分解切断部位はレポーター基と標的組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製に続いて、レポーター基からの標的組換えタンパク質の分離を可能にする。このような酵素およびそれらの同種認識配列には、因子Xa、トロンビンおよびエンテロキナーゼが包含される。典型的な融合発現ベクターには、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合するpGEX(Amrad Corp.，Melbourne，Australia)、pMAL（New Eng land Biolabs，Beverly，MA）およびpRIT5（Pharmacia， Piscataway，NJ）がある。好ましいレポーター基は、タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端に融合可能で、組換え融合タンパク質の金属キレートクロマトグラフィーによる容易な精製を可能にするポリ(His)である。誘導性の非融合発現ベクターとしては、pTrc（Amannら，Gene 69:301-315，19 88）およびpET11d(Studierら，Gene Expression Technology:Methods in Enzymo logy 185，Academic Press，San Diego，California，60-89，1990）がある。一方、標的遺伝子の発現は、pTrc中ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存し、pET11d中に挿入された標的遺伝子の発現は、共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（T7 gn1）によって誘導されるT7 gn10-lac 0融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼはlacUV5プロモーターの転写制御下にT7 gn1を繋留する常在性λプロファージから、宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）によって供給される。たとえば、H.pyloriポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指図する核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ポリペプチドの発現を起こさせるのに適当な条件下に培養することができる。ポリペプチドは分泌され、ペプチドを含有する細胞および培地の混合物から単離される。あるいは、ポリペプチドは細胞質内に留まり、細胞を収穫して溶解し、タンパク質が単離される。細胞培養液には宿主細胞、培地および他の副生成物が包含される。細胞培養に適当な培地は本技術分野において周知である。本発明のポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞またはその両者からタンパク質の精製用の本技術分野において周知の技術、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、およびこのようなポリペプチドに特異的な抗体での免疫親和性精製によって単離することができる。さらに多くの場合、ポリペプチドは未変性のタンパク質の化学的切断（たとえばトリプシン消化）により製造し、切断生成物をついで標準技術によって精製することができる。膜結合タンパク質の場合には、これらは、膜結合タンパク質分画を可溶化された複合体を形成する界面活性剤と接触させることにより単離できる。この場合、膜結合タンパク質は最早膜分画には完全には埋没せず、それを膜分画からのクロマトグラフィーによって少なくとも単離可能な程度に可溶化される。これらの複合体の可溶化に適当な界面活性剤の選択には数種の異なる基準が用いられる。たとえば、考慮される１つの性質は、膜結合タンパク質の変性を、膜結合タンパク質の活性または機能がタンパク質の再構築時に回復できる最小限に抑えて、膜分画内でH.pyloriタンパク質を可溶化する界面活性剤の能力である。界面活性剤を選択する場合に考慮する他の性質は界面活性剤の臨界ミセル濃度（CMC）であり、選択する界面活性剤は再構築後の除去を容易にする高いＣＭＣ値を有することが好ましい。界面活性剤の選択に際し考慮する第３の性質は、界面活性剤の疎水性である。通常、膜結合タンパク質は著しく疎水性であり、したがって疎水性のタンパク質を可溶化するためには同じく疎水性の界面活性剤、たとえばトリトン系が有用である。界面活性剤に重要な他の性質は更なる精製を容易にする最小のタンパク質−タンパク質相互作用によってH.pyloriタンパク質を除去する界面活性剤の能力である。界面活性剤に考慮すべき第５の性質は、界面活性剤の電荷である。たとえば、精製過程でイオン交換樹脂の使用を所望の場合には、界面活性剤は、好ましくは非電荷の界面活性剤でなければならない。最終精製工程に使用できるクロマトグラフィー技術は本技術分野で周知であり、たとえば、疎水性相互作用、レクチン親和性、イオン交換、色素親和性および免疫親和性クロマトグラフィーがある。 E.coliにおける組換えH.pyloriペプチドの発現を最大にする戦略の一つは組換えタンパク質を蛋白質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌におけるタンパク質の発現である（Gottesman，S.，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego， California，119-128，1990）。他の戦略では、発現ベクターに挿入するH.pylor iペプチドをコードする核酸を各アミノ酸の個々のコドンが、高度に発現されたE .coliタンパク質で優先的に利用されるコドンになるように変化させる（Wadaら，Nuc．Acids Res．20:2111-2118，1992）。このような本発明の核酸の変化は標準的なＤＮＡ合成技術によって実施できる。本発明の核酸はまた、標準技術を用いて化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られている。たとえばペプチド合成と同様に、固相合成は市販のＤＮＡ合成装置により完全に自動化されている(たとえば、Itakuraら，米国特許4,598,049;Caruthersら，米国特許4,4 58,066;ならびにItakuraら，米国特許4,401,796および4,373,071参照，引用により本明細書に導入される)。 III．H.pylori ポリペプチド本発明は開示されたH.pyloriゲノム配列によりコードされる単離H.pyloriポリペプチドを包含し、これには、配列表中に含まれる本発明のポリペプチドが包含される。本発明のポリペプチドは好ましくは少なくとも長さ５アミノ酸の残基である。本明細書に提供されたＤＮＡ配列情報を用い、本発明に包含されるポリペプチドのアミノ酸配列は本技術分野でよく知られた方法により推定できる。H.py loriポリペプチドをコードする全核酸配列は、同種のタンパク質コード領域のフラグメントのみをコードするＯＲＦに基づいて単離し、同定できることは明らかである。これはたとえば、ＯＲＦ、またはそのフラグメントをコードする単離核酸を用い、鋳型としてのゲノムH.pyloriＤＮＡとのポリメラーゼ連鎖反応をプライムし、ついで増幅産物を配列決定することによって達成できる。本発明のポリペプチドは、H.pylori核酸が予め導入され、発現された野生型もしくは突然変異H.pylori細胞または異種生物体もしくは細胞（それらに限定されるものではないが、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳動物細胞）から単離できる。さらにポリペプチドは組換え融合タンパク質の部分であってもよい。本発明のH.pyloriポリペプチドは、本明細書に引用したような市販の自動化操作を用いて化学的に合成することができる。 IV．H.pylori に対して有効なワクチン成分および薬剤の標的をコードする核酸の同定開示されたH.pyloriゲノム配列には、リボ核酸およびポリペプチドの合成を指示するセグメントならびに複製の起源、プロモーター、他の種類の調節配列、および遺伝子間核酸が包含される。本発明はH.pyloriに対して有効なワクチンの免疫原性成分および薬剤の標的をコードする核酸を包含する。開示された配列の機能の決定に関与する上記免疫原性成分の同定は、様々なアプローチを用いて達成できる。これらのアプローチの非限定的な例を以下に簡単に記載する。既知配列に対するホモロジー：開示されたH.pylori配列と、公開されているデータベースに存在する既報配列とのコンピューター支援による比較は、機能性の H.pylori核酸およびポリペプチド配列の同定に有用である。タンパク質コード配列をたとえば全体として比較した場合の２つのタンパク質の間のアミノ酸レベルにおける高度の配列ホモロジー（たとえば＞80〜90％）は、２つのタンバク質が、たとえば代謝に関与する酵素、ＤＮＡ合成または細胞壁合成、およびトランスポート、細胞分裂等に関与するタンパク質の間でもある程度の機能的ホモロジーをもつことを指示するものと理解される。さらに、特定のタンパク質クラスの多くの構造的特徴が特定のコンセンサス配列たとえばヌクレオチド、ＤＮＡ、金属イオンおよび他の小分子の結合ドメイン；共有結合修飾たとえばリン酸化、アシル化等の部位；タンパク質−タンパク質相互作用の部位等で同定され、関連づけられてきた。これらのコンセンサス配列はきわめて短く、すなわち全タンパク質コード配列のわずかな分画を表示するのみである。H.pylori配列におけるこのような特徴の同定は、したがって、コードされたタンパク質の機能の決定および抗細菌薬の有用な標的の同定に有用である。本発明に特に関連するのは、分泌シグナルペプチドおよび疎水性の膜貫通ドメインを包含する分泌、膜貫通および表面タンパク質に共通な構造的特徴である。推定されるシグナル配列および／または膜貫通ドメインを含有するとして同定されたH.pyloriタンパク質はワクチンの免疫原性成分として有用である。必須遺伝子の同定：H.pyloriの増殖または生存能に必須のタンパク質をコードする核酸は好ましい薬剤の標的である。H.pyloriの遺伝子は、その遺伝子の欠失および／または破壊の効果を当業者に周知の技術を用いて、すなわちいわゆる遺伝子「ノックアウト」によって調べることにより、その生物体に対する生物学的関連について試験することができる。この方法によって必須遺伝子が同定される。株特異的配列：異なるH.pylori株間の進化的な関連から、本発明で開示された H.pyloriの配列は、以前からに知られているものと新しいH．pylori株間の同定および／または識別に有用であると考えられる。他のH.pylori株は本発明で開示された配列と少なくとも70％の配列ホモロジーを示すものと考えられる。H.pylo ri株を含むサンプルに由来するＤＮＡ配列の系統的な通常の分析ならびに本発明の配列との比較は、株間の識別に使用できる配列およびすべてのH.pylori株に共通の配列の同定を可能にする。一実施態様においては本発明はプローブならびに異なるH.pylori株間を識別するペプチドおよびポリペプチド配列を含む核酸を提供する。株特異的成分も、１種または２種以上のH.pylori株を選択的に認識する抗体を誘発する機能またはそれと反応する能力により機能的に同定することができる。他の実施態様においては、本発明は、プローブならびにすべてのH.pylori株に共通であるが他の細菌種には見出されないペプチドおよびポリペプチド配列を含む核酸を提供する。特殊な実施例：抗体およびワクチン開発のための候補タンパク質抗原の決定ワクチンの開発のための候補タンパク質抗原の選択はH.pyloriポリペプチドをコードする核酸から誘導することができる。第一に、ＯＲＦを他の既知の輸出または膜タンパク質に対するホモロジーについて分析し、Kleinらにより記載された判別分析（Klein，P.，Kanehsia，M & DeLisi，C.，Biochimica et Biophysic aActa 815，468-476，1985）を用いて予測される輸出および膜タンパク質について分析することができる。ホモロジー検索は、予測されるそれぞれのＯＲＦアミノ酸配列を現行のGenBan k，SWISS-PROTおよびPIRデータベースに見出されるすべての配列と比較するためにWisconsin Sequence Analysis Package（Genetics Computer Group，Universi ty Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711）に包含されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴはＯＲＦとデータバンクの配列の間の局部的アラインメントについて検索し、この配列がデータベース中に偶然に見出される確率を示す確率評価を報告する。膜または輸出タンパク質に対して有意なホモロジー（たとえば、ホモロジーがランダムな機会によるのみの１×10^-6より低い確率）を有するＯＲＦはワクチン開発のためのタンパク質抗原を提示する。可能性のある機能は、他の生物体にクローン化された遺伝子に対する配列ホモロジーに基づいてH.pylori遺伝子に提供することができる。判別分析（Kleinら，前出）はＯＲＦのアミノ酸配列を調べるために使用することができる。このアルゴリズムはＯＲＦのアミノ酸配列に含まれる固有の情報を使用し、それを既知の膜および輸出タンパク質の性質に由来する情報に対して比較する。この比較はどのタンパク質が輸出、膜結合または細胞質タンパク質であるかを予想する。このアルゴリズムによって輸出または膜結合タンパク質として同定されたＯＲＦのアミノ酸配列は多分、ワクチン開発のためのタンパク質抗原である。外膜タンパク質に暴露される表面はH.pyloriに対する保護免疫応答を提供する最良の抗原であると思われる。これらの外膜タンパク質の予想の補助に使用できるアルゴリズム中にはそれらのＣ末端における両親媒性β−シート領域の存在が包含される。グラム陰性菌中の多数の外膜タンパク質で検出されているこの領域はＣ末端から交互の位置に密集した疎水性アミノ酸（PheまたはTyr）を特徴とする場合が多い（たとえば図５のブロックＦ；図７のブロックＥ参照）。重要なことは、これらの配列が細胞周辺のタンパク質のＣ末端には検出されておらず、すなわち、一次配列データに基づくこれらのクラスのタンパク質の間の予備的な識別が可能になることである。この現象は以前にStruyveら（J.Mol.Biol．218:141 -148,1991）に報告されている。図５にはまた、H.pyloriの多くの外膜タンパク質中に見出される付加的なアミノ酸配列モチーフを例示する。図５におけるアミノ酸配列のアラインメントは５種のH.pyloriタンパク質の部分配列を記載したもので(一文字アミノ酸コードで記載)、アミノ酸のSEQ ID NOを付し、Ｎ末端からＣ末端を左から右に示す。類似のアミノ酸残基の５または６個の独特なブロック（Ａ〜ＥまたはＦと表示）が見出され、これらは独特な疎水性残基（PheまたはTyr、アミノ酸残基の一文字コードによればＦまたはＹ）を包含し、多くの場合、外膜タンパク質のＣ末端付近の位置に認められた。数種の共通のモチーフの存在が、このグループのタンパク質のメンバーの間の類似性を明瞭に確立している。 H.pyloriから単離された４種の外膜タンパク質について、さらにアミノ酸のアラインメントを図６に記載する。 H.pyloriから単離される外膜タンパク質は、同じくＣ末端疎水性残基を共有する図７の２種のタンパク質について示すような付加的モチーフと、Ｃ末端疎水性残基モチーフは共有しないが異なるＣ末端モチーフを共有する図８の２種のタンパク質について示すような付加的モチーフを共有することが多い。これらの共有される配列モチーフがきわめて重要であり、このグループのタンパク質の類似性を確立することは当業者には自明であろう。稀に核酸配列中の与えられた位置における多重な可能性のあるヌクレオチドの間の識別が可能でないことがある。そのような場合には、不明瞭性は以下のように拡張したアルファベットによって表示される。これらは公式のIUPAC-IUB一文字塩基コードである。コード塩基の説明ＧグアニンＡアデニンＴチミンＣシトシンＲプリン（ＡまたはＧ）Ｙピリミジン（ＣまたはＴまたはＵ）Ｍアミノ（ＡまたはＣ）Ｋケトン（ＧまたはＴ）Ｓ強い相互作用（ＣまたはＧ）Ｗ弱い相互作用（ＡまたはＴ）ＨＧでない（ＡまたはＣまたはＴ）ＢＡでない（ＣまたはＧまたはＴ）ＶＴでない（Ｕでない）（ＡまたはＣまたはＧ）ＤＣでない（ＡまたはＧまたはＴ）Ｎ任意（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）本発明のアミノ酸の翻訳は、不明瞭なコドンを文字「Ｘ」として翻訳することによって核酸配列中の不明瞭性を説明する。すべての場合、ある位置において許容されるアミノ酸残基は標準遺伝子コードに基づく核酸配列の試験から明瞭である。Ｖ．H.pylori 核酸およびポリペプチドのフラグメントおよび類縁体の製造配列表中に提供される本発明のH.pylori遺伝子産物の発見に基づき、当業者は開示された（H.pylori遺伝子の）構造をたとえばフラグメントまたは類縁体の産生により変更し、新たに産生した構造を活性について試験することができる。フラグメントおよび類縁体の産生および試験を可能にする当業者に周知の技術の例については以下に述べる。これらのまたは類似の方法は、ポリペプチドのライブラリー、たとえば、ランダムペプチドのライブラリーまたはフラグメントもしくは細胞性タンパク質の類縁体のライブラリーの作成およびH.pyloriポリペプチドを結合する能力についてのスクリーニングに使用することができる。このようなスクリーニングはH.pyloriのインヒビターの同定に有用である。フラグメントの生成タンパク質のフラグメントは数種の方法で、たとえば組換え、蛋白質分解消化、または化学的合成によって産生させることができる。ポリペプチドの内部または末端フラグメントは、ポリペプチドをコードする核酸の一方の末端（末端フラグメントの場合）または両端（内部フラグメントの場合）から１個または２個以上のヌクレオチドを除去することによって生成させることができる。突然変異させたＤＮＡの発現はポリペプチドフラグメントを産生する。「末端を１個ずつ切断していく」エンドヌクレアーゼで消化すれば、フラグメントのアレイをコードするＤＮＡを生成させることができる。あるタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡはまた、ランダム剪定、制限消化または上述の方法の組合せにより生成させることができる。フラグメントはまた、たとえば慣用のMerrifield固相f-Mocまたはt-Boc化学のような本技術分野で周知の技術を用いて化学的に合成することもできる。たとえば本発明のペプチドは、フラグメントの重複がない所望の長さのフラグメントまたは所望の長さの重複するフラグメントに任意に分割することができる。核酸およびポリペプチドの変化：ランダム法タンパク質のアミノ酸配列変異体は、タンパク質またはタンパク質の特定のドメインまたは領域をコードするＤＮＡのランダム突然変異誘発によって調製することができる。有用な方法にはＰＣＲ突然変異誘発および飽和突然変異誘発が包含される。ランダムなアミノ酸配列変異体のライブラリーは縮重オリゴヌクレオチド配列のセットの合成によっても生成させることができる（変異体のライブラリー中のタンパク質のスクリーニング方法は本明細書の別の項で述べる）。（Ａ）ＰＣＲ突然変異誘発ＰＣＲ突然変異誘発においては、ＤＮＡのクローン化フラグメントにランダムな突然変異を導入するために、忠実度の低下したTaqポリメラーゼを使用する（L eungら，Technique 1:11-15，1989）。突然変異を誘発するＤＮＡ領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用い、Taq ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実度が低下した条件下たとえばdGTP／dATP比５を使用しＰＣＲ反応にMn²⁺を加えて増幅する。増幅したＤＮＡフラグメントのプールを適当なクローニングベクターに挿入し、ランダム突然変異体ライブラリーを与える。（Ｂ）飽和突然変異誘発飽和突然変異誘発は、クローン化されたＤＮＡフラグメントへの多数の単一塩基置換の迅速な導入を可能にする（Mayersら，Science 229:242，1985）。この技術には、たとえば、インビトロにおける一本鎖ＤＮＡの化学的処理または放射線照射、および相補性ＤＮＡ鎖の合成による突然変異の発生が包含される。突然変異の頻度は処理の強度を調節することによって調節が可能で、本質的にすべての可能な塩基置換を達成することができる。この操作は突然変異体フラグメントについての遺伝子選択を包含しないので、中性置換および機能を変化させる置換の両者が得られる。点突然変異の分布が保存配列要素に対して偏向することはない。（Ｃ）縮重オリゴヌクレオチド同族体のライブラリーはまた、縮重オリゴヌクレオチド配列のセットから生成させることもできる。縮重配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成装置によって実施することが可能であり、ついで合成遺伝子は適当な発現ベクターにライゲートする。縮重オリゴヌクレオチドの合成は本技術分野においては周知である（たとえば，Narang，SA，Tetrahedron 39:3，1983;Itakuraら，Recobinant DNA，Pr oc．3rd．Cleveland Sympos．Macromolecules，ed．AG Walton，Amsterdam;Else vierpp．273-289，1981:Itakuraら，Annu．Rev．Biochem．53:323，1984;Itakur aら，Science 198:1056，1984;Ikeら，Nucleic．Acid Res．11:477，1983参照）。このような技術は他のタンパク質の指示された進化にも使用されてきた(たとえばScottら，Science 249:386-390，1990;Robertsら，PNAS 89:2429-2433，199 2;Devlinら，Science 249:404-406，1990;Cwirlaら，PNAS 87:6378-6382，1990; ならびに米国特許5,223,409，5,198,346および5,096,815参照)。核酸およびポリペプチドの変化：指示された突然変異誘発方法非ランダムまたは指示された突然変異誘発技術は、特異的な配列または特異的な領域における突然変異を提供するために使用できる。これらの技術は、たとえばタンパク質の既知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入または置換を包含する変異体の創成に使用することができる。突然変異の部位は個々にまたは一連に、たとえば（１）最初に保存アミノ酸の置換、ついで達成される結果に依存してより徹底的な選択、（２）標的残基の欠失、または（３）局在部位に隣接して同種または異種クラスの残基の挿入、または選択１〜３の組合せによって修飾することができる。（Ａ）アラニン走査突然変異誘発アラニン走査突然変異誘発は、突然変異の誘発に好ましい位置もしくはドメインである所望のタンパク質のある種の残基または領域の同定に有用な方法である（Cunningham & Wells，Science 244:1081-1085，1989）。アラニン走査では、標的残基の残基またはグループ（たとえば、Arg、Asp、His、LysおよびGluのような荷電残基）を同定し、中性または陰性に荷電したアミノ酸（特に好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。アミノ酸の置換は、細胞内部または外部の周囲の水性環境とアミノ酸の相互作用に影響することがある。置換に対して機能的な感受性を表すこれらのドメインはついで、置換部位にまたは置換部位の方にさらにまたは他の変異体を導入することによって改良する。すなわち、アミノ酸配列の変異体の導入部位を予め決定する場合に、突然変異自体の性質を予め決定する必要はない。たとえば、所定の部位における突然変異の効率を至適化するためには、標的コドンまたは領域にアラニン走査またはランダム突然変異の誘発を行い、発現した所望のタンパク質サブユニット変異体を所望の活性の至適な組合せについてスクリーニングする。（Ｂ）オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発はＤＮＡの置換、欠失および挿入変異体の調製に有用な方法である（たとえば、Adelmanら，DNA 2:183，1983参照）。略述すれば、所望のＤＮＡを、所望のタンパク質の不変のまたは未変性のＤＮＡ配列を含有するプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖型であるＤＮＡ鋳型に、突然変異をコードするオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより変化させる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを導入し、所望のタンパク質ＤＮＡ中の選択された変化をコードする鋳型の完全な第２の相補性鎖を合成する。一般的に少なくとも長さ25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが用いられる。至適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチドのいずれかの側において鋳型に完全に相補性の 12〜15ヌクレオチドを有する。これは、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適正にハイブリダイズすることを保証する。オリゴヌクレオチドはたとえばCreaら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:5765，1978）によって記載されているような本技術分野で周知の技術を用いて容易に合成することができる。（Ｃ）カセット突然変異誘発変異体の調製のための他の方法であるカセット突然変異誘発はWellsら（Gene3 4 :315，1985）により報告された技術に基づくものである。出発材料は突然変異を誘発するタンパク質サブユニットＤＮＡを包含するプラスミド（またはベクター）である。突然変異を誘発するタンパク質サブユニットＤＮＡ中のコドン（単数または複数）が同定される。同定された突然変異部位（単数または複数）の各側に、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。このような制限部位がない場合は、上述のオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発法を用いてそれらを所望のタンパク質サブユニットＤＮＡ中の適当な位置に導入して発生させる。プラスミドに制限部位が導入されたのち、プラスミドをこれらの部位で切断して線状化する。制限部位の間にＤＮＡ配列をコードするが、所望の突然変異（単数または複数）を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを標準操作を用いて合成する。２個の鎖は別個に合成し、ついで、標準操作を用いて互いにハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドがカセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドへの直接ライゲーションを可能にするため、線状化プラスミドの末端に匹敵する3'および5'末端を有するように設計される。このプラスミドはこの時点で、突然変異した所望のタンパク質サブユニットＤＮＡ配列を含有する。（Ｄ）組合せ突然変異誘発組合せ突然変異誘発もまた、突然変異体の生成に使用することができる（Ladnerら，WO88／06630）。この方法では、同族体または他の関連タンパク質のグループについてのアミノ酸配列を好ましくは最高のホモロジーの促進が可能なようにアラインする。アラインした配列の所定の位置に現れるアミノ酸のすべてが組合せ配列の縮重セットの作成に選択できる。変異体の多様なライブラリーは核酸レベルにおける組合せ突然変異誘発によって生成させ、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。たとえば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は可能性ある配列の縮重セットが個々のペプチドとしてまたは縮重配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセットとして発現可能な遺伝子配列に酵素的にライゲートすることができる。 H.pylori 核酸およびポリペプチドの他の修飾 H.pyloriポリペプチドの構造を、溶解度の上昇、安定性の増大（たとえば、エクスビボにおける貯蔵寿命、およびインビボにおける蛋白質分解的崩壊に対する抵抗性）のような目的で修飾することが可能である。本明細書に記載するアミノ酸置換、欠失または付加によってアミノ酸配列を変化させた修飾H.pyloriタンパク質またはペプチドを製造することができる。 H.pyloriペプチドはまた、システイン残基の好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシンまたはグルタミン酸残基による置換でジスルフィド結合によるダイマー化が最小限になるように修飾することもできる。さらに、本発明のタンパク質のフラグメントのアミノ酸の側鎖を化学的に修飾することもできる。他の修飾にはペプチドの環状化がある。安定性および／または反応性を増大させるためには、H.pyloriポリペプチドは天然の対立遺伝子変異から生じるタンパク質のアミノ酸配列における１または２以上の多形を導入するように修飾することができる。さらに、本発明の範囲に含まれる修飾タンパク質の製造には、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸または非アミノ酸類縁体を置換または付加することもできる。またさらにH.pyloriポリペプチドはA．Sehonおよび共同研究者（Wieら，前出）の方法に従ってポリエチレングリコール（PEG）を用いて修飾し、ＰＥＧと接合したタンパク質を製造することもできる。さらにＰＥＧはタンパク質の化学的合成時に添加することもできる。H.pyloriタンパク質の他の修飾には還元／アルキル化(Tarr，Methods of Protein Microcharacterization，J．E．Silver ed.，Humana Press，Clifton NJ 155-194，1986)；アシル化（Tarr，前出）；適当な担体への化学的カップリング（Mishell & Shiigi編，Selected Methods in Cellular Immunology，Freeman，WH，San Francisco，CA，1980;米国特許4,939, 239）または緩和なホルマリン処理（Marsh，Int．Arch．of Allergy Appl．Immu nol．41:199-215，1971）がある。 H.pyloriタンパク質またはペプチドの精製を容易にし、また溶解度を上昇させる可能性のためには、ペプチド骨格にアミノ酸融合残基を付加することができる。たとえば、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィーによる精製のためには、タンパク質にヘキサヒスチジンを付加することができる（Hochuli，E．ら，Bi o／Technology 6:1321-1325，1988）。さらに、無関係な配列を含まないペプチドの単離を容易にするためには、特異的なエンドプロテアーゼ切断部位を融合部分の配列とペプチドの配列の間に導入することができる。 H.pyloriポリペプチド内のエピトープの適当な抗原プロセッシングを補助する可能性のためには、組換えまたは合成法により、それぞれ少なくとも１個のエピトープからなる領域の間に共通プロテアーゼ感受性部位を作成することができる。たとえば、ＫＫまたはＲＲのような荷電アミノ酸対をその組換え構築時にタンパク質またはフラグメント内の領域間に導入することができる。得られたペプチドは、カテプシンおよび／または他のトリプシン様酵素による切断に感受性になり、１個または２個以上のエピトープを含有するタンパク質部分を生成する。さらに、このような荷電アミノ酸残基は、ペプチドの溶解度を上昇させることができる。ポリペプチドおよび類縁体のスクリーニングの一次的方法生成した突然変異遺伝子産物のスクリーニングは、様々な技術が本技術分野で知られている。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術は、遺伝子ライブラリーの複製可能な発現ベクターへのクローニング、得られたベクターのライブラリーによる適当な細胞の形質転換、および所望の活性、たとえばこの場合は H.pyloriポリペプチドまたは相互作用タンパク質への結合の検出により、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターが比較的容易に単離し得る条件下における遺伝子の発現を包含することが多い。以下に記載する技術にはそれぞれ、たとえばランダム突然変異誘発技術によって創成される多数の配列のスクリーニングのため、高度のスループット分析を適用することができる。（Ａ）ツーハイブリッドシステム上述のシステムのようなツーハイブリッドアッセイ（本明細書に記載の他のスクリーニング方法と同様）は、ポリペプチドたとえば天然に存在するH.pyloriポリペプチドたとえば細胞性タンパク質のフラグメントもしくは類縁体またはH.py loriタンパク質に結合するランダムに生成させたポリペプチドの同定に用いることができる（H.pyloriドメインがベイト(bait)タンパク質として用いられ、変異体のライブラリーがフィッシュ(fish)融合タンパク質として発現される）。同様の様式によって、ツーハイブリッドアッセイ（本明細書に記載の他のスクリーニング方法と同様）はH.pyloriポリペプチドを結合するポリペプチドの発見に使用できる。（Ｂ）ディスプレーライブラリースクリーニングアッセイの一つのアプローチでは、候補ペプチドは細胞またはウイルス粒子の表面上に表示され、表示された産物を介して適当な受容体タンパク質を結合する特定の細胞またはウイルス粒子の能力が「パニングアッセイ」で検出される。たとえば、遺伝子ライブラリーは細菌細胞の表面膜タンパク質の遺伝子中にクローン化し、得られた融合タンパク質をパニングにより検出することができる（Ladnerら，WO88／06630；Fuchsら， Bio/Technology 9:1370-1371，1991；およびGowardら，TIBS 18:136-140，1992 ）。同様の様式で、検出可能なように標識されたリガンドは機能性を示す可能性があるペプチド同族体の評価に用いることができる。蛍光で標識したリガンドたとえば受容体はリガンド結合活性を維持する同族体の検出に使用することができる。蛍光標識リガンドの使用は細胞を可視的に検査して蛍光顕微鏡下に分離することを可能にするか、または細胞の形態の蛍光活性化細胞ソーターによる分離を可能にする。遺伝子ライブラリーはウイルス粒子の表面上で融合タンパク質として発現させることができる。たとえば繊維状ファージ系では異種ペプチド配列を感染ファージの表面上で発現させることが可能で、これは２つの重要な利点を付与する。第一にこれらのファージは10¹³ファージ／mlより十分高い濃度で親和性マトリックスに適用できるので、多数のファージを一度にスクリーニングできる。第二に、各感染ファージはその表面上に遺伝子産物を表示するので、特定のファージが親和性マトリックスから低収率でしか回収されなくても、ファージは感染の他のラウンドで増幅させることができる。ほぼ同一のE.coli繊維状ファージのグループ、Ｍ13、ｆｄ．およびｆ１がファージディスプレーライブラリーには最も頻繁に使用される。ファージｇIIIまたはｇVIIIコートタンパク質のいずれかを、ウイルス粒子の最終的なパッケージングを分裂させることなく融合タンパク質の生成に用いることができる。異種エピトープはｐIIIのNH₂末端に発現させることが可能で、このようなエピトープをもつファージは、このエピトープを欠く大過剰のファージから回収された（Ladnerら，PCT公開WO90／02909；Garrardら，PCT公開 WO92／09690；Marksら，J．Biol．Chem．267:16007-16010，1992;Griffithsら， EMBOJ．12:725-734，1993;Clacksonら，Nature 352:624-628，1991;Barbasら，P NAS 89:4457-4461，1992）。通常のアプローチではE.coliのマルトース受容体（外膜タンパク質、 LamB）をペプチド融合パートナー（Charbitら，EMBO 5:3029-3037，1986）として使用する。オリゴヌクレオチドはＬａｍＢ遺伝子をコードするプラスミド中に挿入し、タンパク質の細胞外ループの一つに融合するペプチドを製造した。これらのペプチドはリガンド、たとえば抗体への結合に利用することが可能で、細胞を動物に投与した場合、免疫応答を誘発させることができる。他の細胞表面タンパク質たとえばＯｍｐＡ（Schorrら，Vaccines 91:387-392，1991）、ＰｈｏＥ（Agterbergら，Gene 88:37-45，1990）およびＰＡＬ（Fuchsら，Bio/Tech 9:13 69-1372，1991）、ならびに大きな細菌表面構造はペプチドディスプレーのビヒクルとして働く。ペプチドは、重合して遺伝子情報の細菌間の交換のための導管、ピルスを形成するタンパク質のピリンに融合することができる（Thiryら，App l．Environ．Microbiol．55:984-993，1989）。他の細胞との相互作用におけるその役割のため、ピルスは細胞外環境へのペプチドの提示のための有用な支持体を提供する。ペプチドディスプレーに使用される他の大きな表面構造は細菌の運動器官、鞭毛である。サブユニットタンパク質のフラジェリンへのペプチドの融合は宿主細胞上に多くのペプチドコピーの濃密なアレイを提供する（Kuwajimaら，Bio/Tech．6:1080-1083，1988）。他の細菌種の表面タンパク質もペプチド融合パートナーとして役立ってきた。たとえばブドウ球菌（Staphylococcus）のプロテインＡおよびナイセリア（Neisseria）の外膜ＩｇＡプロテアーゼである（H anssonら，J.Bacteriol.174:4239-4245，1992;Klauserら，EMBOJ．9:1991-1999 ，1990)。上述の繊維状ファージ系およびＬａｍＢ系では、ペプチドおよびそれをコードするＤＮＡの間に、表面にペプチドをもつ粒子（細胞またはファージ）内のＤＮＡの拘束により物理的な連結が生じる。そのペプチドの捕獲は粒子とＤＮＡを内部に捕獲する。別の機構はペプチドとＤＮＡの間の連結の形成にＤＮＡ結合タンパク質であるＬａｃＩを使用する（Cullら，PNAS USA 89:1865-1869，1992）。このシステムはその3'末端にオリゴヌクレオチドのクローニング部位を有するＬａｃＩ遺伝子を含有するプラスミドを使用する。アラビノースによって制御された誘導下にLaclペプチド融合タンパク質が産生する。この融合はＬａｃＯオペレーター（LacO）として知られる短いＤＮＡ配列に結合するＬａｃＩの本来の能力を維持している。発現プラスミド上に２コピーのＬａｃＯを装着することにより、ＬａｃＩ−ペプチド融合はそれをコードするプラスミドに強固に結合する。各細胞中のプラスミドは単一のオリゴヌクレオチド配列のみを含有し、各細胞は単一のペプチド配列のみを発現するので、そのペプチドはその合成を指図するＤＮＡ配列と特異的かつ安定に会合する。ライブラリーの細胞を穏やかに溶解し、ペプチド−ＤＮＡ複合体を固定化受容体のマトリックスに暴露し、活性なペプチドを含有する複合体を回収する。会合したプラスミドＤＮＡをついで、増幅およびＤＮＡ配列決定によりペプチドリガンドの同一性を決定するため、細胞に再導入する。この方法の実際的な有用性の証明として、ドデカペプチドの大きなランダムライブラリーを作成し、オピオイドペプチドのダイノルフィンＢに対するモノクローナル抗体で選択した。ペプチド群を回収するとすべてが、ダイノルフィンＢの６残基部分に相当する共通配列により関係付けられた（Cullら，Proc．Natl．Acad.Sci．USA 89:1869，1992）。ペプチド−オン−プラスミドと呼ばれることもあるこの機構は、２つの重要な方法でファージディスプレー法とは異なっている。第一に、ペプチドは融合タンパク質のＣ末端に結合し、遊離のカルボキシ末端を有するペプチドとしてライブラリーメンバーのディスプレーを生じさせる。繊維状ファージコートタンパク質ｐIIIおよびｐVIIIの両者をそれらのＣ末端によってファージに繋留し、ゲストペプチドは外側に伸びたＮ末端ドメイン中に配置する。一部の設計では、ファージ表示ペプチドは融合タンパク質のアミノ末端に正しく表示される（Cwirlaら， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6378-6382，1990）。第二の差はライブラリー中に実際に存在するペプチド集団に影響する生物学的偏向のセットである。ＬａｃＩ融合分子は宿主細胞の細胞質に拘束される。ファージコート融合は翻訳時に短時間細胞質に暴露されるが、内膜を通過して迅速に周辺間隙に分泌され、膜内にそれらのＣ末端疎水性ドメインによって繋留されたまま維持され、ペプチドを含有するＮ末端は周辺質中に突出し、この間ファージ粒子への組立を待っている。ＬａｃＩおよびファージライブラリー中のペプチドは異なる蛋白分解活性へのそれらの暴露の結果として有意に異なる。ファージコートタンパク質はファージへの導入に対する準備として、内膜を横切る輸送およびシグナルペプチダーゼプロセッシングを要求する。ある種のペプチドはこれらの過程に有害な作用を発揮し、ライブラリー中に十分表されない（Gallopら，J．Med．Chem．37(9):1233-1251，1994）。これらの特定の偏向は、ＬａｃＩディスプレーシステム中のファクターではない。組換えランダムライブラリーに利用できる小さなペプチドの数は極めて多い。 10⁷〜10⁹の独立のクローンのライブラリーが定常的に調製される。10¹¹までもの組換え体のライブラリーが創成されているが、このサイズはクローンライブラリーの実用上の限界に近い。ライブラリーのサイズにおけるこの限界は、ＤＮＡ含有ランダムセグメントの宿主細菌細胞へのトランスフォームの工程で起こる。この限界を回避するため、ポリゾーム複合体中で新生したペプチドのディスプレーに基づくインビトロ系が最近開発された。このディスプレーライブラリー法では、現在利用されているファージ／ファージミドまたはプラスミドライブラリーの場合よりも３〜６オーダー大きいライブラリーが産生される可能性がある。さらにライブラリーの構築、ペプチドの発現およびスクリーニングは完全に細胞フリーのフォーマットで行われる。この方法の一つの応用（Gallopら，J．Med．Chem．37(9):1233-1251,1994）では、10¹²のデカペプチドをコードする分子ＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラリーを転写／翻訳系をインビトロカップリングした E.coli S30で発現させた。条件をリボゾームがｍＲＮＡ上で停止するように選択したところ、ポリゾーム中におけるＲＮＡの実質的な部分の蓄積を生じ、それらをコードするＲＮＡにまだ連結している新生ペプチドを含有する複合体が生成した。ポリゾームはより慣用される組換えペプチドディスプレーライブラリーのスクリーニングとほぼ同じ方法で固定化受容体上で親和性精製するのに十分強固である。結合した複合体からＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲにより増幅して次のラウンドの合成およびスクリーニングのための鋳型を製造する。ポリゾームディスプレー法はファージディスプレー系にカップリングさせることができる。数ラウンドのスクリーニング後に、ポリゾームの濃縮されたプールからのｃＤＮＡをファージミドベクターにクローン化した。このベクターは、コートタンパク質に融合したペプチドを表示するペプチド発現ベクター、およびペプチド同定のためのＤＮＡ配列決定ベクターの両者として役立つ。ポリゾーム由来のペプチドをファージ上で発現させることにより、このフォーマットでの親和性選択操作を継続するかまたは個々のクローン上のペプチドのファージＥＬＩＳＡでの結合活性もしくは完全ファージＥＬＩＳＡでの結合特異性をアッセイすることができる（Barretら，Anal．Biochem．204:357-364，1992）。活性ペプチドの配列の同定のためにはファージミド宿主によって産生されたＤＮＡの配列を決定する。ポリペプチドおよび類縁体の二次スクリーニング上述の高度のスループットアッセイに続いて生物活性をさらに同定するため、当業者にたとえばアゴニストとアンタゴニストの識別を可能にする二次スクリーニングを実施できる。二次スクリーニングの種類は、試験の必要がある所望の活性に依存する。たとえば、興味あるタンパク質とそのそれぞれのリガンドの間の相互作用を阻害する能力を、上述の一次スクリーニングの一つによって単離されたペプチドフラグメント群からのアンタゴニストの同定に使用するアッセイを開発することができる。すなわち、フラグメントおよび類縁体を生成させて、それらの活性を試験する方法は本技術分野において周知である。興味あるコア配列が一旦同定されれば、類縁体およびフラグメントを取得することは当業者にとって通常の作業である。 H.pylori ポリペプチドのペプチド模倣体本発明はまた、模倣体たとえばペプチドまたは非ペプチド剤を生成させるための主題のH.pyloriポリペプチドのタンパク質結合ドメインの減数分裂を提供する。ペプチド模倣体は、ポリペプチドのそのカウンターリガンドに対する結合、たとえばH.pyloriポリペプチドの場合には天然に存在するリガンドへの結合を崩壊させることができる。ポリペプチドの分子認識に関与する主題のH.pyloriポリペプチドの重要な残基を決定し、H.pyloriポリペプチドの相互作用ポリペプチドとの結合を競合的にまたは非競合的に阻害するH.pylori由来のペプチド模倣体を生成させるために用いることができる（たとえば、欧州特許出願EP-412，762AおよびEP-Ｂ31,080Ａ参照）。たとえば、走査突然変異誘発は相互作用ポリペプチドの結合に関与する特定の H.pyloriポリペプチドのアミノ酸残基のマッピングに使用することが可能で、相互作用ポリペプチドへの結合にそれらの残基を模倣し、したがってH.pyloriポリペプチドの相互作用ポリペプチドへの結合を阻害することができて、それによって、H.pyloriポリペプチドの機能を妨害するペプチド模倣体化合物（たとえば、ジアゼピンまたはイソキノリン誘導体）を生成させることができる。たとえば、このような残基の加水分解されないペプチド類縁体はベンゾジアゼピン（たとえば、Freidingerら，Peptides:Chemistry and Biology，G．R．Marshall ed．ESC OMPub1isher:Leiden，Netherlands，1988）、アゼピン（たとえば、Huffmanら， Peptides:Chemistry and Biology，G.R．Marshall ed.，ESCOMPublisher:Leiden ，Netherlands，1988）、置換γ−ラクタム環（Garvey ら，Peptides:Chemistry and Biology，G．R．Marshall ed.，ESCOMPublisher:L eiden，Netherlands，1988）、ケトメチレンシュードペプチド（Ewensonら，J． Med．Chem．29:295，1986;Ewensonら，Peptides:Structure and Function（Proc eedings of the 9th American Peptide Symposium）Pierce Chemical Co．Rockl and,IL，1985）、β−ターンジペプチドコア（Nagaiら，Tetrahedron Lett．26 :647，1985;Satoら，J Chem Soc Perkin Trans 1:1231，1986）、ならびにβ− アミノアルコール（Gordonら，Biochem Biophys Res Commun 126:419，1985およびDannら，Biochem Biophys Res Commun 134:71，1986）を用いて生成させることができる。 VI．H.pylori 核酸およびポリペプチドのワクチン処方物本発明はまた、H.pylori感染に対する保護またはH.pylori感染の処置のためのワクチン組成物または処方物（本明細書では交換可能に用いられる）を特徴とする。本明細書で用いられる「H.pylori感染の処置」なる語は、存在するかまたは確立されたH.pylori感染の治療的処置を意味する。「H.pylori感染に対する保護」または「予防的処置」なる語は、H.pylori感染の危険がある患者における危険の低減または感染の予防のためのH.pyloriワクチン処方物の使用を意味する。一実施態様においては、ワクチン組成物は１種または２種以上の免疫原性成分たとえばH.pyloriからの表面タンパク質またはその部分、および医薬的に許容される担体を含有する。たとえば、一実施態様においては、本発明のワクチン処方物は、同種または異種H.pylori抗原からのH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントの少なくとも１種または組合せを含有する。本発明のワクチン処方物に使用するための核酸およびH.pyloriポリペプチドには、配列表に掲げた核酸およびポリペプチド、好ましくは表面タンパク質をコードするH.pylori核酸、および表面タンパク質またはそのフラグメントが包含される。たとえば、本発明のワクチン組成物中に使用される好ましい核酸およびH. pyloriポリペプチドは、表１に掲げた細胞エンベロープタンパク質およびH.pylo ri細胞エンベロープタンパク質をコードする核酸の群から選択される。しかしながら、本発明においては、免疫原性H.pyloriタンパク質およびH.pyloriポリペプチドをコードする任意の核酸またはその部分が使用できる。これらのワクチンは治療的および／または予防的有用性を有する。本発明の一態様は、H.pyloriタンパク質の免疫原性フラグメント少なくとも１種と医薬的に許容される担体を含有する、H.pylori感染に対する防御用ワクチン組成物を提供する。好ましいフラグメントには、少なくとも長さ約10アミノ酸残基、好ましくは長さ約10〜20アミノ酸残基、さらに好ましくは長さ約12〜16アミノ酸残基のペプチドが包含される。本発明の免疫原性成分は、たとえば完全長のH.pyloriタンパク質をコードする核酸の相当するフラグメントから組換えによって製造されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得られる。さらに、フラグメントはたとえば慣用の Merrifieldの固相f-Mocまたはt-Boc化学のような本技術分野で周知の技術を用いて化学的に合成することもできる。一実施態様においては、免疫原性成分は、Ｔ細胞を刺激するペプチドの能力によって同定される。たとえばＴ細胞増殖またはサイトカイン分泌によって測定されるＴ細胞刺激ペプチドは、本明細書においては、少なくとも１個のＴ細胞エピトープからなるペプチドと定義される。Ｔ細胞エピトープは、アレルギーの臨床症状に対応するタンパク質アレルゲンに対する免疫応答の開始および持続に関与するものと考えられる。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面上の適当なＨＬＡ分子に結合することによってＴヘルパー細胞のレベルにおける初期現象を誘発し、それによってエピトープの関連Ｔ細胞受容体をもつＴ細胞亜集団を刺激するものと思われる。これらの現象は、Ｔ細胞の増殖、リンフォカインの分泌、局所炎症反応、抗原／Ｔ細胞相互作用部位への付加的免疫細胞の供給および抗体の産生を導くＢ細胞カスケードの活性化を招来する。Ｔ細胞エピトープは基本的要素またはＴ細胞受容体による認識の最小単位であり、この場合、エピトープは受容体認識に必須のアミノ酸（たとえば、約６または７アミノ酸残基）からなる。Ｔ細胞エピトープの配列を模倣するアミノ酸配列は本発明の範囲内に包含される。他の実施態様においては、本発明の免疫原性成分はゲノムワクチン接種により同定される。この基本的なプロトコールは、病原性ゲノムたとえばH.pyloriゲノムのすべてまたは部分から構成される発現ライブラリーが宿主の遺伝的免疫に用いた場合には保護を付与できるという考え方に基づいている。この発現ライブラリー免疫処置（ELI）は発現クローニングに類似し、遺伝子ワクチンとして作用できるプラスミドへの病原体たとえばH.pyloriのゲノム発現ライブラリーの減少に関与する。プラスミドはまた、体液性反応を劇的に刺激することが可能な遺伝子アジュバントをコードするように設計することもできる。これらの遺伝子アジュバントは、離れた部位に導入することが可能で、細胞外にも細胞内にも同様に作用する。これは、感染の危険のない生存／減弱化病原体の多くの利点を有するワクチン製造への新しいアプローチである。病原体ＤＮＡの発現ライブラリーを用いて宿主を免疫し、それにより危険のない生存ワクチンの抗原提示作用を生じさせる。たとえば本発明においては、H.pyloriゲノムまたはコスミドもしくはプラスミドクローンからのランダムフラグメント、ならびにゲノム配列決定によって同定された遺伝子からのＰＣＲ産物が宿主の免疫に使用できる。このアプローチの実行可能性は、Mycoplasma pulmonisで証明されていて（Barryら，Nature 377:632-6 35，1995）、齧歯動物の天然の病源体であるMycoplasmapulmonisの部分発現ライブラリーでもその病原体からのチャレンジに対し保護を提供した。ＥＬＩは、病原体の生物学についてほとんど分かっていなくても、ＥＬＩは候補遺伝子をスクリーニングするために免疫系を用いることから、非感染性多部分ワクチンの製造を可能にする技術である。一旦単離されればこれらの遺伝子は遺伝ワクチンとしてまたは組換えタンパク質ワクチンの開発に用いることができる。すなわちＥＬＩは系統的な著しく機械化された様式でのワクチンの製造を可能にする。免疫原性成分のスクリーニングは数種の異なるアッセイの１種または２種以上を用いて達成できる。たとえば、インビトロにおいて、免疫原性が既知のまたは疑われるペプチドをＴ細胞培養液中て適当なＭＨＣ分子を提供する抗原提示細胞と接触させることによりペプチドＴ細胞刺激活性をアッセイする。必要な共刺激とともに適当なＭＨＣ分子に会合した免疫原性H.pyloriペプチドのＴ細胞への提示は、Ｔ細胞にサイトカイン、特にインターロイキン−２およびインターロイキン−４の産生レベルの上昇を誘導するシグナルを伝達する作用を示す。培養上清を得て、インターロイキン−２および他の既知サイトカインをアッセイする。たとえば、インターロイキン−２の数種の慣用アッセイの任意の１種を使用することができる。このようなアッセイはProc．Natl．Acad．Sci．USA 86:1333，1989 に記載されており、その関連部分は引用により本明細書に導入される。インターフェロン産生のためのアッセイのキットもGenzyme Corporation（Cambridge，MA ）から入手することができる。別法として、Ｔ細胞の増殖の一般的なアッセイにはトリチウム化チミジンの取り込みの測定が包含される。Ｔ細胞の増殖はインビトロにおいて、培養細胞の複製ＤＮＡ中に取り込まれた³Ｈ−標識チミジンの量を定量することによって測定することができる。したがって、ＤＮＡ合成の速度、さらには細胞分裂の速度も定量化することができる。１種または２種以上の免疫原性成分（たとえばH.pyloriポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはH.pyloriポリペプチドをコードする核酸もしくはそのフラグメント）を含有する本発明のワクチン組成物または処方物には、好ましくは医薬的に許容される担体が包含される。「医薬的に許容される担体」なる語は、医薬投与と適合性の任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗カビ剤、等張化剤および吸収遅延化剤等を包含する意図である。適当な医薬的に許容される担体には、たとえば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等ならびにそれらの混合物の１種または２種以上が包含される。医薬的に許容される担体はさらに、H.pylori核酸またはポリペプチドの貯蔵寿命または有効性を高める少量の補助物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝剤から構成されてもよい。H.pyloriポリペプチドを含有する本発明のワクチン処方物では、ポリペプチドは本明細書に記載の適当なアジュバントおよび／または送達系と共投与することが好ましい。当業者には自明のように、本発明のＤＮＡまたはタンパク質の治療有効量は特に、投与スケジュール、投与されるH.pylori核酸またはポリペプチドの単位用量、タンパク質または核酸が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、患者の免疫状態および健康、ならびに特定のタンパク質または核酸の治療活性に依存する。ワクチン処方物は通常非経口的に、たとえば注射により皮下または筋肉内のいずれかに投与される。筋肉内免疫処置方法はWolffら，Science 247:1465-1468， 1990およびSedegahら，Immunology 91:9866-9870，1994に記載されている。他の投与方法には、経口および経肺処方物、坐剤、および経皮適用が包含される。H. pyloriによる感染に対する保護を誘導するためには非経口的方法より経口的な免疫処置が好ましい（Czinnら，Vaccine 11:637-642，1993）。経口処方物には、このような場合に通常用いられる賦形剤たとえば医薬用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が包含される。一実施態様においては、ワクチン処方物には、医薬的に許容される担体としてアジュバントが包含される。本発明のワクチン処方物に使用するのに適当なアジュバントの例にはそれらに限定されるものではないが、水酸化アルミニウム；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thr-MDP ）；Ｎ−アセチル−nor−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン(CGP116 37，nor-MDPとも呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（1',2'−ジパルミトイル−sn−グリセロ− ３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（CGP19835Ａ，MTP−PEとも呼ばれる）；細菌からの３成分を含むRIBI；モノホスホリルリピドＡ；トレハロースジマイコロエート；２％スクワラン／Tween 80乳化液中細胞壁骨格（MPL+TD M+CWS）;およびコレラトキシンが包含される。使用できる他のアジュバントには、コレラトキシンの非毒性誘導体たとえばそのＢサブユニット、および／または H.pyloriポリペプチドのコレラトキシンもしくはそのＢサブユニットとの接合体もしくは遺伝子操作融合体、プロコレラジェノイド、カビ多糖たとえばシゾフィラン、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド誘導体、ホルボールエステル、 E.coliの不安定なトキシン、非H.pylori菌の溶解物、ブロックポリマーまたはサポニンがある。他の実施態様においては、ワクチン処方物には医薬的に許容される担体として、送達システムが包含される。本発明のワクチン処方物に使用される適当な送達システムは、生物分解性マイクロカプセルもしくは免疫刺激複合体(ISCOM)、コクリート、またはリポソーム、ウイルスもしくは細菌のような遺伝子操作弱毒化生存ベクター、および組換え（キメラ）ウイルス様粒子たとえばブルータングが包含される。本発明の他の実施態様においては、ワクチン処方物は送達システムおよびアジュバントの両者を包含する。ヒトにおける送達システムは、胃の酸性環境から抗原を保護し、融合タンパク質として非溶解型のH.pyloriポリペプチドを包含する腸放出性カプセルとしてもよい。本発明のワクチンに適当な担体は腸溶性コーティングを施したカプセルおよびポリラクチドーグリコリドマイクロスフェアである。適当な希釈剤は0.2Ｎ NaHCO₃および／または生理食塩水である。本発明のワクチンは、成人もしくは小児に一次的予防剤として、感染宿主におけるH.pyloriの撲滅後に二次防御剤として、またはH.pyloriの感染を防止するため疑わしい宿主に免疫応答を誘発する目的での治療剤として投与することができる。本発明のワクチンは当業者によって容易に決定される量を投与される。すなわち、成人における適当な投与量は、10μg〜10g、好ましくは10μg〜100mg、たとえば50μg〜500mgの範囲である。成人における適当な投与量はまた５μg〜500 mgの範囲である。小児に対しても同様の投与量範囲が適用できる。採用されるアジュバントの量は、用いられるアジュバントの種類に依存する。たとえば、粘膜のアジュバントがコレラトキシンである場合は、それは５μg〜5 0μg、たとえば10μg〜35μgの量が使用される。マイクロカプセルの型で使用される場合には、用いられる量は所望の投与量を達成するためにマイクロカプセルのマトリックス中に使用される量に依存することになる。この量の決定は当業者の技術の範囲内である。至適用量が多かれ少なかれ患者の体重、疾患、投与経路および他の因子に依存することは、当業者には明らかである。また、当業者には明らかなように適当な投与量レベルは既知の経口ワクチン、たとえばE.coli溶解物に基づくワクチン（１日用量６mg、総投与量540mgまで）およびエンテロトキシン産性E.coli精製抗原（１mg、４回）における結果に基づいて得られる（Schulmanら，J．Urol．150 :917-921，1993;Boedeckerら，American Gastroenterological Assoc．999:A-22 2，1993）。投与回数は疾患、処方および臨床試験からの有効データにより決定できる。処置の経過に関する制限を意図するものではないが、処置は初期免疫スケジュールでは１ヵ月間にわたって３〜８回の投与によって実施できる(Boedeck er ら，American Gastroenterological Assoc．888:A-222，1993)。好ましい実施態様においては、本発明のワクチン組成物は本発明のH.pyloriタンパク質の免疫原性フラグメントを表面に発現させた死滅全E.coliプレパレーションをベースとするか、またはE.coli溶解物をベースとすることが可能で、この場合、死滅全E.coliは担体またはアジュバントとして作用する。本発明のワクチン組成物の一部がH.pylori感染の防止にのみ有用であり、また一部はH.pylori感染の処置にのみ有用であり、また一部はH.pylori感染の防止および処置の両者に有用であることは当業者には自明である。好ましい実施態様においては、本発明のワクチン組成物は、H.pyloriに対する体液性および／または細胞性免疫を刺激することによりH.pylori感染に対する保護を提供する。H.pylo ri感染の任意の症状の改善、例えばH.pyloriによって引き起こされた疾患の処置に使用される医薬の投与量の低減、あるいは患者の血清または粘膜における抗体産生の増大が所望の臨床的ゴールである。 VII．H.pylori ポリペプチドと反応性の抗体本発明はまた、主題のH.pyloriポリペプチドと特異的に反応する抗体を包含する。抗−タンパク質／抗−ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準プロトコール（たとえばAntibodies:A Laboratory Manualed．Harlow & Lane，Col d Spring Harbor Press，1988）によって作成することができる。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳動物を、免疫原性の型のペプチドで免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、担体への接合または本技術分野で既知の他の技術が包含される。主題のH.pyloriポリペプチドの免疫原性の部分をアジュバントの存在下に投与することができる。免疫の進行は血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイが、抗原としての免疫原とともに抗体のレベルの評価に使用できる。好ましい実施態様においては、本発明の抗体は本発明のH.pyloriポリペプチドの抗原決定基、たとえば配列表に含まれる本発明のポリペプチドの抗原決定基または密接に関連したヒトまたは非ヒト哺乳動物の同族体（たとえば90％さらに好ましくは少なくとも95％のホモロジーを示す）に免疫特異的である。さらに他の好ましい本発明の実施態様においては、抗−H.pylori抗体は、配列表に含まれる本発明の配列とのホモロジーがたとえば80％未満のタンパク質とは、実質的に交叉反応（すなわち、特異的に反応）しない。「実質的に交叉反応しない」とは、抗体が、配列表に含まれる本発明のタンパク質に対する結合親和性10％未満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは１％未満の非相同性タンパク質に対して結合親和性を有することを意味する。特に好ましい実施態様においては、細菌および哺乳動物抗原の間の交叉反応性はない。本明細書で使用される抗体なる語は、H.pyloriポリペプチドと同じく特異的に反応するそのフラグメントを包含する意図である。抗体は、慣用の技術を用いて分画化し、フラグメントは全抗体について上述したのと同じ様式で有用性についてスクリーニングすることができる。たとえば、F(ab')₂フラグメントは抗体をペプシンで処理することによって生成させることができる。得られたF(ab')₂フラグメントはジスルフィド結合を還元するように処理し、Fab'を製造することができる。本発明の抗体には、さらに抗−H.pylori部分を有する二重特異性およびキメラ分子を包含することを意図する。 H.pyloriポリペプチドまたはH.pyloriポリペプチド変異体に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ab）の両者、ならびに抗体フラグメントたとえばFab'およびF(ab')₂は、H.pyloriポリペプチドの作用を遮断し、本発明の特定のH.pyloriポリペプチドの異常なまたは望ましくない細胞内シグナリングにおける役割、ならびに本発明の抗−H.pyloriポリペプチド抗体のマイクロインジェクションによってH.pyloriの正常細胞機能の研究を行うことが可能である。 H.pyloriのエピトープに特異的に結合する抗体は、H.pylori抗原の存在量および発現パターンの評価のために、組織サンプルの免疫組織化学的染色に使用することもできる。抗−H.pyloriポリペプチド抗体は、臨床検査操作の一部として、組織または体液中のH.pyloriのレベルを検出および評価する免疫沈降および免疫ブロッティングに診断的に使用することができる。同様に個体内のH.pyloriポリペプチドレベルをモニターする能力は、このような疾患に冒された個体に対する所定の処置基準の有効性の決定を可能にする。H.pyloriポリペプチドのレベルは体液たとえば尿サンプル中に見出される細胞内で、または胃の生検で得られた組織内で測定することができる。抗−H.pylori抗体を用いる診断的アッセイには、たとえばH.pylori感染の初期診断に役立つように設計されたイムノアッセイがある。本発明はまた、特異的なH.pylori抗原を用いてこの細菌に感染した個体からのサンプル中に含まれる抗体を検出する方法としても使用することができる。本発明の抗−H.pyloriポリペプチド抗体の他の適用には、発現ベクターたとえばλgt11、λgt18−23、λZAPおよびλORF８内に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングにおける適用がある。正しいリーディングフレームおよび方向性で挿入されたコード配列を有するこの種類のメッセンジャーライブラリーは融合タンパク質を産生できる。たとえばλgt11はアミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列から構成され、カルボキシ末端は異種ポリペプチドからなる融合タンパク質を産生する。主題のH.pyloriポリペプチドの抗原性エピトープはついで、たとえば感染させたプレートからリフトしたニトロセルロースフィルターを抗−H.pyloriポリペプチド抗体と反応させて抗体を検出することができる。このアッセイで評価されたファージはついで感染プレートから単離できる。すなわち、H.pylori遺伝子同族体の存在を他の種から検出してクローン化すること、また別のアイソフォーム(スプライシング変異体を含む)を検出しクローン化することができる。 VIII．本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体を含有するキット本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体は他の試薬および部品と組み合わせてキットを形成させることができる。診断の目的でのキットは通常、核酸、ポリペプチドまたは抗体をバイアルまたは他の適当な容器に加えて構成される。キットは通常ハイブリダイゼーション反応、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の実施のための他の試薬、または凍結乾燥成分の再構築のための他の試薬たとえば水性メジウム、塩、緩衝剤等から構成される。キットにはまた、サンプルの処理用試薬たとえば界面活性剤、カオトロピック塩等を加えてもよい。キットにはまた固定化手段たとえば、粒子、支持体、ウエル、ディップスティック等を包含させてもよい。キットはまた、標識手段たとえば染料、発色試薬、放射性同位元素、蛍光試薬、ルミネッセンスまたは化学ルミネッセンス剤、酵素、挿入剤等から構成してもよい。本明細書に提供された核酸およびアミノ酸配列情報により、当業者はそれらの特定の目的に役立つキットを容易に組み立てることが可能である。キットにはさらに使用のための使用説明書を包含させることができる。 IX．H.pylori ポリペプチドを用いる薬剤のスクリーニングアッセイ精製および組換えH.pyloriポリペプチドを利用することにより、本発明は、正常細胞機能、この場合は主題のH.pyloriポリペプチドの正常細胞機能のまたはそれらの細胞内シグナリングにおける役割のアゴニストまたはアンタゴニストである薬剤のスクリーニングに使用できるアッセイを提供する。このようなインヒビターまたはポテンシエーターがヒトにおけるH.pylori感染を撲滅する新しい治療剤として有用である。多様なアッセイフォーマットが十分満足され、それらは本発明に照らして当業者には理解されよう。化合物および天然の抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムには、所定の期間に検討できる化合物の数を最大にするため、高度のスループットアッセイが望ましい。たとえば精製または半精製タンパク質に由来する無細胞系で実施されるアッセイは、試験化合物により誘導される分子標的における変化の迅速な発生および比較的容易な検出を可能にする点で、多くの場合、「一次」スクリーニングとして好ましい。しかも試験化合物の細胞毒性作用および／または生物学的利用性は一般にインビトロシステムでは無視され、その代わりアッセイは他のタンパク質との結合親和性の変動または分子標的の酵素的性質の変化に現われる分子標的に対する薬剤の作用に主として集中される。したがって、本発明のスクリーニングアッセイの例では、興味ある化合物は単離され精製されたH.pyloriポリペプチドと接触させる。スクリーニングアッセイはインビトロにおいて、精製されたH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントにより構成され、この場合、H.pyloriポリペプチドは酵素活性を有し、そのポリペプチドの活性は検出可能な反応生成物を生じる。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を使用して得られたデータから用量反応曲線を作成して評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを提供するために対照のアッセイも行われる。適当な生成物には、たとえば検出が容易に自動化できるように、特有の吸収、蛍光、または化学ルミネッセンスを発する性質をもつ化合物が包含される。様々な合成または天然に存在する化合物がH.pyloriポリペプチドの活性を阻害または増強する化合物を同定するためのアッセイで試験できる。これらの活性な化合物の一部は直接、または膜の透過性もしくは溶解性を促進する化学的変化により、全生存H.pylori細胞で、同じ活性（たとえば酵素活性）を阻害または増強する。本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。本出願を通じて引用されたすべての文献および公開された特許出願の内容は引用により本明細書に導入される。実施例Ｉ．H.pylori ＤＮＡのクローニングおよび配列決定 H.pyloriの染色体ＤＮＡはSchlief R．F．& Wensink P．C．によってあらましが記述されている基本的ＤＮＡプロトコール(Practical Methods in Molecu1arB io1ogy，p.98，Springer-Verlag，NY，1981)をわずかに改変して用い、単離した。略述すれば、細胞をペレット化し、ＴＥ（10mM Tris，1mM EDTA，pH7.6）に再懸濁し、ついでＧＥＳ溶解緩衝液（5.1Ｍグアニジンチオシアナート，0.1Ｍ EDT A，pH8.0，0.5％Ｎ−ラウリルサルコシン）を加えた。懸濁液を冷却し、酢酸アンモニウム（NH₄Ac）を終濃度2.0Ｍになるように加えた。ＤＮＡを最初にクロロホルム、ついでフェノール−クロロホルムで抽出し、クロロホルムで再抽出した。ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、70％EtOHで２回洗浄し、乾燥し、ＴＥに再懸濁した。単離後に、全ゲノムH.pylori ＤＮＡを中央サイズ2000bpに噴霧乾燥した(Bode nteichら，Automated DNA Sequencing and Analysis(J.C.Ventered.)，Academic Press，1994)。噴霧乾燥後ＤＮＡを濃縮し、標準１％アガロースゲル上において分離した。サイズ約900〜1300bp、1300〜1700bp、1700〜2200bpおよび2200〜2 700bpに相当する数種の分画をゲルから切り出し、GeneClean操作（Bio101，Inc. ）によって精製した。精製されたＤＮＡフラグメントをついで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてブラント末端化した。充填したＤＮＡをついで100〜1000倍モル過剰のユニークなBstXI−リンカーアダプターにライゲートした。これらのリンカーはBstXI−切断pMPXベクターに相補性で、オバーハングは自己相補性ではない。したがって、リンカーはコンカテマー化せず、またそれ自体容易にはカットベクター再ライゲートもしない。リンカー採用挿入体を単構成から１％アガロースゲル上で分離し、GeneCleanを用いて精製した。リンカー採用挿入体をついでそれぞれ20pMPXベクターにライゲートし、一連の「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。ベクターはアダプターダイマーがクローン化される時点でインフレームになるクローニング部位にアウトオブフレームのｌａｃＺ遺伝子を含有し、これらはその青色によって回避が可能である。以後の全工程はChurch G.M．& Kieffer-Higgins S.，Science 240:185-188,19 88に概略が述べられているマルチプレックスＤＮＡ配列決定プロトコールに基づいて行われた。プロトコールの主要な改変のみを特に示す。略述すれば、20のベクターそれぞれをついでＤＨ５αコンピーテント細胞にトランスフォームした（ Gibco／BRL、DH５αトランスフォーメーションプロトコール）。アンピシリン、メチシリンおよびIPTG／Xgalを含有する抗生物質プレート上で平板培養してライブラリーを評価した。プレートを37℃で一夜インキュベートした。ついで成功したトランスフォーマントを用いてクローンを平板培養し、マルチプレックスにプールした。クローンを採取し、40mlの増殖培地培養液にプールした。培養液を37 ℃において一夜増殖させた。Qiagen Midi−prepキットおよびTip−100カラム（Q iagen，Inc.）を用いてＤＮＡを精製した。この方法で１プールあたり100μｇのＤＮＡが得られた。ＤＮＡの15個の96−ウエルプレートを生成させて５〜10倍の配列重剰性を得、200〜300塩基平均の読み取りの長さが推定された。これらの精製ＤＮＡサンプルをついで化学的分解法（Church G．M．& Kieffer -Higgins S.，Science 240:185-188，1988）に基づくマルチプレックスＤＮＡ配列決定を用いてまたはSequithrem（Epicenter Technologies）ジデオキシ配列決定プロトコールによって配列を決定した。配列決定反応物を電気泳動に付し、40 cmゲルからの直接トランスファー電気泳動（Richterich P．& Church G．M.，Me thods in Enzymology 218:187-222，1993）またはエレクト・ロブロッティング（Church，前出）によりナイロン膜上に移した。各ゲルあたり24のサンプルを流した。化学的配列決定によって45個、ジデオキシ配列決定により８個の膜の製造に成功した。ＤＮＡを紫外線照射によって膜に共有結合で結合させ、ベクター上のタグ配列の相補性の標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた（Church，前出）。膜を非特異的結合プローブから濯ぎ、Ｘ−線フィルムに露出して個々の配列ラダーを可視化した。オートラジオグラフィー後、65℃でインキュベートしてハイブリダイズしたプローブを除去し、ハイブリダイゼーションサイクルを、膜が化学的配列決定による場合は38回、ジデオキシ配列決定による場合は10回プローブされるまで他のタグ配列で反復した。すなわち、各ゲルが多数のフィルムを産生し、それぞれが新しい配列情報を含有した。新たなブロットを処理する場合は常に、最初に各プールに付加された内部標準配列についてプローブした。フィルムのデジタルイメージを、レーザー走査デンシトメーター（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）を使用して発生させた。デジタルイメージはプログラムREPLICA（登録商標，Churchら，Automated DNA Sequencing and Analysis(J ．C．Venter ed.)，Academic Press，1994）を使用し、コンピューターワークステーション（VaxStation 4000's）で処理した。イメージの処理には、レーン整理、強度差を除去するためのコントラスト調整、および反復ガウス逆重畳による分解能の上昇を包含した。配列をついで自動的にREPLICA（登録商標）に取り込み、プロジェクトデータベースに保存する前に、相互のプルーフリーディングのために表示した。プルーフリーディングには、フィルムイメージの迅速な肉眼的走査、ついで表示されたバンド上でのマウスクリックによる塩基コールの修正が含まれた。ゲノムＤＮＡの同一部分をカバーする多重配列の読みが編集に適当な配列重剰で提供されるので、多くの配列エラーが検出され訂正された。各配列には自動的に確認番号（マイクロタイタープレート、プローブ情報、およびレーンセット番号に相当）が付された。この番号は配列の永久的同定番号として特殊なデータベースに頼らないで任意の特定の配列の起源を同定することができる。 H.pylori配列の定常的な組立てはプログラムFALCON（Churchら，Automated DN A Sequencing and Analysis(J．C．Venter ed.)，Academic Press，1994）を用いて実施した。このプログラムは大部分の配列について迅速で信頼性の高いことが証明されている。組立てられたコンティーグはREPLICA（登録商標）と相万に作動するGenetics Computer Group（GCG）によって開発されたGelAssembleの改良バージョン（Devereuxら，Nucleic．Acid Res．12:387-395，1984）を用いて表示した。これが、多重配列ゲルイメージをREPLICA（登録商標）データベースから即時に呼び出して表示し、コンティーグの迅速な走査およびアッセンブリー中の異なる配列読みの間に矛盾が生じた場所のゲルトレースのプルーフリーディングを可能にする統合的な編集を行う。 II．組換えH.pylori ＤＮＡ配列の同定、クローニングおよび発現 H.pyloriからの膜および分泌タンパク質のクローニング、発現および精製を容易にするため、強力な遺伝子発現システム、E.coliにおける組換えタンパク質のクローニングおよび発現のためのｐＥＴシステム（Novagen）を選択した。また、ペプチドタグ、His−TagをコードするＤＮＡ配列を興味あるＤＮＡ配列の3'末端に融合させて、組換えタンパク質産物の精製を促進させた。5'末端シグナル配列の変化を回避するために融合には3'末端を選択した。ｐｐｉＢは上記に対する例外であり、発現試験において対照として用いるため遺伝子をクローン化した。この試験では、H.pylori ppiBの配列は、完全長遺伝子の5'末端に融合したHis− TagをコードするＤＮＡ配列を含有する。この遺伝子のタンパク質産物はシグナル配列を含まず、細胞質ゾルタンパク質として発現するからである。 Helicobacter pylori のJ99株からの膜および分泌タンパク質のＯＲＦを含有するＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅およびクローニング H.pylori J99株からのクローニングのため（本発明のDNA配列の表から）選択された配列はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅クローニング用に調製した。オープンリーディングフレーム(ORF)の5'および3'末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を設計し、購入した(GibcoBRLLife Technologi es，Gaithersburg，MD，USA）。順行プライマー（配列の5'末端に特異的）はすべて5'の最末端にＮｃｏＩクローニング部位を含むように設計し、HpSeq．48210 82では例外としてＮｄｅＩを使用した。これらのプライマーはバリン残基および未変性のH.pylori ＤＮＡ配列の残りのコード配列に続くメチオニン残基でタンパク質の翻訳開始が可能なように設計された。H.pylori配列4821082は例外でイニシエーターのメチオニンは直ちに未変性のH.pylori ＤＮＡ配列の残部に続く。逆行プライマー（H.pylori ORFの3'末端に特異的）はすべて5'の最末端に各H. pylori配列のpET−28bのリーディングフレームへのクローニングを可能にするようにEcoRI部位を包含させた。pET−28bベクターはHis−Tagからなる６個のヒスヂジン残基（Ｃ最末端）を含むさらに20個のカルボキシ末端アミノ酸（HpSeq．2 6380318およびHpSeq．14640637中の19個のアミノ酸のみ）をコードする配列を提供する。上記に対する例外は、前述のようにｐｐｉＢ遺伝子の構築ベクターである。ｐｐｉＢ遺伝子の5'末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーはその5'最末端にBamHI部位をコードし、ｐｐｉＢ遺伝子の3'末端のためのプライマーはその5'最末端にＸｈｏＩ部位をコードした。 H.pyloriのJ99株（ATCC #55679;Genome Therapeutics Corporation，100 Beav er Street，Waltham，MA 02154により寄託）から調製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅反応(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons， Inc.，F.Ausubelら，ed.，1994）のためのＤＮＡ鋳型の起源として使用した。H ．pylori ORFを含有するＤＮＡ配列を増幅するためには、50ngのゲノムＤＮＡを、2mM MgCl₂、特定のH.pylori ORFに相補性で隣接する合成オリゴヌクレオチドプライマー（順行および逆行プライマー）１μM、各デオキシヌクレオチドトリホスフェート：dATP、dGTP、dCTP、dTTPの0.2mM、ならびに2.5単位の熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq，RocheMolecular Systems，Inc.，Branchburg， NJ，USA）を終容量100μl中に含む反応バイアルに添加した。以後の熱サイクル条件には、Perkin Elmer Cetus／Gene Amp PCR System 9600熱サイクラーを用い、各ＯＲＦについて増幅されたＰＣＲ産物が得られる条件を採用した。タンパク質26054702、タンパク質7116626、タンパク質29479681、タンパク質3 0100332およびタンパク質4821082；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、30℃で15秒間および72℃で1.5分間、 23サイクル、94℃で15秒間、55℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。タンパク質16225006；変性94℃で２分間、 25サイクル、95℃で15秒間、55℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。タンパク質4721061；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、36℃で15秒間および72℃で1.5分間、 23サイクル、94℃で15秒間、60℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。タンパク質26380318；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、38℃で15秒間および72℃で1.5分間、 23サイクル、94℃で15秒間、62℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。タンパク質14640637；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、33℃で15秒間および72℃で1.5分間、 30サイクル、94℃で15秒間、55℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。 H.pylori ppiＢの増幅条件；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、32℃で15秒間および72℃で1.5分間、 25サイクル、94℃で15秒間、56℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。熱サイクル反応の完了後に、増幅されたＤＮＡの各サンプルをQiaquick SpinP CR精製キット（Qiagen，Gaithersburg，MD，USA）を用いて洗浄し精製した。増幅したＤＮＡサンプルすべてを制限エンドヌクレアーゼNcoIおよびEcoRI(New En gland BiolLabs，Beverly，MA，USA)、またはHpSeq．4821082（配列番号：1309 ）の場合は、Nde ＩおよびEcoRI（Current Protocols in MolecularBiology，Joh n Wiley and Sons，Inc.，F．Ausubelら，ed.，1994）による消化に付した。ＤＮＡサンプルはついで1.0％NuSeive（FMC BioProducts，Rockland，ME，USA）アガロースゲル上で電気泳動に付した。ＤＮＡはエチジウムブロミドへの暴露および長波長ＵＶ照射によって可視化した。アガロースゲルから単離されたスライス中に含有されるＤＮＡはBio 101 GeneCleanキットプロトコール（Bio 101Vista，C A，USA）を用いて精製した。 pET−28b原核細胞発現ベクターへのH.pylori ＤＮＡ配列のクローニングpET− 28bベクターは、Nco ＩおよびEcoRI、またはH.pyloriタンパク質4821082の場合はNde ＩおよびEcoRIで消化しクローニングのために調製した（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelら，ed.，1994 ）。ppiＢをクローニングする場合は挿入された遺伝子の５’末端に融合できるH is−TagをコードするpET−28aベクタを用い、ppiＢ遺伝子をクローン化するためのクローニング部位をBamHIおよびXho Ｉ制限エンドヌクレアーゼでの消化により調製した。消化後、ＤＮＡ挿入体を先に消化したpET−28b発現ベクター中にクローン化し（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.A usubelらed.，1994）、例外としppiＢについて増幅した挿入体はpET−28a発現ベクター中にクローニングした。ライゲーション反応の産物を用いて、ついで、以下に記載のように、E.coliのＢＬ21株をトランスフォームした（Current Protoc ols in Molecular Biology，John Wiley and Sons,Inc.，F.Ausubelらed，1994 ）。組換えプラスミドによるコンピーテント細菌のトランスフォーメーションコンピーテントな細菌、E.coli株ＢＬ21またはE.coli株ＢＬ21（DE３）を、クローン化されたH.pylori配列を有する組換えｐＥＴ発現プラスミドにより、標準方法でトランスフォームした（Current Protocols in Molecular，John Wiley a nd Sons，Inc.，F.Ausubelら，ed.，1994）。略述すれば、１μlのライゲーション反応混合物を50μlのエレクトロコンピーテント細胞と混合し、高圧のパルスに付し、ついでサンプルを0.45mlのＳＯＣ培地（0.5％の酵母エキス、2.0％トリプトン、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄および20mMのグルコース）中、37℃において攪拌しながら１時間インキュベートした。サンプルをついで25μg／mlの硫酸カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に播いて一夜増殖させた。ＢＬ21のトランスフォームされたコロニーを採取し、以下に記載するようにクローン化された挿入体を評価した。 H.pylori配列を有する組換えｐＥＴ発現プラスミドの同定組換えpET−28b−H.pylori ORFでトランスフォームした個々のＢＬ21クローンを、最初のＰＣＲ増幅クローニング反応に用いられた各H.pylori配列に特異的な同一の順行および逆行プライマーを用いて、クローン化された挿入体のＰＣＲ増幅により分析した。成功した増幅は発現ベクター中へのH.pylori配列のインテグレーションを確証した（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelら，ed.，1994）。 BL21トランスフォーマントからのプラスミドDNAの単離および調製適当にクローニングされたH.pylori ORFを有する組換えpET−28bベクターの個々のクローンを採取し、５mlのＬＢ培地＋25μg／mlの硫酸カナマイシン中で一夜インキュベートした。翌日、プラスミドＤＮＡを単離し、Qiagenプラスミド精製プロトコール（Qiagen Inc.，Chatsworth，CA，USA）を用いて精製した。組換えH.pylori配列のE.coli内における発現ｐＥＴベクターは、クローニングまたはプラスミド調製の目的でE.coli Ｋ−1 2株たとえばHMS174、HB101、JM109、DH５等任意の株中で増殖させた。発現のための宿主には、T7 RNAポリメラーゼの遺伝子の染色体コピーを含有するE.coli株が包含される。これらの宿主は、lacＩ遺伝子、1acUV５プロモーターおよびT7 R NAポリメラーゼの遺伝子をもつλ誘導体、バクテリオファージDE３の溶菌原である。T7 RNAポリメラーゼはイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）の添加により誘導し、T7 RNAポリメラーゼを任意の標的プラスミド、たとえばＴ７プロモーターと興味ある遺伝子を有するpET−28bに転写する。使用された株には、ＢＬ21（DE３）（Stud ier，F．W.，Rosenberg，A,．H.，Dunn，J．J．& Dubendorff，J．W.，Meth．En zymol．185:60-89，1990）が包含される。組換えH.pylori配列の発現には上述のようにして単離したプラスミドＤＮＡ50 ngを用い上述のコンピーテントＢＬ21（DE３）細菌（pET発現システムキットの一部としてNovagenから提供された）をトランスフォームした。lacＺ遺伝子（β −ガラクトシダーゼ）をH.pyloriの組換え構築体について記載したｐＥＴシステム中で発現させた。トランスフォームされた細胞をＳＯＣ培地中で１時間培養し、培養体をついで25μg／mlの硫酸カナマイシンンを含有するＬＢ培地上で平板培養した。翌日、細菌コロニーをプールし、25μg／mlの硫酸カナマイシンンを含有するＬＢ培地中で600nMにおける光学密度0.5〜1.0 O.D.単位まで増殖させ、この時点で１mMのＩＰＴＧを培養液に加え、H.pylori組換えＤＮＡ構築体の遺伝子発現を３時間誘導した。ＩＰＴＧで遺伝子発現誘導後、細菌をSorvall RC-3B遠心分離器により４℃、3 500×ｇにおいて15分間遠心分離してペレット化した。ペレットを50mlの冷却10m M Tris−HCl，pH8.0，0.1Ｍ NaClおよび0.1mM EDTA（STE緩衝液）に再懸濁した。細胞をついで４℃、2000×ｇで20分間遠心分離した。湿ったペレットを秤量し、タンパク質精製の準備ができるまで−80℃に凍結した。 III．E.coli からの組換えタンパク質の精製分析方法精製タンパク質プレパレーションの濃度はアミノ酸含量から計算した吸光係数を使用して分光光度法によって定量した(Perkins，S．J.，Eur．J．Biochem．15 7 :169-180，1986)。タンパク質濃度はまた，Bradford，M.M.，Anal.Biochem．72 :248-254，1976およびLowry，O.W，Rosebrough,N.，Farr，A．L．& Randall，R ．J.，J．Biol．Chem．193:265-275，1951の方法により標準としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（12％または4.0〜25％アクリルアミド勾配ゲル）はBioRad（Hercules，CA，USA）から購入し、クーマッシーブルーで染色した。分子量マーカーにはウサギ骨格筋ミオシン（200kDa）、E.coliガラクトシダーゼ(116kDa)、ウサギ筋ホスホリラーゼＢ（97.4kDa）、ウシ血清アルブミン（66.2kDa）、オバルブミン（45kDa）、ウシカルボニックアンヒドラーゼ(31kDa )、大豆トリプシンインヒビター(21.5kDa)、卵白リゾチーム（14.4kDa）およびウシアプロチニン（6.5kDa）を包含させた。１．可溶性タンパク質の精製すべての工程を４℃で実施した。凍結した細胞を解凍し、５容量の溶解緩衝液（20mM Tris，pH7.9，0.5Ｍ NaCl，５mMイミダゾール）中に10％グリセロール、 0.1％２−メルカプトエタノール、200μg／mlのリゾチーム、１mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、およびそれぞれ10μg／mlのロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチン、Ｌ−１−クロロ−３−[４−トシルアミド]−７ −アミノ−２−ヘプタノン（TLCK）、Ｌ−１−クロロ−３−[４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン（TPCK）、および大豆トリプシンインヒビターとともに再懸濁し、小容量のマイクロフルーイダイザー（M−110S型、Microflui dics International Corporation，Newton，MA）を数回通して破壊させた。得られたホモジネートに0.1％Brij 35を加え、100,000×ｇで１時間遠心分離して澄明な上清を得た（粗抽出物）。 0.8μmのSuporフィルター（Gelman Sciences，FRG）を通してろ過したのち粗抽出物を、10％グリセロール、0.1％Brij 35および１mM PMSFを含有する溶解緩衝液に予め平衡化したNi²⁺−ニトリロトリ酢酸−アガロース（NTA）の床容量５m l上に直接負荷した（Hochuli，E.，Dbeli，H．& Schacheer，A.，J.Chromatogra phy 411:177-184，1987）。カラムを10％グリセロール、0.1％Brij 35を含有する溶解緩衝液250ml（50床容量）で洗浄し、10％グリセロール、0.05％Brij 35、１mM PMSFならびに20、100、200および50 0mMイミダゾールを含有する溶解緩衝液で順次、連続的に溶出した。分画はＯＤ₂ ₈₀ nmの吸収によってモニターし、ピーク分画をSDS−PAGEで分析した。組換えタンパク質を含む分画は100mMイミダゾールで溶出した。組換えタンパク質14640637とタンパク質、β−ガラクトシダーゼ（lacＺ）およびペプチジル−プロリルcis−transイソメラーゼ（ppiＢ） Ni²⁺−NTA−アガロースカラムからの組換えタンパク質含有分画をプールし、ついで遠心ろ過（Centriprep-10，Amicon，MA）により約５mlに濃縮し、緩衝液Ａ（10mM Hepes，pH7.5，150mM NaCl，0.1mM EGTA）に平衡化したSephacryl S-1 00 HRゲルろ過メジウムの180-mlカラム（1.6×91cm）に直接負荷し、緩衝液Ａ中を18ml／時間で流した。組換えタンパク質を含む分画は280nmの吸収によって同定し、SDS−PAGEによって分析した。分画をプールし、遠心ろ過によって濃縮した。組換えタンパク質7116626 Ni²⁺−NTA−アガロースカラムからの組換えタンパク質含有分画をプールし、１リットルの透析緩衝液（10mM MOPS，pH6.5，50mM NaCl，0.1mM EGTA，0.02％B rij 35，１mM PMSF）に対して一夜透析した。翌朝、微細な白色沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を、50mM NaClを含有する緩衝液Ｂ（10mM MOPS，pH 6.5，0.1mM EGTA）に平衡化したMonoＳ高速液体クロマトグラフィーカラム（Pha rmacia Biotechnology，Inc.，Piscataway，NJ，USA）８ml（８×75mm）上に負荷した。カラムを、50mM NaClを含有する緩衝液Ｂ 10床容量で洗浄して、NaClを増量する（50〜500mM）50-ml直線勾配で展開した。組換えタンパク質7116626は急峻なピークとして300mM NaClで溶出した。２．封入体からの不溶性タンパク質の精製以下の工程は４℃で実施した。細胞ペレットを10％グリセロール、200μg／ml のリゾチーム、５mMのEDTA、１mMのPMSFおよび0.1％メルカプトエタノールとともに溶解緩衝液に再懸濁した。細胞破壊装置を通したのち、得られたホモジネートに0.2％デオキシコール酸を加え、10分間攪拌し、ついで20,000×ｇで30分間遠心分離した。ペレットを10％グリセロール、10mMのEDTA、１％Triton X-100、１mMのPMSFおよび0.1％メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液で洗浄し、ついで１Ｍ尿素、１mMのPMSFおよび0.1％の２−メルカプトエタノールを含む溶解緩衝液で洗浄した。得られた白色のペレットは主として封入体からなり、破壊されなかった細胞および膜材料を含まない。組換えタンパク質26054702、16225006、30100332、4721061 以下の工程は室温で実施した。精製した封入体を１mM PMSFおよび0.1％の２− メルカプトエタノールを含む溶解緩衝液中8.0Ｍ尿素20mlに溶解し、室温で１時間インキュベートした。溶解しなかった物質を遠心分離によって除去した。澄明な上清をろ過し、ついで、溶解緩衝液中8.0Ｍ尿素に予め平衡化したNi²⁺−NTA− アガロースカラムに負荷した。このカラムを8.0Ｍ尿素、1.0mM PMSF、0.1％２− メルカプトエタノール含有溶解緩衝液250ml（50床容量）で洗浄し、８Ｍ尿素、１mM PMSF、0.1％の２−メルカプトエタノール、ならびに20、100、200および50 0mMイミダゾールを含有する溶解緩衝液で順次、連続工程により展開した。分画はＯＤ₂₈₀nmの吸収によってモニターし、ピーク分画をSDS−PAGEで分析した。組換えタンパク質を含む分画は100mMイミダゾールで溶出した。組換えタンパク質29479681、26380318 封入体を含有するペレットを８Ｍ尿素、１mM PMSFおよび0.1％の２−メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液Ｂ中に溶解し、室温で１時間インキュベートした。不溶性の物質を20,000×ｇで30分間遠心分離して除去し、澄明な上清を緩衝液Ｂ、６Ｍ尿素、１mM PMSF、0.1％の２−メルカプトエタノールで予め平衡化したSP−Sepharoseカラム15ml（1.6×7.5cm）上に負荷した。カラムを10床容量で洗浄したのち、０〜500mMのNaClの直線勾配で展開した。タンパク質サンプルの透析および濃縮尿素は0.5％デオキシコール酸（DOC）を含むTris−緩衝生理食塩水（TBS；10m M Tris pH8.0，150mM NaCl）中の尿素濃度を６Ｍ、４Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、0. 5Ｍそして最後には尿素を含まないＴＢＳと連続的に低下させた溶液に対して透析することによってタンパク質サンプルから徐々に除去した。各透析工程は室温で最低４時間実施した。透析後、サンプルはAmiconの撹拌セルを用いる加圧ろ過によって濃縮した。タンパク質濃度は、Perkins（Eur．J．Biochem．157:169-180，1986），Bradford （Anal．Biochem．72：248-254，1976）ならびにLowry（J．Biol．Chem．193：2 65-275，1951）の方法により測定した。上述の方法で精製した組換えタンパク質を以下の表４にまとめる。IV．H.pylori タンパク質のワクチン候補としての分析 H.pyloriタンパク質の免疫修飾作用を検討するために、マウス／H.pyloriモデルを使用した。このモデルは多くの点でヒトH.pylori感染を模倣する。焦点は治療的経口免疫療法のコンセプトを試験するため、H.pylori感染動物における経口的免疫処置の効果である。動物雌性SPF BALB／ｃマウスはBomholt Breedingセンター（Denmark）から購入した。それらは通常のマクロロンケージに入れ、水および飼料を自由に与えた。動物は到着時４〜６週齢であった。感染最低１週間の順化ののち動物をH.pylori（元は潰瘍患者からの単離株244）の２型株（VacＡ陰性）に感染させた。この株は本発明者らの手で以前からマウス胃の良好なコロナイザーであることが証明されていた。細菌は、10％ウシ胎児血清を補充したブルセラ培地上、微好気性雰囲気（10％CO₂，５％O₂）中37℃で一夜増殖させた。動物には経口用量のオメプラゾール（400μmol／kg）を投与し、この３〜５時間後に培地中H.pylori(約10⁸cfu／動物)を経口的に接種した。感染の陽性の取得は接種２〜３週後に一部の動物でチェックした。抗原組換えH.pylori抗原は外部に露出したH.pylori細胞膜との会合に基づいて選択した。これらの抗原は以下のグループから選択された。すなわち、(１)外膜タンパク質；(２)周辺質／分泌タンパク質；(３)外表面タンパク質；および（４）内膜タンパク質である。すべての組換えタンパク質は精製上の理由からヘキサ−ＨＩＳタグで構築され、非Helicobacter pylori対照タンパク質（E.coliからのβ −ガラクトシダーゼ；LacＺ）も同様に構築した。抗原はすべて可溶化型で、すなわちHEPES緩衝液または0.5％デオキシコール酸（DOC）含有緩衝液に溶解して与えた。抗原を下記の表５に挙げる。免疫処置各グループの動物を、34日の期間にわたって４回（１、15、25および35日）に免疫処置した。溶液または懸濁液とした精製抗原を100mg／マウスの用量で投与した。アジュバントとして、各免疫処置と同時に10μg／マウスのコレラトキシン（CT）を投与した。オメプラゾール（400mmol／kg）を抗原の酸分解からの保護のため、免疫処置の３〜５時間前に動物に経口投与した。感染対照動物にはＨＥＰＥＳ緩衝液＋ＣＴまたはＤＯＣ緩衝液＋ＣＴを与えた。最後の免疫処置から２〜４週後に動物を屠殺した。試験の全般的概略は以下の表６に示す。感染の分析粘膜感染：マウスはCO₂および頸部脱臼により屠殺した。腹部を開き、胃を摘出した。胃を大弯に沿って切開後生理食塩水で濯いだ。幽門洞および本体からの 25mm²の面積の粘膜を別個に外科用メスで掻き取った。掻き取った粘膜をブルセラ培地に懸濁し、Blood Skirrow選択プレート上で平板培養した。プレートを微好気性条件下に３〜５日間インキュベートし、コロニーの数を計測した。H.pylo riの同一性をウレアーゼおよびカタラーゼ試験ならびに直接顕微鏡検査またはグラム染色によって確認した。ウレアーゼ試験はほぼ次のように行った。試薬，Urea Agar Base Concentrate はDifco Laboratories，Detroit，MI（カタログ番号＃0284-61-3）から購入した。Urea Agar Base Concentrateは水で１：10に希釈した。希釈した１mlの濃厚液を100〜200mlの活動的に増殖しているH.pylori細胞と混合した。深紅色への変色は細胞がウレアーゼ陽性であったことを指示した。カタラーゼ試験はほぼ以下のように行った。試薬、N,N,N',N'−テトラメチル −ｐ−フェニレンジアミンはSigma、St.Louis，MO（カタログ番号＃T3134）から購入した。試薬の溶液（水中１％w／v）を調製した。H.pylori細胞はWhatmanろ紙上に吸い取らせ、１％溶液で覆った。暗青色への変色は細胞がカタラーゼ陽性であったことを指示した。血清抗体：すべてのマウスの血清は心臓穿刺によって採血した血液から調製した。血清抗体は、Helicobacter pyloriの特異的抗原をプレーティングした通常のＥＬＩＳＡ技術によって同定した。粘膜抗体：十二指腸本体および４cmの特定部分を穏やかに掻き取って粘膜内の抗体の存在を50％のマウスで検出した。抗体力価は通常のELISA技術により血清抗体と同様に測定した。統計的解析：Helicobacter pyloriのコロナイゼーションにおける有意な抗原作用の決定にはWilcoxon−Mann−Whitneyの順位和検定を用いた。Ｐ＜0.05を有意とした。Helicobacter pyloriの主要なコロナイゼーション部位は幽門洞であることから、幽門洞のコロナイゼーションの変化に特に重点を置いた。結果血清中の抗体：ＣＴとともに与えた試験抗原はすべて血清に測定可能な特異的力価の上昇を示した。最高の応答はタンパク質7116626、タンパク4721061、タンパク質26380318、タンパク質14640637およびタンパク質4821082で認められた（図１参照）。粘膜内抗体：掻き取った粘膜には試験したすべての抗原に対する特異的な抗体が認められた。これまでに最高の応答はタンパク質30100332で認められ、ついでタンパク質14640637およびタンパク質26380318であった（図２参照）。治療的免疫処置の効果：すべての対照動物（BALB／cマウス）がH.pylori（ＡＨ244株）は、胃の幽門洞および本体に良好にコロナイズした。試験した抗原中の３種のタンパク質（タンパク質4721061、タンパク質4821082およびタンパク質14640637)ではH.pylori感染の良好で有意な低下および／または撲滅が得られた。幽門洞でのコロナイゼーションの程度は対照に比較してタンパク質7116626およびタンパク質26380318による免疫処置後に低下した。タンパク質16225006、29479681および30100332の作用は対照と差がなかった。非H.pyloriタンパク質の対照タンパク質lacＺは撲滅作用を示さず、実際、HEPES＋CT対照に比較してより高いHelicobacter pyloriのコロナイゼーションを示した。図３および４に示すデータはそれぞれ、すべてHE PESおよびＤＯＣに溶解したタンパク質についてのものである。データは幾何平均値として示す。ｎ＝８〜10、Wilcoxon−Mann−Whitneyの順位和検定、＊＝ｐ＜0.05；ｘ／10=試験したマウスの総数に対するH.pyloriの撲滅を示したマウスの数である。示したデータは、本研究に包含されたH.pylori会合タンパク質のすべてが、経ロアジュバントＣＴとともに経口免疫原として使用した場合、特異的血清および粘膜抗体によって測定される免疫応答の刺激を生じた。大部分のタンパク質がこの動物モデルにおいて、H.pyloriのコロナイゼーションの低下、および一部の場合には、完全なクリアランスを招来した。低下またはクリアランスは、同種保護によるよりも異種保護によったことに留意すべきであり(ポリペプチドは、H.pyl ori Ｊ99株の配列に基づくもので、異種チャレンジ株（ＡＨ244）に対する治療的免疫処置試験に使用した)、広範囲のH.pylori株に対するワクチンの可能性が指示された。幽門洞における最高のコロナイゼーションは非Helicobacter pyloriタンパク質lacＺで処置した動物に認められ、Helicobacter pylori抗原で認められた作用は特異的であったことが指示された。これらのデータを考え合わせると、H.pylori感染の処置および／または防止にヒトで使用するための医薬処方におけるこれらのH.pyloriタンパク質の使用が強力に支持される。Ｖ．Helicobacter pylori 株における遺伝子配列の変動の分析ＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を比較するために、数種のH.pylori株からの４種の遺伝子をクローン化し、配列を決定した。この情報はH．pylori Ｊ99株、およびヒト患者から単離された他のH.pylori株の間の配列の変動の決定に使用された。染色体ＤＮＡの調製培養したH.pylori株（表９に掲げる）をＢＬＢＢ（１％トリプトン、１％ペプタミン、0.1％グルコース、0.2％酵母エキス、0.5％塩化ナトリウム、５％ウシ胎児血清）中でＯＤ₆₀₀が0.2になるまで増殖させた。細胞をSorvall RC-3Bにより４℃、3500×ｇにおいて15分間遠心分離し、ペレットを10mM Tris−HCl、0.1m M EDTA（TE）0.95mlに再懸濁した。リゾチームを終濃度１mg／mlになるように加え、同時にＳＤＳを１％、RNAseA＋Ｔ1をそれぞれ0.5mg／mlおよび５単位／mlになるように加え、37℃で１時間インキュベートした。ついで、プロテイナーゼＫを終濃度0.4mg／mlになるように添加し、サンプルを、55℃で１時間以上インキュベートした。サンプルにNaClを濃度0.65Ｍまで加え、注意深く混合し、0.7Ｍ NaCl中10％CTAB 0.15ml（終濃度１％CTAB／70mM NaCl）を加え、ついで65℃で20 分間インキュベートした。この時点でサンプルを、クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、フェノールで抽出し、ついでクロロホルム：イソアミルアルコールにより再度抽出した。ＤＮＡをEtOH（1.5×容量）またはイソプロパノール（0.6×容量）のいずれかにより−70℃で10分間沈殿させ、70％EtOHで洗浄し、ＴＥに再懸濁した。ＰＣＲ増幅およびクローニング 12種のHelicobacter pylori株から調製したゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅反応の鋳型ＤＮＡの原料として用いた（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelらed.，1994）。H.pylori ＯＲＦを含むＤＮＡ配列を増幅させるためには、ゲノムＤＮＡ（10ng）を、2mM Mg Cl₂、特定のH.pylori ＯＲＦに相補性で隣接する合成オリゴヌクレオチドプライマー（順行および逆行プライマー、表７参照）１μmol、各デオキシヌクレオチドトリホスフェート：dATP、dGTP、dCTP、dTTP 0.2mM、および熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ，U SA）0.5単位を終容量20μl中に含有する反応バイアル中に二重に取り、反応させた。各ＯＲＦについて増幅されたDNA産物を得るためにはPerkin ElmerCetus／Gene Amp PCR System 9600熱サイクラーで以下の熱サイクル条件を用いた。タンパク質7116626およびタンパク質346；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、30℃で15秒間および72℃で1.5分間、 23サイクル、94℃で15秒間、55℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。株ＡＨ5、5155、7958、ＡＨ24、およびＪ99についてタンパク質26054702；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、30℃で15秒間および72℃で1.5分間、 25サイクル、94℃で15秒間、55℃で15秒間および72℃で1.5分間、反応は72℃６分間で終結させた。株ＡＨ4、ＡＨ15、ＡＨ61、5294、5640、ＡＨ18、およびＨp244についてタンパク質26054702およびタンパク質294796813；変性94℃で２分間、２サイクル、94℃で15秒間、30℃で20秒間および72℃で２分間、 25サイクル、94℃で15秒間、55℃で20秒間および72℃で２分間、反応は72℃８分間で終結させた。熱サイクル反応の完了後に、各サンプル対を合わせてそのまま、以下に記載するようにｐＣＲクローニングベクター中へのクローン化に使用した。 H.pylori ＤＮＡ配列のpCR TAクローニングベクターへのクローニングすべての増幅された挿入体をOriginal TAクローニングキット（Invitrogen,Sa n Diego，CA）に記載の方法によってpCR 2.1ベクターにクローン化した。ついでライゲーション反応の産物を用い、以下に記載のE.coli株、TOP 10F'（H.pylori配列350の場合はINVaF'）をトランスフォームした。組換えプラスミドによるコンピーテント細菌のトランスフォーメーションコンピーテントな細菌、E.coli株、TOP IOF'またはINVaF'は標準方法によりクローン化されたH.pylori配列を有する組換えｐＣＲ発現プラスミドによってトランスフォームした（Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley and Sons，Inc.，F.Ausubelらed.，1994）。略述すれば、0.5μＭのＢＭＥ２μlをコンピーテント細胞50μlを含む各バイアルに添加した。ついで、ライゲーション反応混合物２μlをコンピーテント細胞と混合し、氷上で30分間インキュベートした。細胞およびライゲーション混合物をついで42℃で30秒間「熱ショック」に付し、さらに氷上に２分間置いたのち、サンプルを0.45m1のＳＯＣ培地（0.5％酵母エキス、2.0％トリプトン、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄ および20mMのグルコース）中、37℃で攪拌しながら１時間インキュベートした。サンプルをついで25μg／mlの硫酸カナマイシンまたは100μg／mlのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播いて、一夜増殖させた。TOP10F'またはI NVaF'でトランスフォームされたコロニーを採取し、以下に記載のようにクローン化された挿入体を評価するために分析した。 H.pylori配列を有する組換えＰＣＲプラスミドの同定組換えpCR−H.pylori ORFでトランスフォームされた個々のTOP 10F'またはINV aF'クローンを最初のＰＣＲ増幅クローニング反応に使用したのと同一の各H.pyl ori配列に特異的な順行および逆行プライマーを用いるクローン化挿入体のＰＣＲ増幅により分析した。増幅の成功はクローニングベクター中へのH.pylori配列のインテグレーションによって確証した(Current Protocols in Molecular Biol ogy，John Wiley and Sons，Inc.， F.Ausubelらed.，1994)。適当にクローン化されたH.pylori ＯＲＦを有する組換えｐＣＲベクターの個々のクローンを採取し、配列を分析した。配列分析はベクター特異的プライマー（pCRIIまたはpCR2.1，Invitrogen，San Diego，CAに見出される）および以下の表８に掲げるようなＯＲＦに特異的な配列決定プライマーを用いる標準プロトコールによってＡＢＩシーケンサー（Perkin Elmer）上で実施した。結果これらの実験におけるＰＣＲエラー率を確立するために、H.pylori株Ｊ99からの５種の別個のＰＣＲ反応混合物より調製したタンパク質26054702の５つの個々のクローンを、全長897ヌクレオチドにわたる累積計4485塩基のＤＮＡ配列について配列を決定した。５つのクローンのＤＮＡ配列を、以前に異なる方法すなわちランダムショットガンクローニングおよび配列決定によって得たＤＮＡ配列と比較した。本明細書に記載した実験についてのＰＣＲエラー率は4485塩基中２塩基変化であると決定され、これは推定エラー率0.04以下に相当する。ＤＮＡ配列分析は、細菌Helicobacterpyloriの12種の異なる株から遺伝子として同定されＰＣＲ法によって増幅された４種の異なるオープンリーディングフレームについて実施した。この試験に選択された４種のオープンリーディングフレーム中の３種の推定アミノ酸配列が、他の細菌種中に存在する特定のタンパク質に、統計的に有意なＢＬＡＳＴホモロジーを示した。それらのＯＲＦには、F.no vicidaにおけるＡＢＣトランスポーターをコードするva1Ａ & Ｂ遺伝子に相同なタンパク質26054702；H.influenzaeの外膜に存在するリポタンパク質ｅ（Ｐ４）に相同なタンパク質7116626；E.coliにおける鉄（III）二クエン酸トランスポートの外膜受容体fecＡに相同なタンパク質29479681が包含される。タンパク質346 は公開されているデータベース中の配列と低いホモロジーを示したことから、未知のオープンリーディングフレームとして確認された。 H.pyloriの各種の株の間のＯＲＦにおける保存または変動の程度を評価するために、ＤＮＡ配列および推定されるタンパク質配列の変化をH．pyloriのJ99株に見出されたＤＮＡおよび推定されるタンパク質配列と比較した（以下の表９参照）。結果はランダムショットガンクローニングで配列を決定したH.pyloriの.J９ 9株に対する同一性の百分率として示す。Ｊ99株における変動を制御するため、４種の各オープンリーディングフレームをＪ99細菌株から再びクローン化して配列決定し、その配列情報をＪ99株のランダムショットガン配列決定でクローン化した挿入体から収集した配列情報と比較した。データは、ＤＮＡ配列には最低0.12％の差（タンパク質346，Ｊ99株）〜約７％の変化（タンパク質26054702，株ＡＨ5）までの範囲の変動があることを示している。推定されたタンパク質配列では、変動なし（タンパク質346，株ＡＨ18およびＡＨ24）から7.66％のアミノ酸変化（タンパク質26054702，株ＡＨ5）までを示している。 VI．治療用標的となりうる必須H.pylori遺伝子を決定するための実験的ノックアウトプロトコール治療用標的は、タンパク質産物が必須の細胞経路、たとえば細胞エンベロープ合成、ＤＮＡ合成、転写、翻訳、調節およびコロナイゼーション／毒力に重要な役割を果たしていると思われる遺伝子から選択する。細胞に必須の遺伝子を同定するため、H.pylori遺伝子／ＯＲＦの部分の欠失ならびにカナマイシン抵抗性カセットの挿入突然変異誘発のプロトコールは以前に報告された方法(Labigne-Rousselら，J.Bacteriology．170:1704-1708，1988;Co verら，J.Biological Chemistry 269:10566-10573，1994;Reyratら，Proc．Natl .Acad.Sci．92:8768-8772，1995)から改変する。結果は遺伝子の「ノックアウト」である。 H.pylori遺伝子配列の同定およびクローニングノックアウトの標的として選択される遺伝子またはＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の配列はH.pyloriゲノム配列から同定され、遺伝子／ＯＲＦを特異的に増幅するプライマーの設計に使用される。すべての合成オリゴヌクレオチドプライマーは、OLIGOプログラム（National Bioscience，Inc.，Plymouth，MN 55447，USA）の補助によって設計され、Gibco/BRL Life Technologies（Gaithe rsburg，MD，USA）から購入することができる。ＯＲＦが800〜1000塩基対より小さい場合には、隣接プライマーはオープンリーディングフレームの外側から選択される。 Helicobacter pylori Hp Ｊ9株から調製されたゲノムＤＮＡ（ATCC55679；Gen ome Therapeutics Corporation，100 Beaver Street，Waltham，MA 02154により寄託された）を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によるＯＲＦ増幅のための鋳型ＤＮＡの原料として使用する（Current Protocols in Molecular Biology，Jo hn Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelら編，1994）。H.pyloriからのゲノムＤＮＡの調製（実施例I参照）は、10ngのゲノムHpJ99 ＤＮＡを、10mM Tris pH8.3， 50mM KCl, ２mM MgCl₂，２μMの合成オリゴヌクレオチドプライマー（順行＝Ｆ１，逆行＝Ｒ１）、0.2mMの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（dATP，dGTP，dCTP ，dTTP）、および1.25単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq，Roche Mo lecular Systems，Inc.,Branchburg，NJ，USA）を終容量40μlで含有する反応バイアル中に導入することによってＰＣＲ増幅を実施する。ＰＣＲはPerkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600熱サイクラーで実施する。熱サイクリング反応の完了後、増幅したＤＮＡの各サンプルをエチジウムブロミドで染色して２％ＴＡＥアガロースゲル上で可視化し（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelら編，1994）、期待されたサイズの単一産物が反応から生じたことを確認する。増幅したＤＮＡをついで洗浄し、Qiaquick Spin PCR精製キット（Qiagen，Gaithersburg，MD，USA ）を用いて精製する。ＰＣＲ産物をＴＡクローニング戦略を用い（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelら編，1994）ｐＴ７Blue Ｔ− ベクター（カタログ番号#69820-1，Novagen，Inc.，Madison，WI，USA）にクローン化する。ＰＣＲ産物のベクターへのライゲーションは、６倍モル過剰のＰＣＲ産物、10ngのｐＴ７Blue Ｔ−ベクター(Novagen)、１μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（New England Biolabs，Beverly，MA，USA）、ならびに200単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を終容量10μl中に混合することによって達成される。ライゲーションは16℃で16時間進行させる。ライゲーション産物をエレクトロポレーションコンピーテントなXL−１BlueまたはDH５-aE.coli細胞（Clontech Lab.,Inc．Palo Alto，CA，USA）にエレクトロポレートする（Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and S ons，Inc.，F.Ausubelら編，1994）。略述すれば、１μlのライゲーション反応物を40μlのエレクトロコンピーテント細胞と混合し、高圧パルス（25μFarad，2.5kV，200オーム）に付したのちサンプルを0.45m lのSＯＣ培地（0.5％酵母エキス，２％トリプトン，10mM NaCl，2.5mM KCl，10m M MgCl₂，10mM MgSO₄，20mMグルコース）中37℃で振盪しながら１時間インキュベートする。サンプルをついで100μg／mlのアンピシリン、0.3％のＸ-gal，および100μg／mlのIPTGを含有するＬＢ(10ｇ／lのバクトトリプトン，５ｇ/lのバクト酵母エキス，10ｇ/lの塩化ナトリウム)プレートに播く。これらのプレートを37℃において一夜インキュベートする。白色のアンピシリン抵抗性コロニーを選択し、100μg／mlのアンピシリンを含む５mlの液体ＬＢ中で増殖させ、Qiagen ミニプレッププロトコール（Qiagen，Gaithersburg，MD，USA）を用いてプラスミドＤＮＡを単離する。正しいH.pylori ＤＮＡ挿入体がクローン化されたことを確証するため、これらのpT7BlueプラスミドＤＮＡを鋳型とし、Ｊ99 H.pylori配列の最初の増幅に使用したのと同一の順行および逆行プライマーを用いてクローン化された挿入体のＰＣＲ増幅を実施した。２％ＴＡＥ、エチジウムブロミド染色アガロースゲル上で可視化し、正しいサイズのプライマーおよびＰＣＲ産物を認め、正しい挿入体がクローン化されたことを確認する。各ノックアウト標的について２〜６個の確証されたクローンが得られ、−70℃で凍結して保存する。ＰＣＲによるエラーを最小限にするため、これらの確証されたクローンからのプラスミドＤＮＡをプールし、以後のクローニング工程に使用する。ＯＲＦ内で中断または欠失（250塩基対まで）しているが互いに逆方向に配置されたH.pylori ＤＮＡの領域に隣接する第２のプライマー対を設計するため、遺伝子／ＯＲＦの配列を再び使用する。前に単離されたクローンの環状プラスミドＤＮＡのプールをこのＰＣＲのラウンドの鋳型として使用する。この対の欠失プライマーの増幅の方向は互いに異なるので、プライマーの間のＯＲＦ部分は得られたＰＣＲ産物中には含まれない。ＰＣＲ産物は両末端にH.pylori ＤＮＡを有し、それらの間に、ＯＲＦの一部分の本質的な欠失を生じたｐＴ７Blueベクター骨格をもつＤＮＡの線状片である。ＰＣＲ産物を１％ＴＡＥ、エチジウムブロミド染色アガロースゲル上で可視化し、正しいサイズの単一の産物のみが増幅されたことを確認する。カナマイシン抵抗性カセット（Labigne-Rousselら，J.Bacteriology．170:170 4-1708，1988）は、このＰＣＲ産物に以前に用いたＴＡクローニング法（Curren t Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，F.Ausubelら編，1994）によってライゲートする。Campylobacterカナマイシン抵抗性遺伝子を含むカナマイシンカセットは組換えプラスミドpCTB 8：kan（Coverら，J.Biol olical Chemistry 269：10566−10573，1994）のEcoRI消化を行うことによって得られる。適当なフラグメント（1.4kb）は、１％ＴＡＥゲル上に単離し、QIAqu ickゲル抽出キット（Qiagen，Gaithersburg，MD，USA）を用いて単離した。フラグメントは、４μgのDNAフラグメント、0.5mMのdATP、dGTP、dCTP、dTTP１μl、２μlのクレノウ緩衝液（New England Biolabs）、および５単位のクレノウＤＮ ΛポリメラーゼＩ大（クレノウ）フラグメント（New England Biolabs）を20μl の反応液中に混合し、30℃で15分間インキュベートし、75℃に10分間加熱して酵素を不活性化する、クレノウ充填プロトコールを使用して末端を修復する。このブラント末端カナマイシンカセットは、ついでQiaquickカラム（Qiagen，Gaithe rsburg，MD，USA）を通して精製し、ヌクレオチドを除去する。ついで、ブラント末端のカナマイシンカセット５μg、10mM Tris pH8.3、50mM KCl、2mM MgCl₂ 、５単位のＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq，RocheMolecular Systems，Inc.，Br anchburg，NJ，USA）、20μlの5mM dTTPを100μlの反応液中に混合し、反応液を 37℃で２時間インキュベートし「Ｔ」オーバーハングを発生させる。「Kan−T」カセットは、QIAquickカラム（Qiagen，Gaithersburg，MD， USA）を使用して精製する。欠失プライマーのＰＣＲ産物は（Ｆ2およびＲ2）10 〜20ngの欠失プライマーＤＣＲ産物、50〜75ngのKan−ＴカセットＤＮＡ、１μl の10×Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ反応混合物、0.5μlのＴ4 ＤＮＡリガーゼ（New Engl and Biolabs，Beverly，MA，USA）を10μlの反応液中に混合し、16℃で16時間インキュベートしKan−Ｔカセットにライゲートする。ライゲーション産物を前述のようにエレクトロポレーションによって、XL−１ BlueまたはDH５-a E.coli細胞にトランスフォームする。ＳＯＣ中に回収したのち、細胞を100μg／mlのアンピシリンを含有するＬＢプレート上で平板培養し、一夜37℃で増殖させる。これらのプレートをついで25μg／mlのカナマイシンを含有するプレート上でレプリカ平板培養して一夜増殖させる。得られたコロニーはｐＴ７B1ueベクターに存在するアンピシリン抵抗性遺伝子と新たに導入されたカナマイシン抵抗性遺伝子の両者を有する。コロニーを25μg／mlのカナマイシンを含むＬＢ中に採取し、プラスミドＤＮＡをQiagenミニプレッププロトコール（Qiagen，Gaithersburg，MD，USA）を用いて培養細胞から単離する。ＰＣＲ増幅による数種の試験をこれらのプラスミドに実施し、カナマイシンが H.pylori遺伝子／ＯＲＦに挿入されたことを確認し、カナマイシン抵抗性遺伝子のH.pylori遺伝子／ＯＲＦに対する相対的な挿入方向を決定する。カナマイシンカセットがH.pylori配列に挿入されたことを確証するため、ＰＣＲ増幅のための鋳型としてプラスミドＤＮＡを、H.pylori遺伝子／ＯＲＦのクローン化に最初に用いたプライマーのセットとともに使用する。正しいＰＣＲ産物は欠失遺伝子／ＯＲＦのサイズであるが、1.4kbのカナマイシンカセットの付加によりサイズは増大する。H.pylori伝子の発現に対するカナマイシン抵抗性カセットの極性作用の可能性を回避するため、ノックアウト遺伝子／ＯＲＦに対するカナマイシン抵抗性遺伝子の方向を決定したところ両方向とも同様にH.pyloriのトランスフォーメーションに使用される（下記参照）。カナマイシン抵抗性遺伝子の挿入方向を決定するためには、プライマーをカナマイシン抵抗性遺伝子の末端から設計する[Kan−１：5'-ATCTTACCTATCACCTCAAAT-3'（SEQ ID NO：207）、およびK an-2：5'-AGACAGCAACATCTTTGTGAA-3'(SEQ ID NO：208)]。それぞれのクローニングプライマーをそれぞれのKanプライマーとともに使用し（４種のプライマーの組合せ）、H.pylori配列に対するカナマイシンカセットの方向性を決定する。陽性のクローンを「Ａ」方向性（H.pylori遺伝子およびカナマイシン抵抗性遺伝子の両者について転写方向が同じである）または「Ｂ」方向性（H.pylori遺伝子の転写方向はカナマイシン抵抗性遺伝子の場合と逆である）とに分類する。同じ方向性を共有するクローン（ＡまたはＢ）を以後の実験のためにプールし、独立に H.pyloriにトランスフォームする。プラスミドＤＮＡのH.pylori細胞へのトランスフォーメーショントランスフォーメーションには、２種のH.pylori株、H.pylori配列データベースが得られるＤＮＡを提供する臨床単離株のATCC 55679、および継代されマウスの胃にコロナイズする能力のある単離株、AH 244を使用する。トランスフォーメーションのための細胞はSheep-Blood寒天プレート上またはブルセラ培養液中のいずれかで、37℃、10％CO₂、100％湿度において増殖させる。指数増殖期まで細胞を増殖させ、顕微鏡で調べて細胞が「健康」（細胞が活動的に動いている）であり、夾雑していないことを確認する。プレート上で増殖させた場合には細胞は滅菌ループでプレートから掻き取って収穫し、１mlのブルセラ培地に懸濁し、遠心分離し（１分、エッペンドルフマイクロ遠心器の最高速度で）、200μlのブルセラ培地に再懸濁する。ブルセラ培養液中で増殖させた場合は、細胞を遠心分離し（Beckman TJ6遠心器中3000rpmで15分）、細胞ペレットを200μlのブルセラ培地に再懸濁する。細胞のアリコートを採取して細胞の濃度を計算するために、60 0nmにおける光学密度を測定する。懸濁した細胞のアリコート(１〜５ OD₆₀₀単位／25μl）を予め加温したSheep-Blood寒天プレート上に取り、プレートを37℃、６％CO₂、100％湿度で、さらに４時間インキュベートする。このインキュベーション後に、10μlのプラスミドＤＮＡ（100μg／μl）をこれらの細胞上にスポットする。陽性対照（カナマイシン抵抗性遺伝子によりリボヌクレアーゼＨ遺伝子が中断されたプラスミドＤＮＡ）および陰性対照（プラスミドＤＮＡなし）を平行して実験する。プレートを37℃、６％CO₂に戻してさらに４時間インキュベートする。ついで細胞をブルセラ培地中に浸した吸取紙を用いてプレート上に播き、37℃、６％CO₂で20時間増殖させる。細胞をついで25μg ／mlのカナマイシンを含むSheep-Blood寒天プレート上に移し、37℃，６％CO₂， 100％湿度において３〜５日間増殖させる。コロニーが出現したならば、それらを採取し、25μg／mlのカナマイシンを含む新鮮なSheep-Blood寒天プレート上でパッチとして再増殖させる。トランスフォーマントのコロニーが適当な染色体位置における同種組換えによって生じたことを確証するために、３セットのＰＣＲ試験を実施する。ＰＣＲの鋳型（コロニーからのＤＮＡ）は以下のように、迅速煮沸ＤＮＡ調製法によって得られる。すなわち、コロニーのアリコート（楊枝でのコロニーの穿刺）を100 μlの１％Triton X−100，20mM Tris，pH8.5に導入し６分間煮沸する。等容のフェノール：クロロホルム（１：１）を加え、ボルテックス攪拌する。混合物を５分間マイクロ遠心に付し、上清をＰＣＲのＤＮＡ鋳型とし、以下のプライマーと組合わせて用い、適切な染色体位置における同種組換えを確証する。試験１．遺伝子／ＯＲＦの増幅のために最初に用いたクローニングプライマーによるＰＣＲ：正しい染色体位置における同種組換えの陽性結果は、サイズが欠失した遺伝子／ＯＲＦのサイズであることが期待されるが、1.4kbのカナマイシンカセットの付加によりサイズが増大している単一のＰＣＲ産物を示すことである。遺伝子／ＯＲＦのサイズと全く同じサイズのＰＣＲ産物は遺伝子がノックアウトされず、トランスフォーマントは正しい染色体位置における同種組換えの結果ではないことの証明である。試験２．Ｆ３（遺伝子／ＯＲＦの上流配列から設計されたプライマーであり、プラスミド上には存在しない）およびプライマーKan−１またはKan−２（カナマイシン抵抗性遺伝子の末端から設計されたプライマー）によるＰＣＲは用いられたプラスミドＤＮＡが「Ａ」または「Ｂ」方向性のいずれであるかに依存する。正しい染色体位置における同種組換えでは期待されたサイズ（すなわち位置Ｆ3 からカナマイシン抵抗性遺伝子の挿入部位まで）の単−ＰＣＲ産物が生じる筈である。ＰＣＲ産物が得られないか正しくないサイズのＰＣＲ産物はプラスミドが正しい部位に挿入されず、遺伝子はノックアウトされなかったことを証明する。試験３．Ｒ３（遺伝子／ＯＲＦの下流配列から設計されたプライマーであり、プラスミド上には存在しない）およびプライマ−Kan−１もしくはKan−２によるＰＣＲは用いられたプラスミドＤＮＡが「Ａ」もしくは「Ｂ」方向性のいずれであるかに依存する。正しい染色体位置における同種組換えでは期待されたサイズ（すなわち、カナマイシン抵抗性遺伝子の挿入部位からＲ3の下流位置まで）の単−ＰＣＲ産物が生じる筈である。この場合もＰＣＲ産物が得られないか正しくないサイズのＰＣＲ産物は、プラスミドが正しい部位に挿入されず、遺伝子はノックアウトされなかったことを証明する。上述の３つのすべての試験について陽性の結果を示すトランスフォーマントは遺伝子がインビトロにおける生存には必須ではないことを指示する。トランスフォーマントについで上述の３つの試験のいずれかにおける陰性の結果は、遺伝子が破壊されなかったこと、遺伝子がインビトロにおける生存に必須であることを指示する。２つの独立のトランスフォーメーションからコロニーは生じないが、中断されたリボヌクレアーゼＨプラスミドＤＮＡを有する陽性対照がトランスフォーマントを産生する場合は、プラスミドＤＮＡを、コロニー形成のために平板培養する前にトランスフォーマント集団からのＤＮＡについてＰＣＲによりさらに分析する。これは、プラスミドが細胞内に入り、正しい部位で同種組換えを受けることを確証する。略述すれば、プラスミドＤＮＡを上述のトランスフォーメーションプロトコールに従いインキュベートする。プラスミドＤＮＡとのインキュベーション後直ちにH.pylori細胞からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを上記試験２および試験３の鋳型として使用する。試験２および試験３における陽性の結果は、プラスミドＤＮＡが細胞内に入り、正しい染色体位置で同種組換えを受けることを確証する。試験２および試験３が陽性の場合で、生存能のあるトランスフォーマントが得られないことは、遺伝子が必須であり遺伝子の中断を受けた細胞はコロニーを形成できないことを指示する。 VII．高スループットの薬物スクリーニングアッセイクローニング、発現およびタンパク質精製高スループットの薬物スクリーニングアッセイに使用されるH.pylori標的遺伝子およびそのタンパク質産物たとえばH.pylori酵素のクローニング、トランスフォーメーション、発現および精製は上記実施例IIおよびIIIの記載にほぼ従い実施される。特定のH.pylori遺伝子産物、ペプチジル−プロピルcis-transイソメラーゼについてのスクリーニングアッセイの開発および適用は特定の実施例として以下に説明する。酵素アッセイアッセイはFischerらによる記載（Fischer,G．ら，Biomed.Biochim．Acta 43: 1101-1111，1984）にほぼ従い実施する。アッセイでは、試験ペプチド、Ｎ−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−ニトロアニリド（Sigma ＃S-7388、ロット＃84H5805）中のAla-Pro結合のcis-transイソメリゼーションを測定する。このアッセイは、Ala-Pro結合がtransである場合にのみ試験ペプチドを切断するプロテアーゼの能力が生じるα−キモトリプシンとカップリングさせる。アッセイにおける試験ペプチドのtrans異性体への変換はBeckman DU-650型分光光度計により390nmで追跡する。データは毎秒ごとに平均走査時間0.5秒で集める。アッセイは35mM HEPES、pH8.0、終容量400μl 中、10μＭのα−キモトリプシン（ウシ膵臓からの1-5型，Sigma ＃C-7762，ロット23Ｈ7020）および10nMのPPIaseを用いて実施する。反応を開始させるためには、390μlの反応混合物に基質（ＤＭＳＯ中２mMのＮ−スクシニル−Ala−Ala− Pro−Phe−ｐ−ニトロアニリド）を室温で加える。粗製細菌抽出物における酵素アッセイブルセラ培地中Helicobacterpylori（株Ｊ99）50mlの培養液を、中対数期（ＯＤ₆₀₀nm〜１）に収穫し、溶解緩衝液中に以下のプロテアーゼインヒビターすなわち１mM PMSF、および各10μg／mlのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、および大豆トリプシンインヒビターとともに再懸濁する。懸濁液を３サイクルの凍結-解凍（−70℃に15分ついで室温に30分）ついで超音波処理（20秒の処置を３回）に付す。溶解物を遠心分離に付して（12,000× ｇ，30分）、上清について上述のように酵素活性をアッセイする。多くのH.pylori酵素をE.coli内で高レベルに活性型で発現させることができる。このような高収率での精製タンパク質は多様な高スループット薬物スクリーニングアッセイを提供する。均等物当業者によれば、本明細書に記載した特定の実施態様および方法に均等な多くの態様および方法を、定常的にすぎない実験を用いて認識しまたは確認することが可能であろう。このような均等な態様および方法は請求された本発明の範囲に包含される意図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号０８／８９１，９２８ (32)優先日平成９年７月14日(1997．7．14) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約60％のホモロジーを有するH.pyloriポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から構成される単離された核酸。２．SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選択されるH.pyloriポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から構成される単離された核酸。３．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73またはそれらの相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約60％のホモロジーを有するヌクレオチド配列から構成されるH.pyloriポリペプチドをコードする単離された核酸。４．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73またはそれらの相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列から構成される請求項１記載の単離された核酸。５．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73またはそれらの相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる核酸分子に緊縮ハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列から構成されるH.pyloriポリペプチドをコードする単離された核酸分子。６．配列がSEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73またはそれらの相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸に緊縮ハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする、長さ少なくとも８個のヌクレオチド配列から構成される単離された核酸。７．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる核酸であり、その核酸はSEQ ID NO：３、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、S EQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、 SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：4 3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO ：５、SEQ ID NO：６、SEQ ID NO：８、およびSEQ ID NO：21、またはそれらの相補体からなる群より選択される単離された核酸。８．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントはSEQ ID NO：３、SEQ ID NO：25、およびSEQ ID NO：48またはそれらの相補体からなる群より選択される核酸によってコードされるH.pylori内膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである請求項７記載の単離された核酸。９．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントはSEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：5 6、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO ：43、SEQ ID NO：11、およびSEQ ID NO：71、またはそれらの相補体からなる群より選択される核酸によってコードされるH.pylori外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである請求項７記載の単離された核酸。 10．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基およびＣ末端チロシンクラスターまたはそのフラグメントを有するH.py loriポリペプチドまたはそのフラグメントであり、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO： 42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：11、およびSEQ ID NO：71、またはそれらの相補体からなる群より選択される核酸によってコードされる請求項９記載の単離された核酸。 11．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基またはそのフラグメントを有するH.pyloriポリペプチドであり、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID N O：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ I D NO：58、またはそれらの相補体からなる群より選択される核酸によってコードされる請求項９記載の単離された核酸。 12．SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：80、S EQ ID NO：112、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO： 101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：11 6、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、およびSEQ ID NO：94からなる群より選択されるH.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸。 13．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントはSEQ ID NO：76、SEQ ID NO：98、およびSEQ ID NO：121からなる群より選択されるH.py loriの内膜ポリペプチドまたはそれらのフラグメントである請求項12記載の単離された核酸。 14．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントはSEQ ID NO：89、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、 SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO ：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SE Q ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO： 87、SEQ ID NO：116、 SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：90、およびSEQ ID NO：130からなる群より選択されるH.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである請求項12記載の単離された核酸。 15．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基およびＣ末端チロシンクラスターまたはそのフラグメントを有し、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：84 、およびSEQ ID NO：144からなる群より選択されるH.pyloriポリペプチドである請求項14記載の単離された核酸。 16．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基またはそのフラグメントを有し、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：1 28、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129およびSEQ ID NO：131からなる群より選択されるH.pyloriポリペプチドである請求項14記載の単離された核酸。 17．H.pylori分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる核酸において、核酸はSEQ ID NO：72、SEQ ID NO：32、SEQ ID N O：51、SEQ ID NO：２、SEQ ID NO：４、SEQ ID NO：９、SEQ ID NO：13、SEQ I D NO：22、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SE Q ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44 、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO ：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、およびSEQ ID NO：68またはそれらの相補体からなる群から選択される単離された核酸。 18．H.pylori分泌ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる核酸において、核酸はSEQ ID NO：145、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：82、SE Q ID NO：86、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：1 06、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：1 26、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される単離された核酸。 19．H.pyloriの細胞性ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる核酸において、核酸はSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、S EQ ID NO：47、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：69 、SEQ ID NO：70、およびSEQ ID NO：73またはそれらの相補体からなる群より選択される単離された核酸。 20．SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID N O：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：123、SE Q ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143およびSEQ ID NO：146からなる群より選択されるH.pyloriの細胞性ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列からなる単離された核酸。 21．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73またはそれらの相補体からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも８個のヌクレオチドから構成されるヌクレオチド配列からなるプローブ。 22．請求項１〜７、12、または17〜20のいずれかに記載の核酸が転写調節エレメントと実施可能なように連結してなる組換え発現ベクター。 23．請求項22記載の組換え発現ベクターからなる細胞。 24．請求項23記載の細胞をポリペプチドの発現が可能な条件下に培養することからなるH.pyloriの製造方法。 25．さらに細胞からポリペプチドを精製することからなる請求項24記載の方法。 26．サンプル中におけるHelicobacter核酸の存在を検出する方法において、 (a) プローブとサンプル中のHelicobacter核酸の間でハイブリッドを形成できるようにサンプルを請求項６〜21のいずれかに記載の核酸と接触させ、 (b) 工程(a)において形成されたハイブリッドを検出し、ハイブリッドの検出はサンプル中のHelicobacter核酸の存在を指示することからなる方法。 27．SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選択されるH.pyloriポリペプチドと少なくとも約60％のホモロジーを有するアミノ酸配列からなる単離されたH.pyloriポリペプチド。 28．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73からなる群より選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約60％のホモロジーを有するヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされる単離されたH.pyloriポリペプチド。 29．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73からなる群より選ばれるヌクレオチド配列によってコードされる請求項28記載の単離されたH.pyloriポリペプチド。 30．SEQ ID NO：１〜SEQ ID NO：73からなる群より選択される核酸またはそれらの相補体に緊縮ハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする核酸によってコードされる単離されたH.pyloriポリペプチド。 31．SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたH.pyloriポリペプチド。 32．ポリペプチドは、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、 SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO ：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：1 15、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、およびSEQ ID NO：94からなる群より選択される単離されたH.pylori細胞エンベロープポリペプチドまたはそれらのフラグメント。 33．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：98、およびSEQ ID NO：121からなる群より選択されるH. pyloriの内膜ポリペプチドまたはそれらのフラグメントである請求項32記載の単離されたポリペプチド。 34．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110 、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：91、SEQ ID N O：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、S EQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO ：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：90および SEQ ID NO：130からなる群より選択されるH.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントである請求項32記載の単離されたポリペプチド。 35．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基およびＣ末端チロシンクラスターまたはそのフラグメントを有し、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：84 、およびSEQ ID NO：144からなる群より選択されるH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントである請求項34記載の単離されたポリペプチド。 36．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基またはそのフラグメントを有し、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：1 28、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、およびSEQ ID NO：131からなる群より選択されるH.pyloriポリペプチドである請求項34記載の単離されたポリペプチド。 37．ポリペプチドは、SEQ ID NO：３、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、S EQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56 、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO ：43、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：５、SEQ ID NO：６、SEQ ID NO：８およびSEQ ID NO：21からなる群より選択される核酸によってコードされる単離されたH.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメント。 38．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：３、SEQ ID NO：25、およびSEQ ID NO：48からなる群より選択される核酸によってコードされるH.pylori内膜ポリペプチドまたはそれらのフラグメントである請求項37記載の単離されたポリペプチド。 39．H.pyloriの細胞エンベロープポリペプチドまたはそのフラグメントは、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、S EQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19 、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO ：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：11、およびSEQ ID NO：71からなる群より選ばれる核酸によってコードされるH.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそれらのフラグメントである請求項37記載の単離されたポリペプチド。 40．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基およびＣ末端チロシンクラスターまたはそのフラグメントを有し、 SEQ ID NO：１、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：1 1、およびSEQ ID NO：71からなる群より選ばれる核酸によりコードされるH.pylo riポリペプチドである請求項39記載の単離されたポリペプチド。 41．H.pyloriの外膜ポリペプチドまたはそのフラグメントは、末端フェニルアラニン残基またはそのフラグメントを有し、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：７、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：55、S EQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：52 、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、およびSEQ ID NO：58からなる群より選択される核酸によってコードされるH.pyloriポリペプチドである請求項39記載の単離されたポリペプチド。 42．ポリペプチドは、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：120、SE Q ID NO：123、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO ：143およびSEQ ID NO：146からなる群より選択される、単離されたH.pyloriの細胞性ポリペプチドまたはそのフラグメント。 43．ポリペプチドはSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO ：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、およびSEQ ID NO：73からなる群より選択される核酸によってコードされる、単離されたH.pyloriの細胞性ポリペプチドまたはそれらのフラグメント。 44．ポリペプチドは、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：95、S EQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO ：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：117、S EQ ID NO：119、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO ：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、S EQ ID NO：140、およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される、単離されたH .pyloriの分泌ポリペプチドまたはそのフラグメント。 45．ポリペプチドは、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：２、SEQ ID NO：４、SEQ ID NO：９、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、S EQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46 、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO ：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、および SEQ ID NO：68からなる群から選択される核酸によってコードされる、単離されたH.pyloriの分泌ポリペプチドまたはそのフラグメント。 46．SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるH.pyloriポリペプチドが非H.pyloriポリペプチドに実施可能なように連結してなる融合タンパク質。 47．請求項１〜７、12、または17〜20のいずれかに記載の少なくとも１種の単離された核酸の有効量からなるH.pylori感染の予防または処置のためのワクチン処方物。 48．請求項26〜32、37、または42〜45のいずれかに記載の少なくとも１種のH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントの有効量からなるH.pylori感染の予防または処置のためのワクチン処方物。 49．さらに医薬的に許容される担体からなる請求項47記載のワクチン処方物。 50．さらに医薬的に許容される担体からなる請求項48記載のワクチン処方物。 51．医薬的に許容される担体はアジュバントからなる請求項49記載のワクチン処方物。 52．医薬的に許容される担体はアジュバントからなる請求項50記載のワクチン処方物。 53．医薬的に許容される担体は送達システムからなる請求項49記載のワクチン処方物。 54．医薬的に許容される担体は送達システムからなる請求項50記載のワクチン処方物。 55．送達システムは、生存ベクターからなる請求項53記載のワクチン処方物。 56．送達システムは、生存ベクターからなる請求項54記載のワクチン処方物。 57．生存ベクターは細菌またはウイルスである請求項55記載のワクチン処方物。 58．生存ベクターは細菌またはウイルスである請求項56記載のワクチン処方物。 59．医薬的に許容される担体はさらにアジュバントからなる請求項53記載のワクチン処方物。 60．医薬的に許容される担体はさらにアジュバントからなる請求項54記載のワクチン処方物。 61．患者におけるH.pylori感染の処置方法または感染の危険を低下させる方法において、H.pylori感染の処置またはその危険の低下が達成されるように、患者に請求項47記載のワクチン処方物を投与する方法。 62．患者におけるH.pylori感染の処置方法または感染の危険を低下させる方法において、H.pylori感染の処置またはその危険の低下が達成されるように、患者に請求項48記載のワクチン処方物を投与する方法。 63．SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選ばれる少なくとも１種の単離されたH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントを医薬的に許容される担体と配合してワクチン処方物を形成させることからなるワクチン処方物の製造方法。 64.(a)SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選ばれる少なくとも１種の単離されたH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントを提供し、 (b)上述の少なくとも１種の単離されたH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントを医薬的に許容される担体と配合してワクチン処方物を形成させることからなるワクチン処方物の製造方法。 65.(a)SEQ ID NO：74〜SEQ ID NO：146からなる群より選ばれるH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントの発現が可能な条件下に細胞を培養し、 (b) 上記細胞から上記H.pyloriポリペプチドを単離し、 (c) 上述の少なくとも１種の単離されたH.pyloriポリペプチドまたはそのフラグメントを医薬的に許容される担体と配合してワクチン処方物形成させることからなる、ワクチン処方物の製造方法。