JPH0739378A - 逆転写酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ラウス関連ウイルス（Rous associated viru
s ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転写酵素をコードする遺伝
子、及び該酵素の製造方法を提供する。 【構成】 単離されたＲＡＶ−２由来逆転写酵素遺伝
子。該遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換
体を培養し、該培養物からＲＡＶ−２由来逆転写酵素を
採取するＲＡＶ−２由来逆転写酵素の製造方法。ＲＡＶ
−２プロウイルスＤＮＡより、約３．８ｋｂのＤＮＡ断
片をクローニングし、該クローニング断片の塩基配列の
一部を決定し、ＲＳＶの塩基番号１８４〜２８６８の部
分にＲＡＶ−２由来逆転写酵素をコードする２６８５ｂ
ｐの領域を特定した。そのコード領域の塩基配列及び推
定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。 【効果】 遺伝子工学用試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラウス関連ウイルス
（Rous associated virus ２、ＲＡＶ−２）由来の逆転
写酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】逆転写酵素はＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ
を合成する酵素であり、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼ、リバーストランスクリプターゼとも呼ばれる。逆転
写酵素は現在まで種々の由来のものが知られており、そ
の生化学的研究がなされている。一方、近年の分子遺伝
学の進展に伴い、ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成するため
に逆転写酵素が多用されている。特に高等生物の遺伝子
をクローニングする際、このｃＤＮＡ合成は必須のステ
ップであり、遺伝子工学分野において逆転写酵素の重要
性はますます高くなってきている。ＲＡＶ−２由来の逆
転写酵素は遺伝子工学用試薬として適した性質をもつ有
用な酵素であり、市販もされている。該酵素の製造法と
しては、ジャーナル オブバイオケミストリー（Journa
l of Biochemistry ）、第１０５巻、第９７４〜９７８
頁（１９８８）に記載されているものがある。すなわ
ち、ＲＡＶ−２を初代ニワトリ胚線維芽培養細胞に感染
させ、培養上清に放出されるウイルス粒子を超遠心法に
より回収し、更にこの粒子より種々の精製手段を用いて
逆転写酵素を製造する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法は操作が煩雑な上に、培養上清に含まれるＲＡＶ−２
の量は少なく、逆転写酵素の大量製造は困難である。一
方、該逆転写酵素の遺伝子は単離されておらず、当該遺
伝子を発現ベクターに結合して遺伝子工学的に発現させ
る方法についても明らかにされていない。本発明の目的
は、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素をコードする遺伝子を特
定し、該遺伝子を用いたＲＡＶ−２由来逆転写酵素の製
造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は単離されたＲＡＶ−２由来逆転写酵
素遺伝子に関する。本発明の第２の発明はＲＡＶ−２由
来逆転写酵素の製造方法に関し、第１の発明の遺伝子を
含有するプラスミドを保有する形質転換体を培養し、該
培養物からＲＡＶ−２由来逆転写酵素を採取することを
特徴とする。

【０００５】本発明者らは、ＲＡＶ−２プロウイルスＤ
ＮＡより、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素遺伝子全領域を含
む２６８５ｂｐのＤＮＡをクローニングすることに成功
し、更にこのＤＮＡ断片を含むプラスミドを導入した微
生物、特に大腸菌を培養することにより、菌体中にＲＡ
Ｖ−２由来逆転写酵素が蓄積することを見出し、本発明
を完成した。

【０００６】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
の遺伝子は、例えば次に例示する工程により得ることが
できる。 （１）ニワトリ初代線維芽細胞にＲＡＶ−２を感染さ
せ、一定時間の後に細胞を回収する。これよりＲＡＶ−
２プロウイルスを得る。 （２）プロウイルスをＤＮＡ供与体として、λｇｔ１０
をベクターとしたライブラリーを作製する。 （３）ライブラリーより、目的のＤＮＡ断片を有するフ
ァージをスクリーニングする。 （４）ファージより、目的の逆転写酵素をコードする遺
伝子を含むＤＮＡを断片化しプラスミドベクターに結合
させる。 （５）このプラスミドを宿主に導入し、目的のＤＮＡ断
片を含む形質転換体からプラスミドを調製し、これを用
いて遺伝子の塩基配列を決定する。 （６）決定された塩基配列を基にして、逆転写酵素をコ
ードする領域のみをポリメラーゼ チェイン リアクシ
ョン法（ＰＣＲ法）によって増幅する。 （７）増幅されたＤＮＡ断片を大腸菌内で発現するため
のプラスミドベクターに結合する。これを宿主に導入
し、目的の形質転換体を選択する。 抽出、精製、制限酵素による切断等は、公知の方法を用
いることができ、当該法の詳細は、例えばモレキュラー
クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Mole
cular cloning ，a Laboratory Manual ）第７５〜１７
８頁、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版
（１９８２）に記載されている。

【０００７】プロウイルスＤＮＡは、例えば次のように
して得ることができる。すなわち、ニワトリ初代培養胚
線維芽細胞を１０％子ウシ血清を含む動物細胞用培地で
数日間培養し、これにＲＡＶ−２を接触・ 感染させ、培
養を続ける。細胞に侵入したＲＡＶ−２遺伝子（ＲＮ
Ａ）は、ウイルス由来の逆転写酵素によって、プロウイ
ルスＤＮＡに変換される。なお、その後このプロウイル
スＤＮＡは、更にニワトリ細胞の染色体遺伝子に組込ま
れてしまうので、組込まれる以前のプロウイルスＤＮＡ
を得るには、感染から回収までの時間が重要となる。ウ
イルス感染後、プロウイルスＤＮＡのほぼ全長が合成さ
れ、かつ核外に存在する時間を特定し、この条件を基に
感染細胞を回収するハート法〔ジャーナル オブ モレ
キュラーバイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）、第２６巻、第３６５〜３６９頁（１９６７）〕の
改良法によって核外ＤＮＡを回収する。

【０００８】このＤＮＡを制限酵素で消化し、例えばフ
ァージベクターλｇｔ１０と結合させ、これをインビト
ロでパッケージングし、ファージ粒子を形成させ、ライ
ブラリーを作成することができる。更にこのファージを
大腸菌、例えばＣ６００ｈｆｌ株に感染させプレート上
でプラークを形成させ、このプラークをフィルターにト
ランスファーしハイブリダイゼーションを行うことがで
きる。

【０００９】スクリーニングに用いるプローブとして
は、例えばＲＡＶ−２と近縁のラウス肉腫ウイルス（Ro
us sarcoma virus、ＲＳＶ）の逆転写酵素上流をコード
する遺伝子の一部を化学合成したものを用いることがで
きる。なお、ＲＳＶの遺伝子の塩基配列はセル（Cel
l）、第３２巻、第８５３〜８６９頁（１９８３）に記
載されている。これによるスクリーニングによって得ら
れたファージを更に純化し、これからファージＤＮＡを
調製する。このＤＮＡより挿入断片を切り出し適当なク
ローニングベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＴＶ１１８Ｎ等に結合させる。次いで、このファ
ージＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば、野生株、変異株のいずれも使用できる。
用いるベクタープラスミドにより、用いる宿主大腸菌を
適宜変えることも可能である。

【００１０】この様にして目的のＤＮＡ断片を宿主に導
入させ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＴＶ１１
８Ｎにクローン化する場合には、アンピシリン耐性を指
標に選択することができる。クローン化されたＤＮＡの
塩基配列決定は、公知の方法を用いて行うことができ
る。

【００１１】本発明者らは、上記ＲＳＶの塩基配列から
配列表の配列番号２で表されるプローブＤＮＡを作製し
てライブラリーをスクリーニングし、約３．８ｋｂのＤ
ＮＡ断片をクローニングした。更に、該クローニング断
片の塩基配列の一部を決定した。その塩基配列を配列表
の配列番号３に示す。更に、該塩基配列をＲＳＶのそれ
等と比較することにより、塩基番号１８４〜２８６８の
部分にＲＡＶ−２由来逆転写酵素をコードすると思われ
る２６８５ｂｐの領域を特定した。そのコード領域の塩
基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号
１に示す。

【００１２】次に、配列表の配列番号１に示されるコー
ド領域のみを単離する方法としては、例えばＰＣＲ法を
用いることができる。その際、用いるプライマーの塩基
配列を工夫することにより、増幅断片の両端に任意の塩
基配列を導入することができる。本発明者らは、配列表
の配列番号４及び５に示されるプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法にてＤＮＡを増幅した。これらプライマーを用いる
ことにより、該逆転写酵素のＮ末端アミノ酸をコードす
るコドン（ＡＣＴ）の前にＥｃｏＲＩサイトを、翻訳停
止コドンの下流にＳａｃＩサイトを導入した。

【００１３】次に、増幅されたＤＮＡ断片を発現ベクタ
ーに連結させる。このとき、発現を安定化させるため
に、遺伝子の下流に転写終結配列を挿入しても良い。転
写終結配列としては、ジ エンボ ジャーナル（The EM
BO Journal）、第３巻、第２４３７〜２４４２頁（１９
８４）に記載されている大腸菌分泌ベクターpIN −III
−ompA₁ 上のものがある。形質転換する方法は公知のも
のが使用でき、宿主に応じて選択すれば良い。本発明者
らは、増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＳａｃＩで
処理した後、プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社）の
同サイトに翻訳フレームが合うように結合させた。更
に、逆転写酵素をコードする遺伝子の下流に前述の転写
終結配列を挿入した。このようにして、ＲＡＶ−２由来
逆転写酵素を発現するプラスミドｐＴ８ＲＡＶを構築し
た（図１）。次に、ｐＴ８ＲＡＶを大腸菌ＪＭ１０９株
に導入し、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素を生産する形質転
換体を作製した。該形質転換体はEscherichia coli JM1
09/pT8RAV と命名、表示され、工業技術院生命工学工業
技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３７１６として寄託され
ている。

【００１４】逆転写酵素活性を確認する方法としては、
前出のジャーナル オブ バイオケミストリーに記載の
方法を用いることができるが、著量を生産している場合
には菌体抽出物を、直接ドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で検
出することができる。また、該抽出物より逆転写酵素活
性を指標に粗精製し、確認することもできる。

【００１５】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

【００１６】実施例１ （１）プロウイルスＤＮＡの調製 １０日発育鶏卵（ラインＭ、日生研より入手）３個から
胎児を取り出し、内臓、頭部、手足を取り除き、次いで
トリプシン処理〔０．５％（ｗ／ｖ）トリプシン、０．
２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡをダルベッコホスフェートセイ
ライン（Dulbecco's phosphate saline ）（２価カチオ
ン除去、ギブコ社）で１０倍に希釈した溶液中で３０℃
で約２０分間かくはんする〕により胚線維芽細胞の懸濁
液を５％（ｖ／ｖ）新生子ウシ血清（三菱化成社）及び
５％（ｖ／ｖ）トリプトースホスフェートブロスを含む
イーグル(Eagle) ＭＥＭ培地（ギブコ社）１００ｍｌを
入れたローラーボトル（ファルコン＃3027、ベクトン−
デイキンソン社、培養面積８５０ｃｍ² ）３本に０．５
×１０⁶ セルずつ分注播種した。これらのボトルを３７
℃で０．３ｒｐｍの速度で回転培養し、付着培養を行っ
た。培養開始３日後にポリブレン（アルドリッチ社）を
添加（１０μｇ／ｍｌ）し細胞層表面を処理したのち培
養液を除去した。次いでＲＡＶ−２（東京大学付属医科
学研究所より入手）を含むＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）２０ｍｌを上記ボトルに加えることに
より感染を４５分間行った。次いで前記新生子ウシ血清
及びトリプトースホスフェートブロスを含むイーグルＭ
ＥＭ培地８０ｍｌを添加し培養を開始した。培養３日目
に細胞を回収し、ローラーボトル内の胚線維芽細胞をト
リプシン処理（２０ｍｌ）し、細胞を回収した。これを
氷冷したＭＥＭ培地５０ｍｌを用いて洗浄し、次に２５
ｍｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡで洗浄した。更にこの細胞に６０℃に保温
した、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ
７．８、１０ｍＭＥＤＴＡ２０ｍｌを加え細胞を溶解さ
せた。これに５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、４℃で８
時間放置した。２５０００ｒｐｍで１時間遠心した後、
上清を回収した。これに最終濃度５０μｇ／ｍｌになる
ようにプロテイネースＫ（ベーリンガー社）を加え、３
７℃で１時間反応させた。反応後、この溶液にＴＥ緩衝
液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールを加え、ゆるやかに混
合した後、遠心分離して水層を採取した（以下この操作
をフェノール処理という）。これに２倍容のエタノール
を加え、−７０℃で３０分間保持した後、遠心分離を行
い、プロウイルス化したＲＡＶ−２遺伝子を含むＤＮＡ
画分を得た。

【００１７】（２）スクリーニング このプロウイルスを含むＤＮＡ画分の１０μｇをＥｃｏ
ＲＩ２０単位で処理し、その後フェノール処理を行っ
た。これに２倍容のエタノールを加え−７０℃で３０分
間保持した後、遠心分離を行い、ＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このＤＮ
Ａ溶液１μｌにＥｃｏＲＩ処理したファージベクターλ
ｇｔ１０（ストラタジーン社）１μｌを加え、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１００単位を用いリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ）中１６℃
で４時間反応させ両者を結合させた。これをλファージ
パッケージングキット（ギガパックゴールド、ストラタ
ジーン社）を用いてパッケージングし、大腸菌C600hfl
株を宿主としてプラークを形成させた。すなわち、０．
２ｍＭマルトース及び２ｍＭ ＭｇＳＯ₄ を含むＬ−ブ
ロス培地中で大腸菌C600hfl 株を３７℃で一晩培養し、
これに希釈したファージ液を加え、３７℃で１５分間イ
ンキュベートを行った後に、０．７％アガロースを含む
Ｌ−ブロスと共に１．５％アガロース含有Ｌ−ブロスプ
レートに重層し、これを３７℃で一晩培養し、プラーク
を形成させた。次に、約１×１０⁶ 個のファージプラー
クをナイロンメンブラン（ハイボンド−Ｎ、アマシャム
社）に移し、プローブＤＮＡと６×ＳＳＣ（１×ＳＳ
Ｃ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０）、５×デンハーツ液〔１×デン
ハーツ液：０．０２％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリド
ン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．０
２％（Ｗ／Ｖ）フィコール４００〕、及び１００μｇ／
ｍｌ変性サケＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液
中で、６０℃で一晩ハイブリダイズさせた。プローブＤ
ＮＡは配列表の配列番号２で表されるＤＮＡを合成・精
製し、メガラベルキット（宝酒造社）を用いて［γ−³²
Ｐ］ＡＴＰで放射性標識したものを用いた。次に２×Ｓ
ＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む洗浄液で５５℃、５分、更
に同洗浄液で４０℃、５分間、２回フィルターを洗浄し
た。フィルターを増感紙に当てて、一晩、−７０℃でオ
ートラジオグラフィーを行った。この結果、３つのポジ
テイブクローンが得られ、それぞれＫＩ１、ＫＩ５、Ｋ
Ｉ９と命名した。

【００１８】（３）塩基配列の決定 実施例１−（２）で得られた３個のファージプラークを
それぞれ４００μｌのＳＭ緩衝液（５．８ｇのＮａＣ
ｌ、２ｇのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、５０ｍｌの１Ｍ ト
リス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５ｍｌの２％ゼラチンを１
リットルの滅菌水に溶解したもの）に懸濁し、４℃で一
晩、ファージを溶出させた。３個のプラーク由来のファ
ージ液それぞれ１０μｌを実施例１−（２）のように培
養した宿主大腸菌C600hfl の培養液０．５ｍｌに感染さ
せ、１００ｍｌのＬ−ブロス培地中で４〜６時間培養し
溶菌させた。更に溶菌液を遠心し残渣を除いて、ＤＮａ
ｓｅＩ（宝酒造社）及びＲＮａｓｅＡ（シグマ社）を各
５μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、３７℃で３０分
処理した。これに１／１０容の２．５Ｍ ＮａＣｌ、２
０％ポリエチレングリコール６０００を加え、４℃、１
時間放置した後、ファージを遠心回収した。回収したそ
れぞれのファージを２ｍｌのＳＭ緩衝液に溶解し、フェ
ノール処理、フェノール−クロロホルム処理及びクロロ
ホルム処理を行い、更に１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムと２倍量のエタノールを加えた。これを−７０℃、１
時間放置し、ＤＮＡを遠心回収した。次に、これらのＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで処理し、１％アガロースゲルにて電
気泳動し、ファージより切り出されたＤＮＡ断片を回収
して、シーケンス用ベクターＭ１３ｍｐ１８（宝酒造
社）のＥｃｏＲＩサイトにライゲーションし、サブクロ
ーニングを行った。このうち、クローンＫＩ１より得ら
れたサブクローンをＭ１３ｍｐ１８−ＫＩ１と命名し
た。Ｍ１３ｍｐ１８−ＫＩ１の挿入断片の塩基配列の一
部をキロシークエンス用ディレーションキット（宝酒造
社）を用いてダイデオキシ法にて決定した。その塩基配
列を配列表の配列番号３に示す。次に、該塩基配列を前
述のＲＳＶのそれと、更に、ジョンソンらが同定した、
レトロウイルス中の逆転写酵素の領域（プロシーディン
グズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proceedings ofthe Na
tional Academy of Sciences of the USA）、第８３
巻、第７６４８〜７６５２頁（１９８６））と比較する
ことにより、塩基番号１８４〜２８６８の部分に逆転写
酵素をコードする部分を同定した。該コード領域の塩基
配列と推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に
示す。

【００１９】（４）ＲＡＶ−２由来逆転写酵素発現ベク
ターの構築 配列表の配列番号１に示される逆転写酵素をコードする
部分のみを得るために、配列表の配列番号４及び５で示
されるプライマーを合成し、ＰＣＲを行った。すなわ
ち、これらのプライマー１００ｐｍｏｌと、１ｎｇのＭ
１３ｍｐ１８−ＫＩ１を用いて、全量１００μｌで９５
℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の条件でＰＣ
Ｒを行った。反応後、反応液の５μｌをとりアガロース
ゲル電気泳動で分析した結果、約２．７ｋｂのＤＮＡ断
片が特異的に増幅していた。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲ
ＩとＳａｃＩそれぞれ２０単位で処理し、同制限酵素で
処理したベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社）に、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。このｐＴＶ１１８
Ｎのｌａｃプロモーターの下流にＲＡＶ−２由来逆転写
酵素をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターをｐ
Ｔ８ＲＡと命名した。更に、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素
をコードする遺伝子の下流に転写終結配列を導入した。
すなわち、２μｇの大腸菌分泌ベクターｐＩＮ−III −
ｏｍｐＡ₁ をＢａｍＨＩ２０単位で処理し、その後、生
じた末端をブランティングキット（宝酒造社）を用いて
平滑末端化した。これをＳａｌＩで処理し、アガロース
ゲル電気泳動によって約０．９ｋｂｐの転写終結配列を
分離、取得した。次に、２μｇのｐＴ８ＲＡをＳｍａＩ
及びＳａｌＩ各２０単位で処理し、フェノール処理しエ
タノール沈殿によりＤＮＡを回収し、これと先に得た転
写終結配列をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。
このプラスミドをｐＴ８ＲＡＶと命名した。ｐＴ８ＲＡ
Ｖの構築図を図１に示す。次に、ｐＴ８ＲＡＶを大腸菌
ＪＭ１０９株に導入し、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素遺伝
子を含有する形質転換体を得た。該形質転換体をEscher
ichia coli JM109/pT8RAV と命名、表示し、工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ Ｐ−１
３７１６）。

【００２０】（５）ＲＡＶ−２由来逆転写酵素の形質転
換体での発現 Escherichia coli JM109/pT8RAV （ＦＥＲＭ Ｐ−１３
７１６）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブ
ロス培地１００ｍｌ中、３７℃で振とう培養し、対数増
殖期中期にイソプロピルチオガラクトシド（宝酒造社）
を０．４ｍＭになるように加え、更に一晩培養を続け
た。培養後、菌体を遠心回収し一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析したところ、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素と推
定される分子量約９８０００のタンパク質が認められ
た。該タンパク質は、菌体全タンパク質の約１０％を占
めた。次に、Escherichia coli JM109/pT8RAV の培養菌
体を２０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７．５、１５ｍＭ β
−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で超音
波破砕し、その後、遠心分離により不溶性画分を除い
た。この段階で逆転写酵素と推定されるタンパク質の約
２０％が可溶性画分として回収された。この可溶性画分
を１０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．５、３０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．２％ ノ
ニデットＰ４０（ＮＰ−４０）、１０％グリセロールに
対して透析し、その後同緩衝液で平衡化したイオン交換
体ＤＥＡＥ−５２カラム（カラム容量２０ｍｌ、ワット
マン社）に吸着させた。カラムを１００ｍｌの同緩衝液
で洗浄した後、同緩衝液中ＫＣｌ濃度３０ｍＭから７０
０ｍＭまでの塩濃度勾配で溶出した。各フラクションを
５０ｍＭ トリス−ＨＣｌｐＨ８．３、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂ 、３ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０
ｍＭ ＮａＣｌに対し一晩透析し、逆転写酵素活性を測
定した。すなわち、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、３ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭＮａＣｌ、
２０μｇ／ｍｌ ポリアデニル酸／オリゴチミジル酸
〔ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）〕、１００μ
Ｍ 〔³ Ｈ〕−ＴＴＰ（チミジントリホスフェート）
（２２２ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）及び０．１％ ＮＰ−４０
に各フラクションを加え、２０μｌの系で、３７℃、３
０分間反応させた。測定の結果、溶出液ＫＣｌ濃度４０
０ｍＭ付近に逆転写酵素活性を認めた。活性画分をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって分析したところ、分子量約９８０
００のタンパク質を認めた。なお、プラスミドｐＴＶ１
１８Ｎを有する大腸菌ＪＭ１０９株について同様の実験
を行ったが、相当する画分に逆転写酵素活性は見出され
なかった。これらより、Escherichia coli JM109/pT8RA
V は確かにＲＡＶ−２由来逆転写酵素を発現していた。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、遺伝子工学用試薬として
有用なＲＡＶ−２由来逆転写酵素の遺伝子、及び該酵素
の遺伝子工学的製造法が提供された。

【００２２】

【配列表】

【００２３】配列番号：1 配列の長さ：2685 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： ACT GTT GCG CTA CAT CTG GCT ATT CCG CTC AAA TGG AAG CCA GAC 45 Thr Val Ala Leu His Leu Ala Ile Pro Leu Lys Trp Lys Pro Asp 5 10 15 CAC ACG CCT GTG TGG ATT GAC CAG TGG CCC CTT CCT GAA GGT AAA 90 His Thr Pro Val Trp Ile Asp Gln Trp Pro Leu Pro Glu Gly Lys 20 25 30 CTT GTA GCG GTA ACG CAA TTA GTG GAA AAA GAA TTA CAG TTA GGA 135 Leu Val Ala Val Thr Gln Leu Val Glu Lys Glu Leu Gln Leu Gly 35 40 45 CAT ATA GAA CCC TCA CTT AGC TGT TGG AAC ACA CCT GTC TTT GTG 180 His Ile Glu Pro Ser Leu Ser Cys Trp Asn Thr Pro Val Phe Val 50 55 60 ATC CGG AAG GCT TCC GGG TCT TAT CGC TTA TTG CAT GAC TTA CGC 225 Ile Arg Lys Ala Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Leu His Asp Leu Arg 65 70 75 GCT GTT AAC GCC AAG CTT GTT CCT TTT GGG GCT GTC CAA CAG GGG 270 Ala Val Asn Ala Lys Leu Val Pro Phe Gly Ala Val Gln Gln Gly 80 85 90 GCG CCA GTT CTC TCC GCG CTC CCG CGT GGC TGG CCC CTG ATG GTT 315 Ala Pro Val Leu Ser Ala Leu Pro Arg Gly Trp Pro Leu Met Val 95 100 105 CTA GAC CTC AAG GAT TGC TTC TTT TCT ATC CCT CTT GCG GAA CAA 360 Leu Asp Leu Lys Asp Cys Phe Phe Ser Ile Pro Leu Ala Glu Gln 110 115 120 GAT CGC GAA GCT TTT GCA TTT ACG CTC CCC TCT GTG AAT AAC CAG 405 Asp Arg Glu Ala Phe Ala Phe Thr Leu Pro Ser Val Asn Asn Gln 125 130 135 GCC CCC GCT CGA AGA TTC CAA TGG AAG GTC TTG CCC CAA GGG ATG 450 Ala Pro Ala Arg Arg Phe Gln Trp Lys Val Leu Pro Gln Gly Met 140 145 150 ACC TGT TCT CCC ACT ATC TGT CAG TTG GTA GTG GGT CAG GTG CTC 495 Thr Cys Ser Pro Thr Ile Cys Gln Leu Val Val Gly Gln Val Leu 155 160 165 GAG CCC TTG CGA CTC AAG CAC CCA GCT CTG CGC ATG TTG CAT TAT 540 Glu Pro Leu Arg Leu Lys His Pro Ala Leu Arg Met Leu His Tyr 170 175 180 ATG GAC GAT CTT TTG CTA GCC GCC TCA AGT CAT GAT GGG TTG GAA 585 Met Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser His Asp Gly Leu Glu 185 190 195 GCG GCA GGG AAG GAG GTT ATC GGT ACA TTG GAA AGA GCC GGG TTC 630 Ala Ala Gly Lys Glu Val Ile Gly Thr Leu Glu Arg Ala Gly Phe 200 205 210 ACT ATT TCG CCG GAT AAG ATC CAG AGG GAG CCC GGA GTA CAA TAT 675 Thr Ile Ser Pro Asp Lys Ile Gln Arg Glu Pro Gly Val Gln Tyr 215 220 225 CTT GGG TAC AAG TTA GGC AGT ACG TAT GTA GCA CCC GTA GGC TTG 720 Leu Gly Tyr Lys Leu Gly Ser Thr Tyr Val Ala Pro Val Gly Leu 230 235 240 GTA GCA GAA CCC AGG ATA GCC ACC TTG TGG GAT GTT CAA AAG CTG 765 Val Ala Glu Pro Arg Ile Ala Thr Leu Trp Asp Val Gln Lys Leu 245 250 255 GTG GGG TCA CTT CAG TGG CTT CGC CCA GCG TTA GGG ATC CCG CCA 810 Val Gly Ser Leu Gln Trp Leu Arg Pro Ala Leu Gly Ile Pro Pro 260 265 270 CGA CTG ATG GGT CCC TTT TAT GAG CAG TTA CGA GGG TCA GAT CCT 855 Arg Leu Met Gly Pro Phe Tyr Glu Gln Leu Arg Gly Ser Asp Pro 275 280 285 AAC GAG GCG AGG GAA TGG AAT CTA GAC ATG AAA ATG GCC TGG AGA 900 Asn Glu Ala Arg Glu Trp Asn Leu Asp Met Lys Met Ala Trp Arg 290 295 300 GAG ATC GTA CAG CTT AGC ACT ACT GCT GCC TTG GAA CGA TGG GAC 945 Glu Ile Val Gln Leu Ser Thr Thr Ala Ala Leu Glu Arg Trp Asp 305 310 315 CCT GCC CAG CCT CTG GAA GGA GCG GTC GCT AGA TGT GAA CAG GGG 990 Pro Ala Gln Pro Leu Glu Gly Ala Val Ala Arg Cys Glu Gln Gly 320 325 330 GCA ATA GGG GTC CTG GGA CAG GGA CTG TCC ACA CAC CCA AGG CCA 1035 Ala Ile Gly Val Leu Gly Gln Gly Leu Ser Thr His Pro Arg Pro 335 340 345 TGT TTG TGG TTA TTC TCC ACC CAA CCC ACC AAG GCG TTT ACT GCT 1080 Cys Leu Trp Leu Phe Ser Thr Gln Pro Thr Lys Ala Phe Thr Ala 350 355 360 TGG TTA GAA GTG CTC ACC CTT TTG ATT ACT AAG CTA CGC GCT TCG 1125 Trp Leu Glu Val Leu Thr Leu Leu Ile Thr Lys Leu Arg Ala Ser 365 370 375 GCA GTG CGA ACC TTT GGC AAG GAG GTT GAT ATC CTC CTG TTG CCT 1170 Ala Val Arg Thr Phe Gly Lys Glu Val Asp Ile Leu Leu Leu Pro 380 385 390 GCA TGC TTC CGG GAG GAC CTT CCG CTC CCG GAG GGG ATC CTG TTA 1215 Ala Cys Phe Arg Glu Asp Leu Pro Leu Pro Glu Gly Ile Leu Leu 395 400 405 GCA CTT AGG GGG TTT GCA GGA AAA ATC AGG AGT AGT GAC ACG CCA 1260 Ala Leu Arg Gly Phe Ala Gly Lys Ile Arg Ser Ser Asp Thr Pro 410 415 420 TCT ATT TTT GAC ATT GCG CGT CCA CTG CAT GTT TCT CTG AAA GTG 1305 Ser Ile Phe Asp Ile Ala Arg Pro Leu His Val Ser Leu Lys Val 425 430 435 AGG GTT ACC GAC CAC CCT GTG CCG GGA CCC ACT GTC TTT ACC GAC 1350 Arg Val Thr Asp His Pro Val Pro Gly Pro Thr Val Phe Thr Asp 440 445 450 GCC TCC TCA AGC ACC CAT AAA GGG GTG GTA GTC TGG AGG GAG GGC 1395 Ala Ser Ser Ser Thr His Lys Gly Val Val Val Trp Arg Glu Gly 455 460 465 CCA AGG TGG GAG ATA AAA GAA ATA GTT GAT TTG GGG GCA AGT GTA 1440 Pro Arg Trp Glu Ile Lys Glu Ile Val Asp Leu Gly Ala Ser Val 470 475 480 CAA CAA CTG GAG GCA CGC GCT GTG GCC ATG GCA CTT CTG CTG TGG 1485 Gln Gln Leu Glu Ala Arg Ala Val Ala Met Ala Leu Leu Leu Trp 485 490 495 CCG ACA ACG CCC ACT AAT GTA GTG ACT GAC TCT GCG TTT GTT GCG 1530 Pro Thr Thr Pro Thr Asn Val Val Thr Asp Ser Ala Phe Val Ala 500 505 510 AAA ATG TTA CTC AAG ATG GGA CAG GAG GGA GTC CCG TCT ACA GCG 1575 Lys Met Leu Leu Lys Met Gly Gln Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala 515 520 525 GCA GCT TTT ATT TTA GAG GAT GCG TTA AGC CAA AGG TCA GCC ATG 1620 Ala Ala Phe Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ser Gln Arg Ser Ala Met 530 535 540 GCC GCC GTT CTC CAC GTG CGG AGT CAT TCA GAA GTG CCA GGG TTT 1665 Ala Ala Val Leu His Val Arg Ser His Ser Glu Val Pro Gly Phe 545 550 555 TTC ACA GAA GGA AAT GAC GTG GCA GAT AGC CAA GCC ACC TTT CAA 1710 Phe Thr Glu Gly Asn Asp Val Ala Asp Ser Gln Ala Thr Phe Gln 560 565 570 GCG TAT CCC TTG AGA GAG GCT AAA GAT CTT CAT ACC GCT CTC CAT 1755 Ala Tyr Pro Leu Arg Glu Ala Lys Asp Leu His Thr Ala Leu His 575 580 585 ATT GGA CCC CGC GCG CTA TCC AAA GCG TGT AAT ATA TCT ATG CAG 1800 Ile Gly Pro Arg Ala Leu Ser Lys Ala Cys Asn Ile Ser Met Gln 590 595 600 CAG GCT AGG GAG GTT GTT CAG ACC TGC CCG CAT TGT AAT TCA GCC 1845 Gln Ala Arg Glu Val Val Gln Thr Cys Pro His Cys Asn Ser Ala 605 610 615 CCT GCG TTG GAG GCC GGG GTA AAC CCT AGG GGT TTG GGA CCC CTA 1890 Pro Ala Leu Glu Ala Gly Val Asn Pro Arg Gly Leu Gly Pro Leu 620 625 630 CAG ATA TGG CAG ACA GAC TTT ACG CTT GAG CCT AGA ATG GCT CCC 1935 Gln Ile Trp Gln Thr Asp Phe Thr Leu Glu Pro Arg Met Ala Pro 635 640 645 CGT TCC TGG CTC GCT GTT ACT GTG GAC ACC GCC TCA TCA GCG ATA 1980 Arg Ser Trp Leu Ala Val Thr Val Asp Thr Ala Ser Ser Ala Ile 650 655 660 GTC GTA ACT CAG CAT GGC CGT GTT ACA TCG GTT GCT GCA CAA CAT 2025 Val Val Thr Gln His Gly Arg Val Thr Ser Val Ala Ala Gln His 665 670 675 CAT TGG GCC ACG GCT ATC GCC GTT TTG GGA AGA CCA AAG GCC ATA 2070 His Trp Ala Thr Ala Ile Ala Val Leu Gly Arg Pro Lys Ala Ile 680 685 690 AAA ACA GAT AAC GGG TCC TGT TTC ACG TCT AAA TCC ACG CGG GAG 2115 Lys Thr Asp Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ser Lys Ser Thr Arg Glu 695 700 705 TGG CTC GCG AGA TGG GGG ATA GCA CAC ACC ACC GGG ATT CCG GGA 2160 Trp Leu Ala Arg Trp Gly Ile Ala His Thr Thr Gly Ile Pro Gly 710 715 720 AAT TCC CAG GGT CAA GCT ATG GTA GAG CGG GCC AAC CGG CTC CTG 2205 Asn Ser Gln Gly Gln Ala Met Val Glu Arg Ala Asn Arg Leu Leu 725 730 735 AAA GAT AAG ATC CGT GTG CTT GCG GAA GGG GAC GGC TTT ATG AAA 2250 Lys Asp Lys Ile Arg Val Leu Ala Glu Gly Asp Gly Phe Met Lys 740 745 750 AGA ATC CCC GCC AGC AAA CAG GGG GAA CTA CTA GCC AAA GCA ATG 2295 Arg Ile Pro Ala Ser Lys Gln Gly Glu Leu Leu Ala Lys Ala Met 755 760 765 TAT GCC CTC AAT CAC TTT GAG CGT GGT GAA AAC ACG AAA ACA CCG 2340 Tyr Ala Leu Asn His Phe Glu Arg Gly Glu Asn Thr Lys Thr Pro 770 775 780 GTA CAA AAA CAC TGG AGA CCT ACC GTT CTT ACA GAA GGA CCC CCG 2385 Val Gln Lys His Trp Arg Pro Thr Val Leu Thr Glu Gly Pro Pro 785 790 795 GTT AAA ATA CGA ATA GAG ACA GGG GAG TGG GAA AAA GGA TGG AAC 2430 Val Lys Ile Arg Ile Glu Thr Gly Glu Trp Glu Lys Gly Trp Asn 800 805 810 GTG CTA GTC TGG GGC CGA GGT TAT GCC GCT GTG AAA AAC AGG GAC 2475 Val Leu Val Trp Gly Arg Gly Tyr Ala Ala Val Lys Asn Arg Asp 815 820 825 ACT GAT AAG GTT ATT TGG GTA CCC TCT CGA AAG GTT AAA CCG GAC 2520 Thr Asp Lys Val Ile Trp Val Pro Ser Arg Lys Val Lys Pro Asp 830 835 840 ATC ACC CAA AAG GAT GAG GTG ACT AAG AAA GAT GAG GCG AGC CCT 2565 Ile Thr Gln Lys Asp Glu Val Thr Lys Lys Asp Glu Ala Ser Pro 845 850 855 CTT TTT GCA GGC AGT TCT GAC TGG ATA CCC TGG GGA GAC GAG CAA 2610 Leu Phe Ala Gly Ser Ser Asp Trp Ile Pro Trp Gly Asp Glu Gln 860 865 870 GAA GGA CTC CAA GAA GAA GCC GCC AGC AAC AAG CAA GAA GGA CCC 2655 Glu Gly Leu Gln Glu Glu Ala Ala Ser Asn Lys Gln Glu Gly Pro 875 880 885 GGA GAA GAC ACC CTT GCT GCC AAC GAG AGT 2685 Gly Glu Asp Thr Leu Ala Ala Asn Glu Ser 890 895

【００２４】配列番号：2 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCCTAGGAA GAGATTGTCT GCAGG 25

【００２５】配列番号：3 配列の長さ：3252 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列： AATTCCCATG CGAAAGTCTC GGGACATGAT AGAGTTGGGG GTTATTAACC GAGACGGGTC 60 GTTGGAGCGA CCCCTGCTCC TTTTCCCCGC CGTAGCTATG GTTAGGGGGA GTATCCTAGG 120 AAGAGATTGT CTGCAGGGCC TAGGGCTCCG CTTGACAAAT TTGTAGGGAG GGCCACTGTT 180 CTTACTGTTG CGCTACATCT GGCTATTCCG CTCAAATGGA AGCCAGACCA CACGCCTGTG 240 TGGATTGACC AGTGGCCCCT TCCTGAAGGT AAACTTGTAG CGGTAACGCA ATTAGTGGAA 300 AAAGAATTAC AGTTAGGACA TATAGAACCC TCACTTAGCT GTTGGAACAC ACCTGTCTTT 360 GTGATCCGGA AGGCTTCCGG GTCTTATCGC TTATTGCATG ACTTACGCGC TGTTAACGCC 420 AAGCTTGTTC CTTTTGGGGC TGTCCAACAG GGGGCGCCAG TTCTCTCCGC GCTCCCGCGT 480 GGCTGGCCCC TGATGGTTCT AGACCTCAAG GATTGCTTCT TTTCTATCCC TCTTGCGGAA 540 CAAGATCGCG AAGCTTTTGC ATTTACGCTC CCCTCTGTGA ATAACCAGGC CCCCGCTCGA 600 AGATTCCAAT GGAAGGTCTT GCCCCAAGGG ATGACCTGTT CTCCCACTAT CTGTCAGTTG 660 GTAGTGGGTC AGGTGCTCGA GCCCTTGCGA CTCAAGCACC CAGCTCTGCG CATGTTGCAT 720 TATATGGACG ATCTTTTGCT AGCCGCCTCA AGTCATGATG GGTTGGAAGC GGCAGGGAAG 780 GAGGTTATCG GTACATTGGA AAGAGCCGGG TTCACTATTT CGCCGGATAA GATCCAGAGG 840 GAGCCCGGAG TACAATATCT TGGGTACAAG TTAGGCAGTA CGTATGTAGC ACCCGTAGGC 900 TTGGTAGCAG AACCCAGGAT AGCCACCTTG TGGGATGTTC AAAAGCTGGT GGGGTCACTT 960 CAGTGGCTTC GCCCAGCGTT AGGGATCCCG CCACGACTGA TGGGTCCCTT TTATGAGCAG 1020 TTACGAGGGT CAGATCCTAA CGAGGCGAGG GAATGGAATC TAGACATGAA AATGGCCTGG 1080 AGAGAGATCG TACAGCTTAG CACTACTGCT GCCTTGGAAC GATGGGACCC TGCCCAGCCT 1140 CTGGAAGGAG CGGTCGCTAG ATGTGAACAG GGGGCAATAG GGGTCCTGGG ACAGGGACTG 1200 TCCACACACC CAAGGCCATG TTTGTGGTTA TTCTCCACCC AACCCACCAA GGCGTTTACT 1260 GCTTGGTTAG AAGTGCTCAC CCTTTTGATT ACTAAGCTAC GCGCTTCGGC AGTGCGAACC 1320 TTTGGCAAGG AGGTTGATAT CCTCCTGTTG CCTGCATGCT TCCGGGAGGA CCTTCCGCTC 1380 CCGGAGGGGA TCCTGTTAGC ACTTAGGGGG TTTGCAGGAA AAATCAGGAG TAGTGACACG 1440 CCATCTATTT TTGACATTGC GCGTCCACTG CATGTTTCTC TGAAAGTGAG GGTTACCGAC 1500 CACCCTGTGC CGGGACCCAC TGTCTTTACC GACGCCTCCT CAAGCACCCA TAAAGGGGTG 1560 GTAGTCTGGA GGGAGGGCCC AAGGTGGGAG ATAAAAGAAA TAGTTGATTT GGGGGCAAGT 1620 GTACAACAAC TGGAGGCACG CGCTGTGGCC ATGGCACTTC TGCTGTGGCC GACAACGCCC 1680 ACTAATGTAG TGACTGACTC TGCGTTTGTT GCGAAAATGT TACTCAAGAT GGGACAGGAG 1740 GGAGTCCCGT CTACAGCGGC AGCTTTTATT TTAGAGGATG CGTTAAGCCA AAGGTCAGCC 1800 ATGGCCGCCG TTCTCCACGT GCGGAGTCAT TCAGAAGTGC CAGGGTTTTT CACAGAAGGA 1860 AATGACGTGG CAGATAGCCA AGCCACCTTT CAAGCGTATC CCTTGAGAGA GGCTAAAGAT 1920 CTTCATACCG CTCTCCATAT TGGACCCCGC GCGCTATCCA AAGCGTGTAA TATATCTATG 1980 CAGCAGGCTA GGGAGGTTGT TCAGACCTGC CCGCATTGTA ATTCAGCCCC TGCGTTGGAG 2040 GCCGGGGTAA ACCCTAGGGG TTTGGGACCC CTACAGATAT GGCAGACAGA CTTTACGCTT 2100 GAGCCTAGAA TGGCTCCCCG TTCCTGGCTC GCTGTTACTG TGGACACCGC CTCATCAGCG 2160 ATAGTCGTAA CTCAGCATGG CCGTGTTACA TCGGTTGCTG CACAACATCA TTGGGCCACG 2220 GCTATCGCCG TTTTGGGAAG ACCAAAGGCC ATAAAAACAG ATAACGGGTC CTGTTTCACG 2280 TCTAAATCCA CGCGGGAGTG GCTCGCGAGA TGGGGGATAG CACACACCAC CGGGATTCCG 2340 GGAAATTCCC AGGGTCAAGC TATGGTAGAG CGGGCCAACC GGCTCCTGAA AGATAAGATC 2400 CGTGTGCTTG CGGAAGGGGA CGGCTTTATG AAAAGAATCC CCGCCAGCAA ACAGGGGGAA 2460 CTACTAGCCA AAGCAATGTA TGCCCTCAAT CACTTTGAGC GTGGTGAAAA CACGAAAACA 2520 CCGGTACAAA AACACTGGAG ACCTACCGTT CTTACAGAAG GACCCCCGGT TAAAATACGA 2580 ATAGAGACAG GGGAGTGGGA AAAAGGATGG AACGTGCTAG TCTGGGGCCG AGGTTATGCC 2640 GCTGTGAAAA ACAGGGACAC TGATAAGGTT ATTTGGGTAC CCTCTCGAAA GGTTAAACCG 2700 GACATCACCC AAAAGGATGA GGTGACTAAG AAAGATGAGG CGAGCCCTCT TTTTGCAGGC 2760 AGTTCTGACT GGATACCCTG GGGAGACGAG CAAGAAGGAC TCCAAGAAGA AGCCGCCAGC 2820 AACAAGCAAG AAGGACCCGG AGAAGACACC CTTGCTGCCA ACGAGAGTTA ACTATATTCT 2880 CATTATTGGT GTCCTGGTCT TGTGTGAGGT TACGGGGGTA ACGAGCTGAT GTTCACTTAC 2940 TCGAGCAGCC GGGGAACCTT TGGATTACAT GGGCCAGCCG TACAGGCCAA ACGGATTTCT 3000 GCCTTTCTAC ACAGTCAGCC ACCTCCCCTT TTCAAACATG TTTGATAGGT ATCCCGTCCC 3060 CTATTTCTGA GGGTGATTTT AAGGGATATG TCTCTGATAA TTGCACCACT TTGGAACCTC 3120 ACCGGTTAGT CTCGAGAGGC ATTCCTGGCG GACCTGAGAA CAGCACAACC CTTACCTATC 3180 AGAAGGATTC ATGCTTGTTG TTAAAGCTGA ATGTGTCTCT GTTGGACGAG CCATCAGAAC 3240 TACAACTGCT AG 3252

【００２６】配列番号：4 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAACGAATTC GACTGTTGCG CTACATCTG 29

【００２７】配列番号：5 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATAAGAGCTC TTAACTCTCG TTGGCAGC 28

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＴ８ＲＡＶの構築図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 野田 晃弘 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 中島 和男 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寶酒造 株式会社中央研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたＲＡＶ−２由来逆転写酵素遺
   伝子。
2. 【請求項２】 塩基配列が配列表の配列番号１で表され
   る請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 プラスミドｐＴ８ＲＡＶから単離される
   請求項１記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１記載の遺伝子を含有するプラス
   ミドを保有する形質転換体を培養し、該培養物からＲＡ
   Ｖ−２由来逆転写酵素を採取することを特徴とするＲＡ
   Ｖ−２由来逆転写酵素の製造方法。