JPH11509416A - メラトニン・レセプタを暗号化する核酸配列及びそれらの適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｍｅｌ_1cタイプとも称されるＭＥＬ１−Ａタイプのアフリカツメガエルのメラトニン・レセプタを暗号化する核酸配列、これらの配列に含まれるオリゴヌクレオチド、それらをプローブとして、ＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタ活動を有するタンパク質及び／又はこれらタンパク質の断片を発現するために使用する方法、この発現に用いられ得るベクター、これらのベクターを含む宿主細胞、及びメラトニン・レセプタを研究するためのモデル。メラトニン・レセプタ活動を有するタンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニスト活動を持つ物質をスクリーニングするための方法、及びメラトニン・レセプタ活動を有するそれらのタンパク質に対する種々の物質の親和性を検出するためのキット。上記したＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタを暗号化する核酸配列は、次の配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５又はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７から選ばれる。

Description

【発明の詳細な説明】 メラトニン・レセプタを暗号化する核酸配列及びそれらの適用 本発明は、ＭＥＬ１−Ａタイプのアフリカツメガエル(xenopus)のメラトニン ・レセプタ（受容体）（以下、Ｍｅｌ_1Cとも称す）を暗号化乃至は記号化する（ encoding）核酸配列、該核酸配列に含まれるオリゴヌクレオチド、それらのプロ ーブとしての使用方法、ＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタ活動 を有するタンパク質及び／又はこれらのタンパク質断片を発現するための使用方 法、該発現に使用されるベクター、該ベクターを含む宿主細胞、及びメラトニン ・レセプタを研究するためのモデルに関する。 本発明は、更に、メラトニン・レセプタ活動を有するタンパク質に対する、ア ゴニスト的(agonistic)又はアンタゴニスト的（antagonistic）活動を有する物 質をスクリーニングする方法、及びメラトニン・レセプタ活動を有する前記タン パク質に対する種々の物質の親和性の度合を検出するためのキットに関するもの である。 アフリカツメガエル（Xenopus laevis）のメラトニン・レセプタについての記 載が有り（Ｔ．エビサワ他、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、1994、91、6133-613 7）、それは４２０個のアミノ酸のタンパク質である。 しかしながら、このタンパク質を暗号化する配列を、対応する核酸配列の３′ 部分に位置するプライマーを使用して増幅することは不可能であった。 この理由により、本出願人の目的は、ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセ プタを暗号化することが可能で、且つ、それら全体が容易に増幅可能な核酸配列 を求めることにあった。 本発明は、ＭＥＬ１−Ａタイプであり、また、エビサワ他のものに記載された レセプタとは構造が異なっており、更には前記のレセプタとは異なる共役（coup ling）特性及び調節（regulatory）特性を示す機能的メラトニン・レセプタを暗 号化する核酸配列に関する。前記核酸配列は、本願に含まれる配列リストに示さ れる如く、配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７の中から選択されるものである。 本発明に従うこれらの核酸配列は、３′非暗号化（non-coding）配列を有して おり、この非暗号化配列には、短配列と長配列（長配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１ 及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５；短配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７）がある。３′非暗号化配列は、ＲＮＡ調節、即ち、ＲＮＡ半減期におい て、重要な役割を果たすものであり、先行技術の配列に対して修飾されたもので ある。 特に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３配列は、先行技術に記 載された配列よりもアミノ酸の数が６５個少なく、Ｃ末端位置の２つのアミノ酸 も異なっているタンパク質を暗号化するものである。このタンパク質は、ＭＥＬ １−Ａａ又はＭｅｌ_1C(α₎と称されるメラトニン・レセプタに相当する。 ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５、及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７配列は、先行技術に記載さ れた配列よりもアミノ酸の数が６５個少なく、加えて、６アミノ酸残基は、先行 技術の配列のものと異なるタンパク質を暗号化するものである。このタンパク質 は、ＭＥＬ１−Ａｂ又はＭｅｌ_1C(β₎と称されるメラトニン受容体に相当する。 ＭＥＬ１−Ａａ又はＭｅｌ_1C(α₎レセプタを暗号化する配列、及びＭＥＬ１− Ａｂ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを暗号化する配列の両者は、３′非暗号化配列を 保持する際に、ＲＮＡ調節における修飾をもたらし得る（アゴニスト的リガンド による調節；ＲＮＡ寿命の長さ）。 予期せぬことに、アデニル酸シクラーゼを阻害するレセプタは、ＭＥＬ１−Ａ ａ又はＭｅｌ_1C(α₎のみであり、ＭＥＬ１−Ａｂ又はＭｅｌ_1C(β₎は、アデニル 酸シクラーゼを阻害する特性を欠く。 また、これらのタンパク質に関連した他の生物学的な信号が有る。特に、これ らの２つの対立遺伝子イソフォルム(allelic isoform)は、細胞内のｃＧＭＰを 転形（dose-dependent modulation:用量依存転形）することが可能であり、また 、特に、ホスホジエステラーゼの阻害剤により引き起こされるｃＧＭＰの蓄積を 阻害する。 本発明は、更に、所定のメラトニン・レセプタに対応するペプチドを機能的に 発現するため、又は前記レセプタを暗号化する配列を検出するために用いられる 前記配列の断片（fragment）に関するものである。 該断片の中でも、本発明は、特に： − 配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１又はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５のヌクレオチド１ ０５７−１２８６に対応する、２３０個のヌクレオチド塩基対のセグメントより 成る配列； − 配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３又はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７のヌクレオチド１ ０５７−１１２５に対応する、６９個のヌクレオチド塩基対のセグメントより成 る配列を含む。 本発明は、また、前記ヌクレオチド配列との交雑育種(hybridize)を特徴とす るヌクレオチド・プローブに関するものである。 特に適切なハイブリッド形成の条件は、次の通りである。即ち、ハイブリッド 形成は、４×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ、及び５×デンハル ト（Denhardt）緩衝剤から成る４２℃の緩衝液において、実行される。 かくの如きプローブは、特に、ＭＥＬ１−Ａ（ＭＥＬ１−Ａａ又はＭＥＬ１− Ａｂ）タイプの機能的なメラトニン・レセプタの種々の変位体を特徴づけ得る利 点を持つ。 本発明は、又、前記せるように、ヌクレオチド配列により暗号化されること、 及び機能的なＭＥＬ１タイプのメラトニン・レセプタ活動を有することを特徴と するタンパク質及び／又はタンパク質断片に関する。 本発明によれば、前記タンパク質は、本願に含まれる配列リストに示される如 く、配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２（配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２と同一）又は配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.６（配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo. ８はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.６と同一）の中から選択される。 配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及びＮo.４は、ＭＥＬ１−Ａａ又はＭｅｌ_1C(α₎ と称されるメラトニン・レセプタに対応し、配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.６及びＮ o.８は、ＭＥＬ１−Ａｂ又はＭｅｌ_1C(β₎と称されるメラトニン・レ セプタに対応している。 先行技術のタンパク質とは構造を異にするこれら二つのタンパク質は、予期せ ぬことに、とりわけＧタンパク質への共役（signallig:シグナル化）に関して、 以前に記載されたものとは異なる反応及び生物学的信号を示す。 本発明は、更に、本発明に従うヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換 え体クローニング(recombinant cloning)及び／又は発現ベクター（expression vector）に関する。 本発明の意味において、組換え体ベクターは、プラスミド、コスミド又はファ ージの何れかを意味するものと理解される。 前記ベクターの一つの有利な具体例に従えば、該ベクターは、前記ヌクレオチ ド配列が挿入された組換え体ベクターより成る。該組換え体ベクターは、本発明 に従う機能的なＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタ活動を有するタンパ ク質を発現するためのベクターである。 この具体例の有利な一態様によれば、該組換え体ベクターは、ＲＳＶプロモー ター及び配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１を含むｐｃＤＮＡ３（Invitrogen：インビ トロゲン）プラスミドより成るものである。 このタイプのプラスミドは、Ｘ−ＭＥＬ１ａと名付けられて、パスツール研究 所（INSTITUT PASTEUR）により運営される微生物培養寄託所（Collection Natio nale de Culture de Microorganismes）に、寄託番号Ｉ−１５８３として、１９ ９５年６月７日に寄託された。 この具体例の別の有利な態様によれば、前記ベクターは、ＲＳＶプロモーター 及び配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５を含むｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）プラス ミドより成る。 このタイプのプラスミドは、Ｘ−ＭＥＬ１ｂと名付けられて、パスツール研究 所により運営される微生物培養寄託所に、寄託番号Ｉ−１５８４として、１９９ ５年６月７日に寄託された。 本発明は、更に、遺伝的形質転換により得られ、且つ本発明に従う発現ベクタ ーにより形質転換されることを特徴とする適切な宿主細胞に関する。 かかる宿主細胞は、ＭＥＬ１−Ａタイプの機能的なメラトニン・レセプタ活動 （functional melatonin receptor activity）を有するタンパク質を発現するこ とが可能である。 一つの有利な具体例によれば、該宿主細胞は、特に、Ｌ細胞系（L cell line ）の細胞より成るものである。 本発明は、また、本発明に従うタンパク質を発現するための方法に関する。そ の方法は、ＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタ活動を有するタン パク質を暗号化する、本発明に従うヌクレオチド配列を含むベクターにより形質 転換する宿主細胞が、前記レセプタのメンブレン間配列（transmembrane sequen ce）が形質転換された宿主細胞のメンブレンの表面に露出するように、前記発現 タンパク質を産生してメンブレンの方へ運搬するように、培養されることを特徴 とするものである。 本発明は、更に、ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタを研究するため のモデルに関する。そのモデルは、本発明に従う宿主細胞、即ち、メンブレンの 表面においてＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタを発現する宿主 細胞から成ることを特徴とするものである。 かかるモデルは、特に、ＭＥＬ１−Ａタイプのレセプタ（アゴニスト及びアン タゴニスト）の特定のリガンドの同定を可能とすることによって、そしてそれ故 に生物時計の調整に有効な薬剤の開発を可能することにより、メラトニン・レセ プタの薬理学的見地からの研究を可能とし、特に心臓血管球（脂肪分解）及び癌 腫学（細胞の相への引き入れ）において、特に有利な用途を有する。 本発明は、更に、本発明に従うタンパク質に対する物質のリガンドとしての能 力を検出する方法に関する。その方法は： − 少なくとも一つの特定のサイト（site）と前記物質との間の結合の形成を 許容する条件下において、本発明に従う発現ベクターにより予め形質転換され且 つ該タンパク質（メラトニン・レセプタ）を発現する宿主細胞に、該物質を接触 せしめる工程と、 − リガンド／タンパク質タイプの複合体の形成を検出する工程と、 を含むことを特徴とする。 本発明は、加えて、本発明に従うタンパク質と一つ又は二つ以上の所定のリガ ンドとの間の親和性を研究する方法に関する。その方法は： − 本発明に従うベクターにより、所定の宿主細胞を形質転換する工程と、 − ヌクレオチド配列により暗号化される、ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン ・レセプタが、機能的メラトニン・レセプタのメンブレン間配列が形質転換され た宿主細胞の表面に露出するように、発現されて、前記宿主細胞のメンブレンに 運搬され得る条件下で、前記宿主細胞を培養する工程と、 − 前記宿主細胞を所定のリガンドに接触せしめる工程と、 − 形質転換された前記宿主細胞と前記所定のリガンドとの間の親和性反応を 検出する工程と、 を含むことを特徴とする。 本発明は、更にまた、本発明に従うタンパク質に対するリガンドの親和性を検 出するキットに関する。このキットは： − 本発明に従う発現ベクターにより形質転換される宿主細胞の培養体と、 − 必要ならば、本発明に従うヌクレオチド配列により暗号化され且つプロモ ーターが誘導され得るベクターに含まれるタンパク質（ＭＥＬ１−Ａタイプのメ ラトニン・レセプタ）の発現を誘導するための、適切な物理的又は化学的手段と 、 − 前記タンパク質に対して所定の親和性を有する一つの又はそれ以上のコン トロール・リガンド（control ligand）と、 − 発現されたタンパク質の生物学的活動を特徴づけるための物理的又は化学 的手段と、 を含むことを特徴とする。 本発明に従うＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタは、予期せぬことに 、まさに機能的なレセプタであり、また、前記使用方法の全てを実施可能とする ものである。 以上説明した態様に加え、本発明は、更に、本発明に係わる方法の代表的な実 施例の、下記の添付図面を参照した説明から明らかとなる他の態様をも含むもの である。 図１は、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）からのメラトニン・レセプタ のｃＤＮＡをクローン化する仕組みを示す図である。 図２は、使用される種々のクローニング断片を示す図である。なお、メラトニ ン・レセプタを暗号化するものであり、アフリカツメガエルの皮膚メラニン細胞 を使用して前もって同定されたｃＤＮＡ配列の特定のセンス（Ｓ）（→）プライ マー及びアンチセンス（ＡＳ）（←）プライマーの位置、及びこの配列 図３は、メラトニン・レセプタのｃＤＮＡ断片をクローニング及び配列決定す る工程を示している。 図４は、Ｍｅｌ_1C(α₎メラトニン・レセプタとＭｅｌ_1C(β₎メラトニン・レセ プタをそれぞれ暗号化する配列の比較を表すものである。Ｍｅｌ_1C(α₎メラトニ ン・レセプタは（○）にて、またＭｅｌ_1C(β₎メラトニン・レセプタを特徴付け る置換体は（●）にて、それぞれ、図４Ａに図示されている。また、長い及び短 い非翻訳（non-translated）３′領域のＤＮＡ配列は図４Ｂに示されている。Ｍ ｅｌ_1C(α₎レセプタは、短い非翻訳３′領域（３：１、短：長）に優先的に関連 している一方、Ｍｅｌ_1C(β₎レセプタは、長い非翻訳３′領域（１：３）に優先 的に関連している。更に、図４Ｂには、ＥｃｏＲＩクローニング・サイトが下線 にて示されている。 図５は、ＭＥＬ１−Ａ（ａ又はｂ）タイプの機能的なメラトニン・レセプタを 暗号化するｃＤＮＡ配列の暗号部位を、エビサワ他（前出参考文献）の配列と比 較して示している。 図６は、種々のタイプのアフリカツメガエルにおけるＭｅｌ_1C(α₎／Ｍｅｌ_{1C (} β₎レセプタを暗号化するＤＮＡｓの特徴を示している。このテストに使用され たＰＣＲ増幅は、図２の断片３を供給する。得られるＰＣＲ増幅産物 を消化するために用いられる制限酵素は、ＡｆｌII（Ｍｅｌ_1C(α₎配列及びＭｅ ｌ_1C(β₎配列の各々における１サイト）、Ｂｓｐ１２０Ｉ（Ｍｅｌ_1C(α₎配列に おける１サイト及びＭｅｌ_1C(β₎配列における無サイト）及びＰｍｌＩ（Ｍｅｌ_1C( β₎配列における１サイト及びＭｅｌ_1C(α₎配列における無サイト）である。 制限分析は、以下のゲノムＤＮＡｓから由来するＰＣＲ産物について実施される ：１．Ｘ．トロピカリス（tropicalis）; ２．Ｘ．ルーウェンゾリエンシス（ru wenzoriensis）; ３．ホモ接合（ｆｆ）Ｘ．リービス（laevis）固体; ４．クロ ーン化Ｍｅｌ_1C(α₎ｃＤＮＡ; ５．クローン化Ｍｅｌ_1C(β₎ｃＤＮＡ; ６．皮膚 ｍＲＮＡのプールより増幅されたＸ．リービス（laevis）ｃＤＮＡ; ７．ヘテロ 接合（ｆｆ）Ｘ．リービス（laevis）固体; ＮＤ．消化されていないＰＣＲ産物 。 図７は、本発明に従うレセプタ（Ｍｅｌ_1C(α₎又はＭｅｌ_1C(β₎）を発現する 安定Ｌ細胞の存在下における、２−（¹²⁵Ｉ）−ヨードメラトニン／メラトニン ・レセプタ結合の薬理学的特異性を示している。図７Ａは、２−（¹²⁵Ｉ）ヨー ドメラトニン結合の飽和等温線を示す。非特定結合は、１０μＭのメラトニンの 存在下において測定される。この図７Ａは、また、データのスキャッチャードプ ロット（Scatchard plot）を挿入図として含む。図７Ｂは、Ｉ−メラトニン（△ ）、メラトニン（□）、Ｎ−アセチル−５−ヒドロキシトリプタミン（ＮＡＳ） （○）、Ｓ２２１５３（▲）及びＳ２００９８（■）の存在下において、Ｍｅｌ_1C( α₎レセプタ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを発現するＬ細胞のメンブレンにおい て実施される、レセプタに対する２−（¹²⁵Ｉ）ヨードメラトニン（４００ｐＭ ）の競合的結合の研究を表している。 図８は、Ｍｅｌ_1C(α₎及びＭｅｌ_1C(β₎レセプタによる、ｃＡＭＰのフォルス コリン(forsKolin)により刺激された蓄積の転形（modulation）を示している。 Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ（●）又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを暗号化するｃＤＮＡに より形質転換されるＬ細胞の安定クローンは、各メラトニン濃度（横座標に示さ れる）の存在下においてフォルスコリン（ＦＫ）（１０μＭ）により刺激される 。また、縦座標には、ｃＡＭＰの細胞内におけるレベル が、％にて示されている。１００％値（□）は、１０μＭのフォルスコリンの存 在下におけるｃＡＭＰの平均値に相当する。（■）は、メラトニン（１０μＭ） のみの存在下（＊Ｐ＜０．０５）において得られるｃＡＭＰ値を示す。 図９は、過渡的な形質転換分析におけるメラトニン・レセプタによる、ｃＡＭ Ｐのイソプロテレノール(isoproterenol)により刺激された蓄積の転形を示して いる。Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタは、Ｌ細胞においてβ２ アドレナリン作動性レセプタ（β２−ＲＡ）により等量に発現され、且つ、メラ トニン（Ｍｅｌ、１０μＭ）の存在下又は不在下においてイソプロテレノール（ ＩＳＯ、１０μＭ）により刺激される。ｃＡＭＰレベルが測定される。ＮＴは、 形質転換されないことを表す。¹²⁵ＩＣＹＰ及び２−¹²⁵−Ｉ−ヨードメラトニン の形質転換された細胞における特定の結合サイトの数〔（特定のＩＣＹＰ結合サ イト／特定のヨードメラトニン結合サイト）として表され、タンパク質のｆｍｏ ｌ／ｍｇで示されている〕は、以下の通りである：ＮＴ（２４／０）；Ｍｅｌ_{1C (} α₎（５／７７）；Ｍｅｌ_1C(β₎（１３／１４８）；β２−ＲＡ（６２２／０） ；β２−ＲＡ／Ｍｅｌ_1C(α₎（３８６／５４）、β２−ＲＡ／Ｍｅｌ_1C(β₎（４ １６／１５１）（＊Ｐ＜０．０５）。 図１０は、メラトニン・レセプタによる、ｃＧＭＰ蓄積の転形を示している。 図１０Ａにおいては、Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ（□、○）又はＭｅｌ_1C(β₎レセプ タ（■、●）を暗号化するｃＤＮＡにより過渡的に形質転換されたＬ細胞が、横 座標にて示される各メラトニン濃度において、１ｍＭ ＩＭＢＸの存在下（○、 ●）又は不在下（□、■）にて培養される。図１０Ｂにおいては、Ｍｅｌ_1C(α₎ レセプタ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを暗号化するｃＤＮＡにより過渡的に形質転 換されたＬ細胞が、緩衝剤にて又は百日咳毒素（ＰＴＸ、１００ｎｇ／ｍｌ）に より１８時間、前培養され、その後、１ｍＭのＩＢＭＸの存在下及び１０μＭの メラトニンの存在下若しくは不在下にて培養される。細胞内のｃＧＭＰレベル（ 縦座標に示される）が決定される。 しかし、これらの実施例は、本発明の主題を例示する目的のみのために与え られるものであり、それらに何等限定されるものではないことは、当然理解され るべきである。 実施例１：ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタの四つの機能的配列 の単離及び同定 ａ）アフリカツメガエルのメラトニン・レセプタの暗号部位の増幅 先ず、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の皮膚からの全ＲＮＡが、核酸 １ｍｇ当たりＲＮａｓｅフリーのＤＮＡｓｅ Ｉ（ＲＱＩ ＤＮａｓｅ，Promeg a）０．３Ｕにより、３７℃にて２０分間、処理される。２００ｎｇのＲＮＡ（ 反応に先立って６５℃で５分間熱せられる）を、３７℃にて３０分間、Stratage ne“Stratascript RNAse H-” ＭＭＬＶ逆転写酵素の１００単位を用いて、培養 することにより、ｃＤＮＡが合成される。 ９５℃（５分間）での不活性化の後、ｃＤＮＡが、アフリカツメガエルのメラ トニン・レセプタに特有なオリゴヌクレオチドの種々の対を用い、更にＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム）をその緩衝と共に用いて、５ ０μｌ容量の２ｍＭのＭｇＳＯ₄の存在下において、ＰＣＲにより増幅される。 ｃＤＮＡが、９４℃にて２分間、変性され、その後４０倍に増幅される。次いで 、３分間の伸長（elongation）が７２℃にて実行される。１サイクルは、９４℃ における１５秒、オリゴヌクレオチド対の所定温度における３０秒、及び７２℃ における９０秒に対応する（GeneAmp PCR システム 960、Perkin-Elmer Cetus） 。Ｘ．リービス（laevis）メラトニン・レセプタ（図２）を暗号化するｃＤＮＡ の種々の断片を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチド対は、次の通りで ある： − 断片１：５′ＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＡＧＣＡ３′（Ｓ ＥＱ ＩＤ Ｎo.９）（３Ｓ、位置２８）及び５′ＣＧＧＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡ ＡＣＴＧＡＣＡＡＣＡ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１０）（３ＡＳ、位置２４１） （所定ハイブリダイゼーション温度５４℃）； − 断片２：５′ＴＡＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＧＴＣ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１１）（５Ｓ、位置１８３）及び５′ＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴ ＴＴＧＡＴＴＡＴ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１２）（５ＡＳ、位置４６２）（所 定ハイブリダイゼーション温度５０℃）； − 断片３：５′ＣＴＴＣＡＡＣＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＣ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１３）（６Ｓ、位置３９１）及び５′ＴＧＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧ ＴＴＧＧＴＴＡＣ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１４）（６ＡＳ，位置７６４）（所 定ハイブリダイゼーション温度５０℃）； ｂ）アフリカツメガエルのメラトニン・レセプタの３′端の増幅 非翻訳３′領域を含む断片４は、AmpliFINDER^TM RACE（Clontech）キッ ト及び以下のオリゴヌクレオチド：５′ＴＡＴＧＧＴＧＴＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡ ＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１５）及び５′ ＴＡＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＴＧＡＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＧＴＴＧＴＴＴ３ ′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１６）（ハイブリダイゼーション温度５８℃）を使用す ることにより増幅される。 更には、メラトニン・レセプタの全体を暗号化するｃＤＮＡは、以下のプ ライマー：５′ＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＡＧＣＡ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１７）（３Ｓ）及び５′ＴＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡ ３′（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１８）（１２ＡＳ）（ハイブリダイゼーション温度５ ２℃）を使用することにより増幅され得る。幾つかのプライマーの、メラトニン ・レセプタのｃＤＮＡを増幅する能力が、テストされた（図２）。 重複配列（断片１〜３）を含み且つＡｌａ ３４９までの断片を暗号化する領 域に対応するプライマーの三つの異なる対を使用することにより、所望のｃＤＮ Ａの８０％以上が増幅された。 暗号化領域の最後の３′部位及び３′非暗号化領域を増幅する全ての試みは、 失敗に帰した。 メラトニン・レセプタのｃＤＮＡのこの残りの部位が、ｃＤＮＡの３′端のポ リアデニル化サイトをプライマー（原理が図３に記載されている）として用いる 、修飾されたＰＣＲ反応により、増幅された。 この方法により、それぞれ、４００ｂｐ（短断片）及び６００ｂｐ（長断 片）と推定される二つの増幅断片が得られる。４００ｂｐの短断片は、２５０個 の非暗号化塩基対（短３′）と１５０個の暗号化塩基対を含む。６００ｂｐの長 断片は、４５０個の非暗号化塩基対（長３′）と１５０個の暗号化塩基対を含む 。 これらの断片を二つの制限酵素にて消化することにより、予期した制限プロフ ィールが得られる。 増幅産物が、それぞれ別々にベクターにクローン化され、そして酵素的消化に より及びジデオキシ法（４−６クローン／断片）を用いた配列決定により、特徴 付けられる。 断片１は、配列２８−２４１に対応する。先行技術（エビサワ他）に記載の配 列と同じ３つのクローンが配列決定された。 断片２及び断片３を含むクローンの幾つかは、先行技術の配列と同じであり、 その他のものは核酸配列において異なる。 二つの非発現（silent）ヌクレオチド置換体（substitution）（アミノ酸配列 の修飾がない）が、断片２の一つの変位体において見られる。一方、断片３の変 位体には、アミノ酸配列（図４及び５参照）の対応する修飾が得られる２６個の 非発現（silent）ヌクレオチド置換体と６個の置換体とが含まれる。 同時に、四つの断片の短い形態及び長い形態は、位置３５３におけるメチオニ ンまで、メラトニン・レセプタの公知の配列と強い相同性（homology）を呈する 。 短断片４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５及びＮo.７参照）（断片Ｓ）の場合、メチオ ニン３５３を越えて二つの異なるアミノ酸が検出された。即ち、ロイシン（位置 ３５４）に置換するチロシン、及びグリシン（位置３５５）に置換するバリンが 、ストップ・コドン（stop codon）に先行して検出され、アフリカツメガエルの メラトニン・レセプタ（図４Ａ）の先行技術の配列と比べて、アミノ酸が６５個 失われた。 アフリカツメガエル、ヒト及び羊のレセプタのアミノ酸配列を一致させること により、アフリカツメガエルのメラトニン・レセプタの先行技術配列は、二 つの他の種のレセプタ（レパート他、１９９４）のものよりかなり長いＣ−末端 尾を有していることが示される。 先行技術の配列とは異なり、アフリカツメガエルより得られる本発明に従うメ ラトニン・レセプタは、ヒト及び羊から得られるメラトニン・レセプタと同一の サイズのものである。 長断片４（断片Ｌ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及びＮo.３参照）の場合、四つの クローンが配列決定された。それらのクローンの一つは、メチオニン３５３まで 先行技術の配列に対応するものであるが、他の三つは、メチオニン３５３までに ついて、短断片に観察されるものと同じ変化を呈する。全てのクローンにおいて 、アミノ酸３５４と３５５は、先行技術の配列と比較して修飾されたものとなっ ており、短断片に見られ得るように、ストップ・コドンが、位置３５６に存在す る。 更に、長断片の３′非暗号化領域は、ポリアデニル化テール（tail）までの短 断片のものと同じである。その領域は、１６０ｂｐの配列を更に含み、その後に そのポリアデニル化テールが続く（配列表、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及びＮo.３参 照）。 全配列に見られる配列の相違が、図５に、下線で示されている。 このように、予期せぬことに、ＲＴ−ＰＣＲで得られるメラトニン・レセプタ の配列決定により、二つの異なる配列（ＭＥＬ１−Ａａ及びＭＥＬ１−Ａｂ）が 判明する。 また、全メラトニン・レセプタを暗号化するｃＤＮＡは、アフリカツメガエル の皮膚のＤＮＡから、ＰＣＲにより、プライマー３Ｓ及び１２ＡＳを用いて、増 幅され得るものである。後者のプライマーは、３′非暗号化領域に位置せしめら れている（図２参照）。 幾つかのクローンの制限分析により、メラトニン・レセプタの二つの異なるｍ ＲＮＡが、分析されたサンプルに確かに存在することが、確認される。 これらの二つのｍＮＲＡは、チキンのＭｅｌ_1cレセプタに非常に類似する（７ ８％相同性）３５４個のアミノ酸のタンパク質を暗号化する。 従って、断片Ｓ（短断片）もＭｅｌ_1C(α₎で表され、断片Ｌ（長断片）（多く の置換体を含む）がＭｅｌ_1c(β₎で表される。 実施例２：機能的ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタを発現するベ クターの構成 アフリカツメガエル（Xenopus laevis）のメラトニン・レセプタを、ＲＴ−Ｐ ＣＲ法に従ってクローン化した（図１参照）。 アフリカツメガエルの皮膚からＲＮＡを単離し、逆転写酵素を用いて、これを ｃＤＮＡに転写する。 メラトニン・レセプタのｃＤＮＡを、このレセプタに特異なＰＣＲプライマー を用いて、選択的に増幅する。 増幅されたレセプタを、プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）の誘導体 である発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＲＳＶにクローン化する。この発現ベクター ｐｃＤＮＡ３−ＲＳＶが、下記の配列決定法により、確認された。 断片を、断片対に共通の制限酵素を用いて、順次予備的に互いに連結（ligati on）することにより、メラトニン・レセプタの全体を、ラウス肉腫ウイルス（Ro us sarcoma virus：ＲＳＶ）プロモータの制御下において、平滑末端のＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｂｓｐ１２０ＩサイトでプラスミドｐｃＤＮＡ３／ＲＳＶ内に挿入する ことが出来た。先ず、暗号化配列の位置４５５において、断片２及び断片３を、 それらの共通の“ＨｉｎｄＩＩＩ”酵素サイトにて互いに結合する。次いで、こ の後者の断片を、位置２０２において、共通の“Ｂｓｕ３６Ｉ”サイトで断片１ に結合し、更に位置１０１６において共通の“ＸｂａＩ”サイトで断片４に結合 する。最初に、順次連結するために必要な二つの酵素により、各断片を切断する 。この精製断片は、断片１、２、３及び４から成り、その５′端と３′端は、そ れぞれ、平滑末端のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩである。次に、その精製断片 をＰｃＤＮＡ３／ＲＳＶ内に挿入する。 実施例３：幾つかのアフリカツメガエル種におけるＭｅｌ_1c遺伝子座の特徴 高い相同性を有するＭｅｌ_1c(α₎（又はＭｅｌ１−Ａａ）レセプタ及びＭｅｌ_1c( β₎（又はＭｅｌ１−Ａｂ）レセプタは、同一の遺伝子座における二つの異な る対立遺伝子、又は異なる遺伝子により暗号化される二つのイソフォルムを表し 得る。 この問題を解くために、Ｍｅｌ_1c（又はＭｅｌ１−Ａ）レセプタを暗号化する 断片３を、４３体のアフリカツメガエルの個体のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより 増幅した。 これらの動物の幾つかは血族動物であるが、その他のものは、南アフリカから 輸入された野性動物である。 所定サイズの増幅ＤＮＡ断片を、Ｍｅｌ_1c(α₎又はＭｅｌ_1c(β₎ｃＤＮＡに特 異な、適当な制限酵素で、消化する（図６参照）。 Ｍｅｌ_1c(α₎レセプタを暗号化する遺伝子のみが、主要な組織適合性複合体及 びその他の遺伝標識に対するホモ接合性を有する一つのＸ．リービス（laevis） （ｆｆ）個体において観察される。 上記の遺伝標識に対するヘテロ接合性を有するものとして知られている第二の Ｘ．リービス（laevis）（ｒｆ）カエルのＰＣＲ分析により、二つの遺伝子（Ｍ ｅｌ_1c(α₎レセプタを暗号化する遺伝子及びＭｅｌ_1c(β₎レセプタを暗号する遺 伝子）の存在が、判明する（図６参照）。 この観察により、メラトニン・レセプタの二つのイソフォルムが同一の遺伝子 座により暗号化されるという仮説が、確認される。残りの４１体の動物の分析に より、二つの遺伝子（４０個体）の存在、又はＭｅｌ_1c(α₎遺伝子（１個体）の みの存在が判明する。それ自身にＭｅｌ_1c(β₎レセプタに対する遺伝子を有する 動物は、存在しない。 上記のものと同じ方法で、アフリカツメガエルの他の二つの種を研究した。 倍数体として知られる種であるＸ．ルーウェンゾリエンシス（ruwenzoriensis ）のゲノムＤＮＡの分析により、Ｍｅｌ_1c(α₎レセプタを暗号化する遺伝子の存 在が判明する。メラトニン・レセプタを暗号化し且つＭｅｌ_1c(α₎及びＭｅｌ_{1c (} β₎とは明らかに異なる二つの遺伝子が、Ｘ．トロピカリス（tr opicalis）及びＸ．ルーウェンゾリエンシス（ruwenzoriensis）の酵素消化パタ ーン（プロフィール）を比較することにより、検出された（図６参照）。 実施例４：機能的ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタの薬理 ａ）安定的発現 実施例２に従うアフリカツメガエルのメラトニン・レセプタの暗号化領域及び ３′非暗号化領域を含むベクターｐｃＤＮＡ３−ＲＳＶを、マウスのＬ細胞内に 形質転換する。 前日に、３×１０⁵個の細胞を、４．５ｇ／ｌのグルコース、１ｍＭのグルタ ミン酸、１ｍＭのピルビン酸及び１０％ＦＣＳ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）を含むＤＭ ＥＭ培地において２５ｃｍ²フラスコに導入する。形質転換の当日、培地を変更 し（６ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳ／フラスコ）、細胞を３７℃で３時間培養する。 同時に、ＤＮＡ及びＣａＰＯ₄の共沈物を、次の方法で調製する：３０μｇのＤ ＮＡキャリア（PromegaからのｐＧＥＭ３Ｚ）、アフリカツメガエルのメラトニ ン・レセプタの暗号化領域及び３′非暗号化領域を含む２μｇのｐｃＤＮＡ３− ＲＳＶベクター及びＣａＣｌ₂（２５０ｍＭの最終濃度）を、最終容量が５００ μｌの溶液Ａを得るように、混合する。この溶液Ａの４５０ｍｌを、攪拌下で、 ４５０μｌの２xＨＢＳ〔１．６４ｇのＮａＣｌ、１．１９ｇのヘッペス(Hepes) 及び０．０４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏを１００ｍｌのＨ₂Ｏに加えたもの〕 に滴下添加し、そしてそのｐＨを７．１２に調節する。混合物を、攪拌せずに、 周囲温度で４５分間放置する。４００μｌの共沈物を、Ｌ細胞を含むフラスコに 添加する。３７℃で４時間培養した後、細胞を６ｍｌのＤＭＥＭで一度洗浄し、 それから４ｍｌの１５％グリセロールにおいて２分間培養する。次いで、細胞を ＤＭＥＭで二度洗浄し、５ｍＭの酪酸ナトリウムが添加された６ｍＭのＤＭＥＭ ／ＦＣＳにおいて、３７℃で、一昼夜放置する。翌日、培地を取り出し、細胞を ＤＭＥＭ／ＦＣＳでもう一度洗浄した後、ＤＭＥＭ／ＦＣＳ中で一昼夜培養する 。第三日目に、ＤＭＥＭ培地中において、９６のウエルを有するプレートに、異 なる希釈度（１／２、１／４、 １／８、１／１６及び１／３２）で細胞を分配する。このＤＭＥＭ培地は、１０ ％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、４．５ｇ／ｌのグルコース、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン 、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのグルタミン及び４００μｇ ／ｍｌのＧ４１８〔ゲネチシン(geneticin)：ギブコ・ライフ・テクノロジーズ( Gibco Life Technologies)〕が添加されたものである。ゲネチシンに対して抵抗 力のあるクローンが、最終容量が２５０μｌ（緩衝液：５０ｍＭトリス／ＨＣｌ 、ｐＨ７．４、５ｍＭＭｇＣｌ₂）の¹²⁵ヨード−メラトニン（２００ｐＭ）に結 合することによる、メラトニン・レセプタの発現についてテストされる。１０ｍ Ｍのメラトニンの存在下において、特定の結合は見られない。 ｂ）過渡的発現（transient expression） 過渡的発現を得るため、６つのウェルを有するプレート（ｃＡＭＰテスト用、 ０．５・１０⁶細胞／ウェル）上に、又は直径１０ｃｍの皿（ｃＧＭＰテスト用 、２・１０⁶細胞／皿）中にＬ細胞を分散し、翌日、ＤＥＡＥデキストラン(LOPO TA et al.、N.A.R.、1984、12、5707-5717)を用いた方法で形質転換する。 ＰＢＳでの洗浄後、無血清ＤＭＥＭ（５０ｍＭのヘッペス、２００μｇ／ｍｌ のＤＥＡＥデキストラン及び１μｇ／ｍｌのｐｃＤＮＡ３−ＲＳＶプラスミドＤ ＮＡを含む）を添加する。 ３７℃で８時間、培養の後、１．５分間、培地を無血清ＤＭＥＭ中の１０％Ｄ ＭＳＯと取り替える。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭ ＥＭ培地において培養する。形質転換の３日後に分析を実施する。 ａ．ラジオリガンド（radioligand）結合テスト ＊方 法 半融合（subconfluent）細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、２０％トリプシンと２ ｍＭのＥＤＴＡで３７°Ｃにて５分間培養し、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児 血清が添加されたＤＭＥＭにおいて再懸濁せしめる。 ４５０×ｇ及び４℃にて５分間遠心分離の後、細胞ペレットを、ＰＢＳ、ｐＨ ７．４において再懸濁せしめる。 細胞懸濁物を、４００ｐＭの２−（¹²⁵Ｉ）−ヨードメラトニン（メラトニン ・レセプタ上での結合分析用）又は２００ｐＭの（¹²⁵Ｉ）−ＣＹＰ（β２アド レナリン作動性レセプタ上での結合テスト用）にて、１０μＭの冷リガンド（そ れぞれ、メラトニン又はＤ／Ｌ−プロプラノロール）の存在下又は不存在下にお いて、培養する。 結合テストを、次の条件下で行なう： ０．２５ｍｌの最終反応容量で、２５℃にて６０分間。０．３％ポリエチレン イミンを含むＰＢＳ緩衝剤に、前もって３０分間浸漬された（非特定結合を減少 させるため）グラスファイバー製のワットマン(Whatman)ＧＦ／Ｃフィルタによ る急速濾過により、反応が停められる。 細胞ホモジネートにおけるタンパク質濃度を、バイオラド(BIO-RAD)タンパク 質分析システムを用いたブラッドフォード（Bradford）法(Analytical Biochem. 、1976、72、248-254)により測定する。標準として、ウシ血清アルブミンを使用 する。 ＊結 果 （¹²⁵Ｉ）−ヨードメラトニン結合サイトを発現する種々のクローンのうち、 総タンパク質のレセプタ／ｍｇの２００ｆｍｏｌを発現する一つのＭｅｌ_1c(α₎ 及び総タンパク質のレセプタ／ｍｇの１５０ｆｍｏｌを発現する一つのＭｅｌ_{1c (} β₎が、より詳細に特徴付けられた。 ラジオ標識化２−（¹²⁵Ｉ）−ヨードメラトニンアゴニストの解離定数：Ｋｐ は、それぞれ、１６０±３２ｐＭ及び１４３±２５ｐＭであり（図７Ａ参照）、 これらの値は、Ｘ．リービス（laevis）のメラニン細胞から前もってクローン化 されたものを含む、他の高親和性メラトニン・レセプタの解離定数として決定さ れた値と一致する。競争実験の結果、種々のリガンドに対する親和性が、メラト ニン・レセプタの特徴であることが判明した（図７Ｂ及び表Ｉ参照）。 Ｍｅｌ_1c(α₎レセプタとＭｅｌ_1c(β₎レセプタとの重要な相違は、結合サイト において見られなかった。 ｂ．サイクリックＡＭＰの細胞内レベルの決定 ＊方 法 ６つのウェルを有するプレート内で成長した細胞を、無血清ＤＭＥＭで二度洗 浄し、３７℃で１５分間、予備培養した後、１ｍＭのＩＢＭＸ（３−イソブチル −１−メチルキサンチン）を含み、１０μＭのイソプロテレノール（過渡的形質 転換細胞上での分析）又は１０μＭのフォルスコリン（安定細胞クローン上での 分析）及び次第に増加する量のメラトニンを含む又は含まないＤＭＥＭ培地にお いて、３７℃で１５分間培養する。 培養緩衝剤を取り除き、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液中において、３７℃で２ ０分間、細胞を溶解せしめる。１Ｍの酢酸でｐＨを中和した後、細胞溶解物を、 マイクロ遠心分離装置において、１７，０００×ｇで５分間、遠心分離する。上 澄み液を、³ＨサイクリックＡＭＰシステム（アマーシャム：Amersham）を用い て、そのサイクリックＡＭＰの内容について試験する。サイクリックＡＭＰ測定 試験は、２４のウェルを有するプレート（３００μｌ中０．５×１０⁶細胞）に おいて実施することも可能である。次いで、細胞を１５分間培 養し、反応を、１００μｌの２０％トリクロロ酢酸を加えることにより停止し、 上澄み液のサイクリックＡＭＰの内容を試験する。 ＊結 果 高い親和性を呈するメラトニン・レセプタは、アデニル酸シクラーゼ活動の阻 害に参加するものとして、知られている。 Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタを発現するＬ細胞において、メラトニンは、フォルスコ リンにより刺激されたｃＡＭＰの蓄積の阻害を引き起こす（図８）。 この効果のＩＣ₅₀値は、約６．１０^-10Ｍであり、これは、親和性の高いメラ トニン・レセプタにおいて、従来より得られた値と一致するものである。 驚くべきことに、Ｍｅｌ_1C(β₎レセプタを発現する細胞においては、メラトニ ン濃度が０．１ｍＭより高くても、そのような効果の観察は可能ではない。 しかし、ｃＡＭＰの塩基レベルは、研究対象の細胞系（株）の何れも、ＩＢＭ Ｘの存在下であっても、メラトニンに影響されない。 ｃＡＭＰ蓄積のメラトニン・レセプタによる阻害は、Ｇ_iタンパク質に対して 、それらタンパク質のαサブユニットを介して、共役関係を有する。 − Ｍｅｌ_1C(β₎レセプタにより得られる信号がＧ_i(α₎サブユニットの量的 変化によるものではないことを確認するために、Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ又はＭｅ ｌ_1C(β₎レセプタを発現するコントロールＬ細胞及びクローンを、次の手順に従 って、それらＧ_i(α₎サブユニットの内容について比較する。 細胞を、２％のＳＤＳ及び４０ｍＭのジチオトレイトールを含むリームリー(L aemmli)緩衝剤に溶解せしめ、４℃にて音波処理する。マイクロ遠心分離装置に おいて１７，０００×ｇで遠心分離した後、５０μｌの上澄み液を、１２％ＳＤ Ｓ／ポリアクリルアミドゲル上で、その成分に分離する。免疫ブロット（immuno blot）を、３つのＧ_i(α₎サブタイプに対応する８４種の抗血清を用いて、SELZE R E.他（Proc．Natl．Acad．Sci．USA、1993、90、1609-1613）に記載されてい るように分析する。 ３つのＧ_i(α₎サブタイプを認識する特定の抗体を用いるウエスタン・ブロッ ト分析(Western blot analysis)により、重要な量的相違は何等認められな い。 − 形質導入シグナル（シグナル化）の研究 クローンの選択に関連して発生し得る人為構造を除くような方法により、Ｍｅ ｌ_1C ｃＤＮＡの二つのイソフォルムをＬ細胞に過渡的に形質転換した後に、形 質導入の研究を行なった。Ｌ細胞を、ヒトβ２アドレナリン作動性レセプタｃＤ ＮＡ及びＭｅｌ_1C(α₎レセプタｃＤＮＡ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタｃＤＮＡと共 に形質転換する。これらの異なるレセプタの共発現により、外生ＤＮＡを内生化 した細胞の個体群の選択的研究が可能となる。 かかるトランスフェクションの３日後、細胞を、イソプロテレノール、β２− ＲＡアゴニストに応答して起こるサイクリックＡＭＰ蓄積のメラトニン依存阻害 について、及びβ−アドレナリン作動性・メラトニン結合サイトの数について、 検査する（図９）。 野性タイプのコントロール細胞においては、何れのレセプタについても、何等 の結合サイトも測定することが出来ない。β２アドレナリン作動性レセプタｃＤ ＮＡのみで形質転換された細胞においては、イソプロテレノールの培養により、 ｃＡＭＰが５倍に増加する。Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ及びβ２アドレナリン作動性 レセプタを暗号化する同量のｃＤＮＡ（１ｇのプラスミドＤＮＡ）と共に形質転 換された細胞においては、イソプロテレノール及びメラトニンとの同時培養によ り、ｃＡＭＰ蓄積が相当に減少（コントロールの６５±５％、ｐ＜０．０５）す る（図９）。 同一の条件下、Ｍｅｌ_1C(β₎レセプタは、均等数のレセプタ結合サイトが発現 されるにも拘わらず、イソプロテレノールにより引き起こされるｃＡＭＰ蓄積を 阻害し得ない。 Ｍｅｌ_1C(β₎レセプタを暗号化するｃＤＮＡが、β２アドレナリン作動性レセ プタを暗号化するｃＤＮＡに比較して１０倍多く存在する場合には、同様な結果 が得られる。 Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタは、ｃＡＭＰのフォルスコリン刺激蓄積を、ＩＣ₅₀値が 約６．１０^-10Ｍにおいて、用量依存的(dose-dependent manner)に阻害 する。このＩＣ₅₀値は、先に報告された先述のメラトニン・レセプタのものと一 致する値である。 これらの結果とは異なり、メラトニンのＭｅｌ_1C(β₎レセプタとの結合は、フ ォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積がＭｅｌ_1C(α₎レセプタを発現する 細胞系（株）及びＭｅｌ_1C(β₎レセプタを発現する細胞系（株）におけると同様 であるにも拘わらず、ｃＡＭＰレベルの転形を何等刺激するものではない。 アデニル酸シクラーゼ機能の阻害は、活性化Ｇ_iタンパク質と原則的に共役関 係を有する。 ウエスタン・ブロット分析により、同様な量のαＧ_i1-3サブユニットが、二つ の形質転換細胞系（株）と非形質転換コントロールＬ細胞の両方に存在し、それ により、より少量のＧ_iタンパク質を発現する細胞クローンの選択を排除するこ とが、示される。更に、過渡的形質転換分析においては、ｃＡＭＰ調節の不存在 も観察され、Ｍｅｌ_1C(β₎レセプタ自身は、この生物学的経路を活性化し得ない ことが、確認される。 Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタとＭｅｌ_1C(β₎レセプタとの相違、即ち、本質的には、 細胞内ドメインにおける５つのアミノ酸の置換が、この現象の分子ベースを構成 する。即ち、７つのメンブレン間ドメインを持つレセプタ系に属するレセプタに おいて、これらの細胞内領域は、タンパク質Ｇとの共役に係わっているものとし て知られている。適当な実験条件下において、メラトニンは、タイプIIアデニル 酸シクラーゼを発現する細胞内におけるｃＡＭＰ蓄積を刺激することができる。 かかる効果は、Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを発現する安定 なクローンにおいては、又は対応するｃＤＮＡにより過渡的に形質転換されたＬ 細胞においては、観察され得ない。 ｃ．サイクリックＧＭＰの細胞内レベルの決定 ＊方 法 １０ｃｍの直径を持つ皿において成長した、過渡的に形質転換された細胞を、 １ｍＭのＩＢＭＸ及び次第に増加する量のメラトニンの存在下又は不存在下、 無血清ＤＭＥＭ培地において、３７℃で１５分間、培養する。次いで、培地を１ ｍｌの６５％氷冷エタノールに変更し、そして細胞抽出物を２０００×ｇで４℃ にて１５分間遠心分離する。上澄み液を乾燥し、ペレットを２５０μｌの酢酸緩 衝剤に再懸濁する。 サイクリックＧＭＰを、ＥＩＡキット（Amersham）を使って分析する。 ｃＧＭＰ内容の転形等の他の手法が、メラトニン・レセプタについて提案され ている（VANECEK J．et al．、Brain Res.、1989、505、157-159）。 Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを発現するＬ細胞を、メラト ニンで培養し、そして細胞内ｃＧＭＰに関する効果を分析する。メラトニン（１ ０μＭまで）は、どの細胞系（株）においても、ｃＧＭＰの塩基レベルに関して 何等の影響も持たない。 ｃＧＭＰの細胞内の内容は、ｃＧＭＰを合成するグアニル酸シクラーゼ、及び ｃＧＭＰを分解するホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の対立する活動に依存する 。 培地への導入時、ＰＤＥの阻害因子であるＩＢＭＸが、ＰＤＥによるｃＧＭＰ の分解を阻止する。これらの条件下において、ｃＧＭＰのレベルが３のファクタ だけ増加し、無刺激Ｌ細胞内における塩基ＰＤＥの活動の存在を示す。 Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタ又はＭｅｌ_1C(β₎レセプタを発現するＬ細胞において、 メラトニンによる培養が、ｃＧＭＰのＰＤＥ刺激蓄積を、用量依存的に阻害する （図１０Ａ）。 この効果のＩＣ₅₀値（約１０^-9Ｍ）は、競合分析において得られたメラトニン のＫｉ値に対応し、Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタによるアデニル酸シクラーゼの阻害の ために得られたＩＣ₅₀値に近い。 メラトニンによるコントロール細胞の刺激は、ＩＢＭＸにより引き起こされる ｃＧＭＰ産生の増加に、何等の影響をも持たない。 Ｇタンパク質のαＧ_i/oサブユニットの不活性ＡＤＰ−リボシル化（ribosylat ion）の触媒となる百日咳毒素は、タンパク質Ｇ_iと結合し且つメラトニン・レセ プタにより刺激されるｃＧＭＰ蓄積の阻害を阻止する。百日咳毒素によ る細胞の予備培養が、メラトニンのｃＧＭＰ蓄積への影響を防止し、かかる手法 がまたタンパク質Ｇ_i/oに依存することを示唆する。 Ｍｅｌ_1C(α₎及びＭｅｌ_1C(β₎メラトニン・レセプタの二つのｃＤＮＡが、長 い形態又は短い形態で見出される。Ｍｅｌ_1C(α₎レセプタのｃＤＮＡが、主とし て短い形態で存在している（３：１、短：長）のに対して、Ｍｅｌ_1C(β₎レセプ タのｃＤＮＡは、長い形態でより多く存在する（１：３）。β２アドレナリン作 動性レセプタやムスカリン(muscarine)レセプタ等の同じ系統の幾つかのレセプ タの３′非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性の制御に係わる分子決定基(molecular determinant)を含む。このことから、Ｍｅｌ_1C(α₎及びＭｅｌ_1C(β₎レセプタ を暗号化する短い及び長いｍＲＮＡが異なる調節メカニズムに晒されることが、 示唆される。 レセプタのイソフォルムがメラトニンに対して同様な親和性を持つが、異なる 生物学的信号を持つことから、かかる調節メカニズムが、メラトニンによる刺激 に対する細胞の反応性を調節する可能性がある。 メラトニン・レセプタの生物学的手法における第二のメッセンジャーとしての ｃＧＭＰの役割は、未だ議論の余地のあるところである。アフリカツメガエルの メラノサイト（melanocyte）における色素の集合が、メラトニン及びｃＡＭＰに より制御されるが、ｃＧＭＰによる制御については、矛盾する結果が存在する。 他の細胞システム内のメラトニンに結合した生物学的信号の刺激におけるｃＧＭ Ｐの役割は、未だ詳細な調査が為されていない。メラトニン・レセプタによるｃ ＧＭＰの転形を指示する第二の議論は、新生ラットの下垂体組織の分析に基づく ものであるが、この分析では、メラトニンがｃＧＭの産生に対して阻害作用を持 つものと観察されている。上記分析においては、メラトニンにより活性化された Ｍｅｌ_1C(α₎及びＭｅｌ_1C(β₎レセプタが、約１０^-9ＭのＩＣ₅₀値において、ｃ ＧＭＰを用量依存的に且つ効果的に阻害する。この阻害が、ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭ Ｘが培地に含まれていない場合には、Ｌ細胞内における実質的基礎ＰＤＥ活動の ために見られないことは、疑いのないことである。 上記の知見により、高親和性メラトニン・レセプタがメラトニンの生理的濃度 において、ｃＧＭＰを調節（転形）可能であることが確認され、又Ｍｅｌ_1C(β₎ レセプタが、信号形質導入に関して機能的であることが示される。 レセプタのｃＧＭＰに関する影響は、百日咳毒素により、完全に防止されるこ とから、Ｇ_i/oタンパク質が、この信号の形質導入に係わっていることが示され る。 上記のことから明らかなように、本発明は、より明確に記載された実施、実現 及び応用の態様に何等限定されるものではなく、むしろ、本発明の背景又は範囲 を逸脱することなく、当業者が着想可能な全ての変形実施例をも含むものである 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＭＥＬ１−Ａタイプ又はＭｅｌ_1cタイプの機能的メラトニン・レ セプタを暗号化する核酸配列であって、次の配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１、ＳＥ Ｑ ＩＤ Ｎo.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７から選ばれる ことを特徴とする核酸配列。 ２．請求項１に従う配列の断片であって、 − 配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１又はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５のヌクレオチド１ ０５７〜１２８６に対応する、２３０のヌクレオチド塩基対のセグメントから成 る配列； − 配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３又はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.７のヌクレオチド１ ０５７〜１１２５に対応する、６９のヌクレオチド塩基対のセグメントから成る 配列 を含む群から選ばれることを特徴とする断片。 ３．請求項１又は請求項２に従うヌクレオチド配列と交雑育種するこ とを特徴とするヌクレオチド・プローブ。 ４．請求項１又は請求項２に従うヌクレオチド配列により暗号化され 、且つＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタ活動を有することを特 徴とするタンパク質及び／又はタンパク質断片。 ５．次の配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２又はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.６の何 れか１つを呈することを特徴とする請求項４に従うタンパク質。 ６．請求項１又は請求項２に従うヌクレオチド配列を含むことを特徴 とする組換え体クローニング及び／又は発現ベクター。 ７．ＲＳＶプロモーター及び配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１を含むプラ スミドから成ることを特徴とする請求項６に従うベクター。 ８．パスツール研究所により運営される微生物培養寄託所(Collectio n Nationale de Cultures de Microorganisms)に、１９９５年６月７日付けにて 、寄託番号：Ｉ−１５８３として寄託されたことを特徴とする請求項７に従うベ クター。 ９．ＲＳＶプロモーター及び配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.５を含むプラ スミドから成ることを特徴とする請求項６に従うベクター。 １０．パスツール研究所により運営される微生物培養寄託所(Collect ion Nationale de Cultures de Microorganisms)に、１９９５年６月７日付けに て、寄託番号：Ｉ−１５８４として寄託されたことを特徴とする請求項９に従う ベクター。 １１．請求項６乃至１０の何れかに従う発現ベクターにより形質転換 されることを特徴とする、遺伝形質転換により得られた、所定の宿主細胞。 １２．Ｌ細胞系の細胞から成ることを特徴とする請求項１１に従う宿 主細胞。 １３．請求項４又は請求項５に従うタンパク質を発現する方法であっ て、ＭＥＬ１−Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタ活動を暗号化する請求項 １又は請求項２に従うヌクレオチド配列を含むベクターによる形質転換により得 られる宿主細胞が、前記発現されたタンパク質を産生し、それをメンブレンに、 前記レセプタのメンブレン間配列が形質転換した宿主細胞のメンブレンの表面に 露呈されるように、移動するように培養されることを特徴とする方法。 １４．ＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・レセプタを研究するための モデルであって、請求項１１又は請求項１２に従う宿主細胞から成り、ＭＥＬ１ −Ａタイプの機能的メラトニン・レセプタをそれらの細胞メンブレンの表面に発 現する宿主細胞であることを特徴とするモデル。 １５．請求項４又は請求項５に従うタンパク質に対するリガンドとし て作用する物質の活動を検出する方法であって、 − 前記物質を、請求項６乃至１０の何れかに従う発現ベクターにより、前も って形質転換され、且つ前記タンパク質（メラトニン・レセプタ）を発現する宿 主細胞に、特定サイトの少なくとも一つと前記物質との間の結合の形成を許容す る条件下において、接触せしめること、及び − リガンド／タンパク質タイプの複合体の形成を検出すること、 を含むことを特徴とする方法。 １６．請求項４又は請求項５に従うタンパク質の、所定の一つ又はそ れ以上のリガンドに対する親和性を研究する方法であって、 − 請求項６乃至１０の何れかに従うベクターにより、所定の宿主細胞を形質 転換すること、 − ヌクレオチド配列により暗号化されるＭＥＬ１−Ａタイプのメラトニン・ レセプタが発現され、この発現されたメラトニン・レセプタが、機能的メラトニ ン・レセプタのメンブレン間配列が形質転換された宿主細胞の表面に露呈するよ うに、前記細胞のメンブレンに移動され得ることを許容する条件下で形質転換さ れた宿主細胞を培養すること、 − 前記細胞を所定のリガンドと接触せしめること、及び − 前記形質転換された細胞と前記所定のリガンドとの間の親和性反応 を検出すること、 を含むことを特徴とする方法。 １７．請求項４又は請求項５に従うタンパク質に対するリガンドの親 和性を検出するキットであって、 − 請求項６乃至請求項１０の何れかに従う発現ベクターにより形質転換され る宿主細胞の培養体、 − 必要ならば、プロモータが誘導され得るベクターに含まれる請求項１又は 請求項２に従うヌクレオチド配列により暗号化されるタンパク質（ＭＥＬ１−Ａ タイプのメラトニン・レセプタ）の発現を引き起こすための、適切な物理的又は 化学的手段、 − 前記タンパク質に対する所定の親和性を有する一つ又はそれ以上のコント ロール・リガンド、及び − 発現されたタンパク質の生物学的活動を特徴づけるための物理的又は化学 的手段、 を含むことを特徴とするキット。