JP2002315586A - ヒトMutT2 - Google Patents

ヒトMutT2

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JP2002315586A
JP2002315586A JP2001329961A JP2001329961A JP2002315586A JP 2002315586 A JP2002315586 A JP 2002315586A JP 2001329961 A JP2001329961 A JP 2001329961A JP 2001329961 A JP2001329961 A JP 2001329961A JP 2002315586 A JP2002315586 A JP 2002315586A
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hmutt2
polypeptide
dna
sequence
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JP2001329961A
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English (en)
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In-Fei Wei
イン−フェイ ウェイ
Ewen F Kirkness
エフ. カークネス エウェン
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Human Genome Sciences Inc
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Human Genome Sciences Inc
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 hMutT2の必要性を有する患者およびh
MutT2を阻害する必要性を有する患者の処置のため
に、hMutT2に対するアンタゴニストおよびアゴニ
ストを同定する。 【解決手段】 ヒトhMutT2ポリペプチド、および
このようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)
ならびに組換え技術によるこのようなポリペプチドを産
生することを課題とする。酸化されたグアニンを加水分
解し、そしてヌクレオチドプールから排除して、正確な
DNA合成を確実にするために、このようなポリペプチ
ドを使用する方法もまた開示される。hMutT2の変
異体の存在およびhMutT2タンパク質の過剰発現を
検出する診断アッセイもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規に同定したポ
リヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチド
およびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳
細には、本発明のポリペプチドは、ヒトMutT2であ
り、本明細書中において以下「hMutT2」と呼ばれ
ることがある。本発明はまた、このようなポリペプチド
の作用を阻害することに関する。
【0002】
【従来の技術】DNA複製のエラーは自然突然変異へと
至る。自然突然変異が増えると、腫瘍のような異常細胞
の増殖および疾患に直接的に導かれる。自然突然変異の
ある部分は、正常な細胞代謝により発生する内因性フリ
ーラジカルによって引き起こされる。フリーラジカル
は、DNAに対して酸化性の損傷を引き起こし、そして
寿命における重要な決定要因であり得る(Ames,
B.N.およびGold,L.S.,Mutat.Re
s.,250:3−16(1991))。
【0003】酸素ラジカルは染色体DNAに損傷を与
え、細胞死を引き起こし、そして変異を誘発する。酸素
ラジカルによって引き起こされるDNA損傷の1つのタ
イプは、グアニン塩基の酸化体(8−オキソグアニン)
である(Shibutani,S.ら、Nature,
349:431−4(1991))。このグアニンの酸
化体はシトシンおよびアデニンと対を形成し得、続いて
G:CからT:Aへのトランスバージョンが生じる(T
keshelashvili,L.K.ら、J.Bio
l.Chem.,266:6401−6406(199
1))。従って、細胞代謝中間体によって生産される活
性酸素種は、正常な増殖細胞中でさえ、DNAのグアニ
ン塩基を酸化するに十分である。
【0004】グアニンの酸化は遊離ヌクレオチド形態に
おいても進行し、そしてdGTPの酸化体である8−オ
キソ−dGTPはDNA合成に関して強力な変異原性物
質である(Maki,HおよびSekiguchi,
M.,Nature,355:273−275(199
2))。DNAにおいて生じる8−オキソグアニンの結
果とは対照的に、8−オキソ−dGTPはG:Cから
T:AへのトランスバージョンのみならずA:Tから
C:Gへのトランスバージョンを誘発し得る(Chen
g. K.C.ら、J.Biol.Chem.,26
7:166−172(1992))。
【0005】E.coliにおいては、DNA中および
遊離ヌクレオチド形態中の両方のグアニン塩基の酸化に
より引き起こされる変異を回避する機構が存在する。酸
化されたDNAは、損傷したDNAから8−オキソグア
ニン塩基を除去する活性を有するMutMタンパク質に
よって修復される。他方、8−オキソ−dGTPは、変
異原性ヌクレオチドを8−オキソ−dGMPに加水分解
するmutTタンパク質によって、ヌクレオチドプール
から排除され得る(Maki,HおよびSekiguc
hi,M.,Nature,355:273−275
(1992))。mutT変異体において、鋳型のdA
残基に相対して誤って取り込まれた8−オキソ−dGM
Pは、MutMタンパク質によってDNA複製の次の回
の前に除去され得る。従って、mutTタンパク質は、
強力な変異原性物質である8−オキソ−dGTPを無害
なモノホスフェート物質へと分解して、適切なDNA合
成を確実にする。E.coli mutT遺伝子におけ
る変異は、A:TからC:Gへのトランスバージョンの
発生を、野生型レベルの100〜10,000倍に上昇
させる(Akiyama,M.ら、Mol.およびGe
n.Genet.,206:9−16(1987))。
【0006】真核生物および哺乳動物もまた、酸化され
たヌクレオチドを加水分解する酵素を有する。この酵素
は、E.coli mutT遺伝子に相同である。かな
りの量の8−オキソグアニンが哺乳動物細胞の染色体D
NAにおいて形成され、そして損傷を受けたヌクレオチ
ドの大部分がDNAから切除され、そして尿中に排泄さ
れる(Ames,B.N.およびGold,L.S.,
Mutat.Res.,250:3−16(1991)
およびShigenaga,M.K.ら、PNAS,8
6:9697−9701(1989))。
【0007】dGTPの自然酸化は8−オキソ−dGT
Pを形成し、これはほぼ等しい効率で鋳型DNAのdA
残基およびdC残基に相対して挿入され得、そしてmu
tTタンパク質は8−オキソ−dGTPをモノホスフェ
ートに特異的に分解する。従って、グアニンヌクレオチ
ドの酸化体をヌクレオチドプールから排除することが、
DNA合成の高い正確性のために重要である。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】hMutT2の必要性
を有する患者およびhMutT2を阻害する必要性を有
する患者の処置のために、hMutT2に対するアンタ
ゴニストおよびアゴニストを同定することを課題とす
る。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明は、(a)図1の
推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体を
コードするポリヌクレオチド;(b)ATCC寄託番号
75882中に含まれるcDNAによりコードされるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは該ポリペプ
チドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコード
するポリヌクレオチド、からなる群から選択される単離
されたポリヌクレオチドである。
【0010】好適な実施形態においては、上記ポリヌク
レオチドがDNAである。
【0011】好適な実施形態においては、上記ポリヌク
レオチドがRNAである。
【0012】好適な実施形態においては、上記ポリヌク
レオチドがゲノムDNA。
【0013】さらに好適な実施形態においては、上記ポ
リヌクレオチドが図1の推定アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする。
【0014】さらに好適な実施形態においては、上記ポ
リヌクレオチドがATCC寄託番号75882のcDN
Aによってコードされるポリペプチドをコードする。
【0015】好適な実施形態においては、上記ポリヌク
レオチドは図1に示されるコード配列を有する。
【0016】好適な実施形態においては、ベクターは上
記のDNAを含む。
【0017】本発明はまた、宿主細胞は上記のベクター
で遺伝子操作される。
【0018】本発明はまた、ポリペプチドを産生させる
方法であって、上記の宿主細胞から上記DNAによって
コードされるポリペプチドを発現させる工程を包含す
る。
【0019】本発明はまた、ポリペプチドを発現し得る
細胞を生成する方法であって、上記のベクターで細胞を
遺伝子操作する工程を包含する。
【0020】本発明はまた、上記のDNAとハイブリダ
イズし得、かつhMutT2活性を有するポリペプチド
をコードする単離されたDNAである。
【0021】本発明はまた、(i)図1の推定アミノ酸
配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメン
ト、アナログ、および誘導体、および(ii)ATCC
寄託番号75882のcDNAによりコードされるポリ
ペプチド、および該ポリペプチドのフラグメント、アナ
ログ、および誘導体、からなる群から選択されるポリペ
プチドである。
【0022】好適な実施形態においては、上記ポリペプ
チドが図1の推定アミノ酸配列を有する。
【0023】本発明はまた、上記のポリペプチドに対す
る抗体である。
【0024】本発明はまた、上記のポリペプチドを阻害
する化合物である。
【0025】本発明はまた、上記のポリペプチドを活性
化する化合物である。
【0026】本発明はまた、hMutT2の必要性を有
する患者の処置のための方法であって、上記ポリペプチ
ドの治療的有効量を患者に投与する工程を含み、ここで
ポリペプチドをコードするDNAを患者に提供し、そし
てポリペプチドをインビボで発現させることによって、
ポリペプチドが投与される。
【0027】本発明はまた、hMutT2を阻害する必
要性を有する患者の処置のための方法であって、上記の
化合物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む。
【0028】本発明はまた、上記の化合物および薬学的
に受容可能なキャリアーを含む薬学的組成物である。
【0029】本発明はまた、hMutT2に対するアン
タゴニストおよびアゴニストを同定するための方法であ
って:スクリーニングされるべき化合物の存在下、8−
オキソ−dGTPが加水分解される条件下で、hMut
T2を8−オキソ−dGTPに接触させる工程;8−オ
キソ−dGTPの加水分解の程度を決定する工程;およ
び、該化合物がhMutT2による8−オキソ−dGT
Pの加水分解を増強またはブロックするかどうかを同定
する工程を包含する。
【0030】本発明はまた、DNA複製におけるエラー
に対する感受性を診断する方法であって:宿主由来のサ
ンプルからhMutT2をコードする核酸配列を単離す
る工程;および、該hMutT2核酸配列中の変異を決
定する工程を包含する。
【0031】本発明はまた、宿主由来のサンプルにおけ
る上記のポリペプチドの存在を分析する工程を包含する
診断方法である。
【0032】
【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、サイズ
およびアミノ酸相同性においてヒトMutTに相当し、
それ故、ヒトMutT2として予備的に特徴付けられて
いる。
【0033】本発明の1つの局面によれば、hMutT
2である新規の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に
活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、そのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体が提供される。
【0034】本発明の別の局面によれば、hMutT2
をコードする単離された核酸分子(mRNA、DNA、
cDNA、ゲノムDNAを包含する)、ならびに生物学
的に活性であり、かつ診断的または治療的に有用な、そ
のフラグメント、アナログ、および誘導体が提供され
る。
【0035】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドを組換え技術により産生させる方法
が提供される。この方法は、hMutT2核酸配列を含
む組換え原核および/または真核宿主細胞をこのタンパ
ク質の発現を促進する条件下で培養すること、続いてこ
のタンパク質を回収することを包含する。
【0036】本発明のなおさらなる局面によれば、治療
目的、例えば、DNA合成の高い正確性のために、酸化
されたヌクレオシドトリホスフェート(特に8−オキソ
−dGTP)を特異的に加水分解して対応するモノホス
フェートにすることによって、DNA複製におけるエラ
ーおよび異常な細胞の増殖(例えば、腫瘍および癌にお
いて存在する)に関連する疾患を防止または処置するた
めに、このようなポリペプチドまたはこのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が
提供される。
【0037】本発明の別の局面によれば、hMutT2
配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸
分子を含む核酸プローブが提供される。
【0038】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。
【0039】本発明の別の局面によれば、hMutT2
核酸配列における変異およびそのような核酸配列によっ
てコードされるタンパク質に関連する疾患(例えば、異
常な細胞の増殖)または疾患に対する感受性の診断方法
が提供される。
【0040】本発明のさらに別の局面によれば、このよ
うなポリペプチドの作用を阻害するために(例えば、腫
瘍の処置において)使用され得る、このようなポリペプ
チドに対するアンタゴニストが提供される。
【0041】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNA
合成、およびDNAベクターの製造に関連するインビト
ロ目的に使用する方法が提供される。
【0042】本発明のこれらの局面および他の局面は、
本明細書中の教示から当業者には明らかであるはずであ
る。
【0043】本発明の局面によれば、図1の推定のアミ
ノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、またはATCC寄
託番号75882として1994年8月31日に寄託さ
れたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペ
プチドをコードする単離された核酸(ポリヌクレオチ
ド)が提供される。
【0044】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、胸腺、肝臓、脾臓、および前立腺のよう
なほとんどのヒト組織から得られ得る。本発明のポリヌ
クレオチドが、ヒトの8週齢の胚由来のcDNAライブ
ラリーにおいて発見された。これは、hMutTファミ
リーに構造的に関係する。これは、219アミノ酸残基
のタンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ムを含む。このタンパク質は、E.coli MutT
に対して、27アミノ酸長にわたり62%の同一性およ
び77%の類似性により、最も高い程度の相同性を示
す。GETXEおよびRELQ/EEEが、E.col
MutT、ヒトMutT1、およびhMutT2の
間で保存されていることもまた重要である。
【0045】本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形
態またはDNAの形態であり得る。DNAは、cDN
A、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNA
は二本鎖または一本鎖であり得る。そして、一本鎖の場
合、コード鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり
得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図
1に示すコード配列と同一であり得るか、または寄託し
たクローンのコード配列と同一であり得る。あるいは、
コード配列は、遺伝コードの重複または縮重の結果とし
て、図1のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポ
リペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【0046】図1の成熟ポリペプチドまたは寄託したc
DNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、次のものを包含し得る:成熟ポ
リペプチドのコード配列のみ;成熟ポリペプチドのコー
ド配列(および付加的なコード配列)ならびに非コード
配列(例えば、イントロン、または成熟ポリペプチドの
コード配列の5’および/または3’の非コード配
列)。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含む
ポリヌクレオチド、ならびに付加的なコード配列および
/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含す
る。
【0047】本発明はさらに、図1の推定アミノ酸配列
を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDN
Aによりコードされるポリペプチドのフラグメント、ア
ナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポ
リヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの
変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝
子変異体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変
異体であり得る。
【0048】従って、本発明は、図1に示すものと同じ
成熟ポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAに
よりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチド
の変異体を包含する。これらの変異体は、図1のポリペ
プチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコード
されるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはア
ナログをコードする。このようなヌクレオチド変異体
は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変
異体を包含する。
【0049】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図1に示すコード配列または寄託したクロ
ーンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体で
あるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるよう
に、対立遺伝子変異体は、1以上のヌクレオチドの置
換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列
の別の形態であり、これによってコードされるポリペプ
チドの機能は実質的に変化しない。
【0050】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポ
リペプチドの精製を提供するpQE−9ベクターにより
供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるい
は、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主(例えば、
COS−7細胞)が使用される場合、ヘマグルチニン
(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ
ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する
(Wilson,I.ら、Cell、37:767
(1984))。
【0051】本発明はさらに、配列間に少なくとも50
%、そして好ましくは70%の同一性が存在する場合、
本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレ
オチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリ
ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用い
られる用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少
なくとも95%、そして好ましくは少なくとも97%の
同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが
生じることをいう。好ましい実施態様において、本明細
書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドは、図1のcDNAまたは寄託したcDN
Aによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ
生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペプチ
ドをコードする。
【0052】本明細書中でいう寄託物(単数または複
数)は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の条項下に維持される。
これらの寄託物は、当業者に便宜上のみ提供され、そし
て米国特許法第112条の下で寄託が必要とされること
を容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレ
オチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用
されており、そして本明細書中の配列のいかなる記載と
のいかなる矛盾の場合も制御している。寄託物を製造、
使用、または販売するためには実施許諾が必要とされ
得、そしてこのような実施許諾は本明細書によって与え
られるわけではない。
【0053】本発明はさらに、図1の推定アミノ酸配列
を有するか、または寄託したcDNAによりコードされ
るアミノ酸配列を有するhMutT2ポリペプチド、な
らびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体に関する。
【0054】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図1のポリペプチド、または寄託し
たcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場
合、このようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機
能または生物学的活性を保持するポリペプチドを意味す
る。
【0055】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【0056】図1のポリペプチド、または寄託したcD
NAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、
誘導体、またはアナログは、(i)1以上のアミノ酸残
基が保存または非保存のアミノ酸残基(好ましくは保存
アミノ酸残基)で置換され、そしてこのような置換され
たアミノ酸残基が、遺伝コードによりコードされるアミ
ノ酸残基であってもよく、またはなくてもよいもの、あ
るいは(ii)1以上のアミノ酸残基が置換基を含有す
るもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリ
ペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエ
チレングリコール)のような別の化合物に融合されてい
るもの、あるいは(iv)付加的アミノ酸が成熟ポリペ
プチドに融合されるものであり得る。このようなフラグ
メント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示
から、当業者の範囲内にあると考えられる。
【0057】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。
【0058】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境(例えば、天然に存在する場合は、天然の環境)か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは単離されていないが、天然系において共存す
る物質の幾らかまたは全部から分離されたその同じポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。こ
のようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、
そして/またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは組成物の一部であり得、そしてさらに、この
ようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部で
はない点で単離され得る。
【0059】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。
【0060】宿主細胞は、本発明のベクター(これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る)を用いて遺伝子操作(形質導入または形質転換ま
たはトランスフェクト)される。ベクターは、例えば、
プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化す
るか、形質転換体を選択するか、またはhMutT2遺
伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地
中で培養され得る。培養条件(例えば、温度、pHな
ど)は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用
された条件であり、そして当業者には明らかである。
【0061】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか1つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、お
よび合成DNA配列を含有し、例えば、SV40の誘導
体;細菌性プラスミド;ファージDNA;バキュロウイ
ルス;酵母プラスミド;プラスミドおよびファージDN
Aの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のような
ウイルスDNAである。しかし、宿主内で複製可能で、
そして存続可能である限り、任意の他のベクターが使用
され得る。
【0062】適切なDNA配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、DNA配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
(単数または複数)に挿入される。このような手順およ
び他の手順は、当業者に公知の範囲内にあると考えられ
る。
【0063】発現ベクター中のDNA配列は、mRNA
の合成を指示するための適切な発現制御配列(単数また
は複数)(プロモーター)に作動可能に連結される。こ
のようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙
げられ得る:LTRまたはSV40プロモーター、E.
coli lacまたはtrp、λファージPLプロモ
ーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるい
はそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが
公知である他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネ
ーターを含有し得る。ベクターはまた、遺伝子のコピー
数を増幅するための適切な配列を含み得る。
【0064】さらに、発現ベクターは、好ましくは、1
つ以上の選択マーカー遺伝子を含有し、形質転換された
宿主細胞の選択のための表現型特性(例えば、真核生物
細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたは
ネオマイシン耐性、またはE.coliにおけるテトラ
サイクリン耐性またはアンピシリン耐性)を提供する。
【0065】本明細書中上記のような適切なDNA配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。
【0066】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る:細菌細胞(例えば、E.coliSt
reptomycesSalmonella typ
himurium);真菌細胞(例えば、酵母);昆虫
細胞(例えば、Drosophila S2およびSf
);動物細胞(例えば、CHO、COSまたはBow
es黒色腫);アデノウイルス;植物細胞など。適切な
宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内で
あると考えられる。
【0067】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した1つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター(例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター)を含み、このベクター中に
本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。
この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさら
に、配列に作動可能に連結された調節配列(例えば、プ
ロモーターを包含する)を含む。多数の適切なベクター
およびプロモーターが当業者には公知であり、そして市
販されている。以下のベクターが例として提供される。
細菌性:pQE70、pQE60、pQE−9(Qia
gen)、pBS、pD10、phagescrip
t、psiX174、pBluescript SK、
pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18
A、pNH46A(Stratagene);ptrc
99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR
540、pRIT5 (Pharmacia)。真核生
物性:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、p
XT1、pSG(Stratagene);pSVK
3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmaci
a)。しかし、宿主内で複製可能で、そして存続可能で
ある限り、任意の他のプラスミドまたはベクターも使用
され得る。
【0068】プロモーター領域は、CAT(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。2つの適切なベクターは、p
KK232−8およびpCM7である。特によく知られ
た細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T
3、T7、gpt、λPR、PL、およびtrpが挙げら
れる。真核生物プロモーターには、CMV即時初期型、
HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV
40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタ
ロチオネインIが含まれる。適切なベクターおよびプロ
モーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内にあ
る。
【0069】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞(例えば、哺乳動物細胞)または下等真核生
物細胞(例えば、酵母細胞)であり得るか、または宿主
細胞は原核生物細胞(例えば、細菌細胞)であり得る。
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトラン
スフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフ
ェクションまたはエレクトロポレーションにより達成さ
れ得る(Davis,L.、Dibner,M.、Ba
ttey,I.、Basic Methods in
Molecular Biology(1986))。
【0070】宿主細胞内の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生させるために、従来の方
法で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成機により合成的に生成され得
る。
【0071】成熟タンパク質は、適切なプロモーターの
制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞
中で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDN
A構築物に由来するRNAを使用して、このようなタン
パク質を産生させるために用いられ得る。原核生物宿主
および真核生物宿主と共に使用される適切なクローニン
グベクターおよび発現ベクターは、Sambrook
ら、MolecularCloning:A Labo
ratory Manual,第2版、Cold Sp
ring Harbor、N.Y.(1989)(この
開示は、本明細書中に参考として援用されている)に記
載されている。
【0072】本発明のポリペプチドをコードするDNA
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大する。エンハンサーはD
NAのシス作用因子であり、通常は約10〜約300b
pであり、これはプロモーターに作用してその転写を増
大させる。例としては、複製起点の100〜270bp
の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイル
スの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側
のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーが挙げられる。
【0073】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
(例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およ
S.cerevisiaeのTRP1遺伝子)および
下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子に由来す
るプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、解糖酵素(例えば、3−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ(PGK)、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱
ショックタンパク質など)をコードするオペロンに由来
し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止
配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細胞周
辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得るリー
ダー配列と適切な相で組立てられる。必要に応じて、異
種配列は、所望の特徴(例えば、発現された組換え産物
の安定化または簡略化された精製)を与えるN末端同定
ペプチドを含有する融合タンパク質をコードし得る。
【0074】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望のタ
ンパク質をコードする構造DNA配列を適切な翻訳開始
シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入することに
より構築される。ベクターは、1以上の表現型選択マー
カー、ならびに、ベクターの維持を保証するため、およ
び所望により宿主内での増幅を提供するために複製起点
を含有する。形質転換に適切な原核生物宿主は、E.c
oliBacillus subtilisSal
monella typhimurium、ならびにP
seudomonas属、Streptomyces
属、およびStaphylococcus属の種々の種
を包含するが、他もまた選択対象として用いられ得る。
【0075】代表的ではあるが限定的ではない例とし
て、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクロー
ニングベクターpBR322(ATCC 37017)
の遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選
択マーカーおよび細菌の複製起点を含有し得る。このよ
うな市販のベクターは、例えば、pKK223−3(P
harmacia Fine Chemicals、U
ppsala、Sweden)およびGEM1(Pro
mega Biotec、Madison、WI、US
A)を包含する。これらのpBR322「骨格」部分
は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わされる。
【0076】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモー
ターは、適切な手段(例えば、温度シフトまたは化学的
誘導)により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養
される。
【0077】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。
【0078】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。
【0079】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Gluzman、Cell、23:17
5(1981)に記載されているサル腎臓繊維芽細胞の
COS−7株、および適合性のベクターを発現し得る他
の細胞株(例えば、C127、3T3、CHO、HeL
a、およびBHK細胞株)を包含する。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部
位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびス
プライス受容部位、転写終止配列、および5’フランキ
ング非転写配列を含有する。SV40スプライスおよび
ポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非
転写遺伝エレメントを提供するために使用され得る。
【0080】hMutT2ポリペプチドは、以下に挙げ
る方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精
製され得る。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノ
ール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマ
トグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグ
ラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含さ
れる。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ(re
folding)工程が、成熟タンパク質の立体配置
(configuration)を完全にするために使
用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)が最終的な精製工程に用いられ得る。
【0081】本発明のhMutT2ポリペプチドは、天
然に精製された産物であっても、化学合成手順の産物で
あっても、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主か
ら組換え技術により(例えば、培養物中の細菌、酵母、
高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞により)産生され
ても良い。組換え産生手順に用いられる宿主に依存し
て、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもグ
リコシル化されなくても良い。本発明のポリペプチドは
また、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【0082】hMutT2ポリペプチドならびにポリペ
プチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、
本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチド
の発現により用いられ得る。これは、しばしば「遺伝子
治療」と呼ばれる。
【0083】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたは
RNA)を用いてエキソビボで操作され、次いで、操作
された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に
提供され得る。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【0084】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法
によって本発明のポリペプチドを投与するためのこれら
の方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には
明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒ
クルは、レトロウイルス以外のもの(例えば、アデノウ
イルス)であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組
み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用さ
れ得る。
【0085】一旦hMutT2ポリペプチドが遺伝子治
療により細胞内で発現されると、このポリペプチドは、
酸化形態のヌクレオシド3−リン酸を加水分解し、そし
てグアニンヌクレオチドの酸化形態に対する強い親和性
を有し、従ってこれらはヌクレオチドプールから除去さ
れ、そして高い適合度のDNA合成が確保される。hM
utT2ポリペプチドが存在しない場合、DNA複製に
おけるエラーが顕著に増大し、これは変異誘発を導く。
変異誘発は、例えば、腫瘍およびガンにおいて見られる
異常な細胞増殖を含む非常に多くの異常を引き起こすこ
とが知られている。従って、本発明のポリペプチドの投
与は、変異誘発の処置または予防に用いられ得る。
【0086】本発明のさらなる局面によれば、このよう
なポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを、科学研究、DNA合成、お
よびDNAベクターの製造に関するインビトロの目的に
利用するためのプロセスが提供される。
【0087】完全長のhMutT2遺伝子のフラグメン
トは、完全長の遺伝子を単離するため、およびこの遺伝
子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を
有する別の遺伝子を単離するために、cDNAライブラ
リー用のハイブリダイゼーションプローブとして用いら
れ得る。このタイプのプローブは、例えば、20と20
00塩基との間であり得る。しかし好ましくは、プロー
ブは、30と50塩基対との間を有する。プローブはま
た、完全長の転写産物に対応するcDNAクローン、な
らびにゲノムクローン、または制御およびプロモーター
領域、エキソンおよびイントロンを含有する完全なhM
utT2遺伝子を含むクローンを同定するために用いら
れ得る。スクリーニングの一例は、オリゴヌクレオチド
プローブを合成するために既知のDNA配列を用いるこ
とによって、hMutT2遺伝子のコード領域を単離す
ることを包含する。本発明の遺伝子の配列と相補的な配
列を有する標識したオリゴヌクレオチドは、ライブラリ
ーのどのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを
決定するために、ヒトcDNA、ゲノムDNA、または
mRNAのライブラリーのスクリーニングに用いられ
る。
【0088】本発明はまた、変異hMutT2の存在に
関係する疾患の検出、またはこの疾患に対する感受性に
ついての診断的アッセイの一部としてのhMutT2遺
伝子の使用に関する。このような疾患は、DNA複製に
おけるエラー、例えば、腫瘍および癌に導くエラーに関
する。
【0089】hMutT2遺伝子に変異を有する個体
は、多様な技術により、DNAレベルで検出され得る。
診断のための核酸は、患者の細胞、例えば、血液、尿、
唾液、組織生検、および剖検材料から得られ得る。ゲノ
ムDNAは、検出のために直接用いられ得るか、または
分析の前にPCR(Saikiら、Nature,32
4:163−166(1986))を用いて酵素的に増
幅され得る。RNAまたはcDNAも、同じ目的で用い
られ得る。例えば、hMutT2をコードする核酸に相
補的なPCRプライマーは、hMutT2変異の同定お
よび分析に用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、
正常な遺伝子型と比較した場合の増幅産物のサイズの変
化によって検出され得る。点変異は、放射能標識したh
MutT2RNA、または放射能標識したhMutT2
アンチセンスDNA配列に、増幅したDNAをハイブリ
ダイズさせることによって同定され得る。完全にマッチ
した配列は、RNase A消化または融解温度の相違
によりミスマッチの二重鎖から識別され得る。
【0090】DNA配列の相違に基づく遺伝子試験は、
変性剤を含むか、または含まないゲル中でのDNAフラ
グメントの電気泳動による移動度の変化の検出によって
達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能
ゲル電気泳動により可視化され得る。異なる配列のDN
Aフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別
され得る。ここで、異なるDNAフラグメントの移動度
は、ゲル中でその特異的な融解温度または部分融解温度
に従って異なる位置で遅らされ得る(例えば、Myer
sら、Science,230:1242(1985)
を参照)。
【0091】特異的位置における配列変化はまた、例え
ば、RNaseおよびS1保護のようなヌクレアーゼ保
護アッセイまたは化学的切断法により明らかにされ得る
(例えば、Cottonら、PNAS,USA,85:
4397−4401(1985))。
【0092】従って、特異的なDNA配列の検出は、例
えば、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学
的切断、直接DNA配列決定、または制限酵素の使用
(例えば、制限断片長多形(RFLP))、およびゲノ
ムDNAのサザンブロッティングのような方法によって
達成され得る。
【0093】より簡便なゲル電気泳動およびDNA配列
決定に加えて、インサイチュ分析によっても変異は検出
され得る。
【0094】本発明はまた、正常コントロール組織サン
プルと比較したhMutT2タンパク質の過剰発現は、
DNA複製の誤りに関する疾患(例えば、腫瘍)の存在
またはその疾患に対する感受性を検出し得るので、種々
の組織における変化したレベルのhMutT2タンパク
質を検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来
するサンプル中のhMutT2タンパク質のレベルを検
出するために使用されるアッセイは、当業者には周知で
あり、そしてラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセ
イ、ウエスタンブロット分析、ELISAアッセイおよ
び「サンドイッチ」アッセイを含む。ELISAアッセ
イ(Coliganら、CurrentProtoco
ls in Immunology,1(2),第6章
(1991))は、最初にhMutT2抗原に特異的な
抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を
包含する。さらに、レポーター抗体がモノクローナル抗
体に対して調製される。このレポーター抗体に対して、
検出可能な試薬、例えば、放射能、蛍光、またはこの実
施例においては、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を結
合させる。サンプルは宿主から取り出され、そしてサン
プル中のタンパク質と結合する固体支持体(例えば、ポ
リスチレンディッシュ)上でインキュベートされる。次
いで、ディッシュ上の任意のフリーのタンパク質結合部
位は、BSAのような非特異的タンパク質を用いてイン
キュベートすることにより覆われる。次に、モノクロー
ナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされる。こ
の間に、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシ
ュに結合された任意のhMutT2タンパク質と結合す
る。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液を用い
て洗い出される。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合し
たレポーター抗体はここで、ディッシュ中に置かれ、h
MutT2と結合した任意のモノクローナル抗体に対す
るレポーター抗体の結合を生じる。次いで、非付着レポ
ーター抗体は、洗い出される。次いで、ペルオキシダー
ゼ基質が、ディッシュに加えられ、そして所定の時間内
の発色量は、標準曲線と比較した場合、患者サンプルの
所定の容量中に存在するhMutT2タンパク質量の測
定値である。
【0095】競合アッセイが、使用され得る。ここで、
hMutT2に特異的な抗体は、固体支持体に付着し、
そして標識hMutT2および宿主由来のサンプルは、
固体支持体上を通過され、そして例えば、液体シンチレ
ーションクロマトグラフィーにより検出された標識の量
は、サンプル中のhMutT2量と相関し得る。
【0096】「サンドイッチ」アッセイは、ELISA
アッセイに類似する。「サンドイッチ」アッセイにおい
て、hMutT2は固体支持体上を通過され、それと固
体支持体に付着した抗体と結合する。次いで、第2の抗
体をhMutT2と結合させる。次いで、標識され、か
つ第2の抗体に特異的な第3の抗体は、固体支持体上を
通過され、そして第2の抗体に結合し、次いで、量が定
量され得る。
【0097】本発明はまた、hMutT2の機能を増強
する化合物(アゴニスト)、またはブロックする化合物
(アンタゴニスト)を同定するための、化合物のスクリ
ーニング方法に関する。このようなアッセイの例は、h
MutT2およびスクリーニングされるべき化合物の存
在下における8−oxo−dGTPから8−oxo−d
GMPへの加水分解を測定する工程を含む。反応混合物
(12.5 μl)は、20 mM Tris−HCl
(pH8.0)、4 mM MgCl2、40mM N
aCl、20μM 8−oxo−dGTP、80μg/
mlウシ血清アルブミン、8 mM DTT、10%グ
リセロール、hMutT2、およびスクリーニングされ
るべき化合物を含む。反応は30℃で20分間行われ、
そして2.0μlの50 mM EDTAの添加により
停止される。この反応混合物のアリコート(2μl)を
ポリエチレンイミン−セルロースプレート上にスポット
し、そしてその生成物を1時間、1M LiClを用い
るTLCにより基質から分離し、そしてFujix B
io−画像解析機(Fuji Photofilm C
ompany Limited Tokyo)を用いる
オートラジオグラフ分析により定量化する。次いで、h
MutT2の作用を阻害、または増強するための化合物
の能力が分析される。
【0098】ヒトMutT2は、細胞内で生成され、そ
して機能する。従って、アンタゴニストはいずれも細胞
内に存在しなければならない。hMutT2に対する潜
在的なアンタゴニストは、細胞内で生成される抗体を含
む。例えば、hMutT2に拮抗すると同定される抗体
は、当業者に公知の手順(例えば、hMutT2の機能
を妨げるために、適切な細胞を単鎖抗体をコードするD
NAを用いて形質転換する工程)により単鎖抗体として
細胞内で生成され得る。
【0099】別の潜在的なhMutT2アンタゴニスト
は、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンス
構築物である。アンチセンス技術は、三重らせん形成ま
たはアンチセンスDNAあるいはRNAを介して遺伝子
発現を制御するために使用され得る。これらの方法は両
方とも、ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAに結合
することに基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分
は、長さ約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリ
ゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオ
リゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補
的であるように設計され(三重らせん−Leeら、Nu
cl.Acids Res.,6:3073(197
9);Cooneyら、Science,241:45
6(1988);およびDervanら、Scienc
e,251:1360(1991)を参照のこと)、そ
れにより、hMutT2の転写および生成を妨げる。ア
ンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでm
RNAとハイブリダイズし、そしてmRNA分子のhM
utT2ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチ
センス−Okano、J.Neurochem.,5
6:560(1991);Oligodeoxynuc
leotides as Antisense Inh
ibitors of Gene Expressio
n,CRC Press,Boca Raton,FL
(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた、細
胞に送達され得、それによりアンチセンスRNAまたは
DNAがインビボで発現されてhMutT2の生成を阻
害し得る。
【0100】潜在的なアンタゴニストはまた、細胞膜を
通過し得、そしてこのポリペプチドの触媒部位に結合
し、そして占有し得、それにより触媒部位への基質の接
近を不可能にし、その結果、正常な生物学的活性が妨げ
られる低分子を含む。低分子の例としては、低分子ペプ
チドまたはペプチド様分子が挙げられるが、これらに限
定されない。
【0101】アンタゴニストは、所望でない細胞(例え
ば、腫瘍およびガンにおける細胞のような異常に分化す
る細胞)を標的化するために使用され得る。なぜなら、
hMutT2活性の妨害は、DNA複製エラーの修正を
妨げ、そして細胞の破壊を導き得るからである。
【0102】アンタゴニストは、例えば、本明細書中下
記のような薬学的に受容可能なキャリアを有する組成物
中で使用され得る。
【0103】本発明の低分子アゴニストおよびアンタゴ
ニストは、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いら
れ得る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチ
ド、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を
含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝
化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エ
タノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、
これらに限定されない。処方は、投与様式に合わせるべ
きである。
【0104】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1
つ以上の成分で満たされた1つ以上の容器を含む薬学的
パックまたはキットを提供する。このような容器に関し
て、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売
を統制する政府機関により規定された形式の製品表示を
し得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使
用、または販売における機関による認可を表す。さら
に、薬学的組成物は、他の治療化合物と併用して用いら
れ得る。
【0105】薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹
膜内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるよ
うな簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定
の適応症の処置および/または予防に効果的な量で投与
される。一般に、それらは少なくとも約10g/kg体
重の量で投与され、そして多くの場合、それらは1日あ
たり約8mg/kg体重を超えない量で投与される。多
くの場合、投薬量は、1日あたり約10g/kg体重〜
約1mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮
される。
【0106】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置
を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダイズ
し得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定す
る必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能な実
際の配列データ(反復多型)に基づいた染色体標識試薬
はほとんどない。本発明による染色体へのDNAのマッ
ピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子とを関
連付けるのに重要な、第1工程である。
【0107】簡略に述べれば、配列は、cDNAからP
CRプライマー(好ましくは15〜25bp)を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。3’非翻訳領域
のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で1つより多
いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑化
しないプライマーを迅速に選択するために使用される。
次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含
有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使
用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有する
ハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【0108】体細胞ハイブリッドのPCRマッピング
は、特定のDNAを特定の染色体に割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、同様の様式において特定の染色
体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクロ
ーンのプールを用いて部分的位置決め(subloca
lization)が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピングストラテジ
ーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識して
フローサイトメトリーで選別した(flow−sort
ed)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色
体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブ
リダイゼーションによるプレ選択を包含する。
【0109】cDNAクローンの中期染色体展開物への
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)
は、1工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、500または600塩基ほどの短
いcDNAを用いて使用され得るが、しかし2,000
bpより大きなクローンは、簡単な検出のために十分な
シグナル強度を有する独特の染色体位置に対して結合見
込みがより高い。FISHはESTが得られたクローン
の使用を必要とし、クローンは大きいほどよい。例え
ば、2,000bpはよく、4,000bpはよりよ
く、そして4,000より大きなものは、よい結果を妥
当な時間の割合で得るためにおそらく必ずしも必要では
ない。この技術の総説としては、Vermaら、Hum
an Chromosomes:A Manual o
f Basic Techniques,Pergam
on Press、New York(1988)を参
照のこと。
【0110】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
V.McKusick、Mendelian Inhe
ritance in Man(Johns Hopk
ins University Welch Medi
cal Libraryからオンラインで入手可能であ
る)に見出される。次いで、同一の染色体領域にマップ
されている遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析(物理的
に隣接した遺伝子の同時遺伝)により同定される。
【0111】次いで、罹患個体と非罹患個体との間のc
DNAまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。
変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが
正常な個体には観察されない場合、この変異はこの疾患
の原因因子であると思われる。
【0112】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500と
の間の潜在的原因遺伝子の1つであり得る。(これは、
1メガ塩基のマッピング解像度で、そして20kbあた
り1遺伝子と仮定する。)このポリペプチド、それらの
フラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナロ
グ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する
抗体を生成するための免疫原として使用され得る。これ
らの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、
単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメン
ト、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。
当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体および
フラグメントの生成のために使用され得る。
【0113】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して作製される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を作製するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からそのポリペプチドを単離するために使用され
得る。
【0114】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の
技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
(KohlerおよびMilstein、1975、N
ature、256:495−497)、トリオーマ技
術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、
1983、Immunology Today 4:7
2)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するための
EBVハイブリドーマ技術(Coleら、1985、M
onoclonal Antibodies and
CancerTherapy、Alan R.Lis
s,Inc.、77−96頁)が挙げられる。
【0115】単鎖抗体の生成について記載された技術
(米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。トランスジェニックマウスもまた、本
発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発
現するために使用され得る。
【0116】本発明を以下の実施例を参考としてさらに
記載する;しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。すべての部または量は、他
に明記しない限り重量基準である。
【0117】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い特定の方法および/または用語を記載
する。
【0118】「プラスミド」は、小文字のpの前および
/または後の大文字および/または数字により示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、制
限基準なく公的に入手可能であるか、または公表された
手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得るか
のいずれかである。さらに、記載されるプラスミドと等
価なプラスミドが当該分野で公知であり、そして当業者
には明らかである。
【0119】DNAの「消化」は、DNA中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には1μgのプラスミ
ドまたはDNAフラグメントを、約2単位の酵素ととも
に約20μlの緩衝溶液中で使用する。プラスミド構築
のためのDNAフラグメントを単離する目的のために、
代表的には5〜50μgのDNAを20〜250単位の
酵素で、より大きな容量中で消化する。特定の制限酵素
のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特
定される。37℃での約1時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って
変化し得る。消化の後、反応物をポリアクリルアミドゲ
ルで直接電気泳動することにより所望のフラグメントを
単離する。
【0120】切断されたフラグメントのサイズ分離は、
Goeddel,Dら、Nucleic Acids
Res.,8:4057(1980)により記載される
8%ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
【0121】「オリゴヌクレオチド」は、1本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは2つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
5’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とATPとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。
【0122】「連結」は、2つの2本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う(Maniatis,T.ら、同上、146頁)。他
に提供しない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結される
べきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT
4 DNAリガーゼ(「リガーゼ」)とともに、公知の
緩衝液および条件を用いて達成され得る。他に記載しな
い限り、形質転換はGraham,F.およびVan
der Eb,A.、Virology、52:456
−457(1973)の方法に記載されるように行っ
た。
【0123】
【実施例】(実施例1:hMutT2の細菌発現および
精製)hMutT2をコードするDNA配列(ATCC
受託番号第75882号)を、hMutT2タンパク質
の5’配列(シグナルペプチド配列を除く)およびhM
utT2遺伝子に対して3’のベクター配列に対応する
PCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増
幅する。hMutT2に対応するさらなるヌクレオチド
を、それぞれ5’および3’配列に添加した。5’オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、配列5’ GCGGTC
GACATGAGCCAAGAACCAACG 3’を
有し、SalI制限酵素部位、続いてプロセシングされ
たタンパク質の推定末端アミノ酸から始まる21ヌクレ
オチドのhMutT2コード配列を含む。3’配列、
5’ GCGTCTAGATTAAAATTTCAAG
AAGGGCAC 3’は、XbaI部位に相補的な配
列を含み、それに21ヌクレオチドのhMutT2が続
く。制限酵素部位は、細菌発現ベクターpQE−9(Q
iagen,Inc.9259 Eton Avenu
e, Chatsworth,CA,91311)の制
限酵素部位に対応する。pQE−9は、抗生物質耐性
(Ampr)、細菌の複製起点(ori)、IPTG調
節可能プロモーター オペレーター(P/O)、リボソ
ーム結合部位(RBS)、6−Hisタグ、および制限
酵素部位をコードする。次いで、pQE−9をSalI
およびXbaIで消化した。増幅配列をpQE−9に連
結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする
配列にインフレームに挿入した。次いで、連結混合物を
用いて、E.coli株m15/REP4(Qiage
n)をSambrook,J.ら、Molecular
Cloning:A Laboratory Man
ual, Cold Spring Laborato
ry Press,(1989)に記載の手順により形
質転換した。m15/REP4は、プラスミドpREP
4の多数のコピーを含み、lacIリプレッサーを発現
し、そしてカナマイシン耐性(Kanr)も与える。形
質転換体はLBプレート上で増殖するそれらの能力によ
り同定され、そしてアンピシリン/カナマイシン耐性コ
ロニーが選択された。プラスミドDNAを単離して、制
限分析により確認した。所望の構築物を含むクローン
を、Amp(100μg/ml)とKan(25μg/
ml)との両方を補充したLB培地における液体培養で
一晩(O/N)増殖させた。O/N培養物を用いて1:
100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細
胞を、600の光学密度(O.D.600)が0.4と
0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG
(「イソプロピル−B−D−チオガラクトピラノシ
ド」)を加えて1mMの最終濃度にした。IPTGはl
acIリプレッサーを不活性化することにより、遺伝子
発現を増加させるためのP/Oの解放(clear)を
誘導する。細胞をさらに3〜4時間増殖させた。次い
で、細胞を遠心分離により採集した。細胞ペレットをカ
オトロピック剤である6MグアニジンHClで可溶化さ
せた。澄明化後、可溶化されたhMutT2を、6−H
isタグを含むタンパク質によって堅く結合させる条件
下でニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーに
よりこの溶液から精製した(Hochuli, E.
ら、J. Chromatography 411:1
77−184(1984))。hMutT2(80%を
超える純度)を、6MグアニジンHCl(pH 5.
0)でカラムから溶出し、そして再生の目的のために、
3MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウム、
10mMグルタチオン(還元型)、および2mMグルタ
チオン(酸化型)に調整した。この溶液で12時間イン
キュベーションした後、タンパク質を10mMリン酸ナ
トリウムに対して透析した(図3)。
【0124】(実施例2:バキュロウイルス発現系を用
いるhMutT2のクローニングおよび発現)完全長の
hMutT2タンパク質をコードするDNA配列(AT
CC受託番号第75882号)を、遺伝子の5’および
3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて増幅した。
【0125】5’プライマーは、配列
【0126】
【化1】 を有し、SmaI制限酵素部位(下線)、それに続く真
核細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似す
る21ヌクレオチド(J.Mol.Biol.198
7,196,947−950,Kozak,M.)を含
む。
【0127】3’プライマーは、配列5’ GCGGG
TACCTTAAAATTTCAAGAAGGGCAC
3’を有し、制限エンドヌクレアーゼAsp718の
切断部位およびhMutT2遺伝子の3’非翻訳配列に
相補的な21ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、
市販のキット(「Geneclean」 BIO 10
1 Inc.,La Jolla,Ca.)を用いて、
1%アガロースゲルより単離した。次いで、フラグメン
トをエンドヌクレアーゼSmaIおよびAsp718で
消化し、次いで1%アガロースゲルで再度精製した。こ
のフラグメントを、F2と称する。
【0128】ベクターpA2(pVL941ベクターの
改変体、下記)をバキュロウイルス発現系を用いるhM
utT2タンパク質の発現のために用いる(総説につい
て、Summers,M.D.およびSmith,G.
E.1987,A manual of method
s for baculovirus vectors
and insect cell culture
procedures,Texas Agricult
ural Experimental Station
Bulletin No.1555を参照のこと)。
この発現ベクターは、Autographa cali
fornica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の
強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エン
ドヌクレアーゼSmaIおよびAsp718の認識部位
を含む。シミアンウイルス(SV)40のポリアデニル
化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組
換えウイルスを容易に選択するために、E.coli
来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子
のポリアデニル化シグナルの前に、ポリヘドリンプロモ
ーターと同方向に挿入した。ポリヘドリン配列を、コト
ランスフェクトされた野生型ウイルスDNAの細胞媒介
性相同組換えのためのウイルス配列により両端で隣接す
る。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pRG1
の代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pV
L941、およびpAcIM1である(Luckow,
V.A.およびSummers,M.D.、Virol
ogy,170:31−39)。
【0129】プラスミドを制限酵素SmaIおよびAs
p718で消化し、次いで当該分野で公知の手順により
仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次い
で、DNAを、市販のキット(「Geneclean」
BIO 101 Inc.,La Jolla,C
a.)を用いて1%アガロースゲルから単離した。この
ベクターDNAをV2と称する。
【0130】フラグメントF2および脱リン酸化プラス
ミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。
次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、
そして酵素SmaIおよびAsp718を用いて、hM
utT2遺伝子を有するプラスミド(pBac hMu
tT2)を含む細菌を同定した。クローン化フラグメン
トの配列を、DNA配列決定により確認した。
【0131】5gのプラスミドpBac hMutT2
を、リポフェクション法(Felgnerら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,84:74
13−7417(1987))を用いて、1.0gの市
販の線状化したバキュロウイルス(「BaculoGo
ldTM baculovirus DNA」,Phar
mingen,San Diego,CA.)とともに
コトランスフェクトした。
【0132】1gのBaculoGoldTMウイルスD
NAおよび5gのプラスミドpBac hMutT2
を、50lの無血清Grace培地(Life Tec
hnologies Inc.,Gaithersbu
rg,MD)を含むマイクロタイタープレートの無菌ウ
ェル中で混合した。その後、10lリポフェクチンと9
0lのGrace培地を添加し、混合し、そして室温に
て15分間インキュベートした。次いで、そのトランス
フェクション混合物を、無血清Grace培地1mlを
有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9
昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴下した。
プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、
前後に振盪した。次いでプレートを、27℃で5時間イ
ンキュベートした。5時間後、トランスフェクション溶
液をプレートから除去し、そして10%ウシ胎児血清を
補充した1mlのGrace昆虫培地を添加した。プレ
ートをインキュベーターに戻し、そして27℃で4日間
培養を続けた。
【0133】4日後、上清を回収し、そしてSumme
rsおよびSmith(前出)による記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「Blue Ga
l」(Life Technologies In
c.,Gaithersburg)を有するアガロース
ゲルを用いた。(「プラークアッセイ」の詳細な記述は
また、Life Technologies In
c.、Gaithersburg、で配布される昆虫細
胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド(9〜
10頁)においても見い出され得る)。
【0134】ウイルスの連続希釈物を細胞に加えた4日
後、、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒
天を、200lのGrace培地を含むエッペンドルフ
チューブに再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により
除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、
35mmディッシュに播種されたSf9細胞を感染させ
るために用いた。4日後、これらの培養ディッシュの上
清を回収し、次いで4℃で保存した。
【0135】Sf9細胞を、10%熱失活化FBSを補
充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、感染多
重度(MOI)2で組換えバキュロウイルスV−hMu
tT2で感染させた。6時間後、その培地を除去し、そ
してメチオニンおよびシステインを除いたSF900
II培地(Life Technologies In
c.,Gaithersburg)に置き換えた。42
時間後、5Ciの35S−メチオニンおよび5Ciの35
システイン(Amersham)を添加した。細胞を、
さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分
離により採集し、そしてSDS−PAGEおよびオート
ラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可視化
した。
【0136】(実施例3:COS細胞における組換えh
MutT2の発現)発現プラスミドhMutT2 HA
は、以下を含むベクターpcDNAI/Amp(Inv
itrogen)に由来する:1)SV40複製起点、
2)アンピシリン耐性遺伝子、3)E.coli複製起
点、4)ポリリンカー領域、SV40イントロン、およ
びポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。hM
utT2前駆体全体およびその3’末端にインフレーム
で融合されたHAタグをコードするDNAフラグメント
を、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。そ
れゆえ、組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター
下で支配される。HAタグは、以前に記載されたような
インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトー
プに対応する(I.Wilson、H.Niman、
R.Heighten、A Cherenson、M.
Connolly、およびR.Lerner、198
4,Cell 37,767)。本発明者らの標的タン
パク質に対するHAタグの融合は、HAエピトープを認
識する抗体での組換えタンパク質の容易な検出を可能に
する。
【0137】プラスミド構築ストラテジーを以下に記載
する:hMutT2をコードするDNA配列(ATCC
受託番号第75882号)を、以下の2つのプライマー
を用いて、クローン化された最初のESTに対するPC
Rにより構築した:5’プライマー5’ GCGGAA
TTCATGGAGAGCCAAGAACCAACG
3’は、EcoRI部位とその後の開始コドンから始ま
る21ヌクレオチドのhMutT2コード配列を含む;
3’配列5’GCGCTCGAGTCAAGCGTAG
TCTGGGACGTCGTATGGGTAAAATT
TCAAGAAGGGCAC 3’は、XhoI部位、
翻訳停止コドン、HAタグ、およびhMutT2コード
配列の最後の18ヌクレオチド(停止コドンは含まな
い)に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、
EcoRI部位、インフレームで融合されたHAタグが
続くhMutT2コード配列、HAタグに隣接する翻訳
終了停止コドン、およびXhoI部位を含む。PCRで
増幅されたDNAフラグメントおよびベクターpcDN
AI/Ampを、EcoRIおよびXhoI制限酵素に
より消化し、そして連結した。連結混合物を、E.co
li株SURE(Stratagene Clonin
g Systems, 11099 North To
rrey Pines Road,La Jolla,
CA 92037より入手可能)に形質転換し、形質転
換された培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、
そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形
質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在
について制限分析により試験した。組換えhMutT2
の発現のために、COS細胞を、DEAE−DEXTR
AN法(J.Sambrook、E.Fritsch、
T.Maniatis、Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual,C
old Spring Laboratory Pre
ss,(1989))により発現ベクターでトランスフ
ェクトした。hMutT2 HAタンパク質の発現を、
放射標識および免疫沈降法(E.Harlow,D.L
ane,Antibodies:A Laborato
ryManual, Cold Spring Har
bor Laboratory Press,(198
8))により検出した。細胞を、トランスフェクション
の2日後、35S−システインで8時間標識した。次いで
培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(RIPA
緩衝液(150mM NaCl、1% NP−40、
0.1% SDS、1% NP−40、0.5% DO
C、50mMTris(pH7.5))(Wilso
n,I.ら、同上 37:767(1984))で溶解
した。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的
モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈降したタン
パク質を15% SDS−PAGEゲルで分析した。
【0138】(実施例4:ヒト組織におけるhMutT
2の発現パターン)ヒト組織におけるhMutT2の発
現レベルを調べるためにノーザンブロット分析を行っ
た。総細胞RNAサンプルを、RNAzolTM B シ
ステム(Biotecx Laboratories,
Inc.6023 South Loop Eas
t, Houston,TX77033)を用いて単離
した。指定したそれぞれのヒト組織から単離した約15
μgの総RNAを1%アガロースゲルで分離し、そして
ナイロンフィルター上にブロットした(Sambroo
k, FritschおよびManiatis,Mol
ecular Cloning, Cold Spri
ng Harbor Press,(1989))。標
識反応を、Stratagene Prime−Itキ
ットによって50ngのDNAフラグメントを用いて行
った。標識されたDNAを、Select−G−50カ
ラムを用いて精製した。(5Prime−3Prim
e,Inc.5603 Arapahoe Road,
Boulder,CO 80303)。次いで、フィル
ターを0.5M NaPO4(pH 7.4)および7
% SDS中で65℃にて一晩、1,000,000c
pm/mlで放射標識された完全長hMutT2遺伝子
とハイブリダイズした。次いでフィルターを、0.5×
SSC、0.1% SDSを用いて室温で二回、および
60℃で二回洗浄した後、フィルターを増強スクリーン
を用いて−70℃で一晩露出した。hMutT2のメッ
セージRNAは、胸腺、精巣、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、
脾臓、前立腺、胎盤中に豊富である(図4)。
【0139】本発明の多くの改変および変形が、上記の
教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載さ
れた以外にも、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実
施され得る。
【0140】
【発明の効果】hMutT2に対するアンタゴニストお
よびアゴニストを同定することによって、hMutT2
の必要性を有する患者およびhMutT2を阻害する必
要性を有する患者を処置し得る。
【0141】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして
請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するこ
とを意図しない。
【図1A】図1Aは、hMutT2ポリペプチドのcD
NA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸の標準的な1文字略記が用いられている。
【図1B】図1Bは、hMutT2ポリペプチドのcD
NA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸の標準的な1文字略記が用いられている。
【図1C】図1Cは、hMutT2ポリペプチドのcD
NA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸の標準的な1文字略記が用いられている。
【図1D】図1Dは、hMutT2ポリペプチドのcD
NA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸の標準的な1文字略記が用いられている。
【図1E】図1Eは、hMutT2ポリペプチドのcD
NA配列および対応する推定のアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸の標準的な1文字略記が用いられている。
【図2A】図2Aは、E.coli MutT、ヒトM
utT1、およびhMutT2の間のアミノ酸相同性を
示す。ここで陰影を付けた領域は異なる配列間で同一で
あるアミノ酸残基を表す。本発明のhMutT2は、ヒ
トMutT1よりもE.coli MutTに高いアミ
ノ酸相同性を有する。
【図2B】図2Bは、E.coli MutT、ヒトM
utT1、およびhMutT2の間のアミノ酸相同性を
示す。ここで陰影を付けた領域は異なる配列間で同一で
あるアミノ酸残基を表す。本発明のhMutT2は、ヒ
トMutT1よりもE.coli MutTに高いアミ
ノ酸相同性を有する。
【図3】図3は、hMutT2の細菌による発現および
精製の後のゲルを示す。ここでhMutT2はこのゲル
を通して電気泳動されている。レーン1は分子量マーカ
ーであり、レーン2は非誘導のE.coli抽出物であ
り、レーン3はIPTG誘導されたE.coli抽出物
であり、そしてレーン4はレーン3のニッケルカラム精
製例である。レーン3および4において分子量34kD
および31kDの2つのタンパク質バンドが誘導されて
おり、31kDタンパク質は34kDヒトMutT2の
分解産物であると推定される。
【図4】図4はhMutT2のヒト組織における分布を
示すゲルである。レーン1、胸腺;レーン2、精巣;レ
ーン3、胆嚢;レーン4、腎臓;レーン5、肝臓;レー
ン6、肺;レーン7、脾臓;レーン8、前立腺;レーン
9、脳;レーン10、心臓;レーン11、胎盤。hMu
tT2はほとんどのヒトの組織で遍在的に発現される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 38/46 C12N 15/00 ZNAA 48/00 A61K 37/02 A61P 35/00 37/54 (71)出願人 597018381 9410 Key West Avenue, Rockville, Marylan d 20850, United State s of America (72)発明者 ウェイ イン−フェイ アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ダーネスタウン, ストロー ベイル レーン 13524 (72)発明者 エウェン エフ. カークネス アメリカ合衆国 メリーランド 20832, オルネイ, リトル ビスタ テラス 2519 Fターム(参考) 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA01 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA22 CA18 CA43 DC22 NA14 ZB26 ZC19 4C087 AA03 BB65 BC83 CA12 NA14 ZB26 ZC19

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下からなる群から選択される単離され
    たポリヌクレオチド; (a)図1の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、
    あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
    たは誘導体をコードするポリヌクレオチド; (b)ATCC寄託番号75882中に含まれるcDN
    Aによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
    グ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド。
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