JP2000106889A

JP2000106889A - 分泌マウスタンパク質ｓＦＲＰ―１に類似した新規ヒト遺伝子

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Publication number: JP2000106889A
Application number: JP11256823A
Authority: JP
Inventors: Erding Hu; フアーディング; Yuan Zhu; ヅーユアン
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2000-04-18
Also published as: JPH10327881A; EP0879885A1; CA2221836A1

Abstract

(57)【要約】【課題】 ATG-1709ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方法を
提供する。さらに、疾病の治療と、かかる疾病の診断ア
ッセイにおけるATG-1709ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドの使用方法も提供する。【解決手段】配列番号２のATG-1709ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
０％同一であり、かつATG-1709ポリペプチドの活性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
配列を含んでなるポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは７−ＴＭ受容体フリズルド(frizzled)ファミリーに
対する分泌タンパク質リガンドに関し、以後これをATG-
1709と記す。本発明はまた、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化するこ
とに関する。

【０００２】

【従来の技術】７−ＴＭ受容体に対するタンパク質リガ
ンドは、種々の生物学的作用を調節する重要な分子であ
る。グルカゴン、モルフィン、オピエート、トロンビン
はすべてこれらタンパク質リガンドの代表例である。例
えばグルカゴンは、グルカゴン受容体である７−ＴＭ受
容体と相互作用して、細胞グルコース調節機構にシグナ
ルを伝達することにより血中グルコース濃度を上昇させ
る。従って、７−ＴＭ受容体に対する新規タンパク質リ
ガンドの同定により正常状態および病的状態での多くの
生物学的プロセスへの新規な経路が明らかになるだろ
う。こうしたことは、７−ＴＭ受容体フリズルドファミ
リーに対する分泌タンパク質リガンドに治療用ターゲッ
トとしての確立され実証された歴史があることを示して
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、心臓病、高
血圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インスリン抵抗性糖
尿病、および中枢神経系(CNS)疾患を含むがこれらに限
らない、機能障害または疾病を予防し、改善し、治療す
る上で何らかの役割を果たす７−ＴＭ受容体フリズルド
ファミリーに対する分泌タンパク質リガンドの新たなメ
ンバーを同定して特性づける必要性が存在している。本
発明はかかるメンバーを提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、ATG-1709ポリペプチドおよび組換え物質、並び
にその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はAT
G-1709ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
に関する。こうした使用には、とりわけ、心臓病、高血
圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インスリン抵抗性糖尿
病、および中枢神経系(CNS)疾患の治療が含まれる。他
の態様では、本発明は、本発明により提供される物質を
用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方
法、並びに同定された化合物を用いてATG-1709の不均衡
と関連した状態を治療することに関する。本発明のさら
に他の態様は、不適当なATG-1709活性またはATG-1709レ
ベルと関連した疾病を検出するための診断アッセイに関
する。

【０００５】定義下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「ATG-1709」とは、
特に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはそのアレリック変異体を意味
する。「ATG-1709活性またはATG-1709ポリペプチド活
性」または「ATG-1709またはATG-1709ポリペプチドの生
物学的活性」とは、類似の活性、向上した活性、または
望ましくない副作用が低下したこれらの活性を含めて、
ATG-1709の代謝的または生理的機能を意味する。さら
に、前記ATG-1709の抗原的および免疫原的活性も含まれ
る。「ATG-1709遺伝子」とは、配列番号１で表されるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのア
レリック変異体および／またはそれらの相補体を意味す
る。

【０００６】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【０００７】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮ
ＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩
基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基があ
る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行わ
れてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的
または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび
細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含
する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも
包含する。

【０００８】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のあるまたはない環状であってもよい。環状の、分
枝した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の
天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によ
って製造することもできる。修飾としては、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結
合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル
化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメー
トの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシ
ル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解
処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミ
ノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。
例えば、PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERT
IES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Com
pany, New York, 1993; POSTTRANSLATIO NAL COVALENT
MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson編, Academ i
c Press, New York, 1983中のWold, F., Posttranslati
onal ProteinModification s: Perspectives and Prosp
ects, pgs. 1-12; Seifter ら, “Analysis for protei
nMod ifications and nonprotein cofactors", Meth En
zymol (1990) 182:626-646;およびRattan ら, “Protei
n Synthesis: Posttranslational Modifications and A
ging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこ
と。

【０００９】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を
生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異
体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。
一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が
全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるよ
うな相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意
に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ
酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミ
ノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっ
ても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体はアレリック変異体のように天然に存在す
るものでも、天然に存在することが知られていない変異
体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により調製することができる。

【００１０】「同一性」はヌクレオチド配列またはアミ
ノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級の整合
（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」そ
れ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表され
た技法を使って計算することができる。例えば、COMPUT
ATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M. 編, OxfordUn
iversity Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFO
RMATICS AND GENOMEPROJECTS, Smith, D.W. 編, Academ
ic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQ
UENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin, H.
G. 編, HumanaPress, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANA
LYSIS INMOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academi
c Press, 1987;および SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gri
bskov,M. and Devereux, J.編, M Stockton Press, New
York, 1991を参照のこと。２つのポリヌクレオチドま
たはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多数
存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者に
は公知である (Carillo,H. and Lipton, D., SIAM J Ap
plied Math (1988) 48:1073) 。２つの配列間の同一性
または類似性を決定するために汎用される方法として
は、Guide to HugeComputers, Martin J. Bishop 編, A
cademic Press, San Diego, 1994 および Carillo, H.
and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073
に記載される方法があるが、これらに限らない。同一
性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに
集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を
決定するための好適なコンピュータプログラム法として
は、GCS プログラムパッケージ(Devereux, J.ら, Nucle
ic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLAST
N、FASTA (Atschul, S.F.ら, J Molec Biol (1990) 21
5:403)があるが、これらに限らない。

【００１１】一例として、配列番号１の基準ヌクレオチ
ド配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一
性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配
列番号１の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌク
レオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうること
を除けば、基準配列と同一であることを意図している。
言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを得るには、基準配列中の５％までのヌクレオチドを
欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または
基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド
数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突
然変異は、基準ヌクレオチド配列の５'もしくは３'末端
位置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、
基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配
列内に１以上の連続するグループとして配置することが
できる。

【００１２】同様に、配列番号２の基準アミノ酸配列に
対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペ
プチド配列が配列番号２の基準アミノ酸配列のそれぞれ
１００アミノ酸につき最高で５つのアミノ酸変更を含み
うることを除けば、基準配列と同一であることを意図し
ている。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失
させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列
中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列
に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準ア
ミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、また
はこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中
のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以
上の連続するグループとして配置することができる。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド一つの態様において、本発明はATG-1709ポリペプチド
（またはATG-1709タンパク質）に関する。このATG-1709
ポリペプチドには、配列番号２および４のポリペプチド
だけでなく、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプ
チド、その全長において配列番号２のアミノ酸配列と少
なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好
ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチドも含まれる。さらに、少なくとも９７〜
９９％同一であるものが特に好適である。また、その全
長において配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０
％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ
酸配列を有するポリペプチドもATG-1709ポリペプチドに
含まれる。さらに、少なくとも９７〜９９％同一である
ものが特に好適である。ATG-1709ポリペプチドはATG-17
09の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好まし
い。

【００１４】ATG-1709ポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形であっても、融合タンパク質のような、より大き
いタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加の
アミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなア
ミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ
配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列な
どがある。

【００１５】また、ATG-1709ポリペプチドの断片も本発
明に含まれる。こうした断片は全体的に前記ATG-1709ポ
リペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部
とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。ATG-1709ポリペプチドと同様に、断片は「フリース
タンディング」（それ自体で独立）していても、より大
きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその
大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましく
は一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発
明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見
当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、
６１−８０、８１−１００、および１０１からATG-1709
ポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、
「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、
５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えた
り減ったりした範囲を含むものである。

【００１６】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、AT
G-1709ポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケー
ション(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、α
ヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシー
ト形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、
β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合
領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造
的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適で
ある。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片であ
る。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、
その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減
少した断片を含めて、ATG-1709活性を媒介するものであ
る。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫
原性がある断片も含まれる。

【００１７】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めたATG-1709の生物学的活性を保持することが
好ましい。中でも、最も好ましい断片は配列番号４のア
ミノ酸配列を有するものである。特定された配列および
断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型
は同類アミノ酸置換により目的と異なるもの、すなわ
ち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されている
ものである。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Leu
と Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の
間；Asn とGln の間；塩基性残基 LysとArg の間；また
は芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に、数個、５
〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の
組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適
である。

【００１８】本発明のATG-1709ポリペプチドは任意の適
当な方法で製造することができる。このようなポリペプ
チドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組
換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造された
ポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造
されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。

【００１９】本発明のポリヌクレオチド本発明のもう一つの態様はATG-1709ポリヌクレオチドに
関する。ATG-1709ポリヌクレオチドには、ATG-1709ポリ
ペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレ
オチド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチ
ドが含まれる。さらに特定すると、本発明のATG-1709ポ
リヌクレオチドとしては、配列番号２のATG-1709ポリペ
プチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１およ
び３の特定配列を有するポリヌクレオチドがある。さら
に、ATG-1709ポリヌクレオチドには、配列番号２のATG-
1709ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長
において少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオ
チド配列と全長において少なくとも８０％同一であるヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。こ
れに関連して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレ
オチドが好適であり、特に少なくとも９５％同一である
ものが好適である。さらに、少なくとも９７％同一であ
るものがより好ましく、少なくとも９８〜９９％同一で
あるものがより一層好ましく、少なくとも９９％同一で
あるものが最も好ましい。また、増幅反応に使用できる
条件下、またはプローブやマーカーとして使用できる条
件下でハイブリダイズするのに十分な、配列番号１中に
含まれるヌクレオチド配列との同一性を有するヌクレオ
チド配列もATG-1709ポリヌクレオチドに含まれる。本発
明はまた、このようなATG-1709ポリヌクレオチドと相補
的なポリヌクレオチドを提供する。

【００２０】本発明のATG-1709は、ヒトATG-1709をコー
ドするｃＤＮＡの配列決定の結果により示されるよう
に、７−ＴＭ受容体フリズルドファミリーに対する分泌
タンパク質リガンドの他のタンパク質と構造的に関連し
ている。配列番号１のｃＤＮＡ配列は配列番号２の318
個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープ
ンリーディングフレーム（ヌクレオチド番号99−1052）
を含んでいる。表２のアミノ酸配列（配列番号２）は17
9個のアミノ酸残基においてヒト分泌縮れ連関タンパク
質(Finch,P.W., He,X.,Kelle,M.J., Uren,A.,Schaudie
s,P., Popescu, N.C.,Rudikoff,S., Aaronson,S.A.,Var
mus,H.E., and Rubin,J.S. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
94 ,6770-6775(1997))と約56％同一である（FASTA-P使
用）。さらに、このATG-1709ポリペプチドはマウス分泌
フリズルド関連タンパク質sFRP−１と55％の同一性を有
する(Rattner,A.,Hsieh,J.-C.,Smallwood,P.M., Gilber
t, D.J., Copeland,N.G., Jenkins,N.A.and Nathans, P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94 ,2 859-2863(1997))。表
１のヌクレオチド配列（配列番号１）は1281個のヌクレ
オチド残基においてヒト分泌フリズルド関連タンパク質
(Finch,P.W.,He,X., Kelle, M.J., Uren,A.,Schaudies,
P., Popescu,N.C., Rudikoff,S., Aaronson,S.A.,Varmu
s,H.E., and Rubin,J.S. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 9
4,6770-6775(199 7))と約69％同一である（FASTA-N使
用）。さらに、このATG-1709ポリヌクレオチドはマウス
分泌フリズルド関連タンパク質sFRP−１と68％同一であ
る(Rattne r,A.,Hsieh, J.-C., Smallwood,P.M., Gilbe
rt,D.J., Cope land,N.G., Jenkins, N.A. and Natha n
s, J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94 ,2859-2863 (199
7))。したがって、本発明のATG-1709ポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同ポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／
特性をもつことが予測され、それらの有用性は当業者に
は自明である。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【表２】

【００２３】ATG-1709をコードする本発明の一つのポリ
ヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリー
ニングにより、ヒト小腸の細胞中のｍＲＮＡから誘導さ
れたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレスド・シー
クエンス・タグ（expressedsequence tag: EST)分析 (A
dams, M.D. ら, Science (1991) 252:1651-1656; Adam
s, M.D. ら, Nature (1992) 355:632-634; Adams, M.D.
ら, Nature (1995) 377 Sup p:3-174)を用いて得ること
ができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤ
ＮＡライブラリーのような天然源から得ることができ、
商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することも
できる。

【００２４】配列番号２のATG-1709ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリペプ
チドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号99-105
2）と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮重）
のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコードする
配列であってもよい。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドをATG-1709ポリ
ペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌ
クレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列または
その断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもし
くは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タン
パク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする
もの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペ
プチドのコード配列またはその断片が含まれる。例え
ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列
がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例
として、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, In
c.)により提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ
−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグである。また、
このポリヌクレオチドは５'および３'非コード配列、例
えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシング
およびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、
およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。

【００２６】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、表２のATG-1709ポリペプチドのアミノ酸配列（配
列番号２）を含むATG-1709変異型をコードするポリヌク
レオチドである。中でも、本発明の好ましいポリヌクレ
オチドは表４のアミノ酸配列（配列番号４）をコードす
る表３（配列番号３）中に含まれるポリヌクレオチドで
ある。

【００２７】

【表３】

【００２８】

【表４】

【００２９】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００３０】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発
明のポリヌクレオチドは、ATG-1709ポリペプチドをコー
ドする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するた
めに、また、ATG-1709遺伝子との配列類似性が高い他の
遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソロ
グ体(ortholog)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いることができる。このようなハイブリダイゼーシ
ョン技法は当業者には公知である。一般的に、これらの
ヌクレオチド配列は目的のヌクレオチド配列と８０％、
好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一である。
プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、
好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチ
ドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜
５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００３１】一実施態様において、ATG-1709ポリペプチ
ド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体
を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、
配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する
標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニ
ングし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでな
る。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に
公知である。かくして、もう一つの態様では、本発明の
ATG-1709ポリヌクレオチドはさらに、配列番号１のヌク
レオチド配列またはその断片（配列番号３の断片を含
む）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む
ものである。ATG-1709ポリペプチドも、前記のハイブリ
ダイゼーション条件により得られたヌクレオチド配列に
よりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチ
ドを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件は上で定義したとおりであるか、または、50% ホル
ムアミド、５×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナト
リウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)、５×Denhar
dt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し
剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で一
夜インキュベートし、次いでフィルターを 0.1×SSC 中
約６５℃で洗浄する条件である。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００３３】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００３４】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davis ら, BASIC METHODS INMOLE
CULAR BIOLOGY (1986)および Sambrook ら, MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載
される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクシ
ョン、トランスベクション(transvection)、マイクロイ
ンジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクシ
ョン、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ
ローディング(scrape loading)、射出導入(ballistic i
ntroduction)または感染により行うことができる。

【００３５】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００３６】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。

【００３７】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００３８】スクリーニングアッセイで使用するためAT
G-1709ポリペプチドを発現させようとする場合、そのポ
リペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先
立って細胞を回収する。ATG-1709ポリペプチドが培地に
分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、そ
の細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する
必要がある。

【００３９】組換え細胞培養物からATG-1709ポリペプチ
ドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタ
ノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロ
マトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め
た公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、
高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリ
ペプチドが単離および／または精製中に変性されるとき
は、タンパク質を再生させるための公知の技法を用い
て、活性のあるコンフォメーションを復元することが可
能である。

【００４０】診断アッセイ本発明はまた、診断薬としてのATG-1709ポリヌクレオチ
ドの使用に関する。機能障害と関連したATG-1709遺伝子
の変異型の検出は、ATG-1709の過少発現、過剰発現また
は変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診
断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツー
ルを提供するだろう。ATG-1709遺伝子に変異がある個体
を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すこ
とができる。

【００４１】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを
使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化によ
り検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ATG-1709
ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定で
きる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とは
ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区
別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いる
または用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度
の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検
出できる（例えば、Myers ら, Science (1985) 230:124
2 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアー
ゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよび
Ｓ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確
認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19
85) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、
例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行う
ため、ATG-1709ヌクレオチド配列またはその断片を含む
オリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することが
できる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有
し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含め
た分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用い
られている（例えば、M. Chee ら, Science, Vol.274,
pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００４２】診断アッセイは、前記の方法によりATG-17
09遺伝子の変異を検出することで、心臓病、高血圧、心
血管疾患、腎臓病、肥満、インスリン抵抗性糖尿病、お
よび中枢神経系(CNS)疾患への罹りやすさを診断または
判定する方法を提供する。

【００４３】さらに、被験者から得られたサンプルから
ATG-1709ポリペプチドまたはATG-1709ｍＲＮＡのレベル
の異常な低下または増加を測定する方法により、心臓
病、高血圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インスリン抵
抗性糖尿病、および中枢神経系(CNS)疾患の診断を下す
ことができる。発現の低下または増加は、当技術分野で
公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣ
Ｒ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザ
ンブロット、その他のハイブリダイゼーション法により
ＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から得られ
たサンプル中のATG-1709ポリペプチドのようなタンパク
質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業者によく
知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオイム
ノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分
析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００４４】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、疾病、特に心臓病、高血圧、心血管疾患、腎臓
病、肥満、インスリン抵抗性糖尿病、および中枢神経系
(CNS)疾患または該疾病への罹りやすさを診断するため
のキットに関し、このキットは、(a) ATG-1709ポリヌク
レオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配
列）もしくはその断片、(b) (a) のヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列、(c) ATG-1709ポリペプチド
（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしくはそ
の断片、または(d) ATG-1709ポリペプチド（好ましく
は、配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、を含ん
でなる。このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c)
または (d)が実質的な構成成分であることが理解されよ
う。

【００４５】染色体アッセイ本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance inMan (Johns Hopkins University
Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能) 中
に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピング
された遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣接
した遺伝子の共遺伝）により同定する。患者と正常個体
とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることがで
きる。患者の一部または全部に変異が観察されて、どの
正常個体にも観察されない場合は、その変異が疾病の原
因である可能性がある。

【００４６】抗体本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、ATG-1709ポリペプチド
に免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使
用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が
従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親
和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い
親和性を有することを意味する。

【００４７】ATG-1709ポリペプチドに対する抗体は、慣
用のプロトコールを用いて、動物(好ましくはヒト以
外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノ
クローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により
産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることがで
きる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Kohler, G.
およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、ト
リオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法 (Kozbor
ら, ImMunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技法(Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 198
5) などがある。

【００４８】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。ATG-1709ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、
心臓病、高血圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インスリ
ン抵抗性糖尿病、および中枢神経系(CNS)疾患の治療に
使用できる可能性がある。

【００４９】ワクチン本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に心臓病、高血
圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インスリン抵抗性糖尿
病、および中枢神経系(CNS)疾患から前記動物を防御す
るための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるの
に十分なATG-1709ポリペプチドまたはその断片を哺乳動
物に接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態
様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるよ
うな免疫学的応答を引き出すために、in vivo でATG-17
09ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介して
ATG-1709ポリペプチドを供給することを含んでなる、哺
乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関する。

【００５０】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてATG-1709ポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン
製剤（組成物）に関し、この組成物はATG-1709ポリペプ
チドまたはATG-1709遺伝子を含有する。ワクチン製剤は
適当な担体をさらに含んでいてもよい。ATG-1709ポリペ
プチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、
筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含む）に投与するこ
とが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液
と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注
射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性およ
び非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容
器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイ
アル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の
液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管する
こともできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増
強するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュ
バント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含
んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、
ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。

【００５１】スクリーニングアッセイ本発明のATG-1709ポリペプチドは、このポリペプチドを
活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害
する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）
のスクリーニング法において使用することができる。こ
うして、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細
胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合
物からアゴニストまたはアンタゴニストを評価し同定す
るためにも用いられる。これらのアゴニストまたはアン
タゴニストは、本発明のポリペプチドの、場合によっ
て、天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、
酵素などであってよく、また、本発明のポリペプチドの
構造的または機能的な模擬物であってもよい（Coligan
ら, Current Protocols in ImMunology 1(2): Chapter
5 (1991)を参照のこと）。

【００５２】ATG-1709ポリペプチドは多くの病理を含め
て多数の生物学的機能に関与している。したがって、一
方ではATG-1709ポリペプチドを刺激し、他方ではATG-17
09ポリペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を
見つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストは心
臓病、高血圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インスリン
抵抗性糖尿病、および中枢神経系(CNS)疾患のような症
状の治療および予防目的で用いられる。アンタゴニスト
は心臓病、高血圧、心血管疾患、腎臓病、肥満、インス
リン抵抗性糖尿病、および中枢神経系(CNS)疾患のよう
な症状のさまざまな治療および予防目的で使用しうる。

【００５３】一般に、こうしたスクリーニング法はATG-
1709ポリペプチドを発現する適当な細胞、またはATG-17
09ポリペプチドに応答する適当な細胞を用いるものであ
る。この種の細胞には哺乳動物、酵母、ドロソフィラ由
来の細胞または大腸菌細胞が含まれる。次いで、ATG-17
09ポリペプチドを発現する細胞（もしくは発現されたポ
リペプチドを含む細胞膜）またはATG-1709ポリペプチド
に応答する細胞を試験化合物と接触させて、その結合ま
たは機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候補化
合物と接触させた細胞の能力を、接触させなかった同一
細胞とATG-1709活性に関して比較する。このタンパク質
はこれと相互作用するあらゆるタンパク質受容体のスク
リーニングのために使用できる。例えば、GST融合タン
パク質は細菌またはバキュロウイルス系で産生され、AT
G-1709に結合する更なる受容体を同定するために使用で
きる。さらに、このATG-1709タンパク質は細菌および／
またはバキュロウイルス内で大量に生産が可能で、古典
的結合アッセイにおいて相互作用する受容体を探すため
にヨウ素化することができる。また、このタンパク質は
古典的競合実験においてこのタンパク質の７−ＴＭ受容
体フリズルドへの結合を阻害する潜在的なインヒビター
を特徴づける場合にも有用である。

【００５４】これらのアッセイでは候補化合物の結合を
簡単に試験することができ、そこでは候補化合物と直接
または間接に結合された標識により、または標識した競
合物質との競合を用いるアッセイにより、ATG-1709ポリ
ペプチドを担持する細胞への付着が検出される。さら
に、これらのアッセイでは、ATG-1709ポリペプチドを担
持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物がATG-
1709ポリペプチドの活性化により生ずるシグナルを結果
的にもたらすか否かを試験することができる。一般的
に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッ
セイされ、そして候補化合物の存在がアゴニストによる
活性化に与える影響が調べられる。

【００５５】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
とATG-1709ポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混
合物をつくり、この混合物中のATG-1709活性を測定し、
そしてこの混合物のATG-1709活性を標準と比較する各ス
テップを単に含むだけでよい。

【００５６】また、ATG-1709のｃＤＮＡ、タンパク質ま
たはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内での
ATG-1709ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加
化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てるこ
とができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によ
りモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、
ATG-1709タンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベル
を測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、こ
れは適切に操作された細胞または組織からのATG-1709の
生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニス
トまたはアゴニストともいう）の探索に用いることがで
きる。

【００５７】膜結合受容体または可溶性受容体が存在す
るのであれば、当技術分野で公知の標準的な受容体結合
法によりこの種の受容体を同定するためにATG-1709タン
パク質を用いることができる。こうした受容体結合法に
は、限定するものではないが、リガンド結合および架橋
アッセイがあり、このアッセイでは、ATG-1709を放射性
アイソトープ（例：125I）で標識するか、化学的に修飾
（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適した
ペプチド配列に融合させ、そして推定上の受容体源（細
胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など）とイン
キュベートする。その他の方法としては、表面プラズモ
ン共鳴および分光学のような生物物理的方法がある。受
容体の精製およびクローニングに用いることに加えて、
これらの結合アッセイは、もし存在するのであれば、AT
G-1709のその受容体への結合と競合するATG-1709のアゴ
ニストまたはアンタゴニストを同定するために用いるこ
ともできる。スクリーニングアッセイを行うための標準
的な方法は当技術分野でよく理解されている。

【００５８】ATG-1709ポリペプチドの潜在的なアンタゴ
ニストの例としては、抗体、ある場合には、ATG-1709ポ
リペプチドの、場合により、リガンド、基質、受容体、
酵素などと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしく
はタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素
などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合する
が応答を誘導しない（それゆえポリペプチドの活性を妨
げる）小分子などがある。

【００５９】かくして、他の態様において、本発明は、
ATG-1709ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、
リガンド、受容体、基質、酵素など、またはATG-1709ポ
リペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定
するためのスクリーニングキットに関し、このキット
は、(a) ATG-1709ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）(b) ATG-1709ポリペプチド（好まし
くは、配列番号２のポリペプチド）を発現する組換え細
胞、(c) ATG-1709ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）を発現する細胞膜、または(d) ATG-
1709ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプ
チド）に対する抗体、を含んでなる。このようなキット
において、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成
成分であることが理解されよう。

【００６０】予防および治療法本発明は、ATG-1709ポリペプチド活性の過剰量と不足量
のどちらにも関係した心臓病、高血圧、心血管疾患、腎
臓病、肥満、インスリン抵抗性糖尿病、および中枢神経
系(CNS)疾患などの異常な状態の治療法を提供する。ATG
-1709ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつ
かのアプローチが利用可能である。一つのアプローチ
は、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結合
をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑
制することで異常な状態を軽減することにより、ATG-17
09ポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で、前記
の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容され
る担体とともに患者に投与することを含んでなる。もう
一つのアプローチでは、内因性のATG-1709ポリペプチド
との競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体などと結
合する能力がまだある可溶性形態のATG-1709ポリペプチ
ドを投与することができる。このような競合剤の典型的
な例はATG-1709ポリペプチドの断片である。

【００６１】別のアプローチでは、内因性のATG-1709ポ
リペプチドとの競合状態でリガンドと結合する能力がま
だある可溶性形態のATG-1709ポリペプチドを投与するこ
とができる。このような競合剤の典型的な例はATG-1709
ポリペプチドの断片である。

【００６２】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性ATG-1709ポリペプチドをコードする遺伝子
の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、
体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列
の使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCPre
ss, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J Neurochem
(1991) 56:560 を参照のこと。あるいはまた、この遺
伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを
供給することもできる。例えば、Lee ら, Nucleic Acid
s Res (1979) 6:3073; Cooney ら, Science (1988) 24
1:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参照の
こと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することも
できるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させること
もできる。

【００６３】ATG-1709およびその活性の過少発現に関係
した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプロー
チを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有
効な量のATG-1709ポリペプチドを活性化する化合物（す
なわち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体
とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを
含んでなる。別法として、患者の関連細胞においてATG-
1709を内因的に産生させるために遺伝子治療を用いるこ
とができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌク
レオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構
築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質
導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、
パッケージング細胞は目的の遺伝子を含有する感染性の
ウイルス粒子を産生するようになる。in vivo での細胞
処理およびin vivo でのポリペプチド発現のために、こ
れらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に
関しては、HumanMolecular Genetics, T Strachanand A
P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)中の
Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genet
ic-based Therapeutic Approaches(およびその中の引用
文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量の
ATG-1709ポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに
投与することである。

【００６４】製剤および投与可溶性形態のATG-1709ポリペプチドのようなペプチド、
アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分
子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化するこ
とができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペ
プチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または
賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らな
い。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当
技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記
の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器
を含んでなる医薬用パックおよびキットに関する。本発
明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用して
も、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用して
もよい。

【００６５】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００６６】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００６７】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００６８】

【実施例】以下の実施例は、詳細に記載した場合を除い
て、当業者に公知で日常的に使用する一般的な技術を使
用して行なった。これらの実施例は本発明を例示するも
ので、限定するものではない。

【００６９】全長ATG-1709のクローニング：部分的なク
ローン(ATG-1709,HGS EST #458643)をHuman Genome Sci
enceデータベースのランダム検索により最初に同定し
た。この部分クローン(481bp)はマウスsFRP-1に顕著な
相同性(36アミノ酸に対して65％)を示した。全長ｃＤＮ
Ａを得るために、５'および３'ＲＡＣＥ両方を記載の通
りに(J.Sambrook、E.F.Frit chおよびT.Maniatis(1989)
A Laboratory Manaul第２編、Cold Spring Harbor Lab
o ratory Press、Cold Spring Harbor、NewYork)行なっ
た。ＲＡＣＥ生成物をＴＡクローニングベクター(In Vi
trogene Inc.)にクローン化し、この細菌クローンを選
択し配列決定した。318アミノ酸のポリペプチドをコー
ドするオープンリーディングフレームを含む全長にして
1281bpが配列決定された。FASTA分析によりこのポリペ
プチドがマウスおよびヒトのフリズルド関連タンパク質
に高い相同性を有することが示された。

【００７０】真核細胞および原核細胞におけるATG-1709
の発現：実施例１大腸菌におけるATG-1709の発現および精製 ATG-1709は分泌ヒトタンパク質をコードしており、この
タンパク質はＮ末端に開裂可能な分泌シグナルペプチド
を有する。従って原核生物の発現系(大腸菌)を用いて、
細菌により発現されるヒスチジンタグ付きATG-1709のＣ
末端部分を持つATG-1709タンパク質を高純度で大量に産
生することができる。詳細な実験手順を以下に記載す
る。本実施例での細菌発現のために細菌の発現ベクター
pQE60を使用した(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chats
worth,CA,91311)。pQE60はアンピシリン抗生物質耐性(A
mp^r)をコードし、細菌の複製起点(ori)、IPTG誘導プロ
モーター、リボソーム結合部位（RBS）、QIAGEN社から
販売されているニッケル-ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）ア
フィニティー樹脂によるアフィニティー精製を可能とす
るヒスチジン残基をコードする６コドン、および適当な
単一制限酵素開裂部位を含有する。ポリペプチドをコー
ドしている挿入ＤＮＡ断片がそのポリペプチドのカルボ
キシル末端に共有結合的に連結された６ヒスチジン残基
（すなわち、６Ｘ Hisタグ）をもつポリペプチドを発現
するように、これらの要素を配置させた。

【００７１】疎水性リーダー配列を欠くATG-1709タンパ
ク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ATG-1709
タンパク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニールす
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーと、ｃＤＮＡコ
ード配列の３'側の寄託構築物中の配列にアニールする
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託ｃ
ＤＮＡクローンから増幅した。pQE60ベクターへのクロ
ーニングを容易にする制限部位を含有する追加のヌクレ
オチドをそれぞれ５'および３'配列に付加した。

【００７２】成熟タンパク質のクローニングのために、
５'プライマーは配列５'-GAATTCATGCG GGCGGCGGCGGCGGC
GG-３'(配列番号５)を有し、EcoRI制限部位(下線部分)
の後に表１の成熟ATG-1709配列のアミノ末端コード配列
に相補的な21ヌクレオチドが存在する。当業者であれ
ば、タンパク質コード配列中の５'プライマーの開始点
を変化させて成熟体よりも短いかまたは長い完全なタン
パク質の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増
幅することが当然できるだろう。３'プライマーは配列
５'-GAATTCCTACGGGGCGGCAGAACCCCAC-３'(配列番号６)を
有し、EcoRI制限部位(下線部分)の後に表１のATG-1709
配列中の終止コドンの直前の３'末端のコード配列に相
補的な21ヌクレオチドが存在する。その際、前記のコー
ド配列はそのリーディングフレームをpQE60ベクターの
６Hisコドンのリーディングフレームと共に維持するよ
うに該制限部位と整合させた。増幅したATG-1709ＤＮＡ
断片およびpQE60ベクターをEcoRIにより消化し、次いで
消化したＤＮＡを互いに連結した。制限したpQE60ベク
ター中にATG-1709ＤＮＡを挿入することで、IPTG誘導プ
ロモーターの下流に、かつ開始AUGコドンおよび６ヒス
チジンコドンとインフレーム(in-flame)でATG-1709タン
パク質コード領域が配置された。

【００７３】実施例２大腸菌におけるタグ無しATG-1709の発現と精製タグが生物活性を阻害しうる場合は、大腸菌においてど
ちらの末端にもタグをもたないATG-1709を発現させるこ
とができる。以下に詳細な手順を示す。本実施例の細菌
発現のために細菌発現ベクターpQE60を使用した(QIAGEN
Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)。pQE60
はアンピシリン抗生物質耐性(Amp^r)をコードし、細菌の
複製起点(ori)、IPTG誘導プロモーター、リボソーム結
合部位（RBS）、QIAGEN社により販売されているニッケ
ル-ニトリロ三酢酸（Ni-NTA）アフィニティー樹脂によ
るアフィニティー精製を可能とするヒスチジン残基をコ
ードする６コドン、および適当な単一制限酵素開裂部位
を含有する。ポリペプチドをコードしている挿入ＤＮＡ
がそのポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合的に
連結された６ヒスチジン残基（すなわち、“６Ｘ Hisタ
グ"）を発現するようにこれらの要素を配置させた。し
かし、本実施例においては、６Hisコドンの翻訳が阻止
され、従って該ポリペプチドが６X Hisタグ無しで産生
するように、該ポリペプチドをコードする配列を挿入し
た。

【００７４】疎水性リーダー配列を欠くATG-1709タンパ
ク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ATG-1709
タンパク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニールす
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーと、ｃＤＮＡコ
ード配列の３'側の寄託構築物中の配列にアニールする
ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託し
たｃＤＮＡクローンから増幅した。pQE60ベクターへの
クローニングを容易にする制限部位を含有する追加のヌ
クレオチドをそれぞれ５'および３'配列に付加した。

【００７５】成熟タンパク質のクローニングのために、
５'プライマーは配列５'-GAATTCATGCG GGCGGCGGCGGCGGC
GG-３'(配列番号５)を有し、EcoRI制限部位(下線部分)
の後に表１の成熟ATG-1709配列のアミノ末端のコード配
列に相補的な21ヌクレオチドが存在する。当業者であれ
ばタンパク質コード配列中の５'プライマーの開始点を
変化させて、成熟体よりも短いかまたは長い完全なタン
パク質の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増
幅することが当然できるだろう。３'プライマーは配列
５'-GAATTCCTAGTGGGGTTCTGCCGCCCC GTAG-３'(配列番号
７)を有し、EcoRI制限部位(下線部分)の後に表１のATG-
1709ＤＮＡ配列中の終止コドンの直前の３'末端のコー
ド配列に相補的な21ヌクレオチドが存在する。

【００７６】増幅したATG-1709ＤＮＡ断片およびpQE60
ベクターをEcoRIにより消化し、次いで消化したＤＮＡ
を互いに連結した。制限したpQE60ベクター中にATG-170
9ＤＮＡを挿入することで、IPTG誘導プロモーターの下
流に、かつ開始AUGコドンとインフレームでその終止コ
ドンを含むATG-1709タンパク質コード領域が配置され
た。終止コドンを挿入したことにより、その挿入点の下
流の６ヒスチジンコドンの翻訳が阻止された。

【００７７】ライゲーション混合物をSambrookら, MOLE
CULAR CLONING: A LABORATORY MANUA L,第2編, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.(1989)に記載されるような一般的な手法を用いて、
受容能のある(competent)大腸菌に形質転換した。lacリ
プレッサーを発現してカナマイシン耐性(Kan^r)を与える
プラスミドpREP４の複数のコピーを含有する、大腸菌株
Ｍ15／rep４を、ここに記載の実施例を行うために使用
した。ATG-1709タンパク質の発現に適している多くの菌
株の一つに過ぎないこの株は、QIAGEN社から市販されて
いる。形質転換体をアンピシリンとカナマイシンの存在
下でＬＢプレート上に生育するその能力により同定し
た。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、クロ
ーン化ＤＮＡの正体を制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配
列決定により確認した。

【００７８】目的の構築物を含有するクローンをアンピ
シリン(100mg／ml)およびカナマイシン(25mg／ml)の両
方を補充したＬＢ培地中で液体培養下に一晩生育させ
た。この一晩培養物を用いて約1：25〜1：250の希釈率
で大規模な培養物に接種した。細胞を600nm(OD600)で0.
4〜0.6の光学濃度まで増殖させた。次にイソプロピル-b
-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度1mMまで加
え、lacＩリプレッサーを不活性化してlacリプレッサー
感受性プロモーターからの転写を誘導した。続いて細胞
を更に３〜４時間インキュベートし、その後遠心分離し
て細胞を回収した。

【００７９】次に細胞を６Ｍグアニジン-HCl(pH８)中
で、４℃において３〜４時間攪拌し、その細胞破片を遠
心分離で取り除き、ATG-1709を含有する上清を200mM Na
Clを補充した50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH６)に対して
透析した。また、このタンパク質をプロテアーゼ阻害剤
含有500mM NaCl、20％グリセロール、25mMトリス／HClp
H7.4に対し透析してうまく再生することができた。復元
の後、このタンパク質をイオン交換、疎水性相互作用、
サイズ排除クロマトグラフィーにより精製することがで
きた。また、抗体カラムのようなアフィニティークロマ
トグラフィー操作により、純粋なATG-1709タンパク質を
得ることができた。精製したタンパク質は4℃で保存す
るかまたは−80℃で凍結保存した。

【００８０】実施例３バキュロウイルス発現系におけるATG-1709タンパク質の
クローニングと発現本実施例では、プラスミドシャトルベクターpＡ２を用
いて、Summersら、A Manua l of Methods for Baculovi
rus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Te
xas Agricultura l Experimental Station Bulletin N
o.1555(1987)に記載の一般的な方法により、バキュロウ
イルスに天然で関連のある分泌シグナル(リーダー)配列
を含む完全なタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡ
を挿入して成熟ATG-1709タンパク質を発現させた。この
発現ベクターはAutographa californi ca 核多角体病ウ
イルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーターと、
該プロモーターに続いてBamHIおよびAsp718のような格
好の制限部位を含有する。シミアンウイルス40(SV40)の
ポリアデニル化部位を効率のよいポリアデニル化のため
に使用できる。組換え体ウイルスの選択を容易にするた
めに、このプラスミドは弱いドロソフィラプロモーター
の制御下にある大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を同一方向で含有し、その後にポリヘドリン遺伝子の
ポリアデニル化シグナルを含有する。挿入した遺伝子の
両端には、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介相同組換
えを行ってクローン化ポリヌクレオチドを発現する生存
能のあるウイルスを生み出すための、ウイルス配列が存
在していた。

【００８１】pAc373、pVL941およびpAcIM1のような多く
の他のバキュロウイルスベクターを上記ベクターの代わ
りに使ってもよい。ただし、これらのバキュロウイルス
構築物はシグナルペプチドおよび必要なインフレームAU
Gを含め、転写、翻訳、分泌などのための適切に位置し
たシグナルを提供する必要があり、当業者には容易に理
解されるだろう。こうしたベクターは、例えばLuckow
ら、Virology 170:31-39に記載されている。

【００８２】寄託クローン内の全長ATG-1709タンパク質
をコードし、表１(配列番号２)に示すAUG開始コドンお
よび天然で関連のあるリーダー配列を含有するｃＤＮＡ
配列を、その遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した。
５'プライマーは配列５'-GAATTCAAGATGCGGGCGGCGGCGGCG
GCGG -３'(配列番号８)を有し、EcoRI制限部位(下線部
分)と、Kozak,M., J.Mol.B iol.196:947-950(1987)に記
載されるような真核細胞での翻訳の開始にとって効率的
なシグナルと、これに続いてAUG開始コドンから始まる
表１の完全なATG- 170 9タンパク質の配列の21塩基を含
有する。３'プライマーは配列５'-GAATTCCTA GTGGGGTTC
TGCCGCCCCGTAG-３'(配列番号７)を有し、EcoRI制限部位
(下線部分)の後に表１に示したATG-1709ＤＮＡ配列中の
終止コドンの直前の３'末端のコード配列に相補的な21
ヌクレオチドを含有する。

【００８３】増幅した断片は市販のキット(“Geneclea
n",BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して1％アガロー
スゲルから単離した。次いでこの断片をEcoRIで消化
し、再び1％アガロースゲルから精製した。この断片を
本明細書中では「F1」と命名した。プラスミドを制限酵素
EcoRIで消化したが、場合によりウシ腸ホスファターゼ
を使用して、当業者には公知の一般的な手法を用いて脱
リン酸化してもよい。次にＤＮＡを市販のキット(“Gen
eclean,"BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して1％ア
ガロースゲルから単離した。このベクターＤＮＡを本明
細書中では「V1」と命名した。

【００８４】断片F1と脱リン酸化プラスミドV1をＴ4Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて互いに連結させた。大腸菌HB101
またはXL-1 Blue(Stratagene Cloning Systems,La Joll
a,CA)細胞のような他の適当な大腸菌宿主をライゲーシ
ョン混合物で形質転換し、培養プレートにまいた。ＰＣ
Ｒ法を用いてヒトATG-1709遺伝子を保持するプラスミド
を含有する細菌を同定したが、ここでプライマーの1つ
は該遺伝子を増幅するために使用したものであり該遺伝
子内に存在する。また第２のプライマーはATG- 1709遺
伝子断片を含有する細菌コロニーのみがＤＮＡ増幅を示
すように、ベクター内に存在する。クローン化した断片
の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。このプラスミ
ドを本明細書中ではpBacATG-1709と命名した。

【００８５】５mgのpBacATG-1709をFelgnerら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA84:7413-7417 (1987)に記載されたリポ
フェクション法を使用して1.0mgの市販の線状化バキュ
ロウイルスＤＮＡ(“BaculoGoldOバキュロウイルスＤＮ
Ａ"、Pharmingen,San Dieg o,CA)と同時トランスフェク
トした。1mgのBaculoGoldOウイルスＤＮＡおよび５mgの
プラスミドｐBacATG-1709を、50mlの無血清グレース培
地(Life Technolog iesInc., Gaithersburg,MD)を含有
するマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合し
た。その後10mlのリポフェクチンと90mlのグレース培地
を添加し、混合して室温で15分間インキュベートした。
次いでトランスフェクション混合物を1mlの無血清グレ
ース培地を加えた35mm組織培養プレートにまいたSf9昆
虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴下した。新たに加えた溶液
を混合するために、このプレートを前後に揺動した。次
いでこのプレートを27℃で5時間インキュベートした。5
時間後、トランスフェクション溶液をプレートから取り
除き、10％のウシ胎児血清を補充した1mlのグレース昆
虫細胞用培地を加えた。プレートをインキュベータに戻
し、27℃で4日間培養を続けた。

【００８６】4日後、上清を回収してSummers and Smit
h,(前掲)に記載されているようにプラークアッセイを行
なった。「Blue Gal」（Life Technologies Inc., Gaithe
rsbur g ）を含むアガロースゲルを用いると、青く染色
されたプラークをもたらすgal発現クローンの同定およ
び単離が容易になる(このタイプの「プラークアッセイ」
の詳細な説明は、Life Technologies Inc.,(Gaithersbu
rg)から配布された昆虫細胞培養およびバキュロウイル
ス学についてのユーザーズガイドの9〜10ページにも載
っている)。適切なインキュベーションの後、青く染色
されたプラークをマイクロピペッター(例えばエッペン
ドルフ)の先端で拾い上げた。次に、組換え体ウイルス
を含有する寒天を200mlのグレース培地を加えた微量遠
心チューブ内で再懸濁し、組換え体バキュロウイルスを
含有する懸濁液を用いて35mm皿にまいたSf9細胞に感染
させた。4日後これらの培養皿の上清を回収し、4℃で保
存した。この組換え体ウイルスをV-ATG-1709と命名し
た。

【００８７】ATG-1709遺伝子の発現を証明するために、
Sf9細胞を10％熱不活性化FBSを補充したグレース培地中
で培養した。細胞に約2の感染多重度(MOI)で組換え体バ
キュロウイルスV-ATG-1709を感染させた。6時間後培地
を取り出し、メチオニンとシステインを除いたSF900II
培地(Life Technologies Inc.,Rockville,MDから入手可
能)で置き換えた。放射性標識タンパク質が望まれる場
合は、42時間後に５mCiの³⁵S-メチオニンおよび５mCiの
³⁵S-システイン(Amershamから入手可能)を加えた。細胞
を更に１６時間インキュベートした後、遠心分離して回
収した。上清中のタンパク質並びに細胞内のタンパク質
をSDS-PAGEと、その後のオートラジオグラフィーにより
分析した(放射性標識している場合)。精製タンパク質の
アミノ末端のアミノ酸配列のミクロ配列決定により、成
熟タンパク質のアミノ末端配列と、それゆえ分泌シグナ
ルタンパク質の開裂部位および長さを決定することがで
きる。

【００８８】実施例４哺乳類細胞におけるATG-1709のクローニングおよび発現典型的な哺乳類発現ベクターはｍＲＮＡの転写開始を媒
介するプロモーター要素、タンパク質コード配列、およ
び転写の終止および転写物のポリアデニル化に必要なシ
グナルを含有する。更なる要素としてはエンハンサー、
Kozak配列およびＲＮＡスプライシングのためのドナー
部位とアクセプター部位によりはさまれた介在配列があ
る。SV40由来の初期および後期プロモーター、レトロウ
イルス、(例えばRSV,HTLVI,HIVI)由来の長い末端反復配
列(LTRS)、およびサイトメガロウイルス(CMV)由来の初
期プロモーターを使用すると、非常に効率の良い転写が
可能である。しかし、細胞の要素もまた使用できる(例
えばヒトアクチンプロモーター)。本発明を実施する際
に使用するのに適した発現ベクターには、例えばPSVLお
よびPMSG(Pharmac ia,Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC
37152)、pSV2dhfr (ATCC 37146)およびpBC12MI (ATCC 6
7109)のようなベクターが含まれる。使用できる哺乳類
宿主細胞には、ヒトHela 293、H9およびJurkat細胞、マ
ウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、ウ
ズラQC1-3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムス
ター卵巣(CHO)細胞が含まれる。

【００８９】また、遺伝子は該遺伝子が染色体に組み込
まれた安定な細胞系において発現させることができる。
dhfr、gpt、ネオマイシン、またはハイグロマイシンの
ような選択マーカーと同時トランスフェクトすることに
より、トランスフェクト細胞の同定と単離が可能とな
る。トランスフェクトされた遺伝子はまたコードされた
タンパク質を大量に発現するように増幅できる。DHFR
(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)マーカーは目的の遺伝子を
数百コピーあるいは数千コピーでさえも担持する細胞系
を開発するために有用である。別の有用な選択マーカー
は酵素グルタミンシンターゼ(GS)(Murphyら,Biochem J.
227:277-279(1991); Bebbingtonら、Bio/Te chnology
10:169-175(1992))である。これらのマーカーを用いて
哺乳類細胞を選択培地で生育させ、最も高い耐性を示し
た細胞を選択する。これらの細胞系は染色体に組み込ま
れた増幅遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵
巣(CHO)細胞およびNSO細胞はしばしばタンパク質の産生
に使用される。

【００９０】発現ベクターpC１およびpC４はラウス肉腫
ウイルスの強力なプロモーター(LTR)(Cullenら、Molecu
lar and Cellular Biology,438447(March,1985))とCMV
エンハンサーの断片(Boshartら、Cell 41:521-530(198
5))を含有する。例えば制限酵素開裂部位 BamHI、Xbal
およびAsp718を有する多重クローニング部位が目的の遺
伝子をクローニングしやすくする。これらのベクターは
さらに３'イントロン、ラット・プレプロインスリン遺
伝子のポリアデニル化および終止シグナルを含有する。

【００９１】実施例４(ａ) ＣＯＳ細胞におけるクローニングと発現発現プラスミドｐATG-1709HAは、ATG-1709をコードする
ｃＤＮＡを発現ベクターpcDNAI／AmpまたはpcDNAIII(In
vitrogen社より入手可能)でクローニングして得られ
る。発現ベクターpcDNAI／Ampは以下のものを含有す
る：（１）大腸菌または他の原核細胞内での増殖に有効
な大腸菌の複製起点;（２）プラスミド含有原核細胞を
選択するためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核細
胞内での増殖のためのSV40複製起点；（４）CMVプロモ
ーター、ポリリンカー、SV40イントロン；（５）ヘマグ
ルチニン断片をコードする幾つかのコドン(すなわち精
製を容易にするための「HA」タグ)とそれに後続する終止
コドンおよびポリアデニル化シグナル(ｃＤＮＡがCMVプ
ロモーターの発現制御下に置かれ、かつポリリンカー中
の制限部位によりSV40イントロンとポリアデニル化シグ
ナルに機能的に連結されるように配置される)。HAタグ
はWilsonら、Cell 37:767(1984)に記載されているイン
フルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトー
プに相当する。HAタグを標的タンパク質に融合させる
と、HAエピトープを認識する抗体を用いて組換えタンパ
ク質を容易に検出し回収することができる。pcDNAIIIは
さらにネオマイシン選択マーカーを含有する。

【００９２】ATG-1709をコードするＤＮＡ断片を、組換
えタンパク質発現がCMVプロモータにより指令されるよ
うにベクターのポリリンカー領域にクローン化した。プ
ラスミドの構築戦略は以下のとおりである。ATG-1709の
大腸菌発現用のベクターの構築について前記したよう
に、寄託されたクローンのATG-1709ｃＤＮＡを便利な制
限部位を有するプライマーを用いて増幅した。本実施例
で使用した適当なプライマーは以下のものを含有する。
EcoRI部位(下線部分)、Kozak配列、AUG開始コドンおよ
び完全なATG-1709の５'コード領域の６コドンを含有す
る５'プライマーは次の配列を有する：５'-GAATTCAAGAT
GCGGGCGGCGGCGGCGGCGG-３'(配列番号８)。EcoRI部位(下
線部分)、終止コドン、および21bpの３'コード配列を含
有する３'プライマーは次の配列を有する：５'-GAATTCC
TAGTGGGGTTCTGCCGCCCCGTAG-３'(配列番号７)。ＰＣＲ増
幅ＤＮＡ断片とベクターpcDNAI／AmpをEcoRIで消化し、
連結させた。このライゲーション混合物を大腸菌株SURE
(Stratagene Cloning Systems,11099N orth Torrey Pin
es Road,La Jolla,CA92037)中に形質転換し、形質転換
培養物をアンピシリン培地プレート上においてインキュ
ベートし、アンピシリン耐性コロニーを生育させた。プ
ラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、ATG-1709コ
ード断片の存在について制限分析または別の方法によっ
て試験した。

【００９３】組換えATG-1709の発現のために、ＣＯＳ細
胞を、例えば、Sambrookら, MOLECULA R CLONING: A LA
BORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されるDEAE
-DEXTRAN法を用いて、上記の発現ベクターでトランスフ
ェクトした。細胞をベクターによるATG-1709の発現に適
した条件下でインキュベートした。ATG-1709-HA融合タ
ンパク質の発現を、例えばHarlowら、Antibodies: A La
borat ory Manual,第2編、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988)に記載さ
れている方法を用いて放射性標識および免疫沈降により
検出した。そのために、トランスフェクションの2日
後、細胞を³⁵S-システイン含有培地で8時間インキュベ
ートして放射性標識した。細胞と培地を回収し、RIPA緩
衝液：150mM NaCl,1％ NP-40,0.1％ SDS,0.5％ DOC,50m
M TRIS,pH 7.5を含有するデタージェントで細胞を洗浄
し溶解した（Wilsonら、前掲）。タンパク質を細胞溶解
物および培養培地からHA-特異的モノクローナル抗体を
用いて沈降させた。次いで沈降したタンパク質をSDS-PA
GEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。予想
した大きさの発現産物が細胞溶解物中に見られたが、陰
性対照には見られなかった。

【００９４】実施例４(b) ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現 ATG-1709タンパク質の発現のためにベクターpC４を使用
した。プラスミドpC４はプラスミドpSV2−dhfr(ATCC受
託番号37146)の誘導体である。このプラスミドはSV40初
期プロモーターの制御下でマウスDHFR遺伝子を含有す
る。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒ
ドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞ま
たは他の細胞を、化学治療剤メトトレキセートを補充し
た選択培地(アルファマイナスMEM, Life Technologies)
で細胞を生育させることにより選択できた。メトトレキ
セート(MTX)耐性の細胞内でのDHFR遺伝子の増幅は十分
に論述されている(例えば、Alt,F.W., Kellemns,R.M.,
Bertino,J.R., and Sch imke,R.T., 1978, J Biol. Che
m. 253:1357−1370； Hamlin,J.L. and Ma,C.199 0,Bio
chem.etBiophys.Acta, 1097:107-143；Page,M.J.and Sy
denham M.A.1991,Biotechnology 9:64-68)。次第に増加
する濃度のMTXで生育させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅
の結果として標的酵素DHFRの過剰生産により薬物に対す
る耐性を発現した。２番目の遺伝子がDHFR遺伝子に結合
している場合は、通常、該遺伝子は同時に増幅されて過
剰発現される。このアプローチが1000コピー以上の増幅
遺伝子を担持する細胞系を作出し得ることは当分野では
公知である。その後、メトトレキセートを取り除くと、
宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子
を含有する細胞系が得られる。プラスミドpC４は目的の
遺伝子を発現するためにラウス肉腫ウイルスの長い末端
反復配列配列(LTR)の強力なプロモーターを含有し(Cull
enら、Molecular andCellular Biology, March 1985:43
8-447)、さらにヒトサイトメガロウイルス(CMV)の前初
期遺伝子のエンハンサーから単離した断片も含有する(B
oshartら、Cell41:521-530(1985))。プロモーターの下
流には遺伝子の組込みを可能とするBamHI、XbaIおよびA
sp718制限酵素の開裂部位がある。これらのクローニン
グ部位の後方に該プラスミドはラット・プレプロインス
リン遺伝子の３'イントロンおよびポリアデニル化部位
を含有する。他の効率の良いプロモーターも発現のため
に使用可能で、例えばヒトβアクチンプロモーター、SV
40初期もしくは後期プロモーターまたは他のレトロウイ
ルス(例えばＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ)からの長い末端反
復配列がある。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子
発現系や同様の系を用いて哺乳類細胞において調節され
た方法でATG-1709を発現させることができる（Gossen,
M.,& Bujard,H. 1992,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:554
7-5551）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば
ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子からの別のシグ
ナルも同様に使用できる。染色体に組み込まれた目的の
遺伝子を担持する安定な細胞系はまたgpt、G418または
ハイグロマイシンのような選択マーカーと同時トランス
フェクトして選択できる。最初に２つ以上の選択マーカ
ー(例えばG418とメトトレキセート)を使用することが有
利である。

【００９５】プラスミドpC４を制限酵素EcoRIで消化
し、次に当分野で公知の方法によりウシ腸ホスファター
ゼを使用して脱リン酸化した。このベクターをその後1
％のアガロースゲルから単離した。固有のリーダー配列
を含む完全なATG-1709タンパク質をコードするＤＮＡ配
列を、該遺伝子の５'および３'配列に対応するＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。この
５'プライマーは配列５'-GAATTCAAGATGCGGGCGGCGGCGGCG
GCG-３' (配列番号８)を有し、EcoRI制限部位(下線部
分)と、これに続いてKozak,M., J.MolBiol.196:947-950
(1987)に記載の真核細胞における翻訳の開始に効率的な
シグナルと、表１に示すATG-1709のコード配列(配列番
号１)の21塩基が存在している。３'プライマーは配列
５'-GAATTCCTAGTGGGGTTCTGCCGCCCCGTAG-３'(配列番号
７)を有し、EcoRI制限部位(下線部分)の後に表１に示す
ATG-1709遺伝子(配列番号1)の３'領域に相補的な21ヌク
レオチドが存在している。

【００９６】増幅断片をエンドヌクレアーゼEcoRIで消
化し、再び１％アガロースゲル上で精製した。次いで単
離した断片と脱リン酸化ベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結した。さらに大腸菌HB101またはXL-1 Blue細胞を
形質転換して、例えば制限酵素分析を用いて、プラスミ
ドpC４に挿入された断片を含有する細菌を同定した。活
性DHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣(CHO)
細胞をトランスフェクションに使用した。５mgの発現プ
ラスミドpC４を、リポフェクチン(Felgnerら、前掲)を
用いて0.5mgのプラスミドpSV2-neoと同時トランスフェ
クトした。プラスミドpSV2-neoは優性な選択マーカー、
すなわちＧ418を含む抗生物質類に対する耐性を与える
酵素をコードするＴｎ５由来のneo遺伝子を含有する。
これらの細胞を１mg／mlのＧ418を補充したアルファマ
イナスMEM中にまいた。2日後、細胞をトリプシン処理
し、10，25または50ng／mlのメトトレキセートと１mg／
mlのＧ418を補充したアルファマイナスMEM中でハイブリ
ドーマクローニングプレート(Greiner，Germany)にまい
た。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理
し、次いで異なる濃度のメトトレキセート(50nM，100n
M，200nM，400nM、800nM)を使用して６ウェルペトリ皿
または10mlフラスコにまいた。最高濃度のメトトレキセ
ートで生育するクローンを更に高濃度のメトトレキセー
ト(1mM，2mM，5mM，10mM，20mM)を含有する新たな６ウ
ェルプレートに移した。濃度100-200mMで生育するクロ
ーンが得られるまで同じ操作を繰り返した。目的の遺伝
子産物の発現を、例えばSDS-PAGEおよびウェスタンブロ
ット、または逆相HPLC分析により分析した。

【００９７】実施例５ ATG-1709ｍＲＮＡ発現の組織分布ヒト組織におけるATG-1709遺伝子の発現を試験するため
に、とりわけSambrookら、上掲．により記載されている
方法を用いてノーザンブロットを行なった。ATG-1709タ
ンパク質(配列番号１)の完全なヌクレオチド配列を含有
するｃＤＮＡのプローブをランダムプライミングＤＮＡ
標識システム（Amersham Life Science）用いて、製造
業者の指示に従い³²Ｐで標識した。標識の後、このプロ
ーブを製造業者のプロトコール番号PT1200-1に従いCHRO
MA SPIN-100 Ｏカラム(Clontech Laboratories、In
c．）を用いて精製した。次に精製した標識プローブを
使用して種々のヒト組織をATG-1709ｍＲＮＡについて試
験した。種々のヒト組織(Ｈ)またはヒト免疫系組織(Ｉ
Ｍ)を含有する多組織ノーザン(Multiple Tissue Northe
rn:MTN)ブロットをClontechから得て、Express Hybtハ
イブリダイゼーション溶液(Clontech)を用いて製造業者
のプロトコール番号PT1190-1に従い標識プローブで試験
した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、このブロ
ットを固定し、一晩−70℃でフィルムに露出し、標準的
な方法に従いフィルムを現像した。

【００９８】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【００９９】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１２８０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 CGTCCGGAGT CAGGGCCGGG GCGCACGCCG GAACACCTGG GCCGCCGGGC ACCGAGCGTC 60 GGGGGGCTGC GCGGCGCGCA CCTGGAGAGG GCGCATCCAT GCGGGCGGCG GCGGCGGCGG 120 GGGGCGTGCG GACGGCCGCA CTGGCGCTGC TGCTGGGGGC GCTGCACTGG GCGCCGGCGC 180 GCTGCGAGGA GTACCACTAC TATGGCTGGC AGGCCGAGCC GCTGCACGGC CGCTCCTACT 240 CCAAGCCGCC GCAGTGCCTT GACATCCCTG CCGACCTGCC GCTCTGCCAC ACGGTGGGCT 300 ACAAGCGCAT GCGGCTGCCC AACCTGCTGG AGCACGAGAG CCTGGCCGAA GTGAAGCAGC 360 AGGCGAGCAG CTGGCTGCCG CTGCTGGCCA AGCGCTGCCA CTCGGATACG CAGGTCTTCC 420 TGTGCTCGCT CTTTGCGCCC GTCTGTCTCG ACCGGCCCAT CTACCCGTGC CGCTCGCTGT 480 GCGAGGCCGT GCGCGCCGGC TGCGCGCCGC TCATGGAGGC CTACGGCTTC CCCTGGCCTG 540 AGATGCTGAC TGCCACAAGT TCCCCCTGGA CAACGACCTC TGCATCGCCG TGCAGTTCGG 600 GCACCTGCCC GCCACCGCGC CTCCAGTGAC CAAGATCTGC GCCCAGTGTG AGATGGAGCA 660 CAGTGCTGAC GGCCTCATGG AGCAGATGTG CTCCAGTGAC TTTGTGGTCA AAATGCGCAT 720 CAAGGAGATC AAGATAGAGA ATGGGGACCG GAAGCTGATT GGAGCCCAGA AAAAGAAGAA 780 GCTGCTCAAG CCGGGCCCCC TGAAGCGCAA GGACACCAAG CGGCTGGTGC TGCACATGAA 840 GAATGGCGCG GGCTGCCCCT GCCCACAACT GGACAGCCTG GCGGGCAGCT TCCTGGTCAT 900 GGGCCGCAAA GTGGATGGAC AGCTGCTGCT CATGGCCGTC TACCGCTGGG ACAAGAAGAA 960 TAAGGAGATG AAGTTTGCAG TCAAATTCAT GTTCTCCTAC CCCTGCTCCC TCTACTACCC 1020 TTTCTTCTAC GGGGCGGCAG AACCCCACTG AAGGGCACTC CTCCTTGCCC TGCCAGCTGT 1080 GCCTTGCTTG CCCTCTGGCC CCGCCCCAAC TTCCAAGCTG AACCGGCCCT ACTGGAAGGT 1140 GTTTTCCCGA ATGTTGTTAC TGGCACAAGG CTAAGGGATG GGCACGGAGC CCAGGCTGTC 1200 CTTTTTTGAA CCAAGGGTTC TGGGGTTCCC TGGGATATTT GGCTTCCTCT CTCAGGAACA 1260 AGGCTTCTTC ATCTGGGTGA 1280

【０１００】配列番号 :２配列の長さ：３１７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：タンパク質配列 Met Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Val Arg Thr Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Ala Leu His Trp Ala Pro Ala Arg Cys Glu Glu Tyr 20 25 30 His Tyr Tyr Gly Trp Gln Ala Glu Pro Leu His Gly Arg Ser Tyr Ser 35 40 45 Lys Pro Pro Gln Cys Leu Asp Ile Pro Ala Asp Leu Pro Leu Cys His 50 55 60 Thr Val Gly Tyr Lys Arg Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu Glu His Glu 65 70 75 80 Ser Leu Ala Glu Val Lys Gln Gln Ala Ser Ser Trp Leu Pro Leu Leu 85 90 95 Ala Lys Arg Cys His Ser Asp Thr Gln Val Phe Leu Cys Ser Leu Phe 100 105 110 Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys Arg Ser Leu Cys 115 120 125 Glu Ala Val Arg Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Glu Ala Tyr Gly Phe 130 135 140 Pro Trp Pro Glu Met Leu His Cys His Lys Phe Pro Leu Asp Asn Asp 145 150 155 160 Leu Cys Ile Ala Val Gln Phe Gly His Leu Pro Ala Thr Ala Pro Pro 165 170 175 Val Thr Lys Ile Cys Ala Gln Cys Glu Met Glu His Ser Ala Asp Gly 180 185 190 Leu Met Glu Gln Met Cys Ser Ser Asp Phe Val Val Lys Met Arg Ile 195 200 205 Lys Glu Ile Lys Ile Glu Asn Gly Asp Arg Lys Leu Ile Gly Ala Gln 210 215 220 Lys Lys Lys Lys Leu Leu Lys Pro Gly Pro Leu Lys Arg Lys Asp Thr 225 230 235 240 Lys Arg Leu Val Leu His Met Lys Asn Gly Ala Gly Cys Pro Cys Pro 245 250 255 Gln Leu Asp Ser Leu Ala Gly Ser Phe Leu Val Met Gly Arg Lys Val 260 265 270 Asp Gly Gln Leu Leu Leu Met Ala Val Tyr Arg Trp Asp Lys Lys Asn 275 280 285 Lys Glu Met Lys Phe Ala Val Lys Phe Met Phe Ser Tyr Pro Cys Ser 290 295 300 Leu Tyr Tyr Pro Phe Phe Tyr Gly Ala Ala Glu Pro His 305 310 315

【０１０１】配列番号：３配列の長さ：４８１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GGCACGAGGA GCCTGGCCGA AGTGANGNAG CAGGCGAGCA GCTGGCTGCC GCTGCTGGCN 60 AAGCNCTGCC ACTCGGATAC GCAGGTNTTC CTGTGCTCGC TCTTNGGGGC CGTNTNTTTN 120 GACCGGCCCA TCTACCCGTG CCGCTCGCTG TGCGAGGCCG TGCGCGCCGG CTGCGCGCCG 180 CTCATGGAGG CCTACGGCTT CCCCTGGCCT GANATGCTGC ACTGCCACAA GTTCCCCCTG 240 GACAACGACC TCTGCATCGC CGTGCAGTTC GGGNAACTGC CCGCCACCGC GCCTCCAGTG 300 GACCAAGATC TGCGCCCAGT GTGAGNTGGA GCACAGTGCT GACGGNCTCA TGGAGCAGAT 360 GTNCTCCAGT GAACTTTTTG GTCAAAATGC GCATCAAGGA GNTCAAGTTA GAGATGGGGA 420 CCGGAAGTTG NTTTGGAGCC CAGAAAAAGA AGAAGTTGTT NAAGCCGGGT CCNCTNAAGC 480 G 481

【０１０２】配列番号：４配列の長さ：７６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：タンパク質配列 Ser Leu Ala Glu Val Xaa Xaa Gln Ala Ser Ser Trp Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Ala Lys Xaa Cys His Ser Asp Thr Gln Val Phe Leu Cys Ser Leu Xaa 20 25 30 Gly Ala Val Xaa Xaa Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys Arg Ser Leu Cys 35 40 45 Glu Ala Val Arg Ala Gly Cys Ala Pro Leu Met Glu Ala Tyr Gly Phe 50 55 60 Pro Trp Pro Xaa Met Leu His Cys His Lys Phe Pro 65 70 75

【０１０３】配列番号:５配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GAATTCATGC GGGCGGCGGC GGCGGCGG 28

【０１０４】配列番号：６配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GAATTCCTAC GGGGCGGCAG AACCCCAC 28

【０１０５】配列番号:７配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GAATTCCTAG TGGGGTTCTG CCGCCCCGTA G 31

【０１０６】配列番号：８配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GAATTCAAGA TGCGGGCGGC GGCGGCGGCG G 31

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 3/04 3/10 3/10 9/00 9/00 9/12 9/12 13/12 13/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/68 33/531 ＡＧ０１Ｎ 33/53 33/566 33/531 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者ユアンヅーアメリカ合衆国 19406 ペンシルバニア州，キングオブプラッシア，ウェインドライブ 525

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２のATG-1709ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
０％同一であり、かつATG-1709ポリペプチドの活性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
のATG-1709ポリペプチドをコードする配列番号１中に含
まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項３】前記のポリヌクレオチドが、その全長に
おいて配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０
％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１
に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号１のポリヌクレオチドである、
請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】配列番号２のATG-1709ポリペプチドのア
ミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、
欠失または置換されており、かつATG-1709ポリペプチド
の活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項７】下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％
同一であるアミノ酸配列を含むATG-1709ポリペプチドを
産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡまたは
ＲＮＡ分子。
【請求項８】請求項７に記載の発現系を含有する宿主
細胞。
【請求項９】 ATG-1709ポリペプチドを産生させるのに
十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、こ
の培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んで
なる、ATG-1709ポリペプチドの産生方法。
【請求項１０】宿主細胞が適当な培養条件下でATG-17
09ポリペプチドを産生するように、請求項７に記載の発
現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
ションすることを含んでなる、ATG-1709ポリペプチドを
産生する細胞の作製方法。
【請求項１１】全長において配列番号２のアミノ酸配
列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで
なるATG-1709ポリペプチド。
【請求項１２】配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】請求項１１に記載のATG-1709ポリペプ
チドに免疫特異的な抗体。
【請求項１４】請求項１１に記載のATG-1709ポリペプ
チドの活性増加または発現増加を必要としている患者を
治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量
の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアゴニスト、および／ま
たは (b) 前記ポリペプチド活性のin vivo 生産をもたらす形
の、配列番号２のATG-1709ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一で
あるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に
対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離され
たポリヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】請求項１１に記載のATG-1709ポリペプ
チドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療
するための医薬組成物であって、治療上有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および
／または (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
発現を抑制する核酸分子、および／または (c) 前記ポリペプチドのリガンド、基質または受容体に
関して前記ポリペプチドと競合するポリペプチド、を含
んでなる医薬組成物。
【請求項１６】請求項１１に記載のATG-1709ポリペプ
チドの発現または活性と関連した被験者の疾病またはそ
の罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者由来のゲノム中にATG-1709ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列の突然変異があるかどう
かを調べる、および／または (b) 前記被験者から得られたサンプル中のATG-1709ポリ
ペプチド発現の存在または量を分析する、ことを含んで
なる方法。
【請求項１７】請求項１１に記載のATG-1709ポリペプ
チドを阻害（拮抗）または活性化する化合物の同定方法
であって、 (a) ATG-1709ポリペプチドを発現している細胞（もしく
はATG-1709ポリペプチドを発現している細胞膜）または
ATG-1709ポリペプチドに応答する細胞と候補化合物とを
接触させ、そして (b) その結合、または機能的応答の刺激もしくは抑制を
観察するか、または候補化合物と接触させた細胞（また
は細胞膜）の能力を、接触させなかった同一の細胞と、
ATG-1709ポリペプチド活性に関して比較する、ことを含
んでなる方法。
【請求項１８】請求項１７に記載の方法により同定さ
れたアンタゴニスト。
【請求項１９】請求項１０に記載の方法により作製さ
れた組換え宿主細胞、またはATG-1709ポリペプチドを発
現しているその膜。