JPH06217777A - ネコ卵透明帯ｆｚｐ２をコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ネコ卵透明帯ＦＺＰ２蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列。 【効果】 ネコの避妊ワクチン抗原として有用なＦＺＰ
２関連ペプチドの大量供給を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ネコ卵透明帯ＦＺＰ２
蛋白質をコードするＤＮＡ配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】卵透明帯（ＺＰ：Ｚｏｎａ Ｐｅｌｌｕ
ｃｉｄａ）とは、哺乳動物の卵細胞を取り囲んで存在す
る細胞外マトリックスでＺＰ−１，−２，−３，−４と
呼ばれる幾種類かの糖蛋白質が集まって構成されてい
る。この卵透明帯が、授精の場において卵側の精子レセ
プターとなっており、精子はこの卵透明帯を通過できな
いと授精は成立しない（Wassarman P.M. (1990) Develo
pment 108, 1-17)。従って、何らかの形で精子がこの卵
透明帯と結合できないようにすることができれば避妊は
可能となる。その一つの方法として、卵透明帯に対する
抗体はin vitroで授精を阻害できることが報告されてお
り（Shivers, C.H. ら (1972) Science, 178:1211-121
3, メルクの特開昭５３−２６３１１号公報）、さら
に、この蛋白質をワクチン抗原として雌哺乳動物に投与
してその個体を不妊にできることも報告されている（Wo
od D.M. ら (1981) Biol. Reprod. 25:439-450, Skinne
r S.M.ら (1984) Endrocrinology 115:2418-2432, Mahi
-Brown C.A. ら (1985) Biol. Repro. 32:761-772 ）。
この効果はＺＰ−３と呼ばれる成分単独でも効果のある
ことが報告されており、成分全体でなくとも良いと考え
られている。（Sacco A.G.ら(1987) Biol. Reprod. 36:
481-490, Millar S.E. ら(1989) Science 246:935-93
8）。

【０００３】この卵透明帯を構成する卵透明帯蛋白質成
分に関してはその遺伝子クローニングが行なわれアミノ
酸配列、塩基配列が明らかとされてきている。ＺＰ−３
と呼ばれる成分に関しては、マウス（Ringuette M.J.
(1988) Dev. Biol. 127:287-265）、ハムスター（Kinlo
ch R.A.ら (1990) Dev. Biol. 142:414-421) 、ヒト（C
hamberlin M.E. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
7:6014-6018) 、その他本出願人によりブタ、ネコ、ネ
コ由来のものが明らかとなっている。またＺＰ−２と呼
ばれる成分に関しても、ＺＰ−２に対する抗体がin vi
tro で授精を阻害することが報告されており（East I.
J. ら (1985) Dev. Biol. 109:268-273）、ＺＰ−３と
同様にそのワクチン効果が考えられる。ＺＰ−２に関し
ては、マウス（Liang Li-Fang ら (1990) Mol. Cell. B
iol. 10:1507-1515 ）由来のものが明らかとなってい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】天然の卵透明帯蛋白質
をワクチン抗原として用いるためには大量の卵細胞を得
ることが必要である。しかし、そのためにワクチン対象
動物の卵透明帯を必要量得ることは不可能である。又、
天然の卵透明帯を精製する場合、他の卵巣組織の混在す
る危険性がありこれが副作用の原因となる可能性があ
る。これに対して遺伝子工学的手法やペプチド合成とい
った手法で卵透明帯を人工合成できるようにすれば高純
度の卵透明帯蛋白質を安価に製造することが可能とな
る。

【０００５】従って、本発明の目的は、このネコ卵透明
帯成分−２（ＦＺＰ２）の人工合成に必要なＤＮＡ配列
及びアミノ酸配列を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１に
示されるネコ卵透明帯ＦＺＰ２蛋白質のアミノ酸配列の
全部又は一部をコードする塩基配列を含むＤＮＡを提供
する。

【０００７】ネコ卵透明帯ＦＺＰ２（Feline Zona Pell
ucida 2 ）遺伝子の全塩基配列及びそれから推定される
アミノ酸配列の決定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法を用いてネコ卵巣よりＦＺＰ２の全遺伝子をクロ
ーニングすることによって行なわれる。この目的のため
には、一般的な組換えＤＮＡ技術、例えば、組織からの
全ＲＮＡの抽出、オリゴｄＴセルロースによるｍＲＮＡ
の精製、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅、表
現型マーカーを含むベクター内へのＤＮＡの挿入、コン
ピテント宿主細胞の形質転換、コロニーライブラリーか
らの目的ｃＤＮＡクローンのスクリーニング、陽性ｃＤ
ＮＡクローンからのベクターＤＮＡの単離、ＤＮＡの配
列決定などが使用される（例えば、Maniatisら、Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual (1982); Wardら、J.
Virol., 9:61(1972); Saikら、 Science 230:1350-1354
(1985)）。ＦＺＰ２遺伝子のクローニングの詳細につい
ては、後記実施例で述べられる。ここでは、ｍＲＮＡか
ら合成されたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを実施
するが、このとき使用するプライマーを、３つの群すな
わちＦＺＰ２遺伝子の中央領域、５’側領域及び３’側
領域に各々アニーリング可能なプライマー群に分けてＰ
ＣＲを行ない、各領域遺伝子をクローニングする方法を
とった。これにより、それぞれ、配列番号１に示される
ヌクレオチド７５〜５２４（ＦＺＰ２_75-524）；ヌクレ
オチド９〜８６（ＦＺＰ２_9-86）及びヌクレオチド１〜
６５（ＦＺＰ２_1-65）；並びにヌクレオチド４７７〜７
１６（ＦＺＰ２_477-716 ）の各塩基配列が決定され、従
って、ネコ卵透明帯ＦＺＰ２蛋白質をコードする全ＤＮ
Ａ配列が判明した。このＤＮＡ配列は、配列番号１に示
される２２３０ｂｐのヌクレオチド配列から成り、その
うちＦＺＰ２リーディングフレームはヌクレオチド番号
５０〜２１９７までの２１４８ｂｐで構成される。この
ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列も同様に配列番
号１に示されており、Ｍｅｔ¹ ……Ｈｉｓ⁷¹⁶ の７１６
アミノ酸から構成される。

【０００８】本発明のＤＮＡの具体例は、配列番号１に
示されるヌクレオチド番号５０〜２１９７の全部又は一
部から成るＤＮＡである。その他の例として、配列番号
１の配列中、アミノ酸の遺伝暗号の縮重に基づく対応す
る全ての塩基配列を含む全ての可能なヌクレオチド配列
が挙げられる。これらのヌクレオチド配列も、本発明の
一部を構成する。

【０００９】本明細書中「ペプチド」なる用語は、短鎖
及び長鎖ペプチドの両方を意味する。ここで、長鎖ペプ
チドは蛋白質も包含する。

【００１０】上記定義の本発明のＤＮＡを発現すること
により、ＦＺＰ２関連ペプチドを製造することができ
る。例えば、該ペプチドの製造方法は、配列番号１に示
されるアミノ酸配列の全部若しくは一部をコードするヌ
クレオチド配列から成るＤＮＡ又は該ヌクレオチド配列
を含むＤＮＡを複製可能な適切な発現ベクターに組み込
む工程、得られた発現ベクターで適切な宿主を形質転換
する工程、得られた形質転換体を適切な培地中で培養
し、前記ＤＮＡを発現させる工程、及び得られた組換え
型ペプチドを回収する工程、を包含する。

【００１１】この場合、本発明のＤＮＡを発現させるた
めのベクターは、ファージ又はプラスミドであり、通
常、複製部位と選択マーカー配列を含む。複製部位は、
形質転換される宿主細胞に適合するプロモーター、ター
ミネーター、複製起点、リボソーム結合部位などの配列
を適宜含み得る。特に、プロモーターとしては、原核生
物を宿主とする場合には常用のｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター、バクテリオファージλプロモーター
等が、酵母を宿主とする場合にはアルコールデヒドロゲ
ナーゼや解糖系酵素類に対するプロモーター等が、動物
細胞を宿主とする場合にはＳＶ４０ウイルスプロモータ
ーのようなウイルスプロモーター等が挙げられる。ま
た、選択マーカー配列としては、アンピシリン、テトラ
サイクリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が常用さ
れる。発現すべき外来遺伝子は、プロモーターの下流に
挿入される。

【００１２】また、宿主細胞は、原核及び真核生物の両
方を使用し得る。原核生物には、大腸菌、枯草菌、放線
菌等の細菌類が含まれ、また、真核生物には、酵母、昆
虫細胞、植物細胞、動物細胞等が含まれる。これらの宿
主細胞は、対象とするペプチドの糖鎖構造の有無に応じ
て適宜選択され、一般に、糖鎖を含むペプチドを合成し
たい場合には、真核生物が利用される。しかし、その糖
鎖構造は、必要な免疫能が達成される限り、対象とする
天然ペプチドと必ずしも一致していなくてもよい。

【００１３】あるいは、ＦＺＰ２関連ペプチドは化学的
ペプチド合成によっても作り得るだろう。ペプチド合成
に関しては、生化学実験講座１タンパク質の化学ＩＶ−
化学修飾とペプチド合成−第２０５〜４９５頁、１９７
７年（日本生化学会編）に記載の技術等が使用可能であ
る。

【００１４】上述の方法により得られるＦＺＰ２関連ペ
プチドは、これを抗原として含むネコの避妊ワクチンに
使用することができる。ワクチンは、ペプチドの他に通
常、必要に応じて水酸化アルミニウム、リン酸カルシウ
ム、ムラミルジペプチド、Ｆｒｅｕｎｄの完全又は不完
全アジュバント等のアジュバント、油類及び適切な希釈
剤を含み、溶液、乳濁又は懸濁形態で処方され得る。低
アミノ酸数の抗原ペプチドの場合には、免疫能を高める
ためにＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin ）のような
異種蛋白質を結合してもよい。

【００１５】

【実施例】本発明を以下の非限定的実施例によりさらに
詳細に説明する。

【００１６】ＦＺＰ２遺伝子のクローニング １．ＦＺＰ２の中央領域（ＦＺＰ２_75-524 ）遺伝子のク
ローニング ＰＣＲに用いる鋳型ＤＮＡは次のようにして調製した。

【００１７】まず最初にネコ卵巣よりｍＲＮＡを抽出し
た。抽出操作は、ネコ卵巣を液体窒素下でブレンダーを
用いパウダー状に破砕し、これを、市販のｍＲＮＡ抽出
用キット（FastTrack mRNA ISOLATION KIT, Invitroge
n）の抽出方法に従いネコ卵巣ｍＲＮＡを調製した。こ
のｍＲＮＡを市販のｃＤＮＡ合成キット（RiboClone cD
NA Synthesis System, Promega）を用いてｃＤＮＡへと
変換しＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。

【００１８】ｍＲＮＡ抽出 凍結粉末状の卵巣１ｇに対しキット中のＬｙｓｉｓ溶液
１０ｍｌを加えＤｏｕｎｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ
でホモジナイズ（１０〜１２ストローク）する。これを
さらに１８Ｇの注射筒を通過させた後４５℃で２時間ゆ
っくり振盪させる。インキュベート終了後４０００×
ｇ、１０分間遠心し、沈殿をとらないように注意して上
清を回収する。この上清に０．５Ｍとなるように５Ｍ
ＮａＣｌ溶液を加え、混合後、生じた白沈殿を２１Ｇの
注射筒に通して切断する。これに、別途にキット内のＢ
ｉｎｄｉｎｇ溶液で調製してあるオリゴｄＴセルロース
５０ｍｇを加え室温で１時間転倒混和して反応させる。
反応終了後２０００×ｇ、１０分間遠心しオリゴｄＴセ
ルロースを回収する。このセルロースペレットを再度２
０ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ溶液に懸濁させて洗う。この操
作を３回繰り返してオリゴｄＴセルロースを洗浄する。
こうして洗浄の終了したセルロースをキットについてい
るスピンカラムにつめる。このスピンカラムにつめた段
階でさらにＢｉｎｄｉｎｇ溶液で洗い、スピンカラムを
２０００×ｇ、１０秒間遠心し回収溶液のＯＤ₂₈₀ が
０．０５以下になるまで繰り返し洗う。洗浄終了後Ｂｉ
ｎｄｉｎｇ溶液を遠心除去し、キット内の溶出溶液０．
２ｍｌを加えてセルロースペレットを十分に懸濁させ
る。２０００×ｇ、１０秒間遠心し溶出液を回収する、
再びこのセルロースペレットに０．１５ｍｌの溶出溶液
を加え再度懸濁後２０００×ｇ、１分間遠心して完全に
溶出液をセルロースペレットより回収する。この２回の
溶出操作で０．３５ｍｌの回収液が得られる、これにキ
ットについている２Ｍ酢酸ナトリウム溶液を０．１５容
加え、さらに１００％エタノールを２．５容追加して混
合後、−７０℃に凍るまで放置する。凍結後１６０００
×ｇ、１５分間遠心しｍＲＮＡを回収する。冷７０％エ
タノールで２回ｍＲＮＡペレットを洗浄、真空エバポレ
ーターで乾燥させた後、適当量の滅菌水に溶解する。一
部を適当に希釈してＯＤ_320-220 間のスキャンニングを
行ないＯＤ₂₆₀ の吸光度値よりｍＲＮＡ量を算出する。
こうして１ｇのネコ卵巣より７．７μｇのｍＲＮＡを精
製した。取り扱う試薬、器具類はすべてＲＮａｓｅによ
る分解を防ぐための処理を施しておく。

【００１９】ｃＤＮＡ合成 ｍＲＮＡ１μｇをｄＴプライマー０．５μｇと混合後７
０℃、５分間インキュベート、その後室温に戻しこれに
キットのファーストストランド合成試薬（ファーストス
トランドバッファー，ジチオスレイトール溶液，デオキ
シヌクレオシド三リン酸混液，リボヌクレアーゼインヒ
ビター溶液，ピロリン酸ナトリウム溶液，ＡＭＶ逆転写
酵素）を加え、４２℃、１時間反応した。次にキットの
セカンドストランド合成試薬（セカンドストランドバッ
ファー，ジチオスレイトール，ＮＡＤ溶液，ＤＮＡポリ
メラーゼＩ，ＲＮａｓｅＨ，リガーゼ）を追加して１４
℃，２時間反応させた。反応終了後、７０℃，１０分間
の加温処理をしたあと、氷冷し、さらにこれにＴ４ＤＮ
ＡポリメラーゼＩを加え３７℃，１０分間反応させ、
０．２Ｍ ＥＤＴＡで反応を終了させる。こうして作製
したｃＤＮＡを次のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用す
る。

【００２０】ＰＣＲによる遺伝子クローニング ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲキット試薬（GeneAmp DNA
Amplification Reagent Kit, Perkin Elmer Cetus ）及
びＰＣＲ自動化装置（DNA Thermal Cycler, Perkin Elm
er Cetus）を用いた。

【００２１】プライマーは、ＭＺＰ２（Mouse Zona Pel
lucida; Liang. L. F., Chamow. S.M & Dean, J. (199
0) Mol. Cell. Biol. 10, 1507-1515)とＰＺＰ２（本出
願人が一部クローニング済みで現在クローニング継続中
のもの）の分かっている配列から、以下の２つのプライ
マーを作製した。プライマーの合成には自動ＤＮＡ合成
機（Cyclone Plus DNA Synthesizer, Milli Gen/Biosea
rch ）を使用した。

【００２２】

【表１】 プライマー１：５’ＡＡＣＧＧＴＡＣＣＣ［Ｃ，Ｔ］ＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡ３ ^KpnI 'プライマー 2:5'CAGGTCGACGTA[G,A]ATTGGTTGGC ^SalI ＧＧＡＧ［Ｇ，Ａ］ＴＡ３’ （但し、［］はミックスを表わす。） ネコ卵巣ｃＤＮＡとプライマー１及びプライマー２とで
ＰＣＲを実施した。反応条件は、９４℃−３０秒，５５
℃−１分，７２℃−２分を１サイクルとし、これを４０
サイクル実施後７２℃−７分を１回追加する。反応終了
後、等量のクロロホルムを加えてミネラルオイルを反応
溶液より除去し、これに１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．２）と３倍容量の冷エタノールを加えて
ＤＮＡをエタノール沈殿させる。沈殿ＤＮＡは乾燥後、
適量の水に溶解させＫｐｎＩおよびＳａｌＩで完全に消
化させる。これを低融点アガロースゲル電気泳動に流し
１２００ｂｐ程度のＤＮＡを切り出す。ゲルからのＤＮ
Ａの抽出はGENECLEAN II（BIO 101 ）を用いる。このＤ
ＮＡを先にＫｐｎＩ，ＳａｌＩで消化して同様にアガロ
ースゲルより精製してあるｐＵＣ１８ベクターの大断片
にライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結させ、
大腸菌ＪＭ１０９に形質転換させる（この形質転換体を
ｐＦＺＰ２_75-524／ＪＭ１０９と称する）。これを、ア
ンピシリン含有ＬＢプレートに播き、生えてきたコロニ
ーを５ｍｌ培養し QIAGEN Hi PurityPlasmid Kit(QIAGE
N) でプラスミドを精製した。精製したプラスミドはそ
の一部をＫｐｎＩ，ＳａｌＩ消化して目的サイズのＤＮ
Ａが組み込まれていることの確認に用い、残りを通常の
２本鎖シークエンスに用いた。シークエンスはプラスミ
ドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖法ＤＮＡシークエ
ンスキット（SEQUENASEVERSION 2.07-deaza-dGTP Kit,
USB）を用いて決定した。その結果以下の配列が決定さ
れた。

【００２３】決定されたＦＺＰ２_75-524の塩基配列：

【００２４】

【表２】 ５’GCTCGGTACCCTTCTGTGGTGGATCCCTTTAGTTTTGAATTGTTGA
ACTGCACTTACATCTTGGATCCAGAAAATCTCACCTTAAAGGCCCCATAT
GAGACCTGTACCAGAAGAACGCTTGGCCAGCACCGGATGATCATCAGACT
CAAGGACCACAATGCTGCTTCAAGACATAACAGTTTGATGTATCAGATCA
ACTGTCTAGTTATGCAAGCAGAAGAAACCCATGAGCATGCAGGATCCACT
ATCTGCACAAAGGATTCCATGTCTTTTACCTTTAGTGTCATTCCTGGCCT
GGCTGATGAAAATACGGATATCAAGAATCCGATGGGATGGAGCATTGAGG
TTGGTGATGGTACAAAAGCCAAAACTCTGACTCTTCAGGATGTCTTGAGA
CAAGGATACAATATCCTGTTTGATAACCACAAGATCACCTTCCAGGTGTC
ATTCAATGCCACTGGAGTGACTCACTACATGCAAGGTAACAGTCACCTCT
ACATGGTGCCTCTGAAGTTGATACATGAATCTCTTGGGCAGAAGATCATC
TTAACAACACGAGTGCTTTGTATGTCAGATGCTGTGACCTGTAATGCCAC
ACATGTGACTCTGACCATACCAGAGTTTCCTGGGAAGTTAAAATCTGTGA
GCTCTGAAAATAGGAACTTTGCTGTAAGCCAGCTGCACAACAATGGGATT
GATAAAGAATCAAGTGGCTTGACATTGCACTTCAGCAAAACTCTTCTCAA
AATGGAATTCTCTGAAAAATGCCTACCCTATCAGTTGCTACTTAGCTCAC
TCAAGCTGACCTTTGCCTTTCAATCGGAAGAGACTATATCCACGGTGCTT
GATCCTGAGTGTGTCTGTGAGTCACCAGTTTCTATAGTTACAGGTGACCT
GTGTACTCAGGATGGGTTTATGGATCATAAGGTCTACAGTCACCAGACAA
AACCAGCTCTCAACTTAGAAACCCTAAGGGGTGGAGACTCATCCTGCCAA
CCTACCTTCCAGGCTGCATCTCAAGGGCTGATACTGTTTCACATACCCCT
GTATGGATGCGGGACAAGACATAAGTTCAAGGAAGGCAAAGTCATCTATG
AAAATGAAATACATGCTGTCTGGGCGGATCTTCCTCCAAGCACAATTTCT
AGAGATAGTGAATTCAGAATGACAGTGCAGTGCCATTACAGCAAACCTGA
CCTGCTAATAAATACCAGAGTCCAAAGTCTTCCTCCTCCAGAGGCCTCAG
TGAGGCCAGGTCCACTTGCCTTAATCCTGCAAACCTACCCAGATAAATCC
TACCTCCAACCTTACGGGGAGAAGGAGTACCCTGTGGTGAGATACCTCCG
CCAACCAATTTAC ３’ ２．３’側領域遺伝子のクローニング 次の３個のプライマーとネコ卵巣ｃＤＮＡを用いてＦＺ
Ｐ２の残り３’側遺伝子をクローニングし配列を決定し
た。

【００２５】先に決定したＦＺＰ２_75-524の配列より次
のプライマー３及び４を作製し、またｍＲＮＡのポリＡ
配列よりプライマー５を作製した。

【００２６】

【表３】 プライマー３：５’ＡＧＡＧＡＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧ３’ プライマー４：５’ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ ^EcoRI CC3'プライマー 5:5'CGGTACCAAGCTTTTTTTTTT3' ^{Hind III} これらのプライマーは、自動ＤＮＡ合成機を用いて作製
した。また、ＰＣＲ条件は以下のとおりである。

【００２７】

【表４】１回目のＰＣＲ：プライマー３およびプライマ
ー５ 鋳型ＤＮＡ：ネコ卵巣ｃＤＮＡ ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、４５℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃−５分、１回 ２回目のＰＣＲ：プライマー４およびプライマー５ 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物 ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、５０℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃−５分、１回。

【００２８】２回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロース
ゲルにて電気泳動を行ない増幅されたＤＮＡバンドをエ
チジウムブロマイド染色で確認する。その結果２回目の
ＰＣＲ産物に７００ｂｐ程度のバンドが検出された。こ
の２回目のＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、ＥｃｏＲ
Ｉ，Ｈｉｎｄ IIIで消化した後、低融点アガロースゲル
にて電気泳動を行ないゲルより目的の７００ｂｐのＤＮ
ＡをGENECLEAN II（BIO101 ）を用いて精製した。この
精製したＤＮＡをあらかじめ同じＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎｄ
IIIで消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲーショ
ンキット（宝酒造）を用いて連結させた。大腸菌ＪＭ１
０９に形質転換を行なった後、アンピシリン含有ＬＢプ
レートに播き生えてきた形質転換株を拾い上げる（この
形質転換体をｐＦＺＰ２_477-716 ／ＪＭ１０９と称す
る）。これを５ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地で培養
し、プラスミドを精製（QIAGEN Hi Purity Plasmid Ki
t）した。精製したプラスミドはその一部をＥｃｏＲ
Ｉ，Ｈｉｎｄ IIIで消化して目的サイズのＤＮＡが組み
込まれていることの確認に用い、残りを通常の２本鎖シ
ークエンスに用いた。シークエンスはプラスミドをアル
カリ処理後ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシークエンスキ
ット（SEQUENASE VERSION 2.07-deaza-dGTP Kit, USB）
を用いて決定した。その結果、以下の配列が決定され
た。

【００２９】決定されたＦＺＰ２_477-716 の塩基配列：

【００３０】

【表５】 ５’GTCCAAAGTCTTCCTCCTCCAGAGGCCTCAGTGAGGCCAGGTCCAC
TTGCCTTAATCCTGCAAACCTACCCAGATAAATCCTACCTCCAACCTTAC
GGGGAGAAAGAGTACCCTGTGGTGAGATACCTCCGCCAACCAATTTATCT
GGAAGTGAGAGTCCTAAATAGGTCTGACCCCAACATCAAGCTGGTCTTAG
ATGACTGCTGGGCAACACCCACGATGGACCCAGCCTCCGTCCCCCAGTGG
AATATTATCATGGATGGCTGTGAATACAACCTGGACAACCACAGAACCAC
CTTCCATGCAGTTGGCTCCTCTGTGACCTATCCTACTCACTATCGGAGGT
TTGATGTGAAGACCTTTGCCTTTGTATCAGAGGCCCAAGTGCTTGCTAGT
CTGGTCTACTTCCACTGCAGTGTCTTAATCTGCAGTCGACTGTCTGCTGA
CTCCCCTCTGTGTTCCGTGACTTGCCCTGTGCCATTCAGACACAGGAGAG
CCACAGGCACGACTGCAGAAGAGAAAATGATAGTGAGTCTTCCAGGACCC
ATCCTCCTGCTGTCAGATAGCTCTTCACTCAGAGATGTGGTGGACTCCAA
AGGGTATGGGGATGCCGGATATGTTGCTTTTAAGACTGTGGTAGCTGTGG
CTGCCTTAGCAGGCCTCGTGGCAACGCTAGGCTTCATCACCTACCTGCGC
AAGAACAGAACCATGATAAATCACTAAGGATTTTCAAATAAAATGGTTGA
AGT ３’ ３．５’側領域遺伝子のクローニング ＦＺＰ２の５’側領域はＦＺＰ２_75-524の配列をもとに
してｃＤＮＡを作製し、これを鋳型としてＰＣＲを行な
いクローニングした（Michael A. Frohman, Michael K.
Dush,及び Gail R. Martin (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85,8998-9002; Osamu Ohara, Robert L. Dor
it,及び Walter Gilbert (1989) Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA 86, 5673-5677 ）。

【００３１】ＦＺＰ２_9-86 領域の遺伝子クローニング 先に決定したＦＺＰ２_75-524の配列より次の４個のプラ
イマーを合成した。

【００３２】

【表６】 プライマー６：５’ＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧ３’ プライマー７：５’ＴＧＡＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧ３’ プライマー８：５’ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＴＧＧＧＧＣＣＴＴ３’ ^EcoRI プライマー９：５’ＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡ３’ ^EcoRI プライマー６をもとにしてネコ卵巣ｍＲＮＡより一本鎖
ｃＤＮＡを作製した。１本鎖ｃＤＮＡの合成はRiboClon
e cDNA Synthesis System (Promega) を使用した。具体
的には、０．５μｇのネコ卵巣ｍＲＮＡに０．５μｇの
プライマー７を加え７０℃で５分間保温後室温にゆっく
りと戻す、つづいて10×first strandbuffer, 100mM DD
T, 10mM dNTP mix, RNasin ribonuclease inhibitor, 4
0mM Napyrophosphate, 逆転写酵素を加えて４２℃で１
時間保温して１本鎖ｃＤＮＡを合成する。反応終了後１
回フェノール／クロロホルム抽出を行ない、その上清を
ＴＥ（10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA ）であらかじめ
平衡化してあるスパンカラム（Pharmacia ）にかける。
回収液はエタ沈メイト（ニッポンジーン社）とともにエ
タノール沈殿させる。次に合成した１本鎖ｃＤＮＡの
３’側にポリＡを付加する反応を行なう。具体的には、
沈殿させた１本鎖ｃＤＮＡを乾燥後、水に溶解し９４℃
で２分処理後氷上で急冷、これにｄＡＴＰと 5×tailin
g Buffer, terminal deoxynucleotidyl-transferase
（Bethesda Research Laboratories）を加えて３７℃で
１０分間、６５℃、１５分間反応させる。これにＴＥを
加えて希釈してＰＣＲの鋳型ＤＮＡ（５’ＦＺＰ２−ｃ
ＤＮＡと称する）とした。ＰＣＲ条件は以下の通りであ
る。

【００３３】

【表７】１回目ＰＣＲ：プライマー７およびプライマー
５ 鋳型ＤＮＡ：５’ＦＺＰ２−ｃＤＮＡ ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、４５℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃、５分、２回目ＰＣＲ：プライマー８およびプラ
イマー５ 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物 ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、５０℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃、５分、 ３回目ＰＣＲ：プライマー９およびプライマー５ 鋳型ＤＮＡ：２回目ＰＣＲ産物 ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、５０℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃、５分。

【００３４】３回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロース
ゲルにて電気泳動を行なう。エチジウムブロマイドでＤ
ＮＡを染色した。その結果３００ｂｐ程度のＤＮＡバン
ドが検出された。この３００ｂｐのＤＮＡをｐＵＣ１８
のＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩにサブクローニングするため
に、ＰＣＲ産物からクロロホルムでミネラルオイルを取
り除き、エタノール沈殿させる。沈殿は乾燥後水に溶解
した後ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化する。反応終了後２
％低融点アガロース電気泳動で分離し目的の３００ｂｐ
のバンドを切り出しGENECLEAN II（BIO 101 ）を用いて
ゲルより抽出する。これをあらかじめＥｃｏＲＩ，Ｓａ
ｌＩで消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲーショ
ンキット（宝酒造）を用いて連結させる。これを大腸菌
ＪＭ１０９に形質転換させ、アンピシリン含有ＬＢプレ
ートに播く（この形質転換体をｐＦＺＰ２_9-86／ＪＭ１
０９と称する）。生えてきたコロニーは拾い上げて５ｍ
ｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、QUIAGEN, Hi
Purity Plasmid Kitを用いてプラスミドを精製する。精
製したプラスミドはその一部をＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで
消化して目的サイズのＤＮＡが組み込まれていることを
確認した後、残りは通常の２本鎖シークエンスを行なっ
た。シークエンスはプラスミドをアルカリ処理後ジデオ
キシ終止鎖法のＤＮＡシークエンスキット（SEQUENASE
VERSION 2.07-deaza-dGTP Kit, USB）を用いて決定し
た。その結果、以下の配列が決定された。

【００３５】決定されたｐＦＺＰ２_9-86の塩基配列：

【００３６】

【表８】５’AGTGGGAGTCCTTCAAGCTGGTTTAATGCAGATTGGAG
CACCTACAGGTCACTTTTTCTACTCTTTATCCTCGTGACTTCAGTGAATT
CCATAGGTGTTTTGCAGTTGGTGAATCCTGTCTTCCCAGGTACTGTCACT
TGCTATGAAACTAGAATGGCAGTGGAATTTCCAAGTGATTTTGGCACCAA
AAAATGGCATACATCTGTGGTGGATCCCTTTAGTTTTGAATTG ３’ＦＺＰ２_1-65 領域の遺伝子クローニング 上で決定した配列（ＦＺＰ２_9-86）をもとに次のプライ
マーを作製し、さらに５’側領域遺伝子をクローニング
した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。

【００３７】

【表９】 プライマー１０：５’ＣＡＡＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧ３’ ^KpnI １回目ＰＣＲ：プライマー８およびプライマー５ 鋳型ＤＮＡ：５’ＦＺＰ２−ｃＤＮＡ ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、４５℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃、５分、 ２回目ＰＣＲ：プライマー９およびプライマー５ 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物 ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、５０℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃、５分、 ３回目ＰＣＲ：プライマー１０およびプライマー５ 鋳型ＤＮＡ：２回目ＰＣＲ産物 ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒、５５℃−１分、７２℃−
２分、３０回 ７２℃、５分。

【００３８】３回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロース
ゲルにて電気泳動を行なう。エチジウムブロマイドでＤ
ＮＡを染色した。その結果２５０ｂｐ程度のＤＮＡバン
ドが検出された。この２５０ｂｐのＤＮＡをｐＵＣ１８
のＫｐｎＩ，ＳａｌＩにサブクローニングするために、
ＰＣＲ産物からクロロホルムでミネラルオイルを取り除
き、エタノール沈殿させる。沈殿は乾燥後水に溶解した
後ＫｐｎＩ，ＳａｌＩで消化する。反応終了後２％低融
点アガロース電気泳動で分離し目的の２５０ｂｐのバン
ドを切り出しGENECLEAN II（BIO 101 ）を用いてゲルよ
り抽出する。これをあらかじめＫｐｎＩ，ＳａｌＩで消
化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲーションキット
（宝酒造）を用いて連結させる。大腸菌ＪＭ１０９に形
質転換させ、アンピシリン含有ＬＢプレートに播く（こ
の形質転換体をｐＦＺＰ２_1-65／ＪＭ１０９と称す
る）。生えてきたコロニーは拾い上げて５ｍｌのアンピ
シリン含有ＬＢ培地で培養し、QUIAGEN Hi Purity Plas
mid Kit を用いてプラスミドを精製する。精製したプラ
スミドはその一部をＫｐｎＩ，ＳａｌＩで消化して目的
サイズのＤＮＡが組み込まれていることを確認した後、
残りは通常の２本鎖シークエンスをおこなった。シーク
エンスはプラスミドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖
法のＤＮＡシークエンスキット（SEQUENASE VERSION 2.
07-deaza-dGTP Kit, USB）を用いて決定した。その結
果、以下の配列が決定された。

【００３９】決定されたＦＺＰ２_1-65の塩基配列：

【００４０】

【表１０】５’ACAGAACAACCCATTCCTCTATCTGGTTGATTTGGT
GATACTTTTGGCCATGGCCTCCAGACAGAAAGGAGATAGTGGGAGTCCTT
CAAGCTGGTTTAATGCAGATTGGAGCACCTACAGGTCACTTTTTCTACTC
TTTATCCTCGTGACTTCAGTGAATTCCATAGGTGTTTTGCAGTTGGTGAA
TCCTGTCTTCCCAGGTACTGTCACTTGCTATGAAACTAGAATGGCAGTGG
AATTTCCA３’ 以上、クローニングした４つのＤＮＡフラグメント（Ｆ
ＺＰ２_1-65，ＦＺＰ２_9-86，ＦＺＰ２_75-524，ＦＺＰ２
_477-716 ）の塩基配列より下記の配列表に示すネコ卵透
明帯−２（ＦＺＰ２）の全塩基配列（２２３０ｎｔ）お
よびアミノ酸配列（７１６個）が明らかとなった。

【００４１】

【発明の効果】本発明によりネコ卵透明帯ＦＺＰ２遺伝
子のＤＮＡ配列が解明されたことにより、ＦＺＰ２関連
ペプチドを遺伝子工学的手法又はペプチド合成等の手法
を用いて大量供給することが可能となった。得られるペ
プチドはネコの避妊又は不妊用のワクチン抗原として有
用である。

【００４２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２２３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源： 生物名：ネコ 組織の種類：卵巣 細胞の種類：卵 配列： acagaacaac ccattcctct atctggttga tttggtgata cttttggcc atg gcc tcc 58 Met Ala Ser 1 aga cag aaa gga gat agt ggg agt cct tca agc tgg ttt aat gca gat 106 Arg Gln Lys Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ser Ser Trp Phe Asn Ala Asp 5 10 15 tgg agc acc tac agg tca ctt ttt cta ctc ttt atc ctc gtg act tca 154 Trp Ser Thr Tyr Arg Ser Leu Phe Leu Leu Phe Ile Leu Val Thr Ser 20 25 30 35 gtg aat tcc ata ggt gtt ttg cag ttg gtg aat cct gtc ttc cca ggt 202 Val Asn Ser Ile Gly Val Leu Gln Leu Val Asn Pro Val Phe Pro Gly 40 45 50 act gtc act tgc tat gaa act aga atg gca gtg gaa ttt cca agt gat 250 Thr Val Thr Cys Tyr Glu Thr Arg Met Ala Val Glu Phe Pro Ser Asp 55 60 65 ttt ggc acc aaa aaa tgg cat aca tct gtg gtg gat ccc ttt agt ttt 298 Phe Gly Thr Lys Lys Trp His Thr Ser Val Val Asp Pro Phe Ser Phe 70 75 80 gaa ttg ttg aac tgc act tac atc ttg gat cca gaa aat ctc acc tta 346 Glu Leu Leu Asn Cys Thr Tyr Ile Leu Asp Pro Glu Asn Leu Thr Leu 85 90 95 aag gcc cca tat gag acc tgt acc aga aga acg ctt ggc cag cac cgg 394 Lys Ala Pro Tyr Glu Thr Cys Thr Arg Arg Thr Leu Gly Gln His Arg 100 105 110 115 atg atc atc aga ctc aag gac cac aat gct gct tca aga cat aac agt 442 Met Ile Ile Arg Leu Lys Asp His Asn Ala Ala Ser Arg His Asn Ser 120 125 130 ttg atg tat cag atc aac tgt cta gtt atg caa gca gaa gaa acc cat 490 Leu Met Tyr Gln Ile Asn Cys Leu Val Met Gln Ala Glu Glu Thr His 135 140 145 gag cat gca gga tcc act atc tgc aca aag gat tcc atg tct ttt acc 538 Glu His Ala Gly Ser Thr Ile Cys Thr Lys Asp Ser Met Ser Phe Thr 150 155 160 ttt agt gtc att cct ggc ctg gct gat gaa aat acg gat atc aag aat 586 Phe Ser Val Ile Pro Gly Leu Ala Asp Glu Asn Thr Asp Ile Lys Asn 165 170 175 ccg atg gga tgg agc att gag gtt ggt gat ggt aca aaa gcc aaa act 634 Pro Met Gly Trp Ser Ile Glu Val Gly Asp Gly Thr Lys Ala Lys Thr 180 185 190 195 ctg act ctt cag gat gtc ttg aga caa gga tac aat atc ctg ttt gat 682 Leu Thr Leu Gln Asp Val Leu Arg Gln Gly Tyr Asn Ile Leu Phe Asp 200 205 210 aac cac aag atc acc ttc cag gtg tca ttc aat gcc act gga gtg act 730 Asn His Lys Ile Thr Phe Gln Val Ser Phe Asn Ala Thr Gly Val Thr 215 220 225 cac tac atg caa ggt aac agt cac ctc tac atg gtg cct ctg aag ttg 778 His Tyr Met Gln Gly Asn Ser His Leu Tyr Met Val Pro Leu Lys Leu 230 235 240 ata cat gaa tct ctt ggg cag aag atc atc tta aca aca cga gtg ctt 826 Ile His Glu Ser Leu Gly Gln Lys Ile Ile Leu Thr Thr Arg Val Leu 245 250 255 tgt atg tca gat gct gtg acc tgt aat gcc aca cat gtg act ctg acc 874 Cys Met Ser Asp Ala Val Thr Cys Asn Ala Thr His Val Thr Leu Thr 260 265 270 275 ata cca gag ttt cct ggg aag tta aaa tct gtg agc tct gaa aat agg 922 Ile Pro Glu Phe Pro Gly Lys Leu Lys Ser Val Ser Ser Glu Asn Arg 280 285 290 aac ttt gct gta agc cag ctg cac aac aat ggg att gat aaa gaa tca 970 Asn Phe Ala Val Ser Gln Leu His Asn Asn Gly Ile Asp Lys Glu Ser 295 300 305 agt ggc ttg aca ttg cac ttc agc aaa act ctt ctc aaa atg gaa ttc 1018 Ser Gly Leu Thr Leu His Phe Ser Lys Thr Leu Leu Lys Met Glu Phe 310 315 320 tct gaa aaa tgc cta ccc tat cag ttg cta ctt agc tca ctc aag ctg 1066 Ser Glu Lys Cys Leu Pro Tyr Gln Leu Leu Leu Ser Ser Leu Lys Leu 325 330 335 acc ttt gcc ttt caa tcg gaa gag act ata tcc acg gtg ctt gat cct 1114 Thr Phe Ala Phe Gln Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Leu Asp Pro 340 345 350 355 gag tgt gtc tgt gag tca cca gtt tct ata gtt aca ggt gac ctg tgt 1162 Glu Cys Val Cys Glu Ser Pro Val Ser Ile Val Thr Gly Asp Leu Cys 360 365 370 act cag gat ggg ttt atg gat cat aag gtc tac agt cac cag aca aaa 1210 Thr Gln Asp Gly Phe Met Asp His Lys Val Tyr Ser His Gln Thr Lys 375 380 385 cca gct ctc aac tta gaa acc cta agg ggt gga gac tca tcc tgc caa 1258 Pro Ala Leu Asn Leu Glu Thr Leu Arg Gly Gly Asp Ser Ser Cys Gln 390 395 400 cct acc ttc cag gct gca tct caa ggg ctg ata ctg ttt cac ata ccc 1306 Pro Thr Phe Gln Ala Ala Ser Gln Gly Leu Ile Leu Phe His Ile Pro 405 410 415 ctg tat gga tgc ggg aca aga cat aag ttc aag gaa ggc aaa gtc atc 1354 Leu Tyr Gly Cys Gly Thr Arg His Lys Phe Lys Glu Gly Lys Val Ile 420 425 430 435 tat gaa aat gaa ata cat gct gtc tgg gcg gat ctt cct cca agc aca 1402 Tyr Glu Asn Glu Ile His Ala Val Trp Ala Asp Leu Pro Pro Ser Thr 440 445 450 att tct aga gat agt gaa ttc aga atg aca gtg cag tgc cat tac agc 1450 Ile Ser Arg Asp Ser Glu Phe Arg Met Thr Val Gln Cys His Tyr Ser 455 460 465 aaa cct gac ctg cta ata aat acc aga gtc caa agt ctt cct cct cca 1498 Lys Pro Asp Leu Leu Ile Asn Thr Arg Val Gln Ser Leu Pro Pro Pro 470 475 480 gag gcc tca gtg agg cca ggt cca ctt gcc tta atc ctg caa acc tac 1546 Glu Ala Ser Val Arg Pro Gly Pro Leu Ala Leu Ile Leu Gln Thr Tyr 485 490 495 caa gat aaa tcc tac ctc caa cct tac ggg gag aag gag tac cct gtg 1594 Gln Asp Lys Ser Tyr Leu Gln Pro Tyr Gly Glu Lys Glu Tyr Pro Val 500 505 510 515 gtg aga tac ctc cgc caa cca att tat ctg gaa gtg aga gtc cta aat 1642 Val Arg Tyr Leu Arg Gln Pro Ile Tyr Leu Glu Val Arg Val Leu Asn 520 525 530 agg tct gac ccc aac atc aag ctg gtc tta gat gac tgc tgg gca aca 1690 Arg Ser Asp Pro Asn Ile Lys Leu Val Leu Asp Asp Cys Trp Ala Thr 535 540 545 ccc acg atg gac cca gcc tcc gtc ccc cag tgg aat att atc atg gat 1738 Pro Thr Met Asp Pro Ala Ser Val Pro Gln Trp Asn Ile Ile Met Asp 550 555 560 ggc tgt gaa tac aac ctg gac aac cac aga acc acc ttc cat gca gtt 1786 Gly Cys Glu Tyr Asn Leu Asp Asn His Arg Thr Thr Phe His Ala Val 565 570 575 ggc tcc tct gtg acc tat cct act cac tat cgg agg ttt gat gtg aag 1834 Gly Ser Ser Val Thr Tyr Pro Thr His Tyr Arg Arg Phe Asp Val Lys 580 585 590 595 acc ttt gcc ttt gta tca gag gcc caa gtg ctt gct agt ctg gtc tac 1882 Thr Phe Ala Phe Val Ser Glu Ala Gln Val Leu Ala Ser Leu Val Tyr 600 605 610 ttc cac tgc agt gtc tta atc tgc agt cga ctg tct gct gac tcc cct 1930 Phe His Cys Ser Val Leu Ile Cys Ser Arg Leu Ser Ala Asp Ser Pro 615 620 625 ctg tgt tcc gtg act tgc cct gtg cca ttc aga cac agg aga gcc aca 1978 Leu Cys Ser Val Thr Cys Pro Val Pro Phe Arg His Arg Arg Ala Thr 630 635 640 ggc acg act gca gaa gag aaa atg ata gtg agt ctt cca gga ccc atc 2026 Gly Thr Thr Ala Glu Glu Lys Met Ile Val Ser Leu Pro Gly Pro Ile 645 650 655 ctc ctg ctg tca gat agc tct tca ctc aga gat gtg gtg gac tcc aaa 2074 Leu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Ser Leu Arg Asp Val Val Asp Ser Lys 660 665 670 675 ggg tat ggg gat gcc gga tat gtt gct ttt aag act gtg gta gct gtg 2122 Gly Tyr Gly Asp Ala Gly Tyr Val Ala Phe Lys Thr Val Val Ala Val 680 685 690 gct gcc tta gca ggc ctc gtg gca acg cta ggc ttc atc acc tac ctg 2170 Ala Ala Leu Ala Gly Leu Val Ala Thr Leu Gly Phe Ile Thr Tyr Leu 695 700 705 cgc aag aac aga acc atg ata aat cac taaggatttt caaataaaat 2217 Arg Lys Asn Arg Thr Met Ile Asn His 710 715 ggttgaagt ２２３
０

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるネコ卵透明帯ＦＺ
   Ｐ２蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部をコードする
   塩基配列を含むＤＮＡ。