JPH10504961A

JPH10504961A - Ｇａｂａ▲下ａ▼レセプターイプシロンサブユニット

Info

Publication number: JPH10504961A
Application number: JP8508680A
Authority: JP
Inventors: リ，イ; カークネス，イーウェン
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1994-08-26
Publication date: 1998-05-19
Also published as: EP0783523A4; EP0783523A1; EP0783523B1; WO1996006862A1; DE69434090D1; AU1287495A; DE69434090T2

Abstract

(57)【要約】ヒトＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニットレセプターおよびこのようなポリペプチド（ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を開示する。また、組換え技術を使用してこのようなポリペプチドおよびこのようなポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを製造する手順も開示する。例えば、不安、ハンチントン舞踏病、筋攣縮および硬直、および睡眠および発作障害を治療するため該アゴニストを使用する方法を提供する。例えば、不安、ハンチントン舞踏病、睡眠および発作障害、アルツハイマー病、パーキンソン病およびベンゾジアゼピンの過剰投与を診断し、治療するためおよび外科手術の間に全身麻酔の適用後、認識を増強させおよび鎮静を解くためにアンタゴニストを使用してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニット本発明は、新規に同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より詳しくは、本発明のポリペプチドはヒトＧＡＢＡ_Aレセプターである。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を抑制することにも関する。 γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は哺乳動物の中枢神経系における主要な抑制性神経伝達物質である。抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡのレセプターの主要なタイプであるＧＡＢＡ_Aレセプター（ＧＡＢＡ_A）と呼ばれるものは、リガンドゲート化（ ligand-gated）イオンチャンネルの遺伝子のスーパーファミリーの一員である。ＧＡＢＡ_A複合体の内在性リガンドであるＧＡＢＡは、関連塩素イオンチャンネルを通して塩素イオンコンダクタンス（conductance）を刺激する。ＧＡＢＡの主要な効果は神経発火の抑制を産み出すためのシナプス後膜の塩素イオンコンダクタンスの増加を得る特異的なレセプタータンパク質との相互作用である。ＧＡＢＡは多くの中枢神経において（例えば、基底核、小脳）において見いだされている。ＧＡＢＡは、グルタミン酸脱炭酸酵素によって脱炭酸化されたグルタミン酸塩に由来する。レセプターとの相互作用の後、ＧＡＢＡは能動的に接合前ニューロン（prejunctional neuron）へと『汲み上げ』られる。ＧＡＢＡ_Aレセプターは複数のサブユニットリガンドゲート化イオンチャンネル（multi-subunit ligand-gated ion channel）である。このレセプターはいくつかの別個のポリペプチドタイプからなるヘテロオリゴマータンパク質である。５つの異なるサブユニットのクラスであるα、β、γ₁、δ_λおよびρが明らかにされている。これらのポリペプチドのモレキュラークローニングは、それらが互いに２０−４０％の同一性を示すことおよびニコチン性アセチルコリンレセプターおよびストリキニーネ感受性グリシンレセプターと１０−２０％の同一性を示すことを明らかにする。各サブユニットクラスはまた、遺伝子ファミリー（そのメンバーが６０−８０％のアミノ酸配列の同一性を有する）によって代表される。６つのα、３つのβ、３つのγ、１つのδおよび２つのρサブユニットの配列が報告されている。保存されているおよび可変のアミノ酸配列領域は各ポリペプチド内の構造的および機能的ドメインを示唆している。異種細胞において発現しているポリペプチドすべてはＧＡＢＡ活性化塩素チャンネルを生み出し、異なるサブユニットの組合せは異なる薬理学的な特性を表わす。異なるＧＡＢＡ_AレセプターポリペプチドおよびそのサブタイプのｍＲＮＡの分布はレセプターの異質性の薬理学的および生化学的証拠と一致した重要な脳の領域的変異を示す。異なる細胞および領域的な位置を有するＧＡＢＡ_Aレセプターのサブポピュレーション（subpopulation）はＧＡＢＡ、ステロイドのようなモジュレーター、生理学的調節、疾患過程、およびベンゾジアゼピンなどの薬剤による薬理学的操作に対して異なる感受性を示す。ＧＡＢＡ_Aレセプターの種々のサブポピュレーションの特性は、１つまたはそれ以上の異なるサブユニットが所定の細胞において、種々多様なオリゴマータンパク質構造の変異体を生み出すために発現されていることによって決定される。ＧＡＢＡ_Aレセプター塩素−イオノフォア複合体は、ベンゾジアゼピンおよび抗痙攣薬バルビツール酸などの不安および発作障害を治療するために使用される多くの薬剤の一次作用部位である。アロステリック薬剤誘発調整によって不安、不眠、筋緊張およびてんかん作用のレベルが調節されることによって該レセプターは分子制御要素として機能する。本発明者らはＧＡＢＡ_Aサブユニットの新規なクラスを発見した。この新規なＧＡＢＡ_Aサブユニットは他のＧＡＢＡ_Aサブユニットのクラスのように同様のさらなる薬理学的な事象を担っていてよい。本発明の一態様により、ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットである新規成熟ポリペプチドならびに生物学的に活性で、診断学的にまたは治療学的に有用であるその断片、類似体および誘導体を提供する。本発明のポリペプチドはヒト起源のものである。本発明の別の態様により、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。本発明のさらなる別の態様により、組換え技術によりこのようなポリペプチドを製造するための方法を提供する。本発明のさらなる別の態様により、このようなＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットに対するアゴニストおよび例えば、不安、ハンチントン舞踏病および睡眠および発作障害などの診断および治療する目的のため、このようなアゴニストを利用する方法を提供する。本発明のさらなる別の態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のさらなる別の態様により、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ベンゾジアゼピン薬剤の過剰投与および他の神経障害の治療におけるこのようなポリペプチドの作用を抑制することおよび記憶を増強することに使用されてよい、このようなポリペプチドのアンタゴニストを提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者には明らかであろう。以下の図面は本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を制限しようとするものではない。図１は、ＧＡＢＡ_AレセプターイプシロンサブユニットのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。タンパク質の全長は４４０アミノ酸残基であり、成熟タンパク質が４１６アミノ酸残基を含むように最初の２４アミノ酸は推定リーダー配列を表す。図２は、アミノ酸の標準１文字省略記号を使用し、ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットのアミノ酸配列を示す。推定膜貫通領域に下線を付す。図３は、ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットと他のＧＡＢＡ_Aレセプターサブユニットのアミノ酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマッチする部分である。図４は、ＧＡＢＡ_Aイプシロンレセプターサブユニットの二次構造的な特徴を示す。最初の７つの例示はαヘリックス、βシート、ターン領域またはコイル領域であるアミノ酸配列の領域を示す。ボックス化された領域は指示された領域に対応する領域である。図の第２セットは、細胞内、細胞質にさらされているかまたは膜分離アミノ酸配列の領域を描く。ハイドロフィリシティー（hydorophilic ity）のプロットは、膜の脂質二重層であり、ゆえに疎水性であるタンパク質配列の領域、および親水性である脂質二重層膜の外側の領域であるタンパク質の配列の領域を示す。抗原指標は抗原の領域が脂質二重層膜の外側であり抗原を結合することができるため、ハイドロフィリシティーロットに対応する。サーフィスプロバビリティー（surface probability）プロットはさらに抗原指標およびハイドロフィリシティープロットに対応する。両親媒性のプロットは、極性および非極性であるタンパク質配列の領域を示す。可とう性の領域は、膜の外側の領域であり、非可とう性の領域は膜貫通領域であるという意味で図の第２セットに対応する。本発明の一態様により、図１の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託、１９９４年６月１０日、第７５８１０号に寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離した核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本発明のポリヌクレオチドはすい臓腫瘍から得られたｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。それは構造的にＧＡＢＡ_Aサブユニットレセプターファミリーに関連する。該ポリヌクレオチドはほぼ最初の２４アミノ酸残基が、成熟タンパク質が４１６アミノ酸を含むような推定リーダー配列である約４４０アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。該タンパク質は４００アミノ酸長を越えてラットＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンβ−１サブユニットと５０％の同一性および７０％の類似性という高い程度のホモロジーを示す。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む）の形態であってよい。該ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよく、また一本鎖であるならば、コーディング鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であってよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は図１に示すコーディング配列または、寄託されたクローンのコーディング配列に一致していてよいし、または遺伝コードの重複（redundancy）または縮重の結果、図１のＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする別のコーディング配列であってよい。図１の成熟ポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下のものを含んでいてよい：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列、および、リーダー配列または分泌配列などの別のコーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列（および任意に別のコーディング配列）、および成熟ポリペプチドのコーディング配列のイントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディング配列の５'および／または３'非コーディング配列などの非コーディング配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という語には、該ポリペプチドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにまた、別のコーディングおよび／または非コーデイング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体または該ポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であってよい。従って、本発明は、図１に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡによってコードされるポリヌクレオチドの断片、誘導体、または類似体をコードする。そのようなヌクレオチド変異体には欠失変異体、置換変異体および付加または挿入変異体が含まれる。先に示したように、該ポリヌクレオチドは図１に示すコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有してよい。当該技術分野において公知のように、対立遺伝子変異体は１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加（実質的にはコードするポリペプチドの機能を変えない）を有してよい別の形のポリヌクレオチド配列である。本発明はまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列が、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能する、リーダー配列などの宿主からのポリペプチドの発現および分泌を援助するポリペプチド配列と同じリーディングフレーム内で融合されてもよい、ポリペプチドも含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、宿主細胞によってポリペプチドの成熟形態を形成するため開裂されてもよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合したコーディング配列を有してもよい。該マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、ｐＱＥ−９ベクターによって与えられるヘキサ−ヒスチジンタグであってよく、または例えば、哺乳動物宿主（例えば，ＣＯＳ−７細胞）を使用する場合には、マーカー配列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。該ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質より得られるエピトープに対応する（ウィルソン（Ｗilson，Ｉ.）ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４））。本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは少なくとも７０％の同一性がある場合に、本明細書に記載の上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する場合、「ストリンジェント条件」という語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のｃＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。本明細書で使用する寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の約定の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は、いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得て、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニットポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。図１のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに言及する場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、類似体には、プロタンパク質部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロタンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプチドが好ましい。図１のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、または（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロタンパク質配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境）から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってよく、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってよく、それでいて、そのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、なお単離されている。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される（形質導入、または形質転換、またはトランスフェクションされる）。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニット遺伝子を増幅するのに適するよう改変された通常の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかしながら、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモーター）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる；ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．coli）、lac、またはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性といったようなまたは、大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるための１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベクターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）、サルモネラ・テウィフィムリウム（Ｓalmonella typ himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ドロソフィラ（Ｄ rosophila）およびＳｆ９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowe sメラノーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。そのような構築物は、本発明の配列が順方向または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含む。この実施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの調節配列を含む。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙げる。細菌用；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑiagen））、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓtratagene）；ptrc ９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(ファルマシア（Ｐharmacia）)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、 pＸＴ１、pＳＧ(ストラタジーン)pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(ファルマシア)。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲｓ、およびマウスのメタロチオネイン − Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(デイビス（Ｄavis,Ｌ.）、ディブナー（Ｄibner,Ｍ.）、バッテイ（Ｂattey,Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology）（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓambrook）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ＡＬab oratory Ｍanual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor）、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ.cerevisiae）ＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で集合する。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、作動可能なリーディング相にある適当な翻訳開始および終結シグナルと機能的なプロモーターと共に挿入することにより構築される。そのようなベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含むであろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラス・サチリス（Ｂacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム、およびシュードモナス（Ｐseudomonas）属、ストレプロマイセス属、ならびにスタフィロコッカス（Ｓtaphylococcus）属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた選択可能である。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでいてよい。そのような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia Ｆine Ｃhe micals）、ウプサラ（Ｕppsala）、スウェーデン)およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオテク（Ｐromega Ｂiotec）、マディソン（Ｍadison）、ウィスコンシン、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株を形質転換して、その宿主株を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導) により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Ｇluzman）、Ｃell 、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含むであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。ＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニットポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって）組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。本発明のＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニットポリペプチドは、ＧＡＢＡ_Aレセプターの他のサブユニットを同定するのにも使用する。これらのサブユニットの同定のための手法の例には、独特の、細菌により発現されたＧＡＢＡ_Aイプシロンポリペプチドに対する高力価ポリクローナル抗血清を産生させることを含む。ついでこれらのポリクローナル抗血清を哺乳動物脳好ましくはラット脳からの洗剤可溶化ＧＡＢＡAレセプターを免疫沈降するのに使用される。また、好ましくは脳の海馬部位が使用される。ＧＡＢＡ_Aイプシロンポリペプチドはまた、レセプター機能のリガンド／モジュレーターをスクリーニングするために使用されてよい。このスクリーニングはＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニットレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するのに特に有用である。このようなアッセイの例は、パッチクランプアッセイである。ＧＡＢＡ_AイプシロンサブユニットをコードするＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞に挿入する。該ＤＮＡ配列は発現カセット、好ましくは発現プラスミドに挿入される。本明細書で使用する『発現カセット』とは、真核細胞におけるコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。プラスミドの例は、市販されており好ましいｐＣＤＭ８である。選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドをＧＡＢＡ_AイプシロンサブユニットをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドとともにコトランスフェクションしてよい。ＧＡＢＡ_AレセプターはＧＡＢＡの結合により、細胞内へ塩素イオンを通過させることができるゲート化されたチャンネルである。ＧＡＢＡ_AレセプターはＧＡＢＡにチャンネルを開かせることができ、テストされる分子がアゴニストなら細胞に一層多くの塩素イオンを入れ、またはテストされる分子がアンタゴニストなら細胞に塩素イオンを少なくさせるであろう。ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットを通過する塩素イオンの量はパッチクランプアッセイを使用して直接測定できる。該アッセイは細胞の表面上に埋められた電極の内外の電荷の流れを測定する。細胞内へ入る塩素イオンの流れは、ゲートが開くと細胞内の電気的平衡を維持するために細胞をそのままにさせる電流の関数として測定される。該パッチアッセイはハミル(Ｈammill，Ｏ.Ｐ.)ら、インプルーブド・パッチ・クランプ・テクニックス・フォー・ハイ・レゾリューション・カレント・レコーディング・フロム・セルズ・アンド・セルフリー・メンブレン・パッチズ（Ｉmproved Ｐatch Ｃlamp Ｔechniques for Ｈigh Ｒesolution Ｃurrent Ｒeco rding from Ｃells and Ｃell-Ｆree Ｍembrane Ｐatches）、Ｐfluegers Ａrch . 、３９１：８５−１００（１９８１）に詳細に記載されている。パッチクランプアッセイを使用して、化合物が有する安定な細胞株に組み入れられるレセプターへの効果を決定することができる。ホールセル（whole cell）パッチクランプアッセイの感度の範囲は、約１０００ｐＡであり、２から５ｐＡの間の電流を区別することができる。本発明はさらに、ＧＡＢＡとＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットの相互作用を増強または阻害するものを同定するための薬剤のスクリーニング法を提供する。１例として、機能的なＧＡＢＡ_AレセプターイプシロンサブユニットをコードするＤＮＡはアフリカツメガエルの卵母細胞において発現する。発現はクローニングされたｃＤＮＡｓがサイトメガロウイルスプロモーターの転写制御下にある組換えＣＤＭ８ベクターの核注入によりなされる。ついで、ＧＡＢＡ_A レセプターは卵母細胞の外側表面に発現し、該卵母細胞をＧＡＢＡおよび潜在的な薬剤と結合させる適切な条件下でインキュベートする。ついで、ＧＡＢＡとＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットの相互作用は薬剤の存在下で測定され、もし該薬剤がこの相互作用に影響を及ぼすならば決定ができるであろう。潜在的なアンタゴニストには、抗体または場合によってはＧＡＢＡへの接近を阻害するＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットに結合するオリゴヌクレオチドを含む。アンタゴニストはＧＡＢＡ_Aイプシロンサブユニットを認識し結合するＧＡＢＡの密接関連タンパク質であってもよいが、ＧＡＢＡの不活性化形態であり、ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットを効果的に阻害する。潜在的なアンタゴニストはまた、アンチセンス構築物をも含む。アンチセンス技術は三重螺旋形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（その両者の方法はポリヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡに結合させること基礎としている）によって遺伝子発現を制御するのに使用されることができる。例えば、該ポリヌクレオチド配列の５'コーディング部位（本発明の成熟ポリペプチドをコードする）は長さが約１０から４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−リー（Ｌee）ら、Ｎucl．Ａcids Ｒ es.、６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃooney）ら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄervan）ら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９９１）参照）、それによってＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットポリペプチドの転写および産生を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、、ｍＲＮＡ分子のＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットポリペプチドへの翻訳を阻害する（アンチセンス−オカノ（Ｏkano）、Ｊ.Ｎeurochem．５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチド・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibito rs of Ｇene Ｅxpression）、ＣＲＣプレス(ＣＲＣＰress)、ボカ・レイトン（Ｂoca Ｒaton）、フロリダ（１９８８））。上記に記載のオリゴヌクレオチドはまたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイン・ビボでＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットポリペプチドの産生を阻害するために発現されるように細胞に運搬されることができる。上記で同定されたアゴニストおよびアンタゴニストは治療剤として使用されてよい。アゴニストはＧＡＢＡ_AレセプターでＧＡＢＡの効果をまねして使用され、それゆえ抑制性の効果を増大する。それゆえ、これらのアゴニストは不安、ハンチントン舞踏病、筋攣縮および硬直、および睡眠および発作障害に有用である。アンタゴニストはレセプターによって媒体された抑制を阻害し、それゆえ神経発火を増大させ、それゆえアルツハイマー病、パーキンソン病およびベンゾジアゼピンの過剰投与に有用である。アンタゴニストはまた、認識を増強するおよび外科手術の間の全身麻酔の適応後鎮静作用を解くのに使用されてよい。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは、適当な製薬学的担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療上有効な量のアゴニストまたはアンタゴニスト、および製薬学上許容され得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適合すべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供する。そのような容器には、製薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と共に使用することができる。該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、てんかんを特に治療するための肛門内を含む便利な方法で投与することができる。製薬学的な組成物は、特定の徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。患者に投与された該組成物の量および一回投与療法は投与形式、処置される条件の実質および処方する内科医の判断などの複数の要因に依存するであろう。一般に、該組成物は、１日当たり少なくとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、たいていの場合、約８mg／kg(体重)を超えない量で投与されるであろう。たいていの場合、投与経路および症状等を考慮に入れて、投与量は、毎日約１０μg／kg〜約１mg／kg(体重)である。該ポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・ビボにおける発現により、本発明に従って使用してよい。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ（ex vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当該技術分野で公知の方法により操作することができる。同様に、例えば、当該技術分野で既知の方法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のために、細胞をイン・ビボにおいて操作することができる。当該技術分野において知られているように、細胞をイン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するためのプロデューサー細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をイン・ビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝子の３ ' 非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、イン・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、わずか５００または６００塩基の短いｃＤＮＡで利用することができる；しかしながら、２,０００ｂｐより大きいクローンは、簡単な検出に関して十分なシグナル強度を有する独特の染色体の位置に結合しやすい。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが由来するクローンの使用を必要とし、長ければ長いほど良い。例えば、２,０００ｂｐは良く、４,０００は一層良く、および４, ０００以上がおそらく時間の合理的なパーセントの良い結果である。この技術の概説には、ベルマ（Ｖerma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Ｈuman Ｃhromo somes）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック・テクニクス（a Ｍanual of Ｂas ic Ｔechniques）、パガモン・プレス（Ｐergamon Ｐress）、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、マックジック（Ｖ.ＭcＫusick）、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊohns Ｈopkins Ｕniversit y Ｗelch Ｍedical Ｌibrary）を介してオンラインで利用できる)に見い出される。ついで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を連鎖分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の原因となり得る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々な方法を、そのような抗体および断片の製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。ついで、そのような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用できる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法(コーラー（Ｋohler）およびミルシュタイン（Ｍilstein）、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法( コズボール（Ｋozbor）ら、１９８３、Ｉmmunology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Ｃole）ら、１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy）、アラン・アール・リス、インク（ＡlanＲ.Ｌiss，Ｉnc.）、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかしながら、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当該技術分野で公知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、典型的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的には、より多量の容積中、典型的にＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望の断片を単離する。開裂した断片のサイズ分離は、ゲッデル（Ｇoeddel,Ｄ）ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰとともにリン酸を加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片にライゲーションするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(マニアチス（Ｍaniatis,Ｔ.）ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、形質転換は、グラハム（Ｇraham,Ｆ.）およびファン・デル・エブ（Ｖan der Ｅb,Ａ.）、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１ＨＥＫ２９３細胞における組換えＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットの発現ＧＡＢＡ_AレセプターイプシロンサブユニットをコードするｃＤＮＡの断片をその遺伝子の転写を駆りたてるためＣＭＶ即時初期プロモーターを使用してベクターにクローニングした。そのベクターｐＣＤＭ８はインビトロゲン・コーポレーシヨン（Ｉnvitrogen Ｃorporation）、サンディエゴ、カリフォルニア、９２１２１により入手できる。まず、ＨindIIIおよびＸbaI（平滑化）でプラスミドを消化し、そのプラスミドのそれらの部位にｃＤＮＡをライゲーションすることによってそのｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入する。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法（マニアチス（Ｍaniatis，Ｔ.）フリッチュ（Ｅ.Ｆ.Ｆritsch）およびサンブルック、１９８９、モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）の後、２サイクルのＣsＣl平衡密度勾配遠心分離によって調製した。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションする（ＨeＬa細胞もまたトランスフェクションされてよい）のに使用したトランスフェクションプロトコールはチェン(Ｃhen，Ｃ.)およびオカヤマ（Ｈ．Ｏkayama）、１９８７から改変した。プラスミドＤＮＡによる哺乳動物細胞の高効率の形質転換。Ｍol．Ｃell．Ｂiol．７：２７４５−２７５２（チャン（Ｃhan）−オカヤマＣaＰＯ₄、ｐＨ６.９５法）。２.５ＭＣaＣl₂（マリンクロット（Ｍallinckrodt））のストック溶液を調製し、０.４５μmポアサイズ（pore-size）ニトロセルロースフィルター（ナルジ（Ｎalge））を通して濾過滅菌しついで−２０℃で保存した。ついで５０mＭＢes（ｐＨ６.９５）、２８０mＭＮaＣlおよび１.５mＭＮa₂ＨＰＯ₄を含む２ ×Ｂes緩衝食塩水（２×ＢＢＳ）を調製し、濾過滅菌しついで−２０℃で保存した。Ｎ,Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエトラン−スルホン酸（ＢＥＳ）をシグマ（Ｓigma）より得た。そのｐＨを室温でＨＣlで合わせた。ＨＥＫ２９３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerica n Ｔype Ｃulture Ｃollection）、ＣＲＬ１５７３）を５％ＣＯ₂中、３７℃でフォルマ・サイエンティフィック・インキュベーター（Ｆorma Ｓcientific Ｉn cubator）で１０％ウシ胎児血清（ギブコ（Ｇibco）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ）およびグルタミン（ギブコ）を補ったＭＥＭ（ギブコ）で維持した。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで除去し、１０cmのプレート１枚当たりに１.５×１０⁶の密度でプレーティングし、ついで増殖培地１０ml中で５％ＣＯ₂、３７℃で一晩インキュベートした。選択の目的のため、チミジンキナーゼプロモーターによって駆り立てられるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）を含むpＷＬ0Ｎeo（ストラタジーン（Ｓ tratagene））を１×１０⁶細胞を含む１０cm皿１枚当たりに使用した。プラスミドＤＮＡを５０mu lの２.５ＭＣaＣl₂と混合しおよび最終容量が０.５mlとなるよう水を加えた。この混合物に０.５mlの２×ＢＢＳを添加しついで室温で９０秒インキュベートした。この得られたリン酸カルシウムＤＮＡ溶液を細胞のプレートに添加（１mlの容量）し、優しく混ぜついで３％ＣＯ₂の下、１５−２４時間３７℃でインキュベートした。その培地を除去し、細胞をＭＥＭ培地で２度リンスし、ついで１０％ウシ胎児血清を加えた新しいＭＥＭでリンスした。該細胞を５％ＣＯ₂の下４８時間３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの４８時間後、その細胞をトリプシン処理しついで４つのプレートに分割（１：８）した。それらを１mg／mlで、１mg／ml Ｇ４１８硫化物（ギブコ）を含む増殖培地の選択的な圧力の下でコロニーが現れるまで２週間増殖させた。安定な形質転換体の選択には約１５−２０日かった。コロニーを２４ウエル皿に分離し、２枚の１０cm皿に播種するためＧ４１８選択培地中で十分増殖させたのち使用した。１０cm皿中での十分な増殖の後、１つを総ＲＮＡを調製するために使用した；残った皿における細胞を将来のプレーティングのために凍結保存した。そのＲＮＡをノーザンブロットによって分析した。安定な形質転換の頻度を決定するために、細胞を記載したようにトランスフェクションした。細胞を分割し、選択的な圧力下（Ｇ４１８硫化物）でプレーティングした時、細胞をまた二重に、１０cmプレート１枚当たり１−３×１０⁶細胞の密度でプレーティングした。プレートの１組を非選択的な増殖培地中で維持し、一方で二重のプレートはＧ４１８硫化物（mg／ml）を有する増殖培地中で増殖させた。コントロールプレートを非選択培地中で５−７日間維持した；ついでコロニーを染色し数えた。Ｎeo⁺形質転換体の数を決定するために選択的な圧力下で２−３週間維持した；ついでコロニーを染色し数えた。その形質転換効率を形質転換％として表わす。これは非選択培地中で増殖したコロニーの数によってＮeo^r の数を除し、その結果を１００倍することによって決定したものである。トランスフェクションしたプラスミドからのクローンを機能的なチャンネルの発現に関して試験した。これらの試験を細胞全体のパッチクランプ電気生理学によって行った。パッチクランプ法のホールセルコンフィギュレーション（whole- cell configulation）をＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットでトランスフェクションしたヒト胎児腎臓細胞におけるＧＡＢＡ媒体Ｃl流を記録することに使用した。パッチピペットを０.５−２メガオームの抵抗を有するホウケイ酸ガラスで作成した。その細胞を（mＭ）ＮaＣl １３５、ＫＣl ５、ＭgＣl₂ １ .８およびＨepes ５、ｐＨ７.２を含む緩衝培体中に入れた。そのピペットを（m Ｍ）ＣsＣl １４０、ＥＤＴＡ１１、ＡＴＰ２、ＭgＣl₂ ４およびＨepes １０、ｐＨ７.３を含む緩衝培体中に入れた。維持電位は−６０mＶであった。試験薬剤を有するかまたは有さない５μＭＧＡＢＡ_Aを含むベージング溶液（bathing solution）を細胞から約１００ミクロン離れた位置のＵ管を通して細胞に添加した。実施例２ヒト組織におけるＧＡＢＡ_Aイプシロンの発現パターンヒト組織におけるＧＡＢＡ_Aイプシロンの発現のレベルを調べるためノーザンブロット分析を行った。総細胞ＲＮＡサンプルをＲＮＡｚｏｌ^TMＢシステム（バイオテックス・ラボラトリーズ・インク（Ｂiotecx Ｌaboratories，Ｉnc.）６０２３サウス・ループ・イースト（Ｓouth Ｌoop Ｅast）、ヒューストン、テキサス７７０３３）で単離した。特定の各ヒト組織から単離した総ＲＮＡの約１０μgを１％アガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターにブロットした（サンブルック、フリッチュおよびマニアチス、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、（１９８９））。その標識反応は、５０ｎgのＤＮＡ断片とともにストラタジーンプライム−イットキットに従って行った。標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで精製した。（５プライム−３プライム、インク、５６０３アラパホ・ロード（Ａrapahoe Ｒoad）、ブルダー（Ｂoulder）、コロラド８０３０３）。ついで、フィルターを放射性標識したＧＡＢＡ_Aイプシロン遺伝子の全長と０.５ＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７.４および７％ＳＤＳ中で１,０００,０００ｃｐｍ／ｍｌで６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。室温で２回洗浄した後、６０℃で０.５× ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで２回洗浄し、ついでフィルターを増感紙で−７０℃で一晩露光させた。実施例３ＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットのバキュロウイルス発現ＧＡＢＡ_Aレセプターの他のサブユニットの発現に関する一般的な方法は以前に記載されている（カーター(Ｃarter，Ｄ.Ｂ.)、ら、Ｂio／Ｔechnology、１０：６７９−６８１（１９９２））。この例において、ＳＦ−９細胞（約１０⁶細胞）を該イプシロンサブユニットを発現するバキュロウイルス構築物（１０⁸ｐｆｕ）に感染させる。細胞はまた、該イプシロンサブユニットを発現するバキュロウイルス構築物および他の公知のＧＡＢＡ_Aレセプターサブユニットを発現するバキュロウイルス構築物の組合せに共感染されてよい。該感染したＳＦ−９細胞を６０時間後に回収する。該細胞を電気生理学的記録（実施例１参照）またはラジオリガンド結合アッセイに使用する。後者に関しては、細胞を１１８mＭＮa Ｃl、５mＭＫＣl、２０mＭＨＥＰＥＳ−Ｔris、ｐＨ７.３を含む溶液中でポリトロン（Ｐlytron）ホモジナイザーによって破壊する。破壊されなかった細胞および核集合物を１０００ｇで１０分間遠心して除去する。ついで、細胞膜をその上清を４００００ｇで５０分間遠心することによって取り戻す。そのペレットを３００mＭスクロース、５mＭＴris−ＨＣl、ｐＨ７.５および２０％グリセロールを含む溶液中に再懸濁する。その膜をラジオリガンド結合アッセイに使用するまで−８０℃で凍結する。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、追記する請求の範囲内で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Aイプシロンポリペプチド、または該ポリペプチドの断片、類似体または誘導体をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第７５８１０号に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Aイプシロンポリペプチドまたは該ポリペプチドの断片、類似体または誘導体をコードするポリヌクレオチドよりなる群から選択される単離したポリヌクレオチド。２．該ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．該ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが図１の推定アミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Aイプシロンをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．ＡＴＣＣ受託番号第７５８１０号のｃＤＮＡによってコードされたＧＡＢＡ_A イプシロンポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．図１に示すようなＧＡＢＡ_Aイプシロンのコーディング配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ＡＴＣＣ受託番号第７５８１０号のＧＡＢＡ_Aイプシロンのコーディング配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作した宿主細胞。１１．請求項１０に記載の宿主細胞から該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現することからなる、ポリペプチドの製造方法。１２．請求項９に記載のベクターで細胞を遺伝的に操作することからなる、ポリペプチドを発現することができる細胞の生成方法。１３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズでき、ＧＡＢＡ_Aイプシロン活性を有するポリペプチドをコードする単離したＤＮＡ。１４．（ｉ）図１の推定アミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Aイプシロンポリペプチドおよびその断片、類似体および誘導体、および（ii）ＡＴＣＣ受託番号第７５８１０号のｃＤＮＡによってコードされるＧＡＢＡ_Aイプシロンポリペプチドおよび該ポリペプチドの断片、類似体および誘導体よりなる群から選択されるポリペプチド。１５．該ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Aイプシロンである請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１８．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアゴニスト。１９．請求項１４に記載のポリペプチドの治療学的に有効な量を患者に投与することからなるＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットの必要性を有する患者の治療方法。２０．請求項１７に記載のアンタゴニストの治療学的に有効な量を患者に投与することからなるＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットを抑制する必要を有する患者の治療方法。２１．請求項１８に記載のアゴニストの治療学的に有効な量を患者に投与することからなるＧＡＢＡ_Aレセプターイプシロンサブユニットを刺激する必要を有する患者の治療方法。２２．請求項１４に記載のポリペプチドおよび製薬学的に許容し得る担体よりなる医薬組成物。２３．治療学的に有効な量のポリペプチドを、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを患者に提供し、イン・ビボで該ポリペプチドを発現することによって投与する請求項１９に記載の方法。