JPH10509320A

JPH10509320A - ヒトＭｕｔＴ２

Info

Publication number: JPH10509320A
Application number: JP8516005A
Authority: JP
Inventors: イン−フェイウェイ，; エウェンエフ．カークネス，
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-11-15
Filing date: 1994-11-15
Publication date: 1998-09-14
Also published as: EP0795006A1; WO1996015222A1; AU1255895A; EP0795006A4

Abstract

(57)【要約】ヒトhMutT2ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするDNA（RNA）ならびに組換え技術によるこのようなポリペプチドを産生する手順を開示する。酸化されたグアニンを加水分解し、そしてヌクレオチドプールから排除して、正確なDNA合成を確実にするために、このようなポリペプチドを使用する方法もまた開示される。hMutT2の変異体の存在およびhMutT2タンパク質の過剰発現を検出する診断アッセイもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトMutT2 本発明は、新規に同定したポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトMutT2であり、本明細書中において以下「hMutT2」と呼ばれることがある。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。 DNA複製のエラーは自然突然変異へと至る。自然突然変異が増えると、腫瘍のような異常細胞の増殖および疾患に直接的に導かれる。自然突然変異のある部分は、正常な細胞代謝により発生する内因性フリーラジカルによって引き起こされる。フリーラジカルは、DNAに対して酸化性の損傷を引き起こし、そして寿命における重要な決定要因であり得る(Ames，B.N.およびGold，L.S.，Mutat．Res.， 250:3-16(1991))。酸素ラジカルは染色体DNAに損傷を与え、細胞死を引き起こし、そして変異を誘発する。酸素ラジカルによって引き起こされるDNA損傷の１つのタイプは、グアニン塩基の酸化体(8-オキソグアニン)である(Shibutani，S.ら、Nature，349: 431-4(1991))。このグアニンの酸化体はシトシンおよびアデニンと対を形成し得、続いてG:CからT:Aへのトランスバージョンが生じる(Tkeshelashvili，L.K.ら、J.Biol．Chem.，266:6401-6406(1991))。従って、細胞代謝中間体によって生産される活性酸素種は、正常な増殖細胞中でさえ、DNAのグアニン塩基を酸化するに十分である。グアニンの酸化は遊離ヌクレオチド形態においても進行し、そしてdGTPの酸化体である8-オキソ-dGTPはDNA合成に関して強力な変異原性物質である(Maki，HおよびSekiguchi，M.，Nature，355:273-275(1992))。DNAにおいて生じる8-オキソグアニンの結果とは対照的に、8-オキソ-dGTPはG:CからT:AへのトランスバージョンのみならずA:TからC:Gへのトランスバージョンを誘発し得る(Cheng．K.C. ら、J．Biol．Chem.，267:166-172(1992))。 E.coliにおいては、DNA中および遊離ヌクレオチド形態中の両方のグアニン塩基の酸化により引き起こされる変異を回避する機構が存在する。酸化されたDNA は、損傷したDNAから8-オキソグアニン塩基を除去する活性を有するMutMタンパク質によって修復される。他方、8-オキソ-dGTPは、変異原性ヌクレオチドを8- オキソ-dGMPに加水分解するmutTタンパク質によって、ヌクレオチドプールから排除され得る(Maki，HおよびSekiguchi，M.，Nature，355:273-275(1992))。mut T変異体において、鋳型のdA残基に相対して誤って取り込まれた8-オキソ-dGMPは、MutMタンパク質によってDNA複製の次の回の前に除去され得る。従って、mutT タンパク質は、強力な変異原性物質である8-オキソ-dGTPを無害なモノホスフェート物質へと分解して、適切なDNA合成を確実にする。E.coli mutT遺伝子における変異は、A:TからC:Gへのトランスバージョンの発生を、野生型レベルの100〜1 0,000倍に上昇させる(Akiyama，M.ら、Mol.およびGen．Genet.，206:9-16(1987) )。真核生物および哺乳動物もまた、酸化されたヌクレオチドを加水分解する酵素を有する。この酵素は、E.coli mutT遺伝子に相同である。かなりの量の8-オキソグアニンが哺乳動物細胞の染色体DNAにおいて形成され、そして損傷を受けたヌクレオチドの大部分がDNAから切除され、そして尿中に排泄される(Ames，B.N. およびGold，L.S.，Mutat．Res.，250:3-16(1991)およびShigenaga，M.K.ら、PN AS，86:9697-9701(1989))。 dGTPの自然酸化は8-オキソ-dGTPを形成し、これはほぼ等しい効率で鋳型DNAの dA残基およびdC残基に相対して挿入され得、そしてmutTタンパク質は8-オキソ-d GTPをモノホスフェートに特異的に分解する。従って、グアニンヌクレオチドの酸化体をヌクレオチドプールから排除することが、DNA合成の高い正確性のために重要である。本発明のポリペプチドは、サイズおよびアミノ酸相同性においてヒトMutTに相当し、それ故、ヒトMutT2として予備的に特徴付けられている。本発明の１つの局面によれば、hMutT2である新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明の別の局面によれば、hMutT2をコードする単離された核酸分子（mRNA、 DNA、cDNA、ゲノムDNAを包含する）、ならびに生物学的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、そのフラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドを組換え技術により産生させる方法が提供される。この方法は、hMutT2核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞をこのタンパク質の発現を促進する条件下で培養すること、続いてこのタンパク質を回収することを包含する。本発明のなおさらなる局面によれば、治療目的、例えば、DNA合成の高い正確性のために、酸化されたヌクレオシドトリホスフェート（特に8-オキソ-dGTP）を特異的に加水分解して対応するモノホスフェートにすることによって、DNA複製におけるエラーおよび異常な細胞の増殖（例えば、腫瘍および癌において存在する）に関連する疾患を防止または処置するために、このようなポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。本発明の別の局面によれば、hMutT2配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別の局面によれば、hMutT2核酸配列における変異およびそのような核酸配列によってコードされるタンパク質に関連する疾患（例えば、異常な細胞の増殖）または疾患に対する感受性の診断方法が提供される。本発明のさらに別の局面によれば、このようなポリペプチドの作用を阻害するために（例えば、腫瘍の処置において）使用され得る、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNA合成、およびDNAベクターの製造に関連するインビトロ目的に使用する方法が提供される。本発明のこれらの局面および他の局面は、本明細書中の教示から当業者には明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定することを意図しない。図１は、hMutT2ポリペプチドのcDNA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。アミノ酸の標準的な１文字略記が用いられている。図２は、E.coli MutT、ヒトMutT1、およびhMutT2の間のアミノ酸相同性を示す。ここで陰影を付けた領域は異なる配列間で同一であるアミノ酸残基を表す。本発明のhMutT2は、ヒトMutT1よりもE.coli MutTに高いアミノ酸相同性を有する。図３は、hMutT2の細菌による発現および精製の後のゲルを示す。ここでhMutT2 はこのゲルを通して電気泳動されている。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は非誘導のE.coli抽出物であり、レーン３はIPTG誘導されたE.coli抽出物であり、そしてレーン４はレーン３のニッケルカラム精製例である。レーン３および４において分子量34kDおよび31kDの２つのタンパク質バンドが誘導されており、31kDタンパク質は34kDヒトMutT2の分解産物であると推定される。図４はhMutT2のヒト組織における分布を示すゲルである。レーン１、胸腺；レーン２、精巣；レーン３、胆嚢；レーン４、腎臓；レーン５、肝臓；レーン６、肺；レーン７、脾臓；レーン８、前立腺；レーン９、脳；レーン10、心臓；レーン11、胎盤。hMutT2はほとんどのヒトの組織で遍在的に発現される。本発明の局面によれば、図１の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、またはATCC寄託番号75882として1994年８月31日に寄託されたクローンのcDNA によりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、胸腺、肝臓、脾臓、および前立腺のようなほとんどのヒト組織から得られ得る。本発明のポリヌクレオチドが、ヒトの８週齢の胚由来のcDNAライブラリーにおいて発見された。これは、hMutTファミリーに構造的に関係する。これは、219アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、E.Co li MutTに対して、27アミノ酸長にわたり62％の同一性および77％の類似性により、最も高い程度の相同性を示す。GETXEおよびRELQ/EEEが、E.Coli MutT、ヒト MutT1、およびhMutT2の間で保存されていることもまた重要である。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは二本鎖または一本鎖であり得る。そして、一本鎖の場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列と同一であり得るか、または寄託したクローンのコード配列と同一であり得る。あるいは、コード配列は、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１のDNA または寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、次のものを包含し得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列（および付加的なコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロン、または成熟ポリペプチドのコード配列の5'および／または3'の非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的なコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。従って、本発明は、図１に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。これらの変異体は、図１のポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を包含する。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子変異体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これによってコードされるポリペプチドの機能は実質的に変化しない。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合、ヘマグルチニン（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell、37:767(1 984)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％、そして好ましくは70％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが生じることをいう。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcDNAまたは寄託したcDNA によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用されており、そして本明細書中の配列のいかなる記載とのいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、使用、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてこのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するhMutT2ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合、このようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１のポリペプチド、または寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)１以上のアミノ酸残基が保存または非保存のアミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもよく、またはなくてもよいもの、あるいは(ii)１以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されているもの、あるいは(iv)付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質の幾らかまたは全部から分離されたその同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そしてさらに、このようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない点で単離され得る。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはhMutT2遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、および合成DNA配列を含有し、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルスDNAである。しかし、宿主内で複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のベクターが使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者に公知の範囲内にあると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指示するための適切な発現制御配列（単数または複数）（プロモーター）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはtrp、λファージP_Lプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはまた、遺伝子のコピー数を増幅するための適切な配列を含み得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有し、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはE. coli におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E ．coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば、酵母）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSf9）；動物細胞（例えば、CHO、C OSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を含み、このベクター中に本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70、p QE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pB SKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK 233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT 1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、宿主内で複製可能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L 、およびtrpが挙げられる。真核生物プロモーターには、CMV即時初期型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にある。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I.、Basi cMethods in Molecular Biology、(1986))。宿主細胞内の構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために、従来の方法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生させるために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主と共に使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laborator y Manual，第２版、Cold Spring Harbor、N.Y.、（1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーはDNAのシス作用因子であり、通常は約10〜約300pであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例としては、複製起点の100〜270bpの後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、E ．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS ．cerevi siae のTRP1遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、解糖酵素（例えば、 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質など）をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリーダー配列と適切な相で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含有する融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することにより構築される。ベクターは、１以上の表現型選択マーカー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、および所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点を含有する。形質転換に適切な原核生物宿主は、E ．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属の種々の種を包含するが、他もまた選択対象として用いられ得る。代表的ではあるが限定的ではない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、 Uppsala、Sweden）およびGEM1(Promega Biotec、Madison、WI、USA)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例は、Gluzman、Cell、23: 175(1981)に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、転写終止配列、および5'フランキング非転写配列を含有する。SV40スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。 hMutT2ポリペプチドは、以下に挙げる方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（re folding）工程が、成熟タンパク質の立体配置（configuration）を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のhMutT2ポリペプチドは、天然に精製された産物であっても、化学合成手順の産物であっても、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術により（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により）産生されても良い。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもグリコシル化されなくても良い。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。 hMutT2ポリペプチドならびにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これは、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供され得る。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法によって本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。一旦hMutT2ポリペプチドが遺伝子治療により細胞内で発現されると、このポリペプチドは、酸化形態のヌクレオシド3-リン酸を加水分解し、そしてグアニンヌクレオチドの酸化形態に対する強い親和性を有し、従ってこれらはヌクレオチドプールから除去され、そして高い適合度のDNA合成が確保される。hMutT2ポリペプチドが存在しない場合、DNA複製におけるエラーが顕著に増大し、これは変異誘発を導く。変異誘発は、例えば、腫瘍およびガンにおいて見られる異常な細胞増殖を含む非常に多くの異常を引き起こすことが知られている。従って、本発明のポリペプチドの投与は、変異誘発の処置または予防に用いられ得る。本発明のさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学研究、DNA合成、およびDNA ベクターの製造に関するインビトロの目的に利用するためのプロセスが提供される。完全長のhMutT2遺伝子のフラグメントは、完全長の遺伝子を単離するため、およびこの遺伝子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する別の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。このタイプのプローブは、例えば、20と2000塩基との間であり得る。しかし好ましくは、プローブは、30と50塩基対との間を有する。プローブはまた、完全長の転写産物に対応するcDNAクローン、ならびにゲノムクローン、または制御およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含有する完全なhMutT2遺伝子を含むクローンを同定するために用いられ得る。スクリーニングの一例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のDNA配列を用いることによって、hMutT2遺伝子のコード領域を単離することを包含する。本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリーのどのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを決定するために、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーのスクリーニングに用いられる。本発明はまた、変異hMutT2の存在に関係する疾患の検出、またはこの疾患に対する感受性についての診断的アッセイの一部としてのhMutT2遺伝子の使用に関する。このような疾患は、DNA複製におけるエラー、例えば、腫瘍および癌に導くエラーに関する。 hMutT2遺伝子に変異を有する個体は、多様な技術により、DNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞、例えば、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検材料から得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接用いられ得るか、または分析の前にPCR（Saikiら、Nature，324:163-166(1986)）を用いて酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAも、同じ目的で用いられ得る。例えば、hMu tT2をコードする核酸に相補的なPCRプライマーは、hMutT2変異の同定および分析に用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した場合の増幅産物のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、放射能標識したhMut T2 RNA、または放射能標識したhMutT2アンチセンスDNA配列に、増幅したDNAをハイブリダイズさせることによって同定され得る。完全にマッチした配列は、RNas e A消化または融解温度の相違によりミスマッチの二重鎖から識別され得る。 DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、変性剤を含むか、または含まないゲル中でのDNAフラグメントの電気泳動による移動度の変化の検出によって達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により可視化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別され得る。ここで、異なるDNAフラグメントの移動度は、ゲル中でその特異的な融解温度または部分融解温度に従って異なる位置で遅らされ得る（例えば、Myersら、Science，230:1242(1985)を参照）。特異的位置における配列変化はまた、例えば、RNaseおよびS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学的切断法により明らかにされ得る（例えば、 Cottonら、PNAS，USA，85:4397-4401(1985)）。従って、特異的なDNA配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、RNase 保護、化学的切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多形(RFLP)）、およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。より簡便なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、インサイチュ分析によっても変異は検出され得る。本発明はまた、正常コントロール組織サンプルと比較したhMutT2タンパク質の過剰発現は、DNA複製の誤りに関する疾患（例えば、腫瘍）の存在またはその疾患に対する感受性を検出し得るので、種々の組織における変化したレベルのhMut T2タンパク質を検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプル中のhMutT2タンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者には周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイを含む。ELISA アッセイ(Coliganら、Current Protocols in Immunology,1(2),第６章、(1991)) は、最初にhMutT2抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を包含する。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗体に対して調製される。このレポーター抗体に対して、検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍光、またはこの実施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を結合させる。サンプルは宿主から取り出され、そしてサンプル中のタンパク質と結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部位は、BSAのような非特異的タンパク質を用いてインキュベートすることにより覆われる。次に、モノクローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。この間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合された任意のhMutT2タンパク質と結合する。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液を用いて洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したレポーター抗体はここで、ディッシュ中に置かれ、hMutT2と結合した任意のモノクローナル抗体に対するレポーター抗体の結合を生じる。次いで、非付着レポーター抗体は、洗い出される。次いで、ペルオキシダーゼ基質が、ディッシュに加えられ、そして所定の時間内の発色量は、標準曲線と比較した場合、患者サンプルの所定の容量中に存在するhMutT2タンパク質量の測定値である。競合アッセイが、使用され得る。ここで、hMutT2に特異的な抗体は、固体支持体に付着し、そして標識hMutT2および宿主由来のサンプルは、固体支持体上を通過され、そして例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出された標識の量は、サンプル中のhMutT2量と相関し得る。「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」アッセイにおいて、hMutT2は固体支持体上を通過され、それと固体支持体に付着した抗体と結合する。次いで、第２の抗体をhMutT2と結合させる。次いで、標識され、かつ第２の抗体に特異的な第３の抗体は、固体支持体上を通過され、そして第２の抗体に結合し、次いで、量が定量され得る。本発明はまた、hMutT2の機能を増強する化合物（アゴニスト）、またはブロックする化合物（アンタゴニスト）を同定するための、化合物のスクリーニング方法に関する。このようなアッセイの例は、hMutT2およびスクリーニングされるべき化合物の存在下における8-oxo-dGTPから8-oxo-dGMPへの加水分解を測定する工程を含む。反応混合物（12.5 μl）は、20 mM Tris-HCl(pH8.0)、4 mM MgCl₂、4 0 mM NaCl、20μM 8-oxo-dGTP、80μg/mlウシ血清アルブミン、8 mM DTT、10％グリセロール、hMutT2、およびスクリーニングされるべき化合物を含む。反応は 30℃で20分間行われ、そして2.0μlの50 mM EDTAの添加により停止される。この反応混合物のアリコート(2μl)をポリエチレンイミン-セルロースプレート上にスポットし、そしてその生成物を１時間、１M LiClを用いるTLCにより基質から分離し、そしてFujix Bio-画像解析機（Fuji Photofilm Company Limited Tokyo ）を用いるオートラジオグラフ分析により定量化する。次いで、hMutT2の作用を阻害、または増強するための化合物の能力が分析される。ヒトMutT2は、細胞内で生成され、そして機能する。従って、アンタゴニストはいずれも細胞内に存在しなければならない。hMutT2に対する潜在的なアンタゴニストは、細胞内で生成される抗体を含む。例えば、hMutT2に拮抗すると同定される抗体は、当業者に公知の手順（例えば、hMutT2の機能を妨げるために、適切な細胞を単鎖抗体をコードするDNAを用いて形質転換する工程）により単鎖抗体として細胞内で生成され得る。別の潜在的なhMutT2アンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術は、三重らせん形成またはアンチセンスDNAあるいはRNAを介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両方とも、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合することに基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５' コード部分は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的であるように設計され（三重らせん-Leeら、Nucl．Acids Res.，6:30 73(1979); Cooneyら、Science，241:456(1988);およびDervanら、Science，251: 1360(1991)を参照のこと）、それにより、hMutT2の転写および生成を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAとハイブリダイズし、そしてmRNA分子のhMutT2ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス-O kano、J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense In hibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによりアンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現されてhMutT2の生成を阻害し得る。潜在的なアンタゴニストはまた、細胞膜を通過し得、そしてこのポリペプチドの触媒部位に結合し、そして占有し得、それにより触媒部位への基質の接近を不可能にし、その結果、正常な生物学的活性が妨げられる低分子を含む。低分子の例としては、低分子ペプチドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。アンタゴニストは、所望でない細胞（例えば、腫瘍およびガンにおける細胞のような異常に分化する細胞）を標的化するために使用され得る。なぜなら、hMut T2活性の妨害は、DNA複製エラーの修正を妨げ、そして細胞の破壊を導き得るからである。アンタゴニストは、例えば、本明細書中下記のような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物中で使用され得る。本発明の低分子アゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与様式に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるような簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応症の処置および／または予防に効果的な量で投与される。一般に、それらは少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日あたり約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日あたり約10μg/kg体重〜約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子とを関連付けるのに重要な、第１工程である。簡略に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当てるための迅速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用して、同様の様式において特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて部分的位置決め(sublocalization)が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識してフローサイトメトリーで選別した（flow-sorted）染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレ選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、500または600塩基ほどの短いcDNAを用いて使用され得るが、しかし2,000b pより大きなクローンは、簡単な検出のために十分なシグナル強度を有する独特の染色体位置に対して結合見込みがより高い。FISHはESTが得られたクローンの使用を必要とし、クローンは大きいほどよい。例えば、2,000bpはよく、4,000bp はよりよく、そして4,000より大きなものは、よい結果を妥当な時間の割合で得るためにおそらく必ずしも必要ではない。この技術の総説としては、Vermaら、H uman Chromosomes: A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press、New York (1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M cKusick、Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Med ical Libraryからオンラインで入手可能である)に見出される。次いで、同一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次いで、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正常な個体には観察されない場合、この変異はこの疾患の原因因子であると思われる。物理的マッピング技術および遺伝的マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩基のマッピング解像度で、そして20kbあたり１遺伝子と仮定する。）このポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して作製される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を作製するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Ko hlerおよびMilstein、1975、Nature、256: 495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら、198 5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss，Inc.、77-96頁）が挙げられる。単鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第4,946,778号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。トランスジェニックマウスもまた、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。本発明を以下の実施例を参考としてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解されたい。すべての部または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／または後の大文字および／または数字により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的には、代表的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを、約２単位の酵素とともに約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、代表的には５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37 ℃での約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変化し得る。消化の後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動することにより所望のフラグメントを単離する。切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddel,Dら、Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)により記載される８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis，T.ら、同上、146頁)。他に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT 4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）とともに、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しない限り、形質転換はGraham，F.およびVan der Eb，A.、Virology 、52:456-457(1973)の方法に記載されるように行った。実施例１ hMutT2 の細菌発現および精製 hMutT2をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75882号）を、hMutT2タンパク質の５'配列（シグナルペプチド配列を除く）およびhMutT2遺伝子に対して３'のベクター配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅する。hMutT2に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５'および３'配列に添加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列５’GCGGTCGACATGAGCCAAGAA CCAACG ３'を有し、SalI制限酵素部位、続いてプロセシングされたタンパク質の推定末端アミノ酸から始まる21ヌクレオチドのhMutT2コード配列を含む。３'配列、５’GCGTCTAGATTAAAATTTCAAGAAGGGCAC ３'は、XbaI部位に相補的な配列を含み、それに21ヌクレオチドのhMutT2が続く。制限酵素部位は、細菌発現ベクター pQE-9（Qiagen，Inc．9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、抗生物質耐性（Amp^r）、細菌の複製起点（ori）、IP TG調節可能プロモーターオペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、 6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードする。次いで、pQE-9をSalIおよびXbaI で消化した。増幅配列をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列にインフレームに挿入した。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli 株m15/REP4(Qiagen)をSambrook，J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manu al，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換した。 m15/REP4は、プラスミドpREP4の多数のコピーを含み、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性（Kan^r）も与える。形質転換体はLBプレート上で増殖するそれらの能力により同定され、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーが選択された。プラスミドDNAを単離して、制限分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させた。O/N培養物を用いて 1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、600の光学密度（O.D.⁶⁰⁰ ）が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル-B-D -チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にした。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化することにより、遺伝子発現を増加させるためのP/Oの解放（clear）を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により採集した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６MグアニジンH Clで可溶化させた。澄明化後、可溶化されたhMutT2を、6-Hisタグを含むタンパク質によって堅く結合させる条件下でニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製した（Hochuli，E.ら、J．Chromatography 411:1 77-184(1984)）。hMutT2（80％を超える純度）を、６MグアニジンHCl（pH 5.0）でカラムから溶出し、そして再生の目的のために、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整した。この溶液で12時間インキュベーションした後、タンパク質を10 mMリン酸ナトリウムに対して透析した(図３)。実施例２バキュロウイルス発現系を用いるhMutT2のクローニングおよび発現完全長のhMutT2タンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75882号）を、遺伝子の５'および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。５'プライマーは、配列５’GCGCCCGGGATAAGCCAAGAACCAACG ３'を有し、SmaI制限酵素部位（下線）、それに続く真核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する21ヌクレオチド（J．Mol．Biol．1987，196，947-950，Kozak，M. ）を含む。３'プライマーは、配列５’GCGGGTACCTTAAAATTTCAAGAAGGGCAC ３'を有し、制限エンドヌクレアーゼAsp718の切断部位およびhMutT2遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な21ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、市販のキット（「Geneclea n］BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラグメントをエンドヌクレアーゼSmaIおよびAsp718で消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製した。このフラグメントを、F2と称する。ベクターpA2(pVL941ベクターの改変体、下記)をバキュロウイルス発現系を用いるhMutT2タンパク質の発現のために用いる（総説について、Summers，M.D.およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors and in sect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bu lletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californic a核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼSmaIおよびAsp718の認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E ．coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルの前に、ポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入した。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクトされた野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列により両端で隣接する。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である（Luckow，V.A.およびSumm ers，M.D.、Virology，170:31-39）。プラスミドを制限酵素SmaIおよびAsp718で消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて１％アガロースゲルから単離した。このベクターDNAをV2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素SmaIおよびAsp71 8を用いて、hMutT2遺伝子を有するプラスミド（pBac hMutT2）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。５μgのプラスミドpBac hMutT2を、リポフェクション法（Felgnerら Proc．N atl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac hMutT2を、50 μlの無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlリポフェクチンと90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清Grace培地１mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振盪した。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlの Grace昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた４日後、、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブに再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mm ディッシュに播種されたSf9細胞を感染させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱失活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、感染多重度（MOI）２で組換えバキュロウイルスV-hMutT2で感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μCi の³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞を、さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により採集し、そしてSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視化した。実施例３ COS 細胞における組換えhMutT2の発現発現プラスミドhMutT2 HAは、以下を含むベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）に由来する：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E ．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。hMutT2前駆体全体およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター下で支配される。HAタグは、以前に記載されたようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（I．Wilson，H．Niman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 37，767）。本発明者らの標的タンパク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認識する抗体での組換えタンパク質の容易な検出を可能にする。プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： hMutT2をコードするDNA配列（ATCC受託番号第75882号）を、以下の２つのプライマーを用いて、クローン化された最初のESTに対するPCRにより構築した：５’ プライマー５’GCGGAATTCATGGAGAGCCAAGAACCAACG ３'は、EcoRI部位とその後の開始コドンから始まる21ヌクレオチドのhMutT2コード配列を含む；３'配列５’G CGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAAAATTTCAAGAAGGGCAC ３'は、XhoI部位、翻訳停止コドン、HAタグ、およびhMutT2コード配列の最後の18ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、EcoRI部位、インフレームで融合されたHAタグが続くhMutT2コード配列、HAタグに隣接する翻訳終了停止コドン、およびXhoI部位を含む。PCRで増幅されたDNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、EcoRIおよびXhoI制限酵素により消化し、そして連結した。連結混合物を、E ．coli株SURE（Stratagene Cloning Systems，110 99 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能）に形質転換し、形質転換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析により試験した。組換えhMutT2の発現のために、 COS細胞を、DEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecul ar Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）により発現ベクターでトランスフェクトした。hMutT2 HAタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory M anual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）により検出した。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40 、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))(Wilson，I.ら、同上３7:767(1984)）で溶解した。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲルで分析した。実施例４ヒト組織におけるhMutT2の発現パターンヒト組織におけるhMutT2の発現レベルを調べるためにノーザンブロット分析を行った。総細胞RNAサンプルを、RNAzol^TMB システム(Biotecx Laboratories，In c．6023 South Loop East，Houston，TX77033)を用いて単離した。指定したそれぞれのヒト組織から単離した約15μgの総RNAを１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした(Sambrook，FritschおよびManiatis， Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Press,(1989))。標識反応を、Stratag ene Prime-Itキットによって50ngのDNAフラグメントを用いて行った。標識されたDNAを、Select-G-50カラムを用いて精製した。(5Prime-3Prime，Inc．5603 Ar apahoe Road，Boulder，CO 80303)。次いで、フィルターを0.5M NaPO₄（pH 7.4 ）および７％ SDS中で65℃にて一晩、1,000,000cpm/mlで放射標識された完全長h MutT2遺伝子とハイブリダイズした。次いでフィルターを、0.5×SSC、0.1％ SDS を用いて室温で二回、および60℃で二回洗浄した後、フィルターを増強スクリーンを用いて-70℃で一晩露出した。hMutT2のメッセージRNAは、胸腺、精巣、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、脾臓、前立腺、胎盤中に豊富である（図４）。本発明の多くの改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載された以外にも、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 ＺＣ１２Ｑ 1/44 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．以下からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド； (a)図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド； (b)ATCC寄託番号75882中に含まれるcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．前記ポリヌクレオチドが図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．前記ポリヌクレオチドがATCC寄託番号75882のcDNAによってコードされるポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．図１に示されるコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．請求項２に記載のDNAを含むベクター。９．請求項８に記載のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。１０．ポリペプチドを産生させる方法であって、請求項９に記載の宿主細胞から前記DNAによってコードされるポリペプチドを発現させる工程を包含する、方法。１１．ポリペプチドを発現し得る細胞を生成する方法であって、請求項８に記載のベクターで細胞を遺伝子操作する工程を包含する、方法。１２．請求項２に記載のDNAとハイブリダイズし得、かつhMutT2活性を有するポリペプチドをコードする単離されたDNA。１３．以下からなる群から選択されるポリペプチド、(i)図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体、および(ii)ATCC寄託番号75882のcDNAによりコードされるポリペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体。１４．前記ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。１５．請求項１３に記載のポリペプチドに対する抗体。１６．請求項１３に記載のポリペプチドを阻害する化合物。１７．請求項１３に記載のポリペプチドを活性化する化合物。１８．hMutT2の必要性を有する患者の処置のための方法であって、請求項１４のポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与する工程を含み、ここで該ポリペプチドをコードするDNAを該患者に提供し、そして該ポリペプチドをインビボで発現させることによって、該ポリペプチドが投与される、方法。１９．hMutT2を阻害する必要性を有する患者の処置のための方法であって、請求項１６に記載の化合物の治療的有効量を該患者に投与する工程を含む、方法。２０．請求項１６に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアーを含む薬学的組成物。２１．hMutT2に対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための方法であって：スクリーニングされるべき化合物の存在下、8-オキソ-dGTPが加水分解される条件下で、hMutT2を8-オキソ-dGTPに接触させる工程； 8-オキソ-dGTPの加水分解の程度を決定する工程；および該化合物がhMutT2による8-オキソ-dGTPの加水分解を増強またはブロックするかどうかを同定する工程を包含する、方法。２２．DNA複製におけるエラーに対する感受性を診断する方法であって：宿主由来のサンプルからhMutT2をコードする核酸配列を単離する工程；および該hMutT2核酸配列中の変異を決定する工程を包含する、方法。２３．宿主由来のサンプルにおける請求項１３に記載のポリペプチドの存在を分析する工程を包含する、診断方法。