JPH10512145A

JPH10512145A - ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼ

Info

Publication number: JPH10512145A
Application number: JP8521616A
Authority: JP
Inventors: エム．グリーン，ジョン; エイ．ローゼン，クレイグ; エフ．カークネス，エウェン
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-01-11
Filing date: 1995-01-11
Publication date: 1998-11-24
Also published as: AU1830895A; EP0812360A1; EP0812360A4; WO1996021736A1

Abstract

(57)【要約】本出願は、酵素ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼに対するタンパク質配列およびそれをコードする対応するDNA配列を開示する。本出願はまた、この酵素に対して調製された抗体、この酵素を同定する方法、および薬物としてのこの酵素の使用を考察する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼ本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。さらに詳細には、本発明のポリペプチドはヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼ（本明細書中では以下「hGGPS」ともいう）である。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。生物学的高分子の調節、機能的活性化、および細胞内標的化は、しばしば特定部分の共有結合的な接着により媒介される。リン酸化、グリコシル化、アセチル化、脂肪性のアシル化、およびメチル化による特定のタンパク質の翻訳後修飾は、広範に研究されており、そして種々の重要な生物学的機能が特定の側鎖に帰する。これらのなじみ深いタイプの化学的修飾に対して、タンパク質プレニル化は、脂肪親和性のイソプレノイドの群の付着による分子の共有結合的な修飾に帰する。イソプレノイドは反復５-炭素構造に基づく脂肪親和性分子の多種多様なファミリーである。15個の炭素分子ファルネシル二リン酸、および20個の炭素分子ゲラニルゲラニル二リン酸は、タンパク質プレニル化に最も関連したイソプレノイド化合物である。多くの特定のタンパク質がプレニル基で翻訳後修飾される。全てではないにしても、ほとんどのプレニル化タンパク質は、システイン残基へのチオエーテル結合において15-炭素ファルネシルまたは20-炭素ゲラニルゲラニル基(Rilling,H.C .ら、Science，247:318-320(1990))の付着により修飾される。総細胞タンパク質におけるファルネシルシステインおよびゲラニルゲラニル化システインの相対比は生物間および細胞型との間でいくらか変化するが、ほとんどの生物においてゲラニルゲラニル化は、ファルネシル化より一般的な修飾である(Epstein,W.W.ら、PNAS,USA,88:9668-7019(1991))。プレニル化タンパク質は種々の細胞区画中で見い出され、それには核、サイトゾル、および膜結合オルガネラが含まれる（Ma lt ese,W.A.およびSheridan,K.M.,J.Cell.Pysiol.，133:471-81(1987))。その正体が決定されたプレニル化タンパク質のほとんどは、以下の４つのタンパク質ファミリーの一つに属する：低分子量GTP結合タンパク質、リポペプチドフェロモン、核ラミン、および三量体Ｇタンパク質。ほとんどの既知のプレニル化タンパク質は低分子量グアニンヌクレオチド結合タンパク質のRasスーパーファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、以下の４つの低分子量タンパク質ファミリーに分けられ得る：Ras、Rho、Rap、およびRab/Yptファミリー（ Chardin,P.,Biochimie，70:865-68(19889)。これらのタンパク質は種々の細胞機能（細胞増殖および分化の制御、細胞分裂ならびに膜輸送を含む）に関与する。すべての低分子量GTP結合タンパク質はカルボキシル末端またはその近傍にシステイン残基を含有し、これは翻訳後プレニル化の標的として働くようである。 Rasタンパク質は原形質膜局在分子であり、哺乳動物細胞および酵母細胞において細胞分化および増殖を調節する。Rasタンパク質は、システイン、それに続いて２つの脂肪族の残基およびカルボキシル末端Ｘ残基(C,S,M,Q,またはAであり得る)を有するCaaXモチーフと呼ばれるカルボキシル末端に配列を含有する(Tapa rowsky,E.ら、Cell,34:581-56(1983))。タンパク質プレニル化の遺伝的または薬学的阻害は、ヒトおよび酵母のRasタンパク質の両方の膜結合および生物学的活性をブロックする(Hancock,J.F.ら、Cell，57:1167-77(1989)およびSchafer,W.R .ら、Science，245:379-85(1989))。低分子量GTP結合タンパク質の第２の群は、カルボキシル末端位に、ロイシン残基を有するCaaLモチーフと呼ばれるCaaXボックスと類似のカルボキシル末端モチーフを含有する。この群は、RapおよびRhoタンパク質ファミリーのような細胞質分裂に関する多くのタンパク質を含む。これらのタンパク質の多くはゲラニルゲラニル化されることが知られており、G25K、RhoA(Katayama,M.ら、J.Biol.Che m. ，266:12639-45(1991)、およびRap 1Aおよび1B(Buss,J.E.ら、Mol.Cell.Biol. ，11:1523-30(1991)Ral.Rac(kinsella,B>T.ら、J.Biol.Chem.,266:9786-94(1991 )、ならびにおよびKowata,M.ら、PNAS,USA，87:8960-64(1990))を含む。プレニル化カルボキシル末端はRap 1Bの膜への結合に必要とされる。Rap 1Bカルボキシル末端に対応するプレニル化、リン酸化されたペプチドは、GDSとの相互作用についてインタクトなRap 1Bと競合し得るので（どちらの修飾も欠失している他のペプチドは競合し得ないが）、プレニル化およびリン酸化は両方ともGDSとして知られる因子とのRap 1Bの相互作用に必要とされる。GDSはGDP/GTP変換を刺激する(H ata,Y.ら、J.Biol.Chem.，266:6571-77(1991))。 Rhoタンパク質はまた、ゴルジ体にも局在し(McCaffey,M.ら、J.Cell.Biol.，1 15:309-19(1991))、そしてさらに膜および変換因子との結合のためにゲラニルゲラニル化を必要とするようである。低分子量GTP結合タンパク質の第３の群は、カルボキシル末端配列C-C、C-X-C 、またはC-C-X-Xを含有する。これらのタンパク質はRab/YPTタンパク質のほとんどを含み、これらは細胞内輸送の調節に関与し、そして両方とも細胞質に存在し、そして個々の膜区分に結合する(Balch,W.E.,Trends Biochem.Sci.，15:469-72 (1990))。これらのタンパク質のゲラニルゲラニル化は、これらのタンパク質が膜に結合するために必須であることが示されている。ゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼは、代謝のコレステロール／ステロイド経路の分岐に関与し、そしてC²⁰ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)を形成するための、ジメチアリル二リン酸へのイソペンテニル二リン酸の３つの分子のトランス-付加(trans-addition)を媒介する。上述のように、GGPPは、タンパク質を修飾し、シグナル伝達および、これらのタンパク質の活性化ならびにこれらのタンパク質の輸送を制御するプレニルタンパク質修飾基として用いられる。本発明のポリペプチドは、ヒトゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼとして推定的に同定された。この同定は、アミノ酸配列相同性の結果としてなされた。本発明の１つの局面によれば、hGGPSである新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明の別の局面によれば、hGGPSをコードする単離された核酸分子が提供され、それには、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびに生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログ、および誘導体が含まれる。本発明のなおさらなる局面によれば、組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。組換え技術は、上記タンパク質の発現およびその後の前記タンパク質の回収を促進する条件下で、hGGPS核酸配列を含む組換え原核宿主細胞および/または真核宿主細胞を培養することを含む。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、治療目的（例えば、細胞の形態を制御するため、アポトーシスを抑制するため、ならびにアンタゴニストおよび／またはアゴニストをスクリーニングするため）に利用するプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明のなお別の局面によれば、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、これは例えば、腫瘍（例えば、腫瘍およびガン細胞増殖）の処置においてこのようなポリペプチドの作用を阻害するため、ならびにウイルス増殖を妨げるために用いられ得る。本発明の別の局面によれば、hGGPS配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブがまた提供される。本発明の別の局面によれば、疾患またはhGGPS核酸配列中の変異およびこのような核酸配列にコードされるタンパク質に関する疾患に対する感受性の診断方法が提供される。本発明のなお別の局面によれば、開示されたポリヌクレオチドおよび研究目的のためのポリペプチドを使用するためのプロセスが提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により取り囲まれるような本発明の範囲を限定することを意味しない。図１は、hGGPSポリペプチドのcDNA、および対応する推定アミノ酸配列を示す。示したポリペプチドは、このポリペプチドの全長タンパク質配列である。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。配列決定を、373自動DNAシーケンサー(Appli ed Biosystems,Inc.)を用いて行った。配列決定の精度は、97％の精度より大きいことが予想される。図２は、hGGPSポリペプチドとNeurospora crassa由来のゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼとの間のアミノ酸配列の相同性を図示する。図３は、Neurospora crassa由来のGGPSと本発明のhGGPSとの間のアミノ酸配列相同性を示す。アミノ酸が同一である場合、そのアミノ酸の略語をコンセンサスで標識した下の行に示す。本発明の局面によれば、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは1994年９月28日にATCC受託番号第75900号として寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、骨巨細胞腫、８週齢の胎児および微小血管内皮細胞から入手され得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト胎児心臓由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。これは、構造的にポリプレニルシンセターゼファミリーに関連する。これは、300アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、265アミノ酸にわたって54％の同一性および72％の類似性を有し、Neurospor a crassa由来のGGPSと最も高い相同性を示す。hGGPSは、このタンパク質のファミリーに顕著である保存されたアスパラギン酸モチーフである、LLIDDEIDNSKLRR G およびLGLFFQIRDDYANの両方を含有する（図１を参照）。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAはcDNA、ゲノムD NA、および合成DNAを包む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合にはコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列（および随意のさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。従って本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの改変体を包含する。この改変体は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンの cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を含む。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合は、血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37:767 (1984)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％および好ましくは70％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが配列間に少なくとも95％および好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、単に便宜上当業者に提供されるのみであり、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するhGGPSポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAにコードされるポリペプチドをいう場合は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従ってアナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)そこで１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であるかもしれないし、またはそうではないかもしれないもの、あるいは(ii)そこで１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii)そこで成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形熊で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないためなお単離され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはhGGPS遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を含む。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA;バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli. lacまたはtrp 、λファージP_Lプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいはE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。この構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を含み、このベクターの中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE7 0、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK 、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A．pNH46A(Stratagene)；pTRC99a、pKK223-3、p KK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、 pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびPCM7である。特によく知られた細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびt rpを含む。真核プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインIを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシヨン、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molecular Biology,(1986))。宿主細胞中の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核宿主および真核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点(bp100〜270)の後期側の SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、特に解糖酵素（例えば、 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌での使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，U ppsala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列もまた含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。 hGGPSポリペプチドは、以下を包含する方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されるかもしれないし、またはグリコシル化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 hGGPSポリペプチドは、hGGPSの活性および生じるGGPPの形成をブロックするもの（アンタゴニスト）を同定するための化合物をスクリーニングする方法において使用され得る。このタイプのスクリーニングについて多数の方法（例えば、鋭敏な特異性が異なるタンパク質基質の認識に存在し得る）が存在する。これはGG PSのこれらのタンパク質またはペプチド基質に対する結合を評価するアッセイまたは酵素の読み取りにおいて使用され得る。さらに、アッセイは基質アナログを用いて形成され得る。一例として、アゴニスト活性は、hGGPSおよびスクリーニングされるべき化合物の存在下で過剰モルのイソペンテニルジホスファターゼ、ジメチルアリルジホスファターゼから合成されたGGPPの量を測定することにより決定され得る。この反応は、反応混合物の存在下で、そしてGGPPの形成を促進する反応条件下で行われる。上で列挙した基質は、例示の目的のためのみのものであり、多くの基質がこのアッセイにおいて使用され得る。hGGPSの特性を拮抗する、スクリーニングされるべき化合物の能力を、合成されたGGPPの量を測定し、そしてその量と化合物の非存在下で合成されたGGPPの量に相当する量と比較することにより決定する。GGPSはHPLCにより精製され得、そしてLowryアッセイがこのタンパク質の量を測定するために使用され得る。GGPPはまた、アミノ酸配列分析によって同定され得る。ヒトGGPSは細胞内において産生され、そして機能するので、いかなるアンタゴニストも細胞内に存在せねばならない。hGGPSに対する潜在的なアンタゴニストは、細胞内で産生される抗体を含む。例えば、hGGPSを拮抗すると同定された抗体は、当該業者に公知の手順（例えば、hGGPSの機能を妨害する単鎖抗体をコードするDNAで適切な細胞を形質導入すること）により単鎖抗体として細胞内で産生され得る。別の潜在的なhGGPSアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、トリプルヘリックス形態あるいはアンチセンスDNAまたはRNAによって遺伝子発現を調節するために使用され得、これらの方法は両方とも、DNAまたはRNAにポリヌクレオチドが結合することに基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、長さにおいて約10から40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計され（トリプルヘリックス、Leeら、Nucl.Acids Res.、6:3073(1979);Cooneyら、Science、241:456(1988);およびD ervanら、Science、251:1360(1991)を参照のこと）、それにより、hPFGSの転写および産生が妨害される。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでそのmRNAとハイブリダイズし、そのmRNA分子のhGGPSポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス-Okano、J.Neurochem.、56:560(1991);遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド、CRC Press，Boca Rato n，FL(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、そのアンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAがhGGPSの産生を阻害するためにインビボで発現され得るように、細胞に送達され得る。潜在的なhGGPSアンタゴニストはまた、細胞膜を通過し、そしてポリペプチドの触媒部位に結合し占拠し得、それによって正常な生物学的活性を妨げるように、触媒部位を基質に接近させなくする低分子を含む。低分子の例として、小ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これに限定されない。 hGGPSポリペプチドおよびポリペプチドであるアンタゴニストはまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子治療」といわれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はポリペプチドで処置される患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法による本発明のポリペブチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示により当業者には明らかであるはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。ひとたびhGGPSポリペプチドが遺伝子治療を介して細胞内で発現されれば、それは中枢のシグナル伝達タンパク質を修飾し、それにより、多くの疾患を処置するのに用いられ得る。例えば、hGGPSはGGPPの存在を増大し、そして細胞に適切な形態学的表現型を回復させるのに用いられ得る。なぜならタンパク質プレニル化の非存在下では、細胞は丸い屈折した形態に発達するからである。これは、微小管の格子または中間のフィラメント構造における著しい変化を伴わないアクチンケーブルの選択的な欠失のためである。このことはプレニル化されたタンパク質が細胞内アクチンの状態および細胞の一般的な形態を調節することにおいて重大な役割を果たすことを示す。これは高コレステロール状態のためにロバスタチンのようなHMG-CoA還元酵素インヒビターの処置を受けている患者において重要である。 hGGPSはまた、HMG-CoA還元酵素インヒビター処置の副作用である、横紋筋融解（rhabdomyolysis）を処置するために使用され得、ここで筋細胞の形状は制御される。 hGGPSポリペプチドはまた、プログラムされた細胞死またはアポトーシスを抑制するために使用され得る。メバロン酸合成のインヒビターであるロバスタチンは、細胞に増殖および形態における変化を示させ、このようにして細胞はついにはアポトーシスを介して死滅するように誘導される。メバロン酸はイソプレン脂質の前駆体である。これは、細胞死を抑制する機構においてイソプレニル化タンパク質が関与することを指摘する。本発明のなおさらなる局面によれば、ヒトの疾患の処置用の治療学および診断学を開発する目的のために、科学的研究、DNAの合成、およびDNAベクターの作製に関するインビトロでの目的のための研究試薬として、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法が提供される。 hGGPSのアンタゴニストは、ガンに至る細胞の腫瘍性のトランスフォーメーションを妨げるために使用され得る。これらのタンパク質のCaaボックスのシステイン残基に転移したプレニルピロリン酸由来のプレニル基を有さない所定のタンパク質は、細胞の腫瘍性のトランスフォーメーションを妨げるように膜との相互作用に影響し得ない。簡単には、所定のプロトオンコジーン産物はそれらのオンコジーンの潜在力を発現するためにプレニル化を有さねばならない。 hGGPSアンタゴニストは、細胞内質細網状からゴルジ体への輸送に必要なrabタンパク質のイソプレニル化をブロックすることにより、ウイルスエンベロープ前駆体が、ゴルジ体区画に達することから防ぐ処置に使用され得る。アンタゴニストは、アンタゴニストが細胞膜を通過し得る場合には、例えば本明細書に後述するような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物において使用され得る。全長hGGPS遺伝子のフラグメントは、全長遺伝子を単離するためおよびこの遺伝子に高い配列類似性を有する他の遺伝子または類似した生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、一般的に少なくとも20塩基を有する。しかし、好ましくは、このプローブは、少なくとも30塩基を有し、一般的には50塩基を超えないが、より多数の塩基も有し得る。このプローブは、全長転写物と一致するcDNAクローン、および調節領域およびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを含む完全hGGPS遺伝子を含むゲノムクローンまたはクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの実施例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知のDNA配列を使用することによるhGGPS 遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするのに用いられ、プローブがライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするかが決定される。本発明はまた、変異したhGGPS核酸配列の存在に関連する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としてhGGPS遺伝子を使用することに関する。このような疾患は、異常な細胞形態、細胞死、およびヒト先天性脈絡欠如に関連し、Ｘ-結合形態の網膜変性が、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ遺伝子における変異により生じる。 hGGPS遺伝子における変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、組織生検、および剖検物質）より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析前にPCRを用いることにより酵素的に増幅され得る（Saikiら、Nature 、324:163-166(1986)）。RNAあるいはcDNAもまた同じ目的のために使用され得る。一例として、hGGPSをコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、hGGPS変異を同定および分析するのに使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により同定され得る。点変異は、放射性標識されたhGGPS RNAまたは、あるいは、放射性標識されたhGGPS アンチセンスDNA配列に、増幅させたDNAをハイブリダイズさせることにより検出され得る。完全に対合した配列は、RNaseA消化または融解温度の差により、ミスマッチした二重らせんと区別され得る。 DNA配列の相違に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成され得る。小さな配列の欠損または挿入は、高分離能ゲル電気泳動により視覚化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミドグラジエントゲル上で区別され得る。このゲル中で、異なるDNAフラグメントの移動度は、それらの特異的な融解温度または部分的融解温度に従い、異なる位置に、ゲル中で、遅滞される（例えば、Myersら、Science、230:1242(1985)）。特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNas e保護およびS1保護または化学的切断法（例えば、cottonら、PNAS、USA、85:439 7-4401(1985)））により示され得る。従って、特定のDNA配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切断、直接的なDNA配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型(RFLP)）、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法により達成され得る。より慣習的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析により検出され得る。本発明はまた、種々の組織におけるhGGPSタンパク質のレベルの変化を検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サンプルと比較したこのタンパク質の過剰発現は、オンコジーン／シグナル伝達タンパク質の膜局在における増大を示し、これは次にガンに関与する細胞の増大した増殖を示し得るからである。宿主に由来するサンプル中のhGGPSタンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者には周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを含む。 ELISAアッセイ(Coliganら、Current Protocols in Immunology,1(2),第６章、 (1991))は、最初にhGGPS抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調製される。このレポーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍光、またはこの実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を結合させる。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位は、BSAのような非特異的タンパク質を用いてインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合された任意のhGGPSタンパク質と結合する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液を用いて洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したレポーター抗体はここで、ディッシュ中に置かれ、hGGPSと結合した任意のモノクローナル抗体に対するレポーター抗体の結合を生じる。次いで、非付着レポーター抗体は、洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ基質が、ディッシュに加えられ、そして所定の時間内の発色量は、標準曲線と比較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在するhGGPSタンパク質量の測定値である。競合アッセイが、使用され得る。ここで、hGGPSに特異的な抗体は、固体支持体に付着し、そして標識hGGPSおよび宿主由来のサンプルは、固体支持体上を通過され、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出された標識の量は、サンプル中のhGGPS量と相関し得る。「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」アッセイにおいて、hGGPSは固体支持体上を通過され、そして固体支持体に付着した抗体と結合する。次いで、第２の抗体をhGGPSと結合させる。次いで、標識され、かつ第２の抗体に特異的な第３の抗体は、固体支持体上を通過され、そして第２の抗体に結合し、次いで、量が定量され得る。本発明のhGGPSポリペプチドおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的に有効な量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとして、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与様式に合わせるべきである。本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的組成物の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬剤または生物製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の注意を伴い得、この注意はヒトへの投与についての製造、使用、または販売の政府機関による認可を反映する。さらに、薬学的組成物は、他の治療的化合物と結びつけて用いられ得る。この薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、皮内経路のような便利な様式で投与され得る。この薬学的組成物は、特定の適応の処置および／または予防に有効な量で投与される。一般的に、それらは、少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、１日あたり約８mg /kg体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、投与量は、投与経路、症状などを考慮して、１日あたり約10μg/kg体重〜約１mg/kg体重である。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明に従うDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階である。簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的局在性の決定(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピング計画は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(flow-sorted )染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を含む。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基という短いcDNAで使用され得る；しかし、2,000bp よりも長いクローンの方が、簡便な検出のために充分なシグナル強度でユニークな染色体位置に結合しやすい。FISHは、ESTが由来するクローンの使用を必要とし、そしてこのクローンはより長いことが好ましい。例えば、2,000bpが良好であり、4,000bpはより良好であり、そして4,000bpを超える長さは、良好な結果に時間の合理的な割合を得るためにおそらく必要でない。この技術の総説としては、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergamon Pre ss，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させられ得る。このようなデータは、例えば、 V．McKusick，Mendelian Inheritance in Manに見出される(Johns Hopkins Univ ersity Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)。次いで、同一の染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子でありそうである。物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗体の発現に使用され得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い所定の方法および／または用語が記載される。「プラスミド」は、先行する小文字のｐおよび／またはそれに続く大文字および／または数字により命名される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントには、約２単位の酵素が約20μlの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には５〜5 0μgのDNAが20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃にての約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８: 4 057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件で、大体等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。記載しない限り、形質転換はGraham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52: 456-457(1973)の方法に記載のように行った。実施例１ hGGPS の細菌発現および精製 hGGPSをコードするDNA配列（ATCC受託番号第75900号）を、プロセスされたhGG PS核酸配列の５'および３'末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。hGGPSに対応するさらなるヌクレオチドを、５'および３'配列にそれぞれ添加する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５'A GAGGATCCGCCATGGAGAAGACTCAAGAA３'（配列番号３）を有し、BamHI制限酵素部位（下線）、それに続いてプロセスされたタンパク質の推定上の末端アミノ酸から始まるhGGPSコード配列の18ヌクレオチドを含む。３'配列５’CGTTGGCTAGCCTTAT TCATTTTCTTCTTTGGA３'（配列番号４）は、NheI部位（下線）に相補的な配列、それに続いてhGGPSの18ヌクレオチドを含む。これらの制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen、Inc．、Chatsworth、CA）上の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、およびpQE-9をBamHIおよびXbaIで消化する。増幅された配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列とインフレームで挿入する。次いで、連結混合物を用いて、M15/rep4の商標でQiagenから入手可能なE ．coliM15株をSambrook，J.ら、Molecular Clonin g: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4は、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kan^r）を付与するプラスミドpREP4のマルチコピーを含有する。形質転換体をLBプレート上で増殖する能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離して、制限酵素分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp（100μg/ml）および Kan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/N培養物を用いて1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、600の光学密度（O.D.⁶⁰⁰）が0.4と0.6との間になるまで増殖させる。次いで、 IPTG（「イソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にする。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化し、P/Oリーディングを解放することによって遺伝子発現の増加を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離により収集する。この細胞ペレットをカオトロピック薬剤6MグアニジンHCl中で可溶化する。明澄化の後、6-HIsタグを含有するタンパク質による緊密な結合を可能にする条件下でのニッケル−キレートカラムにおけるクロマトグラフィーによって、この溶液から可溶化hGGPSを精製する(Hochuli, Eら、J.Chromatography 471:177-184(1984))。hGGPS(90％純粋)を6MグアニジンH Cl pH5.0でカラムから溶出し、そして再生のために３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および２Mグルタチオン（酸化型）に調整する。この溶液中での12時間のインキュベーションの後、タンパク質を10mMリン酸ナトリウムに対して透析する。実施例２バキュロウイルス発現系を用いるhGGPSのクローニングおよび発現全長のhGGPSタンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75900号）を、この遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５'プライマーは、配列５’GCCAGAGGATCCGCCACCATGGAGAAGACTCAAGAAACA ３'（配列番号５）を有し、BamHI制限酵素部位（太字）、それに続いて真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する６ヌクレオチド（Kozak，M.,J． Mol．Biol.，196，947-950,(1987)）を含み、それはhGGPS遺伝子の最初の21ヌクレオチドの直ぐ後にある（翻訳開始コドン「ATG」に下線を付す）。３'プライマーは、配列５’CGTTGGCTAGCCTTATTCATTTTCTTCTTTGGA ３'（配列番号６）を有し、制限エンドヌクレアーゼNheIの切断部位およびhGGPS遺伝子の３' 非翻訳配列に相補的な18ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離する。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびNhe Iで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。このフラグメントを、F 2と称する。ベクターpA2(pVL941ベクターの改変体、下記)をバキュロウイルス発現系を用いるhGGPSタンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D.およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and inse ct cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bull etin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californica 核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続いて制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルの前に、ポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列は、コトランスフェクトされた野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列と両端で隣接する。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941，およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSummers ，M.D.、Virology，170:31-39）。プラスミドを制限酵素BamHIおよびXbaIで消化する。次いで、このDNAを、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびPstI を用いて、hGGPS遺伝子を有するプラスミド（pBac hGGPS）を含有する細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。５μgのプラスミドpBac-hGGPSを、リポフェクション法（Felgnerら Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Di ego，CA.）とともにコトランスフェクトする。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBachGGPSを、50μl の無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlリポフェクチンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清Grace培地１ml を有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。このプレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振盪する。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのGrace昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続ける。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行う。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いる。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、Li fe Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、20 0μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞を感染させるために用いる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存する。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させる。細胞を、感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスV-hGGPSで感染させる。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換える。42時間後、５μCi の³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加する。細胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そしてSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視化する。実施例３ COS 細胞における組換えhGGPSの発現プラスミドhGGPS HAの発現は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）に由来する：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。hGGPS前駆体全体およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。それゆえ、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson、H．Niman、R．Heighten、A Cherenson，M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 37，767）。本発明者らの標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体での組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： hGGPSをコードするDNA配列（ATCC受託番号第75900号）を、以下の２つのプライマーを用いてPCRにより構築した：５'プライマー５’GCCAGAGGATCCATGGAGAAGA CTCAAGAAACA ３'（配列番号７）は、BamHI部位とそれに続いて開始コドンから始まる21ヌクレオチドのhGGPSコード配列を含む；３'配列５’CGGCTGCTAGCCTCAAGC GTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATTCATTTTCTTCTTTGGA ３'（配列番号８）は、NheI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびhGGPSコード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、BamHI部位、インフレームで融合されたHAタグが続くhGGPSコード配列、HAタグに隣接する翻訳終了停止コドン、およびNheI部位を含む。PCRで増幅されたDNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、BamHIおよびNheI制限酵素により消化し、そして連結する。連結混合物を、E ．coliSURE株（Stratagene Cloning Systems,La Jolla ，CA）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析により試験する。組換えhGGP Sの発現のために、COS細胞を、DEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook，E．Fritsch．T． Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）により発現ベクターでトランスフェクトする。hGGPS HAタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）により検出する。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識する。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))(W ilson，I.ら、同上 37:767(1984)）で溶解する。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させる。沈降したタンパク質を 15％ SDS-PAGEゲルで分析する。実施例４ヒト組織におけるhGGPSの発現パターンヒト組織におけるhGGPSの発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析を行う。総細胞RNAサンプルを、RNAzol^TMB システム(Biotecx Laboratories，Inc. Houston，TX)を用いて単離する。指定したそれぞれのヒト組織から単離した約10 μgの総RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットする(Sambrook，FritschおよびManiatis，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press,(1989))。標識反応を、Stratagene Prime-Itキットによって50ng のDNAフラグメントを用いて行う。標識されたDNAを、Select-G-50カラムを用いて精製する。(5 Prime-3 Prime，Inc．Boulder，CO 80303)。次いで、フィルターを0.5M NaPO₄（pH7.4）および７％ SDS中で65℃にて一晩、1,000,000cpm/mlで放射標識された完全長hGGPS遺伝子とハイブリダイズする。次いでフィルターを、0.5×SSC、0.1％ SDSを用いて室温で二回、および60℃で二回洗浄した後、フィルターを増強スクリーンを用いて-70℃で一晩露出する。本発明の多くの改変および変形が上記の教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載された以外にも、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ (72)発明者ローゼン，クレイグエイ. アメリカ合衆国メリーランド 20882, レイトンズビル，ローリングヒルロード 22400 (72)発明者カークネス，エウェンエフ. アメリカ合衆国メリーランド 20832, オルニー，リトルビスタテラス 2519

Claims

【特許請求の範囲】１．以下からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド； (a)配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド； (b)ATCC寄託番号第75900号中に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドが配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドがATCC寄託番号第75900号のcDNAによってコードされるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号１に示されるコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．請求項２に記載のDNAを含むベクター。９．請求項８に記載のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。１０．ポリペプチドを産生させるプロセスであって、請求項９に記載の宿主細胞から前記DNAによってコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、プロセス。１１．ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するプロセスであって、請求項８に記載のベクターで細胞を形質転換する工程を包含する、プロセス。１２．請求項２に記載のDNAとハイブリダイズし得、かつhGGPS活性を有するポリペプチドをコードする単離されたDNA。１３．以下からなる群から選択されるポリペプチド：(i)配列番号２の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；および(ii)ATCC寄託番号第75900号のcDNAによりコードされるポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体。１４．前記ポリペプチドが配列番号２の推定アミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。１５．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト。１７．hGGPSの必要性を有する患者の処置のための方法であって：請求項１４に記載のポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与する工程を包含し、ここで該投与は、該ポリペプチドをコードするDNAを該患者に提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させることによって行われる、方法。１８．hGGPSを阻害する必要性を有する患者の処置のための方法であって：請求項１６に記載のアンタゴニストの治療的有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。１９．前記投与が、前記アンタゴニストをコードするDNAを前記患者に提供し、そして該アンタゴニストをインビボで発現させることによって行われる、請求項１８に記載の方法。２０．以下の工程を包含するhGGPSに対するアンタゴニストとして活性な化合物を同定するためのプロセス： hGGPS、スクリーニングされるべき化合物、およびhGGPSと相互作用し、GGPPを産生し得る基質を含有する混合物を組み合わせる工程；および形成されたGGPPの量を測定することによりhGGPSの該基質への結合を妨害する該化合物の能力を決定する工程。２１．宿主におけるhGGPS核酸配列中の変異に関する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプロセスであって：宿主由来のサンプル中のhGGPS核酸配列における変異を決定する工程を包含する、プロセス。２２．宿主由来のサンプル中の請求項１３に記載のポリペプチドの存在について分析する工程を包含する、診断プロセス。