JPH05260977A

JPH05260977A - 心臓アデニリルシクラーゼのクローニングおよび特性決定

Info

Publication number: JPH05260977A
Application number: JP4250397A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Ishikawa; 義弘石川
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1991-08-29
Filing date: 1992-08-27
Publication date: 1993-10-12
Also published as: EP0529622A3; NZ244070A; EP0529622A2; AU657780B2; TW242164B; ZA926547B; AU2139392A; WO1993005061A1; AU1888592A; CA2076995A1

Abstract

(57)【要約】【構成】心臓アデニリルシクラーゼと称される新規な
エフェクター酵素をエンコードするＤＮＡ配列、並びに
そのＤＮＡ配列によりエンコードされる心臓アデニリル
シクラーゼのアミノ酸配列。【効果】上記心臓アデニルシクラーゼは患者の心臓機
能の変更のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この出願を通じて、種々の刊行物は括弧内
のアラビア数字で表示する。各表示についての完全な引
用文献は、この明細書の終わりの配列のリストの直前に
記載されている。これらの引用文献の開示は、本発明が
関係する技術水準を記載しており、そしてそれらの開示
をここに引用によって加える。

【０００２】シグナルの形質導入経路は３つの段階に細
分割することができる。第１はレセプターによるリガン
ドの認識である。第２は「形質導入体」のタンパク質に
よるシグナルの伝達および増幅である。最終の段階はエ
フェクター酵素による第２メッセンジャーの発生であ
る。

【０００３】アデニリルシクラーゼ(adenylyl cyclase)
は、種々のホルモン−レセプターの系、例えば、カテコ
ールアミンおよびＡＣＴＨにカップリングされるエフェ
クター酵素である。カテコールアミンのレセプターおよ
びその形質導入体のタンパク質（Ｇ−タンパク質）は、
それらのｃＤＮＡのクローニング以来、よく特性決定さ
れてきている。しかしながら、アデニリルシクラーゼに
ついて比較的ほとんど知られていない。

【０００４】このようなホルモンはレセプターに結合す
るので、それはＧタンパク質、すなわち、ヘテロトリマ
ーのグアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（α，
β，γ）を活性化する。活性化されたＧタンパク質はＧ
ＤＰとＧＴＰとの交換、ならびにβγサブユニットから
の解離を誘発する。α−サブユニットのＧＴＰ結合形態
はアデニリルシクラーゼを刺激し、これはＡＴＰから環
状ＡＭＰを発生する。環状ＡＭＰ、すなわち、第２メッ
センジャーはタンパク質キナーゼを包含する種々のタン
パク質を活性化する。

【０００５】次いで、タンパク質キナーゼは他のタンパ
ク質をリン酸化し、こうしてシグナルの形質導入のカス
ケードを開始する。活性化の他のタイプは、ことに神経
組織における、細胞内のカルシウム濃度の増加を通る。
消極後、カルシウムの流入はカルモデュリン、すなわ
ち、細胞内カルシウム結合タンパク質、の活性化を誘発
する。活性化されたカルモデュリンは、アデニリルシク
ラーゼを直接結合しかつ活性化することが示された
（１）。

【０００６】いくつかの論文は種々のアデニリルシクラ
ーゼを示唆した。フォルスコリン結合親和クロマトグラ
フィーを使用して、酵素のタンパク質の単一のクラスは
ウシの脳から精製された（２、３）。この精製されたタ
ンパク質に対してレイズされたモノクローナル抗体は、
また、この脳の中の大きさが異なるタンパク質の他の形
態を認識した。生化学的特性は、これらの２つはアデニ
リルシクラーゼの異なる型である；一方はカルモデュリ
ン感受性（ＣａＭ感受性）であり、そして他方はＣａＭ
不感受性である。この研究（２）は、１つの組織の中に
アデニリルシクラーゼの２つの型が存在すること、およ
びこれらの型が同一抗体により認識されうる同一のドメ
インを共有することを示した。

【０００７】他の論文はアデニリルシクラーゼの多様性
の遺伝学的証拠を提供した。関連する学習をブロッキン
グするドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ）の中の
Ｘ連鎖劣性突然変異はＣａＭ感受性を欠如するが、フッ
化物またはＧＴＰに対する反応性を事実有した。これが
示唆するように、ＣａＭ感受性シクラーゼ遺伝子はＸ染
色体の中に位置し、これはＣａＭ不感受性アデニリルシ
クラーゼ遺伝子と異なる。

【０００８】３つの異なるｃＤＮＡがこれまでに哺乳動
物組織からクローニングされた。これらはＩ型（脳型
（５））；ＩＩ型（肺型（６））；およびＩＩＩ型（臭
覚型（７））と表示された。Ｉ型およびＩＩＩ型のｃＤ
ＮＡ配列が発表された。これらのｃＤＮＡによりコード
されるアデニリルシクラーゼは、長さが１０００アミノ
酸より大きいタンパク質である。トポグラフィー的に、
すべての型は類似する。すべては大きい細胞質のループ
に関連する２つの６トランスメンブレンのドメインを有
する。細胞質のループのアミノ酸配列はシクラーゼの異
なる型の間に保存される。

【０００９】これらのアデニリルシクラーゼのメッセン
ジャーの組織の分布は、ノザンブロッティングの研究に
示されているように、よく区別される。Ｉ型は脳におい
てのみ発現され、ＩＩ型は肺および脳の中に分布し、そ
してＩＩＩ型は大部分臭覚組織の中でのみ発現され、脳
の中でほとんど発現されない。こうして、アデニリルシ
クラーゼはむしろ組織特異的方法で分布されている。心
臓組織はアデニリルシクラーゼが本来同定される組織の
１つであるという事実にかかわらず、３つの既知の型の
いずれも心臓組織の中で発現されることが示されてきて
いない。

【００１０】アデニリルシクラーゼの１つの形態は、ま
た、心臓の中に存在すること（８）、および心臓からの
シクラーゼが脳からのシクラーゼに対して本来レイズさ
れたモノクローナル抗体により認識されること（９）が
発表された。アデニリルシクラーゼの３つのクローニン
グされた型が大きい細胞質ループの中の保存されたアミ
ノ酸配列を有するということが与えられると、心臓から
のシクラーゼはこの領域において配列の相同性を共有す
ることができる。こうして、脳からのアデニリルシクラ
ーゼｃＤＮＡを使用することによって、心臓からアデニ
リルシクラーゼを得ることを試みることができる。しか
しながら、アデニリルシクラーゼが心臓の組織からクロ
ーニングまたは発現されたということは報告されてきて
いない。本発明は、心臓アデニリルシクラーゼＶ型をエ
ンコードする単離された核酸分子およびこの核酸分子に
よりエンコードされたポリペプチドを提供する。薬物に
ついてスクリーニングしそして心臓機能を変更する方法
がまた提供される。

【００１１】本発明は、心臓アデニリルシクラーゼＶ型
のポリペプチドをエンコードする単離された核酸分子を
提供する。ここで使用するとき、用語「核酸」はＲＮＡ
ならびに一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびｃＤＮＡを
包含する。さらに、ここで使用するとき、用語「ポリペ
プチド」はペプチド結合により連鎖したアミノ酸の線状
ポリマーを意味することを意図し、そして任意の天然に
存在するアレルのその変異型ならびに人工の組み換え形
態を包含する。心臓のアデニリルシクラーゼＶ型のペプ
チド、好ましくは、哺乳動物、例えば、イヌ科の動物ま
たはヒトのポリペプチドである。最も好ましい実施態様
において、ポリペプチドはヒトのポリペプチドである。

【００１２】このような核酸の例は、配列Ｉ．Ｄ．Ｎ
ｏ．１および２を包含するが、これらに限定されない。
本発明は、また、これらのアミノ酸配列をエンコードす
る核酸分子のそれと異なるが、同一の表現型の効果を生
成する核酸分子を包含する。これらの変更されている
が、表現型的に同等の核酸分子は「同等の核酸」と呼
ぶ。そして本発明は、前述の核酸分子と比較したとき、
それから産生されるポリペプチドの表現型を変更しない
非解読領域における変化により特徴づけられる核酸分子
を包含する。本発明は、さらに、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１
および２に示す核酸分子にハイブリダイゼーションする
核酸分子を包含する。

【００１３】前述したように、アデニリルシクラーゼ５
型のポリペプチドは、天然に存在する形態、合成の形態
および組み換えの形態、すなわち、同様な生物学的活性
を有することを可能とするために十分に天然に存在する
ペプチドと同一であるペプチドの天然に存在しない形態
を包含する。このようなポリペプチドは誘導体および類
似体を包含する。

【００１４】また、本発明によれば、精製されたポリペ
プチドがグリコシル化されている、アデニリルシクラー
ゼ５型のポリペプチドに相当する精製された哺乳動物の
ポリペプチドが提供される。しかしながら、本発明は、
また、天然に存在する精製された哺乳動物のアデニリル
シクラーゼ５型のポリペプチドのそれに十分に類似する
グリコシル化を有する、ポリペプチドおよび精製された
哺乳動物のポリペプチドの非グリコシル化形態を包含す
る。

【００１５】また、本発明によれば、有効量の前述の哺
乳動物のポリペプチドまたは下に記載する抗体および製
剤学的許容されうる担体からなる製剤学的組成物が提供
される。本発明の製剤学的組成物は治療および診断アッ
セイにおいて有用である。ここで使用するとき、用語
「製剤学的に許容されうる担体」は、標準の製剤学的担
体、例えば、リン酸塩緩衝液、水、乳濁液、例えば、油
／水乳濁液、および種々の型の湿潤剤を包含する。

【００１６】また、本発明によれば、アデニリルシクラ
ーゼ５型のポリペプチドに相当するアミノ酸配列をエン
コードする核酸分子からなるベクターが提供される。こ
のベクターは、次のものを包含するが、これらに限定さ
れない：プラスミド、ウイルスまたはコスミドのベクタ
ー。

【００１７】本発明は、また、ＲＮＡ転写のプロモータ
ーに操作的に連鎖した本発明の分離された核酸分子、な
らびに他の調節配列を提供する。ここで使用するとき、
用語「操作的に連鎖した」は、プロモーターが核酸分子
のＲＮＡの転写を指令するような方法で位置することを
意味する。このようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ
４およびＴ７である。プロモーターおよびＤＮＡ片が挿
入されるクローニング部位の両者を含有するベクター
は、この分野においてよく知られているプロモーターに
操作的に連鎖している。好ましくは、これらのベクター
はＲＮＡを生体内または試験管内で転写することができ
る。

【００１８】本発明によれば、適当な宿主における前述
のベクターの１つからなる、アデニリルシクラーゼ５型
のポリペプチドの産生のための宿主ベクター系が提供さ
れる。本発明の目的に対して、適当な宿主次のものであ
るが、これらに限定されない：真核生物の細胞、例え
ば、哺乳動物の細胞、酵母の細胞またはバクロウイルス
の発現のための昆虫の細胞。適当な宿主は、また、原核
生物の細胞、例えば、バクテリアの細胞、例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉである。

【００１９】アデニリルシクラーゼ５型のポリペプチド
に相当するアミノ酸を生合成的に産生する方法がまた提
供され、この方法は、前述の宿主ベクター系をアデニリ
ルシクラーゼ５型の産生を可能とする条件下に生育さ
せ、そして生ずるアデニリルシクラーゼ５型を回収する
ことからなる。本発明は、また、この方法により産生さ
れたアデニリルシクラーゼ５型を提供する。

【００２０】本発明は、さらに、前述のアデニリルシク
ラーゼ５型のポリペプチドまたはその断片と複合体を特
異的に形成することができる物質を提供する。本発明の
１つの実施態様において、この物質は抗体、好ましくは
モノクローナル抗体、例えば、マウスまたはヒトのモノ
クローナル抗体である。

【００２１】さらに、前述のモノクローナル抗体を単独
で、あるいは検出可能なマーカー、例えば、放射性同位
元素に接合して、含む製剤学的組成物が提供される。マ
ーカーとは、検出可能なシグナルを直接または間接に提
供する部分を意図する。種々のマーカー、例えば、放射
性同位元素、酵素、蛍光体、化学発光体などを使用す
る。本発明の目的に対して、適当な放射性同位元素は次
のものを包含するが、これらに限定されない：³²Ｐ、³⁵
Ｓおよび¹³¹Ｉ。

【００２２】マウスのモノクローナル抗体の分離のため
に、８週齢のマウスに完全フロインドアジュバント１：
１体積中の約５０μｇのポリペプチド（前述したように
調製した）で腹腔内注射する。マウスを、１月の間隔
で、完全フロインドアジュバントと混合したポリペプチ
ドで促進し、そして尾の静脈から採血する。第４、２日
および融合前の第２日に、マウスを生理的塩類溶液中の
５０μｇのポリペプチドで静脈内促進する。次いで、記
載されそして本発明が関係する当業者に知られている手
順に従い、脾細胞を非分泌性骨髄腫細胞と融合する。し
ばらくして、ほぼ２週後、ハイブリドーマの上澄み液を
ポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニング
する。

【００２３】ヒトモノクローナル抗体の分離は類似する
が、ヒトβ−リンパ球細胞を患者から分離し、そしてＥ
ＢＶで形質転換した。β−リンパ球細胞を、記載されそ
して本発明が関係する当業者に知られている手順に従
い、非分泌性骨髄腫細胞と融合する。しばらくして、ほ
ぼ２週後、ハイブリドーマの上澄み液をポリペプチドに
対する結合活性についてスクリーニングする。陽性のク
ローンを分離し、そして増殖する。あるいは、米国特許
第４，７２０，４５９号、米国特許第４，６９３，９７
５号および米国特許第４，５７４，１１５号、それらの
開示をここに引用によって加える、に記載されている方
法を使用して、ヒトモノクローナル抗体を調製する。

【００２４】患者に本発明のポリペプチドを単独で、あ
るいは製剤学的組成物の形態で投与することによって、
患者における心臓機能を変更する。「投与」は、患者に
投与する方法を意味する。このような方法は当業者によ
く知られており、そして次のものを包含するが、これら
に限定されない：経口的、静脈内、または非経口的投
与。因子の投与は、患者の中のポリペプチドの量が心臓
機能の変更に有効であるように、連続的または間欠的に
実施される。

【００２５】被検体、例えば、ヒトの調製における心臓
機能は、適当なＲＮＡ試料を被検体の試料から分離し、
そして本発明のｃＤＮＡを試料の中のＲＮＡにハイブリ
ダイゼーションさせることによって決定される。試料を
分離しそして試料の中のＲＮＡの量を決定する方法は、
当業者によく知られている（１６）。

【００２６】新規な心臓アデニリルシクラーゼの同定お
よび分離に使用する方法は、イヌ科の動物の心臓のｃＤ
ＮＡのライブラリーの構成で開始する。

【００２７】イヌ科の動物の心臓の左心室をｍＲＮＡ源
として使用する。ライブラリーを記載されているように
（１２）オリゴ−ｄＴプライマーを使用してλｇｔ１０
の中で調製する。λｇｔ１０ライブラリーの予備的スク
リーニングは、低いストリンジェントのハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄条件下に実施する。ほぼ２×１０⁶
のプラークを最初にライブラリーからスクリーニングす
る。予備ハイブリダイゼーションを、３０％のホルムア
ミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、２５ミリモル
のＮａＰＯ₄（ｐＨ６．５）、０．２５ｍｇ／ｍｌの子
ウシ胸腺ＤＮＡ、および０．１％のドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を含有する溶液の中で４２℃において少
なくとも２時間実施する。次いで、ハイブリダイゼーシ
ョンを同一溶液中で４２℃において実施する。Ｉ型アデ
ニリルシクラーゼｃＤＮＡからの９７０塩基対（ｂｐ）
のＡａｔＩ−ＨｉｎｃＩ断片をプローブとして使用す
る。この断片はアデニリルシクラーゼの第１細胞質ドメ
インをエンコードし、このドメインはアデニリルシクラ
ーゼの他の従来知られている型（７）に対して有意に相
同性である。

【００２８】プローブをマルチ−プライマー−ランダム
標識方法により³²Ｐ−ｄＣＴＰで放射線標識する。１８
時間ハイブリダイゼーションした後、ブロットを増加す
るストリンジェントの条件下に洗浄し、次いでラジオオ
ートグラフィーにかける。５つの陽性のクローンが得ら
れる。クローンの中のインサートの大きさは０．７ｋｂ
（キロ塩基）〜３．５ｋｂの範囲である。

【００２９】次の工程はクローンの中のインサートから
の全長のｃＤＮＡ配列を確認することである。イヌ科の
動物の心臓のライブラリーからのすべての陽性のクロー
ンをプラスミドｐＵＣ１８の中にサブクローニングす
る。制限地図を作った後、それらをさらにサブクローニ
ングし、そして普遍プライマーまたは合成したオリゴマ
ーで配列決定する。いくつかの断片について、配列決定
は１系列の欠失をエキソヌクレアーゼＩＩＩの消化によ
りつくった後に実施する。配列決定はシクエナーゼ（Ｓ
ｅｑｕｅｎａｓｅ）（１３）でまたはＴａｑポリメラー
ゼ（１４）により少なくとも２回２方向に実施する。あ
るＧＣに富んだ区域において、配列決定は７％のポリア
クリルアミド、８モルの尿素および２０％のホルムアミ
ドを含有するゲルを使用して実施する。

【００３０】＃８、＃２５および＃１１３と表示する３
つのクローンは、３．５ｋｂの長さにわたって互いにオ
ーバーラッピングすることが同定された（図１）。イン
サート全体を配列決定した後、クローン８および１３は
同一のポリアデニル化部位を使用することが発見され
た。これらの２つの断片は３．５ｋｂのｃＤＮＡ断片を
構成する。しかしながら、この３．５ｋｂの断片は長い
オープンリーディングフレームの中に最適なコザック
（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列をもつ開始ＡＴＧを含
有しない。このｃＤＮＡの５’末端を得るために、クロ
ーン８からの８００ｂｐの５’ＥｃｏＲＩからをプロー
ブとして使用してλｇｔ１０ライブラリーをスクリーニ
ングする。新規なｃＤＮＡクローンの全体の組を配列決
定した後、クローン７は８００塩基についてクローン８
とオーバーラッピングし、そしてこの配列２を上流でさ
らに４００ｂｐを伸長した。追加の５’配列を得るため
に、クローン７の最も上流の６０または５００ｂｐを使
用してｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングする。
８２の一次の陽性のものの中から、クローン７２が得ら
れ、これはこの配列をさらに３８０ｂｐ伸長する。これ
らのクローンの制限地図を図１に示す。これらのクロー
ン（７および７２）は高度にＧＣに富んだ領域を含有す
る。配列決定は、シクエナーゼおよび７−デアザ−ｄＧ
ＴＰをもつまたはもたないＴａｑポリメラーゼの両者を
使用して、少なくとも３回２方向に実施する。反応混合
物を８モルの尿素および２０％のホルムアミドを含有す
るポリアクリルアミドゲルの中で開発する。

【００３１】推定上のＡＴＧ翻訳開始コドンは、合理的
なコザックコンセンサス配列に関して存在し（１５）、
伸長したオープンリーディングフレームの中に存在す
る。このＡＴＧの８１ｂｐ上流の停止コドン（ＴＧＡ）
は同一オープンリーディングフレームの中に存在する
（図２）。この領域は、アデニリルシクラーゼｃＤＮＡ
の他の型において見られるように高度にＧＣに富んでい
る（２−５）。ＡＴＧは３５５２塩基のオープンリーデ
ィングフレームの翻訳を開始し、このオープンリーディ
ングフレームは１１８４アミノ酸のタンパク質および引
き続くポリアデニル化部位の上流の３’非翻訳領域の６
３４ｂｐをエンコードする。脳のアデニリルシクラーゼ
（Ｉ型）の相同性は、ドットのマトリックスの比較によ
り示すように、細胞質においてより高いが、トランスメ
ンブレン部分においてより低い（図３Ｂ）。第１細胞質
ドメイン、ことにループの５’の半分は、酵母のアデニ
リルシクラーゼを包含するシクラーゼの他の型（２４）
およびグアニルシクラーゼの種々の型（２５、２６）に
対して高度に相同性である。これはこのドメイン内の必
須の機能、例えば、ＡＴＰの結合の存在を示唆する。第
９および第１０のトランスメンブレンのスパニング領域
の間のループは最大である。哺乳動物のアデニリルシク
ラーゼの他の型に比較して、Ｖ型はＩＩ型およびＩＶ型
により類似し、より短いＣ末端のテイルを有するが、非
常により長いＮ末端のテイルを有することにおいてシク
ラーゼの間で独特である（Ｖ型、１６４アミノ酸；Ｉ
型、６３；ＩＩ型、４４；ＩＩＩ型、７７；およびＩＶ
型、２８）。

【００３２】この新規な遺伝子産生物の組織の分布はこ
のｃＤＮＡに対して独特のプローブを使用するノザンブ
ロッティングにより検査し、それゆえ高いアデニリルシ
クラーゼ活性を有することが知られている組織を検査す
る。このメッセンジャーは心臓において最も豊富に発現
され、脳において少ない程度に発現されるが、他の組織
（精巣、骨格筋、腎臓および肺）において発現されな
い。心臓および脳の両者は約５および７ｋｂのメッセン
ジャーを含有した（図４）。これらのｍＲＮＡの比
（３：２）は２つの組織の間で類似した。ｃＤＮＡの異
なる部分からの異なるプローブ、すなわち、トランスメ
ンブレン部分、ｃＤＮＡ全体および３’非翻訳部分を使
用するとき、ノザンブロッティングの結果は類似する。
こうして、さらに６つのＶ型のアデニリルシクラーゼの
クローンが得られ、これは完全な３’末端を含有する。
それらの配列およびすべての使用した同一のポリアデニ
ル化部位において発散は存在しない。一緒にすると、こ
れらの発見が示唆するように、２つのメッセンジャー
は、多分単一の前駆体のＲＮＡの交互するスプライシン
グの結果、同一の遺伝子の産生物である可能性が最も強
い。メッセンジャーの大きさは、各々が５’非翻訳配列
の少なくとも１〜３ｋｂを含有することを予測する。い
くつかの細胞系の中のこのメッセージの発現を、また、
検査する。同様な大きさのメッセンジャーＲＮＡをＧＨ
₄およびＰＣ１２細胞において検出されるが、Ｓ４９ま
たはＢＡＥＣにおいて検出されない。アデニリルシクラ
ーゼの他の型と相同性を共有する、このｃＤＮＡの第２
細胞質部分からのプローブ、すなわち、クローン１１３
からの１．８ｋｂのＸｈｏＩ断片を使用するとき、ハイ
ブリダイゼーションを比較的低いストリンジェントの条
件下に実施するとき、ほぼ６ｋｂのＲＮＡ種が、また、
心臓および脳から調製したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡにおいて
見られる。非常により大きい種は同様な条件下に骨格筋
において検出される。このメッセンジャーの大きさはほ
ぼ９．５ｋｂである。これらの追加のｍＲＮＡは、まだ
同一されていないアデニリルシクラーゼの族の他の構成
員を表すことがある。

【００３３】このｃＤＮＡによりエンコードされるタン
パク質産生物の生化学的特性は、ＣＭＴ細胞発現系を使
用して得られる。ＣＭＴ細胞はＣＯＳ細胞の誘導体であ
り、ここでＴ抗原の発現はメタロチオネインのプロモー
ターのコントロール下にある。こうして、細胞の中のＴ
抗原の蓄積はさらに培地の中に重金属イオンの添加によ
り増大される。アデニリルシクラーゼｃＤＮＡ構成体
（１１３−７２）をｐｃＤＮＡ１、すなわち、複製要素
のＳＶ４０エンハンサー由来をもつＣＭＶプロモーター
誘導発現ベクター、の中にクローニングする。粗製の膜
調製物をトランスフェクションしたＣＭＴ細胞から調製
し、そしてアデニリルシクラーゼを刺激ことが知られて
いる種々の因子を検査する（表１）。両者が基礎なかつ
フォルスコリン刺激されている（０〜３０μｇ／トラン
スフェクション）トランスフェクションされたプラスミ
ドの量と生ずるアデニリルシクラーゼ活性との間に投与
量依存性の関係が存在する。インサートをもたないプラ
スミドをトランスフェクションするとき、生ずるアデニ
リルシクラーゼ活性はモックトランスフェクションされ
た細胞のそれよりわずかに（約１５％）低い。すべての
活性は、対照と比較するとき、トランスフェクションさ
れた細胞の中で数倍増大され、フォルスコリン刺激され
た活性は活性の最大の活性を示す（対照より６倍より大
きい活性）。

【００３４】本発明のカルシウム／カルモデュリン感受
性を、また、評価する。心臓から精製したアデニリルシ
クラーゼは、カルシウムの添加により阻害されることが
従来示された（２７）。粗製のＣＭＴ細胞膜の調製物の
３０μｇを、増加する濃度のＣａＣｌ₂の存在下にイン
キュベーションする。ＣＭＴ細胞の中のトランスフェク
ションしたアデニリルシクラーゼは、濃度依存性の方法
で、０〜１ミリモルのカルシウムの添加により阻害され
る。カルモデュリン（２００ミリモル）の添加はこの阻
害作用を変更しない。アデニリルシクラーゼ活性は、ま
た、イヌの心臓の筋細胞膜の中で評価する。それはカル
シウムの存在下に同様な程度の阻害を示す（図６）。

【００３５】アデニリルシクラーゼの他の特徴は、アロ
ステリックのプリン結合またはＰ−部位によるその阻害
である（６）。トランスフェクションされたＣＭＴ膜に
おけるアデニリルシクラーゼ活性は、アデノシンおよび
その類似体（０〜１００μモル）の存在下に、濃度依存
性阻害を示す。これは、酵素をまずＭｎ²⁺、フォルスコ
リンの添加により活性化するとき、いっそう明らかであ
る。効能の程度は次の通りである：２’−デオキシ−
３’−ＡＭＰ＞３’−ＡＭＰ＞２’−デオキシアデノシ
ン＞アデノシン（図７）。上のデータが示すように、こ
のｃＤＮＡによりエンコードされるタンパク質は心臓の
アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の生化学的特徴をも
つアデニリルシクラーゼである。

【００３６】一緒にしたｃＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ１
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエ
ゴ）、すなわち、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０エ
ンハンサー要素をもつ哺乳動物の発現ベクター、の中
に、独特制限部位を使用してクローニングした。全長の
ｃＤＮＡを含有する発現ベクターをｐｃＤＮＡ１１３−
７２と表示する。ＭＣ１０６１／Ｐ３と表示する適当な
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞系の中に挿入された、この発現ベクタ
ーの試料は、特許手続きの目的のための微生物の受託の
国際的認識についてのブダベスト条約の規定に従い、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ
ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州２０８５２ロッ
クビレ、パークローンドライブ１２３０１に受託され、
そして受け入れ番号ＡＴＣＣ６８８８８を受けた。

【００３７】ヒトＶ型アデニリルシクラーゼをエンコー
ドする核酸配列をヒト心臓のｃＤＮＡライブラリーから
分離する。イヌＶ型アデニリルシクラーゼｃＤＮＡクロ
ーン、＃１１３、をプローブとして使用して２．０×１
０⁶の独立のクローンをスクリーニングする。ハイブリ
ダイゼーションは５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、
５×デンハルト溶液、２５ミリモルのＮａＰＯ₄（ｐＨ
６．５）、０．２５ｍｇ／ｍｌの子ウシ胸腺ＤＮＡおよ
び０．１％のＳＤＳを含有する溶液中で４２℃において
実施する。ハイブリダイゼーションを³²Ｐで標識したｃ
ＤＮＡ断片と同一緩衝液中で４２℃において１４〜２０
時間インキュベーションし、次いで増加するストリンジ
ェントの条件下に洗浄する。ヒト心臓ライブラリーから
のすべての陽性のクローンをｐＵＣ１８の中にサブクロ
ーニングする。制限マッピング後、断片をサブクローニ
ングし、そして普遍プライマーで配列決定する。クロー
ン、＃３４１、は１．４ｋｂのインサートを含有し、そ
の配列はイヌＶ型アデニリルシクラーゼと高度に相同性
である。事実、相同性は配列決定した領域（約０．３ｋ
ｂ）において９０％以上である。ＤＮＡのドットブロッ
トマトリックスの比較は、ヌクレオチド残基１９０２〜
４３２８からのイヌＶ型アデニリルシクラーゼｃＤＮＡ
のそれに同等の領域を解読するクローン＃３４１を示し
た。イヌのアイソフォームの中のこの領域は第１細胞質
ドメインの後者の半分をエンコードし、これはアデニリ
ルシクラーゼの異なる型の間の高い変動性を示し、クロ
ーン＃３４１がイヌＶ型アデニリルシクラーゼのヒト類
似体であることを示す。

【００３８】は、特許手続きの目的のための微生物の受
託の国際的認識についてのブダベスト条約の規定に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州２０８５
２ロックビレ、パークローンドライブ１２３０１に受託
され、そして受け入れ番号ＡＴＣＣ６８８８８を受け
た。

【００３９】クローン＃３４１は、特許手続きの目的の
ための微生物の受託の国際的認識についてのブダベスト
条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣ
Ｃ）、米国マリイランド州２０８５２ロックビレ、パー
クローンドライブ１２３０１に受託され、そして受け入
れ番号ＡＴＣＣを受けた。

【００４０】この心臓のアデニリルシクラーゼの産生
は、確立された組み換えＤＮＡ法を使用して、適当な発
現系において心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡをク
ローニングおよび発現することによって達成される。心
臓のアデニリルシクラーゼの産生は、心臓のアデニリル
シクラーゼｃＤＮＡを任意の適当な発現ベクターの中に
組み込み、引き続いて適当な宿主細胞をそのベクターで
形質転換することによって達成される；あるいは、宿主
細胞の形質転換は裸のＤＮＡによりベクターを使用しな
いで直接達成される。真核生物の細胞または原核生物の
細胞による心臓のアデニリルシクラーゼの産生は、本発
明により考えられる。適当な真核生物細胞は哺乳動物の
細胞、植物の細胞、酵母の細胞および昆虫の細胞を包含
する。同様に、適当な原核生物の細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ
に加えて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）を包含する。

【００４１】他の適当な発現ベクターは使用され、そし
て宿主細胞の選択に基づいて選択される。例えば、バク
テリアの細胞の形質転換における使用のために多数のベ
クターはよく知られている。例えば、プラスミドおよび
バクテリオファージ、例えば、λファージはバクテリア
の宿主、とくにＥ．ｃｏｌｉについて最も普通に使用さ
れるベクターである。哺乳動物および昆虫の両者の細胞
において、ウイルスのベクターは外因性ＤＮＡの発現を
得るために頻繁に使用される。とくに、哺乳動物の細胞
はＳＶ４０またはポリオマウイルスで普通に形質転換さ
れる；そして培養中の昆虫の細胞はバクロウイルスの発
現ベクターで形質転換される。酵母の発現系は動原体の
プラスミド、酵母のエピソームのプラスミドおよび酵母
の組み込むプラスミドを包含する。

【００４２】また、理解されるように、本発明の実施は
図２において規定される心臓のアデニリルシクラーゼの
正確な配列（配列ＩＤＮｏ．１）の使用に限定されな
い。配列に対する修飾、例えば、生ずるタンパク質分子
においてサイレントの変化を生成する配列における欠
失、挿入または置換が、また、考えられる。例えば、所
定の部位において化学的に同等のアミノ酸を産生するｃ
ＤＮＡ配列中の変更が考えられる；こうして、アミノ酸
のアラニン、すなわち、疎水性アミノ酸のためのコドン
は、他の疎水性残基、例えば、グリシンをエンコードす
るコドンにより容易に置換することができるか、あるい
はより疎水性の残基、例えば、バリン、ロイシン、また
はイソロイシンで置換することができる。１つの陰性に
帯電した残基の他との置換、例えば、アスパラギン酸の
グルタミン酸との置換、あるいは１つの陽性に帯電した
残基の他との置換、例えば、Ｌｙｓのアルギニンとの置
換を生ずる変化は生物学的に同等の産生物を産生する。

【００４３】タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端の部
分の変更を生ずるヌクレオチドの変化は、これらの領域
が通常生物学的活性に関係しないので、タンパク質の活
性を変更しない。また、配列の中に存在するシステイン
の１または２以上を排除ことは望ましいことがある。な
ぜなら、タンパク質が組み換え的に産生されるとき、シ
ステインの存在はマルチマーの望ましくない形成を生
じ、これにより精製および結晶化のプロセスを複雑とす
ることがあるからである。

【００４４】提案される修飾の各々、ならびにエンコー
ドされた産生物の生物学的活性の決定または保持はこの
分野においてよく知られている。したがって、句「心臓
のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡ配列」または「心臓の
アデニリルシクラーゼ遺伝子」をこの明細書または特許
請求の範囲において使用する場合、生物学的に同等の心
臓のアデニリルシクラーゼタンパク質の産生を生ずる、
すべてのこのような修飾または変化を包含することが理
解されるであろう。また、理解されるように、他の哺乳
動物の種における対応する配列を包含する。とくに、本
発明は図２の配列の十分な複製であるＤＮＡ配列あるい
はクローン番号３４１（ＡＴＣＣＮｏ．）
の中のアデニリルシクラーゼの核酸を包含して、標準の
高いストリンジェントのサザンハイブリダイゼーション
条件、例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、
（１６）に記載されている条件の下のそれらとのハイブ
リダイゼーションを可能とする。

【００４５】このような発現の例において、２０μｇの
精製されたプラスミドｐｃＤＮＡ１１３−７２をサル腎
臓ＣＭＴ細胞の中に、ゴルブ（Ｇｏｌｕｂ）らの変更さ
れた方法（１７）を使用して、トランスフェクションす
る。簡単に述べると、細胞をイーグル培地、１０％の胎
児仔ウシ血清、２ミリモルのグルタミン、４．５ｍｇ／
ｍｌのグルコース、１０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマ
イシンおよび６０μｇ／ｍｌのペニシリンＫのダルベッ
コの変性培地中で８０％の全面成長に成長させる。ＰＢ
Ｓで洗浄後、０．５ｍｌのトリプシン溶液を添加する。
細胞を１０分間インキュベーションし、そして４００μ
ｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランおよび０．１ミリモル
のクロロクインを含有する４ｍｌのＤＭＥＭの中に再懸
濁した２０μｇの精製したプラスミドを添加する。細胞
を４時間インキュベーションし、次いで１０％のジメチ
ルスルホキシドで２分間ショックする。ＰＢＳで２回洗
浄した後、ＤＭＥＭの中に１０％の胎児仔ウシ血清（Ｆ
ＣＳ）、２ミリモルのグルタミン、４．５ｇ／ｍｌの、
２ミリモルのペニシリンおよびストレプトマイシン、お
よび１μモルのＣｄＣｌ₂、０．１μモルのＺｎＣｌ₂を
含有する誘発培地を添加する。プレートを３７℃におい
て７２時間インキュベーションした後、収穫する。

【００４６】このアデニリルシクラーゼのタンパク質
は、１１８４アミノ酸から構成されており、カイト−ド
ーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）の方法（１
１）により、二次構造について分析する（図３）。ソフ
トウェア、マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）３．５
ソフトウェア（ＩＢＩ、コネチカット州ニューヘブン）
を使用してヒドロパシーのプロットを作り、これにより
このアデニリルシクラーゼの膜に関係する構造を同定す
る。このカイト（Ｋｙｔｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ）の方法は７の窓の大きさで使用する。

【００４７】図３に示すように、１２のピークの番号を
付す。これらのピークはトランスメンブレンのスパニン
グ領域を表す。これらの結果が示唆するように、この心
臓のアデニリルシクラーゼは１２のトランスメンブレン
のスパニング領域の構造、ならびに中央および末端に位
置する大きい細胞質ループを有する。トランスメンブレ
ンの位置において、第５の細胞外ループは最大である
（第９のトランスメンブレンのスパンと第１０のトラン
スメンブレンのスパンとの間）。

【００４８】Ｎ末端テイルの１６４は細胞質内に位置
し、次いで１５４アミノ酸の６−トランスメンブレンの
スパニング領域（アミノ酸位置１６５−３１８）が位置
する。次いで細胞質ドメインの３６６アミノ酸（３１９
−６８４）は２４３アミノ酸の第２の６−トランスメン
ブレンのスパニングドメイン（６８５−９２７）の前に
位置し、次いで２５６アミノ酸の他の細胞質ドメイン
（９２８−１１８４）が位置する。こうして、それは６
−トランスメンブレンのスパニング領域および大きい疎
水性細胞質ドメインの複製された形態をつくる。

【００４９】図４に示すように、Ｉ型、ＩＩＩ型および
心臓のアデニリルシクラーゼ、２つの大きい疎水性細胞
質のループの間のタンパク質のドットマトリックスの比
較は互いに約５０％の相同性を示す。しかしながら、２
つのトランスメンブレンのスパニング部分の間の相同性
は非常に低い（３０％より低い）。

【００５０】タンパク質の膜に関連する二次構造（図３
の結果に基づく）は、哺乳動物のアデニリルシクラーゼ
の異なる型の間によく保存される（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ
型、および心臓の型）。それらのすべては、６−トラン
スメンブレンのスパニング領域の存在により中断され
た、２つの大きい細胞質ループを有する。アデニリルシ
クラーゼの異なる型の間の相同性は、他の部分が構造的
に類似する場合でさえ、細胞質部分においてのみ保存さ
れる。さらに、同一のアデニリルシクラーゼのタンパク
質において、２つの細胞質部分の間の相同性はまた保存
される。これがが示唆するように、細胞質部分は遺伝子
の複製の結果である。

【００５１】心臓中のアデニリルシクラーゼの活性のレ
ベルは心臓の疾患と相関関係することが示唆された。疾
患のない心臓におけるシクラーゼ活性と比較して、疾患
をもつ心臓におけるシクラーゼ活性は有意に減少する
（１０、１８、１９、２０）。これらの論文が示唆する
ように、シグナルの形質導入の経路における末梢の調
節、すなわち、シクラーゼのレベルの調節が存在する。
事実、心臓におけるアデニリルシクラーゼの活性の減少
は心臓の疾患の発生における主要な因子であることがあ
る。

【００５２】左心室（ＬＶ）における心臓疾患のペイシ
ング（ｐａｃｉｎｇ）誘発のイヌのモデルを使用して、
次を同定する：１）Ｇ_Sからのベータ−アドレナリン作
動性レセプターのアンカップリング、すなわち、高い親
和性の結合の損失４４±１から３０±２ｆｍｏｌ／ｍ
ｇ）、２）Ｇ_Sそれ自体の活性の変化がないこと、およ
び３）アデニリルシクラーゼの触媒の活性の漸進的減少
は、心臓において主として発現されるクローニングされ
たアデニリルシクラーゼのアイソフォームからエンコー
ドされる、定常状態のｍＲＮＡレベルの変化に関連す
る。アデニリルシクラーゼｍＲＮＡレベルの減少は、左
心室の機能、例えば、心拍（ＨＲ）／分、左心室末端の
拡張期の圧力（ＬＶＥＤＰ、ｍｍＨＧ）、これは１〜４
週のペーシングから生ずる、の漸進的減少、ならびに筋
細胞膜のアデニリルシクラーゼ触媒活性の損失の両者に
相当した。

【００５３】 HR LVEDP AC活性 ACmRNA 数対照 89±4 4.3±0.3 97±6 10±0.08 4 １週 117±2 11±2 65±4 0.74±0.07 3 ４週 136±13 33±4 45±3 0.41±0.03 3 このデータが示すように、アデニリルシクラーゼ触媒そ
れ自体の含量の減少は、心臓疾患の損傷されたサイクル
のＡＭＰの産生に寄与する。

【００５４】本発明の新規な心臓のアデニリルシクラー
ゼを使用して、そのシクラーゼの活性を刺激する化合物
についてスクリーニングする。

【００５５】この心臓のアデニリルシクラーゼの生化学
的性質を、ＣＭＴ細胞（ＣＯＳ細胞の誘導体）を使用し
て、一時的発現系において検査する。ＣＭＴ細胞は、ゲ
ノム中のメタロチオネインのプロモーターにより推進さ
れるＴ−抗原を含有する。こうして、培地中の重金属イ
オンを使用する誘発により、ＣＭＴ細胞はＣＯＳ細胞よ
り多くのＴ−抗原を産生することができるであろう。全
解読配列を含有するアデニリルシクラーゼｃＤＮＡの
４．３ｋｂの断片（＃１１３−７２）を、前述のｐｃＤ
ＮＡ１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に挿入
する。

【００５６】心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡを有
する発現ベクターｐｃＤＮＡ１でトランスフェクション
した細胞のアデニリルシクラーゼ活性を次のようにして
評価する。形質転換されたＣＭＴ細胞をＰＢＳで２回洗
浄し、そして氷上の５０ミリモルのトリス（ｐＨ８．
０）、１ミリモルのＥＤＴＡ、１０μモルのＰＭＳＦ
（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１００Ｕ
のロイペプチン、および５０Ｕの卵白トリプシン阻害因
子（ＥＴＩ）を含有する３ｍｌの冷緩衝液の中にかき落
とす。膜をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ^R）（６に設
定した、１０秒間）中で均質化し、そして４℃において
８００×ｇで１０分間遠心する。上澄み液を４℃におい
て１００×ｇでさらに４０分間遠心する。生ずる沈澱物
を５０ミリモルのトリス（ｐＨ８．０）、１ミリモルの
ＥＤＴＡ、１μモルのＰＭＳＦ、５０Ｕのロイペプチ
ン、および５０ＵのＥＴＩの中に５μｇ／μｌの濃度に
再懸濁させる。この粗製の膜の溶液をアデニリルシクラ
ーゼのアッセイに使用する。

【００５７】アデニリルシクラーゼのアッセイはサロモ
ン（Ｓａｌｏｍｏｎ）（２１）の方法により実施する。
簡単に述べると、ＣＭＴ細胞からの粗製の膜を１ミリモ
ルのリン酸クレアチン、８μｇ／ｍｌのクレアチンホス
ホキナーゼ、４ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、
２ミリモルのＭｇＣｌ₂、０．１ミリモルのｃ−ＡＭ
Ｐ、０．１ミリモルのＡＴＰおよび³²Ｐ−ＡＴＰ（０．
２〜５μＣｉ／アッセイ管）を含有する溶液の中に再懸
濁する。反応混合物を３７℃において３０分間インキュ
ベーションし、そして反応を１００ｍｌの２％のダウリ
ル硫酸ナトリウムの添加により停止させる。カラムから
の回収をモニターするために、³Ｈ標識したｃ−ＡＭＰ
を使用する。環状ＡＭＰをドウェクス（Ｄｏｗｅｘ）お
よびアルミナカラムを通過させることによってＡＴＰか
ら分離し、そして放射能シンチレーションカウンターに
よりカウントする。使用する膜のタンパク質濃度を、ブ
ラドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法（２２）によ
り、標準としてウシ血清アルブミンを使用して測定す
る。

【００５８】トランスフェクションされないＣＭＴ細胞
からの膜を対照として使用する。アデニリルシクラーゼ
活性のアッセイからの抵抗性を表１に示す：

【００５９】

【表１】表１ Basal NaF GTPγS Forskolin 対照 2.5±0.5 15±3.1 30±4.5 52±7.2 トランスフェクション 11.0±1.6 41±4.7 87±12.5 321±28.0 このｃＤＮＡにより発現されるアデニリルシクラーゼ
は、１０ミリモルのフッ化ナトリウム、１００μモルの
ＧＴＰγＳおよび１００μモルのフォルスコリンにより
刺激される。それは対照より２．７、２．８および６．
２倍の刺激を示す。

【００６０】アデニリルシクラーゼ活性は、また、５ミ
リモルののマンガンの存在下に対照より１０倍以上刺激
される。トランスフェクションされた細胞中のアデニリ
ルシクラーゼの増加した基礎活性は、また、観測され
る。これが示唆するように、このシクラーゼは高い基礎
的性を有し、心臓の中の環状ＡＭＰの高い蓄積を可能と
する。これは心臓の組織において見られる高い基礎シク
ラーゼ活性と一致する。心臓のアデニリルシクラーゼ
（Ａ型）の組織の検出可能を明瞭にするために、ノザン
ブロッティングを種々の組織からのｍＲＮＡを使用して
実施する。メッセンジャーＲＮＡを、種々のイヌの組織
（心臓、脳、精巣、骨格筋、腎臓および肺）から、グア
ニジウムナトリウム（２３）およびオリゴ−ｄＴのカラ
ムを使用して精製する。５μｇのｍＲＮＡを各アッセイ
に使用する（ブロットのレーン当たり）。

【００６１】ブロットを５０％のホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ、５×デンハルト溶液、２５ミリモルのＮａＰＯ₄
（ｐＨ６．５）、０．２５ｍｇ／ｍｌの子ウシ胸腺ＤＮ
Ａおよび０．１％のＳＤＳのＳＤＳを含有する溶液中で
４２℃において２時間予備インキュベーションした後、
プローブを添加する。プローブとして、アデニリルシク
ラーゼｃＤＮＡからの０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｃＩＩ制限断片を使用する。プローブは³²Ｐ−ｄＣＴＰ
を使用してマルチプライマーのランダム標識法によりつ
くる。ハイブリダイゼーションを４２℃において１８時
間実施し、次いで増加するストリンジェントの条件下に
洗浄する。次いでブロットをオートラジオグラフィーに
かける。

【００６２】ノザンブロット分析の結果を図５に描写
し、これらの結果が示すように、メッセージは心臓なら
びに脳において最も豊富であるが、他の組織、例えば、
精巣、骨格筋、腎臓および肺においてめったに発現され
ない。心臓および脳において、２つの異なる大きさのメ
ッセージが存在し、それらの大きさは５および７ｋｂ
（図５）。５ｋｂのメッセージはより豊富である。２つ
のメッセージの比はラジオデンシトメーターにより３：
２であると推定される。２つのメッセージは、また、プ
ローブとしてｃＤＮＡの３’非翻訳部分からの断片（Ａ
ｐａＩ−ＸｈｏＩ、０．３ｋｂの断片）を使用すると
き、観測される。

【００６３】全タンパク質は３５５２塩基によりエンコ
ードされる。これが示唆するように、ｍＲＮＡは少なく
とも２．０〜４．０ｋｂの非翻訳配列を含有する。

【００６４】別の系列の実験において、標準の手順に従
い、イヌ心室組織から調製したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを使
用してλｇｔ１０ベクター中でｃＤＮＡライブラリーを
調製する。一次ライブラリーのスクリーニングにおい
て、プローブとしてＶ型アデニリルシクラーゼｃＤＮＡ
からのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片を使用して２．０×１
０⁶の独立のクローンをスクリーニングする。ハイブリ
ダイゼーションを３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、
５×デンハルト溶液、２５ミリモルのＮａＰＯ₄（ｐＨ
６．５）、０．２５ｍｇ／ｍｌの子ウシ胸腺ＤＮＡおよ
び０．１％のＳＤＳのＳＤＳの溶液中で４２℃において
実施する。ハイブリダイゼーションを同一緩衝液中で³²
Ｐで標識したｃＤＮＡ断片を使用して４２℃において１
４〜２０時間実施し、次いで増加するストリンジェント
の条件下に洗浄する。後のスクリーンにおいて、３０％
の代わりに５０％のホルムアミドのハイブリダイゼーシ
ョン溶液を使用する。すべてのＤＮＡの配列決定（普遍
または合成のオリゴヌクレオチドのプライマーを使用す
る）を、シクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）またはＴ
ａｑポリメラーゼを使用して少なくとも２回実施する。
ある種のＧＣに富んだ配列、例えば、５’非翻訳領域に
ついて、反応を７−デアザ−ｄＧＴＰ存在または不存在
下に、シクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）およびＴａ
ｑポリメラーゼの両者を使用して実施する。８モルの尿
素および２０％のホルムアミドを含有するポリアクリル
アミドゲル中で電気泳動を実施して、バンドの凝縮の問
題を根絶する。ゲノムのＤＮＡのクローニングについ
て、ＥＭＢＬ３イヌのゲノムのＤＮＡライブラリーから
の３×１０⁶の組み換えクローンをＡＴＣＣＮｏ．６
８９６８（Ｖ型アデニリルシクラーゼ）からのプローブ
でスクリーニングする。スクリーニングおよび配列決定
を前述したように同様に実施する。

【００６５】第２系列の実験において、ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｐｈＩ（ヌクレオチド１−９５４、ｐｕｃ１８中の＃７
２から）、ＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド９５４
−１６０４、＃７から）、およびＥｃｏＲＩ−ＳｓｐＩ
（ヌクレオチド１６０４−２１３７、＃６Ｌから）の断
片を結合することによって、２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−
ＳｔｕＩ断片、＃１１３−αと表示する、を構成した。
＃１１３をＥｃｏＲＩおよびＳｓｐＩ（Ｖ型アデニリル
シクラーゼからのヌクレオチド１６３９−４３９３）で
消化することによって、＃１１３−βと表示するＥｃｏ
ＲＩ−ＳｔｕＩ断片を構成する。各をプラスミドｐｃＤ
ＮＡＩ−ａｍｐ、哺乳動物の発現ベクター、の独特ポ
リリンカー部位の中にサブクローニングし、そしてｐｃ
ＤＮＡ１１３−αおよび−βと表示する。２０μｇの精
製したプラスミドをＣＭＴ細胞の中にゴルブ（Ｇｏｌｕ
ｂ）らの方法の変更によりトランスフェクションする。
簡単に述べると、細胞を８０％の全面成長に成長させ
る。リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、０．
５ｍｌのトリプシン溶液を使用する。細胞を１０分間イ
ンキュベーションし、そして４００μｇのデキストラン
および０．１ミリモルのクロロクインを含有する４ｍｌ
のＤＭＥＭの中に再懸濁した２０μｇの精製したプラス
ミドを添加する。細胞を４時間インキュベーションし、
次いで２分間ジメチルスルホキシドでショックする。Ｐ
ＢＳで洗浄後、１μモルのＣｄＣｌ₂および０．１μモ
ルのＺｎＣｌ₂を含有するインキュベーション媒質を添
加し、そして細胞を３７℃において７２時間インキュベ
ーションした後、収穫する。対照の細胞をモックトラン
スフェクションし、そして同一の方法で誘発する。

【００６６】２つのプライマーが＃６Ｌからの新規な配
列から得た。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを合計のＲＮＡからオ
リゴ（ｄＴ）セルロースとの結合により分離する。２μ
ｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡまたはｃＤＮＡサイクルキット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）の逆転写
酵素を使用した。この反応を４２℃において１時間イン
キュベーションし、９５℃に加熱し、次いで氷上で急冷
した。ＰＣＲ産生物の１／１０を２％のアガロースゲル
中で電気泳動にかけ、そしてニトロセルロースに移し、
そしてプローブとハイブリダイゼーションさせた。６０
マーのオリゴヌクレオチドのプライマーをプローブとし
て使用し、その配列をＶ型−αのｃＤＮＡの３’末端か
ら取る。ハイブリダイゼーションは前述したように同様
に実施するが、ただし３０％のホルムアミド溶液を５０
％のホルムアミド溶液の代わりに使用する。

【００６７】トランスフェクションしたＣＭＴ細胞をＰ
ＢＳで２回洗浄し、次いで５０ミリモルのトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、２ミリモルのＥＧＴＡ、１０μモルの
ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、
１００Ｕのロイペプチンおよび５０Ｕの（卵白のトリプ
シン阻害因子）を含有する１ｍｌの冷緩衝液の中に集め
る。細胞をポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）（６に設定
する、１０秒）で均質化し、そして４℃において８００
×ｇで１０分間遠心する。上澄み液を４℃において１０
０，０００×ｇで４０分間遠心する。生ずる沈澱物を５
０ミリモルのトリス（ｐＨ８．０）、１ミリモルのＥＤ
ＴＡ、１ミリモルのＰＭＳＦ、５０Ｕのロイペプチンお
よび５０ＵのＥＴＩの中に５μｇ／μｌの濃度に再懸濁
する。この粗製の膜調製物をアデニリルシクラーゼのア
ッセイにおいて使用する。

【００６８】アデニリルシクラーゼ活性をサロモン（Ｓ
ａｌｏｍｏｎ）により測定する。簡単に述べると、ＣＭ
Ｔから洗浄した膜（１５〜３０／アッセイ管）を、１ミ
リモルのリン酸クレアチン、８Ｕ／ｍｌのクレアチンホ
スホキナーゼ、４ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．
０）、２ミリモルのＭｇＣｌ₂、０．１ミリモルの環状
ＡＭＰ、０．１ミリモルのＡＴＰおよび³²Ｐ−ＡＴＰ
（０．２〜５μＣｉ／アッセイ管）を含有する１００ｍ
ｌの溶液の中に再懸濁させる。反応混合物を３０℃にお
いて３０分間インキュベーションし、そして反応を１０
０μｌの２％のＳＤＳの添加により停止させる。カラム
からの回収をモニターするために、³Ｈ標識した環状Ａ
ＭＰを使用する。環状ＡＭＰをＡＴＰからドウェクス
（Ｄｏｗｅｘ）およびアルミナカラムに通過させること
によって分離し、そして放射能を液体シンチレーション
カウンターにより測定する。タンパク質濃度を、ブラッ
ドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法により、標準と
してウシ血清アルブミンを使用して測定する。

【００６９】ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩプローブを使用し
て、１２の一次の陽性のものが得られる。すべてのクロ
ーンをｐｕｃ１８ベクターの中にサブクローニングし、
そして配列決定する。１２クローンのうちで１０はＶ型
アデニリルシクラーゼのクローンと同一である。２つの
クローン、＃６Ｌおよび＃２、は配列の５’半分におい
て同一であるが、その３’末端においてＴＶクローンか
ら完全に発散している。それは約５７０ｂｐの独特配列
および引き続くポリアデニル化シグナルを有した（図１
Ａ）。クローン６Ｌの５’末端は翻訳開始部位から下流
の１５０ｂｐの位置に伸長した。クローン＃２はクロー
ン＃６Ｌに類似するが、ただしそれはクローン＃６Ｌよ
り上流に伸長していなかった。上流および下流の双方に
異なる長さで伸長する、いくつかの他のクローンが同定
され、それらのすべてはクローン同一位置に新規な配列
を有し、そして同一のポリアデニル化シグナルを利用し
た。イヌのゲノムのライブラリーをプローブとしてこの
２００ｂｐの新規な配列を使用してスクリーニングす
る。２百万の独立のコロニーをスクリーニングする。５
つの位置が得られ、１つのクローン、＃１２３、をさら
にスクリーニングする。クローン＃１２３からの１０ｋ
ｂのインサートを制限マッピングし、そして断片をｐｕ
ｃ１８プラスミドの中にサブクローニングする。１０ｋ
ｂのインサートからの４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ
断片は独特のプローブにハイブリダイゼーションするこ
とが発見された。このインサートを部分的に配列決定
し、そして結果を図１Ｂに示す。クローン６Ｌおよび２
から得られた独特配列は遺伝子断片（＃１２３）からの
ものと同一である；それはエクソン−イントロンの境界
部分に引き続くイントロンのそれと同一である。事実、
アクセプターのドナー部位のコンセンサス配列はこのク
ローンにおいて維持される（．．．ＡＡＧＣＧＧＧＴＣ
Ｃ．．．）。

【００７０】これが示唆するように、ｍＲＮＡの転写
は、規則的なエクソン−イントロン接合部位から約５７
０ｂｐ下流のイントロンの中に別のポリアデニル化部位
が存在するために、この新規なｃＤＮＡ中でこの分子の
中央において終わる。こうして、アデニリルシクラーゼ
のこの切頭した形態の成熟したｍＲＮＡは、イントロン
の配列の一部分および引き続いてポリアデニル化を含有
する。このポリアデニル化部位のコンセンサス配列は共
通の方法ではなく、このポリアデニル化部位を利用する
メッセージの量はより少ないであろう。それは５９６ア
ミノ酸から構成されたタンパク質をつくり、それらのう
ちの２５アミノ酸はこのクローンに対して独特である。

【００７１】クローン６Ｌからの２．８ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ断片を、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ１１３−αと呼ぶ、
の中に、その独特制限部位を使用してサブクローニング
する。クローン＃１１３からの２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ
−ＳｓｐＩ断片をｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ１１３−βと
呼ぶ、の中にクローニングした。３つのクローンのアデ
ニリルシクラーゼ活性を比較する；＃１１３−７２、こ
れは普通の完全な分子をエンコードする、＃１１３−
α、これはこの分子の最初の半分をエンコードする、お
よび＃１１３−β、これはこの分子の後の半分をエンコ
ードする。単独で発現されるとき、＃１１３−αまたは
＃１１３−βのいずれもモックトランスフェクションさ
れた対照を越えて増加した活性をもたなかった。しかし
ながら、一緒に同時トランスフェクションするとき、活
性は有意に増大された。完全な分子（＃１１３−７２）
の活性の７０％以上は回収される。この増大は基礎とも
基礎において見られ、そしてＧＴＰγＳ、ＮａＦおよび
フォルスコリンで刺激された。

【００７２】上のデータが示唆するように、Ｖ型−αは
アデニリルシクラーゼ活性をもたず、なおその相手のＶ
型−βと同時トランスフェクションすると、それは活性
を有することができるであろう。これは他の研究者らの
観察と一致しない。このような半分の分子は事実Ｖ型ア
デニリルシクラーゼについて存在するという発見は、ア
デニリルシクラーゼの基本的サブユニットはこの族の他
の構成員と似た６−トランスメンブレンのモチーフであ
ることができることを示唆する。

【００７３】イヌの心臓のアデニリルシクラーゼのポリ
ペプチドは、アプライドタンパク質技術（Ａｐｐｌｉｅ
ｄＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）合成装置
（マサチュセッツ州ケンブリッジ）で固相メリールド
（Ｍｅｒｒｉｅｄ）法により合成され、そして高性能液
体クロマトグラフィーにより＞９９％に精製される。合
成されたペプチドは次の配列を有する。＃１，Ｅ³⁴⁶−
Ｅ³⁶⁵：＃２，Ｋ⁴²⁵−Ｃ⁴⁴⁴；，＃３，Ｋ⁶²⁶−Ａ⁶⁴⁵；
＃４，Ｃ⁸⁰¹−Ｓ⁸²⁵；＃５，Ａ⁸⁸⁶−Ｔ⁹⁰⁵；，＃Ａ，Ｍ
⁵⁸¹−Ｇ⁵⁹⁰；＃Ｂ，Ｙ¹¹⁷⁵−Ｓ¹¹⁸⁴；＃Ｃ，Ｑ¹¹⁴²−Ｎ
¹¹⁵⁴；，＃６，Ｃ⁵⁰⁰−Ｙ⁵¹⁹。

【００７４】表２は、ＣＭＴ細胞におけるＧＴＰλＳ刺
激されたＶ型アデニリルシクラーゼ活性への種々のペプ
チドの作用を示す。使用したペプチドは大きさが４〜２
５アミノ酸だけ異なる。ペプチドの配列は細胞内のドメ
イン（＃１、＃２、＃３、＃６、＃Ａ、＃Ｂおよび＃
Ｃ）、細胞外のドメイン（＃４および＃５）またはトラ
ンスメンブレンのドメイン（＃Ｄ）から取る。１×１０
^-4モルの濃度において、＃２および＃６ペプチドは触媒
活性への有意の阻害を示すが、ペプチドの残部は有意の
作用を示さない。触媒活性の９０％より多くがペプチド
＃２または＃６の存在下に抑制されることは興味あるこ
とである。

【００７５】これらのペプチドの独特の特性は、また、
薬物のスクリーニング手順において利用される。第１
に、ペプチドそれら自体は、被検体に局所的または前身
的に投与されるとき、アデニリルシクラーゼの特異的阻
害因子である。第２に、各ペプチドに対してレイズされ
た推定上の抗体は前述と同一の阻害作用を有する。第３
に、アデニリルシクラーゼ分子に対するペプチドと反応
部位について競争する化合物を、このペプチド阻害アッ
セイを使用することによってスクリーニングする。この
ような化合物はこの分子の触媒活性への生物学的作用を
有する。

【００７６】

【表２】表２ペプチドの存在下のアデニリルシクラーゼ活性の阻害％阻害％対照０＃１＜５＃２＞９０＃３＜５＃４＜５＃５＜５＃６＞９０＃Ａ＜５＃Ｂ＜５＃Ｃ＜５

【００７７】

【表３】

【００７８】

【表４】

【００７９】配列のリスト（１）一般的情報：（ｉ）出願人：イチカワヨシヒロ（ｉｉ）発明の名称：心臓のアデニリルシクラーゼのク
ローニングおよび特性決定（ｉｉｉ）配列の数：１（ｉｖ）通信のアドレス：（Ａ）アドレス：アントイネッテ・Ｆ．コンスキアメリカン・サイアナミド・カンパニー（Ｂ）街：ウェストメインストリート１９３７郵便私
書箱６０（Ｃ）市：スタンフォード（Ｄ）州：コネチカット（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号：０６９０４（ｖ）コンピューターの読み取り：（Ａ）媒体の型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣＡＴ（Ｃ）操作システム：ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＤＷ４からのＡＳＣＩＩ（ｖｉ）現在の出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）前の出願のデータ：（Ａ）出願番号：７５１，４６０（Ｂ）出願日：１９９１年８月２９日（ｖｉｉｉ）代理人の情報：（Ａ）名前：アントイネッテ・Ｆ．コンスキ（Ｂ）登録番号：３４，２０２（Ｃ）参照／整理番号：３１，６１８−０２（ｉｘ）電話通信の情報：（Ａ）電話：２０３３２１２４５５（Ｂ）テレファックス：２０３３２１２９７１（Ｄ）テレックス：（２）配列ＩＤＮｏ．１についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：４３５６塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の表示：配列ＩＤＮｏ．１：

【００８０】

【表５】

【００８１】

【表６】

【００８２】

【表７】

【００８３】

【表８】

【００８４】

【表９】

【００８５】

【表１０】

【００８６】

【表１１】

【００８７】

【表１２】

【００８８】

【表１３】

【００８９】

【表１４】

【００９０】

【表１５】

【００９１】

【表１６】

【００９２】

【表１７】

【００９３】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。

【００９４】１、心臓アデニリルシクラーゼＶ型をエン
コードする単離された核酸分子。２、核酸分子がＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡから成る
群より選択される核酸である上記第１項記載の単離され
た核酸分子。

【００９５】３、核酸分子が哺乳動物の核酸分子である
上記第１項記載の単離された核酸分子。

【００９６】４、上記第１項記載の核酸分子によりエン
コードされる単離されたポリペプチド。

【００９７】５、上記第１項記載の核酸分子からなる発
現ベクター。

【００９８】６、上記第５項記載の発現ベクターからな
る安定に形質転換された宿主細胞。７、上記第４項記載のポリペプチドと複合体を形成する
ことができる抗体。

【００９９】８、上記第６項記載の宿主細胞をポリペプ
チドの産生に好適な条件下に生育させ、そしてそのよう
に産生されたポリペプチドを回収することからなる心臓
アデニリルシクラーゼＶ型のポリペプチドの産生方法。

【０１００】９、工程：ａ）被検体から適当なＲＮＡの試料を単離し、そしてｂ）上記第４項記載のｃＤＮＡを前記試料中のＲＮＡに
ハイブリダイゼーションさせることによって、前記試料
中のＲＮＡの量を決定すること、からなる被検体におけ
る心臓機能を決定する方法。

【０１０１】１０、患者に上記第４または７項記載のポ
リペプチドまたは抗体の製剤学的組成物を投与すること
からなる患者における心臓機能の変更方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡはＶ型のアデニリルシクラーゼの部分的制限
地図を示す。Ａ：アデニリルシクラーゼＤＮＡの部分的
制限地図。クローニング部分はボックスであり、そして
ハッチングしたボックスはポリアデニル部位を示す。
Ｅ：ＥｃｏＲＩ認識部位。Ｈ：ＨｉｎｃＩＩ。Ｓ：Ｓｐ
ｈ１Ｘ。Ｘ：ＸｈｏＩ。ＳＳ：ＳｓｐＬ。Ｂはイヌ科の
動物の心臓のλｇｔ１０ライブラリーおよび配列決定の
方法から得られたＶ型のアデニリルシクラーゼのｃＤＮ
Ａクローンを示す。１．２〜３．５ｋｂの大きさの範囲
の５つの異なるクローン、＃７、＃８、＃２５、＃７２
および＃１１３は、解読領域全体を含有する４．４ｋｂ
のｃＤＮＡを構成する。

【図２】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されたアミノ酸配列を示す。解読配列全体、ならびに
５’非翻訳配列および完全な３’非翻訳配列の一部分を
示す。ＡＴＧはオープンリーディングフレームの中の推
定上の翻訳開始部位を示す。ＴＧＡはオープンリーディ
ングフレームの中の翻訳停止コドンを示す。示した推定
上のポリアデニル化はイタリックでしるす（ＡＡＴＡＡ
Ａ）。また、配列ＩＤ＃１として示す。

【図３】Ｖ型のアデニリルシクラーゼのヒドロパシー
（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）のプロットおよびＩ型アデニ
リルシクラーゼとのタンパク質のドットマトリックスの
ドットのマトリックスである。マクベクター（ＭａｃＶ
ｅｃｔｏｒ）３．５ソフトウェアを使用して、Ｖ型のア
デニリルシクラーゼの構造を分析した。カイト（Ｋｙｔ
ｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）（１１）
の方法を７の窓の大きさで使用する。１２のピークに番
号を付し、これらの番号は推定上のトランスメンブレン
のスパニング領域を表す。

【図４】Ａは図３と同様であるが、６０％に設定した厳
格さおよび８の窓の大きさでＶ型とＩ型との間のアミノ
酸のドットマトリックスを比較するために、マクベクタ
ー（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）３．０を使用する。Ｂはアデ
ニリルシクラーゼの他の型（Ｉ型および型ＩＩＩ）の間
のタンパク質のドットのマトリックスの比較である。マ
クベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）３．０ソフトウェア
を、６５％の厳格さおよび８の窓の大きさの分析のため
に使用する。

【図５】心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡからの断
片による種々のイヌ科の動物の組織のノザンブロット分
析を描写する。５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを各アッセイ
のために使用する。心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮ
ＡからのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩの０．９ｋｂの断片
をプローブとして使用する。レーンは次の通りである：
Ｈ−心臓、Ｂ−脳、Ｔ−精巣、Ｓ−骨格筋、Ｋ−腎臓、
Ｌ−肺。標準（キロ塩基）（ｋｂ）をブロットの左に記
載する。

【図６】Ｖ型のアデニリルシクラーゼ活性へのカルシウ
ムの作用を描写する。アデニリルシクラーゼ活性（ｐｃ
ＤＮＡ１１３−７２で形質転換されたＣＭＴ細胞または
心臓の筋細胞膜）を増加する濃度のカルシウム（０〜１
ミリモル）の存在下に測定する。心臓の筋細胞膜は記載
されているように調製する（２６）。両者の膜の調製物
をまずＥＧＴＡで洗浄した後、アッセイする（２７）。
３つの独立の実験において、同様な結果が得られる。対
照を越えた基礎的およびフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏ
ｌｉｎ）刺激アデニリルシクラーゼ活性の少なくとも４
倍の増加により、トランスフェクションの効率は確証さ
れる。トランスフェクションされた膜（□）、カルモデ
ュリン（２００ナノモル）でトランスフェクションされ
た膜（■）、心臓の筋細胞膜（◇）、カルモデュリン
（２００ナノモル）でトランスフェクションされた筋細
胞膜（◆）。

【図７】Ｖ型のアデニリルシクラーゼ活性へのアデノシ
ンおよびその類似体の作用を描写する。膜（ｐｃＤＮＡ
１１２−７２でトランスフェクションしたまたは対照）
を、アッセイ前に、５ミリモルのＭｎ²⁺および１００μ
モルのフォルスコリンと１０分間予備インキュベーショ
ンする。アデノシン（■）、２’−デオキシ−アデノシ
ン（□）、３’−ＡＭＰ（◆）、および２’−デオキシ
−３’−ＡＭＰ（◇）。３回の独立の実験において同様
な結果が得られた。各点は３回の反復実験の決定の平均
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＮＮ 8413−4ＣＣ０７Ｋ 13/00 8619−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】心臓アデニリルシクラーゼＶ型をエンコ
ードする単離された核酸分子。
【請求項２】請求項１記載の核酸分子によりエンコー
ドされる単離されたポリペプチド。
【請求項３】請求項１記載の核酸分子からなる発現ベ
クター。
【請求項４】請求項３記載の発現ベクターからなる安
定に形質転換された宿主細胞。
【請求項５】請求項２記載のポリペプチドと複合体を
形成することができる抗体。
【請求項６】請求項４記載の宿主細胞をポリペプチド
の産生に好適な条件下に生育させ、そしてそのように産
生されたポリペプチドを回収することを特徴とする心臓
アデニリルシクラーゼＶ型のポリペプチドの産生方法。
【請求項７】工程：ａ）被検体から適当なＲＮＡ試料を単離し、そしてｂ）請求項２記載のｃＤＮＡを前記試料中のＲＮＡにハ
イブリダイゼーションさせることによって、前記試料中
のＲＮＡの量を決定することからなることを特徴とする
被検体における心臓機能を決定する方法。
【請求項８】患者に請求項２または５記載のポリペプ
チドまたは抗体の製剤学的組成物を投与することを特徴
とする患者における心臓機能の変更方法。