JPH10512749A

JPH10512749A - ヒトデオキシシチジンキナーゼ２

Info

Publication number: JPH10512749A
Application number: JP8521623A
Authority: JP
Inventors: ウェイ，イン−フェイ; エフ．カークネス，エウェン
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1998-12-08
Also published as: WO1996021724A1; AU1680495A; EP0815199A1; EP0815199A4

Abstract

(57)【要約】ヒトデオキシシチジンキナーゼ２ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを生産するための手順が開示される。悪性腫瘍およびウイルス感染の処置に対してこのようなポリペプチドを利用する方法もまた開示される。このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよび免疫不全障害を処置するための治療物としてのそれらの使用もまた開示される。hdCK2核酸配列における変異に関連した疾患を検出するための診断アッセイおよびこのような核酸配列によりコードされるポリペプチドの濃縮物もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトデオキシシチジンキナーゼ２本発明は、新規に同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトデオキシシチジンキナーゼ２であり、本明細書中において以下「hdCK2」ということがある。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。ヒトデオキシシチジンキナーゼ２は、数個のデオキシリボヌクレオシドおよびそのアナログのリン酸化を担う。この酵素は、広い基質特異性を有し、そして正常なデオキシリボヌクレオチドプールの維持において生理学的な役割を果たすことが示されている。デオキシシチジンキナーゼはまた、１-β-D-アラビノフラノシルシトシンおよびジデオキシシチジンを含む種々の抗腫瘍性ヌクレオシドアナログおよび抗ウイルスヌクレオシドアナログのリン酸化における鍵酵素であり（ Ullman,B.ら、J.Biol.Chem.、263:12391-12396(1988)）、そしてデオキシシチジンキナーゼの欠陥は、これらの薬剤に対する抵抗性を活発に媒介する。この酵素は、いくつかのデオキシリボヌクレオチドによってアロステリックに調節され、そしてデオキシシチジンのリン酸化のためのリン酸基ドナーとしてATPを優先的に使用する（Ikeda,S.ら、Bio.Chem.、27:8648-8652(1988)）。ヒトリンパ芽球性の培養Ｔ細胞株から単離したデオキシシチジンキナーゼは、見かけ上60,000の分子量および32Åのストークス半径を有していた。デオキシシチジンキナーゼ酵素は、２つの同一のサブユニットから構成されると考えられる。デオキシシチジンのリン酸化の速度は、pH7.0で本質的に最大であるが、最適p Hは、pH6.5からpH9.0までの広い範囲にわたる。この酵素はまた、マグネシウムに対する絶対的要求性を有する。２価のカチオンの添加の欠如下では、デオキシシチジンは2.4 mMのマグネシウムを用いて見られた速度の約10％でリン酸化される。このタンパク質の重要な構造上の機能は、アミノ酸28〜34における有望なヌクレオチド結合ドメインの存在である。共通配列Gly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Gly-Lysは、種々のチミジンキナーゼ、ラクトバチルスおよびAMPデアミナーゼを含むATP結合酵素、ならびにデオキシシチジン／デオキシアデノシンキナーゼにおいて報告されている（Kim,Mら、Bio.Chem.Biophys.Res.Commun.、156:92-98(1988)）。31 位におけるアラニン残基の置換は、有効なヌクレオチド結合を妨害しない。このデオキシシチジンキナーゼタンパク質は、シトシンアラビノシド、デオキシグアノシン、デオキシアデノシン、シチジン、２-クロロ-アデノシン、およびジデオキシシチジンを含む多数の基質を有する。デオキシシチジンキナーゼにウリジン −シチジンキナーゼが混入した場合、シチジンリン酸化は、ウリジンにより阻害されるにちがいない。ATPが好ましいリン酸基ドナーである一方、GTP、ITP、およびXTPもATPと比較して80％以上の活性を有していた。デオキシシチジンキナーゼは、以下のヒト組織を含む多くの起源から部分精製されている（Baxter,Aら、Bio.Chem.J.、173:1005-1008(1978)）：扁桃リンパ球、白血病脾臓、Ｔ-リンパ芽球、および骨髄芽球。デオキシシチジンキナーゼは、化学療法剤シトシンアラビノシドの、その5'三リン酸への活性化における律速段階である（Mejer,J.、Scand.J.Clin.Lab.Inves t. 、42:401-406(1982)）。デオキシシチジンキナーゼがその最初の活性化を触媒する臨床的に重要な他の化学療法剤は、ara-C、２-フルオロ-９-β-D-アラビノフラノシルアデニン、およびジデオキシシチジンである(Kufe,D.W.およびSprigg s,D.R.、Semin.Oncol.、12:34-48(1985))。本発明のポリペプチドは、ヒトデオキシシチジンキナーゼ２として推定的に同定されている。この同定は、マウスデオキシシチジンキナーゼ１に対するアミノ酸配列の相同性の結果として行われた。本発明の１つの局面において、hdCK2である新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性でありかつ、診断的または治療的に有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明の別の局面において、hdCK2をコードする単離された核酸分子（mRNA、D NA、cDNA、ゲノムDNAを含む）、ならびにアナログおよび生物学的に活性でありかつ、診断的または治療的に有用なそのフラグメントが提供される。本発明のなおさらなる局面において、またhdCK2配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸分子プローブが提供される。本発明のなおさらなる局面において、このようなポリペプチドを組換え技術により生産させるための方法が提供される。この方法は、hdCK2核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を先述のタンパク質の発現を促進する条件下で培養する工程、そしてそれに引き続くこのタンパク質の回収を含む。本発明のなおさらなる局面において、治療目的のため(例えば、リボヌクレオチドを特異的な抗ガン剤および抗ウイルス剤に活性化するためにデオキシリボヌクレオシドをリン酸化するため、およびデオキシヌクレオチドプールの適合度(f idelity)を維持するため)に、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用するための方法が提供される。本発明のなおさらなる局面において、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のなお別の局面において、例えば、免疫不全疾患の処置において、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために使用され得る、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。本発明の別の局面において、hdCK2核酸配列内の変異およびそのような核酸配列によりコードされるタンパク質に関する疾患または疾患に対する感受性（例えば、異常なDNA複製および翻訳)を診断する方法が提供される。本発明のなお別の局面において、研究目的のために、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いる方法が提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らなはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含されるように、本発明の範囲を限定することは意図されない。図１は、cDNA配列およびhdCK2ポリペプチドの相当する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準１文字略語が用いられている。図２は、hdCK1、hdCK2、およびマウスdCK1との間のアミノ酸配列の相同性を示し、ここでこの陰を付けた領域は、異なる配列間での同一のアミノ酸残基を示す。図３は、hdCK2の細菌の発現および精製ならびにSDS-PAGE分析後のゲルの例示である。本発明の局面において、図１の推定アミノ酸配列（配列番号２）を有する成熟ポリペプチド、または1994年８月31日にATCC受託番号第75881号として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト卵巣、精巣、胆嚢、肝臓、肺、脾臓、前立腺、および心臓から得られ得る。本発明のポリペプチドは、シクロヘキシミド処理したヒトCEM細胞由来のcDNAライブラリー中に見出された。これは、デオキシシチジンキナーゼファミリーと構造的に関連している。これは、172アミノ酸残基の蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、90アミノ酸範囲にわたり60％の同一性および70％の類似性で、ヒトデオキシシチジンキナーゼ１に最も高い程度の相同性を示す。 ATP結合のためのGly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Gly-Lys共通配列が保存されていることもまた重要である。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得、ここでDN Aは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含む。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして、一本鎖であるならばコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、またはコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは以下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列および付加的なコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じて付加的なコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびに付加的なコード配列および /または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中前記のポリヌクレオチドの変異体に関する。そのポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体、またはそのポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。従って、本発明は、図１（配列番号２）に示される同成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに変異体が、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする、そのようなポリヌクレオチドの変異体を含む。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を含む。本明細書中で前に示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、コードされたポリペプチドの機能を実質的には変化させない、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態である。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームに融合されたコード配列を有し得る。そのマーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するためにpQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得、あるいは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合、赤血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する(Wilson,I.ら、Cell、37:767 (1984))。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％そして好ましくは70％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じることをいう。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１(配列番号１)のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これらの寄託物は、単に便宜のために当業者に提供されるものであり、そして寄託が米国特許法第112条の下で必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列のあらゆる記載とのいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、使用、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１(配列番号２)の推定アミノ酸配列を有する、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するhdCK2ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１(配列番号２)のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、活性化成熟ポリペプチドを生産するために、プロタンパク質部分の切断により活性化され得るプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１(配列番号２)のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドの、フラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)その中で１つ以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされるものであり得るかまたはあり得ない、あるいは(ii)その中で１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)その中で成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物と融合されているもの、あるいは(iv)その中で、リーダーまたは分泌配列、あるいは成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列のような付加的なアミノ酸が、成熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離された同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／または、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そしてさらにこのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないように単離され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの生産に関する。宿主細胞は、本発明のベクター(これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る)を用いて遺伝子操作(形質導入または形質転換またはトランスフェクト)される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはhdCK2遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件(例えば、温度、pHなど)は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを生産するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つの内に含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAを含む。しかし、宿主において複製可能で、そして生存可能である限り、あらゆる他のベクターも使用され得る。適切なDNA配列が、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位(単数または複数)に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指示する適切な発現制御配列(単数または複数)(プロモーター)に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.c oli ．lac またはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物に対するジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供するための１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。本明細書中上記のような適切なDNA配列、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターが、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞(例えば、E ．coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium)；真菌細胞(例えば酵母)；昆虫細胞(例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9)；動物細胞(例えば、CHO 、COS、またはBowes黒色腫)；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。その構築物として、本発明の配列が、正または逆方向に挿入されたベクター(例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター)が挙げられる。この実施態様の好ましい局面において、この構築物はさらに、その配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーターを含む)を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70、pQE60、pQE- 9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A 、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR54 0、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagen e)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主中で複製し得、そして生存可能である限り、あらゆる他のプラスミドまたはベクターが使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびPCM7である。特によく知られた細菌性プロモーターとして、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L 、およびtrpが挙げられる。真核性プロモーターとして、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basic Methods in Molecular Biology、(1986))。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産するために、従来の様式で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生産され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物由来のRNAを用い、このようなタンパク質を生産するために使用され得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングおよび発現ベクターは、 Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor、N.Y.、（1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点bp100〜270の後期側のSV 40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi siae のTRP1遺伝子）、および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のような解糖酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質(他にもあるが)をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列と共に適切な相内で構築される。必要に応じて、異種配列は所望の特徴(例えば、発現された組換え産物の安定化または簡易精製)を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターとともに、操作可能な読み取り相(operable reading phase)に、適切な翻訳開始および終止シグナルを有する所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、ならびにベクターの維持を保証するため、および所望ならば、宿主内での増幅を提供するために複製起点を含む。形質転換のための適切な原核宿主として、E ．coli、Bacillus subtil is 、Salmonella tyPhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種が挙げられるが、他もまた選択対象として用いられ得る。代表的であるが、非限定的な例として、細菌使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような市販のベクターとして、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals、Uppsala 、Sweden)およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)が挙げられる。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と結合される。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、その選択されたプロモーターは、適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物がさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の便利な方法により破砕され得、このような方法は、当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例として、Gluzman、Cell、23:175(1981)に記載されたサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株)が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および5'隣接非転写配列を含む。SV 40のスプライス、およびポリアデニル化部位由来のDNA配列が、必要な非転写遺伝因子を提供するために使用され得る。 hdCK2ポリペプチドは、硫安沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフイー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により、組換え細胞培養物から回収されそして精製され得る。必要に応じて、タンパク質の再生工程が、成熟タンパク質の立体配置を完成するために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最後の精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞により）から組換え技術により生産され得る。組換え生成手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、あるいはグリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。以下に論じる、hdCK2ポリペプチドならびにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、インビボにおけるこのようなポリペプチドの発現（これは、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる）によって、本発明に従って使用され得る。従って、例えば、患者由来の細胞は、エクスビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）を用いて操作され得、次いで、この操作した細胞は、このポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。そのような方法は、当該分野において周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野において公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、例えば、当該分野に公知の手順によって、インビボにおけるポリペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞が、インビボで細胞を操作するためおよびインビボにおけるポリペプチドの発現のために、患者に投与され得る。そのような方法による本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであるはずである。例えば、細胞を操作をするための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外、例えば適切な送達ビヒクルとの組み合わせの後、インビボで細胞を操作するために使用され得るアデノウイルスであり得る。一旦hdCk2ポリペプチドが、遺伝子治療を介して細胞内で発現されると、これは、悪性腫瘍（例えば、腫瘍、ガン、白血病およびリンパ腫ならびにウイルス性感染症）を処置するために使用され得る。なぜなら、hdCK2は、ヌクレオチドの細胞傷害性三リン酸誘導体（例えば、ara-C、2-フルオロ-９-β-D-アラビノフラノシルアデニン、およびジデオキシシチジン）の形式における最初のリン酸化行程を触媒するからである。これらの化合物は、上記の異常の処置において広範に使用される。 hdCK2はまた、正常なデオキシリボヌクレオチドのプールを維持し、従って、正確なDNA合成を確実にするために使用され得る。本発明のなおさらなる局面に従って、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的な研究、DNAの合成およびDNAベクターの製造に関するインビトロでの目的のために、ならびにヒトの疾患を処置するための診断物および治療物を設計するために利用するためのプロセスが提供される。完全長hdCK2遺伝子のフラグメントは、完全長のhdCK2遺伝子を単離するための、そしてhdCK2遺伝子に対する高い配列類似性または類似した生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するための、cDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。このタイプのプローブは、一般に、少なくとも20塩基を有する。しかし、好ましくは、このプローブは、少なくとも30塩基を有し、そして一般に50塩基を越えないが、それらは、より多数の塩基を有し得る。このプローブはまた、完全長の転写産物に対応するcDNAクローン、ならびに制御およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全なhdCK2遺伝子を含むゲノムクローン（単数または複数）を同定するために用いられ得る。スクリーニングの一例は、既知のDNA配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成することによって、hdCK2遺伝子のコード領域を単離する工程を包含する。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーにこのプローブがハイブリダイズするかを決定するために、ヒトのcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために用いられる。本発明はまた、変異hdCK2の存在に関する疾患または疾患に対する感受性（例えば、抗ウイルスおよび抗悪性腫瘍組成物に対する耐性）を検出するための診断アッセイの一部分としての、hdCK2遺伝子の使用に関する。 hdCK2遺伝子に変異を有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出され得る。診断用の核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織生検、および解剖材料）から得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析の前に、PCR(Saikiら、Nature,324:163-166(1986))を使用して酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的のために使用され得る。一例としては、hdCK2をコードする核酸に相補的なPCRプライマーは、hdCK2変異を同定および分析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入が、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、増幅 DNAを放射性標識hdCK2 RNAあるいは放射性標識hdCK2アンチセンスDNA配列にハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全にマッチした配列は、RNase A 消化によるか、または融解温度の差異によりミスマッチした二重鎖と区別され得る。 DNA配列の差異に基づく遺伝学的試験は、変性剤を有するか、または有しないゲル中でのDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され得る。小配列の欠失および挿入は、高分離能ゲル電気泳動により可視化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルで区別され得、ここで、異なるDNAフラグメントの移動度は、その特異的な融解温度または部分的な融解温度に従って、ゲル中で異なる位置に遅延される（例えば、Myersら、Science,230:1242(1985)を参照のこと）。特定の位置の配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNaseおよびS1保護または化学的切断法）により示され得る（例えば、cottonら、PNAS,U SA,85:4397-4401(1985))。従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（R FLP））、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。より慣例的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析により検出され得る。本発明はまた、種々の組織におけるhdCK2タンパク質の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常なコントロール組織サンプルと比較したこのタンパク質の過剰発現は、例えば、腫瘍のような、悪性疾患に関連する疾患の存在またはその疾患に対する感受性を検出し得るからである。宿主に由来するサンプル中のhdCK2タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知のアッセイであり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを含む。ELISAアッセイ（Coliganら、Current Protocols in I mmunology,1(2),第６章、(1991))は、最初に、hdCK2抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がそのモノクローナル抗体に対して調製される。このレポーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍光、または本発明の実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を付着させる。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位は、BSAのような非特異的タンパク質とともにインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付着されたすべてのhdCK2タンパク質と付着する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液を用いて洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したレポーター抗体はここで、ディッシュ中に置かれ、hdCK2に結合したすべてのモノクローナル抗体へのレポーター抗体の結合を生じる。次いで、非付着レポーター抗体が洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ基質が、ディッシュに添加され、そして所定の時間内の発色量は、検量線に対して比較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在するhdCK2タンパク質量の測定値である。競合アッセイが使用され得る。ここで、hdCK2に特異的な抗体は、固体支持体に付着され、そして標識hdCK2および宿主由来のサンプルは、固体支持体上を通過させられ、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出された標識の量は、サンプル中のhdCK2量と相関し得る。「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」アッセイでは、hdCK2は固体支持体上を通過させられ、そして固体支持体に付着された抗体と結合する。次いで、第２の抗体がhdCK2に結合させられる。次いで、標識されており、かつ第２の抗体に特異的な第３の抗体が、固体支持体上を通過させられ、そして第２の抗体に結合し、次いで、量が定量され得る。 hdCK2ポリペプチドはまた、化合物をスクリーニングして、hdCK2のリン酸化活性を増強する化合物（アゴニスト）またはブロックする化合物（アンタゴニスト）を同定する方法において使用され得る。そのような方法の例は、hdCK2を発現する哺乳動物細胞または膜調製物（例えば、HL-60細胞）からhdCK2を単離するする工程、反応混合物、hdCK2酵素、およびスクリーニングすべき化合物を調製する工程を包含する。次いで、反応混合物は、高められた温度でインキュベートされ、そして形成されたこのデオキシシチジン一リン酸は、DE-81ディスク法(Chen g,Y.C.ら、Biochem.Biophys.Acta、481:481-492(1977))によって検出される。hd CK2活性は、fmolのdCMP/分/μgタンパク質として算出され、そして表現され得る。次いで、この化合物の非存在において、標準活性と比較して、hdCK2活性を増強またはブロックする化合物の活性を測定し得る。ヒトhdCK2は、細胞内で産生され、そして機能する。従って、すべてのアンタゴニストは細胞内性でなければならない。hdCK2に対する潜在的なアンタゴニストは、細胞内で産生される抗体を含む。例えば、hdCK2をアンタゴナイズするとして同定された抗体は、当該分野で公知の手順（例えば、単鎖抗体をコードする DNAを用いて適切な細胞を形質転換して、hdCK2の機能を妨害すること）によって単鎖抗体として細胞内で産生され得る。潜在的なhdCK2アンタゴニストはまた、アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンス構築物を含む。アンチセンス技術は、三重らせん形成あるいはアンチセンスDNAまたはRNAを介して遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの方法の両方は、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であるように設計され（三重らせん−Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Cooneyら、Science，241:456(1988);およびDervanら、Sc ience，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、hdCK2の転写および産生を妨害する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAとハイブリダイズし、そしてmRNA分子のhdCK2ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス − Okano、J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988 ))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現されてhdCK2の産生を阻害し得る。潜在的なhdCK2アンタゴニストはまた低分子を包含する。それらは細胞膜を通過し得、そしてポリペプチドの触媒部位に結合し、そしてそれを占有し、それにより正常な生物学的活性が妨害されるように、触媒部位を基質に接近し得ないようにする。低分子の例としては、小さなペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。アンタゴニストは、免疫不全疾患を処置するために使用され得る。なぜなら、 hdCK2が、これらの異常において、その蓄積がＴ細胞前駆体に細胞傷害性を与えるdATPまたはdGTPの合成における重要な行程を触媒するからである。従って、hd CK2機能の阻害は、これらの異常を除去し得る。このアンタゴニストは、（例えば、本明細書中の以下に記載されている）薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物中で使用され得る。本発明の低分子アゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分が充填された１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示が伴われ得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を反映する。さらに、薬学的組成物は、他の治療的化合物と併用して用いられ得る。これらの薬学的組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路により、従来の様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の徴候の処置および／または予防に効果的な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして大部分の場合、それらは１日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与される。大部分の場合、投薬量は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約10μg/kg体重から約１mg/kg体重である。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これらの配列と、疾患に関連する遺伝子とを相関させることにおいて重要な第１工程である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。3'非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて類似の様式で部分的位置付け(sublocalization)が達成され得る。その染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメトリーで分取した染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基ほどの短いcDNAを用いて使用され得るが、しかし2,000b pより大きなクローンは、簡単な検出のために十分なシグナル強度をともなって独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。FISHは、ESTが由来したクローンの使用を必要とし、クローンは大きいほどよい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpがより良好であり、そして4,000より大きなものは、良好な結果を妥当な時間の割合で得るためにはおそらく必要ではない。この技術の総説としては、Vermaら、Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Pre ss、New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を、遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V ． McKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Me dical Libraryからオンラインで入手可能である)に見出される。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次いで、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、あるいはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を含む。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、1985 、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁) が挙げられる。単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。本発明を以下の実施例に関してさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、先頭に位置する小文字のｐおよび／あるいは後に続く大文字および／または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、商業的に入手可能であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のためには、代表的には５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。 37℃での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化後、反応物は直接ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動されて所望のフラグメントが単離される。切断されたフラグメントのサイズによる分離は、Goeddel，D.ら、Nucleic Aci d Res.，8:4057(1980)に記載の８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸をATPとともに添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結されない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結される。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、前出、146頁)。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しない限り、形質転換は、Graham，F.およびVan der Eb，A.、Virolo gy、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。実施例１ hdCK2 の細菌発現および精製 hdCK2をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75881号）を、プロセスされたhdC K2遺伝子の5'および3'末端配列（シグナルペプチド配列を除く）ならびにhdCK2 遺伝子に対して3'側のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。hdCK2に対応するさらなるヌクレオチドを、5'および3'配列それぞれに付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’CGG GATCCATGGCCAAGAGCCCACTC 3'（配列番号３）を有し、これはBam HI制限酵素部位続いてプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ酸から開始する18ヌクレオチドのhdCK2コード配列を含む。3'配列、5’GCTCTAGATTACAGATTCTTTACAAA 3 '（配列番号４）は、XbaI部位に相補的な配列を含み、そしてhdCK2のＣ末端の18 ヌクレオチドが続く。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen,Inc．C hatsworth,CA,）の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をBam HIおよびXbaIで消化した。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列にインフレームで挿入した。次いで、連結混合物を用いて、E.coli m15/pREP4株（Qiagen）をSambrook，J.ら、Molecula r Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換した。M15/rep4は、プラスミドpREP4の多数のコピーを含む。プラスミドpREP4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kan^r）も与える。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、A mp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大規模な培養物を接種する。細胞を、光学密度600（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にした。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oを解放（clear）させて遺伝子発現を増大させることを誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により採集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６MグアニジンHClで可溶化させた。明澄化後、可溶化されたhdCK2を、6-Hisタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にする条件下でニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した(Hochuli，E.ら、J．Chromatography 411:177-184(1984))。hdCK2（99 ％純粋）を、６MグアニジンHCl pH5.0中でカラムから溶出し、そして再生の目的のために、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液中で12時間インキュベーションした後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析した。実施例２バキュロウィルス発現系を用いるhdCK2のクローニングおよび発現全長のhdCK2タンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75881号）を、遺伝子の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。 5'プライマーは、配列5’GCGGGATCCATGGCCAAGAGCCCACTC3'（配列番号５）を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）、続いてhdCK2コード配列の18ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ATG」に下線を付している）を含む。 3'プライマーは、配列5’GCGGGTACCTTACAGATTCTTTACAAAGG3'（配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼAsp718の切断部位およびhdCK2遺伝子の3' 配列に相補的な20ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販のキット（「Geneclea n」、BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。このフラグメントを、F2と称する。ベクターpA2(pVL941ベクターの改変体、下記）をバキュロウィルス発現系を用いるhdCK2タンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D.およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and inse ct cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bull etin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californica 核多角体病ウィルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いて制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718の認識部位を含む。シミアンウィルス（S V）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウィルスを容易に選択するために、E．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルがそれに続く。ポリヘドリン配列を、同時トランスフェクトされる野生型ウィルスDNAの細胞媒介性相同組換えのために、ウィルス配列により両端で隣接させる。多くの他のバキュロウィルスベクター（例えば、pAc373、pV L941、およびpAcIM1(Luckow，V.A.およびSummers，M.D.、Virology，170:31-39) )が、pRG1の代わりに用いられ得た。プラスミドを制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、次いで当該分野に公知の手順によって仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いでこのDNA を、市販のキット(「Geneclean」 BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびAsp71 8を用いて、hdCK2遺伝子を有するプラスミド（pBac hdCK2）を含んだ細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。５μgのプラスミドpBac hdCK2を、リポフェクション法(Felgnerら Proc．Nat l．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987))を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウィルス（「BaculoGold^TMバキュロウイルスDNA」，Pharmingen，San D iego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。 1μgのBaculoGold^TMウィルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac hdCK2を、50μ lの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウエル中で混合する。その後、10μlのLipofec tinおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含有グレース培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CR L 1711）に滴下する。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振とうする。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（上述）による記載と同様にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologles Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li fe Technologies Inc.、Gaithersburgにより配布される昆虫細胞培養およびバキュロウィルス学のための使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウィルスを含む寒天を、 200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁する。寒天を、短い遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウィルスを含む上清を、35mm ディッシュに播種されたSf9細胞を感染させるために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存する。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウィルスV-hdCK2で感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換える。42時間後、５μCi の³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加する。細胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そしてSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視化する。実施例３ COS 細胞における組換えhdCK2の発現発現プラスミドhdCK2 HAは、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）に由来する。ベクターpcDNAI/Ampは：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３） E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター、を含有する。完全なhdCK2前駆体、およびその３ '末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現は CMVプロモーター下で指向される。HAタグは、以前に記載されたようにインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson、H．Ni man、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 37，767）。本発明者らの標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体を用いての組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： hdCK2をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75881号）を、２つのプライマーを用いてPCRにより構築する：5'プライマー5’GCGGGATCCATGGCCAAGAGCCCACTC 3' （配列番号７）は、BamHI部位、続いて開始コドンから開始するhdCK2コード配列の18ヌクレオチドの配列を含む；3’配列5’GCGTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTC GTATGGGTACAGATTCTTTACAAAGGTG3'（配列番号８）は、XbaI部位、翻訳終止コドン、HAタグ、およびhdCK2コード配列の最後の19ヌクレオチド（終止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、BamHI部位、インフレームで融合したHAタグが続くhdCK2コード配列、HAタグに隣接する翻訳終止コドン、およびXbaI部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、BamHIおよびXbaI制限酵素で消化し、そして連結する。連結混合物を、E.col i SURE株（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析で試験する。組換えhdCK2の発現のために、COS細胞をDEAE -DEXTRAN法により発現ベクターでトランスフェクトする(J．Sambrook、E．Frits ch、T．Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Lab oratory Press，(1989))。hdCK2 HAタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法により検出する。(E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解する(Wilson，I.ら、同上３7:767( 1984))。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させる。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲルで分析する。実施例４ヒト組織におけるhdCK2の発現パターンヒト組織におけるhdCK2の発現レベルを検討するために、ノーザンブロット分析を実施する。全細胞RNAサンプルを、RNAzol^TMBシステム（Biotecx Laboratori es,Inc.Houston,TX）を用いて単離する。特定された各々のヒト組織から単離した約10μgの全RNAを、１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットする(Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning， Cold Spring Harbor Press、(1989))。50ngのDNAフラグメントを用いて、Strata gene Prime-Itキットに従って標識反応を行う。標識DNAをSelect-G-50カラムを用いて精製する（5 Prime-3 Prime,Inc.Boulder、CO）。次いで、このフィルターを、0.5M NaPO₄（pH7.4）および７％SDS中で65℃で一晩、1,000,000cpm/mlの放射性標識全長hdCK2遺伝子とハイブリダイズさせる。0.5×SSC、0.1％SDSで室温で２回、そして60℃で２回洗浄後、次いでこのフィルターを増感スクリーンを用いて-70℃で一晩曝露する。本発明の多数の改変および変更は、上記教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたポリヌクレオチドであって：（a）配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド；（b）ATCC受託番号75881に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド；からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号75881のcDNAによりコードされるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号１に示されるコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ATCC受託番号75881として寄託されたポリペプチドのコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のDNAを含むベクター。１０．請求項９に記載のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞。１１．ポリペプチドを生産する方法であって：請求項１０に記載の宿主細胞から、前記DNAによりコードされるポリペプチドを発現させる工程、を包含する、方法。１２．ポリペプチドを発現し得る細胞を生産する方法であって、請求項９に記載のベクターを用いて細胞を遺伝子操作する工程を包含する、方法。１３．請求項２に記載のDNAにハイブリダイズし得、そしてhdCK2活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたDNA。１４．ポリペプチドであって、(i)配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログ、および誘導体、ならびに(ii)AT CC受託番号75881のcDNAによりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体、からなる群から選択される、ポリペプチド。１５．前記ポリペプチドが、配列番号２の推定アミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストとして有効な化合物。１８．hdCK2の必要性を有する患者の処置方法であって：請求項１４に記載のポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与する工程、ここで該ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードするDNAを提供する工程および該ポリペプチドをインビボで発現させる工程により投与される、を包含する方法。１９．hdCK2を阻害する必要性を有する患者の処置方法であって：請求項１７に記載の化合物の治療的に有効な量を該患者に投与する工程を包含する、方法。２０．hdCK2に対するアンタゴニストとして有効な化合物を同定する方法であって：請求項１４のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合物、およびデオキシリボヌクレオシドを含む反応混合物を組み合わせる工程；およびデオキシリボヌクレオシドのリン酸化を阻害する該化合物の能力を決定する工程、を包含する、方法。２１．hdCK2核酸配列中の変異に関する疾患または疾患に対する感受性を診断する方法であって：宿主由来のサンプルにおける該hMutT2核酸配列中の変異を決定する工程；を包含する、方法。２２．診断方法であって：宿主由来のサンプル中の請求項１４に記載のポリペプチドの存在を分析する工程、を包含する診断方法。