JPH0799974A - ヒト卵透明帯−２蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト卵透明帯−２（ＨＺＰ２）蛋白質をコー
ドするＤＮＡ。 【効果】 遺伝子工学的又はペプチド合成といった手法
を用いて、ＨＺＰ２の人工合成が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト卵透明帯−２蛋白
質をコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の卵透明帯（zona pellucida）
は、卵母細胞を取り囲む細胞外マトリックスであり、通
常、ＺＰ１、ＺＰ２、ＺＰ３、ＺＰ４等のＺＰ糖蛋白質
から構成されている。これらのＺＰ糖蛋白質は、卵母細
胞の成長初期段階及び卵胞の細胞分化の初期段階で形成
され、子宮壁に着床するまでの間、卵母細胞及び胎児を
保護する役割をもつ。また、精子が卵透明帯のＺＰ糖蛋
白質に付着し、卵透明帯に侵入する受精過程において
も、これらのＺＰ糖蛋白質は重要な機能を有している
（Wassarman P.M.“Z0NA PELLUCIDA GLYCOPROTEINS”A
m. Rev. Biochem. 1988, 57:415-442；Wassarman P.M.
(1990) Development 108:1-17）。

【０００３】従って、精子が結合し得るＺＰ糖蛋白質を
ブロックすることにより、受精を阻害し、その結果、避
妊又は不妊が可能となる。その１つの方法として、卵透
明帯に対する抗体はin vitro で受精を阻害できること
が報告されており（Shivers,C. H.ら(1972) Science 17
8:1211-1213；メルクの特開昭５３−２６３１１号公
報）、さらに、ＺＰ糖蛋白質を含む卵透明帯蛋白質をワ
クチン抗原として雌の哺乳動物に投与すると、該抗原に
対する抗体がｉｎ ｖｉｖｏ生成され、それがブロック
剤となって受精、または、卵胞の発育が阻害されること
も報告されている（Wood D. M.ら (1981) Biol. Repro
d. 25:439-450；Skinner S. M. ら (1984)Endrocrinolo
gy 115:2418-2432; Mahi-Brown C. A.ら (1985) Biol.
Reprod. 32:761-772）。この効果は、ＺＰ３と呼ばれる
成分単独でも効果のあることが報告されており、成分全
体でなくてもよいと考えられている（Sacco A. G. ら(1
987)Biol. Reprod. 36:481-490 ；Millar S. E.ら (198
9) Science 246:935-938 ）。これらの抗原はいわゆる
避妊ワクチンとして知られ、また、このワクチンによる
避妊法は、従来の避妊法であるピル、ＩＵＤ、コンドー
ム、リズム法、不妊手術等による方法とは異なり免疫学
的避妊法として知られる。

【０００４】この卵透明帯を構成する卵透明帯蛋白質成
分に関しては、その遺伝子クローニングが行なわれ、ア
ミノ酸配列及び塩基配列が明らかとなってきている。例
えばＺＰ３と呼ばれる成分に関しては、マウス（M. J.
Ringuette ら、 Dev. Biol.127, 287〜295 (1988)）、
ハムスター（R. A. Kinloch ら(1990) Dev. Biol.142:4
14-421 ）及びヒト（M.E.ChamberlinとJ. Dean (1990)
Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87, 6014〜6018）由来のも
のが報告されている。また、ＺＰ２と呼ばれる成分に関
しても、ＺＰ２に対する抗体がin vitro で受精を阻害
することが報告されており（East I. J.ら(1985) Dev.
Biol. 109:268-273 ）、ＺＰ３と同様にワクチン効果を
もつと考えられている。ＺＰ２のクローニングに関して
は、マウス（Liang, Li-Fangら(1990) Mol. Cell Biol.
10:1507-1515 ）由来のものが報告されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ワクチン抗原として可
溶化卵透明帯を直接使用する哺乳動物の避妊法において
は、該抗原を得るために大量の卵巣を必要とする欠点が
あり、また、卵透明帯を精製するうえで他の卵巣組織が
混在し、これが副作用の原因となる可能性を有してい
る。これに対して、遺伝子工学的手法やペプチド合成と
いった手法で卵透明帯蛋白質を人工合成できるようにす
れば、高純度の卵透明帯蛋白質を安価に製造することが
できる利点をもつ。しかしながら、ヒトに関しては、卵
透明帯ＺＰ２蛋白質の一次構造は不明であり、この蛋白
質の免疫学的避妊法への応用は知られていない。

【０００６】従って、本発明の目的は、ヒト卵透明帯−
２（以下ＨＺＰ２と称する）の人工合成に必要な遺伝子
配列及びアミノ酸配列を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１に
示されるアミノ酸番号１〜７４２のアミノ酸配列を有す
るヒト卵透明帯−２蛋白質の全体又はその一部をコード
するＤＮＡを提供する。

【０００８】ヒト卵透明帯ＨＺＰ２遺伝子のクローニン
グは、一般的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うことがで
きる。このような技術の中には、細胞又は組織からの全
ＲＮＡの抽出、オリゴ−ｄＴによるｍＲＮＡの精製、ｍ
ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、ＰＣＲ（Polymerase Chain
Reaction ）増幅、表現型マーカーを含むベクター内へ
のＤＮＡの挿入、コンピテント宿主細胞の形質転換、コ
ロニーライブラリーからの目的ｃＤＮＡクローンのスク
リーニング、陽性ｃＤＮＡクローンからのベクターＤＮ
Ａの単離、ＤＮＡの配列決定などが含まれる。

【０００９】具体的なＤＮＡ配列決定手順の例を以下に
示す。

【００１０】ヒト卵巣から得た全ＲＮＡを、例えばＷａ
ｒｄら（J. Virol., 9, 61 (1972)）の方法に従って抽
出する。即ち、凍結、粉砕した卵巣をホモジナイズし、
遠心した後、細胞を溶解し、遠心により核をペレット化
し、全ＲＮＡを含む上清をフェノール／クロロホルム抽
出により精製し、塩化ナトリウムの存在下水相にエタノ
ールを加えて全ＲＮＡを沈殿させる。次に、オリゴーｄ
Ｔセルロースクロマトグラフィーを用いて、全ＲＮＡ調
製物からｍＲＮＡを精製する（Oppermann ら、Virolog
y, 108, 47 (1981) ）。

【００１１】ポリ（Ａ）⁺ ｍＲＮＡに対してランダムプ
ライマー、オリゴ−ｄＴプライマー等を用いて逆転写酵
素により相補鎖ＤＮＡを伸長し、さらにＲＮａｓｅ Ｈ
によりＲＮＡを分離し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて
二本鎖ｃＤＮＡを合成する。

【００１２】ｃＤＮＡライブラリーを作るため、得られ
た二本鎖ｃＤＮＡの両末端にリンカーを連結して、λフ
ァージベクターに導入し、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏパッ
ケージングを行い、ファージ粒子を得る。このファージ
粒子を大腸菌株に感染させ、寒天培地上に培養して、λ
ファージの溶菌プラークを形成させる。プラークをニト
ロセルロース膜に移動、固定した後、イムノスクリーニ
ング、または、ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼー
ションによりＨＺＰ２蛋白質をコードするＤＮＡが組み
込まれたファージプラークを同定する。

【００１３】得られたファージＤＮＡを制限酵素消化
し、得られるＤＮＡ断片を同様の制限酵素部位をもつプ
ラスミドにサブクローニングする。

【００１４】得られたＨＺＰ２蛋白質をコードするＤＮ
Ａを含むプラスミドを各種の制限酵素により消化し、各
フラグメントをＭ１３ファージベクターにサブクローニ
ングする。

【００１５】得られたファージプラークから一本鎖ＤＮ
Ａを調製し、Ｍ１３ジデオキシ法により各フラグメント
の塩基配列を決定する。

【００１６】この操作段階中λファージベクターに導入
することなく、ＨＺＰ２蛋白質をコードする遺伝子を増
幅するために、該遺伝子を含むｃＤＮＡをＰＣＲ法（Sa
iki,R.K. ら(1985) Science 230, 1350-1354; Lee, C.
C.ら(1988) Science 239, 1288-1291; Frohman, M.A.ら
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002）
に掛けることができる。使用されるプライマーは、例え
ばマウス卵透明帯ＭＺＰ２（Liang, L. F.ら(1990) Mo
l. Cell. Biol. 10:1507-1515）の公知の遺伝子配列に
基づいて推定され、作製し得る。

【００１７】上述の手順により、全長ヒト卵透明帯−２
蛋白質をコードするＤＮＡ配列が決定された。このＤＮ
Ａ配列は、配列番号１に示される２２７７ bp のヌクレ
オチド配列から成り、そのうちＨＺＰ２リーディングフ
レームはヌクレオチド番号２６から２２５１までの２２
２６ bp で構成されることが判明した。このＤＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列も同様に配列番号１に示さ
れており、Ｍｅｔ¹ ………Ｈｉｓ⁷⁴² の７４２アミノ酸
から構成されることが分った。

【００１８】したがって、本発明の実施態様により、本
発明は、配列番号１に示されるヌクレオチド番号２６〜
２２５１の塩基配列の全体又はその一部から成るＤＮＡ
を提供する。さらに、本発明においては、配列番号１の
配列中、アミノ酸の遺伝暗号の縮重に基づく対応する全
ての塩基を含む全ての可能なヌクレオチド配列が包含さ
れる。

【００１９】本発明により決定されたＨＺＰ２をコード
するヌクレオチド配列及びＨＺＰ２の推定アミノ酸配列
を利用することによって、ヒト用避妊ワクチンとして有
用であろうＨＺＰ２蛋白質又はその断片の人工合成が可
能となる。このような合成法としては、遺伝子工学的手
法又はペプチド合成手法が挙げられる。

【００２０】遺伝子工学的手法による組換え型ＨＺＰ２
又はその断片の製造の場合、例えばその方法は、配列番
号１に示されるアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜７４
２）の全体若しくはその一部をコードするヌクレオチド
配列から成るＤＮＡを複製可能な適切な発現ベクターに
組み込む工程、得られた発現ベクターで適切な宿主を形
質転換する工程、得られた形質転換体を適切な培地中で
培養し、前記ＤＮＡを発現させる工程、及び得られた組
換え型ＨＺＰ２又はその断片を回収する工程、を包含す
る。

【００２１】本発明のＤＮＡを発現させるためのベクタ
ーは、ファージ又はプラスミドであり、通常、複製部位
と選択マーカー配列を含む。複製部位は、形質転換され
る宿主細胞に適合するプロモーター、ターミネーター、
複製起点、リボソーム結合部位などの配列を適宜含み得
る。特に、プロモーターとしては、原核生物を宿主とす
る場合には常用のｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモー
ター、バクテリオファージλプロモーター等が、酵母を
宿主とする場合にはアルコールデヒドロゲナーゼや解糖
系酵素類に対するプロモーター等が、動物細胞を宿主と
する場合にはＳＶ４０ウイルスプロモーターのようなウ
イルスプロモーター等が挙げられる。また、選択マーカ
ー配列としては、アンピシリン、テトラサイクリン耐性
遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が常用される。発現すべ
き外来遺伝子は、通常、プロモーターの下流に挿入され
る。

【００２２】宿主細胞は、原核及び真核生物の両方を使
用し得る。原核生物には、大腸菌、枯草菌、放線菌等の
菌類が含まれ、また、真核生物には、酵母、昆虫細胞、
植物細胞、動物細胞等が含まれる。これらの宿主細胞
は、対象とするペプチドの糖鎖構造の有無に応じて適宜
選択され、一般に、糖鎖を含むペプチドを合成したい場
合には、真核生物が使用される。

【００２３】一方、ペプチド合成手法によるＨＺＰ２又
はその断片の製造の場合、例えば生化学実験講座１タン
パク質の化学ＩＶ−化学修飾とペプチド合成−第 205〜
495頁、1977年（日本生化学会編）に記載の技術等を適
用可能であるが、小断片の製造の場合、特に有効であろ
う。

【００２４】

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説
明する。

【００２５】実施例１ ヒト卵透明帯ＨＺＰ２ ｃＤＮＡライブラリーの作製 ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入したヒト卵巣ｍＲＮＡ（＃
ＣＬ６５４４−１）を、市販のｃＤＮＡ合成キット（Ri
boClone cDNA Synthesis System, Promega）を用いて、
メーカーの指示に従ってｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲ法の
鋳型ＤＮＡとした。具体的には、ｍＲＮＡ１μｇをオリ
ゴｄＴプライマー０．５μｇと混合後７０℃、５分間イ
ンキュベートし、その後室温に戻しこれにキットのファ
ーストストランド合成試薬（ファーストストランドバッ
ファー，ジチオスレイトール溶液，デオキシヌクレオシ
ド三リン酸混液，リボヌクレアーゼインヒビター溶液，
ピロリン酸ナトリウム溶液，ＡＭＶ逆転写酵素）を加
え、４２℃，１時間反応した。次にキットのセカンドス
トランド合成試薬（セカンドストランドバッファー，ジ
チオスレイトール，ＮＡＤ溶液，ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ，ＲＮａｓｅＨ，リガーゼ）を追加して１４℃，２時
間反応させた。反応終了後、７０℃，１０分間の加温処
理をした後、氷冷しさらにこれにＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼＩを加え３７℃，１０分間反応させ、０．２Ｍ ＥＤ
ＴＡで反応を終了させた。こうして調製したｃＤＮＡを
以下のＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。

【００２６】ＨＺＰ２ ｃＤＮＡの配列決定 （Ａ）ＨＺＰ２の中央領域（ＨＺＰ２_94-515 ）遺伝子の
クローニング 得られた鋳型ＤＮＡを増幅するために、市販のＰＣＲキ
ット試薬（GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit, P
erkin Elmer Cetus ）及びＰＣＲ自動化装置（DNA Ther
mal Cycler, Perkin Elmer Cetus）を用いて、メーカー
の指示に従ってＰＣＲ反応を実施した。反応条件は次の
とおりである。１）熱変性ステップ：９４℃，３０秒
間、２）プライマーのアニーリングステップ：５５℃，
１分間、３）プライマーの伸長ステップ：７２℃，２分
間から成る３つのステップを１サイクルとして合計４０
サイクル行なった後、さらに７２℃，７分間を１回行っ
て１ラウンドのＰＣＲを終了した。このとき使用したプ
ライマーは、マウス卵透明帯ＭＺＰ２（Liang, L. F.ら
(1990) Mol. Cell Biol. 10:1507-1515 ）及び本発明者
がクローニングしたブタ卵透明帯ＰＺＰ２の遺伝子配列
から推定した、

【００２７】

【表１】

【００２８】（但し、［］はミックスを表わす。）であ
る。プライマーの合成には、自動ＤＮＡ合成機（Cyclon
e Plus DNA Synthesizer, Milli Gen／Biosearch ）を
使用した。

【００２９】反応終了後、等量のクロロホルムを加えて
ミネラルオイルを反応溶液より除去し、これに１／１０
容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と３倍容量の
冷エタノールを加えてＤＮＡをエタノール沈殿させる。
沈殿ＤＮＡは乾燥後、適量の水に溶解させＥｃｏＲＩお
よびＳａｌＩで消化させる。これを低融点アガロースゲ
ル電気泳動に流し１２００ｂｐ程度のＤＮＡを切り出
す。ゲルからのＤＮＡの抽出はＧＥＮＥＣＬＥＡＮＤ
（ＢＩＯ １０１）を用いる。このＤＮＡを先にＥｃｏ
ＲＩ，ＳａｌＩで消化して同様にアガロースゲルより精
製してあるｐＵＣ１８ベクターの大断片にライゲーショ
ンキット（宝酒造）を用いて連結させ、大腸菌ＪＭ１０
９に形質転換させる（ｐＨＺＰ２_94-515／ＪＭ１０
９）。これを、アンピシリン含有ＬＢプレートに播き、
生えてきたコロニーを５ｍｌ培養しQIAGENHi Purity Pl
asmid Kit(QIAGEN)でプラスミドを精製する。精製した
プラスミドはその一部をＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化し
て目的サイズのＤＮＡが組み込まれていることの確認に
用い、残りを通常の２本鎖シークエンスに用いた。シー
クエンスはプラスミドをアルカリ処理後ジデオキシ終止
鎖法のＤＮＡシークエンスキット（SEQUENASE VERSION
2.07-deaza-dGTP Kit, USB）を用いて決定した。その結
果以下の配列（ＨＺＰ２_94-515）が決定された。

【００３０】

【表２】

【００３１】（Ｂ）３’側領域のクローニング ＨＺＰ２_515-733 のクローニング ：次の３個のプライマ
ーとヒト卵巣ｃＤＮＡを用いてＨＺＰ２の３’側遺伝子
をクローニングし配列を決定した。

【００３２】先に決定したＨＺＰ２_94-515の配列より次
のプライマー３，４，５を、又ｍＲＮＡのポリＡ配列よ
りプライマー６を自動ＤＮＡ合成機を用いて作製した。

【００３３】

【表３】

【００３４】さらに、次のＰＣＲの条件に従って、遺伝
子増幅を実施した。

【００３５】

【表４】 １回目のＰＣＲ−プライマー３および６： 鋳型ＤＮＡ：ヒト卵巣ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ２回目のＰＣＲ−プライマー４および６： 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ３回目のＰＣＲ−プライマー５および６： 鋳型ＤＮＡ：２回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：２回目ＰＣＲ条件と同じ ３回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲルにて電気
泳動を行ない、増幅されたＤＮＡバンドをエチジウムブ
ロマイド染色で確認する。その結果２回目のＰＣＲ産物
に７００ bp 程度のバンドが検出された。この２回目の
ＰＣＲ産物をエタノール沈澱後、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ
消化した後、低融点アガロースゲルにて電気泳動を行な
い、ゲルより目的の７００ bp のＤＮＡをＧＥＮＥＣＬ
ＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）を用いて精製した。この
精製したＤＮＡをあらかじめ同じＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ
で消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲーションキ
ット（宝酒造）を用いて連結させた。大腸菌ＪＭ１０９
に形質転換を行なった後、アンピシリン含有ＬＢプレー
トに播き、生えてきた形質転換株を拾い上げる（ｐＨＺ
Ｐ２_515-733 ／ＪＭ１０９）。これを５ｍｌアンピシリ
ン含有ＬＢ培地で培養しプラスミドを精製（ＱＩＡＧＥ
Ｎ Ｈｉ Ｐｕｒｉｔｙ ＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ使用）
した。精製したプラスミドはその一部をＥｃｏＲＩ，Ｓ
ａｌＩ消化して目的サイズのＤＮＡが組み込まれている
ことを確認した後、残りを遺伝子配列決定のため通常の
２本鎖シークエンスに用いた。シークエンスはプラスミ
ドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシーク
エンスキット（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯＮ
２．０７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ Ｋｉｔ，ＵＳＢ）を
用いて決定した。その結果以下の配列（ＨＺＰ２
_515-733 ）が決定された。

【００３６】

【表５】

【００３７】ＨＺＰ２_623-742 のクローニング：次の３
個のプライマーとヒト卵巣ｃＤＮＡを用いてＨＺＰ２の
残り３’側遺伝子をクローニングし配列を決定した。

【００３８】先に決定したＨＺＰ２_515-733 の配列より
次のプライマー７，８を自動ＤＮＡ合成機を用いて作製
した。

【００３９】

【表６】

【００４０】さらに次のＰＣＲ条件に従って、遺伝子増
幅を実施した。

【００４１】

【表７】 １回目のＰＣＲ−プライマー３および６： 鋳型ＤＮＡ：ヒト卵巣ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ２回目のＰＣＲ−プライマー７および６： 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ３回目のＰＣＲ−プライマー８および６： 鋳型ＤＮＡ：２回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃−５分，１回 ３回のＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲルにて電気
泳動を行ない、増幅されたＤＮＡバンドをエチジウムブ
ロマイド染色で確認する。その結果３回目のＰＣＲ産物
に４５０ｂｐ程度のバンドが検出された。この３回目の
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ
消化した後低融点アガロースゲルにて電気泳動を行な
い、ゲルより目的の４５０ｂｐのＤＮＡをＧＥＮＥＣＬ
ＥＡＮII（ＢＩＯ １０１）を用いて精製した。この精
製したＤＮＡをあらかじめ同じＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで
消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲーションキッ
ト（宝酒造）を用いて連結させた。大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換を行なった後、アンピシリン含有ＬＢプレート
に播き生えてきた形質転換株を拾い上げる（ｐＨＺＰ２
_623-742 ／ＪＭ１０９）。これを５ｍｌアンピシリン含
有ＬＢ培地で培養しプラスミドを精製（QIAGEN Hi Puri
ty Plasmid Kit使用）した。精製したプラスミドはその
一部をＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化して目的サイズのＤ
ＮＡが組み込まれていることの確認に用い、残りを通常
の２本鎖シークエンスに用いた。シークエンスはプラス
ミドをアルカリ処理後ジデオキシ終止鎖法のＤＮＡシー
クエンスキット（SEQUENASE VERSION 2.07-deaza-dGTP
Kit, USB）を用いて決定した。その結果以下の配列（Ｈ
ＺＰ２_623-742 ）が決定された。

【００４２】

【表８】

【００４３】（Ｃ）５’側領域遺伝子のクローニング ＨＺＰ２の５’側領域は前記のＨＺＰ２_94-515の配列を
もとにしてｃＤＮＡを作製し、これを鋳型としてＰＣＲ
を行ないクローニングした（Michael A. Frohman, Mich
ael K. Dush, and Gail R. Martin (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci USA85, 8998-9002; Osamu Ohara, Robert
L. Dorit, and Walter Gilbert (1989)Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86, 5673-5677) 。

【００４４】ＨＺＰ２_1-113 領域遺伝子のクローニン
グ：先に決定したＨＺＰ２_94-515の配列より次の３個の
プライマーを合成した。

【００４５】

【表９】

【００４６】プライマー９をもとにしてヒト卵巣ｍＲＮ
Ａより一本鎖ｃＤＮＡを作製した。１本鎖ｃＤＮＡの合
成は RiboClone cDNA Systhesis System (Promega)を使
用した。具体的には、０．５μｇのヒト卵巣ｍＲＮＡに
０．５μｇのプライマー８を加え７０℃で５分間保温後
室温にゆっくりと戻す。つづいて10×first strand buf
fer, 100mM DDT, 10mM dNTP mix, RNasin ribonuclease
inhibitor, 40mM Napyrophosphate, reverse transcri
ptaseを加えて４２℃で１時間保温して１本鎖ｃＤＮＡ
を合成する。反応終了後１回フェノール／クロロホルム
抽出を行ないその上清をＴＥ（10mM Tris-HCl pH7.5, 1
mM EDTA ）であらかじめ平衡化してあるスパンカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける。回収液はエタ沈メイ
ト（ニッポンジーン）とともにエタノール沈澱させる。
次に合成した１本鎖ｃＤＮＡの３’側にポリＡを付加す
る反応を行なった。具体的には、沈澱させた１本鎖ｃＤ
ＮＡを乾燥後、水に溶解し９４℃で２分処理後氷上で急
冷し、これにｄＡＴＰと５×tailing Buffer, terminal
deoxynucleotidyl-transferase （Bethesda Research
Laboratories）を加えて３７℃で１０分間，６５℃、１
５分間反応させる。これにＴＥを加えて希釈してＰＣＲ
の鋳型ＤＮＡ（５’ＨＺＰ２−ｃＤＮＡ）とした。ＰＣ
Ｒは以下の条件で実施した。

【００４７】

【表１０】 １回目ＰＣＲ−プライマー１０および６； 鋳型ＤＮＡ：５’ＨＺＰ２ｃＤＮＡ； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，４５℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃，５分 ２回目ＰＣＲ−プライマー１１および６； 鋳型ＤＮＡ：１回目ＰＣＲ産物； ＰＣＲ条件：９４℃−３０秒，５０℃−１分，７２℃−
２分，３０回；７２℃，５分 ２回目のＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲルにて電
気泳動を行なった。エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色した。その結果４００ bp 程度のＤＮＡバンドが検出
された。この４００ bp のＤＮＡをｐＵＣ１８のＥｃｏ
ＲＩ，ＳａｌＩにサブクローニングするために、ＰＣＲ
産物からクロロホルムでミネラルオイルを取り除き、エ
タノール沈澱させた。沈澱は乾燥後水に溶解した後Ｋｐ
ｎＩ，ＳａｌＩ消化した。反応終了後２％低融点アガロ
ースゲル電気泳動で分離し目的の４００ bp のバンドを
切り出しＧＥＮＥＣＬＥＡＮ II （ＢＩＯ １０１）を
用いてゲルより抽出した。これをあらかじめＫｐｎＩ，
ＳａｌＩで消化してあるｐＵＣ１８の大断片にライゲー
ションキット（宝酒造）を用いて連結させた。これを大
腸菌ＪＭ１０９に形質転換させ、アンピシリン含有ＬＢ
プレートに播き、生えてきたコロニーは拾い上げて５ｍ
ｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で培養し、ＱＵＩＡＧＥ
Ｎ，Ｈｉ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを用
いてプラスミドを精製した（ｐＨＺＰ２_1-113 ／ＪＭ１
０９）。精製したプラスミドはその一部をＫｐｎＩ，Ｓ
ａｌＩ消化して目的サイズのＤＮＡが組み込まれている
ことを確認した後、残りは通常の２本鎖シークエンスに
用いた。シークエンスはプラスミドをアルカリ処理後ジ
デオキシ終止鎖法のＤＮＡシークエンスキット（ＳＥＱ
ＵＥＮＡＳＥ ＶＥＲＳＩＯＮ ２．０７−ｄｅａｚａ
−ｄＧＴＰ Ｋｉｔ，ＵＳＢ）を用いて決定した。その
結果以下の配列（ＨＺＰ２_1-113 ）が決定された。

【００４８】

【表１１】

【００４９】以上、クローニングした４つのＤＮＡフラ
グメント（ＨＺＰ２_1-113 ，ＨＺＰ２_94-515，ＨＺＰ２
_515-733 ，ＨＺＰ２_623-742 ）の塩基配列より以下の配
列表の配列番号１に示すヒト卵透明帯−２（ＨＺＰ２）
蛋白質の全塩基配列（２２７７ｎｔ）およびアミノ酸配
列（７４２個）が明らかとなった。これより、ＨＺＰ２
蛋白質を遺伝子工学的手法又はペプチド合成等の手法を
用いて人工的に作ることが可能となった。

【００５０】

【発明の効果】本願発明により、ヒト卵透明帯−２（Ｈ
ＺＰ２）蛋白質をコードするヌクレオチド配列及び該蛋
白質のアミノ酸配列が明らかになった。これにより、遺
伝子工学的又はペプチド合成といった手法を用いてＨＺ
Ｐ２の人工合成が可能となり、しかもヒト用の避妊ワク
チン開発にあたって純粋な形のＨＺＰ２を大量に安価に
供給することが可能となろう。

【００５１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２２７７ ｂｐ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起 源： 生物名：ヒト 組織の種類：卵巣 配列： ＧＧＴＴＧＡＴＣＴＧ ＧＴＡＧＴＧＴＣＴＴ ＣＴＧＣＴ ＡＴＧ ＧＣＧ
ＴＧＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＣＴ 52 Met Ala Cys Arg Gln Arg Gly Gly Ser 1 5 TGG AGT CCC TCA GGC TGG TTC AAT GCA GGC TGG AGC ACC TAC AGG TCG 100 Trp Ser Pro Ser Gly Trp Phe Asn Ala Gly Trp Ser Thr Tyr Arg Ser 10 15 20 25 ATT TCT CTC TTC TTC GCC CTT GTG ACT TCA GGG AAC TCC ATA GAT GTT 148 Ile Ser Leu Phe Phe Ala Leu Val Thr Ser Gly Asn Ser Ile Asp Val 30 35 40 TCT CAG TTG GTA AAT CCT GCC TTT CCA GGC ACT GTC ACT TGC GAT GAA 196 Ser Gln Leu Val Asn Pro Ala Phe Pro Gly Thr Val Thr Cys Asp Glu 45 50 55 AGG GAA ATA ACA GTG GAG TTC CCA AGC AGT CCT GGC ACC AAG AAA TGG 244 Arg Glu Ile Thr Val Glu Phe Pro Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Trp 60 65 70 CAT GCT ACT GTG GTG GAT CCT CTT GGT CTC GAC ATG CCG AAC TGC ACT 292 His Ala Thr Val Val Asp Pro Leu Gly Leu Asp Met Pro Asn Cys Thr 75 80 85 TAC TAC CTG GAC CCA GAA AAG CTC ACC CTG AGG GCT ACC TAT GAT AAC 340 Tyr Tyr Leu Asp Pro Glu Lys Leu Thr Leu Arg Ala Thr Tyr Asp Asn 90 95 100 105 TGT ACC AGG AGA GTG CAT GGT GGA CAC CAG ATG ACC ATC AGA GTC ATG 388 Cys Thr Arg Arg Val His Gly Gly His Gln Met Thr Ile Arg Val Met 110 115 120 AAC AAC AGT GCT GCC TTA AGA CAC GGA GCT GTC ATG TAT CAG TTC TTC 436 Asn Asn Ser Ala Ala Leu Arg His Gly Ala Val Met Tyr Gln Phe Phe 125 130 135 TGT CCA GCT ATG CAA GTA GAA GAG ACC CAG GGG CTT TCA GCA TCT ACA 484 Cys Pro Ala Met Gln Val Glu Glu Thr Gln Gly Leu Ser Ala Ser Thr 140 145 150 ATC TGC CAG AAG GAT TTC ATG TCT TTT TCC TTG CCA CGG GTC TTC TCT 532 Ile Cys Gln Lys Asp Phe Met Ser Phe Ser Leu Pro Arg Val Phe Ser 155 160 165 GGC TTG GCT GAC GAC AGT AAG GGG ACC AAA GTT CAG ATG GGA TGG AGC 580 Gly Leu Ala Asp Asp Ser Lys Gly Thr Lys Val Gln Met Gly Trp Ser 170 175 180 185 ATT GAG GTT GGT GAT GGT GCA AGA GCC AAA ACT CTG ACC CTG CCA GAG 628 Ile Glu Val Gly Asp Gly Ala Arg Ala Lys Thr Leu Thr Leu Pro Glu 190 195 200 GCC ATG AAG GAA GGC TTC AGC CTC TTG ATT GAC AAC CAC AGG ATG ACC 676 Ala Met Lys Glu Gly Phe Ser Leu Leu Ile Asp Asn His Arg Met Thr 205 210 215 TTC CAT GTG CCA TTC AAT GCC ACT GGA GTG ACT CAC TAT GTG CAA GGT 724 Phe His Val Pro Phe Asn Ala Thr Gly Val Thr His Tyr Val Gln Gly 220 225 230 AAC AGT CAT CTC TAC ATG GTG TCT CTG AAG CTT ACA TTT ATA TCT CCT 772 Asn Ser His Leu Tyr Met Val Ser Leu Lys Leu Thr Phe Ile Ser Pro 235 240 245 GGA CAG AAG GTG ATC TTC TCT TCA CAA GCT ATT TGT GCA CCA GAT CCT 820 Gly Gln Lys Val Ile Phe Ser Ser Gln Ala Ile Cys Ala Pro Asp Pro 250 255 260 265 GTG ACC TGC AAT GCC ACA CAC ATG ACT CTC ACC ATA CCA GAG TTT CCT 868 Val Thr Cys Asn Ala Thr His Met Thr Leu Thr Ile Pro Glu Phe Pro 270 275 280 GGG AAG CTT AAG TCT GTG AGC TTT GAA AAC CAG AAC ATT GAT GTG AGC 916 Gly Lys Leu Lys Ser Val Ser Phe Glu Asn Gln Asn Ile Asp Val Ser 285 290 295 CAG CTG CAT GAC AAT GGA ATT GAT CTA GAA GCA ACA AAT GGC ATG AAA 964 Gln Leu His Asp Asn Gly Ile Asp Leu Glu Ala Thr Asn Gly Met Lys 300 305 310 TTG CAT TTC AGC AAA ACT CTG CTC AAA ACG AAA TTA TCT GAA AAA TGC 1012 Leu His Phe Ser Lys Thr Leu Leu Lys Thr Lys Leu Ser Glu Lys Cys 315 320 325 CTA CTC CAT CAG TTC TAC TTA GCT TCA CTC AAG CTG ACC TTT CTC CTT 1060 Leu Leu His Gln Phe Tyr Leu Ala Ser Leu Lys Leu Thr Phe Leu Leu 330 335 340 345 CGG CCA GAG ACA GTA TCC ATG GTG ATC TAT CCT GAG TGT CTC TGT GAG 1108 Arg Pro Glu Thr Val Ser Met Val Ile Tyr Pro Glu Cys Leu Cys Glu 350 355 360 TCA CCC GTT TCT ATA GTT ACA GGG GAG CTG TGC ACC CAG GAT GGG TTT 1156 Ser Pro Val Ser Ile Val Thr Gly Glu Leu Cys Thr Gln Asp Gly Phe 365 370 375 ATG GAC GTC GAG GTC TAC AGC TAC CAA ACA CAA CCA GCT CTT GAC CTG 1204 Met Asp Val Glu Val Tyr Ser Tyr Gln Thr Gln Pro Ala Leu Asp Leu 380 385 390 GGT ACT CTG AGG GTG GGA AAC TCA TCC TGC CAG CCT GTC TTT GAG GCT 1252 Gly Thr Leu Arg Val Gly Asn Ser Ser Cys Gln Pro Val Phe Glu Ala 395 400 405 CAG CCT CAG GGG CTG GTA CGG TTC CAC ATA CCC CTG AAT GGA TGT GGA 1300 Gln Pro Gln Gly Leu Val Arg Phe His Ile Pro Leu Asn Gly Cys Gly 410 415 420 425 ACG AGA TAT AAG TTC GAA GAT GAT AAA GTC GTC TAT GAA AAC GAA ATA 1348 Thr Arg Tyr Lys Phe Glu Asp Asp Lys Val Val Tyr Glu Asn Glu Ile 430 435 440 CAT GCT CTC TGG ACG GAT TTT CCT CCA AGC AAA ATA TCT AGA GAC AGT 1396 His Ala Leu Trp Thr Asp Phe Pro Pro Ser Lys Ile Ser Arg Asp Ser 445 450 455 GAG TTC AGA ATG ACA GTG AAG TGT TCT TAT AGC AGG AAT CGA CAT GCT 1444 Glu Phe Arg Met Thr Val Lys Cys Ser Tyr Ser Arg Asn Arg His Ala 460 465 470 ACT AAA CTA CAA CGA AGA AGC CTT ACT CCT CCA GTG AAG TTG GGT CCA 1492 Thr Lys Leu Gln Arg Arg Ser Leu Thr Pro Pro Val Lys Leu Gly Pro 475 480 485 TTT ACC TTG ATG GTG CAA AGC TAC CCA GAT AAT TCC TAC CAA CAA CCT 1540 Phe Thr Leu Met Val Gln Ser Tyr Pro Asp Asn Ser Tyr Gln Gln Pro 490 495 500 505 TAT GGG GAA AAC GAG TAC CCT CTA GTG AGA TTC CTC CGC CAA CCA ATT 1588 Tyr Gly Glu Asn Glu Tyr Pro Leu Val Arg Phe Leu Arg Gln Pro Ile 510 515 520 TAC ATG GAA GTG AGA GTG CTA AAC AGG GAT GAC CCC AAC ATC AAG CTG 1636 Tyr Met Glu Val Arg Val Leu Asn Arg Asp Asp Pro Asn Ile Lys Leu 525 530 535 GTC TTA GAT GAC TGC TGG GCG ACG TCC ACC ATG GAT CCA GAC TCT TTC 1684 Val Leu Asp Asp Cys Trp Ala Thr Ser Thr Met Asp Pro Asp Ser Phe 540 545 550 CCC CAG TGG AAC GTT GTC GTG GAT GGC TGT GCA TAT GAC CTG GAC AAC 1732 Pro Gln Trp Asn Val Val Val Asp Gly Cys Ala Tyr Asp Leu Asp Asn 555 560 565 TAC CAG ACC ACC TTC CAT CCA GTC GGA TCC TCT GTG ACC CAT CCT GAT 1780 Tyr Gln Thr Thr Phe His Pro Val Gly Ser Ser Val Thr His Pro Asp 570 575 580 585 CAC TAT CAG AGG TTT GAC ATG AAG GCT TTT GCC TTT GTA TCA GAA GCC 1828 His Tyr Gln Arg Phe Asp Met Lys Ala Phe Ala Phe Val Ser Glu Ala 590 595 600 CAC GTG CTC TCT AGC CTG GTC TAC TTC CAC TGC AGT GCC TTA ATC TGT 1876 His Val Leu Ser Ser Leu Val Tyr Phe His Cys Ser Ala Leu Ile Cys 605 610 615 AAT CGA CTC TCC CCT GAC TCC CCA CTG TGT TCT GTG ACC TGC CCT GTG 1924 Asn Arg Leu Ser Pro Asp Ser Pro Leu Cys Ser Val Thr Cys Pro Val 620 625 630 TCC TCT AGG CAC AGG CGA GCC ACA GGG GCC ACT GAA GCA GAG AAA ATG 1972 Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Thr Gly Ala Thr Glu Ala Glu Lys Met 635 640 645 ACA GTG AGC CTC CCA GGA CCC ATT CTC CTG TTG TCA GAT GAC TCC TCA 2020 Thr Val Ser Leu Pro Gly Pro Ile Leu Leu Leu Ser Asp Asp Ser Ser 650 655 660 665 TTC AGA GGT GTC GGC TCA TCT GAT CTA AAA GCA AGT GGG AGC AGT GGG 2068 Phe Arg Gly Val Gly Ser Ser Asp Leu Lys Ala Ser Gly Ser Ser Gly 670 675 680 GAG AAG AGT AGG AGT GAA ACA GGG GAG GAG GTT GGC TCA CGA GGT GCT 2116 Glu Lys Ser Arg Ser Glu Thr Gly Glu Glu Val Gly Ser Arg Gly Ala 685 690 695 ATG GAC ACC AAA GGG CAC AAG ACT GCT GGA GAT GTT GGT TCC AAA GCT 2164 Met Asp Thr Lys Gly His Lys Thr Ala Gly Asp Val Gly Ser Lys Ala 700 705 710 GTG GCT GCT GTG GCT GCC TTT GCA GGT GTG GTG GCA ACT CTA GGC TTC 2212 Val Ala Ala Val Ala Ala Phe Ala Gly Val Val Ala Thr Leu Gly Phe 715 720 725 ATC TAC TAC CTG TAC GAG AAA AGG ACT GTG TCA AAT CAC TAAATGGGCT 2261 Ile Tyr Tyr Leu Tyr Glu Lys Arg Thr Val Ser Asn His 730 735 740 TCTAAATAAA GCAGTC 2277

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸番号１〜
   ７４２のアミノ酸配列を有するヒト卵透明帯−２蛋白質
   の全体又はその一部をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号１に示されるヌクレオチド番号
   ２６〜２２５１の塩基配列の全体又はその一部から成る
   請求項１記載のＤＮＡ。