JP2001523098A - 複数のサブユニットからなるａｓｌｖ逆転写酵素の生成のための方法 - Google Patents

複数のサブユニットからなるａｓｌｖ逆転写酵素の生成のための方法

Info

Publication number
JP2001523098A
JP2001523098A JP54629298A JP54629298A JP2001523098A JP 2001523098 A JP2001523098 A JP 2001523098A JP 54629298 A JP54629298 A JP 54629298A JP 54629298 A JP54629298 A JP 54629298A JP 2001523098 A JP2001523098 A JP 2001523098A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
reverse transcriptase
nucleic acid
aslv
subunits
rsv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP54629298A
Other languages
English (en)
Inventor
エフ． ジェラード，ゲイリー
ディー． スミス，マイケル
ケイ． チャタジー，デブ
Original Assignee
ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド filed Critical ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド
Publication of JP2001523098A publication Critical patent/JP2001523098A/ja
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般的に、核酸分子（特に、メッセンジャーRNA分子）の逆転写のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、逆転写酵素（RT）活性を有するポリペプチドの混合物を含む組成物、およびこれらの組成物またはポリペプチドを用いて、特に、約55℃より上の温度で、核酸分子（特に、cDNA分子）を生成、増幅、または配列決定する方法に関する。本発明はまた、これらの方法により生成された核酸分子、これらの核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに所望のポリペプチドを生成するためのこのような核酸分子の使用に関する。本発明はまた、ラウス肉腫ウイルス(RSV)およびトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)RT、または他のトリ肉腫−白血病ウイルス(ASLV)RT（そのαおよび／またはβサブユニット）を生成するための方法、このようなRSV RT、AMV RT、または他のASLVRTサブユニットをコードする単離された核酸分子、これらの単離された核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの方法により生成されたRSVRT、AMV RT、または他のASLV RTサブユニットに関する。本発明は、さらに、組換えヘテロダイマーRTホロ酵素（特に、ヘテロダイマーRSV RT、AMV RT、または他のASLV RT(これらはαβRT、ββRT、またはαRTであり得る)）をコードする核酸分子、これらの核酸分子を含むベクター（特に、バキュロウイルスベクター）および宿主細胞（特に、昆虫細胞および酵母細胞）、これらのヘテロダイマーRTを生成するための方法、ならびにこれらの方法により生成されたヘテロダイマーRTに関する。本発明はまた、本発明の組成物、ポリペプチド、またはRSV RT、AMV RT、もしくは他のASLV RTを含むキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 複数のサブユニットからなるASLV逆転写酵素の生成のための方法 発明の分野 本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野にある。本発明は、一般的に、 逆転写酵素、および核酸分子（本質的に、メッセンジャーRNA分子）の逆転写の ための方法に関する。特に、本発明は、逆転写酵素の混合物を含む組成物、およ びこれらの逆転写酵素または組成物を用いて核酸分子（特に、cDNA分子）を生成 するか、増幅するか、または配列決定する方法に関する。本発明はまた、これら の方法により生成される核酸分子、および所望のポリペプチドを生成するこのよ うな核酸分子の使用に関する。本発明はまた、このような組成物を含むキットに 関する。 発明の背景 cDNAおよびcDNAライブラリー 生物、組織、または細胞の構造および生理学を調べることにおいて、しばしば 、その遺伝的内容を決定することが望ましい。生物の遺伝的フレームワークは、 生物の体細胞および生殖細胞に含まれるデオキシリボ核酸(DNA)中のヌクレオチ ド塩基の２本鎖配列にコードされる。DNAの特定のセグメントの遺伝内容、すな わち遺伝子は、遺伝子がコードするタンパク質の生成の際にのみ現れる。タンパ ク質を生成するために、DNA二重らせんの一方の鎖（「コーディング」鎖）の相 補コピーは、リボ核酸(RNA)の特定の配列をもたらすポリメラーゼ酵素により生 成される。この特定のRNAの型は、タンパク質生成のための、DNAに由来する遺伝 メッセージを含むので、メッセンジャーRNA（mRNA）と呼ばれる。 所定の細胞、組織、または生物内で、無数のmRNA種が存在し、各々が別々のお よび特定のタンパク質をコードする。この事実は、組織または細胞における遺伝 子発現を研究することに関心のある研究者に強力な道具を提供する＿mRNA分子は 単離され、そして種々の分子生物学技術によりさらに操作され得、それにより細 胞、組織、または生物の完全な機能的遺伝的内容の解明を可能にする。 遺伝子発現研究に対する１つの一般的なアプローチは、相補DNA(cDNA)クロー ンの生成である。この技術において、生物に由来するmRNA分子は、生物の細胞ま たは組織の抽出物から単離される。この単離は、しばしば、チミジン（Ｔ）オリ ゴマーが複合体化されている、固形クロマトグラフィーマトリクス（例えば、セ ルロースまたはアガロース）を使用する。大部分の真核生物mRNA分子における3' 末端は一連のアデノシン(A)塩基を含み、そしてＡはＴに結合するので、mRNA分 子は、組織または細胞抽出物中の他の分子および物質から迅速に精製され得る。 これらの精製mRNA分子から、cDNAコピーが酵素逆転写酵素(RT)を用いて作製され 得、RTは、１本鎖cDNA分子の生成をもたらす。次いで、１本鎖cDNAは、DNAポリ メラーゼの作用により、最初の・RNAの完全な２本鎖DNAコピー（すなわち、２本 鎖cDNA）に変換され得る（従って、生物ゲノムに含まれる、このmRNAをコードす る最初の２本鎖DNA配列）。次いで、タンパク質特異的２本鎖cDNAは、プラスミ ドまたはウイルスベクターに挿入され得、次いで、これは、宿主細菌、酵母、動 物細胞、または植物細胞に導入される。次いで、宿主細胞は培養培地において増 殖され、これは、目的の遺伝子を含む（または、多くの場合、発現する）宿主細 胞の集団をもたらす。 mRNA単離から、cDNAのプラスミドまたはベクターへの挿入、単離された遺伝子 を含む宿主細胞集団の増殖までのこの全プロセスは、「cDNAクローニング」と呼 ばれる。cDNAが多数の異なるmRNAから調製される場合、得られるcDNAセットは、 このcDNAセットが、供給源細胞、組織、または生物に存在する機能的遺伝情報を 含む遺伝子の「集団」を示すので、適切な用語である「cDNAライブラリー」と呼 ばれる。これらのcDNAライブラリーの遺伝子型分析は、それらが由来する生物の 構造および機能に関する多くの情報をもたらし得る。 レトロウイルス逆転写酵素 レトロウイルスRTの３つの原型形態は、徹底的に研究されてきた。モロニーマ ウス白血病ウイルス(M-MLV)RTは、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性およびRNaseH 活性を有する78kDaの単一サブユニットを有する。この酵素はクローニングされ 、 そしてE.coliにおいて十分に活性な形態で発現された（Prasad,V.R.,Reverse Tr anscriptase,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory P ress,135頁(1993)で概説される）。ヒト免役不全ウイルス(HIV)RTは、p66および p51サブユニットのヘテロダイマーであり、ここで小サブユニットはタンパク質 分解により大サブユニットに由来する。p66サブユニットは、p51サブユニットが 、DNAポリメラーゼドメインのみを有する一方で、RNA依存性DNAポリメラーゼお よびRNaseHドメインの両方を有する。活性HIV p66/p51 RTはクローニングされ、 そして多数の発現宿主（E.coliを含む）において首尾良く発現された（Le Grice ,S.F.J.,Reverse Transcriptase,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring H arbor Laboratory press,163頁(1993)に概説される）。HIV p66/p51ヘテロダイ マー内では、51kDサブユニットは触媒的に不活性であり、そして66kDサブユニッ トは、DNAポリメラーゼ活性およびRNaseH活性の両方を有する（Le Grice,S.F.J. ら、EMBO Journal 10:3905(1991)；Hostomsky,Z．ら、J.Virol.66:3179(1992)） 。トリ肉腫-白血病ウイルス(ASLV)RT（ラウス肉腫ウイルス(RSV)RT、トリ骨髄芽 球症ウイルス(AMV)RT、トリ赤芽球症ウイルス(AEV)ヘルパーウイルスMCAV RT、 トリ骨髄細胞腫症ウイルスMC29ヘルパーウイルスMCAV RT、トリ網内症ウイルス( REV-T)ヘルパーウイルスREV-A RT、トリ肉腫ウイルスUR2ヘルパーウイルスUR2AV RT、トリ肉腫ウイルスY73ヘルパーウイルスYAV RT、ラウス関連ウイルス(RAV)R T、および骨髄芽球症関連ウイルス(MAV)RTを含むが、それらに限定されない）も また、２つのサブユニットα（約62kDa）およびβ（約94kDa）のヘテロダイマー であり、ここでαは、タンパク質分解切断によりβに由来する（Prasad,V.R.,Re verse Transcriptase,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Labo ratory Press(1993),135頁で概説される）。ASLV RTは、２つのさらなる触媒的 に活性な構造形態、ββおよびαで存在し得る（Hizl,AおよびJoklik,W.K.,J.Bi ol.Chem．252:2281(1977)）。沈降分析は、αβおよびββがダイマーであり、 そしてα形態がモノマー形態とダイマー形態との間の平衡で存在することを示唆 する（Grandgenett,D.P.ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 70:230(1973)；Hizi,A.お よびJoklik,W.K.,J.Biol.Chem.252:2281(1977)；ならびにSoltis,D.A.およびSka lka,A.M.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85:3372(1988)）。ASLVαβおよびββ RTは 、同じタンパ ク質複合体において３つの異なる活性（DNAポリメラーゼ活性、RNaseH活性、お よびDNAエンドヌクレアーゼ（インテグラーゼ）活性）を含むレトロウイルスRT の唯一知られている例である（Skalka,A.M.,Reverse Transcriptase,Cold Sprin g Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993),193頁に概説 される）。α形態は、インテグラーゼドメインおよび活性を欠く。 ASLV RTの個々のサブユニットの種々の形態がクローニングされ、そして発現 された。これらは、98kDa前駆体ポリペプチド（通常、βおよびβカルボキシ末 端から除去される４kDaポリペプチドにタンパク質分解的にプロセシングされる （Alexander,F.ら、J.Viol.61:534(1987)およびAnderson,D.ら、Focus 17:53(19 95)））、ならびに成熟βサブユニット（Weis,J.H.およびSalstrom,J.S.,米国特 許第4,663,290号(1987)；ならびにSoltis,D.A.およびSkalka,A.M.Proc.Nat.Acad .Sci.USA 85:3372(1988)）を含む。ヘテロダイマーRSVαβRTもまた、クローニ ングされたRSVβ遺伝子を発現するE.coli細胞から精製された（Chernov,A.P.ら 、Blomed.Sci.2:49(1991)）。しかし、今まで、ヘテロダイマーαβRTの形成を もたらすクローニングASLV RTαおよびβ遺伝子の同時発現の報告はなかった。 逆転写効率 上記のように、RT媒介逆転写によるmRNAのcDNAへの変換は、クローニング遺伝 子から発現されたタンパク質の研究において必須の工程である。しかし、逆転写 を触媒する非改変RTの使用は、少なくとも２つの理由で非効率的である。第１に 、RTは、時々、主にRTに存在する内在性RNaseH活性の活性のために、逆転写が開 始される前にRNA鋳型を破壊する。第２に、RTは、しばしば、逆転写を、このプ ロセスが開始された後に完了しない（Berger,S.L.ら、Biochemistry 22:2365-23 72(1983)；Krug,M.S.およびBerger,S.L.,Meth.Enzymol.152:316(1987)）。RTのR NaseH活性除去は、第１の問題を排除し、そして逆転写効率を改善し得る（Gerar d,G.F.ら、FOCUS 11(4):60(1989)：Gerard,G.F.ら、F0CUS14(3):91(1992)）。し かし、RT（RNaseH活性を欠く形態（「RNaseH-」形態）を含む）は、核酸鋳型に おける特定の２次構造障壁(barrier)（Gerard,G.F.ら、FOCUS 11(4):60(1989)； Myers,T.W.およびGelfand,D.H.,Biochemistry 30:7661(1991)）、ならびに配列 障壁（Messer,L.I.ら、Virol.146:146(1985)；Abbotts,Jら、J.Biol.Chem.268:1 0312-10323(1993)）でDNA合成を未熟に終結する傾向がまだある。 今日利用可能な、最も効率的な逆転写系（これは、RNase-M-MLV RTを使用する ）においてでさえ、総cDNA産物の収量は、一般的に、投入mRNAの50％を超えず、 そして完全長産物の画分は50％を超えない。上記のようにこれらの制限を生じさ せ得るmRNAテンプレートにおける２次構造および配列の障壁は、ホモポリマース トレッチで頻繁に生じ（Messer,L.I.ら、Virol.146:146(1985)；Huber,H.E.ら、 J.Biol.Chem.264:4669-4678(1989)；Myers,T.W.およびGelfand,D.H.,Biochemist ry 30:7661(1991)）、より頻繁に、２次構造障壁よりもむしろ配列障壁であり（ Abbotts,J.ら、J.Biol.Chem.268:10312-10323(1993)）、そしてしばしば、異な るRTについて異なる（Abbotts,J.ら、J.Biol.Chem.268:10312-10323(1993)）。 これらの障壁が克服され得る場合、逆転写反応における総cDNA産物および完全長 cDNA産物の収量が、増大され得る。 発明の要旨 本発明は、逆転写酵素、このような酵素を含む組成物、および上記のcDNA長の 制限を克服することに有用な方法を提供する。一般的に、本発明は、核酸分子の 逆転写における使用のための組成物（逆転写酵素活性を有する２つ以上の異なる ポリペプチドを含む）を提供する。このような組成物は、１つ以上のヌクレオチ ド、適切な緩衝液、および／または１つ以上のDNAポリメラーゼをさらに含み得 る。本発明の組成物はまた、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含み得 る。本発明の組成物に使用される各々の逆転写酵素は、所定のmRNA分子上で異な る転写中断(pause)部位を有し得る。これらの組成物における逆転写酵素は、好 ましくは、RNaseH活性が低減されたか、または実質的に低減されており、そして 最も好ましくは、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)H-逆転写酵素、ラウス 肉腫ウイルス(RSV)H-逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)H-逆転写酵素、 ラウス関連ウイルス(RAV)H-逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス(MAV)H-逆転写 酵素、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)H-逆転写酵素、または他のASLV H-逆転 写酵素からなる群より選択される酵素である。好ましい組成物において、逆転写 酵素は、作用濃度で存在する。 本発明はまた、１つ以上の核酸分子を作製するための方法に関し、この方法は 、１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、１つ以上のRNA鋳型、および最も好ましく は、１つ以上のメッセンジャーRNA鋳型）を、逆転写酵素活性を有する２つ以上 のポリペプチドと混合する工程、および１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部に 相補的な第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で混合物をインキュベート する工程を含む。好ましい実施態様において、第１の核酸分子は、１本鎖cDNAで ある。本発明のこの局面に従う逆転写に適切な核酸鋳型は、任意の核酸分子また は核酸分子の集団（好ましくは、RNA、および最も好ましくは、mRNA）、特に細 胞または組織に由来する核酸分子を含む。好ましい局面において、mRNA分子の集 団（代表的に細胞または組織から得られる多数の異なるmRNA分子）を使用して、 本発明に従うcDNAライブラリーを作製する。核酸鋳型の好ましい細胞供給源は、 細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞を含む。 本発明はまた、１つ以上の２本鎖核酸分子を作製するための方法に関する。こ のような方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、RNAまたはmRNA、お よびより好ましくは、mRNA鋳型の集団）を、逆転写酵素活性を有する２つ以上の ポリペプチドと混合する工程；（ｂ）１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補的 な第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする工 程；および（ｃ）第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を 作製するのに十分な条件下で第１の核酸分子をインキュベートし、それにより第 １および第２の核酸分子を含む１つ以上の２本鎖核酸分子を形成する工程を含む 。このような方法は、１つ以上の２本鎖核酸分子を作製するプロセスの一部とし て、１つ以上のDNAポリメラーセの使用を含み得る。本発明はまた、このような ２本鎖核酸分子を作製するのに有用な組成物に関する。このような組成物は、２ つ以上の逆転写酵素、ならびに必要に応じて、１つ以上のDNAポリメラーゼ、適 切な緩衝液、および１つ以上のヌクレオチドを含む。 本発明はまた、核酸分子を増幅するための方法に関する。このような増幅方法 は、上記のように生成される２本鎖核酸分子を、１つ以上のDNAポリメラーゼと 混合する工程、および２本鎖核酸分子を増幅するのに十分な条件下で混合物をイ ンキュベートする工程を含む。第１の好ましい実施態様において、本発明は、核 酸分子を増幅するための方法に関し、この方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型（ 好ましくは、１つ以上のRNAまたは・RNA鋳型、およびより好ましくは、mRNA鋳型 の集団）を、逆転写酵素活性を有する２つ以上の異なるポリペプチドおよび１つ 以上のDNAポリメラーゼと混合する工程、ならびに（ｂ）１つ以上の鋳型の全て または一部に相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で混合物をインキュ ベートする工程を含む。好ましくは、逆転写酵素は、RNaseH活性が低減されたか 、または実質的に低減されており、そしてDNAポリメラーゼは、3'エキソヌクレ アーゼ活性を有する第１のDNAポリメラーゼおよび実質的に低減された3'エキソ ヌクレアーゼ活性を有する第２のDNAポリメラーゼを含む。本発明はまた、増幅 反応における使用のための、２つ以上の逆転写酵素および１つ以上のDNAポリメ ラーゼを含む組成物に関する。このような組成物は、１つ以上のヌクレオチドお よび増幅に適切な緩衝液をさらに含み得る。本発明の組成物はまた、１つ以上の オリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。 本発明によれば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なく とも５つ、少なくとも６つの、またはより多くの逆転写酵素が使用され得る。好 ましくは、２〜６つ、２〜５つ、２〜４つ、２〜３つの、および最も好ましくは 、２つの逆転写酵素が、本発明の組成物および方法において使用される。このよ うな複数の逆転写酵素は、本発明の組成物へ、または本発明の方法において任意 の順番で、同時または連続的に添加され得る。あるいは、異なる酵素を用いた複 数の異なる反応が別々に行われ得、そして反応産物が混合され得る。従って、本 発明は、複数の逆転写酵素が同時または連続的または別々に使用される本発明の 方法による核酸分子合成に関する。特に、本発明は、１つ以上の核酸分子を作製 する方法に関し、この方法は、１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ 以上の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、１つ以上の核酸鋳型（好ましく は、１つ以上のRNA鋳型またはmRNA鋳型、およびより好ましくは、mRNA鋳型の集 団）を第１の逆転写酵素とインキュベートする工程を含む。本発明によれば、１ つ以上の核酸分子（mRNA鋳型および／または合成核酸分子を含む）は、鋳型の全 てまたは一部に相補的なさらなる核酸分子を作製するのに、または以前に作製さ れた 核酸分子の長さを増大するのに十分な条件下で、第２の逆転写酵素とインキュベ ートされ得る。本発明によれば、この手順は、本発明の同じまたは異なる逆転写 酵素を用いて、任意の回数で繰り返され得る。例えば、第１および第２の逆転写 酵素は、同じか、または異なり得る。さらに、第１および第３の逆転写酵素（こ の手順が第１、第２、および第３の逆転写酵素を用いて３回繰り返される、本発 明の局面において）は同じであり得るが、一方、第２の逆転写酵素は、第１およ び第３の逆転写酵素と異なり得る。従って、同じおよび／または異なる逆転写酵 素の任意の組み合せは、本発明のこの局面において使用され得る。好ましくは、 複数の逆転写酵素が使用される場合、少なくとも２つの逆転写酵素は異なる。 本発明の関連する局面において、反応に使用される逆転写酵素は、後の反応工 程の間、その活性の全てまたは一部を保持し得る。あるいは、反応に使用される 逆転写酵素は、さらなる逆転写酵素とのインキュベーション前に任意の方法によ り不活化され得る。このような不活化は、熱不活化、（例えば、フェノールおよ び／またはクロロホルムを用いた）有機抽出、エタノール沈殿などを含み得るが 、それらに限定されない。 次いで、逆転写酵素の同時のまたは連続のまたは別々の添加により作製される 合核酸分子を使用して、２本鎖核酸分子を作製し得る。このような合成核酸分子 は、適切な条件下で（例えば、好ましくは、１つ以上のDNAポリメラーゼの存在 下で）インキュベートされる場合、合成核酸分子の全てまたは一部に相補的な核 酸分子を作製し、それにより、多数の２本鎖核酸分子を形成する、鋳型として働 く。次いで、２本鎖分子は、本発明に従って増幅され得る。 本発明はまた、上記の方法に従って生成される核酸分子（特に、１本鎖もしく は２本鎖cDNA分子）または増幅核酸分子、およびこれらの核酸分子または増幅核 酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）に関する。 本発明はまた、上記の核酸分子、増幅核酸分子、またはベクターを含む組換え 宿主細胞に関する。好ましいこのような宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物 細胞、および動物細胞（昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）を含む。 本発明は、さらに、上記の組換え宿主細胞を培養する工程およびポリペプチド を単離する工程を含むポリペプチドを生成する方法、ならびにこのような方法に より生成されるポリペプチドに関する。 本発明はまた、本発明の組成物または酵素を用いて、１つ以上の核酸分子を配 列決定するための方法に関する。このような方法は、（ａ）配列決定される１つ 以上の核酸分子（例えば、１つ以上のRNAまたはDNA分子）を、１つ以上のプライ マー、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上のヌクレオチ ド、および１つ以上の終結剤（例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド３リ ン酸）と混合する工程；（ｂ）配列決定される１つ以上の核酸分子の全てまたは 一部に相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、混合物をインキ ュベートする工程；および（ｃ）核酸分子の集団を分離して、配列決定される１ つ以上の核酸分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する工程を含む。 本発明のこれらの配列決定方法において、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポ リペプチドは、上記のような反応混合物に、同時に、連続的に、または別々に添 加され得る。 本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットに関する。このよう なキットは、核酸分子（１本鎖または２本鎖）を作製するか、配列決定するか、 または増幅するために使用され得る。本発明のキットは、その中に密に閉じ込め た１つ以上の容器（例えば、バイアル、チューブ、瓶など）を有するキャリア（ 例えば、箱またはボール箱）を含む。本発明のキットにおいて、第１の容器は、 １つ以上の逆転写酵素（好ましくは、RNaseH活性が低減されたか、もしくは実質 的に低減された、１つ以上のこのような酵素）、または本発明の１つ以上の組成 物を含む。別の局面において、キットは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ 以上、６つ以上などの逆転写酵素をを含む１つ以上の容器を含み得、好ましくは 、２〜６つ、２〜５つ、２〜４つ、２〜３つの、またはより好ましくは２つの逆 転写酵素を含む１つ以上の容器を含み得る。本発明のキットはまた、同じまたは 異なる容器に、１つ以上のDNAポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性DNAポリメラー ゼ）、核酸合成に適切な緩衝液、および１つ以上のヌクレオチドを含み得る。あ るいは、組成物の成分は、別々の容器（例えば、各酵素について１つの容器）に 分けられ得る。本発明の好ましいキットにおいて、逆転写酵素は、RNaseH活性が 低減されたか、または実質的に低減されており、そして最も好ましくは、M-MLV H-逆転写酵素、RSV H-逆転写酵素、AMV H-逆転写酵素、RAV H-逆転写酵素、MAV H-逆転写酵素、およびHIV H-逆転写酵素からなる群より選択される。本発明のさ らなる好ましいキットにおいて、容器中の酵素（逆転写酵素および／またはDNA ポリメラーゼ）は、作用濃度で存在する。 本発明はまた、RSV逆転写酵素（および／またはそのサブユニット）を生成す る方法に関する。特に、本発明は、RNaseH活性を含むRSV逆転写酵素（および／ またはそのサブユニット）を生成するための方法、RNaseH活性が低減されたか、 または実質的に低減されたRSV逆転写酵素（および／またはそのサブユニット） を生成するための方法、ならびにこのような方法により生成されるRSV逆転写酵 素（および／またはそのサブユニット）に関する。 本発明は、さらに、このような逆転写酵素を使用するための方法、およびこの ような逆転写酵素を含むキットに関する。特に、本発明のRSV逆転写酵素（およ び／またはそのサブユニット）は、核酸分子の（例えば、逆転写を介した）配列 決定、増幅、および生成の方法において使用され得る。 本発明はまた、AMV逆転写酵素（および／またはそのサブユニット）を生成す る方法に関する。特に、本発明は、RNaseH活性を含むAMV逆転写酵素（および／ またはそのサブユニット）を生成するための方法、RNaseH活性が低減されたか、 または実質的に低減されたAMV逆転写酵素（および／またはそのサブユニット） を生成するための方法、ならびにこのような方法により生成されるAMV逆転写酵 素（および／またはそのサブユニット）に関する。 本発明は、さらに、このような逆転写酵素を使用するための方法、およびこの ような逆転写酵素を含むキットに関する。特に、本発明のAMV逆転写酵素（およ び／またはそのサブユニット）は、核酸分子の（例えば、逆転写を介した）配列 決定、増幅、および生成の方法において使用され得る。 本発明はまた、一般的に、ASLV逆転写酵素（および／またはそのサブユニット ）を生成する方法に関する。特に、本発明は、RNaseH活性を含むASLV逆転写酵素 （および／またはそのサブユニット）を生成するための方法、RNaseH活性が低減 されたか、または実質的に低減されたこのようなASLV逆転写酵素を生成するため の方法、ならびにこのような方法により生成されるASLV逆転写酵素に関する。 本発明は、さらに、このような逆転写酵素を使用するための方法、およびこの ような逆転写酵素を含むキットに関する。特に、本発明のASLV逆転写酵素（およ び／またはそのサブユニット）は、核酸分子の（例えば、逆転写を介した）配列 決定、増幅、および生成の方法において使用され得る。 本発明は、さらに、核酸分子の上昇した温度の逆転写または高温逆転写のため の方法に関し、この方法は、（ａ）１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、１つ以上 のRNA分子（例えば、１つ以上のmRNA分子もしくはポリA+RNA分子、およびより好 ましくは、mRNA分子の集団）、または１つ以上のDNA分子）を、逆転写酵素活性 を有する１つ以上のポリペプチドと混合する工程；および（ｂ）50℃以上の温度 で、または１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子（例 えば、完全長cDNA分子）を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベー トする工程を含む。好ましい局面において、mRNA分子の集団は、上昇した温度ま たは高温でcDNAライブラリーを作製するために使用される。別の局面において、 上昇した温度または高温の核酸合成は、複数の逆転写酵素（すなわち、２つ以上 、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上などの、より好ましくは２〜６つ、 ２〜５つ、２〜４つ、２〜３つの、およびいっそうより好ましくは、２つの逆転 写酵素）を用いて行われ、逆転写酵素は、上記のように同時に、または連続的に 、または別々に反応混合物に添加され得る。好ましいこのような方法において、 混合物は、約51℃以上、約52℃以上、約53℃以上、約54℃以上、約55℃以上、約 56℃以上、約57℃以上、約58℃以上、約59℃以上、約60℃以上、約61℃以上、約 62℃以上、約63℃以上、約64℃以上、約65℃以上、約66℃以上、約67℃以上、約 68℃以上、約69℃以上、約70℃以上、約71℃以上、約72℃以上、約73℃以上、約 74℃以上、約75℃以上、約76℃以上、約77℃以上、もしくは約78℃以上の温度で ；または約50℃〜約75℃、約51℃〜約75℃、約52℃〜約75℃、約53℃〜約75℃、 約54℃〜約75℃、約55℃〜約75℃、約50℃〜約70℃、約51℃〜約70℃、約52℃〜 約70℃、約53℃〜約70℃、約54℃〜約70℃、約55℃〜約70℃、約55℃〜約65℃、 約56℃〜約65℃、約56℃〜約64℃、もしくは約56℃〜約62℃の温度範囲でインキ ュベートされる。本発明はまた、第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第 ２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、第１の核酸分子をインキュベート する工程をさらに含む、このような方法に関する。本発明によれば、これらの方 法により生成される第１および第２の核酸分子はDNA分子であり得、そして完全 長cDNA分子であり得る２本鎖DNA分子（例えば、cDNAライブラリー）を形成し得 る。これらの方法において使用される、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリ ペプチドは、好ましくは、RNaseH活性が低減されたか、または実質的に低減され ており、そして好ましくは、ASLV逆転写酵素（および／またはそのサブユニット ）（例えば、AMV逆転写酵素の１つ以上のサブユニット、および／またはRSV逆転 写酵素の１つ以上のサブユニット、および／またはMAV逆転写酵素の１つ以上の サブユニット、および／またはRAV逆転写酵素の１つ以上のサブユニット）から 選択され、特に、ここでサブユニットは、RNaseH活性が低減されたか、または実 質的に低減されている。 本発明はまた、上昇した温度または高温の核酸合成のためのキットに関し、こ のキットは、１つ以上の逆転写酵素（好ましくは、１つ以上のASLV逆転写酵素（ 例えば、AMVもしくはRSV逆転写酵素）（または１つ以上のそのサブユニット）、 およびより好ましくは、RNaseH活性が低減されたか、または実質的に低減された １つ以上のAMVもしくはRSV逆転写酵素（または１つ以上のそのサブユニット）） 、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のプライマー、および１つ以上の適切な緩 衝液からなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る。 本発明はまた、完全長cDNA分子であり得る、上記の方法により生成される核酸 分子、これらの核酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）、ならびにこれ らのベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞に関する。 本発明の他の好ましい実施態様は、以下の図面および発明の説明、ならびに請 求の範囲を考慮して当業者に明らかである。 図面の簡単な説明 図１〜６は、昆虫ウイルスプロモーター制御下にRSV RTαおよびβ遺伝子を配 置する、発現ベクター（pDABH-His）の構築を模式形式で（詳細は明瞭化のため に省略する）示す： 図１：pJD100、pAMP18、pAMP18N、pAMP1、pAMP1C、pAMP18NM、およびpAMP18B 。 図２：M13、M13RT、pAMP18BH-およびM13RTH-。 図３：pAMPIA。 図４：pDBH-Kpn、pDABH-、pDBH-KpnHis。 図５：pFastBacDUAL、pFastBacDUAL Nde、pDBH-およびpDA。 図６：pDABH-His。 図７〜21は、図１〜６に記載のプラスミドのより詳細なマップである。 図７：pJD100。 図８：pAMP18N。 図９：pAMP1C。 図10：pAMP18NM。 図11：pAMP18B。 図12：M13RT。 図13：M13RTH-。 図14：pAMP18BH-。 図15：pDBH-。 図16:pAMP1A。 図17：pDBH-Kpn。 図18：pDBH-KpnHis。 図19：pDA。 図20：pDABH-。 図21：pDABH-His。 図22〜25は、昆虫ウイルスプロモーター制御下にAMV RTαおよびβ遺伝子を配 置する、発現ベクター（pDAMVAH-BH-）の構築を模式形式で（詳細は明瞭化のた めに省略する）示す： 図22：AMV RT遺伝子のRNAからのクローニング；pSP0RT8。 図23：Hisタグ化AMV RTβ遺伝子の構築；pAMVN、pAMVNM、pAMVNMH-、pAMVC、 およびpAMVBH-。 図24：PCRによるAMV RTαサブユニットについてのクローンの構築；pAMVAおよ びpAMVAH-。 図25：AMV RTαおよびβ遺伝子を含むベクターの構築；pD、pDAMVAH-、pDAMVA 、pAMVH-BH-、pDAMVABH-、およびpJAMVBH-。 図26〜38：は、図22〜25に記載のプラスミドのより詳細なマップである。 図26：pAMVN。 図27：pAMVC。 図28：pAMVNM。 図29：pAMVNMH-。 図30：pAMVBH-。 図31：pAMVA。 図32：pAMVAH-。 図33：pFastBacDual(pD)。 図34：pDAMVA。 図35：pDAMVAH-。 図36：pDAMVABH-。 図37：pJAMVBH-。 図38：pDAMVAH-BH-。 図39は、示された時間および温度でインキュベートされた種々のRTのRT活性を 証明する片対数グラフである。 図40は、示された温度（℃）で50分の反応にわたって種々のRTより1.4、2.4、 4.4、および7.5Kb mRNAから合成されたcDNA産物のオートラジオグラフである。 図41は、示された温度（℃）で30分の反応にわたってRSV H-RTおよびSS II RT より1.4、2.4、4.4、および7.5Kb mRNAから合成されたcDNA産物のオートラジオ グラフである。M：32P標識1kb DNAラダー。 図42は、インキュベーション温度の関数とした、図41においてSSIIおよびRSVH -RTにより合成された完全長cDNA量のグラフである。 図43は、プラスミドpBP-RT(PCR)の制限地図である。 図44は、プラスミドpBP-RT(ATG)の制限地図である。 図45は、プラスミドpBK-RT15(ATG)の制限地図である。 図46は、プラスミドpFBBH-Hisの制限地図である。 図47は、プラスミドpJB-Hisの制限地図である。 図48は、プラスミドpJBD110E-Hisの制限地図である。 図49は、プラスミドpDAD110Eの制限地図である。 図50は、プラスミドpFBBD110E-Hisの制限地図である。 図51は、プラスミドpDABHisの制限地図である。 図52は、プラスミドpDABD110EHisの制限地図である。 図53は、プラスミドpDAD110EBHisの制限地図である。 図54は、プラスミドpDAD110EB110Eの制限地図である。 発明の詳細な説明 概要 本発明は、核酸分子の逆転写の間にしばしば観察される長さ制限を克服するこ とに有用な組成物および方法を提供する。従って、本発明は、今まで可能でなか った完全長cDNA分子の生成を容易にする。 一般的に、本発明は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上な どの異なる逆転写酵素活性を有するポリペプチドを含む、核酸分子の逆転写にお ける使用のための組成物を提供する。本発明の組成物は、好ましくは、２〜６つ 、２〜５つ、２〜４つ、２〜３つの逆転写酵素活性を有するポリペプチドを含み 、より好ましくは２つの逆転写酵素活性を有するポリペプチドを含む。これらの 組成物における酵素は、好ましくは、作用濃度で存在し、そしてRNaseH活性は低 減されたか、または実質的に低減されているが、酵素の混合物（ある酵素はRNas eH活性を有し、そしてある酵素はRNaseH活性が低減されたか、または実質的に低 減されている）が、本発明の組成物において使用され得る。あるいは、本発明の 組成物において使用される逆転写酵素としては、RNaseH活性を有し得る。好まし い逆転写酵素には、M-MLV H-逆転写酵素、RSV H-逆転写酵素、AMV H-逆転写酵素 、RAV H-逆転写酵素、MAV H-逆転写酵素、およびMIV H-逆転写酵素、または他の ASLV H-逆転写酵素が含まれる。 本発明はまた、１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法に関し、この方法は 、１つ以上の核酸鋳型（好ましくは、RNAまたはメッセンジャーRNA（mRNA）、よ り 好ましくは、mRNA分子の集団である）を、逆転写酵素活性を有する２つ以上のポ リペプチド（または本発明の組成物）と混合する工程、および１つ以上の鋳型の 全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をイ ンキュベートする工程を含む。このような核酸合成は、複数の逆転写酵素を連続 して、または同時に、または別々に添加することにより達成され得る。好ましく は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上などの逆転写酵素が使 用されるか、または２〜６つ、２〜５つ、２〜４つ、２〜３つの範囲の逆転写酵 素、そしてより好ましくは、２つの逆転写酵素が使用される。１つ以上の鋳型に 相補的な核酸分子を作製するために、プライマー（例えば、オリゴ(dT)プライマ ー）および１つ以上のヌクレオチドが、3'から5'方向の核酸合成に使用される。 本発明のこの局面に従う逆転写に適切な核酸分子は、任意の核酸分子、特に、原 核生物細胞または真核生物細胞に由来する核酸分子を含む。このような細胞は、 正常細胞、疾患細胞、形質転換細胞、樹立細胞、前駆細胞(progenitor cell)、 前駆細胞（precursor cell）、胎児細胞、胚細胞、細菌細胞、酵母細胞、動物細 胞（ヒト細胞を含む）、鳥類細胞、植物細胞など、または植物もしくは動物（例 えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、 ウサギ、鳥、魚、昆虫など）から単離された組織を含み得る。このような核酸分 子はまた、ウイルスから単離され得る。 本発明は、さらに、核酸分子を増幅または配列決定するための方法を提供し、 この方法は、核酸分子と逆転写活性を有する２つ以上のポリペプチド（または本 発明の組成物）とを接触させる工程を含む。このような反応は、逆転写酵素活性 を有する２つ以上のポリペプチドを反応混合物に連続して、または同時に、また は別々に添加することにより達成され得る。好ましいこのような方法は、１つ以 上のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。 本発明はまた、上記の方法に従って生成されたcDNA分子または増幅核酸分子、 これらのcDNA分子または増幅核酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）、 およびこのようなcDNA分子、増幅核酸分子、またはベクターを含む組換え宿主細 胞を提供する。本発明はまた、これらの組換え宿主細胞を培養する工程およびポ リペプチドを単離する工程を含むポリペプチドを生成する方法を提供し、そして このような方法により生成されたポリペプチドを提供する。 本発明はまた、本発明に従う使用のためのキットを提供する。このようなキッ トは、運搬手段（例えば、箱またはボール箱の中に１つ以上の容器手段（例えば 、バイアル、チューブ、瓶など）を密閉して有する箱またはボール箱）を含み、 ここでキットは、同じかまたは異なる容器に、逆転写酵素活性を有する２つ以上 のポリペプチドを含む。本発明のキットはまた、同じかまたは異なる容器に、１ つ以上のDNAポリメラーゼ、適切な緩衝液、および／または１つ以上のヌクレオ チド（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)）を含み得る。 本発明はまた、実質的に純粋なRSV逆転写酵素(RSV RT)に関し、これは、RNase H活性が低減または実質的に低減されてもよいし、されなくてもよい。このよう なRSV RTは、１つ以上のαサブユニット、１つ以上のβサブユニット、および１ つ以上のβp4サブユニットから選択される１つ以上のサブユニット（またはそれ らの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）を含み得、これらのいず れかまたは全ては、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、さ れなくてもよい。本発明の１つの好ましい局面において、RSV RTは、RNaseH活性 が低減もしくは実質的に低減されたαサブユニット、およびRNaseH活性を有する βサブユニットを含み得る（すなわち、RSV αH-βH+RT）。この実施態様の好ま しい局面において、αサブユニットをコードする遺伝子は、RNaseH活性を低減す るように改変または変異されているが、一方、βサブユニットをコードする遺伝 子は、このように変異または改変されていない。このような変異または改変は、 好ましくは、αサブユニットのRNaseHドメイン内で作製される。予想外に、この 構築物の表現型は、実質的に低減した（すなわち、野生型の約５％）RNaseH活性 を示した。別の好ましい局面において、RSV RTは、RNaseH活性が低減もしくは実 質的に低減されたαサブユニット、および同様にRNaseH活性が低減もしくは実質 的に低減されたβサブユニットを含み得る（すなわち、RSV αH-/βH-RT）。別 の好ましい局面において、RSV RTは２つのβサブユニットを含み得、これらのい ずれかまたは両方は、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、 されなくてもよい（すなわち、RSV βH-/βH-RT；RSV βH-/βH+RT；またはRSV βH+/βH+RT）。別の好ましい局面において、RSV RTは、単一のαサブユニット を含 み得、これは、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、されな くてもよい（すなわち、RSV αH-RTまたはRSV αH+RT）。別の好ましい局面にお いて、RSV RTは、１つ以上のβp4サブユニットを含み得、これらのいずれかまた は全ては、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、されなくて もよい（例えば、RSV βp4H-/βp4H-RT；RSV β4H-/βp4H+RT；RSV βp4H+/βp4 H+RT；RSV αH-/βp4H+RT；RSV αH+/βp4H+RT；RSV αH-/βp4H-RT；RSV αH+/ βp4H-RT；RSV βH-/βp4H+RT；RSV βH-/βp4H-RT；RSV βH+/βp4H-RT；RSV βH+/βp4H+RT；など）。理解されるように、上記のサブユニットのいずれかま たは全ての、誘導体、改変体、フラグメント、または変異体もまた、本発明に従 って使用され得る。 本発明の関連する局面において、RSV RTが、２つ以上のサブユニット（または それらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）を含み、好ましくは 、２つのサブユニット（例えば、ダイマー）を含む場合、これらのサブユニット の好ましくは全てではないが、少なくとも１つは、少なくとも１つのサブユニッ トのポリメラーゼ活性を低減するか、実質的に低減するか、または排除するよう に改変または変異され得る（例えば、pol-）。好ましい局面において、αおよび βサブユニットを含むRSV RTについて、βサブユニットは、ポリメラーゼ活性を 低減するか、実質的に低減するか、または排除するように（好ましくは、組換え 技術により）改変または変異されているが、一方、αサブユニットのポリメラー ゼ活性は、このように変異または改変されていない。好ましくは、このようなRS V RTのαサブユニットはまた、RNaseH活性を低減または実質的に低減するように 改変または変異されているが、一方、βサブユニットは、このように改変または 変異されていない。このような構築物は、αH-/βH+pol-と呼ばれ得る。サブユ ニットの任意の数の組み合わせが調製され得、ここで変異または改変は２サブユ ニット酵素のうちの１つのサブユニットにおいてなされ、そしてこれらの構築物 は他の改変または変異（例えば、RNaseH活性を低減または実質的に低減する改変 または変異）と組み合され得る。例示される例としては、RSVαH-/βH-pol-；RS V αH+/βH+pol-；RSVaH-pol-/βH+；RSVαH-pol-/βH-；RSVaH+pol-/βH+；RSV βH-/βH-pol-；RSVβH-/βH+pol-；RSVβH+/βH+pol-；RSVβp4H-/β p4H-pol-；RSVβp4H-/βp4H+pol-；RSVβp4H+/βp4H+pol-；RSVαH-/βp4H-pol- ；RSVαH+/βp4H+pol-；RSVαH+/βp4H-pol-；RSVβH-/βp4H+pol-；RSVβH-/β p4H+pol-；RSVβH+/βp4H-pol-；などが含まれるが、これらに限定されない。好 ましい局面において、サブユニットのポリメラーゼドメインは、組換え技術によ り改変または変異される（１つ以上の点変異、欠失変異、および／または挿入変 異）。別の局面において、ポリメラーゼドメインのヌクレオチド結合部位は、改 変または変異される。好ましい局面において、ヌクレオチド結合部位内の１つ以 上の酸性アミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。変異または改変のための、 ヌクレオチド結合部位内の特に好ましいアミノ酸には、Asp107、Leu108、Lys109 、およびAsp110、または対応するアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定され ない。 本発明はまた、本発明のRSV RTを生成する方法に関し、この方法は、１つ以上 のαサブユニット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変 異体）をコードする核酸配列、および／あるいは１つ以上のβサブユニット（ま たはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）をコードする核 酸配列、および／あるいは１つ以上のβp4サブユニット（またはそれらの誘導体 、改変体、フラグメント、もしくは変異体）をコードする核酸配列を含む宿主細 胞を得る工程、ならびに本発明のRSV RTを生成するのに十分な条件下で宿主細胞 を培養する工程を含む。このようなαサブユニットおよび／またはこのようなβ サブユニットおよび／またはこのようなβp4サブユニットをコードする核酸配列 は、同じベクターまたは異なるベクターに含まれ得る。本発明によれば、このよ うなαサブユニットおよび／またはβサブユニットおよび／またはβp4サブユニ ットは、本発明のRSV RTを形成するために、別々に生成され得、そして各サブユ ニット単離の前もしくは後に混合され得る。あるいは、このようなαサブユニッ トおよび／またはβサブユニットおよび／またはβp4サブユニットは、同じ宿主 細胞内で同時に発現され（すなわち、同時発現され）、それによりαサブユニッ トおよびβサブユニット、αサブユニット単独、βサブユニット単独、βp4サブ ユニット単独、βサブユニットおよびβp4サブユニット、２つのβサブユニット もしくは２つのβp4サブユニット、またはそれらの誘導体、改変体、フラグメン ト、 もしくは変異体を含むRSV RTを生成し得る。好ましい局面において、αサブユニ ット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）は、β サブユニット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体 ）と共に宿主細胞内で同時に発現される。本発明の関連する局面において、βま たはβp4サブユニット（またはそれらの誘導体、フラグメント、もしくは変異体 ）は、このようなβまたはβp4サブユニットのいくつかまたは全てのインビボプ ロセシングを達成して、対応するαサブユニットを形成する、宿主または宿主細 胞において発現され得る。βおよびαサブユニット両方の存在は、αおよびβサ ブユニットを含むRSV RTのインビボ形成を可能にする。このようなインビボプロ セシングは、好ましくは、βおよび／またはβp4サブユニット（またはそれらの 誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）を宿主細胞において発現する ことにより達成され、宿主細胞は、このようなβまたはβp4サブユニットを切断 して対応するαサブユニットを形成する、適切なプロセシング酵素またはタンパ ク質を有する、原核生物または真核生物であり得る。このようなプロセシング酵 素またはタンパク質は、組換え手段により宿主系において導入および発現され得 るか、または宿主系において天然に存在し得る。インビボプロセシングに好まし い宿主は、例えば、酵母、菌類、植物、動物、昆虫、魚などのような真核生物の 細胞または細胞小器官を含む。インビボプロセシングのためのβまたはβp4サブ ユニット（またはそれらの誘導体、フラグメント、もしくは変異体）のクローニ ングを可能にする、組換え系（ベクター、発現ベクター、プロモーターなど）は 、当業者に周知である。上記のように、これらの組換え技術により生成された、 RSV RTのαおよび／またはβおよび／またはβp4サブユニット（またはそれらの 誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）のいずれかまたは全ては、RN aseH活性が低減または実質的に低減され得る。 次いで、これらのRSV RTまたはそのサブユニットは宿主細胞から単離され得、 そして当業者が精通するタンパク質精製の任意の方法（例えば、クロマトグラフ ィー、電気泳動、透析、高塩沈殿、またはその組み合わせ）により実質的に精製 され得る。本発明はまた、本発明の１つ以上のRSV RTを含むキットに関する。 本発明はまた、実質的に純粋なニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(AMV R T)に関し、これは、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、さ れなくてもよい。このようなAMV RTは、１つ以上のαサブユニット、１つ以上の βサブユニット、および１つ以上のβp4サブユニット（またはそれらの誘導体、 改変体、フラグメント、もしくは変異体）から選択される１つ以上のサブユニッ トを含み得、これらのいずれかまたは全ては、RNaseH活性が低減もしくは実質的 に低減されてもよいし、されなくてもよい。本発明の１つの好ましい局面におい て、AMV RTは、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されたαサブユニット、 およびRNaseH活性を有するβサブユニットを含み得る（すなわち、AMV αH-βH+ RT）。この実施態様の特に好ましい局面において、αサブユニットをコードする 遺伝子は、RNaseH活性を低減するように（好ましくは、RNaseHドメイン内で）改 変または変異されているが、一方、βサブユニットをコードする遺伝子は、RNas eH活性に影響を及ぼすように改変または変異されていない。予想外に、この構築 物は、αサブユニットおよびβサブユニットを含むAMV RTのRNaseH活性が、RNas eH活性において実質的に低減された（すなわち、野生型の約５％）表現型を証明 する。別の好ましい局面において、AMV RTは、RNaseH活性が低減もしくは実質的 に低減されたαサブユニット、および同様にRNaseH活性が低減もしくは実質的に 低減されたβサブユニットを含み得る（すなわち、AMV αH-/βH-RT）。別の好 ましい局面において、AMV RTは２つのβサブユニットを含み得、これらのいずれ かまたは両方は、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、され なくてもよい（すなわち、AMV βH-/βH-RT；AMV βH-/βH+RT；またはAMV βH+ /βH+RT）。別の好ましい局面において、AMV RTは、単一のαサブユニットを含 み得、これは、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、されな くてもよい（すなわち、AMV αH-RTまたはAMV αH+RT）。別の好ましい局面にお いて、AMV RTは、１つ以上のβp4サブユニットを含み得、これらのいずれかまた は全ては、RNaseH活性が低減もしくは実質的に低減されてもよいし、されなくて もよい（例えば、AMV βp4H-/βp4H-RT；AMV βp4H-/βp4H+RT；AMV βp4H+/βp 4H+RT；AMV αH-/βp4H+RT；AMV αH-/βp4H+RT；AMV αH-/βp4H-RT；AMV αH+ /βp4H-RT；AMV βH-/βp4H-RT；AMV βH+/βp4H-RT；など）。 本発明の関連する局面において、AMV RTが、２つ以上のサブユニット（または それらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）を含み、好ましくは 、２つのサブユニット（例えば、ダイマー）を含む場合、これらのサブユニット の少なくとも１つ（しかし、好ましくは、これらのサブユニットの全てではない ）は、少なくとも１つのサブユニットのポリメラーゼ活性を低減するか、実質的 に低減するか、または排除するように改変または変異され得る（例えば、pol-） 。好ましい局面において、αおよびβサブユニットを含むAMV RTについて、βサ ブユニットは、ポリメラーゼ活性を低減するか、実質的に低減するか、または排 除するように（好ましくは、組換え技術により）改変または変異されているが、 一方、αサブユニットのポリメラーゼ活性は、このように変異または改変されて いない。好ましくは、このようなAMV RTのαサブユニットはまた、RNase H活性 を低減または実質的に低減するように改変または変異されているが、一方、βサ ブユニットは、このように改変または変異されていない。このような構築物は、 αH-/βH+pol-と呼ばれ得る。サブユニットの任意の数の組み合わせが調製され 得、ここで変異または改変は２サブユニット酵素のうちの１つのサブユニットに おいてなされ、そしてこれらの構築物は他の改変または変異（例えば、RNase H 活性を低減または実質的に低減する改変または変異）と組み合わされ得る。例示 される例は、AMVαH-/βH-pol-；AMVαH+/βH+pol-；AMVaH-pol-/βH+；AMVαH- pol-/βH-；AMVαH+pol-/βH+；AMVβH-/βH-pol-；AMVβH-/βH+pol-：AMVβH+ /βH+pol-；AMVβp4H-/βp4H-pol-；AMVβp4H-/βp4H+pol-；AMVβp4H+/βp4H+p ol-；AMVαH-/βp4H-pol-；AMVαH+/βp4H+pol-；AMVαH+/βp4H-pol-；AMVβH- /βp4H+pol-;AMVβH-/βp4H+pol-；AMVβH+/βp4H-pol-；などを含むが、それら に限定されない。好ましい局面において、サブユニットのポリメラーゼドメイン は、組換え技術により改変または変異される（１つ以上の点変異、欠失変異、お よび／または挿入変異）。別の局面において、ポリメラーゼドメインのヌクレオ チド結合部位は、改変または変異される。好ましい局面において、ヌクレオチド 結合部位内の１つ以上の酸性アミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。変異ま たは改変のための、ヌクレオチド結合部位内の特に好ましいアミノ酸は、Asp107 、Leu108、Lys109、およびAsp110、または対応するアミノ酸配列を含むが、それ らに限定されない。 本発明はまた、本発明のAMV RTを生成する方法に関し、この方法は、１つ以上 のαサブユニット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変 異体）をコードする核酸配列、および／あるいは１つ以上のβサブユニット（ま たはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）をコードする核 酸配列、および／あるいは１つ以上のβp4サブユニット（またはそれらの誘導体 、改変体、フラグメント、もしくは変異体）をコードする核酸配列を含む宿主細 胞を得る工程、ならびにAMV RTを生成するのに十分な条件下で宿主細胞を培養す る工程を含む。このようなαサブユニットおよび／またはこのようなβサブユニ ットおよび／またはこのようなβp4サブユニットをコードする核酸配列は、同じ ベクターおよび／または異なるベクターに含まれ得る。本発明によれば、このよ うなαサブユニットおよび／またはβサブユニットおよび／またはβp4サブユニ ットは、本発明のAMV RTを形成するために、別々に生成され得、そして各サブユ ニット単離の前または後に混合され得る。あるいは、このようなαサブユニット またはβサブユニットおよび／またはβp4サブユニットは、同じ宿主細胞内で同 時に発現され（すなわち、同時発現され）、それによりαサブユニットおよびβ サブユニット、αサブユニット単独、βサブユニット単独、βp4サブユニット単 独、βサブユニットおよびβp4サブユニット、２つのβサブユニットもしくは２ つのβp4サブユニット、またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしく は変異体を含むAMV RTを生成し得る。好ましい局面において、αサブユニットは 、βサブユニットと共に宿主細胞内で同時に発現される。本発明の関連する局面 において、βまたはβp4サブユニット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグ メント、もしくは変異体）は、RSV RT生成について上記されたようにインビボプ ロセシングを達成する、宿主または宿主細胞において発現され得る。従って、適 切なプロセシング酵素またはタンパク質を有する宿主系においてβサブユニット および／またはβp4サブユニット（またはそれらの誘導体、フラグメント、もし くは変異体）を発現することにより、対応するαサブユニットは生成され得、α およびβサブユニット、ならびにαおよびβp4サブユニットなどを含むAMV RTの 形成を可能にする。上記のように、AMV RTのαおよび／またはβおよび／または βp4サブユニット（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変 異 体）のいずれかまたは全ては、RNase H活性が低減または実質的に低減され得る 。次いで、これらのAMV RTまたはそのサブユニットは宿主細胞から単離され得、 そしてRSV RT精製について上記された方法により実質的に精製され得る。本発明 はまた、本発明の１つ以上のAMV RTを含むキットに関する。 本発明はまた、他の実質的に純粋なASLV逆転写酵素に関し、これは、RNase H 活性が低減もしくは実質的に低減されてもよく、または低減もしくは実質的に低 減されてなくてもよい。このようなASLV RTは、上記のRSV RTおよびAMV RTにつ いて記載されたように、１つ以上のαサブユニット、１つ以上のβサブユニット 、および１つ以上のβp4サブユニットから選択される１つ以上のサブユニット（ またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）を含み得る。 本発明はまた、RSV RTおよびAMV RTについて上記されたように、本発明のこのよ うなASLV RTを生成する方法に関する。 本発明はまた、mRNA鋳型から第１鎖cDNAを生成するタンパク質の能力により測 定されるような機能的活性を有する、本発明のRSV逆転写酵素およびAMV逆転写酵 素または他のASLV逆転写酵素、ならびにそのサブユニット（ならびにそれらの誘 導体、改変体、フラグメント、および変異体）に関する。このような機能的活性 は、合成反応間に作製される総完全長逆転写産物に基づいて、本発明に従って測 定され得る。産物量は、好ましくは、生成される産物の量（例えば、ナノグラム ）に基づいて測定されるが、産物量を測定する他の手段が当業者により理解され る。さらに、機能的活性は、cDNA合成反応間に生成される完全長産物の割合につ いて測定され得る。例えば、完全長機能的活性パーセントは、完全長産物量をcD NA合成反応間に生成される総産物量で割り、そしてこの結果に100を掛けて、割 合を得ることにより決定され得る。本発明のRSVおよびAMV逆転写酵素ならびにそ れらのサブユニット（ならびにそれらの誘導体、改変体、フラグメント、および 変異体）は、核酸合成反応において、約４％より多い完全長cDNA、好ましくは約 ５％より多い完全長cDNA、より好ましくは約7.5％より多い完全長cDNA、いっそ うより好ましくは約10％より多い完全長cDNA、いっそうより好ましくは約20％よ り多い完全長cDNA、そして最も好ましくは約25％より多い完全長cDNAを生成する 。このような割合の好ましい範囲は、約５％〜約100％、約7.5％〜約75％、約 7.5％〜約50％、約10％〜約50％、約15％〜約40％、約20％〜約40％、および約2 ０％〜約50％を含む。機能的活性はまた、合成反応における投入mRNA量と比較し た総cDNA産物の割合を決定することにより、本発明に従って測定され得る。従っ て、総cDNA産物量を投入mRNA量で割り、この結果に100を掛けて、使用鋳型量と 比較した生成産物量に関連する機能的活性の割合を決定する。好ましくは、本発 明の逆転写酵素は、cDNA合成反応において、投入mRNAと比較して、約15％より多 いcDNA、より好ましくは約20％より多いcDNA、いっそうより好ましくは約25％よ り多いcDNA、いっそうより好ましくは約30％より多いcDNA、そして最も好ましく は約40％より多いcDNAを生成する。このような割合の好ましい範囲は、約５％〜 約100％、約10％〜約80％、約15％〜約80％、約15％〜約75％、約20％〜約75％ 、約20％〜約70％、約25％〜約75％、約25％〜約70％、約25％〜約60％、および 約25％〜約50％を含む。本発明のAMVおよびRSV逆転写酵素ならびにそれらのサブ ユニット（ならびにそれらの誘導体、改変体、フラグメント、および変異体）は 、好ましくは、約５単位/mgより大きな比活性、より好ましくは約50単位/mgより 大きな比活性、いっそうより好ましくは約100単位/mg、250単位/mg、500単位/mg 、1000単位/mg、5000単位/mg、または10,000単位/mgより大きな比活性、そして 最も好ましくは約15,000単位/mgより大きな比活性、約16,000単位/mgより大きな 比活性、約17,000単位/mgより大きな比活性、約18,000単位/mgより大きな比活性 、約19,000単位/mgより大きな比活性、および約20,000単位/mgより大きな比活性 を有する。本発明のAMVおよびRSV RTならびにそれらのサブユニット（またはそ れらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）の好ましい比活性範囲 は、約５単位/mg〜約140,000単位/mgの比活性、約５単位/mg〜約125,000単位/mg の比活性、約50単位/mg〜約100,000単位/mgの比活性、約100単位/mg〜約100,000 単位/mgの比活性、約250単位/mg〜約100,000単位/mgの比活性、約500単位／・g 〜約100,000単位/mgの比活性、約1000単位/mg〜約100,000単位/mgの比活性、約5 000単位/mg〜約100,000単位/mgの比活性、約10,000単位/mg〜約100,000単位/mg の比活性、約25,000単位/mg〜約75,000単位/mgの比活性を含む。他の好ましい比 活性範囲は、約20,000単位/mg〜約140,000単位/mgの比活性、約20,000単位/mg〜 約130,000単位/mgの比活性、約20,000単位/mg〜約120,000単位/mgの比活性、約2 0,000単位/m g〜約110,000単位/mgの比活性、約20,000単位/mg〜約100,000単位/mgの比活性、 約20,000単位/mg〜約90,000単位/mgの比活性、約25,000単位/mg〜約140,000単位 /mgの比活性、約25,000単位/mg〜約130,000単位/mgの比活性、約25,000単位/mg 〜約120,000単位/mgの比活性、約25,000単位/mg〜約110,000単位/mgの比活性、 約25,000単位/mg〜約100,000単位/mgの比活性、および約25,000単位/mg〜約90,0 00単位/mgの比活性を含む。好ましくは、比活性範囲の下限は、30,000、35,000 、40,000、45,000、50,000、5,000、60,000、65,000、70,000、75,000、および8 0,000単位/mgで変化し得るが、一方、この範囲の上限は、150,000、140,000、13 0,000、120,000、110,000、100,000、および90,000単位/mgで変化し得る。本発 明によれば、比活性は、反応において使用されたタンパタ質または酵素の総量と 比較した、タンパク質または酵素の酵素活性（単位）の測定値である。比活性測 定値は、当業者に周知の標準的な技術により決定され得る。酵素またはタンパク 質の比活性を決定するために好ましいアッセイは、以下の実施例に詳細に記載さ れる。 本発明のRSV RTおよびAMV RTまたは他のASLV RTならびにそれらのサブユニッ ト（またはそれらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）は、１つ 以上の鋳型から核酸分子を作製するために使用され得る。このような方法は、１ つ以上の核酸鋳型（例えば、mRNA、より好ましくはmRNA分子の集団）を、本発明 の１つ以上のRSV RTおよび／または１つ以上のAMV RTおよび／または他のASLV R Tと混合する工程、ならびに１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部に相補的な１ つ以上の核酸分子を作製するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする工 程を含む。 本発明はまた、１つ以上の核酸分子の増幅のための方法に関し、この方法は、 １つ以上の核酸鋳型を、本発明の１つ以上のRSV RTおよび／または１つ以上のAM V RTおよび／または他のASLV RT、ならびに必要に応じて１つ以上のDNAポリメラ ーゼと混合する工程、ならびに１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部に相補的な １つ以上の核酸分子を増幅するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする 工程を含む。 本発明はまた、１つ以上の核酸分子を配列決定するための方法に関し、この方 法は、（ａ）配列決定される１つ以上の核酸分子を、１つ以上のプライマー核酸 分子、本発明の１つ以上のRSV RTおよび／または１つ以上のAMV RTおよび／また は他のASLV RT、１つ以上のヌクレオチド、ならびに１つ以上の終結剤と混合す る工程；（ｂ）配列決定される１つ以上の核酸分子の全てまたは一部に相補的な 核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工 程；ならびに（ｃ）核酸分子の集団を分離して、配列決定される１つ以上の核酸 分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する工程を含む。 本発明はまた、核酸分子の上昇した温度の逆転写または高温逆転写のための方 法に関し、この方法は、（ａ）核酸鋳型（好ましくは、RNA（例えば、mRNA分子 もしくはポリA+RNA分子）またはDNA分子）を、逆転写酵素活性を有する１つ以上 のポリペプチドと混合する工程；および（ｂ）50℃以上の温度で、および核酸鋳 型の全てまたは一部に相補的な第１の核酸分子（例えば、完全長cDNA分子）を作 製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする工程を含む。好ましい このような方法において、混合物は、約51℃以上、約52℃以上、約53℃以上、約 54℃以上、約55℃以上、約56℃以上、約57℃以上、約58℃以上、約59℃以上、約 60℃以上、約61℃以上、約62℃以上の温度で；または約50℃〜約70℃、約51℃〜 約70℃、約52℃〜約70℃、約53℃〜約70℃、約54℃〜約70℃、約55℃〜約70℃、 約55℃〜約65℃、約56℃〜約65℃、約56℃〜約64℃、もしくは約56℃〜約62℃の 温度範囲でインキュベートされる。本発明はまた、第１の核酸分子の全てまたは 一部に相補的な第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、第１の核酸分子 をインキュベートする工程をさらに含む、このような方法に関する。本発明によ れば、これらの方法により生成される第１および第２の核酸分子はDNA分子であ り得、そして完全長cDNA分子であり得る２本鎖DNA分子を形成し得る。これらの 方法において使用される、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドは、 好ましくは、RNase H活性が低減されたか、または実質的に低減されており、そ してAMV逆転写酵素の１つ以上のサブユニット、およびRSV逆転写酵素の１つ以上 のサブユニット、および他のASLV逆転写酵素の１つ以上のサブユニット（または それらの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）からなる群より選択 され得る。上記のように、このようなAMV RTまたはRSV RTまたは他のASLV RTは 、 １つ以上のαサブユニット、１つ以上のβサブユニット、および／または１つ以 上のβp4サブユニットを含み得、これらのサブユニットのいずれかまたは全ては 、RNase H活性が低減されるか、または実質的に低減され得る。これらの方法に おける使用のためのRT活性を有する特に好ましいポリメラーゼは、上記のRSV RT およびAMV RTまたは他のASLV RT、ならびにそれらのサブユニット（またはそれ らの誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）である。 本発明はまた、このような方法により生成される核酸分子（完全長cDNA分子で あり得る）、これらの核酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）、ならび にこれらのベクターおよび核酸分子を含む宿主細胞に関する。 酵素供給源 本発明の組成物、方法、およびキットにおける使用のための酵素は、逆転写酵 素活性を有する任意の酵素を含む。このような酵素は、レトロウイルス逆転写酵 素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザ イクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリ メラーゼ(Salki,R.K．ら、Science 239:487-491(1988)；米国特許第4,889,818号 および同第4,965,188号）、Tne DNAポリメラーゼ(WO 96/10640)、Tma DNAポリメ ラーゼ（米国特許第5,354,553号）、およびその変異体、フラグメント、改変体 、または誘導体を含むが、それらに限定されない（例えば、共同所有の、同時係 属中の米国特許出願第08/706,702号および同第08/706,706号を参照のこと、両出 願は1996年９月９日に出願され、それらの全体が本明細書中に参考として援用さ れる）。当業者により理解されるように、改変された逆転写酵素は、当該分野で 日常的なおよび周知の組換え技術または遺伝子工学技術により得られ得る。変異 体逆転写酵素は、例えば、目的の逆転写酵素をコードする遺伝子または遺伝子群 を位置指定変異誘発またはランダム変異誘発により変異することにより得られ得 る。このような変異は、点変異、欠失変異、および挿入変異を含み得る。好まし くは、１つ以上の点変異（例えば、１つ以上のアミノ酸の１つ以上の異なるアミ ノ酸での置換）は、本発明の変異体逆転写酵素を構築するために使用される。逆 転写酵素のフラグメントは、当該分野で日常的なおよび周知の組換え技術による 欠失変 異、または多数の周知のタンパク質分解酵素のいずれかを用いる目的の逆転写酵 素の酵素消化により得られ得る。 本発明における使用に好ましい酵素は、RNase H活性が低減されたか、または 実質的に低減された酵素を含む。RNase H活性が低減されたか、または実質的に 低減されたこのような酵素は、目的の逆転写酵素内のRNase Hドメインを、好ま しくは、上記のような１つ以上の点変異、１つ以上の欠失変異、および／または １つ以上の挿入変異により変異することにより得られ得る。「RNase H活性が実 質的に低減された」酵素は、対応する野生型またはRNase H酵素（例えば、野生 型モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)、また はラウス肉腫ウイルス(RSV)逆転写酵素）のRNase H活性の、約30％未満、約25％ 未満、20％未満、より好ましくは約15％未満、約10％未満、約7.5％未満、また は約５％未満、そして最も好ましくは約５％未満または約２％未満を有する酵素 を意味する。任意の酵素のRNase H活性は、例えば、米国特許第5,244,797号、Ko tewicz,M.L．ら、Nucl.Acids Res.16:265(1988)、Gerard,G.F.ら、FOCUS 14(5): 91(1992)、および米国特許第5,668,005号（これらの全ての開示は、完全に本明 細書中に参考として援用される）に記載されるアッセイのような種々のアッセイ により決定され得る。 本発明における使用に特に好ましい酵素は、M-MLV H-逆転写酵素、RSV H-逆転 写酵素、AMV H-逆転写酵素、RAV H-逆転写酵素、MAV H-逆転写酵素、およびHIV H-逆転写酵素を含むが、それらに限定されない。しかし、RNase H活性が実質的 に低減された、リボ核酸分子からDNA分子を生成し得る（すなわち、逆転写酵素 活性を有する）任意の酵素は、本発明の組成物、方法、およびキットにおいて等 しく使用され得ることが当業者により理解される。 本発明において使用される酵素は、鋳型核酸に関して別個の逆転写中断部位を 有し得る。２つの酵素が別個の逆転写中断部位を有するか否かは、種々のアッセ イ(例えば、２つの酵素により生成されるDNA分子の鎖長の電気泳動分析(Weaver, D.T.およびDePamphilis,M.L.,J.Biol.Chem.257(4):2075-2086(1982)；Abbots,J. ら、J.Biol.Chem.268(14):10312-10323(1993))を含む)により、または当業者に よく知られている他のアッセイにより決定され得る。上記のように、これらの 別個の転写中断部位は、ホモポリマーストレッチでしばしば生じる、核酸鋳型に おける２次構造障壁（barrier）および配列障壁を示し得る。従って、例えば、 第２の酵素は、点（ここまで第１の酵素が鋳型核酸を逆転写する）に近位または 遠位（すなわち、3'または5'）の、鋳型核酸上の点（例えば、ヘアピン）まで逆 転写し得る。別個の逆転写中断部位を有する２つ以上の酵素のこの組み合わせは 、２次構造障壁および配列障壁が克服され得るので、完全長cDNA分子の生成を容 易にする。さらに、本発明の上昇した温度の逆転写または高温逆転写はまた、核 酸合成間の２次構造障壁および配列障壁の克服において助け得る。従って、上昇 した温度の合成または高温合成は、完全長cDNA合成を容易にするために、２つ以 上の逆転写酵素を組み合せて（好ましくは、AMV RT、RSV RT、または他のASLV R Tを用いて）使用され得る。 種々のDNAポリメラーゼは、本発明に従って有用である。このようなポリメラ ーゼは、Thermus thermophilus(Tth)DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus(Taq) DNAポリメラーゼ、Thermotoga neapolitana(Tne)DNAポリメラーゼ、Thermotoga maritima(Tma)DNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(TliまたはVENTTM)DNA ポリメラーゼ、Pyrococcus furiosis(Pfu)DNAポリメラーゼ、DEEPVENTTM DNAポ リメラーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)DNAポリメラーゼ、Bacillus sterothermop hilus(Bst)DNAポリメラーゼ、Bacillus caldophilus(Bca)DNAポリメラーゼ、Sul folobus acidocaldarius(Sac)DNAポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum(Tac )DNAポリメラーゼ、Thermus flavus(Tfl/Tub)DNAポリメラーゼ、Thermus ruber( Tru)DNAポリメラーゼ、Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNAポリメラーゼ、Meth anobacterium thermoautotrophicum(Mth)DNAポリメラーゼ、Mycobacterium spp. DNAポリメラーゼ(Mtb,Mlep)、ならびにその変異体、改変体、および誘導体を含 むが、それらに限定されない。 本発明に従って使用されるDNAポリメラーゼは、代表的に5'から3'方向で、核 酸鋳型からDNA分子を合成し得る任意の酵素であり得る。このようなポリメラー ゼは、中熱菌性または高熱菌性であり得るが、好ましくは高熱菌性である。中熱 菌ポリメラーゼは、T5 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、クレノウフラグ メントDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIIIなどを含む。好ましいDNAポリメラ ー ゼは、耐熱性DNAポリメラーゼ（例えば、Taq、Tne、Tma、Pfu、VENTTM、DEEPVEN TTM、Tth、ならびにその変異体、改変体、および誘導体(米国特許第5,436,149号 ；米国特許第5,512,462号；WO 92/06188；WO 92/06200；WO 96/10640；Barnes， W.M.,Gene 112:29-35(1992)；Lawyer,F.C.ら、PCR Meth.Appl.2:275-287(1993) ；Flaman,J.-M.ら、Nucl.Acids Res.22(15):3259-3260(1994))である。長い核酸 分子（例えば、長さが約３〜５Kbより長い核酸分子）の増幅のために、代表的に は、少なくとも２つのDNAポリメラーゼ（一方は3'エキソヌクレアーゼ活性を実 質的に欠き、そして他方は3'エキソヌクレアーゼ活性を有する）が使用される。 米国特許第5,436,149号；米国特許第5,512,462号；Barnes,W.M.,Gene 112:29-35 (1992)；および1997年２月14日に出願された、共同所有の同時係属中の米国特許 出願第08/801,720号（これらの全ての開示は、それらの全体が本明細書中に援用 される）を参照のこと。3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くDNAポリメラ ーゼの例は、Taq、Tne(exo-)、Tma、Pfu(exo-)、Pwo、およびTth DNAポリメラー ゼ、ならびにその変異体、改変体、および誘導体を含むが、それらに限定されな い。3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの限定しない例は、Pfu /DEEPVENTTMおよびTli/VENTTM、ならびにその変異体、改変体、および誘導体を 含む。 本発明における使用のための逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、例えば 、Life Technologies,Inc.(Rockville,Maryland)、Pharmacia(Piscataway,New J ersey)、Sigma(Saint Louis,Missouri)、またはBoehringer Mannheim Biochemic als(Indianapolis，Indiana)から商業的に得られ得る。あるいは、逆転写酵素活 性を有するポリペプチドは、当業者に周知である天然タンパク質を単離および精 製するための標準的な手順に従って、それらの天然ウイルスまたは細菌供給源か ら単離され得る（例えば、Houts,G.E.ら、J.Virol.29:517(1979)を参照のこと） 。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者によく知られている 組換えDNA技術により調製され得る（例えば、Kotewicz,M.L.ら、Nucl.Acids Res .16:265(1988)；Soltis,D.A.およびSkalka,A.M.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85:337 2-3376(1988)を参照のこと）。 本発明における使用のためのDNAポリメラーゼは、例えば、Life Technologies , Inc.(Rockville,Maryland)、Perkin-Elmer(Branchburg,New Jersey)、New Engla nd BioLabs(Beverly,Massachusetts)、またはBoehringer Mannheim Biochemical s(Indianapolis,Indiana)から商業的に得られ得る。 酵素組成物の処方 本発明の組成物を形成するために、好ましくは、２つ以上の逆転写酵素が緩衝 化塩溶液中に混合される。本発明の組成物を作製するために、必要に応じて、１ つ以上のDNAポリメラーゼおよび／または１つ以上のヌクレオチドが添加され得 る。より好ましくは、酵素は、安定な緩衝化塩溶液中に作用濃度で提供される。 本明細書中で使用する用語「安定な」および「安定性」は、一般的に、酵素また は酵素を含む組成物が、約４℃の温度で約１週間、約-20℃の温度で約２〜６ヶ 月、および約-80℃の温度で約６ヶ月以上貯蔵された後の、最初の酵素活性（ユ ニット）の少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なく とも90％の組成物（例えば、酵素組成物）による保持を意味する。本明細書中で 使用する用語「作用濃度」は、特定の機能（例えば、核酸の逆転写）を行うため に溶液に使用される最適濃度の、または最適濃度に近い酵素濃度を意味する。 本発明の組成物の形成に使用される水は、好ましくは、蒸留され、脱イオンさ れ、そして（0.1〜0.2マイクロメーターフィルターに通して）濾過滅菌されてお り、そしてDNアーゼおよびRNase酵素による汚染物を含まない。このような水は 、例えば、Sima Chemical Company(Saint Louis,Missouri)から市販されている か、または当業者に周知の方法に従って必要とされるように作製され得る。 酵素成分に加えて、本発明の組成物は、好ましくは、１つ以上の緩衝液および 核酸分子（例えば、cDNA分子）の合成に必要な補因子を含む。本発明の組成物の 形成における使用に特に好ましい緩衝液は、Tris-(ヒドロキシメチル)アミノメ 使用され得る。緩衝液塩に加えて、補因子塩（例えば、カリウム塩（好ましくは 、塩化カリウムまたは酢酸カリウム）およびマグネシウム塩（好ましくは、塩化 マグネシウムまたは酢酸マグネシウム））が組成物に含まれる。組成物および／ ま たは合成反応混合物への１つ以上の炭水化物および／または糖の添加はまた、保 管の際の組成物および／または反応混合物の増強した安定性を支持するために有 利であり得る。本発明の組成物および／または合成反応混合物中の含有に好まし いこのような炭水化物または糖は、スクロース、トレハロースなどを含むが、こ れらに限定されない。さらに、このような炭水化物および／または糖は、本発明 の酵素組成物およびキットの生成において使用される酵素の貯蔵緩衝液に添加さ れ得る。このような炭水化物および／または糖は、多数の供給源（Sigma(St．Lo uis,MO)を含む）から市販されている。 最初に、緩衝液塩、補因子塩、および炭水化物または糖を作用濃度で水に溶解 し、そして酵素添加前に溶液のpHを調節することがしばしば好ましい。この方法 において、pH感受性酵素は、本発明の組成物の処方間の酸またはアルカリ媒介不 活化を受け難くい。 緩衝化塩溶液を処方するために、緩衝化塩（好ましくは、Tris(ヒドロキシメ 50ミリモル、好ましくは10〜60ミリモル、そして最も好ましくは約20〜60ミリモ の溶液に、マグネシウム塩（好ましくは、その塩化物または酢酸塩のいずれか） は、１〜10ミリモル、好ましくは1.5〜8.0ミリモル、そして最も好ましくは約３ 〜7.5ミリモルのその作用濃度を提供するために添加され得る。カリウム塩（好 ましくは、カリウムの塩化物または酢酸塩）もまた、10〜100ミリモル、最も好 ましくは約75ミリモルの作用濃度で溶液に添加され得る。還元剤（例えば、ジチ オスレイトール）は、好ましくは約１〜100mMの最終濃度、より好ましくは５〜5 0mMまたは約7.5〜20mMの濃度、そして最も好ましくは約10mMの濃度で溶液に添加 され得る。本発明の組成物中の含有に好ましい炭水化物および／または糖の濃度 は、約５％(w/v)〜約30％(w/v)、約7.5％(w/v)〜約25％(w/v)、約10％(w/v)〜約 25％(w/v)、約10％(w/v)〜約20％(w/v)、好ましくは、約10％(w/v)〜約15％(w/v )の範囲である。少量のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)塩（例えば、EDTA二ナト リウム）もまた添加され得るが（好ましくは、約0.1ミリモル）、EDTAの含有は 、本発明の組成物の機能または安定性に必須ではないようである。全ての緩衝液 お よび塩の添加後、この緩衝化塩溶液は、全ての塩が溶解されるまで十分に混合さ れ、そしてpHは、当該分野で公知の方法を用いて、7.4〜9.2、好ましくは8.0〜9 .0、そして最も好ましくは約8.4のpH値に調節される。 本発明の組成物を生成するために、これらの緩衝化塩溶液に、酵素（逆転写酵 素および／またはDNAポリメラーゼ）が添加される。M-MLV RTは、溶液中に、好 ましくは、１ミリリットルあたり約1,000〜約50,000ユニット、１ミリリットル あたり約2,000〜約30,000ユニット、１ミリリットルあたり約2,500〜約25,000ユ ニット、１ミリリットルあたり約3,000〜約22,500ユニット、１ミリリットルあ たり約4,000〜約20,000ユニットの作用濃度で、最も好ましくは、１ミリリット ルあたり約5,000〜約20,000ユニットの作用濃度で添加される。AMV RT、MAV RT 、RSV RT、およびRAV RT（上記の本発明のRTを含む）は、好ましくは、溶液中に 、１ミリリットルあたり約100〜約5000ユニット、１ミリリットルあたり約125〜 約4000ユニット、１ミリリットルあたり約150〜約3000ユニット、１ミリリット ルあたり約200〜約2500ユニット、１ミリリットルあたり約225〜約2000ユニット の作用濃度で、最も好ましくは、１ミリリットルあたり約250〜約1000ユニット の作用濃度で添加される。高熱菌DNAポリメラーゼ群における酵素（Taq、Tne、T ma、Pfu、VENTTM、DEEPVENTTM、Tth、ならびにその変異体、改変体、および誘導 体）は、好ましくは、溶液中に、１ミリリットルあたり約100〜約1000ユニット 、１ミリリットルあたり約125〜約750ユニット、１ミリリットルあたり約150〜 約700ユニット、１ミリリットルあたり約200〜約650ユニット、１ミリリットル あたり約225〜約550ユニットの作用濃度で、最も好ましくは、１ミリリットルあ たり約250〜約500ユニットの作用濃度で添加される。酵素は、任意の順番で溶液 に添加され得るか、または同時に添加され得る。 本発明の組成物は、さらに、１つ以上のヌクレオチド（好ましくは、デオキシ ヌクレオシド３リン酸(dNTP)またはジデオキシヌクレオシド３リン酸(ddNTP)で ある）を含み得る。本発明の組成物のdNTP成分は、新たに合成される核酸の「建 築ブロック(building block)」として働き、ポリメラーゼの作用により核酸に取 り込まれ、そしてddNTPは、本発明に従う配列決定法において使用され得る。本 発明の組成物における使用に適切なヌクレオチドの例は、dUTP、dATP、dTTP、dC TP、dGTP、dITP、7-デアザ-dGTP、α-チオ-dATP、α-チオ-dTTP、α-チオ-dGTP 、α-チオ-dCTP、ddUTP、ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddITP、7-デアザ-ddGTP 、α-チオ-ddATP、α-チオ-ddTTP、α-チオ-ddGTP、α-チオ-ddCTP、またはそれ らの誘導体を含むが、それらに限定されず、これらの全ては、Life Technologie s,Inc.(Rockville,Maryland)、New England BioLabs(Beverly,Massachusetts)、 およびSigma Chemical Company(Saint Louis,Missouri)を含む供給源から市販さ れる。ヌクレオチドは非標識であり得るか、またはヌクレオチドは、当該分野で 公知の方法により、ヌクレオチドを放射性同位体（例えば、3H、14C、32P、また は35S）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン 、ローダミン、テキサスレッド、またはフィコエリトリン）、化学発光標識（例 えば、Life Technologies,Inc.(Rockville,Maryland)から市販される、PHOTO-GE NETMまたはACESTM化学発光系を用いる）、ジゴキシゲニンなどとカップリングす ることにより検出可能に標識され得る。標識ヌタレオチドはまた、例えば、Life Technologies，Inc.(Rockville,Maryland)またはSigma Chemical Company(Sain t Louis,Missouri)から商業的に得られ得る。本発明の組成物において、ヌクレ オチドは、約10〜4000マイクロモーラー、約50〜2000マイクロモーラー、約100 〜1500マイクロモーラー、または約200〜1200マイクロモーラーの、最も好まし くは、約1000マイクロモーラーの各ヌクレオチドの作用濃度を生じるように添加 される。 成分劣化を低減するために、試薬組成物の保管は、好ましくは、約４℃で１日 まで、または最も好ましくは、-20℃で１年までである。 別の局面において、本発明の組成物および逆転写酵素は、１つ以上の炭水化物 、糖、または合成ポリマーの存在下で乾燥形態で調製および貯蔵され得る。乾燥 した組成物または逆転写酵素の調製に好ましい炭水化物、糖、またはポリマーは 、スクロース、トレハロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、またはそれらの 組み合わせを含むが、それらに限定されない。例えば、米国特許第5,098,893号 、同第4,891,319号、および同第5,556,771号（これらの開示は、本明細書中に参 考として全てが援用される）を参照のこと。このような乾燥組成物および酵素は 、本発明の酵素または組成物の成分の有意な劣化なく、種々の温度で長期の間、 貯蔵され得る。好ましくは、乾燥した逆転写酵素または組成物は、４℃または-2 0℃で保管される。 cDNA分子の生成 核酸分子の供給源 本発明に従って、cDNA分子（１本鎖または２本鎖）は、種々の核酸鋳型分子か ら調製され得る。本発明における使用に好ましい核酸分子は、１本鎖または２本 鎖のDNAおよびRNA分子、ならびに２本鎖DNA:RNAハイブリッドを含む。より好ま しい核酸分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、および リボソームRNA(rRNA)分子を含むが、mRNA分子は、本発明に従う好ましい鋳型で ある。 本発明の方法に従ってcDNA分子を調製するために使用される核酸分子は、当業 者によく知られている標準的な有機化学合成法に従って合成的に調製され得る。 より好ましくは、核酸分子は、天然供給源（例えば、種々の細胞、組織、器官、 または生物）から得られ得る。核酸分子の供給源として使用され得る細胞は、原 核生物（細菌細胞（Escherichia、Bacillus、Serratia、Salmonella、Staphyloc occus、Streptococcus、Clostridium、Chlamydia、Neisseria、Treponema、Myco plasma、Borrelia、Legionella、Pseudomonas、Mycobacterium、Helicobacter、 Erwinia、Agrobacterium、Rhizobium、Xanthomonas、およびStreptomyces属の種 の細胞を含むが、それらに限定されない））、または真核生物（菌類（特に、酵 母）、植物、原生生物および他の寄生生物、ならびに動物（昆虫（特に、ショウ ジヨウバエspp.細胞）、線虫（特に、Caenorhabditis elegans細胞）、および哺 乳動物（特に、ヒト細胞））を含む）であり得る。 核酸供給源として使用され得る哺乳動物体細胞は、血液細胞（網状赤血球およ び白血球）、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン細胞（中枢神経系または末梢神経 系に由来する）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋に由来する筋細胞およ び筋原細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽 細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の支質細胞（例えば、マク ロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）を含む。哺乳動物生殖細胞（精母細胞お よび卵母細胞）はまた、本発明における使用のための核酸供給源として使用され 得、同様に、上記の体細胞および生殖細胞を生じさせる先祖(progenitor)、前駆 体、および幹細胞が使用され得る。哺乳動物組織または器官（例えば、脳、腎臓 、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、泌尿生殖器組織、循環組織、リ ンパ組織、胃腸組織、および結合組織の供給源に由来するもの、ならびに哺乳動 物（ヒトを含む）胚または胎児に由来するもの）もまた、核酸供給源としての使 用に適切である。 上記の原核生物または真核生物の細胞、組織、および器官のいずれもが、正常 であり、疾患性であり、形質転換され、樹立され、先祖であり、前駆体であり、 胎児性であり、または胚性であり得る。疾患細胞は、例えば、感染疾患（細菌、 菌類もしくは酵母、ウイルス（AIDS、HIV、HTLV、ヘルペス、肝炎などを含む） 、または寄生生物により引き起こされる）、遺伝的または生化学的病理（例えば 、嚢胞性線維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくは多発 性硬化症）、あるいはガンプロセスに関与する疾患細胞を含む。形質転換または 樹立された動物細胞株は、例えば、COS細胞、CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeL a細胞、HepG2細胞、K562細胞、293細胞、L929細胞、F9細胞などを含み得る。本 発明における使用のための核酸の供給源として適切な他の細胞、細胞株、組織、 器官、および生物は、当業者に明らかである。 一旦、出発細胞、組織、器官または他のサンプルが得られると、核酸分子（例 えば、mRNA）は、当該分野で周知の方法によりそれらから単離され得る（例えば 、Maniatis,Tら、Cell 15:687-701(1978)；Okayama,H.およびBerg,P.,Mol.Cell. Biol.2161-170(1982)；Gubler,U.およびHoffman,B.J.,Gene 25:263-269(1983)を 参照のこと）。次いで、このように単離された核酸分子は、本発明に従うcDNA分 子およびcDNAライブラリーを調製するために使用され得る。 本発明の実施において、cDNA分子またはcDNAライブラリーは、上記のように得 られた１つ以上の核酸分子（好ましくは、１つ以上のmRNA分子（例えば、mRNA分 子の集団））を、逆転写酵素活性を有する２つ以上のポリペプチド、あるいは１ つ以上の本発明の組成物、あるいは１つ以上の本発明のRSV RTおよび／またはAM V RTおよび／または他のASLV RTと、cDNA分子（１本鎖または２本鎖）を形成す る酵素または組成物の作用による核酸分子逆転写に有利な条件下で混合すること により生成される。従って、本発明の方法は以下を含む、（ａ）１つ以上の核酸 鋳型（好ましくは、１つ以上のRNAまたはmRNA鋳型（例えば、mRNA分子の集団） ）を、１つ以上の本発明の逆転写酵素と混合する工程；および（ｂ）１つ以上の 鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子を作製するのに十分な条件 下で混合物をインキュベートする工程を含む。このような方法は、１つ以上のDN Aポリメラーゼの使用を含み得る。本発明は、cDNA合成法（例えば、以下の実施 例に記載される方法）、またはcDNA分子もしくはライブラリーを生成するための 当該分野で周知の他の方法（例えば、Gubler,U.およびHoffman,B.J.,Gene 25:26 3-269(1983)；Krug,M.S.およびBerger,S.L.,Meth.Enzymol.152:316-325(1987)； Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,8.60〜8.63頁(1989)を参照の こと）と共に使用され得る。 本発明はまた、特に、上昇した温度での核酸分子逆転写のための方法に関する 。実施例５により詳細に記載されるように、一般的に、レトロウイルスRTは、こ れらの中温菌酵素の限定された熱安定性のため、核酸テンプレート（例えば、RN A分子）をコピーするために37℃〜42℃より上の温度で使用されない。しかし、 これらの温度で、mRNAの二次構造は逆転写を妨げ得（Gerard,G.F.ら、FOCUS 11: 60(1989)；Myers,T.W.およびGelfand,D.H.,Biochem.30:7661(1991)）、そしてプ ライマー結合特異性は、遺伝子特異的逆転写プロセス（例えば、RT-PCR）の間に 低減され、高いバックグラウンドシグナルを引き起こし得る（Myers,T.W.および Gelfand,D.H.,Biochem.30:7661(1991)；Freeman,W.N.ら、BioTechniques 20:782 (1996)）。従って、これらの問題を克服するのを助けるために、本発明は、より 上昇した温度での（すなわち、50℃より上の）RNA逆転写の方法を提供する。 従って、本発明は、核酸分子逆転写のための方法に関し、この方法は、（ａ） 核酸テンプレートを、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドと混合す る工程；および（ｂ）約50℃以上の温度で、および核酸テンプレートの全てまた は一部に相補的な第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で混合物をインキ ュベートする工程を含む。これらの方法に従ってコピーされ得る核酸テンプレー トは、RNA分子（例えば、mRNA分子またはポリA+RNA分子）およびDNA分子（例え ば、１本鎖または２本鎖DNA分子）を含むが、それらに限定されない。本発明に よれば、これらの方法により生成される第１の核酸分子は、完全長cDNA分子であ り得る。約50℃以上の任意のインキュベーション温度が本発明の方法において使 用され得るが、一方、特に好ましいインキュベーション温度は、約51℃以上、約 52℃以上、約53℃以上、約54℃以上、約55℃以上、約56℃以上、約57℃以上、約 58℃以上、約59℃以上、約60℃以上、約61℃以上、約62℃以上、約63℃以上、約 64℃以上、約65℃以上、約66℃以上、約67℃以上、約68℃以上、約69℃以上、ま たは約70℃以上の温度を含むが、それらに限定されない。他のこのような方法に おいて、インキュベーション温度は、ある範囲のインキュベーション温度（約50 ℃〜約70℃、約51℃〜約70℃、約52℃〜約70℃、約53℃〜約70℃、約54℃〜約70 ℃、約55℃〜約70℃、約55℃〜約69℃、約55℃〜約68℃、約55℃〜約67℃、約55 ℃〜約66℃、約55℃〜約65℃、約56℃〜約65℃、約56℃〜約64℃、または約56℃ 〜約62℃を含むが、それらに限定されない）にわたり得る。本発明はまた、第１ の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を作製するのに十分な条 件下で、第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに含む、このような方 法に関する。本発明によれば、これらの方法により生成される第１および第２の 核酸分子はDNA分子であり得、そして完全長cDNA分子であり得る２本鎖DNA分子を 形成し得る。上記の方法について記載されたように、これらの高温方法において 使用される、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドは、好ましくは、 RNaseH活性が低減されたか、または実質的に低減されており、そして１つ以上の AMV逆転写酵素またはそのサブユニット（またはその誘導体、改変体、フラグメ ント、もしくは変異体）、および１つ以上のRSV逆転写酵素またはそのサブユニ ット（またはその誘導体、改変体、フラグメント、もしくは変異体）、あるいは 他のASLV RTまたはそのサブユニット（またはその誘導体、改変体、フラグメン ト、もしくは変異体）からなる群より選択され得る。特に好ましいAMV RTおよび RSV RTおよび他のASLV RTは、本発明により提供され、そして上記で詳細に記載 されたものを含む。遺伝子型AMV αH-/βH+RTまたはRSV αH-/βH+RTを有するAM V RTおよびRSV RTは、より特に好ましい。このような構築物は、好ましくは、RN aseH活性を低減するか、または実質的に低減するように、αサブユニットをコ ードする遺伝子を変異または改変することにより作製されるが、一方、βサブユ ニットをコードする遺伝子は、そのように変異または改変されない。（同時発現 により生成される）得られるポリペプチドは、RNaseH活性が低減されるか、また は実質的に低減される。 本発明を有利に使用し得るcDNA合成の他の方法は、当業者に容易に明らかであ る。 本発明の方法に従ってcDNA分子またはライブラリーを得たなら、これらのcDNA は、さらなる分析または操作のために単離され得る。cDNA精製のための詳細な方 法論は、GENETRAPPERTMマニュアル(Life Technologies,Inc.；Rockville,Maryla nd)（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）において教示さ れるが、cDNA単離の代替の標準的技術（例えば、以下の実施例に記載される技術 または当該分野で公知の他の技術（例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Lab oratory Press,8.60〜8.63頁(1989)を参照のこと））もまた使用され得る。 本発明の他の局面において、本発明は、核酸分子を増幅および配列決定するた めの方法において使用され得る。本発明のこの局面に従う核酸増幅方法は、１段 階（例えば、１段階RT-PCR）または２段階（例えば、２段階RT-PCR）反応であり 得る。本発明によれば、１段階RT-PCR型反応は、１つのチューブ内で達成され得 、それにより汚染の可能性を低くする。このような１段階反応は、（ａ）核酸鋳 型（例えば、mRNA）を、逆転写酵素活性を有する２つ以上のポリペプチドおよび １つ以上のDNAポリメラーゼと混合する工程；および（ｂ）鋳型の全てまたは一 部に相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で混合物をインキュベートす る工程を含む。あるいは、増幅は、鋳型を、逆転写酵素活性を有する（必要に応 じて、DNAポリメラーゼ活性を有する）２つ以上のポリペプチドと混合すること により達成され得る。このような反応混合物を適切な条件下でインキュベートす ることは、鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子の増幅を可能にする。この ような増幅は、逆転写酵素活性単独により、またはDNAポリメラーゼ活性と組み 合せて達成され得る。２段階RT-PCR反応は、２つの別々の段階において達成され 得る。このような方法は、（ａ）核酸鋳型（例えば、mRNA）を、２つ以上の逆転 写 酵素活性と混台する工程、（ｂ）鋳型の全てまたは一部に相補的な核酸分子（例 えば、DNA分子）を作製するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする工 程、（ｃ）核酸分子を１つ以上のDNAポリメラーゼと混合する工程、および（ｄ ）工程（ｃ）の混合物を、核酸分子を増幅するのに十分な条件下でインキュベー トする工程を含む。長い核酸分子（すなわち、長さが約３〜５Kbより長い）の増 幅のために、DNAポリメラーゼの組み合わせが使用され得る（例えば、１つのDNA ポリメラーゼは3'エキソヌクレアーゼ活性を有し、そして別のDNAポリメラーゼ は3'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低減されている）。代替の２段階手順は 、逆転写酵素およびDNAポリメラーゼの別々の添加よりもむしろ、逆転写酵素活 性およびDNAポリメラーゼ活性を有する２つ以上のポリペプチド（例えば、Tth、 Tma、またはTne DNAポリメラーゼなど）の使用を含む。 本発明のこの局面に従う核酸配列決定方法は、サイクル配列決定反応（増幅と 組み合せて配列決定する）および標準的な配列決定反応の両方を含み得る。従っ て、本発明の配列決定方法は、（ａ）配列決定される核酸分子を、１つ以上のプ ライマー、２つ以上の逆転写酵素、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の 終結剤と混合する工程、（ｂ）混合物を、配列決定される分子の全てまたは一部 に相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で混合物をインキュベー トする工程、および（ｃ）集団を分離して、配列決定される分子の全てまたは一 部のヌクレオチド配列を決定する工程を含む。本発明によれば、１つ以上のDNA ポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性DNAポリメラーゼ）は、逆転写酵素と組み合 せて、または逆転写酵素とは別に使用され得る。 本発明に従って使用され得る増幅方法は、PCR（米国特許第4,683,195号および 同第4,683,202号）、鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification)(SDA；米 国特許第5,455,166号；EP 0 684315)、ならびに核酸配列に基づく増幅(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)(NASBA；米国特許第5,409,818号；EP 0 32 9 822)を含む。本発明の組成物を使用し得る核酸配列決定技術は、ジデオキシ配 列決定法（例えば、米国特許第4,962,022号および同第5,498,523号に開示される 方法）、ならびにより複雑なPCRに基づく核酸フィンガープリンティング技術（ 例えば、ランダム増幅多型DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)(RFPD)分 析(Williams,J.G.K.ら、Nucl.Acids Res.18(22):6531-6535,1990)、任意プライ ムPCR(Arbitrarily Primed PCR)(AP-PCR；Welsh,J.およびMcClelland,M.,Nucl.A cids Res.18(24):7213-7218,1990)、DNA増幅フィンガープリンティング(DAF；Ca etano-Anollesら、Bio/Technology 9:553-557，1991)、マイクロサテライトPCR またはミニサテライト領域DNAの指定増幅(Directed Amplfication of Minisatel lite-region DNA)(DAMD；Health,D.D.ら、Nucl.Acids Res.21(24):5782-5785,19 93)、および増幅フラグメント長多型(AFLP)分析(EP 0 534858；Vos,P.ら、Nucl. Acids Res.23(21):4407-4414,1995)；Lin,J.J.およびKuo,J.,FOCUS 17(2):66-70 ,1995）を含む。特に好ましい局面において、本発明は、１つ以上のポリメラー ゼ連鎖反応(PCR)（例えば、上記のPCRに基づく方法のいずれか）を含む、核酸分 子を増幅または配列決定するための方法において使用され得る。 キット 別の実施態様において、本発明は、核酸分子の逆転写もしくは増幅における使 用のためのキットに、または核酸分子の配列決定における使用のためのキットに まとめられ得る。本発明のこの局面に従うキットは、運搬手段（例えば、箱、ボ ール箱、チューブなど）（その中に密に閉じ込めた１つ以上の容器手段（例えば 、バイアル、チューブ、アンプル、瓶など）を有する）を含み、ここで第１の容 器手段は、逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドを含む。これらの逆 転写酵素活性を有するポリペプチドは、２つ以上のポリペプチドの混合物として 単一容器中にあり得るか、または別々の容器中にあり得る。本発明のキットはま た、１つ以上のDNAポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つ以上のヌクレオチド、お よび／または１つ以上のプライマーを（同じまたは別々の容器中に）含み得る。 本発明の特定の局面において、逆転写および増幅キットは、１つ以上の、好ま しくは２つ以上の本発明の逆転写酵素活性を有するポリペプチド、１つ以上の核 酸分子合成に必要とされるヌクレオチド、および／またはプライマー（例えば、 逆転写についてはオリゴ(dT)）を含む、１つ以上の成分を（混合物中でまたは別 々に）含み得る。このような逆転写および増幅キットは、さらに、１つ以上のDN Aポリメラーゼを含み得る。本発明の配列決定キットは、１つ以上の、好まし くは２つ以上の本発明の逆転写酵素活性を有するポリペプチド、および必要に応 じて１つ以上のDNAポリメラーゼ、１つ以上の核酸分子配列決定に必要とされる 終結剤（例えば、ジデオキシヌクレオシド三リン酸分子）、１つ以上のヌクレオ チド、および／または１つ以上のプライマーを含み得る。好ましい逆転写酵素活 性を有するポリペプチド、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、なら びに本発明の逆転写、増幅、および配列決定キットにおける使用に適切な他の成 分は、上記のものを含む。本発明のこの局面により含まれるキットは、さらに、 標準的な核酸逆転写、増幅、または配列決定プロトコルを行うために必要な、さ らなる試薬および化合物を含み得る。このような本発明の逆転写酵素活性を有す るポリペプチド、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、およびさらな る試薬、成分、または化合物は、１つ以上の容器に含まれ得、そして２つ以上の 上記の成分の混合物でこのような容器に含まれ得るか、または本発明のキットに おいて別々の容器に含まれ得る。 核酸分子の使用 本発明の方法により調製される核酸分子またはcDNAライブラリーは、例えば、 クローニングおよび配列決定（すなわち、核酸分子のヌクレオチド配列を決定す ること）により、本発明の配列決定方法により、または当該分野で標準的な他の 方法（例えば、米国特許第4,962,022号および同第5,498,523号（これらはDNA配 列決定方法を指向する）を参照のこと）によりさらに特徴付けられ得る。あるい は、これらの核酸分子は、産業プロセスにおける種々の材料（例えば、当該分野 で周知の方法によるハイブリダイゼーションプローブ）の製造のために使用され 得る。cDNAからのハイブリダイゼーションプローブの生成は、例えば、医学分野 の人が、患者の細胞または組織を、特定の遺伝子マーカー（例えば、ガンマーカ ー、感染疾患もしくは遺伝病マーカー、または胚発生マーカー）の存在について 調べる能力を提供する。さらに、このようなハイブリダイゼーションプローブは 、さらなる特徴付けのために、異なる細胞、組織、または生物から調製されたゲ ノムDNAまたはcDNAライブラリーからDNAフラグメントを単離するために使用され 得る。 本発明の核酸分子はまた、組換えDNA方法論における使用のための組成物を調 製するために使用され得る。従って、本発明は、本発明のcDNAまたは増幅核酸分 子を含む組換えベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、これら のベクターおよび宿主細胞を用いる組換えポリペプチド生成のための方法、なら びにこれらの方法を用いて生成される組換えポリペプチドに関する。 組換えベクターは、当該分野で周知の方法を用いて、本発明に従って調製され る１つ以上のcDNA分子または増幅核酸分子をベクターに挿入することにより、本 発明のこの局面に従って生成され得る。本発明のこの局面において使用されるベ クターは、例えば、ファージまたはファージミドであり得、そして好ましくは、 プラスミドである。目的のポリペプチドをコードする核酸にシス作用性制御領域 を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主により供給され るか、相補ベクターにより供給されるか、または宿主への導入の際にベクター自 体により供給され得る。 この点についての特定の好ましい実施態様において、ベクターは、特異的発現 を提供し（従って、「発現ベクター」と呼ばれる）、これは誘導性および／また は細胞型特異的であり得る。このようなベクターのうち、操作しやすい環境因子 （例えば、温度および栄養添加物）により誘導可能なベクターが特に好ましい。 本発明において有用な発現ベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルス に由来するベクター（例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来 するベクター、ならびにその組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミド およびファージミド））を含み、そして好ましくは、少なくとも１つの選択マー カー（例えば、細菌宿主細胞における培養のためのテトラサイクリンまたはアン ピシリン耐性遺伝子）を含む。このような発現ベクターへの挿入前に、本発明の cDNAまたは増幅核酸分子は、適切なプロモーター（例えば、ファージλPLプロモ ーター、E.coli lac、trp、およびtacプロモーター）に作動可能に連結されるべ きである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。 本発明における使用に好ましいベクターのうち、Qiagenから入手可能なpQE70 、pQE60およびpQE-9；Stratageneから入手可能なpBSベクター、Phagescriptベク ター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A；Invitrogenから 入 手可能なpcDNA3；Pharmaciaから入手可能なpGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pE T-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5；ならびにLife Technologies,Inc.か ら入手可能なpSPORT1、pSPORT2、およびpSV-SPORT1を含む。他の適切なベクター は、当業者に容易に明らかである。 本発明はまた、本発明のcDNA分子、増幅核酸分子、または組換えベクターを含 む組換え宿主細胞を生成する方法、ならびにこのような方法により生成される宿 主細胞を提供する。本発明に従って生成され得る代表的な宿主細胞（原核生物ま たは真核生物）は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞を含むが、 それらに限定されない。好ましい細菌宿主細胞は、Escherichia coli細胞（最も 詳細には、E.coli DHk0BおよびStb12株）（これらは市販されている(Life Techn ologles,Inc.Rockville,Maryland)）、Bacillus Subtilis細胞、Bacillus megat erium細胞、Streptomyces spp.細胞、Erwinia spp.細胞、Klebsiella spp.細胞 、およびSalmonella typhimurium細胞を含む。好ましい動物宿主細胞は、昆虫細 胞（最も詳細には、Spodoptera frugiperda Sf9およびSf21細胞、ならびにTrich oplusa High-Five細胞）、ならびに哺乳動物細胞（最も詳細には、CHO、COS、VE RO、BHK、およびヒト細胞）を含む。このような宿主細胞は、当業者によく知ら れている、周知の形質転換、エレクトロポレーション、またはトランスフェクシ ョン技術により調製され得る。 さらに、本発明は、組換えポリペプチドを生成するための方法、およびこれら の方法により生成されるポリペプチドを提供する。本発明のこの局面によれば、 組換えポリペプチドは、任意の上記の組換え宿主細胞を、組換え宿主細胞からの ポリペプチドの生成およびポリペプチドの単離に有利な条件下で培養することに より生成され得る。組換え宿主細胞の培養、ならびに組換え宿主細胞からのポリ ペプチドの生成および単離のための方法は、当業者に周知である。 本明細書に記載された方法および適用に対する他の適切な改変および適応が、 明らかであり、そして本発明またはその任意の実施態様の範囲を逸脱することな くなされ得ることは、関連分野の当業者に容易に明らかである。今や本発明を詳 細に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照してより明らかに理解される 。実施例は、例示の目的のためだけに本明細書に含まれ、そして本発明を制限す る ことを意図されない。 実施例１：RSV RNaseH-RTのクローニングおよび発現 一般的な方法 RSV H-RTは、レトロウイルスRTのクローニングされた形態であり、ここでαサ ブユニットおよびβサブユニットの両方は、RNaseH活性を排除するために単一の アミノ酸変化により変異されている。実質的に低減したRNaseH活性を示すRSV RT もまた、αサブユニットのみがRNaseH活性を実質的に低減するように変異された 場合に生成される（βサブユニットはRNaseHドメインにおいて変異されていない ）。変異およびプラスミド構築を、以下に記載のように改変される、標準的な分 子生物学方法（例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manu al,第２版,Cold Spring Harbor,NY:Laboratory Press(1989)を参照のこと）を用 いて行った。 プラスミド調製。1ml E.coli培養物からのプラスミド調製物を、アルカリ溶解 手順（Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold S pring Harbor,NY:Laboratory Press(1989)）により作製した。10ml培養物からの 調製物を、さらにフェノール-クロロホルムで処理し、エタノール沈殿し、そし て50μlのTris-EDTA(TE)緩衝液（20mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0）に再懸濁し た。バクミド(bacmid)調製物については、処理間のDNA剪断を避けるように気を 付けた（すなわち、ボルテックスなし；フェノール-クロロホルム抽出物を、振 盪するよりむしろ穏やかに回転させた；ゆっくりしたピペッティング）。 PCR。ポリメラーゼ連鎖反応を、Perkin-Elmer9600サーモサイクラーにおいて 行った。反応混合物（各50μl）は、50mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8.3)および5mM MgCl2からなる反応緩衝液中に、0.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、１μlの各オ リゴヌクレオチド、各50μlのdCTP、dGTP、dTTPおよびdATP、ならびに約100ngの 標的DNAを含んだ。他に示されなければ、各PCRのサイクル条件は、94℃５分、続 いて55℃15秒／72℃30秒／94℃15秒、次いで72℃１分の８サイクルであった。 ゲル電気泳動およびDNAフラグメント単離およびクローニング。DNAを、約0.3 μg/ml臭化エチジウムを含むTris-酢酸-EDTA緩衝液（Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor,NY:Laboratory Pres s(1989)）中でアガロースゲルにおいて約10V/cmで電気泳動した。フラグメント を紫外光を用いて視覚化し、そしてGlassMAX法（Simms,Dら、Focus 13:99(1991) ）によりゲルスライスから単離した。DNA連結反応を、標準的な条件（King,P.W. およびBlakesley,R.W.,Focus 8:1(1986)）下でT4 DNAリガーゼを用いて行い、そ してE.coli DH10B細胞を、CaCl2法（Lorow,D.およびJessee,J.,Focus 12:19(199 0)）の改変により形質転換した。 昆虫細胞培養およびバキュロウイルス生成。５×105細胞/mlのSf21昆虫細胞サ ンプル（１ml）を、公開された手順（Anderson,D.ら、Focus 16:53(1995)）に従 って、0.2ml SF900-II無血清昆虫細胞培養培地（Life Technologies,Inc.；Rock ville,Maryland；Godwin,G.およびWhitford,W.,Focus 15:44(1993)を参照のこと ）中の１μgのバクミドDNAおよび８μlのCellfectinの混合物でトランスフェク トした。増殖(growth)および増殖(propagatlion)のために、Sf9およびSf21昆虫 細胞を、100rpm（600ml培養について）または130rpm（他の全ての培養について ）の振盪インキュベーターにおいて、27℃でSF900-II培地中で継代した。培養物 が増殖間に４×106細胞/mlを超えるか、または希釈間に0.5×106細胞/mlを下回 ることを避けるように気を付けた。ウイルス集団を拡大するために、約１×106 細胞/mlのSf21細胞を、約２×106細胞/mlまでの増殖を可能にするが、４×106細 胞/ml以下の増殖を可能にするのに十分なウイルスストック（約0.2％(v/v)ウイ ルス／培養物）で感染させた。72時間後、培養物を遠心分離し（2,000rpm、10分 間）、そして上清をデカンテーションし、そして４℃で暗所で貯蔵した。タンパ ク質生成のための細胞感染のために、約1.5×106細胞/mlのSf21昆虫細胞を、増 殖なしまたは2.5×106細胞/ml未満の増殖を可能にするのに十分なウイルスで感 染させた。72時間後、培養物を、1,000rpmで５分間の遠心分離により採集し、そ して細胞を、500ml培養物あたり、15mlのPBS（0.2g/リットルKCl、0.2g/リット ルKH2PO4、８g/リットルNaCl、1.15g/リットルNa2HPO4、2.16g/リットルNa2HPO4 ・7H2O）中に再懸濁した。 RSV RTαおよびβサブユニットをコードする遺伝子のクローニングおよび 発現 RSV RTαサブユニットおよびβサブユニットの両方は、より大きなポリペプチ ド前駆体のタンパク質分解プロセシングにより生成される（Gerard,G.F.,Enzyme s of Nucleic Acid Synthesis and Modification,第１巻：DNA Enzymes,Jacob,S .T.編,Boca Raton,FL:CRC Press,1〜38頁(1983)）。タンパク質分解プロセシン グの必要条件を不必要にするために、RSV RTのコード配列を、そしてαサブユニ ットおよびβサブユニットの両方が、標準的な開始および停止翻訳シグナルを有 する遺伝子によりコードされるように変異誘発およびサブクローニングした。両 方の遺伝子をRNaseH領域において変異誘発したが、サブユニットの任意の組み合 せ（例えば、αRNaseH-/βRNaseH+；αRNaseH+/βRNaseH+；αRNaseH+/βRNaseH- ；αRNaseH-/βRNaseH-）の構築は、この同じ様式で達成され得る。RSVαRNase H-/βRNaseH+は、RNaseH活性が実質的に低減されることが発見された（野生型の 約５％）。アフィニティタグをコードする配列を、βサブユニットのカルボキシ 末端に付加した。 RSV RTβサブユニットのアミノ末端、カルボキシ末端および中央の変異誘発お よびサブクローニング。RSV RT遺伝子を、成熟RTポリペプチドをコードする配列 のアミノ末端にATGコドンおよびNdeI部位を付加するように変異誘発した。この 変異誘発を、pJD100標的（図１、７）（Wilkerson,V.W.ら、J.Virol.55:314-321 (1985)）および以下のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより達成した： PCRを行い、そしてPCR産物を上記のように精製し、そしてPCR産物を、UDGクロ ーニング（Buchman,G.W.ら、Focus 15:36(1993)）によりpAMP18にクローニング して、プラスミドpAMP18N（図１、８）を形成した。 アミノ末端の変異誘発およびクローニングの後、RSVβサブユニット遺伝子の カルボキシ末端を変異誘発し、そして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCR およびUDGクローニングによりpJD100からpAMP1（図１）ヘサブクローニングし た： これらのオリゴヌクレオチドを、「p4」領域がβp4ポリペプチドから切断され る部位でβ遺伝子中に翻訳停止コドンを導入し、そして遺伝子末端の後ろにXhoI 部位を付加するように設計した。PCR産物をゲル電気泳動により精製し、そしてU DGクローニングによりpAMP1へクローニングし、pAMP1C（図１、９）を形成した 。このカルボキシ末端はHisタグを有さず、Hisタグは最終構築物を形成するため に後に付加されたことに留意のこと。 RSV RTβサブユニットの中央領域を付加するために、RSV RTβサブユニットの 中央をコードする、pJD100に由来する2.3kb HpaI-KpnIフラグメント（図１）を 、pAMP18NのHpaI-KpnI部位にクローニングして、pAMP18NM（図１、10）を形成し た。RSV RTβサブユニットのカルボキシ末端を付加するために、βサブユニット 遺伝子のカルボキシ末端をコードする113bp KpnI-EcoRIフラグメントを、pAMP1C からpAMP18NMのKpnI-EcoRI部位にクローニングして、pAMP18B（図２、11）を形 成した。 RSV RTβサブユニット（これはRNaseH活性を含む）の構築後、この遺伝子を位 置指定変異誘発により変異誘発して、RNaseH活性が実質的に低減された（すなわ ち、「RNaseH-」)RSV RTβサブユニットをコードする構築物を生成した。全RT遺 伝子を含むpJD100由来３kb PstIフラグメント（図２）をM13mp19にクローニング して、M13RT（図２、12）を形成した。ウラシルを含む１本鎖DNAを、PstIフラグ メントを含むM13RTファージでの感染後、E.coli CJ236株（Bio-Rad；Hercules,C A；およびCathy Joyce,Yale University,New Haven,CT）から単離した。RNaseH 領域を変異し、そしてSstII部位を導入するために、以下のオリゴヌクレオチド を使用した： このオリゴヌクレオチドは、RT450位のアスパラギン酸残基の代わりにアラニン 残基の置換を誘導し、M13RTH-（図２、13）を形成した。RNaseH-RSV RTを作製す る代替アプローチにおいて、Glu484はグルタミンに変異され得、そして／または Asp505はアスパラギンに変異され得る。βサブユニットに変換してRNaseH+に戻 すために、野生型配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用され得る。 あるいは、実質的にRNaseH活性を低減するために、欠失または挿入がRNaseH領域 においてなされ得る。DNA配列決定を使用して、Asp450→Ala450変異を確認し、 そしてM13RTH-由来426bp BglII-BstEIIフラグメントを、pAMP18BのBglII-BstEII 部位にクローニングして、RNaseH領域を置換し、そしてpAMP18BH-（図２、14） を形成した。 RSV RTαサブユニットをコードする遺伝子の変異誘発およびサブクローニング 。RSV RTαサブユニットをコードする遺伝子を作製するために、２つのオリゴヌ クレオチドを使用して、pDBH-（図３、15）に由来するRNaseH-変異体RSV RT遺伝 子のアミノ末端を変異誘発し、そしてトリレトロウイルスプロテアーゼp15が正 常に前駆体ポリタンパク質を切断してαサブユニットを作製する翻訳停止コドン を導入した： PCRサイクリング条件は、94℃５分、続いて55℃15秒／72℃２分／94℃15秒の ８サイクル、次いで72℃２分であった。PCR産物を、上記のようにUDGクローニン グによりpAMP1にクローニングして、pAMP1A（図３、16）を形成した。 His6タグのRSVβサブユニットカルボキシ末端への付加。His6タグを、位置指 定変異誘発によりRSV RTβサブユニットカルボキシ末端へ付加し、そして変異体 配列を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、上記のようにPCRおよびUDGクロー ニングによりpJD100からサブクローニングした： これらのオリゴヌクレオチドを、遺伝子に翻訳停止コドンを導入し、そしてヒス チジンタグをタンパク質末端に付加するように設計した。従って、遺伝子産物は 、６つのヒスチジンがカルボキシ末端に付加されたポリペプチドであった。PCR 産物をゲル電気泳動により精製し、そしてUDGクローニングによりpAMP1に挿入し て、pAMPChisを形成した。 RSV RTβ遺伝子のカルボキシ末端を除去し、そしてそれをHis6タグを含むカル ボキシ末端で置換するために、RSV RTβ遺伝子を含むバキュロウイルスベクター におけるKpnI部位数を減らさなければならなかった。プラスミドpDBH-（図４） をAflIIIで切断し、そしてこの部位をE.coliDNAポリメラーゼIのクレノウフラグ メントで「平滑化」し、ポリメラーゼを熱処理により不活化し、そしてベクター をPvuII（図４）でさらに切断した。次いで、欠失ベクター（5.9kb）をゲル電気 泳動により精製し、それ自身に連結し、そしてE.coli DH10B株を形質転換するた めに使用して、pDBH-Kpn（図４、17）を形成した。βカルボキシ末端とHis6タグ を有するKpnI-SstIフラグメントを、pAMPChisからpDBH-KpnのKpnI-SstI部位にク ローニングして、pDBH-KpnHis（図４、18）を形成した。 RSVαおよびβサブユニットのバキュロウイルス発現ベクターへのクローニン グ。本研究の進行の間に、RSV RTβ遺伝子がアミノ末端にHis6タグを有するバキ ュロウイルスベクターにおいて発現され得る、構築物を作った。しかし、構築間 に導入された変異のために、タグのリーディングフレームは、β遺伝子のリーデ ィングフレームとは異なった。この構築物の一部は、最終的なバキュロウイルス 発現ベクターを構築するために使用されたので、その構築を本明細書中に記載す る。 His6タグおよびNdeI部位をバキュロウイルスベクターに導入するために、以下 のオリゴヌクレオチドをアニールし、そしてpFastBac Dual(Harris,R.およびPol ayes,D.A.,Focus 19:6-8(1997)；図５）にクローニングした。： 両方のオリゴヌクレオチドを100μMの濃度でTE緩衝液に処方し、そして５μl の各オリゴヌクレオチド処方物を、単一チューブ中で15μlの水および２μlの10 ×React2緩衝液（500mM NaCl、500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、pH8.0）と混合し た。このチューブを65℃水浴中で加熱し、そして60分間にわたって25℃までゆっ くりと冷却した。得られた産物は、5'末端にEcoRI部位（下線）および3'末端にS a1I部位（イタリック体）を有する２本鎖DNA分子であった：この産物をEcoRIおよびSalIで切断し、そして所望のフラグメントを、標準的な 技術（Harris,R.およびPolayes,D.A.,Focus 19:6-8(1997)）によりベクターpFas tBac DualのEcoRI-SalI部位にクローニングし、プラスミドpFastBac Dual Ndeの 形成をもたらした（図５）。pAMP18BH-のNdeI-XhoI Ｂフラグメントを、pFastBa c Dual NdeのNdeI-SalI部位にクローニングして、pDBH-（図５、15）を作製した 。 RSV RTα遺伝子をバキュロウイルスベクターにクローニングするために、α遺 伝子を、SmaIおよびBspHIでpAMP1Aから切り出し、そしてpFastBac DualのNcoI-S maI部位にサブクローニングし、pDA（図５、19）を作製した。これは、バキュロ ウイルスP10プロモーターの下流にRSV RTα遺伝子を配置した。RSVαペプチド遺 伝子およびP10プロモーターをRsrIIおよびSmaIで切除し、そしてpDBH-のRsrII-S maI部位にクローニングして、pDABH-（図４、20）を作製した。 pDABH-におけるRSV RTβ遺伝子をpDBH-KpnHisにおけるカルボキシHis6タグ化 β遺伝子で置換するために、pDBH-KpnHisをNdeIで切断し、この部位をクレノウ フラグメントで平滑化し、次いで、カルボキシHis6タグを有するβ遺伝子をSstI で放出した（図６）。pDABH-をEcoRIで切断し、この部位をクレノウフラグメン トで平滑化し、次いでβ遺伝子をSstIで消化することにより除去した。ベクター フラグメント（これは、P10プロモーターの前にクローニングされたα遺伝子を 有するpFastBac Dualの平滑末端SstIフラグメントであった）を、pDBH-KpnHis由 来カルボキシHisタグ化β遺伝子を有する平滑末端SstIフラグメントに連結した 。E. coli DH10B細胞をこの構築物で形質転換し、そしてpDABH-His（図６、21）を含 む形質転換体を選択した。 プラスミドpDABH-Hisを含む組換え宿主細胞であるE.coli DH10B（pDABH-His） を、1997年４月15日に、Collection，Agricultural Research Culture Collecti on(NRRL),1815 North University Street,Peorla,Illinois 61604 USAに、受託 番号NRRL B-21679として寄託した。 寄託されたプラスミドを用いて、当業者は、標準的な遺伝子操作技術（例えば 、上記の位置指定変異誘発のための技術）を用いて、RSV RTのαサブユニットお よび／またはβサブユニットの種々の形態（例えば、αRNaseH+/βRNaseH+；αR NaseH-/βRNaseH-：αRNaseH+/βRNaseH-；およびαRNaseH-/βRNaseH+）をコー ドするプラスミドを容易に生成し得る。 ウイルスおよびRSV RT生成のための昆虫細胞のトランスフェクション。昆虫細 胞のトランスフェクションのためのベクターを調製するために、最初に、RSV RT 遺伝子構築物をバキュロウイルスゲノムに挿入することが必要であった。この挿 入を達成する１つの方法は、部位特異的トランスポゾンTn7（Luckow,V.A.,Recom binant DNA Technology and Applications,Prokop,Aら編,New York:McGraw-Hill (1991)）を使用することによる。DH10Bac宿主細胞において、大部分のバキュロ ウイルスゲノムは、低コピープラスミド（「バクミド(bacmid)」）（これもまた 遺伝子内にTn7挿入部位を含む）に示される（Harris,R.およびPolayes,D.A.,Foc us 19:6-8(1997)）。Tn7の転位は、DH10Bac宿主細胞において第２のプラスミド から生成されるTn7トランスポゼースにより容易にされ、そしてpFastBac DUALは 、プロモーターおよびクローニング部位に隣接する、Tn7の「右」および「左」 領域と共に構築される。 本発明の構築物をバクミド発現ベクターに挿入するために、pDABH-HisをDH10B ac細胞に形質転換し、そしてRSV RTβ遺伝子（その合成は、バキュロウイルスポ リヘドリンプロモーターにより指向される）およびRSV RTα遺伝子（その合成は 、バキュロウイルスP10プロモーターにより指向される）をコードする配列の転 位に続いて、β-ガラクトシダーゼαペプチドをコードするバクミド上の部位へ の転位後のβ-ガラクトシダーゼ活性損失についてスクリーニングする（Harris, R. およびPolayes,D.A.,Focus 19:6-8(1997)）。次いで、バクミドDNAを、標準的な ミニプレップ手順（Sambrook,J．ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２版,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1 989)）のわずかな改変により10ml形質転換体培養物から調製した。次いで、約１ μgのバクミドDNAを使用して、陽イオン性脂質Cellfectin(Anderson,D．ら、Foc us 16:53(1995))を用いてSf21昆虫細胞をトランスフェクトした。 １次ウイルスの拡大のために、トランスフェクションの約72時間後に、上清を トランスフェクト細胞から取り出し、そして１mlを使用して、35mlのSf21昆虫細 胞（約1.2×105細胞/ml）を感染した。72時間後、培養物を遠心分離し（2,000rp m；10分）、そして上清をデカントし、そして２次ウイルスストックとして使用 した。２次ウイルスストックを、35mlのSf21昆虫細胞を0.1mlの２次ストックで 感染することにより同様に拡大した。 次いで、ウイルスストックを使用して、RSV RT発現のためにSf21細胞を感染し た。予備実験において、感染細胞からのRT活性の発現は、感染の約72時間後に最 大であることが見出された。試験発現のために、70mlのSf21細胞を５mlのウイル スストックで感染し、そして細胞を、1,000rpmで５分間の遠心分離、PBS（培養 容量の2.5％）中の再懸濁、および1,000rpmで５分間の再遠心分離により感染の7 2時間後に採集した。上清を除去し、そして細胞を使用まで-70℃で貯蔵した。よ り大規模な生成のために、2.8リットルFernbachフラスコ中の600ml細胞を、２ml のウイルスストックで感染し、そして細胞を感染の72時間後に採集した。 実施例２：RSV RNaseH-RTの単離 精製組換えRSV H-RTを提供するために、クローニングされたRSV H-RTを、実施 例１に記載のように培養昆虫細胞において過剰発現させ、そしてアフィニティお よびイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。生成されたRSV RTは、αお よびβサブユニットを含む。RSV RT単離は、夾雑酵素および他のタンパク質が実 質的に除去された実質的に純粋なRSV RTを提供するが、このような夾雑物は、完 全に除去される必要はない。 緩衝液。全ての緩衝液のpHを23℃で決定し、そして緩衝液を使用まで４℃で貯 蔵した。Crack緩衝液は、50mM Tris-HCl（pH7.9）、0.5M KCl、0.02％(v/v)Trit on X-100、および20％(v/v)グリセロールを含んだ。使用の直前に、以下のプロ テアーゼインヒビター（Boehringer Mannheim;Indianapolis，IN）を、示された 最終濃度：ロイペプチン（２μg/ml）、Pefabloc（48μg/ml）、ペプスタチンＡ （２μg/ml）、ベンズアミド（800μg/ml）、およびPMSF（50μg/ml）でCrack緩 衝液に添加した。緩衝液Ａは、20mM Tris-HCl（pH7.9）、0.25M KCl、0.02％(v/ v)Triton X-100、および10％(v/v)グリセロールを含んだ。緩衝液Ｂは、1Mイミ ダゾールが添加された緩衝液Ａであった。緩衝液Ｓは、50mM Tris-HCl（pH8.2） 、0.02％(v/v)Triton X-100、10％(v/v)グリセロール、0.1mM EDTA、および１mM ジチオトレイトール（DTT）を含んだ。緩衝液Ｔは、1M KClが添加された緩衝液 Ｓであった。緩衝液Ｈは、20mMリン酸カリウム（pH7.1）、0.02％(v/v)Triton X -100、20％(v/v)グリセロール、0.1mM EDTA、および１mM DTTを含んだ。緩衝液 Ｊは、1M KClが添加された緩衝液Ｈであった。貯蔵緩衝液は、200mMリン酸カリ ウム（pH7.1）、0.05％(v/v)NP-40、50％グリセロール(v/v)、0.1mM EDTA、１mM DTT、および10％(w/v)トレハロースを含んだ。 抽出物調製。凍結昆虫細胞（25g）を解凍し、そしてスラリーを、50mlのCrack 緩衝液＋インヒビターを用いて４℃で調製した。細胞を、最大出力の25％でFish er550ソニケーターを用いて超音波処理により４℃で破壊した。破壊された粗抽 出物を、４℃で30分間の27,000×gでの遠心分離により清澄化した。 RSV RT単離。清澄化後、抽出物を分画し、そしてRSV RTを４℃でカラムクロマ トグラフィーにより精製した。清澄化粗抽出物を、製造者の説明書に従ってNiSO4 で満たされ、そして99.5％緩衝液A+0.5％緩衝液Ｂで平衡化された、30ml Chela ting Sepharose Fast Flowカラム（Pharmacia;Piscataway,NJ）にロードした。 カラムを、１カラム容量の99％緩衝液Ａ＋１％緩衝液Ｂで洗浄し、次いで10カラ ム容量の98.5％緩衝液Ａ＋1.5％緩衝液Ｂで洗浄した。RTを、98.5％緩衝液Ａ＋1 .5％緩衝液Ｂから75％緩衝液Ａ＋25％緩衝液Ｂの10カラム容量直線勾配で溶出し た。 精製の間、逆転写酵素活性を、逆転写酵素に特異的であるポリ(C)-オリゴ(dG) を用いてアッセイした（Gerard G.F．ら、Biochemistry 13:1632-1641(1974)） 。 RT単位活性を、記載されたように（Houts,G.E．ら、J.Virol.29:517-522(1979) ）定義およびアッセイした。ポリ(C)-オリゴ(dG)アッセイを用いて、Chelating Sepharose Fast FlowカラムからのRT活性のピーク画分（10〜17％緩衝液Ｂ）を プールし、等容量の緩衝液Ｓで希釈し、そして緩衝液Ｓ中で平衡化された５ml A F-ヘパリン-650Mカラム（TosoHaas;Montgomeryville,PA）にロードした。12カラ ム容量の90％緩衝液Ｓ＋l0％緩衝液Ｔでの洗浄の後、カラムを、緩衝液Ｓから30 ％緩衝液Ｓ＋70％緩衝液Ｔの15カラム容量直線勾配で溶出した。RT活性のピーク 画分（43〜50％緩衝液Ｔ）をプールし、2.5容量の緩衝液Ｈで希釈し、そして緩 衝液Ｈ中で平衡化されたMono S HR5/5カラム（Pharmacla;Picataway,N」）に口ー ドした。20カラム容量の85％緩衝液Ｈ＋15％緩衝液Ｊでの洗浄の後、カラムを、 85％緩衝液Ｈ＋15％緩衝液Ｊから50％緩衝液Ｈ＋50％緩衝液Ｊの20カラム容量勾 配で溶出した。RTピーク画分をプールし、貯蔵緩衝液に対して一晩透析し、そし て-20℃で貯蔵した。 精製後、RSV H-RTは、SDS-PAGEにより判断されたように＞95％均一であること が見出された。精製酵素はまた、RNaseおよびDNアーゼ夾雑を実質的に欠いてお り、そしてRNaseH活性が実質的に低減されたことが見出された。 実施例３：完全長cDNA分子の調製 酵素。明白なRNaseH活性を欠くモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)RT(すな わち、「RNaseH-RT」)のクローニング形態であるSuperScript II RT(SS II RT) は、Life Technologies,Inc．(Rockville,Maryland)に由来した。M-MLV RT、完 全なRNaseH活性を有するクローニングマウスRT（すなわち、「RNaseH+RT」）も また、Life Technologies,Inc.に由来した。AMV RT、トリ骨髄芽球症ウイルスRT のRNaseH+非クローニング形態は、Seikagaku America,Inc.に由来した。RSVH-RT を、実施例１および２に記載のように調製した。組換えTth DNAポリメラーゼ、 逆転写酵素活性を有するThermus thermophilusに由来するクローニングされた好 熱性(thermophilic)DNAポリメラーゼは、Perkin Elmerに由来した。 合成mRNA。120ヌクレオチドの3'ポリ(A)テイルを有する7.5キロ塩基対(Kb)合 成mRNA(Life Technologies,Inc.；Rockville,Maryland）を、種々の酵素（単独 または組み合せ）の効率を試験するための鋳型として使用した。 cDNA合成反応混合物。反応混合物（各20μl）は、他に指定しない限り以下の 成分を含んだ：50mM Tris-HCl(24℃でpH8.4)、75mM KCl、10mMジチオトレイトー ル、１mMの各[32P]dCTP(300cpm/pmol)、dGTP、dTTP、およびdATP、25μg/ml(p(d T)25-30)、125μg/mlの7.5Kb mRNA、ならびに35単位のクローニングラットRNase インヒビター。反応混合物（RT単独または組み合わせ）は以下を含んだ： RTが組み合せて使用された場合、１つの酵素を最初に添加し、続いて直ぐに第 ２の酵素のアリコートを添加した。単一の酵素を使用したいくつかの場合におい て、同じ酵素の第２のアリコートを、単一酵素量倍加の効果を評価するためのコ ントロールとして添加した。 全てのcDNA合成反応を45℃で50分間行い、そして得られたcDNA産物を、32P標 識デオキシリボヌクレオシド３リン酸前駆体のRT触媒取り込みにより検出可能に 標識した。cDNA総収量を、cDNA産物の一部の酸沈殿およびそれをシンチレーショ ンカウンターにおいて計数することにより決定した。残りの反応混合物中の32P 標識cDNA産物を、アルカリアガロースゲル電気泳動（Carmichael,G.G.およびMcM aster,G.K.,Meth.Enzymol.65.380-385(1980)）により分画した。ゲルを乾燥し、 そしてcDNA産物のサイズ分布をオートラジオグラフィーにより確立した。オート ラジオグラフィーフィルムをテンプレートとして用いて、乾燥ゲルを切り、そし て合成された完全長（7.5Kb）産物の画分を確立するためにシンチレーションカ ウンティングにより分析した。 表１および２は、合成されたcDNAおよび合成された完全長cDNA（それぞれ、酵 素単独または組み合せによる7.5Kb mRNAに由来する）の総量を示す。以下の結論 が引き出され得る： １．RTが単独で存在する場合、総産物および完全長産物の最も高い収量は、RT のRNaseH-形態を用いて得られた。RSV H-RTまたはSS II RTのいずれかを用いて 、総収量は、RNaseH+酵素を用いて得られた最も高い収量のほぼ２倍であった（ それぞれ、1011および946ng対607ng）。反応からRNaseHを除去する効果は、完全 長収量が試験された場合、さらにより劇的であった。この場合、収量は、少なく とも３倍であった（それぞれ、RSV H-およびSS II RTの234および208ng対M-MLV H+RTおよびAMV RTの79および26ng）。これらの結果は、RTからRNaseHを排除する 劇的な正の効果を示す。 ２．RTが組み合わされた場合、いくつかの効果が観察された。RNaseH-でもRNa seH+でも、異なる供給源に由来するRTの混合は、総収量および完全長収量を増大 させた。これは、１つの酵素に独特の部位での中断が、異なるセットの中断部位 を有する第２のRTにより低減され得るという仮説と一致する。しかし、総cDNA産 物および完全長cDNA産物の断然最も多い収量は、２つの異なるRNaseH-RTが組み 合わされた場合に得られた（表１および２の影を付けた囲みを参照のこと）。こ れらの結果は、２つのRNaseH-酵素が共同して、完全長cDNA分子を合成すること を示す：第１の酵素は短縮型cDNA分子を合成し、次いでこのcDNA分子は、第２の 酵素の活性を介して完全長に伸長される。従って、本発明の組成物および方法は 、完全長cDNA分子の合成を容易にする。 1総cDNA産物量（ng）2 試験せず 1完全長（7.5kb）cDNA産物量（ng）2 試験せず 表１および２に要約される混合実験において、単一の所定のRTの最適状態に及 ばなかったかもしれない条件下で、２つの逆転写酵素を反応物に同時に添加した 。これは、トリおよびマウスRTが共に使用された場合であった。なぜなら、MgCl2 濃度が、マウスおよびトリRTそれぞれの最適条件３mMと7.5mMとの間の５mMに設 定されたからである。さらに、あまり耐熱性でないマウスRTを含む反応における トリRNaseH-RTの熱安定性のこれらの実験において、十分な好結果が得られなか った。 複数の酵素を使用し、そして異なる酵素が異なる最適条件を有し得ることと取 り組むために、本発明の方法に従って、酵素の連続添加または別々の使用がなさ れ得る。例えば、cDNAは、各RTに最適の反応条件下で、異なるRTを有する別々の 反応チューブ中の同じRNAの異なるアリコートから合成され得る。続いて、各反 応からのcDNAは、さらなる操作を行う前に混合され得る。あるいは、RTは、cDNA 合成を行う１つのチューブ中で単独でおよび連続的に使用され得る。すなわち、 SuperScriptIIは、最初に、最適反応条件下でRNA集団をコピーするために使用さ れ得、次いで、同じチューブ中でRSV H-RTに最適なように条件が調節され得、そ してさらなる合成が上昇した温度でトリRTを用いて行われ得る。 実施例４：トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)RTおよびAMV RNaseH-(AMV H-)RTのクロ ーニングおよび発現 一般的な方法 本発明のAMV RTは、トリレトロウイルスRTのクローン化形態である。AMV H-RT は、αおよびβサブユニットの両方が、RNaseH活性を排除するように単一アミノ 酸変化により変異された、クローン化AMV RT改変体であるが、RNaseH活性が実質 的に低減されたAMV RTはまた、αサブユニット単独を変異することにより生成さ れる（βサブユニットはRNaseHドメインにおいて変異を含まない）。変異および プラスミド構築を、以下に記載のように改変された、標準的な分子生物学方法（ 例えば、Sambrook,J．ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Col d Spring Harbor,NY:Laboratory Press(1989)を参照のこと）を用いて行われた 。プラスミド調製、PCR、ゲル電気泳動、DNAフラグメント単離およびクロー二ン グ、昆虫細胞培養、ならびにバキュロウイルス生成を、全て、実施例１において RSV RTクローニングおよび発現について記載されたように行った。 AMV RTαおよびβサブユニットをコードする遺伝子のクローニングおよび発現 AMV RTをクローン化するために、AMVウイルスRNAを、Life Sciences(St.Peter sburg,Florida)から得られた精製(Grandgenett,D.P.ら、Appl.Microbiol.26:452 (1973))AMVから調製した（Strauss,E.M．ら、J.Virol.Meth.1:213(1980)）。AMV RT cDNAを、cDNA合成およびプラスミドクローニング用のSuperScript Plasmid S ystem（Life Technologies,Inc.:Rockville,Maryland）を用いて、キットマニュ アルの説明書に従ってAMVウイルスRNAから調製した。cDNAにNotI部位を付加する 、AMV RTに特異的なプライマーを使用した。調製後、AMV RT cDNAを、SalIおよ びNotIで処理されたpSPORT1にクローニングし、AMV RT遺伝子を含むベクター（p SPORT8）を得た（図22）。 AMV RTのαおよびβサブユニット両方を、より大きなポリペプチド前駆体（Ge rard,G.F.,Enzymes of Nucleic Acid Synthesis and Modification,第１巻：DNA Enzymes,Jacob,S.T.編,Boca Raton,Florida:CRC Press,1〜38頁(1983)）のタン パク質分解プロセシングにより生成する。タンパク質分解プロセシングの必要条 件を不必要にするために、AMV RTのコード配列を、αおよびβサブユニットの両 方が標準的な開始および停止翻訳シグナルを有する遺伝子によりコードされるよ うに、変異誘発およびサブクローニングした。RNaseH-構築物を作製するために 、αおよびβ遺伝子の両方をRNaseH領域において変異誘発させたが、サブユニッ トの任意の組み合せ（例えば、αRNaseH-/βRNaseH+；αRNaseH+/βRNaseH+；α RNaseH+/βRNaseH-；αRNaseH-/βRNaseH-）構築を、この同じ様式で達成し得る 。AMV RTαRNaseH-/βRNaseH+は、RNaseH活性が実質的に低減されたことが発見 された（野生型の約５％）。アフィニティタグをコードする配列を、βサブユニ ットのカルボキシ末端に付加した。 AMV RNAからのcDNAの合成。AMV RNAを、AMV RT遺伝子の3'末端に相補的な3'プ ライマーを用いてDNAにコピーし、これは、遺伝子3'末端にNotI部位を付加する （図22）。得られたcDNAの5'末端を、SalIアダプターの付加によりSalI末端に作 った。次いで、このcDNAを、SalI-NotI切断ベクター（pSPORTl）にクローニング した。第１鎖cDNAを、Superscript II RT(Gerard,G.F．ら、FOCUS 11:66(1989)) およびNotIプライマーアダプターの代わりに遺伝子特異的プライマー（オリゴヌ クレオチド＃１）を用いて合成した： 第２鎖合成を、E.coli RNaseHおよびDNAリガーゼと組み合せたDNAポリメラー ゼＩを用いて16℃で達成し、続いてT4 DNAポリメラーゼを用いて末端に仕上げを 施した（polish）。cDNAをタンパク質除去し、そしてエタノール沈殿し、そして オリゴヌクレオチド＃２および＃３からなるSalIアダプターをcDNAに連結した： アダプター付加に続いて、NotIで消化した。cDNAのサイズ分画を、cDNAクロー ニングキットによって提供される１mlの予めパックされたカラムにおいて行った 。各画分のcDNA量を、取り込まれた32P標識の比活性から計算し、そしてcDNAサ イズを、アガロースゲルのオートラジオグラフィーにより決定した。3Kbより大 きな画分を、クローニングのために選択した。 AMV cDNAのベクターへのクローニング。cDNAを、SalI-NotI切断pSPORT1ベクタ ーに連結し、次いで、連結cDNAを使用して、E.coli MAX EFFICIENCY DH10BTMコ ンピテント細胞（Life Technologies,Inc.,Rockville,Maryland)）を形質転換し た。形質転換後、細胞のアリコートを、アンピシリンを含むLBプレートにプレー トした。12個のコロニーを拾い、そして１ml培養物をミニプレップのために増殖 させた。ゲルを作動させて、制限酵素SalI、MluI、PstI、ApaI、DraIII、SphI、 およびBglIIを用いた消化後の特定のフラグメントについてチェックした。１つ のプラスミドpSPORT8を選択した。なぜなら挿入物が、AMV RT遺伝子（３Kb）を コードするのに十分大きく、そしてAMV RT遺伝子5'末端が存在することを示すPs tＩ部位が存在するからであった（図22）。 AMV RTβサブユニットのアミノ末端、カルボキシ末端、および中央の変異誘発 およびサブクローニング。AMV RT遺伝子を、標的としてpSPORT8および以下のオ リゴヌクレオチドを用いるPCRにより、成熟RTポリペプチドをコードする配列の アミノ末端にATGコドンおよびEcoRI部位を付加するように変異誘発した： 上記のように、PCRを行い、そしてPCR産物を精製した。PCR反応物をDpnIで処 理して標的を破壊し、そしてPCR産物をUDGクローニング（Buchman,G.W.ら、Focu s 15:36(1993)）によりpAMP18にクローニングし、プラスミドpAMVN（図23、26） を形成した。 アミノ末端の変異誘発およびクローニングの後、His6アフィニティータグ、Xh oI部位、および翻訳停止コドンを、以下のオリゴヌクレオチドを用いるPCRによ りpSPORT8においてAMV RTβサブユニット遺伝子のカルボキシ末端に付加した： 上記のように、PCRを行い、そしてPCR産物を精製した。PCR反応物をDpnIで処 理して標的を破壊し、そしてPCR産物をUDGクローニング（Buchman,G.W.ら、Focu s 15:36(1993)）によりpAMP18にクローニングし、プラスミドpAMVC（図23、27） を形成した。 AMV RTβサブユニットの中央領域を付加するために、AMV RTβサブユニットの 中央をコードするpSPORT8由来2.3Kb HpaI-KpnIフラグメントを、pAMVNのHpaI-Kp nI部位にクローニングし、pAMVNM（図23、28）を形成した。AMV RTβサブユニッ トのカルボキシ末端を付加するために、pAMVCは２つのKpnI部位を有するので（ 図27）、これをKpnIで部分的に切断し、次いでScaIで完全に切断し、そしてAMV RTのカルボキシ末端を有する３Kbフラグメントを単離し、そしてpAMVNMH-（図29 ）の3.5Kb ScaI-KpnIフラグメントに連結し、pAMVBH-（図23、30）を形成した。 βサブユニットを変異誘発してRNaseH-にする。RSV RTおよびAMV RT遺伝子は 、関連がある（RSV-Cについては、GenBank配列J02342、J0202l、およびJ02343； AMVについては、GenBank配列L10922、L10923、L10924）。これらの遺伝子は、RN aseH領域の短い区域にわたって同一のアミノ酸配列をコードする。実施例１に上 記のように、RSV RT遺伝子のクローニングおよび変異誘発の間、RSV RTβ遺伝子 のRNaseH-誘導体を部位特異的変異誘発により作った。使用したオリゴヌクレオ チド（オリゴヌクレオチド＃８）はアミノ酸Asp450をAla450に変え、そしてSstI I部位（下線）を導入した。 RSV RTβ遺伝子においてRNaseH-変異を有するプラスミドは、pAMP18BH-（図２、 14）である。pAMP18BH-に由来する129bp BsrGI-BstEIIフラグメントを、pAMVNM のBsrGI-BstEII部位にクローニングし、このプラスミドにおけるRNaseH+領域を 置換し、そしてpAMVNMH-を形成した（図23、29）。この置換の効果は、他のいず れのアミノ酸も変えることなく、AMVβ遺伝子においてAsp450をAla450に変える ことであった。βサブユニットをRNaseH+に変換し戻すために、野生型配列を有 するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し得る。 AMV RTαサブユニットをコードする遺伝子の変異誘発およびサブクローニング 。AMV RTαサブユニットをコードする遺伝子を創作するために、オリゴヌクレオ チド＃９および＃10を使用して、pAMVNMに由来するAMV RT遺伝子アミノ末端を、 トリレトロウイルスプロテアーゼp15が前駆体ポリタンパク質を正常に切断して 、αサブユニットを作製する翻訳停止コドンを導入するように変異誘発した： PCRサイクリング条件は、94℃５分、続いて55℃15秒／72℃２分／94℃15秒、次 いで72℃２分の８サイクルであった。PCR反応物をDpnIで処理して標的を破壊し 、そしてPCR産物をUDGクローニング（Buchman,G.W.ら、Focus 15・36(1993)）に よりpAMP18にクローニングし、プラスミドpAMVAを形成した（図24、31）。AMV R TのαサブユニットのRNaseH-対立遺伝子を作製するために、標的としてpAMVBH- を用いて同じ手順に従い、プラスミドpAMVAH-を形成した（図24、32）。 AMV RTαおよびβ遺伝子をpFastBac Dualにクローニングする。α遺伝子を、S malおよびBspHIを用いてpAMVAから切除し、そしてpFastBac DualのNcoI-PvuII部 位にサブクローニングし（pD；図33）、プラスミドpDAMVAを作製した（図25、34 ）。RNaseH-AMV RTα遺伝子を、同様にpAMVAH-からクローニングし、プラスミド pDAMVAH-を形成した（図25、35）。両方のプラスミドにおいて、AMV RTα遺伝子 は、バキュロウイルスp10プロモーターの下流であった。RNaseH-AMV RTβ遺伝子 をEcoRIでpAMVBH-から切除し、そしてpDAMVAのEcoRI部位にクローニングした。A MV RTβ遺伝子がポリヘドリンプロモーターの下流であるようにEcoRI挿入物が 配向された、プラスミドpDAMVABH-を形成する（図25、36）、クローンを選択し た。この構築物において、AMV RTα遺伝子はRNaseH+であったが、β遺伝子はRNa seH-であった。AMV RNaseH-RTβ遺伝子およびポリヘドリンプロモーターを、Rsr IIおよびNotIを用いてpDAMVABH-から切除し、そしてpSPORT1のRsrII-NotI部位に クローニングし、プラスミドpJAMVBH-を形成した（図25、37）。AMV RNaseH-RT β遺伝子およびポリヘドリンプロモーターを、RsrIIおよびNotIを用いてpJAMVBH -から切除し、そしてpDAMVAH-のRsrII-NotI部位にクローニングし、プラスミドp DAMVAH-BH-を形成した（図25、38）。 プラスミドpDAMVABH-を含む組換え宿主細胞であるE.coli DH10B(pDAMVABH-)を 、1997年６月17日に、コレクションであるAgricultural Research Culture Coll ection(NRRL),1815 North University Street,Peoria，Illinois 61604 USAに、 寄託番号NRRL B-21790として寄託した。 寄託されたプラスミドを用いて、当業者は、標準的な遺伝子操作技術（例えば 、上記の部位特異的変異誘発のための技術）を用いて、AMV RTのαサブユニット および／またはβサブユニットの種々の形態（例えば、αRNaseH+/βRNaseH+； αRNaseH-/βRNaseH-；αRNaseH+/βRNaseH-；およびαRNaseH-/βRNaseH+）を コードするプラスミドを容易に生成し得る。 ウイルスおよびAMV RT生成のための昆虫細胞のトランスフェクション。昆虫細 胞のトランスフェクションのためのベクターを調製するために、最初に、AMV RT 遺伝子構築物をバキュロウイルスゲノムに挿入することが必要であった。この挿 入を、実施例１においてRSV RT遺伝子構築物のバクミドへの挿入について記載さ れたように、部位特異的トランスポゾンTn7を使用して達成した。プラスミドpDA MVABH-をDH10Bac細胞に形質転換し、そしてAMV RTβ遺伝子（その合成は、バキ ュロウイルスポリヘドリンプロモーターにより指向される）およびAMV RTα遺伝 子（その合成は、バキュロウイルスp10プロモーターにより指向される）をコー ドする配列の転位に続いて、β-ガラクトシダーゼαペプチドをコードするバク ミド上の部位への転位後のβ-ガラクトシダーゼ活性の消失についてスクリーニ ングした（Harris,R.およびPolayes,D.A.,FOCUS 19:6-8(1997)）。次いで、バク ミドDNAを、実施例１に記載のように、標準的なミニプレップ手順のわずかな改 変により形質転換体（10ml培養物）から調製した。約１μgのバクミドDNAを使用 して、陽イオン脂質Cellfectinを用いてSf21昆虫細胞をトランスフェクトした(A nderson,D.ら、FOCUS 16:53(1995))。 １次ウイルスの拡大のために、トランスフェクションの約72時間後に、上清を トランスフェクト細胞から取り出し、そして１mlを使用して、35mlのSf21昆虫細 胞（約1.2×105細胞/ml）を感染した。72時間後、培養物を遠心分離し（2,000rp m；10分）、そして上清をデカンテーションし、そして２次ウイルスストックと して使用した。２次ウイルスストックを、35mlのSf21細胞を0.1mlの２次ストッ クで感染することにより同様に拡大した。 次いで、ウイルスストックを使用して、AMV RT発現のためにSf21細胞を感染し た。予備実験において、感染細胞によるRT活性の発現は、感染の約72時間後に最 大であることが見出された。試験発現のために、70mlのSf21細胞を５mlのウイル スストックで感染し、そして細胞を、1,000rpmで５分間の遠心分離、PBS（培養 容量の2.5％）中の再懸濁、および1,000rpmで５分間の再遠心分離により感染の7 2時間後に採集した。上清を除去し、そして細胞を使用まで-70℃で貯蔵した。よ り大規模な生成のために、2.8リットルFernbachフラスコ中の600ml細胞を、２ml のウイルスストックで感染し、そして細胞を感染の72時間後に採集した。次いで 、AMV RTを、実施例２においてRSV RTについて記載されたように単離した。 実施例５：55℃より上の温度でのレトロウイルスRTを用いた逆転写 レトロウイルス逆転写は、歴史的に、37℃〜42℃の範囲の温度でmRNA逆転写を 触媒するために使用されてきた（RTの市販者（例えば、LTI、Pharmacla、Perkin Elmer、Boehringer Mannhelm、およびAmersham）の技術文献を参照のこと）。 これらの温度で、mRNA２次構造は逆転写を妨げ（Gerard,G.F．ら、FOCUS11:60(1 989)；Myers,T.W.およびGelfand,D.H.,Biochem.30:7661(1991)）、そしてプライ マー結合特異性は、遺伝子特異的逆転写プロセス（例えば、RT-PCR）間に低減さ れ、高いバックグラウンドシグナルを引き起こす（Myers,T.W.およびGelfand,D. H.,Biochem.30:7661(1991)；Freeman,W.N．ら、BioTechniques 20:782(1996)） という一般的な考えがある。従って、これらの問題を軽減するのを助けるために 、 より上昇した温度（すなわち、55℃より上）でRNA逆転写を行うことが望ましい 。 上記のように、レトロウイルスRTは、これらの中温菌酵素の限定された熱安定 性のため、一般的に、RNAをコピーするために37℃〜42℃より上の温度で使用さ れない。しかし、近年、AMV RTを使用して、50℃で、および限定された範囲で55 ℃で小アンプリコン(＜500塩基)のRT-PCRを行い得ることが報告された（Freeman ,W.M.ら、BioTechniques 20:782(1996)；Mallers,F.ら、BioTechniques 18:678( 1995)；Wang,R.F.ら、BioTechniques 12:702(1992)）。RNaseHドメインの除去（ Gerard,G.F.ら、FOCUS 11:66(1989)）またはRT遺伝子における点変異（Gerard,G .F.ら、FOCUS 14:91(1992)）のために、RNaseH活性を欠くM-MLV RT形態もまた、 cDNA合成を触媒するために50℃で使用され得るが、55℃で使用され得ない。 従って、RNaseH-RSV RTの熱安定性および大きなcDNA合成のためのより高温の （すなわち、50℃より上）逆転写反応におけるその有用性を調べた。 方法 酵素およびRNA。SuperScript RT(SS RT)、SuperScript II RT(SS II RT)、お よびモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)RTは、LTIより取得した。AMV RTはSe ikagaku America,Inc．より取得したか、または実施例４において上記したよう に調製した。SS RTは、RNaseH活性が、RTポリペプチドのRNaseHドメインの除去 （78KDaよりむしろ57KDaの分子量を有する酵素をもたらす）により排除された、 M-MLV RTのRNaseH-形態である（Gerard,G.F.ら、FOCUS 11:66(1989)；Kotewicz, M.L.ら、Noc.Acids Res.16:265(1988)）。SS II RTは、RNaseH活性が、M-MLV RT のRNaseHドメインにおける３つの点変異導入により排除された、M-MLV RTのRNas eH-形態である（Gerard,G.F.ら、FOCUS 14:91(1992)）。ラウス関連ウイルス(RA V)RTは、Amershamより取得した。RSV RNaseH-およびRSV RNaseH+RTを、実施例１ および２に上記のように、クローニング、発現、および精製した。鋳型として使 用したRNAは、1.4、2.4、4.4、および7.5Kbの合成RNAであり、各々は3'末端に12 0ヌクレオチドポリ(A)テールを有し、LTIより取得した。合成CAT mRNAはLTIより 取得した。 逆転写酵素の機能的熱安定性を決定するためのモデル系。1.4、2.4、4.4、お よび7.5Kb mRNAの混合物を使用して、種々のRTが種々の温度で完全長cDNAコピー を合成する能力を試験した。合成されたcDNA産物を、32P標識デオキシリボヌク レオチド３リン酸前駆体のRT触媒取り込みにより放射性標識した。32P標識cDNA 産物を、アルカリアガロースゲル電気泳動（Carmichael,G.G.およびMcMaster,G. K.,Meth.Enzymol.65:380(1980)）により分画した。ゲルを乾燥し、そしてcDNA産 物のサイズ分布をオートラジオグラフィーにより確立した。オートラジオグラフ ィーフィルムをテンプレートとして用いて、1.4、2.4、4.4、および7.5Kbの完全 長cDNAバンドを乾燥ゲルから切り、そして合成された各完全長産物の量を確立す るためにシンチラント(scintillant)において計数した。 cDNA合成反応条件。全てのcDNA合成反応を、30または50分間、示された温度で 行った。全ての反応混合物は20μlであり、そして他に指定されない限り、以下 の成分を含んだ：50mM Tris-HCl(24℃でpH8.4)、75mMKCl、10mMジチオスレイト ール、１mMの各[32P]dCTP(300cpm/pmol)、dGTP、dTTP、およびdATP、25μg/ml(p (dT)25-30)、各12.5μg/mlの1.4、2.4、4.4、および7.5Kb mRNA、ならびに35単 位のクローン化ラットRNaseインヒビター。さらに、反応混合物は以下を含んだ ： 酵素以外の全ての成分を含む反応混合物を、所望の温度で３分間プレインキュベ ートし、次いでRTを添加して、cDNA合成を開始した。 半減期決定。RTの半減期を、RTの個々のチューブを所望の温度で適切な時間の 長さでインキュベートし、そしてチューブを氷上に置くことによりインキュベー ションを止めることにより決定した。RSV RT、RAV RT、およびAMV RTを、50mM T ris-HCl(pH8.4)、75mM KCl、7.5mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、50μg/mlC ATm RNA、25μg/ml p(dT)12-18、および350〜700単位/ml RTを含む20μアリコー ト中でインキュベートした。マウスRT（SS RT、SS II RT、M-MLV RT）を、MgCl2 が３mMであり、そして酵素が2,500単位/mlであったことを除いて、同じ成分を含 む混合物中でインキュベートした。各チューブからのアリコート（トリRTについ ては５μlおよびマウスRTについては１μl）を、単位アッセイ反応混合物中のRT 活性についてアッセイして、残存RT活性を決定した。 単位アッセイ。単位アッセイ反応混合物（50μl）は、50mM Tris-HCl(pH8.4) 、40mM KCl、６mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、500μM[3H]dTTP(30cpm/pmo le)、0.5mMポリ(A)、および0.5mM(dT)12-18を含んだ。反応混合物を37℃で10分 間インキュベートし、そして標識産物をGF/Cガラスフィルター上に酸沈殿させ、 これをシンチレーションカウンターにおいて計数した。 結果および考察 いくつかの例外はあるが、45℃、50℃、55℃、および60℃での鋳型プライマー 存在下での半減期を、RSV H+RT、RAV RT、AMV RT、RSV H-RT、M-MLV H+RT、SS R T、およびSS II RTについて決定した。結果を図39および表３に示す。 1半減期を図39に示すデータから決定した。2 ND：決定せず。3 ND：決定せず、なぜなら、この反応混合物における半減期が短すぎて正確に決 定され得なかったため。 図39および表３に示した結果は、RNaseH+RT（RSV、RAV、およびAMV）が、M-ML V RTより非常に耐熱性であり、そして50℃で妥当な半減期を有することを明らか に証明する。さらに、これらのRTを、それらの対応するRNaseH-形態を生成する ように変異することは、それらの半減期をさらに増大させる。最も劇的には、RN aseH-RSV RTは、45℃、50℃、および55℃で、他のいずれのレトロウイルスRTよ りも非常に長い半減期を有する。従って、単一アミノ酸変化の、RSV RT各サブユ ニットのRNaseHドメインへの導入は、50℃でのその半減期を約５倍ほど増大させ る。 50℃より上の温度でのcDNA合成に対するこの増大した熱安定性の影響は、劇的 であることが見出された。図40は、長さが1.4〜7.5KbのmRNAをコピーすることに おける、45℃、50℃、55℃、および60℃でのこれらのRTの性能比較の結果を示す 。RSV H-RTの例外はあるが、RTのいずれもが、55℃または60℃で、長さが2.4Kb より長い実質的な産物を生成することが見出されなかった。対照に、RSVH-RTは 、 55℃で完全長7.5Kb cDNAを、そして60℃で完全長4.4Kb cDNAを作り続けた。図41 および42は、図40において最もよく実行した２つのRT（すなわち、SS II RTおよ びRSV H-RT）のより詳細な比較を示す。55℃より上の温度で、RSV H-RTは、全て の長さのcDNAを合成し続けることが見出されたが、一方、SS II RTは、長さが１ Kbより大きなcDNAでは低レベルしか生成しなかった。 ひとまとめにして考えると、これらの結果は、RNaseH-RSV RTが、市販されて いる他のいずれのレトロウイルスRTよりも非常に高熱活性(thermoactive)であり 、そして60℃でより長いcDNA（４Kb長まで）を合成するために使用され得ること を証明する。RNaseH-RSV RTの増強した高熱活性は、50℃〜60℃での、RNaseH+RT と比較して増大した熱安定性に起因するものであり、この安定性は、RSV H-RTを 、50℃〜60℃でのmRNA逆転写における使用に理想的な酵素にする。 実施例６：上昇した温度でのトリRTを用いた逆転写 実施例５（表３および図39）において、種々のRTの半減期を示した。特に、各 サブユニットのRNaseHドメインがRNaseH活性を排除するように変異された（実施 例１；αサブユニットおよびβサブユニット両方においてAsp450→Ala）、クロ ーン化RSV RTについての半減期が報告された。 RT半減期に対するこれらの変異の効果をさらに調べるために、構築物を上記の ように生成し、ここで変異体の種々の組み合わせを形成するように、２つのサブ ユニットのうち１つだけを一度に変異した（例えば、αRNaseH-/βRNaseH+およ びαRNaseH+/βRNaseH-）。これらのRSV RT、ならびにクローン化AMVαRNaseH-/ βRNaseH+RTの半減期を、実施例５の方法の節において上記されたように決定し た。 表４に示すように、RSVまたはAMV RTのαサブユニットを変異し、βサブユニ ット野生型をインタクトなままにした場合、得られたRTは、他のトリRTについて 観察された熱安定性よりも大きな熱安定性を証明した。これらの変異体RTをまた 、実施例５の方法の節において記載されたようなモデル系を用いて、それらの機 能的熱安定性について調べた。各酵素について、増大した熱安定性は、改善した 機能的性能と相関することが見出され、例えば、55℃で最も高い熱安定性を証明 し た（表４）αRNaseH-/βRNaseH+トリRTはまた、種々の上昇した温度で最も高い 機能的活性を証明した（表５）。 実施例７：トリ逆転写酵素を作製するための代替方法およびそれらの特性の特 徴付け 関連技術の節において上記のように、レトロウイルスRTの３つの原型形態が徹 底的に研究されている--M-MLV RT、HIV RT、およびASLV RT（RSVおよびAMV RTを 含む）。３つのレトロウイルスRTの各々は、αおよびβサブユニットのヘテロダ イマーとして存在するが、一方、これまで、ヘテロダイマーαβRTの形成をもた らす、クローニングされたASLV RTαおよびβ遺伝子の同時発現の報告はなかっ た。 上記の実施例１〜４は、mRNAを効率的にコピーするRSVおよびAMV RTのαβ形 態のクローニング、発現、および精製を記載した。αβRT形成を、αおよびβ遺 伝子についての二重プロモーターのベクターからの同時発現によりバキュロウイ ルス感染昆虫細胞において達成した。本実施例において示された研究は、HIV p6 6/p51RTを首尾良くクローニングおよび発現するように使用されてきた他の種々 の方法により、RSVαβRTを作製するために設計された。さらに、以下に記載の ように、RSV RTの個々のサブユニット（βp4、β、およびαを含む）は、今やク ローニング、発現、および精製され、そしてこれらのサブユニットがmRNAをコピ ーする能力は、今や特徴付けられている。 材料および方法 一般的な方法 変異およびプラスミド構築を、以下に記載のように改変された、標準的な分子 生物学方法（例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Clonlng:A Laboratory Manual ,第２版,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照のこと）を用いて行った。プラスミド調製、PCR、ゲル電気泳動、D NAフラグメント単離およびクローニング、昆虫細胞培養、ならびにバキュロウイ ルス生成を、全て、実施例１においてRSV RTのクローニングおよび発現について 記載されたように行った。 E.coliにおけるRSV RTのクローニングおよび発現 多数のアプローチを、E.coliにおいてRSV RTβp4からRSVαβRTを作製するた めに試みた。 NdeI-XbaIフラグメントのPCR。RSV RTβp4遺伝子のアミノ末端を、以下のオリ ゴヌクレオチドを用いたpJD100（図７）のPCR（１サイクル、94℃５分；15サイ クル、94℃10秒、55℃15秒、72℃15秒；１サイクル、72℃５分）によりNdeI部位 を導入するように変異誘発した： 上記のオリゴヌクレオチド＃11におけるNdeI部位は、太いイタリック体の字体 で見られるが、一方、オリゴヌクレオチド＃11および＃12において下線を付され た塩基は、本来のRT遺伝子配列に由来した。これらの２つのオリゴを有するPCR 産物は、遺伝子の始まりにNdeI部位を含み、そしてRT遺伝子内に存在するXbaI部 位を保持した。PCR産物を、NdeIとXbaI部位との間でpUC18にクローニングし、pU C18＃3を形成した。 SmaI部位をクローンp15に導入するための部位特異的変異誘発。全RSV RT遺伝 子を含むpJD100に由来する3Kb PstIフラグメントを、M13mp19にクローニングし た。次いで、クローンRF-SmaIを、以下の変異誘発オリゴヌクレオチドを用いる 部位特異的変異誘発（実施例１を参照のこと）により、RSV RTβp4遺伝子のカル ボキシ末端でSmaI部位を導入することにより生成した： オリゴヌクレオチド#13（配列番号19）： 5'-ACT CGA GCA GCC CGG GAA CCT TTG-3' RT遺伝子の再構築。RF-SmaI由来の2.8kb SmaI-PstIフラグメントを、pUC18にS maI/PstI部位でクローニングした。このクローンを、pUCI8-PstI-SmaIと呼ぶ。p UC18＃3に由来するNdeI-XbaIフラグメントをpUC18-PstI-SmaIに導入して、開始 コドンにNdeI部位を有する全RSV RTβp4遺伝子を再生した。このクローンを、pU C18-RTと呼ぶ。 pRE2における全RT遺伝子のクローニング。pUC18＃3に由来するNdeI-XbaIフラグ メントを発現ベクターpRE2にクローニングして、pRE2-NdeI-Xbaを作製した。pRE 2は、誘導性λpLプロモーターを含む。RSV RTβp4遺伝子の残りを、pUC18-PstI- SmaIに由来するNdeI-SstIフラグメントとして、XbaIおよびSstIで消化されたpRE 2-NdeI-Xbaにサブクローニングし、pRE2-RTを作製した。 p15のpRE2-RTへのクローニング。RSV RTを、RSV p15プロテアーゼによりRSV R Tβp4からαβヘテロダイマーにプロセシングする。本来のαβを作製するため に、p15プロテアーゼ遺伝子をクローニングし、そして以下の通りに、RSV RTβp 4遺伝子と共に発現させた。RSV p15プロテアーゼ遺伝子を、標的としてpJD100お よび上記のプロトコルを用いてPCRにより作製した。PCRのために使用されたオリ ゴヌクレオチドは以下の通りであった： 上記のオリゴヌクレオチド＃14および＃15において、制限部位（Smal、Ndel、お よびSalI）を太文字で示したが、一方、下線の塩基領域はリボソーム結合部位で ある。これらのオリゴヌクレオチドを用いるPCRは、約450bpのフラグメントを作 製し、このフラグメントをSmaIおよびSalIで消化し、そしてpUC19にクローニン グした。このクローンをpUC19-p15と呼ぶ。p15遺伝子を、450bpのSmaI-SalIフラ グメントをSmaI/SalI部位でサブクローニングすることによりpRE2-RTに導入した 。最終プラスミドを、pRE2-RT.p15と呼ぶ。 pRE2-RTおよびpRE2-RT.p15からのRTの発現。pRE2-RTまたはpRE2-RT.p15のいず れかを含むE.coli CJ374を、アンピシリン（100μg/ml）およびクロラムフェニ コール（30μg/ml）の存在下のEGブロス中で、30℃で0.5のA590まで増殖させた 。培養物の半分を42℃で45分間誘導し、次いで、30℃で２時間増殖させた。もう 半分を、非誘導コントロールとして30℃で増殖させた。培養物は、SDS-PAGEによ る調査の際に、いずれの目に見える誘導タンパク質も生成しなかった。細胞抽出 物は、いずれのRT活性も示さなかった。 pRE1におけるRT.p15の再クローニング。上記の構築物におけるRT発現の欠如は 、RTがE.coliに毒性であると考えられるので、（ｉ）PCR間に変異がRT遺伝子に 導入され、RT遺伝子を不活性にした、または（ii）クローニング間に、λpLプロ モーターにおける変異が生じた、可能性を示唆した。従って、全RT.p15遺伝子を NdeI-SalIフラグメントとしてpRE1に再クローニングし（複数クローニング部位 が反対方向にあることを除いて、pRE2と同じ）、そしてこの構築物をE.coli CJ3 74に導入した。さらに、得られたクローンの2269bp HpaI-KpnIフラグメントを、 pJD100に由来する同じHpaI-KpnIフラグメントにより置換した。この置換は、PCR に由来する約200bpアミノ末端領域のみを残す。さらに、この領域（NdeI部位〜H paI部位）を、PCRによる変異がないことを確認するために配列決定した。このプ ラスミドを、pRE1-RT.15と呼ぶ。このプラスミドもまた、プロテアーゼ欠損E.co 1i株であるBL21に導入した。p15遺伝子もまた、プラスミドをXhoIおよびSalIで 消化し、そしてプラスミドを再環状化することによりpREI-RT.15から欠失された 。得られたプラスミドをpRE1-RTと呼ぶ。 pRE1-RTおよびpRE1-RT.15を有するE.coliCJ374およびBL21におけるRTの発現。 培養物を上記のように増殖させた。可溶性細胞抽出物を、RT活性についてアッセ イした。活性は極端に低かったが、誘導細胞抽出物中のRT活性が、非誘導細胞抽 出物中のRT活性より10倍高いことは明らかであった。活性レベルは、CJ374およ びBL21の両方において同様であった。pRE1-RTおよびpRE1-RT.15からのRTの発現 レベルは同様であった。 tacプロモーター下へのRT遺伝子のクローニング。RSV RTβp4は、λpLプロモ ーター下で十分に発現されなかったので、異なるプロモーター制御下の発現を試 みた。p15遺伝子を伴うおよび伴わないRSV RTβp4遺伝子を、tacプロモーター下 にクローニングした。RT遺伝子をクローニングするために、pRE1-RTをNsiIで消 化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、そして最後に、XhoIで消化した。RT フラグメントを、アガロースゲルから精製した。RT.15遺伝子をクローニングす るために、pRE1-RT.15をNsiIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、そ して最後に、SalIで消化した。RT.15遺伝子組み合せフラグメントを、アガロー スゲルから精製した。ベクターpTrc99A(Pharmacia)をNcoIで消化し、クレノウフ ラグメントで平滑末端化し、そして最後に、SalIで消化した。大きなベクターフ ラグメントを精製し、そして精製されたRTまたはRT.15フラグメントのいずれか と連結した。得られた構築物を、E.coli DH10Bに導入した。正しい挿入物を有す るクローンを取っておいた。このクローンを、pTrcRTおよびpTrcRT.15と呼んだ 。 tacプロモーター下のRT発現。RSV RTβp4発現の誘導のためのIPTG（1mM）添加 前に、pTrcRTまたはpTrcRT.15を有するE.coli細胞を、緩衝化リッチ(rich)培地 中で37℃で、0.1または0.6のA590まで増殖させた。細胞を、誘導の２時間後に収 集した。非誘導培養物を、いずれの誘導物質の添加もなく同様に増殖させた。可 溶性細胞抽出物中のRT酵素活性は、λpLプロモーターを有する構築物から得られ た活性と等価であった。 発現されたタンパク質のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動。RSV RTは、分 子量94kD(β)および62kD(α)の２つのサブユニットからなる。αサブユニットは 、βサブユニットに由来するタンパク質分解フラグメントである。タンパク質分 解を、インビボでRSV p15プロテアーゼにより達成する。しかし、記載されたプ ラスミドを有する誘導E.coli抽出物を調べた場合、分子量75kDおよび62kDの２つ の誘導タンパク質が検出された。両方のタンパク質は、主に、E.coli抽出物不溶 性画分にあることが見出された。E.coliにおける発現後の、75kDタンパク質の存 在および期待された94kDタンパク質の非存在は、（ｉ）未熟な翻訳終結を引き起 こすカルボキシ末端近くの変異があったか、（ii）E.coliサイトゾルにおいてタ ンパク質分解があったか、または（iii）RTの内部翻訳開始があったことを示唆 した。RT遺伝子のカルボキシ末端領域を配列決定した場合、未熟な翻訳終結を引 き起こし得た変異は見出されなかった。内部翻訳開始があったか否か試験するた めに、RT遺伝子を、HpaI-XhoIフラグメントとしてSmaIおよびSalI消化pTrc99に クローニングした。誘導タンパク質は検出され得ず、これは、75kDまたは62kDタ ンパク質のいずれかを生じる内部開始はなかったことを示唆した。 種々のE.coli宿主におけるRT発現。上記のように、RSV RT発現を、E.coli DH1 0B、CJ374、およびBL21において調べた。これらのE.coli宿主のいずれもαβRT を生成せず、そして各宿主におけるRT活性レベルは極端に低かった。M-MLV RTは E.coli N4830において十分に発現し、そしてHIV RTはE.coli RRlにおいて十分に 発現するので、これらの２つの宿主におけるRSV RTの発現レベルを調べた。これ らの宿主のいずれも、試験された他の宿主より活性RTを少しもよく発現しないこ とが見出され、それらは、いずれの完全長94kDタンパク質も生成しなかった。 融合タンパク質としてのRTの発現。E.coliにおいてあまり発現しないいくつか のタンパタ質が翻訳融合体として十分に発現されることは、現在十分に確立され ており、ここで十分に発現される遺伝子に由来するタンパク質は、融合タンパク 質のアミノ末端を形成する。１つのこのような融合パートナーであるチレドキシ ンの遺伝子は、pTrxfus(Genetics Institute;Cambridge,MA)と呼ばれるベクター に存在する。従って、チレドキシンと融合されたRSV RTβp4の発現レベルを調べ た。 バキュロウイルス系においてRSV RTを発現する過程において、RSV RT遺伝子フ ラグメントを、SmaI-XhoIフラグメントとしてpBacPAK9においてクローニングし て、pBacPak-RTを構築した（以下を参照のこと）。チレドキシン融合体を作製す るために、pBacPak-RTを、XmaI（SmaIと同じ認識）およびPstIで消化し、そして RTフラグメントを、アガロースゲルにおいて精製した。ベクターpTrxfusをXmaI およびPstIで消化し、そして大きなベクターフラグメントを精製した。精製フラ グメントを連結し、そしてE.coli CJ374およびGI724またはGI698(Genetic Insti tute,MA)を、連結された物質で形質転換した。正しい挿入物を有するクローンを 取っておいた。培養物を誘導し、そして細胞抽出物を酵素活性についてアッセイ した場合、RT活性は検出されなかった。しかし、両方の誘導培養物は、抽出物の SDS-PAGEにより判断されるように、期待サイズの多量の不溶性融合タンパク質を 生成した。他の融合体もまた試験した。RSV RTβ遺伝子を、GST（グルタチオンS トランスフェラーゼ）遺伝子に融合し、そしてRSV RTα遺伝子を、λCROタンパ ク質遺伝子に融合した。E.coli DH10B株におけるtrcプロモーターからのどちら の融合体発現も、適切な分子量の多量の不溶性タンパク質をもたらしたが、RT活 性は、誘導細胞抽出物においてほとんど検出されなかった。両方の融合体（GST- βおよびCRO-α）を有する発現ベクター（ここで、融合体はtrcプロモーター誘 導により同時発現された）を構築した。E.coli DH10B株における両方の融合体の 同時発現は、適切な分子量の多量の不溶性タンパク質をもたらしたが、RT活性は ほとんどなかった。 バキュロウイルス系におけるRSV RTサブユニットα、β、およびβp4をコードす る遺伝子のクローニングおよび別々の発現 バキュロウイルス系におけるRSV RTβp4のクローニング RSV RTβp4遺伝子をバキュロウイルス転移(transfer)ベクターpBacPAK9(Clont ech)においてクローニングするために、RSV RT遺伝子フラグメントをPCRにより 作製した。このPCRを容易にするために、以下のオリゴヌクレオチドを、RSV RT βp4遺伝子の初めにBamHI部位（太字）およびATG開始コドンを有して設計した： オリゴヌクレオチド＃12および＃16（それぞれ、配列番号18および22）を、鋳 型としてpJD100を用いるPCRのために使用した。PCR産物をBamHIおよびXbaIで消 化し、次いで、BamHIおよびXbaIで消化されたpBacPAK9に連結した。クローンpBP -RT(PCR)（図43）のうちの１つを、さらなるクローニングのために使用した。RT 遺伝子全体を再構成するために、pBP-RT(PCR)の小さなHpaI-XhoIフラグメントを 、pRE1-RT.15の2500bp HpaI-XhoIフラグメントと置換した。再構成されたプラス ミドを、pBP-RT(ATG)（図44）と呼んだ。 pBacPAK-RT(ATG)におけるp15のクローニング。pBP-RT(ATG)においてRSV p15プ ロテアーゼ遺伝子を配置することを、３段階クローニングにより達成した。第１ に、p15遺伝子フラグメントを、KpnI-SalIフラグメントとしてpUC19-p15（上記 を参照のこと）からpSport1(LT1)にサブクローニングして、pSport-p15を作製し た。第２に、p15フラグメントを、NotI-SmaIフラグメントとしてpSport-p15から バキュロウイルス転移ベクターpAcUW43にサブクローニングして、pAcUW43-p15を 作製した。p15遺伝子をp10プロモーター下に導入するために、このクローニング を行った。最後に、p10プロモーターを含むp15遺伝子を、XhoI-NotIフラグメン トとしてpAcUW43-p15からpBP-RT(ATG)にサブクローニングして、pBP-RT15(ATG) （図45）を作製した。 昆虫細胞におけるRSV RTβp4の発現。昆虫細胞(SF9)を、pBP-RT15(ATG)および 線状化バキュロウイルスベクターDNA（BaculoGold,Pharmingen）の混合物でトラ ンスフェクトした。この系において、pBP-RT15(ATG)プラスミドとバキュロウイ ルスDNAとの間の組換えは、ポリヘドリンプロモーター下流にRSV RTβp4遺伝子 を有する組換えウイルスゲノムをもたらす。組換えウイルスを標準的な技術によ り上清から単離し、そしてウイルスストックを作り、これらを１つのさらなる研 究のために選択した。昆虫細胞を純粋なウイルスストックで感染し、そして感染 細胞を、感染後の種々の時間で採集した。RT活性は、感染細胞において容易に検 出可能であった。 RNaseH-RSV RTの作製。RSV RTβp4遺伝子のRNaseH領域における変異の作製は 、上記の実施例１において詳細に記載される。変異をpBP-RT(ATG)に導入するた めに、pBP-RT(ATG)のHpaI-KpnIフラグメントを、M13RTH-（図13）のHpaI-KpnIフ ラグメントと置換した。新たに構築されたプラスミドを、pBP-RT(H-)ATGと呼ぶ 。昆虫細胞(Sf9)を、pBP-RT(H-)および線状化バキュロウイルスベクターDNA（Ba culoGold,Phamingen）の混合物でトランスフェクトした。pBP-RT(H-)プラスミド とバキュロウイルスDNAとの間の組換えは、ポリヘドリンプロモーター下流にRSV RTβH-p4遺伝子を有する組換えウイルスゲノムをもたらす。組換えウイルスを 標準的な技術により上清から単離した。昆虫細胞をウイルスストックで感染し、 そして感染細胞を、感染後の種々の時間で採集した。RT活性は、感染細胞におい て容易に検出可能であった。 ヒスチジンタグのRSV RTβp4への付着。pBP-RT(H-)をBamHIおよびXbaIで切断 し、そしてRSV RTβp4遺伝子のアミノ末端を有する0.9kbフラグメントを、pFast BacHTにBamHI-XbaI部位でクローニングし、アミノ末端にヒスチジンタグを有す るβp4部分構築物を（翻訳融合により）創作した（pFBHTβp4）。pBP-RT(H-)に 由来するRSV RTβH-p4カルボキシ末端を有する２kb XbaI-XhoIフラグメントを、 pFBHTβp4のXbaI-XhoI部位に挿入し、pFBH-Tβp4を創作した。pFBH-Tβp4をE.co 1i DH10Bac細胞に形質転換し、そしてHisタグ化RS VRTβH-p4遺伝子をバクミド に転位させた。バクミドDNAを単離し、そしてSf9昆虫細胞にトランスフェクトし た。感染細胞培養物のためのウイルス調製物を使用してSF21細胞を感染し、そし て感染細胞に由来するHisタグ化RSV RTβH-p4を単離し、そして特徴付けた。 昆虫細胞のトランスフェクション。Sf9細胞のトランスフェクションを、Bacul ogold virus（Pharmingen,CA）およびpBP-RT(H-)ATGを用いて行い、組換えウイ ルスを作製した。２個の６ウェル(60mm)組織培養プレートにおける10個のウェル に、１×106個のSf9細胞(LTI)を播種した。細胞を、27℃で30分間付着させた。 細胞が付着している間、各々200μlのSf-900II SFM培地(LTI)を含む10個のチュ ーブを用意した。チューブ１において、500ngのBaculogoldおよび２μgのpBP-RT (H-)ATGを添加した。チューブ２において、250ngのBaculogoldおよび１μgのpBP -RT(H-)ATGを添加し；そしてチューブ３において、125ngのBaculogoldおよび500 ngのpBP-RT(H-)ATGを添加した。チューブ６〜９は、36μlのリポフェクチン(LTI )を含んだ。チューブ１、チューブ２、チューブ３、チューブ４、およびチュー ブ５の内容物を、それぞれ、チューブ６、７、８、９、および10に移した。これ らのチューブの各々に、2mlのSf-900 II SFMを添加した。各ウェルから培養培地 を除去し、そして２mlのDNA/リポフェクチン混合物を２つのウェルに分配した（ 各１ml）。従って、チューブ１および６、２および７、ならびに３および８の混 合物を含むウェルは、異なる量のDNA混合物を含み；チューブ４および９の混合 物を含むウェルは、リポフェクチンを含むが、DNAを含まないコントロールであ り；そしてチューブ５および10の混合物を含むウェルは、DNAもリポフェクチン も含まないコントロールであった。プレートを27℃で４時間インキュベートし、 培地を除去し、そして４mlの新鮮なSf-900 II SFMと置換し、そしてプレートを2 7℃でさらに72時間インキュベートした。DNA含有ウェルからのファージ上清を取 り出し、そして１次ファージストックとして印を付けた。第２の感染を、組換え ファージを増幅するために、１×106個のSf9細胞を１mlの１次ファージストック で感染することにより行った。プレートを27℃で48時間インキュベートし、そし てファージストックを収集した。 昆虫幼虫のインジェクション。Trichoplusa ni幼虫に、pBP-RT(H-)ATGを有す る組換えウイルスを注射し、そして幼虫を記載されたように採集した（Medin,J. A.ら、Methods in Molecular Biology 39:26(1995)）。 バキュロウイルス系におけるRSV RTαH-発現 pDA（図19）をE.coli DH10Bac細胞に形質転換し、RTαH-遺伝子をバクミドに 転位し、そしてバクミドDNAを精製し、そしてSF21昆虫細胞にトランスフェクト した。感染細胞培養物からのウイルス調製物を使用してSF21細胞を感染し、そし て感染細胞からRSV RTαH-を単離し、そして特徴付けた。 バキュロウイルス系におけるRSV RTβH-His発現 pDABH-His（図21）をRsrIIおよびPstIで切断し、そしてβH-His遺伝子を有す る2.6kbフラグメントを、pFastBacのRsrII-PstI部位にクローニングした。pFBBH -HisをE.coli DH10Bac細胞に形質転換し、RTβH-His遺伝子をバクミドに転位し 、そしてバクミドDNAを精製し、そしてSF21昆虫細胞にトランスフェクトした。 感染細胞培養物からのウイルス調製物を使用してSF21細胞を感染し、そして感染 細胞からRSV RT βH-Hisを単離し、そして特徴付けた。 ポリメラーゼ活性部位が変異されたRSVαβRTをコードする遺伝子のクローニン グおよび発現 ポリメラーゼドメインにおいて変異されたRSV RTの作製。RSV RTペプチド配列 とHIV RT、M-MLV RTに由来する配列、および他のRT遺伝子の配列とのアラインメ ントは、RSV RTポリメラーゼドメインにおける触媒残基のうちの１つの有望な位 置であるD110（110位のアスパラギン酸残基）を明らかにした。文献によれば、H IV RTの大きな鎖における対応アミノ酸の、Ｄ（アスパラギン酸）からＥ（グル タミン酸）への変異は、ポリメラーゼ活性のほぼ全ての喪失をもたらした。１本 鎖DNAを、E.coli DH5αF'IQ/pJB-His細胞のM13KO7での感染によりpJB-Hisから単 離し、そしてこのDNAを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、位置指定変異誘 発（詳細なプロトコルについては実施例１を参照のこと）により変異した： このオリゴヌクレオチドは、RSV RT触媒ドメインの110位アスパラギン酸残基の グルタミン酸への変異（D110E）を誘導し、そしてSstI部位（太字）を付加して 、プラスミドpJBD110E-His（図48）を形成する。pJBD110E-His由来460bp NheI-E co 47IIIフラグメントを、NheI-Eco47III切断pDAの6.5kbフラグメントに挿入するこ とにより、この変異部位をRSV RTα遺伝子に導入し、pDAD110E（図49）を形成し た。460bp NheI-Eco47IIIフラグメントを、NheI-Eco47III切断pFBBH-His（図４6 ）に挿入することにより、D110E変異もまたβ遺伝子に導入し、pFBBD110E-His（ 図50）を形成した。2.6kb RSV RTβD110E遺伝子を、2.6kb RsrII-EcoRIフラグメ ントとしてpFBBD110E-HisからpDABHis（図51）にクローニングし、RSV RTβ-His 遺伝子を置換し、pDABD110EHis（図52）を形成した。pDABHisをXhoI+PvuIで切断 し、そしてβ遺伝子を有する4.6kbフラグメントを、4.9kbのpDAD110E XhoI-PvuI フラグメントに連結し、pDAD110EBHis（図53）を形成した。βD110E遺伝子を有 する4.6kbのPDABD110EHis XhoI-PVUIフラグメントを、4.9kbのpDAD110E XhoI-Pv uIフラグメントに連結し、pDAD110EBD110E（図54）（その短縮名にかかわらずhi sタグを有する）を形成した。pDAD110EBHis、pDABD110EHis、およびpDAD110EBD1 10Eを、E.coli DH10B-Bacに形質転換し、RT遺伝子をバクミドに転位し、そして バクミドDNAを精製し、そしてSF21昆虫細胞にトランスフェクトした。感染細胞 培養物からのウイルス調製物を使用してSF21細胞を感染し、そして感染細胞から RSV RTを単離し、そして特徴付けた。 ３つの変異体プラスミドを以下の表に要約し、ここで「w.t.」は110位の野生 型アミノ酸（Ｄ、アスパラギン酸）をいい、そしてD110Eは110位の変異（Ｄから Ｅ、グルタミン酸）をいう： プラスミド α β pDABHis w.t. w.t. pDABD110EHis w.t. D110E pDAD110EBHis D110E w.t. pDAD110EB110E D110E D110E 酵母におけるRSV RTβp4 RTのクローニングおよび発現 RSVβp4 RT遺伝子のクローニング。InVitrogen(CA)から入手可能なpHIL-D2ベ クターをEcoRIで消化し、クレノウフラグメントで平滑末端化し、そしてアルカ リホスファターゼで処理した。pREI-RT.15をNdeIで消化し、クレノウフラグメン トで平滑末端化した。NdeI消化は、p15プロテアーゼ遺伝子を有さない全RSV RT 遺伝子を生じた。フラグメントを連結し、そしてE.coli DH10Bを連結混合物で形 質転換した。正しいクローンを、適切な挿入および方向について選択した。試験 された８つのクローンのうち２つは、正しい方向でRT遺伝子フラグメントを有し た。クローンのうちの１つ、pHILD2-RTを、さらなる調査のために使用した。こ のプラスミドにRNaseH-ドメインを導入するために、pHILD2-RTをBamHI+XhoIで消 化し、そして野生型フラグメントを、pBacPAK-RT(H-)ATGに由来するBamHI-XhoI フラグメントで置換した。最後のクローンをSstIIでスクリーニングした。この クローンを、pmLD2-RT(H-)と呼んだ。 Pichia pastorisの形質転換。Pichia pastoris GS115(InVitrogen)を、InVitr ogenにより推奨されるプロトコルに従って形質転換に使用した。プラスミドpHIL D2-RTおよびpHILD2RT(H-)をNotIで消化し、フェノール-クロロホルム抽出し、そ して形質転換前にエタノール沈殿した。形質転換は、再生プレートにおいて野生 型RSV RTについては20のクローンおよびRSV H-RTについては12のクローンを生じ た。これらのクローンを、メタノール含有プレートにおけるそれらの増殖につい てスクリーニングした。２つの推定クローンを最初の20クローン（野生型RT）か ら選択した。これらの２つのうちの一方であるH1は、メタノール中で完全に増殖 し得ず、そして他方のH2は、メタノール中で非常にゆっくりと増殖し得た。RSVH -RTクローンについては、３つのクローンを、スクリーニングされた12個から選 択した。クローンのうちの１つであるH-3は、メタノール中で非常にゆっくりと 増殖した。その他のH-4およびH-5は、メタノール中で適度に増殖した。クローン H1およびH-3を、発現研究のために選択した。 Pichia pastorisにおけるRSVβp4 RT発現。クローンH1およびH-3を増殖し、そ して本質的に、製造者(Invitrogen)により提供される使用者マニュアルに記載さ れたように誘導した。コントロールとして、β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むG S115(InVitrogen)を増殖し、そしていっしょに誘導した。RT活性は、GS115/β-g al細胞において検出され得なかったが、一方、かなりのレベルの活性が、H1（野 生型RT）およびH-3（H-RT）細胞の両方において検出された。さらに、活性は、 誘導時間の増加と共に増大した。 RSVββ、α、およびβp4βp4の単離 RSVββRT単離。RSVββRTを、以下を除いて、RSVαβRTについて実施例２に 記載されたように精製した。RSVββRTを、55〜62％緩衝液ＴのAF-Heparin-650M カラムから、および58〜62％緩衝液ＪのMono S HR 5/5カラムから溶出した。RSV ββRTは、SDS-PAGEにより判断されるように90％均一であった。 RSVαRT単離。RSVαRTを、以下を除いて、RSVαβRTについて実施例２に記載 されたように精製した。Chelating Sepharose Fast Flowカラムを100％緩衝液Ａ で平衡化し、そして清澄化粗抽出物をカラムに通過させた後、100％緩衝液Ａで 洗浄した。RSVαRTを、100％緩衝液Ａ〜75％緩衝液Ａ＋25％緩衝液Ｂの10カラム 容量の線状勾配を用いて溶出した。Chelating Sepharose Fast Flowカラムから のRT活性のピーク画分（11〜20％緩衝液Ｂ）をプールし、ジチオスレイトールお よびEDTAを、それぞれ、最終濃度１mMおよび0.1mMを達成するようにプールに添 加し、そしてプールを、95％緩衝液Ｓ＋５％緩衝液Ｔに対して一晩透析した。透 析されたプールを、緩衝液Ｓ中で平衡化された22ml AF-Heparin-650Mカラムにロ ードした。９カラム容量の95％緩衝液Ｓ＋５％緩衝液Ｔを用いた洗浄後、カラム を、95％緩衝液Ｓ＋５％緩衝液Ｔから60％緩衝液Ｓ＋40％緩衝液Ｔの９カラム容 量線状勾配で溶出した。RT活性のピーク画分（10〜12％緩衝液Ｊ）をプールし、 そして97.5％緩衝液Ｈおよび2.5％緩衝液Ｊに対して３〜４時間透析した。透析 されたプールを、100％緩衝液Ｈ中で平衡化された3.5mlホスホセルロースカラム （Whatman）にロードした。12カラム容量の97.5％緩衝液Ｈおよび2.5％緩衝液Ｊ を用いた洗浄後、カラムを、97.5％緩衝液Ｈおよび2.5％緩衝液Ｊから60％緩衝 液Ｈ＋40％緩衝液Ｊの14カラム容量線状勾配で溶出した。RT活性のピーク画分（ 12〜20％緩衝液Ｊ）をプールし、そして99％緩衝液Ｓおよび１％緩衝液Ｔに対し て一晩透析した。透析されたプールを、緩衝液Ｓ中で平衡化されたMono S HR 5/ 5カラムにロードした。10カラム容量の100％緩衝液Ｓを用いた洗浄後、カラムを 、100％緩衝液Ｓから75％緩衝液Ｓ＋25％緩衝液Ｔの20カラム容量線状勾配で 溶出した。RTピーク画分（15〜17％緩衝液Ｔ）をプールし、そして貯蔵緩衝液に 対して一晩透析し、そして-20℃で貯蔵した。RSVαRTは、SDS-PAGEにより判断さ れるように80％均一であることが見出された。 RSVβp4βp4 RT単離。RSVβp4βp4 RTを、以下を除いて、RSVαβについて実 施例２に記載されたように精製した。Chelating Sepharose Fast Flowカラムか らのプールされたRT画分を、90％緩衝液Ｈおよび10％緩衝液Ｊに対して一晩透析 した。RSVβp4βp4 RTは、この緩衝液中で沈殿した。RTを遠心分離により回収し 、0.5M KClを含む貯蔵緩衝液に溶解し、そして-20℃で貯蔵した。RSVβp4βp4 R Tは、SDS-PAGEにより判断されるように＞95％均一であることが見出された。 バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるα、αβ、およびββRSV RT量の評価 実施例２に記載のクロマトグラフィー方法を使用して、ウイルス感染昆虫細胞 からの粗抽出物に存在するいずれのα、αβ、およびββRSV RTでも分離および 単離し得る。RSV RTαは、Chelating Sepharose Fast Flowカラムにおけるクロ マトグラフィーにより他の２つの酵素形態から分離でき、ここでαは、＜30mMイ ミダゾールで結合も、溶出もせず、そしてαβおよびββは、＞50mMイミダゾー ルで共に溶出する。これは、βに存在するが、αには存在しないHis6タグにより 可能である。RSVαβおよびββRTは、Heparin-650Mにおけるクロマトグラフィ ーにおより引き続き分離可能である（αβは0.45M KClで溶出し、そしてββは0 .58M KClで溶出する）。逆転写酵素を、ポリ(C)・オリゴ(dG)を用いるアッセイ （Gerard,G.F.ら、Biochemistry 13:1632(1974)）により定量する。ポリ(C)・オ リゴ(dG)を用いたRSV RTα、αβおよびββの比活性は、それぞれ、140,000、9 0,000、および6,000単位/mgタンパク質である。 RSVウイルスプロテアーゼp15のクローニング、発現、精製、および使用 RSVウイルスプロテアーゼを、E.coliにおいて連結ダイマーとしてクローニン グおよび発現し、そして記載されたように（Bizub,D.ら、J.Biol.Chem.266:4951 991）封入体から精製した。 RSVβp4 RTをRSVプロテアーゼで消化するために使用した反応混合物（25μl） は、100mM NaPO4(pH6.0〜7.0)、１mM 2-メルカプトエタノール、0.01％(W/V)Tri ton X-100、2.4M NaCl、５μg RSVβp4 RT、および５μg RSVプロテアーゼを含 んだ。インキュベーションは、４℃で１〜16時間であった。消化産物を、SDS-PA GEにより、およびRT活性回収のアッセイにより分析した。 RSV RTのRNaseHの活性アッセイ RSV RTのRNaseH活性を、[3H]ポリ(A)・ポリ(dT)における[3H]ポリ(A)可溶化を モニターすることにより決定した。反応混合物(50μl)は、50mM Tris-HCl(pH8.4 )、20mM KCl、10mM MgCl2、[3H]ポリ(A)・ポリ(dT)における各10μMの[3H]ポリ( A)(300cpm/pmol)およびポリ(dT)、ならびに10mMジチオスレイトールを含んだ。 反応混合物を、37℃で20分間インキュベートした。インキュベーションを、80μ lの20％(W/V)TCAおよび10μlの１mg/mlt RNAの添加により終結させ、そして遠心 分離後、可溶化[3H]ポリ(A)量を、水性シンチレーション液中で上清を計数する ことにより決定した。RNaseH活性１単位は、37℃、20分で1nmoleの[3H]ポリ(A) を可溶化する酵素量であった。 ポリ(C)・オリゴ(dG)12-18を用いたDNAポリメラーゼ活性のアッセイ RSV RTのRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を、酸不溶性[3H]ポリ(dG)形態のポリ (C)・オリゴ(dG)の合成をモニターすることにより決定した。反応混合物(50μl) は、50mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、10mM MgCl2、0.5mMポリ(C)、0.2mMオリ ゴ(dG)12-18、0.5mM[3H]dGTP(40cpm/pmole)、ならびに10mMジチオスレイトール を含んだ。反応物を37℃で10分間インキュベートし、そして標識産物をGF/Cガラ スフィルター上に酸沈殿させ、これをシンチレーションカウンターにおいて計数 した。DNAポリメラーゼ活性１単位は、37℃、10分で１nmoleの[3H]dGTPを取り込 む酵素の量であった。 結果および考察 RSVαβRTを作製する代替方法 実施例１〜６は、トリRTのRNaseH-形態が、mRNAをコピーすることにおいてRNa seH+RTより効率的であることを証明した。本実施例において示される研究は、い くつかの発現系におけるRSVαおよびβ遺伝子の同時発現により作製されたRSV R NaseH-αβRTによる・RNAコピー効率を決定するために設計された。 E.coliにおける発現。少量の可溶性および活性なα、ββ、βp4βp4、および αβRSV RTは、E.coliから精製されている（Alexander,F.ら、J.Viol.61:534(19 87);Weis,J.H.およびSalstrom,J.S.,米国特許第4,663,290号(1987)；Soltis,D.A .およびSkalka,A.M.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85:3372(1988)；ならびにCherhov,A .P.ら、Biomed Sci.2:49(1991)）。しかし、これらの以前の報告のE.coliにおい て発現された大部分のRSV RTは、不溶性形態であった。 E.coliから容易に精製されるRSV RTタンパク質の量を発現する本努力は、本実 施例の材料および方法の節において報告される。一般的に、以前に公表された結 果と類似する結果が得られ；すなわち、E.coliにおいて発現された大部分のRSVR Tタンパク質は不溶性であり、そして少量のRT活性しか観察されなかった。低いR Tレベルのため、E.coliにおいて発現されたRSV RTを精製することは試みられな かった。 培養昆虫細胞におけるRSV RTβp4またはβ遺伝子の発現。ヘテロダイマーp66/ p51 HIV RTは、クローン化されたHIV p66遺伝子が発現された場合、E.coliおよ び酵母宿主細胞において生成された（Lowe,D.M.ら、Biochemistry 27:8884(1988 )；Muller,B.ら、J.Biol.Chem。264：13975(1989)；およびBarr,P.J.ら、BioTec hnology 5:486(1987)）。ヘテロダイマー形成は、内因性宿主プロテアーゼによ るp66/p66のタンパク質分解プロセシングにより起こる。対照的に、培養昆虫細 胞におけるHIV RT p66遺伝子の発現は、p66/p66ホモダイマーのみを生じた（Kaw a,S.ら、Prot.Expression and Purification 4:298(1993)）。 本研究において、培養昆虫細胞におけるRSV RTβp4遺伝子の発現は、ホモダイ マーβp4βp4の生成のみをもたらすことが同様に見出され（データは示さず）； αβまたはαへのプロセシングはほとんど観察されなかった。しかし、RSV RTβ 遺伝子がこれらの細胞において発現された場合、RSV RTの３つ全ての形態が生成 された（表６）。細胞に存在する大部分のRTはββであり（50〜80％）；少量の αβが生成され（約10％）；そしてαでさえも得られた（10〜40％）。これらの 結果は、培養昆虫細胞における内因性宿主プロテアーゼがββをタンパク質分解 してαβにするが、βp4βp4をタンパク質分解してαβにしないことを示唆する 。ββのタンパク質分解により作製されたRSVαβRTは、RSV RTαおよびβ遺伝 子の同時発現より生成されたαβより非常に低い機能的活性を有した（表７）。 表６．RSV RTβ遺伝子で感染された昆虫細胞におけるRSV RTの発現レベル 昆虫幼虫におけるRSV RTβp4の発現。RSV RTβp4遺伝子を有するバキュロウイ ルスはまた、ウイルスの物理的注入により生きている幼虫を感染するために使用 された。幼虫および幼虫抽出物に存在するプロテアーゼレベルは、培養昆虫細胞 に存在するプロテアーゼレベルより非常に高い。βp4の、タンパク質分解RTの複 数形態へのプロセシングは、αへのプロセシングを含めて観察された。これらの 抽出物から精製され得たRTの主な種は、SDS-PAGE上で97kDa（Hisタグ化β）、87 kDa（タンパク質分解されたβ）、67kDa（部分的にプロセシングされたHisタグ 化α）、および62kDa（Hisタグがタンパク質分解により除去されたα）に移動し た、４つの主なバンドを有した。このRSV RTは、RSVαβRTに匹敵する、55,000 単位/mgタンパク質の比活性を有した。しかし、機能的活性アッセイ（実施例３ ）において、幼虫から精製されたRTは、αおよびβの同時発現により生成された RSVαβRTの総産物および完全長産物の機能的活性の、それぞれ85％および60％ を有した（表７）。 培養昆虫細胞におけるRSV RTβp4およびRSVプロテアーゼp15の同時発現。ヘテ ロダイマーp66/p51 HIV RTは、HIVプロテアーゼおよびHIV RTp66の同時発現によ りE.coliにおいて効率的に生成された（Mizuahi,V.ら、Arch.Biochem Biophys.2 73:347(1989)、ならびにLe Grice,S.F.J.およびGruninger-Leitch,F.,Eur.J.Bio chem.187:307(1990)）。ウイルスプロテアーゼの同時発現は、p66/p66をヘテロ ダイマーに変換する全効率を増大させた。本実施例の材料および方法の節に上記 のように、E.coliにおけるRSV RTβ遺伝子およびRSVプロテアーゼp15遺伝子の同 時発現は、RSVαβRT生成の増強をもたらさなかった。同様に、培養昆虫細胞に おけるRSV RTβp4およびRSVプロテアーゼp15の同時発現は、認め得るほどに、RS VαβRT形成を増強しなかった。 インビトロでのRSVプロテアーゼp15を用いたRSV RTβp4プロセシング。ヘテロ ダイマーp66/p51 HIV RTは、インビトロでのHIVプロテアーゼを用いた処理によ り、E.coliから精製されたp66から生成された（Chattopodhyay,D.ら、J.Biol.Ch em.267:14227(1992)）。精製されたRSV RTβp4をRSVプロテアーゼp15で処理して 、RSVαβRTを作製した。このアプローチは、SDS-PAGE分析に基づいてβp4から いくつかのαβを作製することに成功したが、いくつかの困難に直面した。第１ に、HIV p66 RTのウイルスプロテアーゼ処理で観察されたものとは反対に、タン パク質分解が進行するにつれて、βより多いαが形成されたので、βp4からαβ へのプロセシングは、常にαβで止まるとは限らなかった。第２に、DNAポリメ ラーゼ活性の有意な喪失がタンパク質分解間に観察され、これは、RSV RTが、RS Vプロテアーゼにより必要とされる酸性pH反応条件により部分的に不活化された ことを示唆する。 インビトロでのキモトリプシンを用いたRSV RTβp4のプロセシング。ヘテロダ イマーp66/p51 HIV RTはまた、α-キモトリプシンを用いた限定したタンパク質 分解により、p66から生成された（Lowe,D.M.ら、Biochemistry 27:8884(1988)） 。このアプローチは、RSV RTβp4を用いて首尾良く試されなかった。本発明者ら は、α-キモトリプシンを用いたβp4消化が制御しにくいことを見出し、そして タンパク質分解は、αβで止まらないが、βp4からαへの変換まで進むことが観 察された。 αβを作製するためのRSV RTαおよびβの（インビトロでの）混合。ヘテロダ イマーp66/p51 HIV RTは、p51単独およびp66単独を含む別々の粗細胞溶解物を混 合することにより生成された（Stahlhut,Mら、Protein Expression and Purific ation 5:614(1994)）。別々のサブユニットの混合は、p66/p51の1:1モル濃度の 複合体の形成をもたらす。対照的に、精製RSVαRTと精製RSVβRTとの、約1:1モ ル濃度比での混合は、αβ複合体の形成をもたらさなかった。これらの結果は、 RSVサブユニットは、一旦、活性な立体配座で別々にフォールディングされると 、混合された場合、分離したままであることを好むという考えと一致する。 RNAをコピーする種々の形態のRSV RTの相対的能力 ４つの異なる形態のRSV RT（αβ、ββ、α、およびβp4βp4）の、RNAをコ ピーする能力を比較した。これらの酵素における各サブユニットのRNaseH活性部 位を、RNaseH活性を排除するように変異した。各RTを、上記の方法および実施例 １の方法により、培養昆虫細胞において発現し、そして精製した。２つのRNAを 比較のために使用した：合成ホモポリマーポリ(A)および7.5Kb mRNA。鋳型-プラ イマーとしてポリ(A)・オリゴ(dT)を用いて、制限(limiting)酵素濃度で触媒され たポリ(dT)合成の初速度を決定し、次いで、反応におけるRTの所定量(mg)に対し てこの速度を正規化することにより、比活性を計算した。この比活性は、所定の RTが人工鋳型を用いて単一デオキシヌクレオチドを取り込む能力を単に示し、そ してこの酵素がヘテロポリマーRNAをコピーする能力を必ずしも示さない。7.5Kb RNAを鋳型として用いて、RTが長いヘテロポリマーRNAの完全長コピーを作製す る能力を評価した（詳細については実施例３を参照のこと）。結果を、上記の表 ７において示す。 αβの２つの異なる形態を、表７において特徴付けた。一方の形態は、RSV RT β遺伝子の発現、および後の宿主昆虫細胞におけるタンパク質分解プロセシング の結果として生成され、そして低減した比活性および機能的活性を有した。他方 の形態のαβは、RSV RTαおよびβ遺伝子の同時発現により生成された。この形 熊のαβは、αと同様の比活性である約50,000単位/mgを有し、そしてββまた はβp4βp4（約16,000単位/mg）のいずれかより高い比活性を有した。このαβ と他のRT形態との機能的活性比較は、非常により劇的な対比を示した。RSVαβT Rは、7.5Kb RNAから、ββ、βp4βp4、およびαより、それぞれ７、９、および 15倍多い総cDNA/酵素量を生じた。完全長産物の収量を評価した場合、いっそう 大きな差違が観察された：RSVαβTRは、ββ、βp4βp4、およびαより、それ ぞれ21、13、および146倍多い完全長産物／酵素量を生じた。従って、RSV RTαH -およびβH-遺伝子の同時発現により生成されたRSVαβTRは、類似方法により調 製された任意の他の形態のRSV RTより、mRNAをコピーすることにおいて非常に効 率的である。 RSVαβTRのαサブユニットのみが活性である証拠 HIV RTヘテロダイマーp66/p51の選択的DNAポリメラーゼ活性部位変異誘発は、 p66のDNAポリメラーゼ活性部位のみがDNAポリメラーゼ活性に非常に重要である ことを示した（LeGrice,S.F.J.ら、The EMBO Journal 10:3905(1991)およびHost omsky,Z．ら、J.Virol.66:3179(1992)）。HIV p66/p51ヘテロダイマーのp51サブ ユニットは、基質結合の裂け目(cleft)を有さず、従って、直接的にdNTPの結合 および取り込みに関与しない立体配座を明らかにとる（Jacob-Molina,A.ら、Pro c.Nat.Acad.Sci.USA90:6320(1993)）。 本研究において、RSVαβRTについて同じ質問をした。この場合、各サブユニ ットが、DNAポリメラーゼおよびRNaseH活性部位の両方を含むので、DNAポリメラ ーゼ変異体単独およびRNaseH変異体単独の組み合わせを特徴付けた。結果を表８ に示す。 表８．種々の形態のRSV RTのポリメラーゼDNAおよびRNaseH活性 表８に示すように、両サブユニットにおけるRNaseH活性部位を、RNaseH活性を 排除するように変異した場合、精製酵素におけるRNaseH活性は検出可能レベル以 下に低減されたが、一方、DNAポリメラーゼ活性は変化しなかった。βにおけるR NaseH活性部位を同じ変異により変え、そしてαRNaseH活性部位は野生型であっ た場合、酵素は、ポリメラーゼ活性およびRNaseH活性において野生型と同様であ った。対照的に、RNaseHにおけるαサブユニットの変異は、RNaseH活性において 200倍の低減をもたらしたが、βサブユニットの変異は低減をもたらさなかった 。従って、RSVαβRTの場合、大サブユニット（β）のRNaseHドメインは、不活 性な立体配座でフォールディングする。RSVαβRTのDNAポリメラーゼ活性部位変 異体の調査は、同じ結果を示した（表８）。αサブユニットは、DNAポリメラー ゼ触媒活性を与えるが、βサブユニットは与えない。そのため、HIVp66/p51RTと は対照的に、より小さいRSVαβRTサブユニットは酵素活性を維持し、より大き いRSVαβRTサブユニットは酵素活性を維持しない。両酵素における共通要素は 、DNAポリメラーゼおよびRNaseHドメインを有するサブユニットが、活性な立体 配座でフォールディングするが、一方、RNaseHドメインを欠くか、またはさらな るド メイン（インテグラーゼ）を有するサブユニットが、不活性な立体配座にフォー ルディングすることである。 要するに、これらの結果は、αβ形態のASLV RTのみがmRNAを効率的にコピー することを証明する。さらに、本結果は、E.coliにおけるASLV RT発現が、活性R T生成をほとんどまたは全くもたらさないが、一方、昆虫細胞および酵母におけ るASLV RTのクローニングおよび発現により、発現および活性が劇的に増大する ことを示す。最後に、RSVαβRTのαまたはβサブユニットのDNAポリメラーゼま たはRNaseH活性部位のいずれかにおいて点変異を配置することにより、RSV RTα βヘテロダイマーのDNAポリメラーゼおよびRNaseH触媒活性は、αサブユニット のみに存在することが今や発見された。 理解の明瞭の目的のための例示および例として、今や十分に本発明をいくらか 詳細に記載したので、本発明は、本発明の範囲またはその任意の特定の実施態様 に影響を及ぼすことなく、本発明を広範なおよび等範囲の条件、処方、および他 のパラメーター内で本発明を改変または変えることにより行われ得ることが、お よびこのような改変または変化は、添付の請求の範囲の範囲内に含まれると意図 されることが、当業者に明らかである。 本明細書において述べられた全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明 が属する当業者の技術レベルを示し、そして各々の個々の刊行物、特許、または 特許出願が参考として援用されるために詳細におよび個々に示されるのと同程度 に、本明細書中に参考として援用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 チャタジー，デブ ケイ. アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ノース ポトマック，フォレスト リッジ コート ６

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．核酸分子の逆転写における使用のための組成物であって、該組成物が、逆転 写酵素活性を有する２つ以上のポリペプチドを含む、組成物。 ２．前記ポリペプチドが異なる供給源から得られる、請求項１に記載の組成物。 ３．前記ポリペプチド各々の転写中断部位が、前記組成物における他のポリペプ チド各々の転写中断部位とは異なる、請求項１に記載の組成物。 ４．前記ポリペプチドは、RNaseH活性が低減されたか、または実質的に低減され た、請求項１に記載の組成物。 ５．請求項４に記載の組成物であって、ここで前記ポリペプチドが、M-MLV H-逆 転写酵素、RSV H-逆転写酵素、AMV H-逆転写酵素、RAV H-逆転写酵素、MAV H-逆 転写酵素、およびHIV H-逆転写酵素、ならびにその誘導体、改変体、フラグメン ト、または変異体からなる群より選択される、組成物。 ６．請求項５に記載の組成物であって、ここで前記AMV H-逆転写酵素が、AMV α H-/βH-逆転写酵素、AMVαH-/βH+逆転写酵素、AMVβH-/βH-逆転写酵素、AMVβ H+/βH-逆転写酵素、AMVβp4/βp4逆転写酵素、およびAMVαH-逆転写酵素、なら びにその誘導体、改変体、フラグメント、または変異体からなる群より選択され る、組成物。 ７．請求項５に記載の組成物であって、ここで前記RSV H-逆転写酵素が、RSVαH- /βH-逆転写酵素、RSVαH-/βH+逆転写酵素、RSVβH-/βH-逆転写酵素、RSVβH+ /βH-逆転写酵素、RSVβp4/βp4逆転写酵素、およびRSVαH-逆転写酵素、なら びにその誘導体、改変体、フラグメント、または変異体からなる群より選択され る、組成物。 ８．前記ポリペプチドが、Taq、Tne、Tma、Pfu、VENTTM、DEEPVENTTM、およびTt hDNAポリメラーゼ、ならびにその変異体、フラグメント、改変体、および誘導体 からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。 ９．前記ポリペプチドが作用濃度で前記組成物に存在する、請求項１に記載の組 成物。 １０．１つ以上の核酸分子の逆転写のための方法であって、該方法は、以下の工 程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、逆転写酵素活性を有する２つ以上のポリペプチ ドと混合する工程；および （ｂ）該１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ以上の第１の核酸分 子を作製するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程、 を包含する、方法。 １１．前記核酸鋳型がメッセンジャーRNA分子またはmRNA分子の集団である、請 求項１０に記載の方法。 １２．請求項１０に記載の方法であって、該方法は、前記１つ以上の第１の核酸 分子の全てまたは一部に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分 な条件下で、該１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに包 含する、方法。 １３．請求項１０に記載の方法に従って作製された、cDNA分子。 １４．請求項１２に記載の方法に従って作製された、cDNA分子。 １５．１つ以上の核酸分子を増幅するための方法であって、該方法は、以下の工 程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、逆転写酵素活性を有する２つ以上のポリペプチ ドおよび１つ以上のDNAポリメラーゼと混合する工程；ならびに （ｂ）該１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子を増 幅するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程 を包含する、方法。 １６．１つ以上の核酸分子を増幅するための方法であって、該方法は、以下の工 程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、逆転写酵素活性およびDNAポリメラーゼ活性を 有する２つ以上のポリペプチドと混合する工程；ならびに （ｂ）該１つ以上の核酸鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子 を増幅するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程 を包含する、方法。 １７．請求項１５または請求項１６に記載の方法に従って増幅された核酸分子。 １８．請求項１４に記載のcDNA分子を含む、ベクター。 １９．前記ベクターが発現ベクターである、請求項１８に記載のベクター。 ２０．請求項１４に記載のcDNA分子を含む、宿主細胞。 ２１．１つ以上の核酸分子を配列決定するための方法であって、該方法は、以下 の工程： （ａ）配列決定される１つ以上の核酸分子を、１つ以上のプライマー、逆転写 酵素活性を有する２つ以上のポリペプチド、１つ以上のヌクレオチド、および１ つ以上の終結剤と混合する工程； （ｂ）該配列決定される１つ以上の分子の全てまたは一部に相補的な分子の集 団を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程；および （ｃ）該集団を分離して、該配列決定される１つ以上の核酸分子の全てまたは 一部のヌクレオチド配列を決定する工程、 を包含する、方法。 ２２．核酸分子の逆転写、増幅、または配列決定における使用のためのキットで あって、該キットは、逆転写酵素活性を有する２つ以上のポリペプチドを含む、 キット。 ２３．請求項２２に記載のキットであって、該キットは、１つ以上のヌクレオチ ド、１つ以上のDNAポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つ以上のプライマー、およ び１つ以上の終結剤からなる群より選択される１つ以上の成分をさらに含む、キ ット。 ２４．前記終結剤がジデオキシヌクレオチドである、請求項２３に記載のキット 。 ２５．前記キットの２つ以上の成分が混合物として存在するか、または別々の成 分として存在する、請求項２３に記載のキット。 ２６．ASLV逆転写酵素を生成する方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）ASLV逆転写酵素の１つ以上のサブユニットをコードする１つ以上の核酸 配列を含む宿主細胞を得る工程；および （ｂ）該ASLV逆転写酵素サブユニットを生成するのに十分な条件下で、該宿主 細胞を培養する工程、 を包含する、方法。 ２７．前記ASLV逆転写酵素の１つ以上のサブユニットをコードする１つ以上の核 酸配列が１つ以上のベクターに含まれる、請求項２６に記載の方法。 ２８．請求項２６に記載の方法であって、ここで前記ASLV逆転写酵素サブユニッ トが、１つ以上のASLV逆転写酵素の、１つ以上のαサブユニット、１つ以上のβ サブユニット、および１つ以上のβp4サブユニット、ならびにその誘導体、改変 体、フラグメント、または変異体からなる群より選択される、方法。 ２９．前記サブユニットが１つ以上のαサブユニットである、請求項２６に記載 の方法。 ３０．前記サブユニットが１つ以上のβサブユニットである、請求項２６に記載 の方法。 ３１．前記サブユニットが１つ以上のβp4サブユニットである、請求項２６に記 載の方法。 ３２．前記サブユニットが、１つ以上のASLV逆転写酵素の１つのαサブユニット および１つのβサブユニットである、請求項２６に記載の方法。 ３３．前記サブユニットがASLV逆転写酵素を形成するために同時発現され、そし てここで前記ASLV逆転写酵素が前記宿主細胞から単離される、請求項２６に記載 の方法。 ３４．前記ASLV逆転写酵素のサブユニットが単離され、次いで、ASLV逆転写酵素 を形成するために混合される、請求項２６に記載の方法。 ３５．前記βサブユニットが、２つのβサブユニットを含むASLV逆転写酵素を形 成する、請求項３０に記載の方法。 ３６．前記αおよびβサブユニットが、αおよびβサブユニットを含むASLV逆転 写酵素を形成する、請求項３２に記載の方法。 ３７．１つ以上の前記サブユニットが、該サブユニットにおけるRNaseH活性を低 減するか、または実質的に低減するように改変された、請求項２６に記載の方法 。 ３８．前記サブユニットが、同じベクターまたは異なるベクターに含まれる１つ 以上のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２６に記載の方法。 ３９．前記ＡＳＬＶ逆転写酵素がＲＳＶ逆転写酵素である、請求項２６に記載の 方法。 ４０．前記ＡＳＬＶ逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、請求項２６に記載の 方法。 ４１．請求項２６に記載の方法に従って生成された、ASLV逆転写酵素。 ４２．請求項４１に記載のASLV逆転写酵素であって、ここで該ASLV逆転写酵素が 、ASLVαβ逆転写酵素、ASLVββ逆転写酵素、ASLVβp4βp4逆転写酵素、および ASLVα逆転写酵素からなる群より選択される、逆転写酵素。 ４３．前記ASLV逆転写酵素は、RNaseH活性が低減されたか、または実質的に低減 された、請求項４１に記載のASLV逆転写酵素。 ４４．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項４１に記載のASLV逆 転写酵素。 ４５．前記ASLV逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項４１に記載のASLV逆 転写酵素。 ４６．ASLV逆転写酵素の１つ以上のサブユニットをコードするヌクレオチド配列 を含む、単離された核酸分子。 ４７．前記分子が、ASLV逆転写酵素の１つ以上のαサブユニット、またはその誘 導体、フラグメント、もしくは変異体をコードする、請求項４６に記載の核酸分 子。 ４８．前記分子が、ASLV逆転写酵素の１つ以上のβサブユニット、またはその誘 導体、フラグメント、もしくは変異体をコードする、請求項４６に記載の核酸分 子。 ４９．前記分子が、ASLV逆転写酵素の１つ以上のβp4サブユニット、またはその 誘導体、フラグメント、もしくは変異体をコードする、請求項４６に記載の核酸 分子。 ５０．前記分子が、αおよびβASLV逆転写酵素サブユニット、またはその誘導体 、改変体、フラグメント、もしくは変異体をコードする、請求項４６に記載の核 酸分子。 ５１．請求項４６に記載の核酸分子を含む、ベクター。 ５２．請求項４６に記載の核酸分子をを含む、宿主細胞。 ５３．前記ベクターがプラスミドｐＤＡＢＨ−Ｈｉｓである、請求項５１に記載 のベクター。 ５４．前記宿主細胞がE.coli DH10B(pDABH-His)である、請求項５２に記載の宿 主細胞。 ５５．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項４６に記載の単離さ れた核酸分子。 ５６．前記ＡＳＬＶ逆転写酵素がＡＭＶ逆転写酵素である、請求項４６に記載の 単離された核酸分子。 ５７．１つ以上の核酸鋳型の逆転写により１つ以上のcDNA分子を生成するための 方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上のサブユニットを含むASLV RTと混合 する工程；および （ｂ）該１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ以上の第１の核酸分 子を作製するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程、 を包含する、方法。 ５８．前記サブユニットが、１つ以上のαサブユニット、１つ以上のβサブユニ ット、１つ以上のβp4サブユニット、またはその組み合わせである、請求項５７ に記載の方法。 ５９．請求項５７に記載の方法であって、ここで前記ASLV逆転写酵素が、ASLVα β逆転写酵素、ASLVββ逆転写酵素、ASLVβp4βp4逆転写酵素、およびASLVα逆 転写酵素からなる群より選択される、方法。 ６０．前記核酸鋳型がmRNA分子またはmRNA分子の集団である、請求項５７に記載 の方法。 ６１．請求項５７に記載の方法であって、ここで該方法は、前記１つ以上の第１ の核酸分子の全てまたは一部に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するの に十分な条件下で、該１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程をさ らに包含する、方法。 ６２．前記第１および第２の核酸分子が２本鎖DNA分子を形成する、請求項６１ に記載の方法。 ６３．前記２本鎖DNA分子が完全長cDNA分子である、請求項６２に記載の方法。 ６４．請求項５７に記載の方法に従って作製された、cDNA分子。 ６５．請求項６１に記載の方法に従って作製された、cDNA分子。 ６６．請求項６５に記載のcDNA分子を含む、ベクター。 ６７．前記ベクターが発現ベクターである、請求項６６に記載のベクター。 ６８．請求項６５に記載のcDNA分子を含む、宿主細胞。 ６９．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項６１に記載の方法。 ７０．前記ASLV逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項６１に記載の方法。 ７１．１つ以上の核酸分子を増幅するための方法であって、該方法は、以下の工 程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、１つ以上のサブユニットを含む１つ以上のASLV RT、および必要に応じて１つ以上のDNAポリメラーゼと混合する工程；および （ｂ）該１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子を増 幅するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程 を包含する、方法。 ７２．前記サブユニットが、１つ以上のαサブユニット、１つ以上のβサブユニ ット、１つ以上のβp4サブユニット、またはその組み合わせである、請求項７１ に記載の方法。 ７３．請求項７１に記載の方法であって、ここで前記ASLV逆転写酵素が、ASLVα β逆転写酵素、ASLVββ逆転写酵素、ASLVβp4βp4逆転写酵素、およびASLVα逆 転写酵素からなる群より選択される、方法。 ７４．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項７１に記載の方法。 ７５．前記ASLV逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項７１に記載の方法。 ７６．１つ以上の核酸分子を配列決定するための方法であって、該方法は、以下 の工程： （ａ）配列決定される１つ以上の核酸分子を、１つ以上のプライマー、１つ以 上のサブユニットを含むASL VRT、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の 終結剤と混合する工程； （ｂ）該配列決定される１つ以上の核酸分子の全てまたは一部に相補的な核酸 分子の集団を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程 ；および （ｃ）該核酸分子の集団を分離して、該配列決定される１つ以上の核酸分子の 全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する工程、 を包含する、方法。 ７７．前記サブユニットが、１つ以上のαサブユニット、１つ以上のβサブユニ ット、１つ以上のβp4サブユニット、またはその組み合わせである、請求項７６ に記載の方法。 ７８．請求項７６に記載の方法であって、ここで前記ASLV逆転写酵素が、ASLVα β逆転写酵素、ASLVββ逆転写酵素、ASLVβp4βp4逆転写酵素、およびASLVα逆 転写酵素からなる群より選択される、方法。 ７９．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項７６に記載の方法。 ８０．前記ASLV逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項７６に記載の方法。 ８１．１つ以上のASLV RTサブユニット、または１つ以上のその誘導体、改変体 、フラグメント、もしくは変異体を含むキット。 ８２．請求項８１に記載のキットであって、ここで前記ASLV RTサブユニットが 、１つ以上のASLV RTαサブユニット、１つ以上のASLV RTβサブユニット、１つ 以上のASLV RTβp4サブユニット、またはその組み合わせである、キット。 ８３．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項８１に記載のキット 。 ８４．前記ASLV逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項８１に記載のキット 。 ８５．ASLV RTを含むキットであって、ここで前記ASLVが、ASLVαβRT、ASLVβ βRT、ASLVβp4βp4RT、およびASLVαRT、またはその誘導体、フラグメント、も しくは変異体からなる群より選択される、キット。 ８６．前記ASLV RTが、αおよびβサブユニットを含む、請求項８５に記載のキ ット。 ８７．前記ASLV逆転写酵素がRSV逆転写酵素である、請求項８５に記載のキット 。 ８８．前記ASLV逆転写酵素がAMV逆転写酵素である、請求項８５に記載のキット 。 ８９．１つ以上の核酸鋳型の逆転写により１つ以上のcDNA分子を生成するための 方法であって、該方法は、以下の工程： （ａ）１つ以上の核酸鋳型を、逆転写活性酵素を有する１つ以上のポリペプチ ドと混合する工程；および （ｂ）約50℃以上の温度で、および該１つ以上の鋳型の全てまたは一部に相補 的な１つ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、該混合物をイン キュベートする工程、 を包含する、方法。 ９０．前記温度が60℃以上である、請求項８９に記載の方法。 ９１．前記温度が約50℃から約70℃の範囲である、請求項８９に記載の方法。 ９２．前記温度が約55℃から約65℃の範囲である、請求項８９に記載の方法。 ９３．前記核酸鋳型がRNAまたはDNA分子である、請求項８９に記載の方法。 ９４．前記RNA分子がmRNA分子またはポリA+RNA分子である、請求項93に記載の方 法。 ９５．前記核酸鋳型がmRNA分子の集団である、請求項８９に記載の方法。 ９６．前記第１の核酸分子が完全長cDNA分子である、請求項９４に記載の方法。 ９７．請求項８９に記載の方法であって、該方法は、前記１つ以上の第１の核酸 分子の全てまたは一部に相補的な１つ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分 な条件下で、該１つ以上の第１の核酸分子をインキュベートする工程をさらに包 含する、方法。 ９８．前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子がDNA分子である、請求項 ９７に記載の方法。 ９９．前記第１のDNA分子および前記第２のDNA分子が２本鎖DNA分子を形成する 、 請求項９８に記載の方法。 １００．前記２本鎖DNA分子が完全長cDNA分子である、請求項９９に記載の方法 。 １０１．前記逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドは、RNaseH活性が 低減されたか、または実質的に低減された、請求項８９に記載の方法。 １０２．前記逆転写酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドが、１つ以上のサ ブユニットを含む１つ以上のASLV逆転写酵素である、請求項８９に記載の方法。 １０３．前記１つ以上のASLV逆転写酵素が１つ以上のRSV逆転写酵素である、請 求項１０２に記載の方法。 １０４．前記１つ以上のASLV逆転写酵素が１つ以上のAMV逆転写酵素である、請 求項１０２に記載の方法。 １０５．請求項１０２に記載の方法であって、ここで前記ASLV RTサブユニット が、１つ以上のASLV RTαサブユニット、１つ以上のASLV RTβサブユニット、１ つ以上のASLV RTβp4サブユニット、またはその組み合わせである、方法。 １０６．請求項１０２に記載の方法であって、ここで前記ASLV RTが、ASLVαβR T、ASLVββRT、ASLVβp4βp4RT、およびASLVαRT、ならびにその誘導体、改変 体、フラグメント、もしくは変異体からなる群より選択される、方法。 １０７．前記ASLV RTが、ASLVαβRT、またはその誘導体、改変体、フラグメン ト、もしくは変異体である、請求項１０２に記載の方法。 １０８．前記１つ以上のサブユニットは、RNaseH活性が低減されたか、または実 質的に低減された、請求項１０２に記載の方法。 １０９．請求項８９に記載の方法に従って生成された、核酸分子。 １１０．請求項９７に記載の方法に従って生成された、核酸分子。 １１１．前記核酸分子が完全長cDNA分子である、請求項１１０に記載の核酸分子 。 １１２．請求項１１０に記載の核酸分子を含む、ベクター。 １１３．前記ベクターが発現ベクターである、請求項１１２に記載のベクター。 １１４．請求項１０９に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。 １１５．請求項１１０に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
JP54629298A 1997-04-22 1998-04-22 複数のサブユニットからなるａｓｌｖ逆転写酵素の生成のための方法 Ceased JP2001523098A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4458997P 1997-04-22 1997-04-22
US60/044,589 1997-04-22
US4987497P 1997-06-17 1997-06-17
US60/049,874 1997-06-17
PCT/US1998/008072 WO1998047912A1 (en) 1997-04-22 1998-04-22 Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001523098A true JP2001523098A (ja) 2001-11-20

Family

ID=26721734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54629298A Ceased JP2001523098A (ja) 1997-04-22 1998-04-22 複数のサブユニットからなるａｓｌｖ逆転写酵素の生成のための方法

Country Status (9)

Country Link
US (7) US6989259B2 (ja)
EP (3) EP2251347A3 (ja)
JP (1) JP2001523098A (ja)
CN (1) CN1259957B (ja)
AT (1) ATE445630T1 (ja)
AU (1) AU7360198A (ja)
CA (1) CA2287542A1 (ja)
DE (1) DE69841241D1 (ja)
WO (1) WO1998047912A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013165669A (ja) * 2012-02-15 2013-08-29 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5244797B1 (en) * 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
US5861295A (en) 1997-01-02 1999-01-19 Life Technologies, Inc. Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof
ATE486961T1 (de) 1997-04-03 2010-11-15 Life Technologies Corp Verfahren und produkte zur reversen transkription gekoppelt mit polymerasekettenreaktion (rt-pcr)
EP2251347A3 (en) 1997-04-22 2011-02-23 Life Technologies Corporation Methods for the production of ASLV reverse transcriptases composed of multiple subunits
US20040185493A1 (en) * 1997-05-12 2004-09-23 Invitrogen Corporation Methods for production and purification of nucleic acid molecules
EP1829856A3 (en) 1998-11-12 2009-02-25 Invitrogen Corporation Transfection reagents
DE60042969D1 (de) 1999-03-02 2009-10-29 Life Technologies Corp Zubereitungen und methoden zur verwendung in rekombinatorischem klonen von nukleinsäuren
US6630333B1 (en) 1999-03-23 2003-10-07 Invitrogen Corporation Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof
NZ515673A (en) * 1999-05-21 2004-03-26 Invitrogen Corp Compositions and methods for labeling of nucleic acid molecules
JP4729222B2 (ja) 1999-12-10 2011-07-20 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 組換えクローニングにおける独自の選択性を有する複数の組換え部位の使用
CN100390275C (zh) 2000-03-15 2008-05-28 茵维特罗根公司 高保真逆转录酶及其用途
JP2004511211A (ja) 2000-05-26 2004-04-15 インヴィトロジェン　コーポレーション 耐熱性逆転写酵素およびその使用
US9771565B2 (en) 2000-05-26 2017-09-26 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US7078208B2 (en) * 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US20060141632A1 (en) * 2000-07-25 2006-06-29 The Procter & Gamble Co. New methods and kits for sequencing polypeptides
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
DE10046960A1 (de) 2000-09-22 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung einer aktiven, heterodimeren AMW-RT in prokaryotischen Zellen
EP1349917B1 (en) 2000-12-08 2010-03-10 Life Technologies Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20030021799A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-30 Wilkinson Jonathan Frome Reverse transcriptase formulations
JP2005508630A (ja) * 2001-09-14 2005-04-07 インヴィトロジェン コーポレーション Ｄｎａポリメラーゼとその変異体
US20040152072A1 (en) * 2002-07-30 2004-08-05 Invitrogen Corporation Reverse transcription
WO2004024749A2 (en) 2002-09-13 2004-03-25 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
US7141398B2 (en) * 2002-12-30 2006-11-28 Rosetta Inpharmatics Llc Methods for recycling mRNA for linear cRNA amplification
US20040157213A1 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Kennell John C. Fungal reverse transcriptases with enhanced capabilities
EP1594982A4 (en) * 2003-01-29 2006-04-12 Quanta Biosciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DETECTION AND QUANTIFICATION
US20040265870A1 (en) * 2003-04-09 2004-12-30 Invitrogen Corporation Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules
US7727752B2 (en) * 2003-07-29 2010-06-01 Life Technologies Corporation Kinase and phosphatase assays
US7619059B2 (en) * 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
CA2445420A1 (en) * 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
JP2007505315A (ja) * 2003-09-12 2007-03-08 インヴィトロジェン コーポレーション 多重結合および活性アッセイ
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
CN100537756C (zh) * 2004-01-13 2009-09-09 中国科学院生物物理研究所 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法
US7566532B1 (en) 2004-07-02 2009-07-28 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting retroviruses
US9505846B2 (en) 2005-01-28 2016-11-29 Life Technologies Corporation Multi-component inhibitors of nucleic acid polymerases
US20060234360A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Paola Branduardi Ascorbic acid production from D-glucose in yeast
US7836146B2 (en) * 2005-06-27 2010-11-16 Novarc L.L.C System and method for concurrently downloading digital content and recording to removable media
EA017740B1 (ru) * 2007-06-19 2013-02-28 Борд Оф Сьюпервайзорз Оф Луизиана Стэйт Юниверсити Энд Эгрикалчурал Энд Мекэникал Колледж Синтез и применение антиинвертированных фосфоротиоатных аналогов кэп-структуры матричной phk
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
EP2208785A1 (en) 2009-01-15 2010-07-21 Newbiotechnic, S.A. Methods and kits to generate miRNA- and smallRNA-expressing vectors, and its application to develop lentiviral expression libraries
DK3109326T3 (da) 2010-06-21 2022-02-14 Life Technologies Corp Sammensætning og fremgangsmåde til nukleinsyresyntese og amplifikation under anvendelse af rt
EP3150723B1 (en) 2010-06-21 2019-01-30 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids
KR101818126B1 (ko) 2011-02-09 2018-01-15 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
JP2014523914A (ja) 2011-07-18 2014-09-18 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 操作された微生物標的化分子およびその使用
JP2013126402A (ja) * 2011-12-19 2013-06-27 Tosoh Corp 逆転写酵素の製造方法
WO2013130875A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 President And Fellows Of Harvard College Rapid antibiotic susceptibility testing
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
WO2014071322A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Life Technologies Corporation Small RNA Capture, Detection and Quantification
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
JP2017503521A (ja) 2014-01-22 2017-02-02 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 高温核酸合成で使用するための新規な逆転写酵素
EP3169310A1 (en) 2014-07-15 2017-05-24 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
CN114250278A (zh) 2015-03-13 2022-03-29 生命技术公司 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒
WO2017100177A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Dimeric reverse transcriptase
KR20160045656A (ko) 2016-04-11 2016-04-27 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
KR20170016422A (ko) 2017-02-03 2017-02-13 (주)바이오니아 열안정성이 증가된 역전사효소
AU2018386331A1 (en) 2017-12-15 2020-07-02 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for the amplification of mRNA
WO2020132966A1 (zh) * 2018-12-26 2020-07-02 深圳华大生命科学研究院 酶活性提高的逆转录酶及其应用
WO2022265965A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
WO2023114473A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 10X Genomics, Inc. Recombinant reverse transcriptase variants for improved performance

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US32086A (en) * 1861-04-16 Wagon-lock
US60618A (en) * 1866-12-18 Improvement in potato digger
US28447A (en) * 1860-05-29 Improvement in machines for picking curled hair
US90618A (en) * 1869-05-25 Improvement in pruning-imflement
US198944A (en) * 1878-01-08 Improvement in apparatus for refining raw sugars
US4663290A (en) 1982-01-21 1987-05-05 Molecular Genetics, Inc. Production of reverse transcriptase
US4748233A (en) 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
EP0229810B1 (en) 1985-07-09 1991-10-16 Quadrant Bioresources Limited Protection of proteins and the like
US5322770A (en) 1989-12-22 1994-06-21 Hoffman-Laroche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription
US5618711A (en) 1986-08-22 1997-04-08 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase
US5310652A (en) 1986-08-22 1994-05-10 Hoffman-La Roche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5561058A (en) 1986-08-22 1996-10-01 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for coupled high temperatures reverse transcription and polymerase chain reactions
US5693517A (en) 1987-06-17 1997-12-02 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reactions
US5407800A (en) 1986-08-22 1995-04-18 Hoffmann-La Roche Inc. Reverse transcription with Thermus thermophilus polymerase
US5374553A (en) 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
US4962022A (en) 1986-09-22 1990-10-09 Becton Dickinson And Company Storage and use of liposomes
US5618702A (en) 1988-08-19 1997-04-08 City Of Hope PCR amplification of mRNA
SU1490961A1 (ru) 1987-06-17 1994-07-15 Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср Способ получения обратной транскриптазы вируса саркомы рауса
US5244797B1 (en) 1988-01-13 1998-08-25 Life Technologies Inc Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5498523A (en) 1988-07-12 1996-03-12 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing with pyrophosphatase
US5219989A (en) 1988-12-13 1993-06-15 Mcgill University Bifunctional protein for the isolation of capped mRNA
GB8903593D0 (en) 1989-02-16 1989-04-05 Pafra Ltd Storage of materials
ATE181106T1 (de) 1990-09-28 1999-06-15 Hoffmann La Roche Mutationen in der 5'-3'-exonukleaseaktivität thermostabiler dna-polymerasen
DE553264T1 (de) 1990-10-05 1994-04-28 Wayne M Barnes Thermostabile dna polymerase.
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
ZA927323B (en) 1991-09-24 1993-08-30 Keygene Nv Selective restriction fragment amplification: A general method for DNA fingerprinting
FR2690691B1 (fr) * 1992-04-29 1999-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'arn necessitant une seule etape de manipulation.
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
JPH0739378A (ja) 1993-07-30 1995-02-10 Takara Shuzo Co Ltd 逆転写酵素遺伝子
US5556772A (en) 1993-12-08 1996-09-17 Stratagene Polymerase compositions and uses thereof
US5512462A (en) 1994-02-25 1996-04-30 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of long DNA sequences
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5912155A (en) 1994-09-30 1999-06-15 Life Technologies, Inc. Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
JPH08131171A (ja) 1994-11-11 1996-05-28 Asahi Chem Ind Co Ltd 逆転写酵素の安定化組成物
US5556771A (en) 1995-02-10 1996-09-17 Gen-Probe Incorporated Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US6013488A (en) 1996-07-25 2000-01-11 The Institute Of Physical And Chemical Research Method for reverse transcription
US6060240A (en) 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
ATE486961T1 (de) * 1997-04-03 2010-11-15 Life Technologies Corp Verfahren und produkte zur reversen transkription gekoppelt mit polymerasekettenreaktion (rt-pcr)
EP2251347A3 (en) 1997-04-22 2011-02-23 Life Technologies Corporation Methods for the production of ASLV reverse transcriptases composed of multiple subunits
DK0981609T3 (da) 1997-05-13 2001-11-12 Azign Bioscience As Fremgangsmåde til kloning af mRNA'er og display af differentielt udtrykte transkripter (DODET)
US7074556B2 (en) * 1999-03-02 2006-07-11 Invitrogen Corporation cDNA synthesis improvements
US6630333B1 (en) * 1999-03-23 2003-10-07 Invitrogen Corporation Substantially pure reverse transriptases and methods of production thereof
US7078208B2 (en) 2000-05-26 2006-07-18 Invitrogen Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
JP3925124B2 (ja) * 2000-09-20 2007-06-06 株式会社村田製作所 弾性表面波装置の製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013165669A (ja) * 2012-02-15 2013-08-29 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998047912A1 (en) 1998-10-29
CN1259957B (zh) 2012-08-22
EP2184289A1 (en) 2010-05-12
EP1005481B1 (en) 2009-10-14
US20030198944A1 (en) 2003-10-23
EP2251347A3 (en) 2011-02-23
US6989259B2 (en) 2006-01-24
AU7360198A (en) 1998-11-13
US6518019B2 (en) 2003-02-11
US20110008770A1 (en) 2011-01-13
US20030186270A1 (en) 2003-10-02
ATE445630T1 (de) 2009-10-15
US20070269878A1 (en) 2007-11-22
EP1005481A4 (en) 2005-03-16
DE69841241D1 (de) 2009-11-26
US7115406B2 (en) 2006-10-03
EP2251347A2 (en) 2010-11-17
US6835561B1 (en) 2004-12-28
US20030032086A1 (en) 2003-02-13
CN1259957A (zh) 2000-07-12
US20020081581A1 (en) 2002-06-27
EP1005481A1 (en) 2000-06-07
CA2287542A1 (en) 1998-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2001523098A (ja) 複数のサブユニットからなるａｓｌｖ逆転写酵素の生成のための方法
WO1998047912A9 (en) Methods for the production of aslv reverse transcriptases composed of multiple subunits
US7501237B2 (en) Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
JP5148799B2 (ja) 高忠実度逆転写酵素およびその使用
EP0929564B1 (en) High level expression of proteins
KR100510619B1 (ko) 변형된 열안정성 디엔에이 폴리머라아제
US4795699A (en) T7 DNA polymerase
US4994372A (en) DNA sequencing
US5075227A (en) Directional cloning
EP0265293A2 (en) T7 DNA polymerase
JPH04507197A (ja) 増強された核酸増幅方法
WO1998035060A9 (en) Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
WO1993015096A1 (en) Cloning and expression of t5 dna polymerase reduced in 3'-to-5' exonuclease activity
AU2001247413A1 (en) High fidelity reverse transcriptases and uses thereof
Wang et al. The Mauriceville plasmid of Neurospora crassa: characterization of a novel reverse transcriptase that begins cDNA synthesis at the 3'end of template RNA
Burns et al. Thermal energy requirement for strand separation during transcription initiation: the effect of supercoiling and extended protein DNA contacts
EP0562206B1 (en) Single-stranded DNA-RNA hybrid molecules and methods for their production
US5079151A (en) Production of branched RNA-linked multi-copy single-stranded DNA using permeabilized cells
WO2007076461A1 (en) Thermostable dna polymerase from thermus scotoductus
Dunon-Bluteau et al. DNA synthesis in a mitochondrial lysate of Xenopus laevis oocytes: H strand replication in vitro
US20040157213A1 (en) Fungal reverse transcriptases with enhanced capabilities
AU2005234731A1 (en) High fidelity reverse transcriptases and uses thereof: RSV and AMV
HU202580B (en) Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050419

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070612

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712

Effective date: 20070706

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20070706

A313 Final decision of rejection without a dissenting response from the applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A313

Effective date: 20071031

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20071211