JP2002128799A - Ｇａｂａａレセプターイプシロンサブユニット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトＧＡＢＡ_Ａイプシロンサブユニットレセ
プターおよびそのようなポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、組換え技術を使用して該ポリペプチドお
よび該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト
を製造する手順を提供する。 【解決手段】 （ａ）図１〜図３の推定アミノ酸配列を
有するＧＡＢＡ_Ａイプシロンポリペプチド、または該ポ
リペプチドの断片、類似体または誘導体をコードするポ
リヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号第７５８１０
号に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配
列を有するＧＡＢＡ_Ａイプシロンポリペプチドまたは該
ポリペプチドの断片、類似体または誘導体をコードする
ポリヌクレオチドよりなる群から選択される単離したポ
リヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用ならびにこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より詳
しくは、本発明のポリペプチドはヒトＧＡＢＡ_Ａレセプ
ターである。本発明はまた、このようなポリペプチドの
作用を抑制することにも関する。

【０００２】

【従来の技術】γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は哺乳動物
の中枢神経系における主要な抑制性神経伝達物質であ
る。抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡのレセプターの主要な
タイプであるＧＡＢＡ_Ａレセプター（ＧＡＢＡ_Ａ）と呼
ばれるものは、リガンドゲート化（ligand-gated）イオ
ンチャンネルの遺伝子のスーパーファミリーの一員であ
る。ＧＡＢＡ_Ａ複合体の内在性リガンドであるＧＡＢＡ
は、関連塩素イオンチャンネルを通して塩素イオンコン
ダクタンス（conductance）を刺激する。ＧＡＢＡの主
要な効果は神経発火の抑制を産み出すためのシナプス後
膜の塩素イオンコンダクタンスの増加を得る特異的なレ
セプタータンパク質との相互作用である。ＧＡＢＡは多
くの中枢神経において（例えば、基底核、小脳）におい
て見いだされている。ＧＡＢＡはグルタミン酸に由来
し、グルタミン酸がグルタミン酸脱炭酸酵素によって脱
炭酸化されたものである。レセプターとの相互作用の
後、ＧＡＢＡは能動的に接合前ニューロン（prejunctio
nal neuron）へと「汲み上げ」られる。

【０００３】ＧＡＢＡ_Ａレセプターは複数のサブユニッ
トリガンドゲート化イオンチャンネル（multi-subunit
ligand-gated ion channel）である。このレセプターは
いくつかの別個のポリペプチドタイプからなるヘテロオ
リゴマータンパク質である。５つの異なるサブユニット
のクラスであるα、β、γ１、δ_λおよびρが明らかに
されている。これらのポリペプチドのモレキュラークロ
ーニングは、それらが互いに２０〜４０％の同一性を示
すことおよびニコチン性アセチルコリンレセプターおよ
びストリキニーネ感受性グリシンレセプターと１０〜２
０％の同一性を示すことを明らかにしている。各サブユ
ニットクラスはまた、遺伝子ファミリー（そのメンバー
が６０〜８０％のアミノ酸配列の同一性を有する）によ
って代表される。

【０００４】６つのα、３つのβ、３つのγ、１つのδ
および２つのρサブユニットの配列が報告されている。
保存されているおよび可変のアミノ酸配列領域は各ポリ
ペプチド内の構造的および機能的ドメインを示唆してい
る。異種細胞において発現しているポリペプチドすべて
はＧＡＢＡ活性化塩素チャンネルを生み出し、異なるサ
ブユニットの組合せは異なる薬理学的な特性を表わす。
異なるＧＡＢＡ_Ａレセプターポリペプチドおよびそのサ
ブタイプのｍＲＮＡの分布はレセプターの異質性の薬理
学的および生化学的証拠と一致した重要な脳の領域的変
異を示す。異なる細胞および領域的な位置を有するＧＡ
ＢＡ_Ａレセプターのサブポピュレーション（subpopulat
ion）はＧＡＢＡ、ステロイドのようなモジュレータ
ー、生理学的調節、疾患過程、およびベンゾジアゼピン
などの薬剤による薬理学的操作に対して異なる感受性を
示す。ＧＡＢＡ_Ａレセプターの種々のサブポピュレーシ
ョンの特性は、１つまたはそれ以上の異なるサブユニッ
トが所定の細胞において、種々多様なオリゴマータンパ
ク質構造の変異体を生み出すために発現されていること
によって決定される。

【０００５】ＧＡＢＡ_Ａレセプター塩素−イオノフォア
複合体は、ベンゾジアゼピンおよび抗痙攣薬バルビツー
ル酸などの不安および発作障害を治療するために使用さ
れる多くの薬剤の一次作用部位である。アロステリック
薬剤誘発調整によって不安、不眠、筋緊張およびてんか
ん作用のレベルが調節されることによって該レセプター
は分子制御要素として機能する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＧＡＢＡ_Ａ
サブユニットの新規なクラスを発見した。この新規なＧ
ＡＢＡ_Ａサブユニットは他のＧＡＢＡ_Ａサブユニットの
クラスのように同様のさらなる薬理学的な事象を担って
いてよい。本発明の一態様により、ＧＡＢＡ_Ａレセプタ
ーイプシロンサブユニットである新規成熟ポリペプチド
ならびに生物学的に活性で、診断学的にまたは治療学的
に有用であるその断片、類似体および誘導体を提供す
る。本発明のポリペプチドはヒト起源のものである。

【０００７】本発明の別の態様により、このようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を提供する。本発明のさらなる別の態様によ
り、組換え技術によりこのようなポリペプチドを製造す
るための方法を提供する。本発明のさらなる別の態様に
より、このようなＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブ
ユニットに対するアゴニストおよび例えば、不安、ハン
チントン舞踏病および睡眠および発作障害などの診断お
よび治療する目的のため、このようなアゴニストを利用
する方法を提供する。

【０００８】本発明のさらなる別の態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のさ
らなる別の態様により、例えばアルツハイマー病、パー
キンソン病、ベンゾジアゼピン薬剤の過剰投与および他
の神経障害の治療におけるこのようなポリペプチドの作
用を抑制することおよび記憶を増強することに使用され
てよい、このようなポリペプチドのアンタゴニストを提
供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明
細書中の教示から当業者には明らかであろう。

【０００９】本発明の一態様により、図１〜図３の推定
アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたはＡＴＣＣ
寄託、１９９４年６月１０日、第７５８１０号に寄託さ
れたクローンのｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリ
ペプチドをコードする単離した核酸（ポリヌクレオチ
ド）を提供する。本発明のポリヌクレオチドは膵臓腫瘍
から得られたｃＤＮＡライブラリーにおいて発見され
た。それは構造的にＧＡＢＡ_Ａサブユニットレセプター
ファミリーに関連する。該ポリヌクレオチドは約４４０
アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーデ
ィングフレームを含み、該アミノ酸残基のうちほぼ最初
の２４アミノ酸残基が推定リーダー配列であり、それゆ
え成熟タンパク質は４１６アミノ酸を含む。該タンパク
質は４００アミノ酸長にわたってラットＧＡＢＡ_Ａレセ
プターβ−１サブユニットと５０％の同一性および７０
％の類似性という高い程度のホモロジーを示す。

【００１０】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡまた
はＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを
含む）の形態であってよい。該ＤＮＡは二本鎖または一
本鎖であってよく、また一本鎖であるならば、コーディ
ング鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であっ
てよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配
列は図１〜図３に示すコーディング配列または、寄託さ
れたクローンのコーディング配列に一致していてよい
し、または遺伝コードの重複（redundancy）または縮重
の結果、図１〜図３のＤＮＡまたは寄託されたｃＤＮＡ
と同じ成熟ポリペプチドをコードする別のコーディング
配列であってよい。

【００１１】図１〜図３の成熟ポリペプチドまたは寄託
されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドは以下のものを含んでいて
よい：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟
ポリペプチドのコーディング配列、および、リーダー配
列または分泌配列などの別のコーディング配列；成熟ポ
リペプチドのコーディング配列（および任意に別のコー
ディング配列）、および成熟ポリペプチドのコーディン
グ配列のイントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列の５'および／または３'非コーディング配列な
どの非コーディング配列。従って、「ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド」という語には、該ポリペプ
チドのコーディング配列のみが含まれるポリヌクレオチ
ド、さらにまた、別のコーディングおよび／または非コ
ーデイング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００１２】本発明はさらに、図１〜図３の推定アミノ
酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローン
のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの断片、類
似体および誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチ
ドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、該
ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体ま
たは該ポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体で
あってよい。従って、本発明は、図１〜図３に示すのと
同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤ
ＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレ
オチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、図１〜図
３のポリペプチドまたは寄託されたクローンのｃＤＮＡ
によってコードされるポリヌクレオチドの断片、誘導
体、または類似体をコードする。そのようなヌクレオチ
ド変異体には欠失変異体、置換変異体および付加または
挿入変異体が含まれる。

【００１３】先に示したように、該ポリヌクレオチドは
図１〜図３に示すコーディング配列の天然に存在する対
立遺伝子変異体または寄託されたクローンのコーディン
グ配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコーデ
ィング配列を有してよい。当該技術分野において公知の
ように、対立遺伝子変異体は１またはそれ以上のヌクレ
オチドの置換、欠失または付加（実質的にはコードする
ポリペプチドの機能を変えない）を有してよい別の形の
ポリヌクレオチド配列である。

【００１４】本発明はまた、成熟ポリペプチドのコーデ
ィング配列が、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を
制御する分泌配列として機能する、リーダー配列などの
宿主からのポリペプチドの発現および分泌を援助するポ
リペプチド配列と同じリーディングフレーム内で融合さ
れてもよい、ポリペプチドも含む。リーダー配列を有す
るポリペプチドはプレタンパク質であり、宿主細胞によ
ってポリペプチドの成熟形態を形成するため開裂されて
もよい。

【００１５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合したコーディング配列を有してもよい。
該マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融
合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、ｐＱ
Ｅ−９ベクターによって与えられるヘキサ−ヒスチジン
タグであってよく、または例えば、哺乳動物宿主（例え
ば，ＣＯＳ−７細胞）を使用する場合には、マーカー配
列は、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであってよい。該ＨＡ
タグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質より得ら
れるエピトープに対応する（ウィルソン（Wilson, I.）
ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４））。

【００１６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは少なくとも７０％の同一性がある場
合に、本明細書に記載の上記の配列にハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリン
ジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用す
る場合、「ストリンジェント条件」という語は、配列間
に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％
の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが
起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１〜図３のｃＤＮＡまたは寄託されたｃＤ
ＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学
的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドを
コードする。

【００１７】本明細書で使用する寄託は、特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約
定の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当
業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３
５ Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認する
ものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、さらにまた、それによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際
は、いつでも照合している。寄託された物質を製造し、
使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得
て、またそのような実施許諾は、ここでは付与されな
い。

【００１８】本発明はさらに、図１〜図３の推定アミノ
酸配列を有する、または寄託されたｃＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するＧＡＢＡ_Ａイプシロンサ
ブユニットポリペプチド、さらにはまた、そのようなポ
リペプチドの断片、類似体および誘導体に関する。図１
〜図３のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡにより
コードされるポリペプチドに言及する場合、「断片」、
「誘導体」および「類似体」という語は、そのようなポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保
有するポリペプチドを意味する。従って、類似体には、
プロタンパク質部分を切断することにより活性化して、
活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロタ
ンパク質が含まれる。

【００１９】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっ
てよいが、組換えポリペプチドが好ましい。図１〜図３
のポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、
（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存または
非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）
で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が
遺伝コードによりコードされるものであってもよく、ま
たはコードされたものでなくてもよいもの、または（i
i）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含ま
れるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリ
ペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエ
チレングリコール）のような他の化合物と融合している
もの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または
成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロ
タンパク質配列といったような、付加的アミノ酸が成熟
ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのよう
な断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から
当業者の範囲内であると思われる。

【００２０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。「単離された」と
いう語は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に
存在するなら、天然の環境）から除去されていることを
意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在す
るポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
ないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全
てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは
ベクターの一部であってよく、および／またはそのよう
なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部
であってよく、それでいて、そのようなベクターまたは
組成物はその天然の環境の一部ではないという点で、な
お単離されている。

【００２１】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明
のベクターで遺伝的に操作される（形質導入、または形
質転換、またはトランスフェクションされる）。該ベク
ターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ
等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモータ
ーを活性化し、形質転換体を選択し、またはＧＡＢＡ_Ａ
イプシロンサブユニット遺伝子を増幅するのに適するよ
う改変された通常の栄養培地で培養することができる。
温度、ｐＨ等といったような培養条件は、発現用に選択
された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業
者に明らかであろう。

【００２２】本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドを組換え技術により製造するのに使用することができ
る。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプ
チドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１
つに含ませることができる。そのようなベクターには、
染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮ
Ａ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；
ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；
プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから得られ
るベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、偽狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれ
る。しかしながら、他のいずれのベクターも、それが宿
主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用す
ることができる。

【００２３】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当該技術分野で公知の方法により適当な制限エンドヌク
レアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方
法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクター
中のＤＮＡ配列を、適当な発現調節配列（プロモータ
ー）に作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を行わせる。
そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが
挙げられる；ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸
菌（Ｅ．coli）、lac、またはtrp、ファージラムダＰ_Ｌ
プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれ
らのウイルスでの遺伝子の発現を調節することが知られ
ている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開
始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネータ
ーも含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当
な配列も含み得る。

【００２４】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン
耐性といったようなまたは、大腸菌ではテトラサイクリ
ンまたはアンピシリン耐性といったような、形質転換さ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるための
１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む
のが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらに
はまた、適当なプロモーターまたは調節配列を含むベク
ターを、適当な宿主を形質転換するために使用して、そ
の宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることがで
きる。

【００２５】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：大腸菌、ストレプトマイセス（Streptomyc
es）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typ
himurium）といったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ドロソフィラ（Drosophila）およびＳｆ９といっ
たような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノ
ーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主
の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内である
と思われる。

【００２６】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。そのような構築物は、本発明の配列が順方
向または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウ
イルスベクターといったようなベクターを含む。この実
施態様の好ましい側面では、該構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に連結したプロモーターなどの調
節配列を含む。適当なベクターおよびプロモーターが多
数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベ
クターを例として挙げる。細菌用；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ
６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Qiagen））、ｐｂｓ、ｐ
Ｄ１０、phagescript、ｐｓｉＸ１７４、pbluescript
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Stratagen
e)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、p
ＤＲ５４０、pＲＩＴ５（ファルマシア（Pharmaci
a）)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ（ストラタジーン)、pＳＶＫ
３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ（ファルマシア)。しか
しながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、
それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限
り、使用することができる。

【００２７】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ前初期(immediate e
arly)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ
４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメ
タロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよび
プロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内
である。

【００２８】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、哺
乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような下
等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞の
ような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入
は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレク
トロポレーションにより行うことができる（デイビス
（Davis, Ｌ.）、ディブナー（Dibner, Ｍ.）バッテイ
（Battey, Ｌ.）、ベーシック・メソッズ・イン・モレ
キュラー・バイオロジー（Basic Methods in Molecular
Biology）（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常
の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝
子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明
のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成
的に製造することができる。

【００２９】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
調節下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、サンブルック（Sambrook）
ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Ma
nual）、 第２版、コールド・スプリング・ハーバー（C
old Spring Harbor）、ニューヨーク、（１９８９）に
記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成す
る。

【００３０】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増大する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用性配列であ
る。例には、１００〜２７０ｂｐの、複製開始点の後期
側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス
初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側に
あるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエ
ンハンサーが含まれる。

【００３１】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマ
ーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子なら
びにサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）Ｔ
ＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を行わせる
ために高度に発現される遺伝子から得られるプロモータ
ーが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、と
りわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）の
ような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、また
は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得る
ことができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始およ
び終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の
細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることが
できるリーダー配列と共に、適当な相（phase）で集合
する。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特
性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精
製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融
合タンパク質をコードすることができる。

【００３２】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
作動可能なリーディング相にある適当な翻訳開始および
終結シグナルと機能的なプロモーターと共に挿入するこ
とにより構築される。そのようなベクターは、ベクター
の維持を確実なものとするために、また所望により、宿
主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表
現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含むであ
ろう。形質転換に適当な原核宿主には、大腸菌、バシラ
ス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・テ
ィフィムリウム、およびシュードモナス（Pseudomona
s）属、ストレプロマイセス属、ならびにスタフィロコ
ッカス（Staphylococcus）属の範囲内の様々な種が含ま
れるが、他のものもまた選択可能である。

【００３３】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用な発現ベクターは、周知のクロー
ニングベクター ｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の
遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、
選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでい
てよい。そのような市販のベクターには、例えば、pＫ
Ｋ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
（Pharmacia Fine Chemicals）、ウプサラ、スウェーデ
ン）およびＧＥＭ１(プロメガ・バイオテク（Promega B
iotec）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含ま
れる。これらのpＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロ
モーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせ
る。

【００３４】適当な宿主株を形質転換して、その宿主株
を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロ
モーターを適当な方法（例えば、温度シフトまたは化学
誘導）により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。
細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的ま
たは化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製
の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の
発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、
超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含
むいずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法
は、当業者に周知である。

【００３５】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、グルズマン（Gluzman）、Cel
l、２３：１７５（１９８１）により記載されている、
サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能
なベクターを発現させることができる他の細胞系、例え
ば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ
細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始
点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいず
れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含むで
あろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ
配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とさ
れる非転写遺伝要素を与えることができる。

【００３６】ＧＡＢＡ_Ａイプシロンサブユニットポリペ
プチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸
抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、
およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法によ
り、組換え細胞培養物から回収して、精製することがで
きる。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タ
ンパク質の立体配置を完成するのに使用することができ
る。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を最終精製工程に使用することができる。

【００３７】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て）組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００３８】本発明のＧＡＢＡ_Ａイプシロンサブユニッ
トポリペプチドは、ＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユ
ニットを同定するのにも使用する。これらのサブユニッ
トの同定のための手法の例には、独特の、細菌により発
現されたＧＡＢＡ_Ａイプシロンポリペプチドに対する高
力価ポリクローナル抗血清を産生させることを含む。つ
いでこれらのポリクローナル抗血清を哺乳動物脳好まし
くはラット脳からの洗剤可溶化ＧＡＢＡ_Ａレセプターを
免疫沈降するのに使用される。また、好ましくは脳の海
馬部位が使用される。

【００３９】ＧＡＢＡ_Ａイプシロンポリペプチドはま
た、レセプター機能のリガンド／モジュレーターをスク
リーニングするために使用されてよい。このスクリーニ
ングはＧＡＢＡ_Ａイプシロンサブユニットレセプターの
アゴニストおよびアンタゴニストを同定するのに特に有
用である。このようなアッセイの例は、パッチクランプ
アッセイである。ＧＡＢＡ_Ａイプシロンサブユニットを
コードするＤＮＡをＨＥＫ ２９３細胞に挿入する。該
ＤＮＡ配列は発現カセット、好ましくは発現プラスミド
に挿入される。本明細書で使用する「発現カセット」と
は、真核細胞におけるコーディング配列の発現に必要な
ＤＮＡ配列をいう。プラスミドの例は、市販されており
好ましいｐＣＤＭ８である。

【００４０】選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミ
ドをＧＡＢＡ_ＡイプシロンサブユニットをコードするＤ
ＮＡ配列を含むプラスミドとともにコトランスフェクシ
ョンしてよい。ＧＡＢＡ_ＡレセプターはＧＡＢＡの結合
により、細胞内へ塩素イオンを通過させることができる
ゲート化されたチャンネルである。ＧＡＢＡ_Ａレセプタ
ーはＧＡＢＡにチャンネルを開かせることができ、テス
トされる分子がアゴニストなら細胞に一層多くの塩素イ
オンを入れ、またはテストされる分子がアンタゴニスト
なら細胞に塩素イオンを少なくさせるであろう。ＧＡＢ
Ａ_Ａレセプターイプシロンサブユニットを通過する塩素
イオンの量はパッチクランプアッセイを使用して直接測
定できる。該アッセイは細胞の表面上に埋められた電極
の内外の電荷の流れを測定する。細胞内へ入る塩素イオ
ンの流れは、ゲートが開くと細胞内の電気的平衡を維持
するために細胞をそのままにさせる電流の関数として測
定される。該パッチアッセイはハミル（Hammill，O.
P.)ら、インプルーブド・パッチ・クランプ・テクニッ
クス・フォー・ハイ・レゾリューション・カレント・レ
コーディング・フロム・セルズ・アンド・セルフリー・
メンブレン・パッチズ（Improved Patch Clamp Techniq
ues for High Resolution Current Recordingfrom Cell
s and Cell-Free Membrane Patches）、Pfluegers Arc
h.、３９１：８５−１００（１９８１）に詳細に記載さ
れている。

【００４１】パッチクランプアッセイを使用して、化合
物が有する安定な細胞株に組み入れられるレセプターへ
の効果を決定することができる。ホールセル（whole ce
ll）パッチクランプアッセイの感度の範囲は、約１００
０ｐＡであり、２から５ｐＡの間の電流を区別すること
ができる。本発明はさらに、ＧＡＢＡとＧＡＢＡ_Ａレセ
プターイプシロンサブユニットの相互作用を増強または
阻害するものを同定するための薬剤のスクリーニング法
を提供する。１例として、機能的なＧＡＢＡ_Ａレセプタ
ーイプシロンサブユニットをコードするＤＮＡはアフリ
カツメガエルの卵母細胞において発現する。発現はクロ
ーニングされたｃＤＮＡがサイトメガロウイルスプロモ
ーターの転写制御下にある組換えＣＤＭ８ベクターの核
注入によりなされる。ついで、ＧＡＢＡ_Ａレセプターは
卵母細胞の外側表面に発現し、該卵母細胞をＧＡＢＡお
よび潜在的な薬剤と結合させる適切な条件下でインキュ
ベートする。ついで、ＧＡＢＡとＧＡＢＡ_Ａレセプター
イプシロンサブユニットの相互作用は薬剤の存在下で測
定され、もし該薬剤がこの相互作用に影響を及ぼすなら
ば決定ができるであろう。

【００４２】潜在的なアンタゴニストには、抗体または
場合によってはＧＡＢＡへの接近を阻害するＧＡＢＡ_Ａ
レセプターイプシロンサブユニットに結合するオリゴヌ
クレオチドを含む。アンタゴニストはＧＡＢＡ_Ａイプシ
ロンサブユニットを認識し結合するＧＡＢＡの密接関連
タンパク質であってもよいが、ＧＡＢＡの不活性化形態
であり、ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニット
を効果的に阻害する。

【００４３】潜在的なアンタゴニストはまた、アンチセ
ンス構築物をも含む。アンチセンス技術は三重螺旋形成
またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（その両者の方
法はポリヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡに結合させ
ること基礎としている）によって遺伝子発現を制御する
のに使用されることができる。例えば、該ポリヌクレオ
チド配列の５'コーディング部位（本発明の成熟ポリペ
プチドをコードする）は長さが約１０から４０塩基対の
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに
使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与す
る遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺
旋−リー（Lee）ら、Nucl．Acids Res.、６：３０７３
（１９７９）；クーニー（Cooney）ら、Science、２４
１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Dervan）
ら、Science、２５１：１３６０（１９９１）参照）、
それによってＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニ
ットポリペプチドの転写および産生を妨害する。

【００４４】アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは
イン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分
子のＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニットポリ
ペプチドへの翻訳を阻害する（アンチセンス−オカノ
（Okano）、J. Neurochem．５６：５６０（１９９
１）；オリゴデオキシヌクレオチド・アズ・アンチセン
ス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッショ
ン（Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors o
f Gene Expression）、ＣＲＣプレス（CRC Press)、ボ
カ・レイトン、フロリダ（１９８８））。上記に記載の
オリゴヌクレオチドはまたアンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡがイン・ビボでＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサ
ブユニットポリペプチドの産生を阻害するために発現さ
れるように細胞に運搬されることができる。

【００４５】上記で同定されたアゴニストおよびアンタ
ゴニストは治療剤として使用されてよい。アゴニストは
ＧＡＢＡ_ＡレセプターでＧＡＢＡの効果をまねして使用
され、それゆえ抑制性の効果を増大する。それゆえ、こ
れらのアゴニストは不安、ハンチントン舞踏病、筋攣縮
および硬直、および睡眠および発作障害に有用である。
アンタゴニストはレセプターによって媒体された抑制を
阻害し、それゆえ神経発火を増大させ、それゆえアルツ
ハイマー病、パーキンソン病およびベンゾジアゼピンの
過剰投与に有用である。アンタゴニストはまた、認識を
増強するおよび外科手術の間の全身麻酔の適応後鎮静作
用を解くのに使用されてよい。

【００４６】本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト
は、適当な製薬学的担体と組み合わせて使用することが
できる。そのような組成物は、治療上有効な量のアゴニ
ストまたはアンタゴニスト、および製薬学上許容され得
る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体に
は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩
衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エ
タノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。その
製剤は、投与方法に適合すべきである。

【００４７】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器には、製薬学的または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府当局により規定
された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒトへの
投与のための製造、使用または販売の、該当局による承
認を表わす。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治
療化合物と共に使用することができる。

【００４８】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、てんかんを特に治療するための肛門内を含む便利
な方法で投与することができる。製薬学的な組成物は、
特定の徴候を治療および／または予防するのに有効な量
で投与される。患者に投与された該組成物の量および一
回投与療法は投与形式、処置される条件の実質および処
方する内科医の判断などの複数の要因に依存するであろ
う。一般に、該組成物は、１日当たり少なくとも約１０
μｇ／ｋｇ（体重）の量で投与され、たいていの場合、
約８ｍｇ／ｋｇ（体重）を超えない量で投与されるであ
ろう。たいていの場合、投与経路および症状等を考慮に
入れて、投与量は、毎日約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／
ｋｇ（体重）である。

【００４９】該ポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子
治療」と呼ばれる、そのようなポリペプチドのイン・ビ
ボにおける発現により、本発明に従って使用してよい。
従って、例えば、患者由来の細胞を、エクス・ビボ（ex
vivo）においてポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細
胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような
方法は、当該技術分野で公知である。例えば、本発明の
ポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス
粒子の使用によって、細胞を当該技術分野で公知の方法
により操作することができる。

【００５０】同様に、例えば、当該技術分野で既知の方
法により、ポリペプチドのイン・ビボにおける発現のた
めに、細胞をイン・ビボにおいて操作することができ
る。当該技術分野において知られているように、細胞を
イン・ビボにおいて処理してポリペプチドをイン・ビボ
において発現させるために、本発明のポリペプチドをコ
ードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するた
めのプロデューサー細胞を患者に投与することができ
る。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作す
るための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、
例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞を
イン・ビボにおいて操作するために使用することができ
るアデノウイルスであってもよい。

【００５１】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。該配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対
して特異的に標的化して、ハイブリダイズさせることが
できる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定
する必要がある。実際の配列データ（反復多型性）に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を疾患関
連遺伝子と関係づける重要な第一段階である。

【００５２】簡単に言えば、ｃＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー（好ましくは、１５〜２５bp）を調製することに
より、配列を染色体にマップすることができる。該遺伝
子の３'非翻訳領域のコンピューター分析を使用して、
ゲノムＤＮＡ中の１を越えるエクソンにまたがらないプ
ライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑な
ものとする。ついで、これらのプライマーを、個々のヒ
ト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニ
ングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含
むハイブリッドのみが、増幅された断片を与えるであろ
う。

【００５３】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来の断片のパネルを用いる類似の方法で達成するこ
とができる。その染色体へマッピングするのに同様に利
用することができる他のマッピング方法には、イン・サ
イチュ（in situ）ハイブリダイゼーション、標識化フ
ロー−ソーティッド（flow−sorted）染色体を用いての
プレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライ
ブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによ
るプレセレクションが含まれる。

【００５４】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
（spread）への蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーシ
ョン（ＦＩＳＨ）を利用して、正確な染色体位置を一工
程で与えることができる。この技術は、わずか５００ま
たは６００塩基の短いｃＤＮＡで利用することができ
る；しかしながら、２,０００ｂｐより大きいクローン
は、簡単な検出に関して十分なシグナル強度を有する独
特の染色体の位置に結合しやすい。ＦＩＳＨは、ＥＳＴ
が由来するクローンの使用を必要とし、長ければ長いほ
ど良い。例えば、２,０００ｂｐは良く、４,０００は一
層良く、および４,０００以上がおそらく時間の合理的
なパーセントの良い結果である。この技術の概説には、
ベルマ（Verma）ら、ヒューマン・クロモソームズ（Hum
an Chromosomes）：ア・マニュアル・オブ・ベーシック
・テクニクス（a Manual of BasicTechniques）、パガ
モン・プレス（Pergamon Press）、ニューヨーク（１９
８８）を参照。

【００５５】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、マックジック（V. McKusick）、メンデリアン
・インヘリタンス・イン・マン（Mendelian Inheritanc
e in Man）(ジョーンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
ー・ウェルチ・メディカル・ライブラリー（Johns Hopk
ins University WelchMedical Library）を介してオン
ラインで利用できる）に見出される。ついで、同じ染色
体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を
連鎖分析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinherit
ance)）によって確認する。

【００５６】次に、罹患した個体と罹患していない個体
との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必
要がある。変異が、罹患した個体のいくつかまたは全て
において認められるが、いずれの正常な個体においても
認められないなら、その変異は疾患の原因となるもので
あるらしい。現在の物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピング技術の解析から、疾患と関連する染色体領域に正
確に局在化したｃＤＮＡは、５０〜５００の原因となり
得る遺伝子の１つとなり得るであろう（これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０ｋｂ当り１つの遺伝
子を仮定する）。

【００５７】ポリペプチド、それらの断片もしくは他の
誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発
現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗
体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さ
らにはまた、Fabフラグメント、またはFab発現ライブラ
リーの生成物も含まれる。当該技術分野で公知の様々な
方法を、そのような抗体および断片の製造に使用するこ
とができる。

【００５８】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。ついで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドの断片のみをコードする配列さえも、完全な天
然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用す
ることができる。ついで、そのような抗体は、そのポリ
ペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するた
めに使用できる。

【００５９】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ法
（コーラー（Kohler）およびミルシュタイン（Milstei
n）、１９７５、Nature、２５６:４９５−４９７)、ト
リオーマ(trioma)法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(コ
ズボール（Kozbor）ら、１９８３、Immunology Today
４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造する
ためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法(コール（Cole）ら、
１９８５、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド
・キャンサー・セラピー（Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy）、アラン・アール・リス、インク（Al
an R. Liss, Inc.）、７７−９６頁において）が含まれ
る。

【００６０】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術（米国特許第４,９４６,７７８号）は、本発明の免疫
原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するの
に適合し得る。本発明をさらに、以下の実施例に関して
記載する；しかしながら、本発明は、そのような実施例
に限定されないことを理解すべきである。部または量は
全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の
実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出て
くる方法および／または用語を記載する。

【００６１】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されている
か、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当該技術分野で公知であって、当業者に明らか
であろう。

【００６２】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒開裂することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、典型的に、緩衝溶液約２０μｌ中、１μｇのプラス
ミドまたはＤＮＡ断片を約２単位の酵素と共に使用す
る。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片を単離する目的
には、より多量の容積中、典型的にＤＮＡ５〜５０μｇ
を２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素
に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定され
ている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることが
できる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲル
で直接電気泳動して、所望の断片を単離する。

【００６３】開裂した断片のサイズ分離は、ゲッデル
（Goeddel, D）ら、Nucleic Acids Res.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルア
ミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化
学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌク
レオチド、または２つの相補的ポリデオキシヌクレオチ
ド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'
リン酸を有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰ
とともにリン酸を加えることなしには、別のオリゴヌク
レオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌク
レオチドは、脱リン酸化されていない断片にライゲーシ
ョンするであろう。

【００６４】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
断片の間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう
（マニアチス（Maniatis,Ｔ.）ら、同上、１４６頁）。
特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲート
させるべきＤＮＡ断片のほぼ等モル量の０.５μg当り１
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。特にことわらない限り、形質転換は、グラハム（Gr
aham, F.）およびファン・デル・エブ（van der Eb,
A.）、Virology、５２：４５６−４５７（１９７３）の
方法に記載されているようにして行った。

【００６５】

【実施例】実施例１ ＨＥＫ２９３細胞における組換えＧＡＢＡ_Ａレセプター
イプシロンサブユニット の発現 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニットをコード
するｃＤＮＡの断片をその遺伝子の転写を駆りたてるた
めＣＭＶ前初期プロモーターを使用してベクターにクロ
ーニングした。そのベクターｐＣＤＭ８はインビトロゲ
ン・コーポレーション（Invitrogen Corporation）、サ
ンディエゴ、カリフォルニア、９２１２１により入手で
きる。まず、HindIIIおよびXbaI（平滑化）でプラスミ
ドを消化し、そのプラスミドのそれらの部位にｃＤＮＡ
をライゲーションすることによってそのｃＤＮＡ断片を
プラスミドに挿入する。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶
解法（マニアチス（Maniatis, T.）フリッチュ（E. F.
Fritsch）およびサンブルック、１９８９、モレキュラ
ークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド
・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）の後、２サイ
クルのＣsＣl平衡密度勾配遠心分離によって調製した。

【００６６】ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクション
する（ＨeＬa細胞もまたトランスフェクションされてよ
い）のに使用したトランスフェクションプロトコールは
チェン（Chen，C.）およびオカヤマ（H, Okayama）、１
９８７から改変した。プラスミドＤＮＡによる哺乳動物
細胞の高効率の形質転換。Mol. Cell. Biol. ７：２７
４５−２７５２（チャン（Chan）−オカヤマ ＣaＰ
Ｏ_４、ｐＨ ６.９５法）。２.５Ｍ ＣaＣl_２（マリンク
ロット（Mallinckrodt））のストック溶液を調製し、
０.４５μｍポアサイズ（pore-size）ニトロセルロース
フィルター（ナルジ（Nalge））を通して濾過滅菌しつ
いで−２０℃で保存した。ついで５０ｍＭ Bes（ｐＨ
６.９５）、２８０ｍＭ ＮaＣlおよび１.５ｍＭ Ｎa_２
ＨＰＯ_４を含む２×Bes緩衝食塩水（２×ＢＢＳ）を調
製し、濾過滅菌しついで−２０℃で保存した。Ｎ,Ｎ−
ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエトラン−
スルホン酸（ＢＥＳ）をシグマ（Sigma）より得た。そ
のｐＨを室温でＨＣlで合わせた。ＨＥＫ２９３細胞
（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）、ＣＲＬ １５７
３）を５％ＣＯ_２中、３７℃でフォルマ・サイエンティ
フィック・インキュベーター（Forma Scientific Incub
ator）で１０％ウシ胎児血清（ギブコ（Gibco）、ペニ
シリン−ストレプトマイシン（ギブコ）およびグルタミ
ン（ギブコ）を補ったＭＥＭ（ギブコ）で維持した。

【００６７】指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３細
胞をトリプシン−ＥＤＴＡで除去し、１０ｃｍのプレー
ト１枚当たりに１.５×１０^６の密度でプレーティング
し、ついで増殖培地１０ｍｌ中で５％ＣＯ_２、３７℃で
一晩インキュベートした。選択の目的のため、チミジン
キナーゼプロモーターによって駆り立てられるアミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）を含むｐ
ＷＬ０Ｎｅｏ（ストラタジーン（Stratagene））を１×
１０^６細胞を含む１０ｃｍ皿１枚当たりに使用した。プ
ラスミドＤＮＡを５０mu lの２.５Ｍ ＣaＣl_２と混合し
および最終容量が０.５ｍｌとなるよう水を加えた。こ
の混合物に０.５ｍｌの２×ＢＢＳを添加しついで室温
で９０秒インキュベートした。この得られたリン酸カル
シウムＤＮＡ溶液を細胞のプレートに添加（１ｍｌの容
量）し、穏やかに混ぜ、ついで３％ＣＯ_２の下、１５−
２４時間３７℃でインキュベートした。その培地を除去
し、細胞をＭＥＭ培地で２度リンスし、ついで１０％ウ
シ胎児血清を加えた新しいＭＥＭでリンスした。該細胞
を５％ＣＯ_２の下４８時間３７℃でインキュベートし
た。

【００６８】トランスフェクションの４８時間後、その
細胞をトリプシン処理し、ついで４つのプレートに分割
（１：８）した。それらを１ｍｇ／ｍｌで、１ｍｇ／ｍ
ｌのＧ４１８硫酸塩（ギブコ）を含む増殖培地の選択的
な圧力の下でコロニーが現れるまで２週間増殖させた。
安定な形質転換体の選択には約１５−２０日を要した。
コロニーを２４ウエル皿に分離し、２枚の１０ｃｍ皿に
播種するためＧ４１８選択培地中で十分増殖させたのち
使用した。１０ｃｍ皿中での十分な増殖の後、１つを総
ＲＮＡを調製するために使用した；残った皿における細
胞を将来のプレーティングのために凍結保存した。その
ＲＮＡをノーザンブロットによって分析した。

【００６９】安定な形質転換の頻度を決定するために、
細胞を記載したようにトランスフェクションした。細胞
を分割し、選択的な圧力下（Ｇ４１８硫酸塩）でプレー
ティングした時点で、細胞を２複写にて１０ｃｍプレー
ト１枚当たり１〜３×１０^６細胞の密度でプレーティン
グした。プレートの１組を非選択的な増殖培地中で維持
し、一方で２つ目のプレートはＧ４１８硫酸塩（ｍｇ／
ｍｌ）を有する増殖培地中で増殖させた。コントロール
プレートを非選択培地中で５〜７日間維持した；ついで
コロニーを染色し数えた。Ｎｅｏ^＋形質転換体の数を決
定するために選択的な圧力下で２−３週間維持した；つ
いでコロニーを染色し数えた。その形質転換効率を形質
転換％として表わす。これは非選択培地中で増殖したコ
ロニーの数によってＮｅｏ^ｒの数を除し、その結果を１
００倍することによって決定したものである。

【００７０】トランスフェクションしたプラスミドから
のクローンを機能的なチャンネルの発現に関して試験し
た。これらの試験を細胞全体のパッチクランプ電気生理
学によって行った。パッチクランプ法のホールセルコン
フィギュレーション（whole-cell configuration）をＧ
ＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニットでトランス
フェクションしたヒト胎児腎臓細胞におけるＧＡＢＡ媒
体Ｃｌ流を記録することに使用した。パッチピペットを
０.５〜２メガオームの抵抗を有するホウ珪酸ガラスで
作成した。その細胞を（mＭ）ＮaＣｌ １３５、ＫＣｌ
５、ＭｇＣｌ_２１.８およびHepes ５、ｐＨ７.２を含む
緩衝培体中に入れた。そのピペットを（ｍＭ）ＣｓＣｌ
１４０、ＥＤＴＡ １１、ＡＴＰ ２、ＭｇＣｌ_２ ４お
よびHepes １０、ｐＨ７.３を含む緩衝培体中に入れ
た。維持電位は−６０ｍＶであった。試験薬剤を有する
かまたは有さない５μＭ ＧＡＢＡ_Ａを含むベージング
溶液（bathing solution）を細胞から約１００ミクロン
離れた位置のＵ管を通して細胞に添加した。

【００７１】実施例２ ヒト組織におけるＧＡＢＡ_Ａイプシロンの発現パターン ヒト組織におけるＧＡＢＡ_Ａイプシロンの発現のレベル
を調べるためノーザンブロット分析を行った。総細胞Ｒ
ＮＡサンプルをＲＮＡｚｏｌ^ＴＭＢシステム（バイオテ
ックス・ラボラトリーズ・インク（Biotecx Laboratori
es，Inc.）６０２３ サウス・ループ・イースト、ヒュ
ーストン、テキサス７７０３３）で単離した。特定の各
ヒト組織から単離した総ＲＮＡの約１０μｇを１％アガ
ロースゲル上で分離し、ナイロンフィルターにブロット
した（サンブルック、フリッチュおよびマニアチス、モ
レキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュ
アル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（１９
８９））。その標識反応は、５０ｎgのＤＮＡ断片とと
もにストラタジーンプライム−イット キットに従って
行った。標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラムで
精製した（５ プライム−３ プライム、インク、５６０
３ アラパホ・ロード、ブルダー、コロラド ８０３０
３）。ついで、フィルターを放射性標識したＧＡＢＡ_Ａ
イプシロン遺伝子の全長と０.５Ｍ ＮａＰＯ_４、ｐＨ
７.４および７％ ＳＤＳ中で１,０００,０００ｃｐｍ／
ｍｌで６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。室温で２回
洗浄した後、６０℃で０.５×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳ
で２回洗浄し、ついでフィルターを増感紙で−７０℃で
一晩露光させた。

【００７２】実施例３ ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニットのバキュ
ロウイルス発現 ＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットの発現に関す
る一般的な方法は以前に記載されている（カーター（Ca
rter，D. B.)、ら、Bio／Technology、１０：６７９−
６８１（１９９２））。本実施例では、ＳＦ−９細胞
（約１０^６細胞）に該イプシロンサブユニットを発現す
るバキュロウイルス構築物（１０^８ｐｆｕ）を感染させ
る。細胞はまた、該イプシロンサブユニットを発現する
バキュロウイルス構築物および他の公知のＧＡＢＡ_Ａレ
セプターサブユニットを発現するバキュロウイルス構築
物の組合せに共感染されてよい。該感染したＳＦ−９細
胞を６０時間後に回収する。該細胞を電気生理学的記録
（実施例１参照）または放射性リガンド結合アッセイに
使用する。後者に関しては、細胞を１１８ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Tris、ｐＨ
７.３を含む溶液中でポリトロン（Polytron）ホモジナ
イザーによって破壊する。破壊されなかった細胞および
核集合物を１０００ｇで１０分間遠心して除去する。つ
いで細胞膜を、その上清を４００００ｇで５０分間遠心
することによって回収する。そのペレットを３００ｍＭ
スクロース、５ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７.５および２
０％グリセロールを含む溶液中に再懸濁する。その膜を
放射性リガンド結合アッセイに使用するまで−８０℃で
凍結する。先の教示から見て、本発明の多数の変更およ
び変化が可能であることから、追記する請求の範囲内
で、詳しく記載した以外に、本発明を行うことができ
る。

【００７３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> GABAA Receptor Epsilon Subunit <130> 179398 <160> 2 <210> 1 <211> 1650 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 GGGACAGGGC TGAGGATGAG GAGAACCCTG GGGACCCAGA AGACCGTGCC TTGCCCGGAA 60 GTCCTGCCTG TAGGCCTGSS GGACTTGCCC TAACAGAGCC TCAACAACTA CCTGGTGATT 120 CCTACTTCAG CCCCTTGGTG TGAGCAGCTT CTCAACATGA ACTACAGCCT CCACTTGGCC 180 TTCGTGTGTC TGAGTCTCTT CACTGAGAGG ATGTGCATCC AGGGGAGTCA GTTCAACGTC 240 GAGGTCGGCA GAAGTGACAA GCTTTCCCTG CCTGGCTTTG AGAACCTCAC AGCAGGATAT 300 AACAAATTTC TCAGGCCCAA TTTTGGTGGA GAACCCGTAC AGATAGCGCT GACTCTGGAC 360 ATTGCAAGTA TCTCTAGCAT TTCAGAGAGT AACATGGACT ACACAGCCAC CATATACCTC 420 CGACAGCGCT GGATGGACCA GCGGCTGGTG TTTGAAGGCA ACAAGAGCTT CACTCTGGAT 480 GCCCGCCTCG TGGAGTTCCT CTGGGTGCCA GATACTTACA TTGTGGAGTC CAAGAAGTCC 540 TTCCTCCATG AAGTCACTGT GGGAAACAGG CTCATCCGCC TCTTCTCCAA TGGCACGGTC 600 CTGTATGCCC TCAGAATCAC GACAACTGTT GCATGTAACA TGGATCTGTC TAAATACCCC 660 ATGGACACAC AGACATGCAA GTTGCAGCTG GAAAGCTGGG GCTATGATGG AAATGATGTG 720 GAGTTCACCT GGCTGAGAGG GAACGACTCT GTGCGTGGAC TGGAACACCT GCGGCTTGCT 780 CAGTACACCA TAGAGCGGTA TTTCACCTTA GTCACCAGAT CGCAGCAGGA GACAGGAAAT 840 TACACTAGAT TGGTCTTACA GTTTGAGCTT CGGAGGAATG TTCTGTATTT CATTTTGGAA 900 ACCTACGTTC CTTCCACTTT CCTGGTGGTG TTGTCCTGGG TTCTGTATTT CATTTTGGAA 960 GATTCAGTCC CTGCAAGAAC CTGCATTGGA GTGACGACCG TGTTATCAAT GACCACACTG 1020 ATGATCGGGT CCCGCACTTC TCTTCCCAAC ACCAACTGCT TCATCAAGGC CATCGATGTG 1080 TACCTGGGGA TCTGCTTTAG CTTTGTGTTT GGGGCCTTGC TAGAATATGC AGTTGCTCAC 1140 TACAGTTCCT TACAGCAGAT GGCAGCCAAA GATAGGGGGA CAACAAAGGA AGTAGAAGAA 1200 GTCAGTATTA CTAATATCAT CAACAGCTCC ATCTCCAGCT TTAAACGGAA GATCAGCTTT 1260 GCCAGCATTG AAATTTCCAG CGACAACGTT GACTACAGTG ACTTGACAAT GAAAACCAGC 1320 GACAAGTTCA AGTTTGTCTT CCGAGAAAAG ATGGGCAGGA TTGTTGATTA TTTCACAATT 1380 CAAAACCCCA GTAATGTTGA TCACTATTCC AAACTACTGT TTCCTTTGAT TTTTAGTCTA 1440 GCCAATGTAT TTTACTGGGC ATACTACATG TATTTTTGAG TCAATGTTAA ATTTCTTGCA 1500 TGCCATAGGT CTTCAACAGG ACAAGATAAT GATGTAAATG GTATTTTAGG CCAAGTGTGC 1560 ACCCACATCC AATGGTGCTA CAAGTGACTG AAATAATATT TGAGTCTTTC TGCTCAAAGA 1620 ATGAAGCTCC AACCATTGTT CTAAGCTGTG 1650

【００７４】 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Asn Tyr Ser Leu His Leu Ala Phe Val Cys Leu Ser Leu Phe -20 -15 -10 Thr Glu Arg Met Cys Ile Gln Gly Ser Gln Phe Asn Val Glu Val -5 1 5 Gly Arg Ser Asp Lys Leu Ser Leu Pro Gly Phe Glu Asn Leu Thr 10 15 20 Ala Gly Tyr Asn Lys Phe Leu Arg Pro Asn Phe Gly Gly Glu Pro 25 30 35 Val Gln Ile Ala Leu Thr Leu Asp Ile Ala Ser Ile Ser Ser Ile 40 45 50 Ser Glu Ser Asn Met Asp Tyr Thr Ala Thr Ile Tyr Leu Arg Gln 55 60 65 Arg Trp Met Asp Gln Arg Leu Val Phe Glu Gly Asn Lys Ser Phe 70 75 80 Thr Leu Asp Ala Arg Leu Val Glu Phe Leu Trp Val Pro Asp Thr 85 90 95 Tyr Ile Val Glu Ser Lys Lys Ser Phe Leu His Glu Val Thr Val 100 105 110 Gly Asn Arg Leu Ile Arg Leu Phe Ser Asn Gly Thr Val Leu Tyr 115 120 125 Ala Leu Arg Ile Thr Thr Thr Val Ala Cys Asn Met Asp Leu Ser 130 135 140 Lys Tyr Pro Met Asp Thr Gln Thr Cys Lys Leu Gln Leu Glu Ser 145 150 155 Trp Gly Tyr Asp Gly Asn Asp Val Glu Phe Thr Trp Leu Arg Gly 160 165 170 Asn Asp Ser Val Arg Gly Leu Glu His Leu Arg Leu Ala Gln Tyr 175 180 185 Thr Ile Glu Arg Tyr Phe Thr Leu Val Thr Arg Ser Gln Gln Glu 190 195 200 Thr Gly Asn Tyr Thr Arg Leu Val Leu Gln Phe Glu Leu Arg Arg 205 210 215 Asn Val Leu Tyr Phe Ile Leu Glu Thr Tyr Val Pro Ser Thr Phe 220 225 230 Leu Val Val Leu Ser Trp Val Ser Phe Trp Ile Ser Leu Asp Ser 235 240 245 Val Pro Ala Arg Thr Cys Ile Gly Val Thr Thr Val Leu Ser Met 250 255 260 Thr Thr Leu Met Ile Gly Ser Arg Thr Ser Leu Pro Asn Thr Asn 265 270 275 Cys Phe Ile Lys Ala Ile Asp Val Tyr Leu Gly Ile Cys Phe Ser 280 285 290 Phe Val Phe Gly Ala Leu Leu Glu Tyr Ala Val Ala His Tyr Ser 295 300 305 Ser Leu Gln Gln Met Ala Ala Lys Asp Arg Gly Thr Thr Lys Glu 310 315 320 Val Glu Glu Val Ser Ile Thr Asn Ile Ile Asn Ser Ser Ile Ser 325 330 335 Ser Phe Lys Arg Lys Ile Ser Phe Ala Ser Ile Glu Ile Ser Ser 340 345 350 Asp Asn Val Asp Tyr Ser Asp Leu Thr Met Lys Thr Ser Asp Lys 355 360 365 Phe Lys Phe Val Phe Arg Glu Lys Met Gly Arg Ile Val Asp Tyr 370 375 380 Phe Thr Ile Gln Asn Pro Ser Asn Val Asp His Tyr Ser Lys Leu 385 390 395 Leu Phe Pro Leu Ile Phe Met Leu Ala Asn Val Phe Tyr Trp Ala 400 405 410 Tyr Tyr Met Tyr Phe 415

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。タンパク質の全長は４４０アミノ酸残基であり、成
熟タンパク質が４１６アミノ酸残基を含むように最初の
２４アミノ酸は推定リーダー配列を表す。

【図２】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。タンパク質の全長は４４０アミノ酸残基であり、成
熟タンパク質が４１６アミノ酸残基を含むように最初の
２４アミノ酸は推定リーダー配列を表す。

【図３】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示
す。タンパク質の全長は４４０アミノ酸残基であり、成
熟タンパク質が４１６アミノ酸残基を含むように最初の
２４アミノ酸は推定リーダー配列を表す。

【図４】 アミノ酸の標準１文字省略記号を使用し、Ｇ
ＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニットのアミノ酸
配列を示す。推定膜貫通領域に下線を付す。

【図５】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トとＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットのアミノ
酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマッ
チする部分である。

【図６】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トとＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットのアミノ
酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマッ
チする部分である。

【図７】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トとＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットのアミノ
酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマッ
チする部分である。

【図８】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トとＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットのアミノ
酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマッ
チする部分である。

【図９】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニッ
トとＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットのアミノ
酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマッ
チする部分である。

【図１０】 ＧＡＢＡ_Ａレセプターイプシロンサブユニ
ットとＧＡＢＡ_Ａレセプターの他のサブユニットのアミ
ノ酸配列の比較を示す。影を付けた残基は全く正確にマ
ッチする部分である。

【図１１】 ＧＡＢＡ_Ａイプシロンレセプターサブユニ
ットの二次構造的な特徴を示す。最初の７つの例示はα
ヘリックス、βシート、ターン領域またはコイル領域で
あるアミノ酸配列の領域を示す。四角に囲んだ領域は指
示された領域に対応する領域である。図の第２セット
は、細胞内、細胞質に曝されているかまたは膜分離アミ
ノ酸配列の領域を描く。ハイドロフィリシティー（hydr
ophilicity）のプロットは、膜の脂質二重層であり、ゆ
えに疎水性であるタンパク質配列の領域、および親水性
である脂質二重層膜の外側の領域であるタンパク質の配
列の領域を示す。抗原指標は抗原の領域が脂質二重層膜
の外側であり抗原を結合することができるため、ハイド
ロフィリシティーロットに対応する。サーフィスプロバ
ビリティー（surface probability）プロットはさらに
抗原指標およびハイドロフィリシティープロットに対応
する。両親媒性のプロットは、極性および非極性である
タンパク質配列の領域を示す。可とう性の領域は、膜の
外側の領域であり、非可とう性の領域は膜貫通領域であ
るという意味で図の第２セットに対応する。

【図１２】 ＧＡＢＡ_Ａイプシロンレセプターサブユニ
ットの二次構造的な特徴を示す。最初の７つの例示はα
ヘリックス、βシート、ターン領域またはコイル領域で
あるアミノ酸配列の領域を示す。四角に囲んだ領域は指
示された領域に対応する領域である。図の第２セット
は、細胞内、細胞質に曝されているかまたは膜分離アミ
ノ酸配列の領域を描く。ハイドロフィリシティーのプロ
ットは、膜の脂質二重層であり、ゆえに疎水性であるタ
ンパク質配列の領域、および親水性である脂質二重層膜
の外側の領域であるタンパク質の配列の領域を示す。抗
原指標は抗原の領域が脂質二重層膜の外側であり抗原を
結合することができるため、ハイドロフィリシティーロ
ットに対応する。サーフィスプロバビリティープロット
はさらに抗原指標およびハイドロフィリシティープロッ
トに対応する。両親媒性のプロットは、極性および非極
性であるタンパク質配列の領域を示す。可とう性の領域
は、膜の外側の領域であり、非可とう性の領域は膜貫通
領域であるという意味で図の第２セットに対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 １０１ Ａ６１Ｐ 25/08 25/08 25/14 25/14 25/16 25/16 25/20 25/20 25/22 25/22 25/28 25/28 25/30 25/30 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 イ・リ アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ハワード・ランディング・ ドライブ16125番 (72)発明者 イーウェン・カークネス アメリカ合衆国20832メリーランド州オル ネー、リトル・ビスタ・テラス2519番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA12 DA02 DA05 EA04 GA11 HA01 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA07 BA22 BA23 CA53 CA56 DB63 NA14 ZA03 ZA05 ZA06 ZA16 ZA22 ZA23 ZA94 ZC37 ZC41 ZC42 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA03 ZA05 ZA06 ZA16 ZA22 ZA23 ZA94 ZC37 ZC41 ZC42 4H045 AA10 AA20 CA40 DA50 EA21 EA50 FA72 FA74

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本明細書に記載したＧＡＢＡ_Ａレセプタ
   ーイプシロンサブユニット。