JP2002369684A - ヒトウリジンジホスフェートガラクトース−４−エピメラーゼ - Google Patents
ヒトウリジンジホスフェートガラクトース−４−エピメラーゼInfo
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- JP2002369684A JP2002369684A JP2002134760A JP2002134760A JP2002369684A JP 2002369684 A JP2002369684 A JP 2002369684A JP 2002134760 A JP2002134760 A JP 2002134760A JP 2002134760 A JP2002134760 A JP 2002134760A JP 2002369684 A JP2002369684 A JP 2002369684A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコード
するＤＮＡ（ＲＮＡ）、およびこのようなポリペプチド
を組換え技術によって産生すること。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって、
以下： （ａ）配列番号２に示されるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポリヌクレオ
チド；および （ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のフラグメ
ント、該フラグメントは少なくとも５０塩基対長であ
る、からなる群より選択されるメンバーを包含する、単
離されたポリヌクレオチド。
ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコード
するＤＮＡ（ＲＮＡ）、およびこのようなポリペプチド
を組換え技術によって産生すること。 【解決手段】 単離されたポリヌクレオチドであって、
以下： （ａ）配列番号２に示されるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポリヌクレオ
チド；および （ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のフラグメ
ント、該フラグメントは少なくとも５０塩基対長であ
る、からなる群より選択されるメンバーを包含する、単
離されたポリヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】ヒトウリジンジホスフェート
ガラクトース−４−エピメラーゼ本発明は、新規に同定
されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
にコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本
発明のポリペプチドはヒトウリジンジホスフェートガラ
クトース−４−エピメラーゼとして推定的に同定され
た。
ガラクトース−４−エピメラーゼ本発明は、新規に同定
されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド
にコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本
発明のポリペプチドはヒトウリジンジホスフェートガラ
クトース−４−エピメラーゼとして推定的に同定され
た。
【０００２】
【従来の技術】炭水化物は動物、植物、そして多くの微
生物における主要なエネルギー源である。これらはま
た、脂肪酸、トリグリセリド、およびいくつかのアミノ
酸のような他の化合物の生合成における前駆体であり得
る。炭水化物はまた、結合組織、神経組織、細菌細胞
壁、および核酸の構造的成分として重要である。
生物における主要なエネルギー源である。これらはま
た、脂肪酸、トリグリセリド、およびいくつかのアミノ
酸のような他の化合物の生合成における前駆体であり得
る。炭水化物はまた、結合組織、神経組織、細菌細胞
壁、および核酸の構造的成分として重要である。
【０００３】高等動物によって摂取される二糖類は、通
常加水分解されて腸への吸収の前に単糖類になる。例え
ば、スクロースはグルコースとフルクトースとに、マル
トースはグルコースに、そしてラクトースはグルコース
とガラクトースに、ほとんどの場合は酵素的活性によっ
て変換される。炭水化物の生合成のために最終的に使用
されるのは、これらの単糖類である。単糖類のＬ型は重
要性が少なく、そして炭水化物の生合成において最も頻
繁に利用されるのはＤ型である。
常加水分解されて腸への吸収の前に単糖類になる。例え
ば、スクロースはグルコースとフルクトースとに、マル
トースはグルコースに、そしてラクトースはグルコース
とガラクトースに、ほとんどの場合は酵素的活性によっ
て変換される。炭水化物の生合成のために最終的に使用
されるのは、これらの単糖類である。単糖類のＬ型は重
要性が少なく、そして炭水化物の生合成において最も頻
繁に利用されるのはＤ型である。
【０００４】ガラクトースは、炭水化物の生合成、およ
び哺乳動物系の正常な機能に重要な多くの他の巨大分子
の合成において重要な前駆体である。
び哺乳動物系の正常な機能に重要な多くの他の巨大分子
の合成において重要な前駆体である。
【０００５】ウリジンジホスフェート−ガラクトース
（ＵＤＰ−ガラクトース）はまた、腸管においてラクト
ースまたは乳糖（ｍｉｌｋ ｓｕｇａｒ）の酵素的加水
分解によって形成される遊離Ｄ−ガラクトースの代謝に
おける重要な中間体である。Ｄ−ガラクトースは肝臓に
おいて２種の反応によってＤ−グルコースに変換され
る。これらの反応は、ヒトの遺伝的欠損に関連し、その
結果、遺伝的疾患であるガラクトース血症の異なる形態
を引き起こすために、多くの感心を引きつける。ガラク
トース血症は、３つの公知の形態の欠損（ガラクトキナ
ーゼ欠損、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランス
フェラーゼ欠損、およびＵＤＰ−ガラクトース−４−エ
ピメラーゼ欠損）から生じる。
（ＵＤＰ−ガラクトース）はまた、腸管においてラクト
ースまたは乳糖（ｍｉｌｋ ｓｕｇａｒ）の酵素的加水
分解によって形成される遊離Ｄ−ガラクトースの代謝に
おける重要な中間体である。Ｄ−ガラクトースは肝臓に
おいて２種の反応によってＤ−グルコースに変換され
る。これらの反応は、ヒトの遺伝的欠損に関連し、その
結果、遺伝的疾患であるガラクトース血症の異なる形態
を引き起こすために、多くの感心を引きつける。ガラク
トース血症は、３つの公知の形態の欠損（ガラクトキナ
ーゼ欠損、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランス
フェラーゼ欠損、およびＵＤＰ−ガラクトース−４−エ
ピメラーゼ欠損）から生じる。
【０００６】肝臓において、遊離のＤ−ガラクトースは
最初に炭素原子１でガラクトキナーゼによってリン酸化
されてＤ−ガラクトース−１−リン酸を生じ、これは２
つの起こり得る反応の１つによってＵＤＰガラクトース
に変換される。重要でない方の経路は、ＵＴＰガラクト
ース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼによって
触媒される。
最初に炭素原子１でガラクトキナーゼによってリン酸化
されてＤ−ガラクトース−１−リン酸を生じ、これは２
つの起こり得る反応の１つによってＵＤＰガラクトース
に変換される。重要でない方の経路は、ＵＴＰガラクト
ース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼによって
触媒される。
【０００７】こうして形成されたＵＤＰ−ガラクトース
は、通常ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼによ
ってＵＤＰ−グルコースに変換される。我々が理解する
ように、ＵＤＰ−グルコースがそのグルコース残基をグ
リコーゲンに与え得るので、これらの反応によって、ガ
ラクトース残基がグルコース代謝の主要な経路に入るこ
とが可能になる。このウリジルトランスフェラーゼは、
成人の肝臓には多量に存在するが、小児では欠如してい
る。
は、通常ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼによ
ってＵＤＰ−グルコースに変換される。我々が理解する
ように、ＵＤＰ−グルコースがそのグルコース残基をグ
リコーゲンに与え得るので、これらの反応によって、ガ
ラクトース残基がグルコース代謝の主要な経路に入るこ
とが可能になる。このウリジルトランスフェラーゼは、
成人の肝臓には多量に存在するが、小児では欠如してい
る。
【０００８】遊離ガラクトースの利用のための第２の経
路はまた、ガラクトース−１−リン酸で始まる。これ
は、ＵＤＰ−グルコース：ガラクトース−１−リン酸ウ
リジルトランスフェラーゼによって触媒される。この特
定の酵素は正常な胎児肝臓に存在するが、ガラクトース
血症の１つの形態を有する小児では欠如している。従っ
て、このような小児は、いずれの経路によってもガラク
トースを利用し得ない。ガラクトース血症の小児は、血
液中に過剰の濃度のＤ−ガラクトースを有し、そして、
眼の水晶体の白濁、精神障害、末梢神経系の欠陥、失
明、聴覚の不全、臓器巨大症、肝機能異常（血液ガラク
トースの上昇、ガラクトース尿症、高クロール血症性
（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｏｒｅｍｉｃ）アシドーシス、ア
ルブミン尿症、およびアミノ酸尿症を含む）を罹患する
（Ｍａｓｏｎ，Ｈ．Ｈ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｍ．
Ｅ．、Ａｍ．Ｊ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ，５０：３５９
（１９３５）およびＫｏｍｒｏｗｅｒ，Ｇ．Ｍ．ら、Ａ
ｒｃｈ．Ｄｌｓ．Ｃｈｉｌｄ，３１：２５４（１９５
６））。
路はまた、ガラクトース−１−リン酸で始まる。これ
は、ＵＤＰ−グルコース：ガラクトース−１−リン酸ウ
リジルトランスフェラーゼによって触媒される。この特
定の酵素は正常な胎児肝臓に存在するが、ガラクトース
血症の１つの形態を有する小児では欠如している。従っ
て、このような小児は、いずれの経路によってもガラク
トースを利用し得ない。ガラクトース血症の小児は、血
液中に過剰の濃度のＤ−ガラクトースを有し、そして、
眼の水晶体の白濁、精神障害、末梢神経系の欠陥、失
明、聴覚の不全、臓器巨大症、肝機能異常（血液ガラク
トースの上昇、ガラクトース尿症、高クロール血症性
（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｏｒｅｍｉｃ）アシドーシス、ア
ルブミン尿症、およびアミノ酸尿症を含む）を罹患する
（Ｍａｓｏｎ，Ｈ．Ｈ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｍ．
Ｅ．、Ａｍ．Ｊ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ，５０：３５９
（１９３５）およびＫｏｍｒｏｗｅｒ，Ｇ．Ｍ．ら、Ａ
ｒｃｈ．Ｄｌｓ．Ｃｈｉｌｄ，３１：２５４（１９５
６））。
【０００９】精神遅延は、ガラクトース血症の最も顕著
な結果である。遅延の程度は、極めて低いＩＱ値が生じ
ることで特徴づけられる。不十分な活力、内気、および
引きこもりにより、精神学的問題もまた有力であるよう
である（Ｎａｄｌｅｒ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｇａｌａｃｔｏｓ
ｅｍｉａ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ，１２７頁（１９６９）ならび
にＫｏｍｒｏｗｅｒ，Ｇ．Ｍ．およびＬｅｅ Ｄ．
Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ，４５：３６７
（１９７０））。他の結果は、適切な食事療法を受けた
女性における高ゴナドトロピン性性機能不全を伴う卵巣
不全の高発生率を含む（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｆ．Ｒ．ら、
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０５：９９４（１９８
１）； Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，３０５：４６４（１９８１）； Ｋａｕ
ｆｍａｎ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅ
ｔａｂ．Ｄｉｓ．，９：１４０（１９８６）； Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅ
ｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．，９１：１９９（１９８４）；
およびＦｒａｓｅｒ，Ｉ．Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｐｒ
ｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，４：１３３（１９８６））。こ
れらの欠損は、この疾患に起因するごくわずかな欠損で
あり、そしてこの疾患に起因する多数の他の障害ならび
に解剖学的問題および生物学的問題が存在する。ガラク
トース血症の第２の型は、生物学的原因および結果とし
て生じる疾患においてわずかな変化を伴って、第１の型
と類似する。
な結果である。遅延の程度は、極めて低いＩＱ値が生じ
ることで特徴づけられる。不十分な活力、内気、および
引きこもりにより、精神学的問題もまた有力であるよう
である（Ｎａｄｌｅｒ，Ｈ．Ｌ．ら、Ｇａｌａｃｔｏｓ
ｅｍｉａ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ，１２７頁（１９６９）ならび
にＫｏｍｒｏｗｅｒ，Ｇ．Ｍ．およびＬｅｅ Ｄ．
Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ，４５：３６７
（１９７０））。他の結果は、適切な食事療法を受けた
女性における高ゴナドトロピン性性機能不全を伴う卵巣
不全の高発生率を含む（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｆ．Ｒ．ら、
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３０５：９９４（１９８
１）； Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，３０５：４６４（１９８１）； Ｋａｕ
ｆｍａｎ，Ｆ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｍｅ
ｔａｂ．Ｄｉｓ．，９：１４０（１９８６）； Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅ
ｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．，９１：１９９（１９８４）；
およびＦｒａｓｅｒ，Ｉ．Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｐｒ
ｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，４：１３３（１９８６））。こ
れらの欠損は、この疾患に起因するごくわずかな欠損で
あり、そしてこの疾患に起因する多数の他の障害ならび
に解剖学的問題および生物学的問題が存在する。ガラク
トース血症の第２の型は、生物学的原因および結果とし
て生じる疾患においてわずかな変化を伴って、第１の型
と類似する。
【００１０】ウリジンジホスフェートガラクトース−４
−エピメラーゼは食物ガラクトースの代謝における第３
の酵素であり、そしてグルコースからのガラクトース代
謝産物の新しい合成における重要な酵素である（Ｇｉｔ
ｚｅｌｍａｎｎ，Ｒ．およびＳｔｅｉｎｍａｎｎ，
Ｂ．，Ｅｎｚｙｍｅ，３２：３７−４６，（１９８
４））。ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼは、Ｕ
ＤＰ−グルコースとＵＤＰ−ガラクトースとの間の可逆
的交換を触媒し、そしてこの酵素の欠損は、ガラクトー
ス血症を引き起こす。
−エピメラーゼは食物ガラクトースの代謝における第３
の酵素であり、そしてグルコースからのガラクトース代
謝産物の新しい合成における重要な酵素である（Ｇｉｔ
ｚｅｌｍａｎｎ，Ｒ．およびＳｔｅｉｎｍａｎｎ，
Ｂ．，Ｅｎｚｙｍｅ，３２：３７−４６，（１９８
４））。ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼは、Ｕ
ＤＰ−グルコースとＵＤＰ−ガラクトースとの間の可逆
的交換を触媒し、そしてこの酵素の欠損は、ガラクトー
ス血症を引き起こす。
【００１１】エピメラーゼ欠損の最初の症例は、１９７
２年にＧｉｔｚｅｌｍａｎｎによって、見かけ上健康な
小児の血液細胞において記録された（Ｇｉｔｚｅｌｍａ
ｎｎ．Ｒ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｐａｅｄｉａｔ．Ａｃｔａ，
２７：１２５−１３０（１９７２））。続いて臨床的発
見が、ガラクトース血症の重篤な臨床的所見は 通常、
全身性エピメラーゼ欠損の患者において観察され、そし
てガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラー
ゼ欠損によって生じる古典的ガラクトース血症と識別し
得ないことを示した（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．お
よびＨｏｏｌｔｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅ
ｔａｂ．Ｄｉｓ．，６：１７−２０（１９８３））。循
環血液中のエピメラーゼ活性の完全な欠損の発生率は、
日本において２３，０００人中１人であると評価されて
いる（Ｍｉｓｕｍｉ，Ｈ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉ
ｍｉｃａ Ａｃｔａ，１１６：１０１−１０５（１９８
１））。体細胞ハイブリッド研究は、ガラクトースエピ
メラーゼについての遺伝子を含むようである第１染色体
ｐｔｅｒ−ｐ２１由来の領域を決定した（Ｂｅｎｎ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ
ｔ．，２４：１３８−１４２（１９７９）およびＬｉ
ｎ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．ＣｅｌｌＧｅｎ
ｅｔ．，２４：２１７−２２３（１９７９））。
２年にＧｉｔｚｅｌｍａｎｎによって、見かけ上健康な
小児の血液細胞において記録された（Ｇｉｔｚｅｌｍａ
ｎｎ．Ｒ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｐａｅｄｉａｔ．Ａｃｔａ，
２７：１２５−１３０（１９７２））。続いて臨床的発
見が、ガラクトース血症の重篤な臨床的所見は 通常、
全身性エピメラーゼ欠損の患者において観察され、そし
てガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラー
ゼ欠損によって生じる古典的ガラクトース血症と識別し
得ないことを示した（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．お
よびＨｏｏｌｔｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅ
ｔａｂ．Ｄｉｓ．，６：１７−２０（１９８３））。循
環血液中のエピメラーゼ活性の完全な欠損の発生率は、
日本において２３，０００人中１人であると評価されて
いる（Ｍｉｓｕｍｉ，Ｈ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉ
ｍｉｃａ Ａｃｔａ，１１６：１０１−１０５（１９８
１））。体細胞ハイブリッド研究は、ガラクトースエピ
メラーゼについての遺伝子を含むようである第１染色体
ｐｔｅｒ−ｐ２１由来の領域を決定した（Ｂｅｎｎ，
Ｐ．Ａ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ
ｔ．，２４：１３８−１４２（１９７９）およびＬｉ
ｎ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．ＣｅｌｌＧｅｎ
ｅｔ．，２４：２１７−２２３（１９７９））。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】一般に、ガラクトース
血症は、常染色体の劣性の特性として遺伝される。ま
た、この酵素は存在し得るが、機能的酵素をコードする
遺伝子配列における変異のために機能的であり得ない。
血症は、常染色体の劣性の特性として遺伝される。ま
た、この酵素は存在し得るが、機能的酵素をコードする
遺伝子配列における変異のために機能的であり得ない。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明によると、以下の
項目１〜２４が提供され、上記目的が達成される。
項目１〜２４が提供され、上記目的が達成される。
【００１４】（項目１．）単離されたポリヌクレオチド
であって、以下： （ａ）配列番号２に示されるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポリヌクレオ
チド；および （ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のフラグメ
ント、該フラグメントは少なくとも５０塩基対長であ
る、からなる群より選択されるメンバーを包含する、単
離されたポリヌクレオチド。
であって、以下： （ａ）配列番号２に示されるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポリヌクレオ
チド；および （ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のフラグメ
ント、該フラグメントは少なくとも５０塩基対長であ
る、からなる群より選択されるメンバーを包含する、単
離されたポリヌクレオチド。
【００１５】（項目２．）配列番号２に示されるポリペ
プチドをコードする、項目１に記載のポリヌクレオチ
ド。
プチドをコードする、項目１に記載のポリヌクレオチ
ド。
【００１６】（項目３．）項目１に記載のポリヌクレオ
チドにハイブリダイズし得、かつ少なくとも７０％が同
一である配列を有するポリヌクレオチド。
チドにハイブリダイズし得、かつ少なくとも７０％が同
一である配列を有するポリヌクレオチド。
【００１７】（項目４．）配列番号１に示されるヌクレ
オチド１からヌクレオチド１２４９を含む、項目１に記
載のポリヌクレオチド。
オチド１からヌクレオチド１２４９を含む、項目１に記
載のポリヌクレオチド。
【００１８】（項目５．）配列番号１に示されるヌクレ
オチド９３からヌクレオチド１１３６を含む、項目１に
記載のポリヌクレオチド。
オチド９３からヌクレオチド１１３６を含む、項目１に
記載のポリヌクレオチド。
【００１９】（項目６．）ポリヌクレオチドがＤＮＡで
ある、項目１に記載のポリヌクレオチド。
ある、項目１に記載のポリヌクレオチド。
【００２０】（項目７．）ポリヌクレオチドがＲＮＡで
ある、項目１に記載のポリヌクレオチド。
ある、項目１に記載のポリヌクレオチド。
【００２１】（項目８．）ポリヌクレオチドがゲノムＤ
ＮＡである、項目１に記載のポリヌクレオチド。
ＮＡである、項目１に記載のポリヌクレオチド。
【００２２】（項目９．）単離されたポリヌクレオチド
であって、以下： （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮ
Ａにコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮ
Ａによって発現されるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポ
リヌクレオチド；および （ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の
ポリヌクレオチドフラグメント、該ポリヌクレオチドフ
ラグメントは少なくとも５０塩基対長である、からなる
群より選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌク
レオチド。
であって、以下： （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮ
Ａにコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮ
Ａによって発現されるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズし得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポ
リヌクレオチド；および （ｄ）ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の
ポリヌクレオチドフラグメント、該ポリヌクレオチドフ
ラグメントは少なくとも５０塩基対長である、からなる
群より選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌク
レオチド。
【００２３】（項目１０．）前記ポリヌクレオチドがＡ
ＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮＡにコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードする、項目９に記載
のポリヌクレオチド。
ＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮＡにコー
ドされる成熟ポリペプチドをコードする、項目９に記載
のポリヌクレオチド。
【００２４】（項目１１．）前記ポリヌクレオチドがＡ
ＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮＡによっ
て発現されるポリペプチドをコードする、項目９に記載
のポリヌクレオチド。
ＴＣＣ寄託番号第９７１１２号に含まれるＤＮＡによっ
て発現されるポリペプチドをコードする、項目９に記載
のポリヌクレオチド。
【００２５】（項目１２．）項目５に記載のポリヌクレ
オチドを含むベクター。
オチドを含むベクター。
【００２６】（項目１３．）項目１２に記載のベクター
で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【００２７】（項目１４．）ポリペプチドを産生するた
めのプロセスであって：前記ＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドを項目１３に記載の宿主細胞から発現させる工
程、を包含する、プロセス。
めのプロセスであって：前記ＤＮＡにコードされるポリ
ペプチドを項目１３に記載の宿主細胞から発現させる工
程、を包含する、プロセス。
【００２８】（項目１５．）ヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼを発現し得る細胞を産生するためのプ
ロセスであって、項目１３に記載の組換え宿主細胞を前
記ポリペプチドの発現およびその回収を促進する条件下
で培養する工程を包含する、プロセス。
４−エピメラーゼを発現し得る細胞を産生するためのプ
ロセスであって、項目１３に記載の組換え宿主細胞を前
記ポリペプチドの発現およびその回収を促進する条件下
で培養する工程を包含する、プロセス。
【００２９】（項目１６．）ポリペプチドであって、以
下： （ａ）配列番号２に示される推定アミノ酸配列を有する
ポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体；ならびに （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号のｃＤＮＡにコ
ードされるポリペプチド、および該ポリペプチドのフラ
グメント、アナログ、および誘導体、からなる群より選
択されるメンバーを包含する、ポリペプチド。
下： （ａ）配列番号２に示される推定アミノ酸配列を有する
ポリペプチド、およびそのフラグメント、アナログ、お
よび誘導体；ならびに （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号のｃＤＮＡにコ
ードされるポリペプチド、および該ポリペプチドのフラ
グメント、アナログ、および誘導体、からなる群より選
択されるメンバーを包含する、ポリペプチド。
【００３０】（項目１７．）前記ポリペプチドが配列番
号２に示される推定アミノ酸配列を含む、項目１６に記
載のポリペプチド。
号２に示される推定アミノ酸配列を含む、項目１６に記
載のポリペプチド。
【００３１】（項目１８．）項目１６に記載のポリペプ
チドに対する抗体。
チドに対する抗体。
【００３２】（項目１９．）項目１６に記載のポリペプ
チドと基質との相互作用を増強する化合物。
チドと基質との相互作用を増強する化合物。
【００３３】（項目２０．）ヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼの必要性を有する患者を処置するため
の方法であって：患者に治療有効量の項目１６に記載の
ポリペプチドを投与する工程、を包含する、方法。
４−エピメラーゼの必要性を有する患者を処置するため
の方法であって：患者に治療有効量の項目１６に記載の
ポリペプチドを投与する工程、を包含する、方法。
【００３４】（項目２１．）前記治療有効量のポリペプ
チドが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを患者に提
供し、そしてインビボで該ポリペプチドを発現させるこ
とによって投与される工程を含む、項目２０に記載の方
法。
チドが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを患者に提
供し、そしてインビボで該ポリペプチドを発現させるこ
とによって投与される工程を含む、項目２０に記載の方
法。
【００３５】（項目２２．）不十分なヒトＵＤＰガラク
トース−４−エピメラーゼ活性に関連する状態を処置す
るための方法であって：ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼが必要な患者に治療有効量の項目１６に記
載のポリペプチドを投与し、それによって該状態を緩和
する工程、を包含する、方法。
トース−４−エピメラーゼ活性に関連する状態を処置す
るための方法であって：ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼが必要な患者に治療有効量の項目１６に記
載のポリペプチドを投与し、それによって該状態を緩和
する工程、を包含する、方法。
【００３６】（項目２３．）ヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼ欠損に関連する状態を診断するための
方法であって：宿主由来の核酸サンプルと配列番号１に
示されるポリヌクレオチド配列との差異を比較する工
程、ここで、該差異はヒトＵＤＰガラクトース−４−エ
ピメラーゼ遺伝子における変異を示す、を包含する、方
法。
４−エピメラーゼ欠損に関連する状態を診断するための
方法であって：宿主由来の核酸サンプルと配列番号１に
示されるポリヌクレオチド配列との差異を比較する工
程、ここで、該差異はヒトＵＤＰガラクトース−４−エ
ピメラーゼ遺伝子における変異を示す、を包含する、方
法。
【００３７】（項目２４．）診断方法であって：宿主由
来のサンプル中の項目１６に記載のポリペプチドの存在
を分析する工程、を包含する、診断方法。
来のサンプル中の項目１６に記載のポリペプチドの存在
を分析する工程、を包含する、診断方法。
【００３８】
【発明の実施の形態】本発明の遺伝子は、ヒトＵＤＰガ
ラクトース−４−エピメラーゼとして推定的に同定され
た。この同定は、ＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼについてのラットのｇａｌＥ ｍＲＮＡに対するアミ
ノ酸配列相同性の結果としてなされた。
ラクトース−４−エピメラーゼとして推定的に同定され
た。この同定は、ＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼについてのラットのｇａｌＥ ｍＲＮＡに対するアミ
ノ酸配列相同性の結果としてなされた。
【００３９】本発明の一つの局面によれば、新規な成熟
ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、そして診断
的または治療的に有用なそれらのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体が提供される。
ポリペプチド、ならびに生物学的に活性で、そして診断
的または治療的に有用なそれらのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体が提供される。
【００４０】本発明の別の局面によれば、本発明のポリ
ペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、
この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、ならびにそれらのアナログ、および生物学的に
活性で、かつ診断または治療に有用なそれらのフラグメ
ントを含む。
ペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、
この核酸分子は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、ならびにそれらのアナログ、および生物学的に
活性で、かつ診断または治療に有用なそれらのフラグメ
ントを含む。
【００４１】本発明のなおさらなる局面によれば、前記
タンパク質の発現およびその後の前記タンパク質の回収
を促進する条件下で、本発明のポリペプチドをコードす
る核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および／また
は組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する組
換え技術によって、このようなポリペプチドを産生する
ためのプロセスが提供される。
タンパク質の発現およびその後の前記タンパク質の回収
を促進する条件下で、本発明のポリペプチドをコードす
る核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および／また
は組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する組
換え技術によって、このようなポリペプチドを産生する
ためのプロセスが提供される。
【００４２】本発明のなおさらなる局面によれば、治療
目的（例えば、ガラクトース血症、白内障、精神障害、
末梢神経系の欠陥、失明、聴覚の不全、および臓器巨大
症の処置）のために、このようなポリペプチド、またな
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を利用するためのプロセスが提供される。
目的（例えば、ガラクトース血症、白内障、精神障害、
末梢神経系の欠陥、失明、聴覚の不全、および臓器巨大
症の処置）のために、このようなポリペプチド、またな
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を利用するためのプロセスが提供される。
【００４３】本発明のなおさらなる局面によれば、本発
明のポリペプチドに特異的にハイブリダイズするに十分
な長さの核酸分子を含む核酸プローブがまた、提供され
る。
明のポリペプチドに特異的にハイブリダイズするに十分
な長さの核酸分子を含む核酸プローブがまた、提供され
る。
【００４４】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。
【００４５】本発明はまた、ヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼ欠損を診断する方法を提供する。この
方法は、個体から核酸サンプルを単離する工程、そして
この核酸サンプルの配列を本発明の参照遺伝子でアッセ
イする工程、そしてこのサンプルと本発明の核酸との間
の差異を比較する工程を包含し、ここで、この差異は、
個体から単離されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピ
メラーゼ遺伝子における変異を示す。
４−エピメラーゼ欠損を診断する方法を提供する。この
方法は、個体から核酸サンプルを単離する工程、そして
この核酸サンプルの配列を本発明の参照遺伝子でアッセ
イする工程、そしてこのサンプルと本発明の核酸との間
の差異を比較する工程を包含し、ここで、この差異は、
個体から単離されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピ
メラーゼ遺伝子における変異を示す。
【００４６】本発明はまた、遺伝子療法による不十分な
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ活性に関す
る状態を処置するための方法を提供する。本発明のＵＤ
Ｐガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子を含むさらな
る参照遺伝子を、インビボまたはエクスビボのいずれか
で患者の細胞に挿入する。この参照遺伝子はトランスフ
ェクトされた細胞において発現され、結果として、参照
遺伝子によってコードされるタンパク質が欠損を補正
し、従って、トランスフェクトされた細胞が正常に機能
し、そして疾患状態（または症状）が緩和される。
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ活性に関す
る状態を処置するための方法を提供する。本発明のＵＤ
Ｐガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子を含むさらな
る参照遺伝子を、インビボまたはエクスビボのいずれか
で患者の細胞に挿入する。この参照遺伝子はトランスフ
ェクトされた細胞において発現され、結果として、参照
遺伝子によってコードされるタンパク質が欠損を補正
し、従って、トランスフェクトされた細胞が正常に機能
し、そして疾患状態（または症状）が緩和される。
【００４７】本発明のなおさらなる局面によれば、科学
的研究、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの作製、ならび
にヒト疾患の処置および診断に関連するインビトロの目
的のために、このようなポリペプチド、またはこのよう
なポリペプチドにコードされるポリヌクレオチドを利用
するためのプロセスが提供される。
的研究、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの作製、ならび
にヒト疾患の処置および診断に関連するインビトロの目
的のために、このようなポリペプチド、またはこのよう
なポリペプチドにコードされるポリヌクレオチドを利用
するためのプロセスが提供される。
【００４８】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。
【００４９】本発明の１つの局面によれば、図１（配列
番号２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド
をコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）、ま
たは１９９５年４月１２日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１
１２号として寄託されたクローンのｃＤＮＡにコードさ
れる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポ
リヌクレオチド）が提供される。
番号２）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド
をコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）、ま
たは１９９５年４月１２日にＡＴＣＣ寄託番号第９７１
１２号として寄託されたクローンのｃＤＮＡにコードさ
れる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポ
リヌクレオチド）が提供される。
【００５０】本発明のポリヌクレオチドは、ヒト子宮内
膜腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見され
た。これは、エピメラーゼファミリーと構造的に関連す
る。これは、３４８アミノ酸残基のタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを含む。このタンパ
ク質は、全アミノ酸範囲にわたり８５％以上の同一性で
ラットエピメラーゼ遺伝子と高い程度の相同性を示す。
膜腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見され
た。これは、エピメラーゼファミリーと構造的に関連す
る。これは、３４８アミノ酸残基のタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを含む。このタンパ
ク質は、全アミノ酸範囲にわたり８５％以上の同一性で
ラットエピメラーゼ遺伝子と高い程度の相同性を示す。
【００５１】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡの形態で有り得、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖
または一本鎖で有り得、そして一本鎖の場合、コード鎖
または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポ
リペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号
１）に示すコード配列、または寄託したクローンのコー
ド配列と同一であり得るか、または、コード配列が、遺
伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番
号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同一の成熟ポ
リペプチドをコードする、異なるコード配列であり得
る。
態またはＤＮＡの形態で有り得、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖
または一本鎖で有り得、そして一本鎖の場合、コード鎖
または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポ
リペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号
１）に示すコード配列、または寄託したクローンのコー
ド配列と同一であり得るか、または、コード配列が、遺
伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番
号１）のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同一の成熟ポ
リペプチドをコードする、異なるコード配列であり得
る。
【００５２】図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドを
コードするかまたは寄託されたｃＤＮＡにコードされる
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとし
て：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列およびさらなるコード配列；成熟ポリ
ペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコ
ード配列）および非コード配列（例えば、イントロンま
たは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／また
は３’非コード配列）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
コードするかまたは寄託されたｃＤＮＡにコードされる
成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとし
て：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ
チドのコード配列およびさらなるコード配列；成熟ポリ
ペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコ
ード配列）および非コード配列（例えば、イントロンま
たは成熟ポリペプチドのコード配列の５’および／また
は３’非コード配列）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。
【００５３】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
含む。
【００５４】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託された
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本
明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポ
リヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に
存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天
然に存在しない改変体であり得る。
定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託された
クローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本
明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポ
リヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に
存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天
然に存在しない改変体であり得る。
【００５５】従って、本発明は、図１（配列番号２）に
示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託されたク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそ
のようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体
は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託され
たクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
のフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。
このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改
変体、および付加または挿入改変体を含む。
示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託されたク
ローンのｃＤＮＡによりコードされるものと同じ成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそ
のようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体
は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託され
たクローンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド
のフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。
このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改
変体、および付加または挿入改変体を含む。
【００５６】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託されたクローンのコード配列の天然に存在する対
立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野
で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌク
レオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレ
オチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリ
ペプチドの機能を実質的に変化させない。
レオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列また
は寄託されたクローンのコード配列の天然に存在する対
立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野
で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌク
レオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレ
オチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリ
ペプチドの機能を実質的に変化させない。
【００５７】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ６０ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ６０ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、赤血球凝集
素（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応
する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７
（１９８４））。
【００５８】本発明はさらに、配列間に少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合に、本明細
書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレ
オチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる
用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼー
ションが、配列間に少なくとも９５％、そして好ましく
は少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じ
ることを意味する。好ましい実施態様において、本明細
書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは
寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチ
ドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを
保持するポリペプチドをコードする。
％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましく
は少なくとも９５％の同一性が存在する場合に、本明細
書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレ
オチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる
用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼー
ションが、配列間に少なくとも９５％、そして好ましく
は少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じ
ることを意味する。好ましい実施態様において、本明細
書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドは、図１（配列番号１）のｃＤＮＡまたは
寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチ
ドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを
保持するポリペプチドをコードする。
【００５９】あるいは、このポリヌクレオチドは、本発
明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中
上記したように、それに対して同一性を有し、そして活
性を保持していても保持していなくてもよい、少なくと
も２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましく
は少なくとも５０塩基を有し得る。そのようなポリヌク
レオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのための、
例えばこのポリヌクレオチドの回収のための、プロー
ブ、または診断プローブ、またはＰＣＲプライマーとし
て用いられ得る。
明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中
上記したように、それに対して同一性を有し、そして活
性を保持していても保持していなくてもよい、少なくと
も２０塩基、好ましくは３０塩基、そしてより好ましく
は少なくとも５０塩基を有し得る。そのようなポリヌク
レオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのための、
例えばこのポリヌクレオチドの回収のための、プロー
ブ、または診断プローブ、またはＰＣＲプライマーとし
て用いられ得る。
【００６０】従って、本発明は、配列番号２のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一
性、そしてより好ましくは９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメント（このフ
ラグメントは少なくとも３０塩基、そして好ましくは５
０塩基を有する）、およびこのようなポリヌクレオチド
にコードされるポリペプチドに関する。
チドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一
性、そしてより好ましくは９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメント（このフ
ラグメントは少なくとも３０塩基、そして好ましくは５
０塩基を有する）、およびこのようなポリヌクレオチド
にコードされるポリペプチドに関する。
【００６１】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便
宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第１１
２条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではな
い。寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配
列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そし
て本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる事象にお
いての矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、ま
たは販売するためには実施許諾が必要とされ得、そして
そのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけ
ではない。
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便
宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第１１
２条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではな
い。寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配
列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そし
て本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる事象にお
いての矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、ま
たは販売するためには実施許諾が必要とされ得、そして
そのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけ
ではない。
【００６２】本発明はさらに、図１（配列番号２）の推
定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するヒトＵＤＰガ
ラクトース−４−エピメラーゼポリペプチドならびにそ
のようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび
誘導体に関する。
定アミノ酸配列を有するか、または寄託されたｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するヒトＵＤＰガ
ラクトース−４−エピメラーゼポリペプチドならびにそ
のようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび
誘導体に関する。
【００６３】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託されたｃＤＮＡにコードされるポリペプチド
をいう場合、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生
物学的機能または活性を保持しているポリペプチドを意
味する。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切
断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し
得るプロタンパク質を含む。
び「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチド
または寄託されたｃＤＮＡにコードされるポリペプチド
をいう場合、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生
物学的機能または活性を保持しているポリペプチドを意
味する。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切
断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し
得るプロタンパク質を含む。
【００６４】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００６５】図１（配列番号２）のポリペプチドまたは
寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ
以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存ア
ミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され
たものであって、そしてこのような置換アミノ酸残基は
遺伝コードによりコードされ得るアミノ酸残基であって
もよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉ
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、
あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチド
の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレング
リコール）のような別の化合物と融合されているもの、
あるいは（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列、または成
熟ポリペプチドの精製のために用いられる配列、または
プロタンパク質配列のような、さらなるアミノ酸が、成
熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。この
ようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
寄託されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの
フラグメント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）１つ
以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存ア
ミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され
たものであって、そしてこのような置換アミノ酸残基は
遺伝コードによりコードされ得るアミノ酸残基であって
もよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉ
ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、
あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチド
の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレング
リコール）のような別の化合物と融合されているもの、
あるいは（ｉｖ）リーダーもしくは分泌配列、または成
熟ポリペプチドの精製のために用いられる配列、または
プロタンパク質配列のような、さらなるアミノ酸が、成
熟ポリペプチドに融合されているものであり得る。この
ようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。
【００６６】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは精製されて均質である。
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そし
て好ましくは精製されて均質である。
【００６７】本発明のポリペプチドは、配列番号２のポ
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番
号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性
（好ましくは７０％の同一性）、そしてより好ましくは
配列番号２のポリペプチドに対して９０％の類似性（よ
り好ましくは９０％の同一性）、そしてさらにより好ま
しくは配列番号２のポリペプチドおよびこのようなポリ
ペプチドの部分（ポリペプチドのこのような部分は、一
般に少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少
なくとも５０アミノ酸を含む）に対して９５％の類似性
（さらにより好ましくは９５％の同一性）を有するポリ
ペプチドを含む。
リペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに配列番
号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の類似性
（好ましくは７０％の同一性）、そしてより好ましくは
配列番号２のポリペプチドに対して９０％の類似性（よ
り好ましくは９０％の同一性）、そしてさらにより好ま
しくは配列番号２のポリペプチドおよびこのようなポリ
ペプチドの部分（ポリペプチドのこのような部分は、一
般に少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少
なくとも５０アミノ酸を含む）に対して９５％の類似性
（さらにより好ましくは９５％の同一性）を有するポリ
ペプチドを含む。
【００６８】当該分野で公知のように、２つのポリペプ
チド間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配列に対
するアミノ酸配列およびポリペプチドのその保存アミノ
酸置換基の比較によって決定される。
チド間の「類似性」は、第２のポリペプチドの配列に対
するアミノ酸配列およびポリペプチドのその保存アミノ
酸置換基の比較によって決定される。
【００６９】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチ
ドの生成のために使用し得、従って、このフラグメント
を全長ポリペプチドの生成のための中間体として使用し
得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは
部分を使用して、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成
し得る。
は部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチ
ドの生成のために使用し得、従って、このフラグメント
を全長ポリペプチドの生成のための中間体として使用し
得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは
部分を使用して、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成
し得る。
【００７０】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり
得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然
の環境の一部ではないため、なお単離され得る。
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり
得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然
の環境の一部ではないため、なお単離され得る。
【００７１】用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生
に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これはコード
領域（リーダーおよびトレイラー）の前後の領域ならび
に個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列
（イントロン）を含む。本発明はまた、本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて
遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本
発明のポリペプチドの産生に関する。
に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；これはコード
領域（リーダーおよびトレイラー）の前後の領域ならび
に個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列
（イントロン）を含む。本発明はまた、本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて
遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本
発明のポリペプチドの産生に関する。
【００７２】宿主細胞は、本発明のベクター（これは、
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、またはヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼ遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄
養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温
度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞に
以前使用された条件であり、そして当業者には明らかで
ある。
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであ
り得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入される
か、または形質転換されるか、またはトランスフェクト
される）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス
粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主
細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選
択するか、またはヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼ遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄
養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温
度、ｐＨなど）は、発現のために選択される宿主細胞に
以前使用された条件であり、そして当業者には明らかで
ある。
【００７３】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列、例えば、Ｓ
Ｖ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；
バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよび
ファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ウイ
ルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、および仮性狂犬病）を包含する。しかし、
宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他
の任意のベクターが使用され得る。
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発
現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非
染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列、例えば、Ｓ
Ｖ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；
バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよび
ファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ウイ
ルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏
痘ウイルス、および仮性狂犬病）を包含する。しかし、
宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他
の任意のベクターが使用され得る。
【００７４】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は、当該分
野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。このような手順および他の手順は、当
業者の範囲内であると考えられる。
【００７５】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍ
ＲＮＡの合成を指向する。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物細
胞または真核生物細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子
の発現を制御することが知られている他のプロモータ
ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクタ
ーはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得
る。
現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍ
ＲＮＡの合成を指向する。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物細
胞または真核生物細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子
の発現を制御することが知られている他のプロモータ
ー。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクタ
ーはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得
る。
【００７６】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシ
リン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を
含有する。
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシ
リン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を
含有する。
【００７７】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。
【００７８】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫）；アデノウイル
ス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００７９】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して市販されている。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核
性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸ
Ｔ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクター
が、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能で
ある限り、使用され得る。
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して市販されている。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核
性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸ
Ｔ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクター
が、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能で
ある限り、使用され得る。
【００８０】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロ
ウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン
Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選
択は、十分に当業者のレベル内である。
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特によく知られ
た細菌性プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真
核生物プロモーターは、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジ
ンキナーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロ
ウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン
Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選
択は、十分に当業者のレベル内である。
【００８１】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。
築物を含有する宿主細胞に関する。
【００８２】宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、
哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母
細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞
（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞へ
の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、また
はエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖ
ｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，
Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６））。
哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母
細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞
（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞へ
の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、また
はエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖ
ｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，
Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６））。
【００８３】宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法
で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得
る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチ
ド合成機により合成的に産生され得る。
で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得
る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチ
ド合成機により合成的に産生され得る。
【００８４】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主での使用に適切なクローニングベクター
および発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主での使用に適切なクローニングベクター
および発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）に記載されて
いる。
【００８５】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点の後期側のｂｐ
１００〜２７０のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点の後期側のｂｐ
１００〜２７０のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロ
ウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。
【００８６】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも糖分解酵素（例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファター
ゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペ
ロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列およ
び翻訳終止配列と適切な相内で組立てられる。必要に応
じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組
換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ
末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得
る。
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、中でも糖分解酵素（例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファター
ゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペ
ロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列およ
び翻訳終止配列と適切な相内で組立てられる。必要に応
じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組
換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ
末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得
る。
【００８７】細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。
的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻
訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタ
ンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することに
より構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マ
ーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望さ
れる場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を
含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、なら
びにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種
々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用い
られ得る。
【００８８】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよ
うな市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕ
ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよ
うな市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕ
ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を含む。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。
【００８９】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度までの宿主株の増殖後、選択されたプロモーターは
適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）に
より誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
密度までの宿主株の増殖後、選択されたプロモーターは
適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）に
より誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。
【００９０】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。
【００９１】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。
【００９２】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現させるために用いられ得る。哺乳動
物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：
１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞
のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る
他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現
ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエン
ハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプ
ライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フ
ランキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプラ
イス部位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ
配列は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するため
に使用され得る。
えタンパク質を発現させるために用いられ得る。哺乳動
物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：
１７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞
のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る
他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現
ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエン
ハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプ
ライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フ
ランキング非転写配列をまた含有する。ＳＶ４０スプラ
イス部位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ
配列は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するため
に使用され得る。
【００９３】本発明のポリペプチドは、硫安沈殿または
エタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを
含む方法により組換え細胞培養物から回収され、そして
精製され得る。必要に応じて、タンパク質の再折りたた
み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配
置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工
程に用いられ得る。
エタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフ
ィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロ
マトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを
含む方法により組換え細胞培養物から回収され、そして
精製され得る。必要に応じて、タンパク質の再折りたた
み（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の配
置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工
程に用いられ得る。
【００９４】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物または化学合成手順の産物であり得るか、あるい
は原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中
の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）
から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に
用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化され得るか、またはグリコシル化されない
かもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメ
チオニンアミノ酸残基を含み得る。
た産物または化学合成手順の産物であり得るか、あるい
は原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中
の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）
から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に
用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、
グリコシル化され得るか、またはグリコシル化されない
かもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメ
チオニンアミノ酸残基を含み得る。
【００９５】本発明のヒトＵＤＰガラクトース−４−エ
ピメラーゼ遺伝子および遺伝子産物を使用して、ガラク
トース血症を処置し得る。常染色体の遺伝的欠損のヒト
ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの生合成、また
は非機能的ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
の合成を妨げる事象において、本発明のポリペプチド
を、ガラクトースとグルコースとの間の可逆的反応を触
媒するために投与し得る。従って、ガラクトースレベル
の変化およびグルコースレベルの変化に起因する所望で
ない疾患および欠損の全てが、本発明のヒトＵＤＰガラ
クトース−４−エピメラーゼの投与によって緩和され
る。
ピメラーゼ遺伝子および遺伝子産物を使用して、ガラク
トース血症を処置し得る。常染色体の遺伝的欠損のヒト
ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの生合成、また
は非機能的ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
の合成を妨げる事象において、本発明のポリペプチド
を、ガラクトースとグルコースとの間の可逆的反応を触
媒するために投与し得る。従って、ガラクトースレベル
の変化およびグルコースレベルの変化に起因する所望で
ない疾患および欠損の全てが、本発明のヒトＵＤＰガラ
クトース−４−エピメラーゼの投与によって緩和され
る。
【００９６】例えば、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エ
ピメラーゼを使用して、白内障、精神障害、末梢神経系
の欠陥、失明、聴覚の不全、臓器巨大症、肝機能異常、
ガラクトース尿症、高クロール血症性アシドーシス、ア
ルブミン尿症、およびアミノ酸尿症を処置し得る。
ピメラーゼを使用して、白内障、精神障害、末梢神経系
の欠陥、失明、聴覚の不全、臓器巨大症、肝機能異常、
ガラクトース尿症、高クロール血症性アシドーシス、ア
ルブミン尿症、およびアミノ酸尿症を処置し得る。
【００９７】本発明のヒトＵＤＰガラクトース−４−エ
ピメラーゼ遺伝子は、ガラクトース−１−リン酸ウリジ
ルトランスフェラーゼまたはガラクトキナーゼの欠損に
よって生じるガラクトース血症とエピメラーゼ欠損性ガ
ラクトース血症の区別を補助する。エピメラーゼ欠損に
起因するガラクトース血症は、この障害の他の形態と比
較すると異なる処置が必要である。すなわち、少量の食
物ガラクトースが、ＵＤＰガラクトースを前駆体として
必要とするガラクトプロテインおよびガラクト脂質の生
合成のために供給されなければならない。トランスフェ
ラーゼまたはガラクトキナーゼ欠損性ガラクトース血症
においては、必要とされるＵＤＰ−ガラクトースの多く
は、エピメラーゼの作用を介してＵＤＰ−グルコースか
ら変換され得る。
ピメラーゼ遺伝子は、ガラクトース−１−リン酸ウリジ
ルトランスフェラーゼまたはガラクトキナーゼの欠損に
よって生じるガラクトース血症とエピメラーゼ欠損性ガ
ラクトース血症の区別を補助する。エピメラーゼ欠損に
起因するガラクトース血症は、この障害の他の形態と比
較すると異なる処置が必要である。すなわち、少量の食
物ガラクトースが、ＵＤＰガラクトースを前駆体として
必要とするガラクトプロテインおよびガラクト脂質の生
合成のために供給されなければならない。トランスフェ
ラーゼまたはガラクトキナーゼ欠損性ガラクトース血症
においては、必要とされるＵＤＰ−ガラクトースの多く
は、エピメラーゼの作用を介してＵＤＰ−グルコースか
ら変換され得る。
【００９８】全長ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼ遺伝子のフラグメントは、ヒトＵＤＰガラクトー
ス−４−エピメラーゼ遺伝子に対して高い配列類似性ま
たは類似した生物学的活性を有する他の遺伝子を単離す
るために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用され得る。このプローブは、少
なくとも２０塩基を有し、好ましくは、少なくとも３０
塩基を有し、そしてさらにより好ましくは５０塩基以上
を有する。プローブはまた、全長の転写物に対応するｃ
ＤＮＡクローンおよびゲノムクローン、または調節およ
びプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを
含む完全ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺
伝子を含有するクローンを同定するために使用され得
る。スクリーニングの例として、既知のＤＮＡ配列を使
用し、オリゴヌクレオチドプローブを合成することによ
り、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子
のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の
配列と配列相補性を有する標識されたオリゴヌクレオチ
ドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡの
ライブラリーをスクリーニングするために使用され、ラ
イブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイズ
するかを決定する。
ラーゼ遺伝子のフラグメントは、ヒトＵＤＰガラクトー
ス−４−エピメラーゼ遺伝子に対して高い配列類似性ま
たは類似した生物学的活性を有する他の遺伝子を単離す
るために、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用され得る。このプローブは、少
なくとも２０塩基を有し、好ましくは、少なくとも３０
塩基を有し、そしてさらにより好ましくは５０塩基以上
を有する。プローブはまた、全長の転写物に対応するｃ
ＤＮＡクローンおよびゲノムクローン、または調節およ
びプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを
含む完全ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺
伝子を含有するクローンを同定するために使用され得
る。スクリーニングの例として、既知のＤＮＡ配列を使
用し、オリゴヌクレオチドプローブを合成することによ
り、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子
のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の
配列と配列相補性を有する標識されたオリゴヌクレオチ
ドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡの
ライブラリーをスクリーニングするために使用され、ラ
イブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイズ
するかを決定する。
【００９９】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドを、ヒト疾患に対する処置および診断法の発見のた
めの研究試薬および材料として使用し得る。
チドを、ヒト疾患に対する処置および診断法の発見のた
めの研究試薬および材料として使用し得る。
【０１００】本発明は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼとその基質との相互作用に影響する化合物
を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提
供する。例として、サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）および
／または線維芽細胞の細胞株のような哺乳動物細胞を、
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードす
る本発明のｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターでトラン
スフェクトする。次いで細胞をスクリーニングされるべ
き化合物の存在下で標識したガラクトースと接触させ
る。ガラクトースは放射能などによって標識され得る。
次いで、標識されたガラクトースから形成される任意の
グルコースが測定され得る。例えば、グルコースはアフ
ィニティークロマトグラフィーなどのような当該分野で
公知の方法によって単離され得、そして液体シンチレー
ションカウンターを使用してグルコースの容量が測定さ
れ得る。このグルコースの量が、スクリーニングされる
べき化合物を欠くコントロールアッセイにおいて生成さ
れたグルコースの量に対して測定され得る。
エピメラーゼとその基質との相互作用に影響する化合物
を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提
供する。例として、サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）および
／または線維芽細胞の細胞株のような哺乳動物細胞を、
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードす
る本発明のｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターでトラン
スフェクトする。次いで細胞をスクリーニングされるべ
き化合物の存在下で標識したガラクトースと接触させ
る。ガラクトースは放射能などによって標識され得る。
次いで、標識されたガラクトースから形成される任意の
グルコースが測定され得る。例えば、グルコースはアフ
ィニティークロマトグラフィーなどのような当該分野で
公知の方法によって単離され得、そして液体シンチレー
ションカウンターを使用してグルコースの容量が測定さ
れ得る。このグルコースの量が、スクリーニングされる
べき化合物を欠くコントロールアッセイにおいて生成さ
れたグルコースの量に対して測定され得る。
【０１０１】本発明のポリペプチドおよび上記の化合物
は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得
る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチドま
たは化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは
賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩
水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げら
れるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に
合わせるべきである。
は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得
る。このような組成物は、治療有効量のポリペプチドま
たは化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは
賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩
水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げら
れるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に
合わせるべきである。
【０１０２】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、
または販売を統制する政府機関により規定された形式の
製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの投与につい
ての製造、使用、または販売における機関による認可を
表す。さらに、本発明のポリペプチドまたは化合物は、
他の治療化合物と併用して用いられ得る。
つまたはそれ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を
含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような
容器に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、
または販売を統制する政府機関により規定された形式の
製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの投与につい
ての製造、使用、または販売における機関による認可を
表す。さらに、本発明のポリペプチドまたは化合物は、
他の治療化合物と併用して用いられ得る。
【０１０３】薬学的組成物は、例えば、経口、局所（例
えば点眼溶液で）、鼻腔内、または皮内経路による簡便
な様式で投与され得る。非経口投与（例えば、静脈内、
腹腔内、筋肉内、および皮下）が、特に好ましい。ポリ
ペプチドはまた、リポソームのような膜結合ベシクルに
囲まれ得る。薬学的組成物は、特定の症状の処置および
／または予防に有効な量で投与される。一般に、それら
は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そ
して多くの場合、それらは１日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を
超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日
に約１０μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重であ
り、投与経路、症状などが考慮される。
えば点眼溶液で）、鼻腔内、または皮内経路による簡便
な様式で投与され得る。非経口投与（例えば、静脈内、
腹腔内、筋肉内、および皮下）が、特に好ましい。ポリ
ペプチドはまた、リポソームのような膜結合ベシクルに
囲まれ得る。薬学的組成物は、特定の症状の処置および
／または予防に有効な量で投与される。一般に、それら
は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そ
して多くの場合、それらは１日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を
超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日
に約１０μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重であ
り、投与経路、症状などが考慮される。
【０１０４】ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼ遺伝子はまた、本発明に従って、インビボでのヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子コードされ
るポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしば
しば「遺伝子療法」と呼ばれる。
ゼ遺伝子はまた、本発明に従って、インビボでのヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子コードされ
るポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしば
しば「遺伝子療法」と呼ばれる。
【０１０５】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエクスビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
り、本明細書中の教示により明らかである。例えば、細
胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有
するレトロウイルスプラスミドベクターの使用により、
操作され得る。
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエクスビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
り、本明細書中の教示により明らかである。例えば、細
胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有
するレトロウイルスプラスミドベクターの使用により、
操作され得る。
【０１０６】同様に、細胞は、例えば当該分野で公知の
手順によって、インビボでのポリペプチドの発現のため
にインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細
胞が本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルスプラスミドベクターで形質導入され得、そ
の結果、パッケージング細胞は目的の遺伝子を含む感染
性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細
胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボ
でのポリペプチドの発現のために、患者に投与され得
る。このような方法による本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から
当業者に明らかであるはずである。
手順によって、インビボでのポリペプチドの発現のため
にインビボで操作され得る。例えば、パッケージング細
胞が本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルスプラスミドベクターで形質導入され得、そ
の結果、パッケージング細胞は目的の遺伝子を含む感染
性ウイルス粒子を産生する。これらのプロデューサー細
胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボ
でのポリペプチドの発現のために、患者に投与され得
る。このような方法による本発明のポリペプチドを投与
するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から
当業者に明らかであるはずである。
【０１０７】レトロウイルスプラスミドベクターとして
は、モロニーマウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血
病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
およびハーベイ肉腫ウイルスを含むレトロウイルス由来
であり得るが、これらに限定されない。
は、モロニーマウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血
病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
およびハーベイ肉腫ウイルスを含むレトロウイルス由来
であり得るが、これらに限定されない。
【０１０８】好ましい実施態様において、レトロウイル
ス発現ベクター、ｐＭＶ−７は、モロニーマウス肉腫ウ
イルスの長末端反復（ＬＴＲ）に隣接し、そして単純ヘ
ルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）プ
ロモーターの調節下で選択的薬物耐性遺伝子ｎｅｏを含
む。Ｕｎｉｖｑｕｅ ＥｃｏＲＩおよびＨｉｍｄＩＩＩ
部位は、コード配列の導入を容易にする（Ｋｉｒｓｃｈ
ｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５
（１９８８））。
ス発現ベクター、ｐＭＶ−７は、モロニーマウス肉腫ウ
イルスの長末端反復（ＬＴＲ）に隣接し、そして単純ヘ
ルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）プ
ロモーターの調節下で選択的薬物耐性遺伝子ｎｅｏを含
む。Ｕｎｉｖｑｕｅ ＥｃｏＲＩおよびＨｉｍｄＩＩＩ
部位は、コード配列の導入を容易にする（Ｋｉｒｓｃｈ
ｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５
（１９８８））。
【０１０９】ベクターは以下の１つ以上の適切なプロモ
ーター：レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ
ー；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，第７巻、第９号、９８０−９９０（１９８９）に記
載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒスト
ン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβアクチンプロモーターを
含むがこれらに限定されない真核生物細胞プロモーター
のような細胞プロモーター）を含むが、これらに限定さ
れない。適切なプロモーターの選択は、本明細書の教示
から、当業者に明らかである。
ーター：レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ
ー；およびＭｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，第７巻、第９号、９８０−９９０（１９８９）に記
載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ー、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒスト
ン、ｐｏｌ ＩＩＩ、およびβアクチンプロモーターを
含むがこれらに限定されない真核生物細胞プロモーター
のような細胞プロモーター）を含むが、これらに限定さ
れない。適切なプロモーターの選択は、本明細書の教示
から、当業者に明らかである。
【０１１０】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適切なプロモーターの制御下にあり、これらは単
純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターのよ
うなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルスＬＴＲ、βアクチンプロモーター、およびポリペ
プチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモータ
ーを含むが、これらに限定されない。
列は、適切なプロモーターの制御下にあり、これらは単
純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターのよ
うなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウ
イルスＬＴＲ、βアクチンプロモーター、およびポリペ
プチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモータ
ーを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】レトロウイルスプラスミドベクターを使用
してパッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサ
ー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケ
ージング細胞の例として、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ
−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１
９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株（Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｈｕｍｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，
第１巻、５−１４頁（１９９０）に記載される）が挙げ
られるが、これらに限定されず、そしてこれらはその全
体が本明細書中で参考として援用される。ベクターは当
該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を
形質導入し得る。このような手段として、エレクトロポ
レーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿
が挙げられるが、これらに限定されない。別の手段とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターを、リポソーム
中にカプセル化するか、または脂質と結合させ、次いで
宿主に投与し得る。
してパッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサ
ー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケ
ージング細胞の例として、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ψ
−２、ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１
９−１７−Ｈ２、ψＣＲＥ、ψＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８
６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株（Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｈｕｍｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，
第１巻、５−１４頁（１９９０）に記載される）が挙げ
られるが、これらに限定されず、そしてこれらはその全
体が本明細書中で参考として援用される。ベクターは当
該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を
形質導入し得る。このような手段として、エレクトロポ
レーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿
が挙げられるが、これらに限定されない。別の手段とし
て、レトロウイルスプラスミドベクターを、リポソーム
中にカプセル化するか、または脂質と結合させ、次いで
宿主に投与し得る。
【０１１２】トランスフェクトされ得るパッケージング
細胞株の例として、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、およびＧ
Ｐ＋ａｍ１２が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターは当該分野で公知の任意の手段によってパッケ
ージング細胞を形質導入し得る。このような手段とし
て、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およ
びＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、これらに限定されな
い。
細胞株の例として、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、およびＧ
Ｐ＋ａｍ１２が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターは当該分野で公知の任意の手段によってパッケ
ージング細胞を形質導入し得る。このような手段とし
て、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およ
びＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、これらに限定されな
い。
【０１１３】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイルスベ
クター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのい
ずれかで、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入さ
れた真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配
列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞として、
線維芽細胞、および内皮細胞が挙げられるが、これらに
限定されない。
コードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクタ
ー粒子を生じる。次いで、このようなレトロウイルスベ
クター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのい
ずれかで、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入さ
れた真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配
列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞として、
線維芽細胞、および内皮細胞が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０１１４】本発明はまた、診断としてのヒトＵＤＰガ
ラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子の使用に関する。
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの変異形態
の検出によって、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼの過少発現（例えば、ガラクトース血症）に起因
する疾患または疾患に対する感受性の診断が可能にな
る。ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子
における変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮ
Ａレベルで検出され得る。診断のための核酸は、血液、
尿、唾液、組織生検、および剖検材料を含むがこれらに
限定されない患者の細胞から得られ得る。ゲノムＤＮＡ
は、検出のために直接使用され得るか、または分析の前
にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６
３−１６６（１９８６））の使用によって酵素的に増幅
され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のた
めに使用され得る。例として、ヒトＵＤＰガラクトース
−４−エピメラーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを使用して、ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼの変異を同定しそして分析し得る。例え
ば、欠失および挿入を正常な遺伝子型との比較によって
増幅産物のサイズにおける変化によって検出し得る。点
変異は、増幅されたＤＮＡを放射標識されたヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼＲＮＡ、あるいは放射
標識されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズさせることに
よって同定され得る。完全に適合した配列は、ＲＮａｓ
ｅ Ａ消化または異なる融解温度（Ｔｍ）の差によっ
て、適合していない二本鎖と区別され得る。このような
診断は、特に胎児期、そして新生児の試験にさえ有用で
ある。
ラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子の使用に関する。
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの変異形態
の検出によって、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼの過少発現（例えば、ガラクトース血症）に起因
する疾患または疾患に対する感受性の診断が可能にな
る。ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子
における変異を有する個体は、種々の技術によってＤＮ
Ａレベルで検出され得る。診断のための核酸は、血液、
尿、唾液、組織生検、および剖検材料を含むがこれらに
限定されない患者の細胞から得られ得る。ゲノムＤＮＡ
は、検出のために直接使用され得るか、または分析の前
にＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６
３−１６６（１９８６））の使用によって酵素的に増幅
され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同じ目的のた
めに使用され得る。例として、ヒトＵＤＰガラクトース
−４−エピメラーゼをコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを使用して、ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼの変異を同定しそして分析し得る。例え
ば、欠失および挿入を正常な遺伝子型との比較によって
増幅産物のサイズにおける変化によって検出し得る。点
変異は、増幅されたＤＮＡを放射標識されたヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼＲＮＡ、あるいは放射
標識されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイズさせることに
よって同定され得る。完全に適合した配列は、ＲＮａｓ
ｅ Ａ消化または異なる融解温度（Ｔｍ）の差によっ
て、適合していない二本鎖と区別され得る。このような
診断は、特に胎児期、そして新生児の試験にさえ有用で
ある。
【０１１５】参照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の
配列の差異は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかに
され得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメント
は、特異的なＤＮＡセグメントを検出するためのプロー
ブとして用いられ得る。本方法の感度は、ＰＣＲと組み
合わされた場合、非常に増大される。例えば、配列決定
プライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物または改変されたＰＣ
Ｒによって作製された一本鎖テンプレート分子を用いて
使用される。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用
いる従来の手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手
順によって実施される。クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをまたプローブとして使用して、特定のＤＮＡセグ
メントを検出し得る。この方法の感度はＰＣＲと組み合
わされた場合に非常に増大される。ヌクレオチド反復の
存在は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−ガラクトキナー
ゼ活性における変化（指標的変化）と相関し得るか、ま
たは種々の多型についてのマーカーとして役立ち得る。
配列の差異は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかに
され得る。さらに、クローン化されたＤＮＡセグメント
は、特異的なＤＮＡセグメントを検出するためのプロー
ブとして用いられ得る。本方法の感度は、ＰＣＲと組み
合わされた場合、非常に増大される。例えば、配列決定
プライマーは、二本鎖ＰＣＲ産物または改変されたＰＣ
Ｒによって作製された一本鎖テンプレート分子を用いて
使用される。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用
いる従来の手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手
順によって実施される。クローン化されたＤＮＡセグメ
ントをまたプローブとして使用して、特定のＤＮＡセグ
メントを検出し得る。この方法の感度はＰＣＲと組み合
わされた場合に非常に増大される。ヌクレオチド反復の
存在は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−ガラクトキナー
ゼ活性における変化（指標的変化）と相関し得るか、ま
たは種々の多型についてのマーカーとして役立ち得る。
【０１１６】ＤＮＡ配列の差異に基づいた遺伝的試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出に
より達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分
解能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列
のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルに
おいて区別され得る。ここで異なるＤＮＡフラグメント
の移動度は、それらの特異的融解温度または部分的融解
温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４２
（１９８５）を参照のこと）。さらに、配列の変化、特
に小さな欠失は、非変性ゲル電気泳動におけるＤＮＡヘ
テロ二本鎖の移動パターン（すなわち、ヘテロ２本鎖電
気泳動）における変化として検出され得る（例えば、Ｎ
ａｇａｍｉｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，
４５：３３７−３３９（１９８９）を参照のこと）。
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出に
より達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分
解能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列
のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルに
おいて区別され得る。ここで異なるＤＮＡフラグメント
の移動度は、それらの特異的融解温度または部分的融解
温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４２
（１９８５）を参照のこと）。さらに、配列の変化、特
に小さな欠失は、非変性ゲル電気泳動におけるＤＮＡヘ
テロ二本鎖の移動パターン（すなわち、ヘテロ２本鎖電
気泳動）における変化として検出され得る（例えば、Ｎ
ａｇａｍｉｎｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，
４５：３３７−３３９（１９８９）を参照のこと）。
【０１１７】特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレ
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。
アーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ
１保護または化学的切断法（例えば、ｃｏｔｔｏｎら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。
【０１１８】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション（例えば、ヘテロ二本鎖電気泳動、
Ｗｈｉｔｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：３０１−３０
６（１９９２）を参照のこと）、ＲＮａｓｅ保護（例え
ば、Ｍｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４
２（１９８５）を参照のこと）、化学的切断（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８５：４３９７−
４４０１（１９８５））、直接ＤＮＡ配列決定、または
制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型（Ｒ
ＦＬＰ））のような方法によって達成され得る。ここ
で、制限フラグメントの数およびサイズにおける変化
は、挿入、欠失、ヌクレオチド反復の存在およびエンド
ヌクレアーゼ制限配列を生成または破壊する他の変異を
示し得る。ゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用
して、大きな（すなわち、１００塩基対を超える）欠失
および挿入もまた同定し得る。
ブリダイゼーション（例えば、ヘテロ二本鎖電気泳動、
Ｗｈｉｔｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：３０１−３０
６（１９９２）を参照のこと）、ＲＮａｓｅ保護（例え
ば、Ｍｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４
２（１９８５）を参照のこと）、化学的切断（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，８５：４３９７−
４４０１（１９８５））、直接ＤＮＡ配列決定、または
制限酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型（Ｒ
ＦＬＰ））のような方法によって達成され得る。ここ
で、制限フラグメントの数およびサイズにおける変化
は、挿入、欠失、ヌクレオチド反復の存在およびエンド
ヌクレアーゼ制限配列を生成または破壊する他の変異を
示し得る。ゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用
して、大きな（すなわち、１００塩基対を超える）欠失
および挿入もまた同定し得る。
【０１１９】より便利なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列
決定に加えて、変異（例えば、わずかな欠失、異数性、
転座、逆位）はまたインサイチュ分析により検出され得
る（例えば、Ｋｅｌｌａｒら、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，
第２版、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９３）を参照のこ
と）。すなわち、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列および細
胞を膜上に単離および／または固定することなく、変異
について分析し得る。蛍光インサイチュハイブリダイゼ
ーション（ＦＩＳＨ）は、現在、最も普通に適用されて
いる方法であり、そして多数のＦＩＳＨの総説が出版さ
れている。例えば、Ｔｒａｃｈｕｋら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５０：５５９−５６２（１９９０）およびＴｒａ
ｓｋら、Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔ．，７：１４９−１
５４（１９９１）を参照のこと。これらは背景の目的の
ために本明細書中で参考として援用される。それゆえ、
特定の遺伝子（例えば、ＵＤＰガラクトース−４−エピ
メラーゼ）の構造に基づく核酸の使用によって、エピメ
ラーゼ欠損についての診断試験を開発し得る。
決定に加えて、変異（例えば、わずかな欠失、異数性、
転座、逆位）はまたインサイチュ分析により検出され得
る（例えば、Ｋｅｌｌａｒら、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，
第２版、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９９３）を参照のこ
と）。すなわち、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列および細
胞を膜上に単離および／または固定することなく、変異
について分析し得る。蛍光インサイチュハイブリダイゼ
ーション（ＦＩＳＨ）は、現在、最も普通に適用されて
いる方法であり、そして多数のＦＩＳＨの総説が出版さ
れている。例えば、Ｔｒａｃｈｕｋら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５０：５５９−５６２（１９９０）およびＴｒａ
ｓｋら、Ｔｒｅｎｄｓ，Ｇｅｎｅｔ．，７：１４９−１
５４（１９９１）を参照のこと。これらは背景の目的の
ために本明細書中で参考として援用される。それゆえ、
特定の遺伝子（例えば、ＵＤＰガラクトース−４−エピ
メラーゼ）の構造に基づく核酸の使用によって、エピメ
ラーゼ欠損についての診断試験を開発し得る。
【０１２０】さらに、いくつかの疾患は、ｍＲＮＡにお
ける変化によって検出され得る遺伝子発現の変化の結果
であるか、またはこれによって特徴づけられる。あるい
は、ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子を対
照として使用して、例えば、ノーザンブロッティングま
たはインサイチュハイブリダイゼーションによって、減
少したレベルのエピメラーゼを発現する個体を同定し得
る。
ける変化によって検出され得る遺伝子発現の変化の結果
であるか、またはこれによって特徴づけられる。あるい
は、ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子を対
照として使用して、例えば、ノーザンブロッティングま
たはインサイチュハイブリダイゼーションによって、減
少したレベルのエピメラーゼを発現する個体を同定し得
る。
【０１２１】より従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析によっ
て検出され得る。
列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析によっ
て検出され得る。
【０１２２】本発明はまた、正常なコントロール組織サ
ンプルと比較して、過少発現が、ガラクトース血症、ま
たはガラクトース血症にかかる罹患性の検出を可能にす
るので、種々の組織におけるヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼタンパク質の変化したレベルを検出す
るための診断アッセイに関する。宿主由来のサンプル中
のヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパク
質のレベルの検出に使用するアッセイは、当業者に周知
であり、そして放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、
ウェスタンブロット分析、および好ましくはＥＬＩＳＡ
アッセイを含む。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ抗原に特異的な抗
体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する工程を
包含する。さらに、レポーター抗体をモノクローナル抗
体に対して調製する。このレポーター抗体に、放射活
性、蛍光、または本発明の実施例における西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬を結合させ
る。サンプルを宿主から取り出し、サンプル中のタンパ
ク質と結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディ
ッシュ）上でインキュベートする。次いで、ディッシュ
上の任意の遊離タンパク質結合部位をＢＳＡのような非
特異的タンパク質と共にインキュベートすることによっ
て覆う。次に、モノクローナル抗体を、モノクローナル
抗体がポリスチレンディッシュに結合した全てのヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパク質と結合
する時間の間、ディッシュ内でインキュベートする。全
ての結合していないモノクローナル抗体を緩衝液で洗浄
して除去する。次いで西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合したレポーター抗体をディッシュ内に入れると、レポ
ーター抗体のヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼに結合した全てのモノクローナル抗体への結合が生じ
る。次いで、結合していないレポーター抗体を洗浄す
る。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに添加
し、そして所定の時間内に発色した量が、標準曲線と比
較した場合に、所定の量の患者のサンプルに存在するヒ
トＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパク質の
量の測定値である。
ンプルと比較して、過少発現が、ガラクトース血症、ま
たはガラクトース血症にかかる罹患性の検出を可能にす
るので、種々の組織におけるヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼタンパク質の変化したレベルを検出す
るための診断アッセイに関する。宿主由来のサンプル中
のヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパク
質のレベルの検出に使用するアッセイは、当業者に周知
であり、そして放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、
ウェスタンブロット分析、および好ましくはＥＬＩＳＡ
アッセイを含む。ＥＬＩＳＡアッセイは、最初にヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ抗原に特異的な抗
体（好ましくはモノクローナル抗体）を調製する工程を
包含する。さらに、レポーター抗体をモノクローナル抗
体に対して調製する。このレポーター抗体に、放射活
性、蛍光、または本発明の実施例における西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬を結合させ
る。サンプルを宿主から取り出し、サンプル中のタンパ
ク質と結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディ
ッシュ）上でインキュベートする。次いで、ディッシュ
上の任意の遊離タンパク質結合部位をＢＳＡのような非
特異的タンパク質と共にインキュベートすることによっ
て覆う。次に、モノクローナル抗体を、モノクローナル
抗体がポリスチレンディッシュに結合した全てのヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパク質と結合
する時間の間、ディッシュ内でインキュベートする。全
ての結合していないモノクローナル抗体を緩衝液で洗浄
して除去する。次いで西洋ワサビペルオキシダーゼに結
合したレポーター抗体をディッシュ内に入れると、レポ
ーター抗体のヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼに結合した全てのモノクローナル抗体への結合が生じ
る。次いで、結合していないレポーター抗体を洗浄す
る。次いで、ペルオキシダーゼ基質をディッシュに添加
し、そして所定の時間内に発色した量が、標準曲線と比
較した場合に、所定の量の患者のサンプルに存在するヒ
トＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパク質の
量の測定値である。
【０１２３】ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼ遺伝子産物に対して惹起されたモノクローナル抗体
は、赤血球、線維芽皮膚細胞、および他の細胞型中のエ
ピメラーゼの定量に有用である。
ゼ遺伝子産物に対して惹起されたモノクローナル抗体
は、赤血球、線維芽皮膚細胞、および他の細胞型中のエ
ピメラーゼの定量に有用である。
【０１２４】ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼに特異的な抗体が固体支持体に結合され、そして標識
されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼおよ
び宿主由来のサンプルが固体支持体を通過され、そして
固体支持体に結合された検出される標識の量がサンプル
中のヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの量に
相関し得る場合に競合アッセイが使用され得る。
ゼに特異的な抗体が固体支持体に結合され、そして標識
されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼおよ
び宿主由来のサンプルが固体支持体を通過され、そして
固体支持体に結合された検出される標識の量がサンプル
中のヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの量に
相関し得る場合に競合アッセイが使用され得る。
【０１２５】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体の位置をマークするために利
用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色
体マーキング試薬はほとんどない。本発明に従うＤＮＡ
の染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関す
る遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階で
ある。
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色体の位置をマークするために利
用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色
体マーキング試薬はほとんどない。本発明に従うＤＮＡ
の染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関す
る遺伝子とを相関させることにおける重要な第１段階で
ある。
【０１２６】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非
翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１
つのエキソンを越えてまたがらず、従って増幅プロセス
を複雑にするプライマーを迅速に選択するために使用さ
れる。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むこ
れらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。遺伝子の３’非
翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１
つのエキソンを越えてまたがらず、従って増幅プロセス
を複雑にするプライマーを迅速に選択するために使用さ
れる。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色
体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに
使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むこ
れらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【０１２７】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる本発明を使用して、特定のその染色体由来のフラ
グメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクロ
ーンのプールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏ
ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。その染色体に
マップするために同様に使用され得る他のマッピングス
トラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、
標識化フロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色
体でのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーショ
ンによる予備選択を包含する。
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる本発明を使用して、特定のその染色体由来のフラ
グメントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクロ
ーンのプールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏ
ｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。その染色体に
マップするために同様に使用され得る他のマッピングス
トラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、
標識化フロー選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色
体でのプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーショ
ンによる予備選択を包含する。
【０１２８】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程での正確な染色体位置を提供するために
使用され得る。この技術は、５０または６０塩基程度の
短さのｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の総説
としては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程での正確な染色体位置を提供するために
使用され得る。この技術は、５０または６０塩基程度の
短さのｃＤＮＡを用いて使用され得る。この技術の総説
としては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０１２９】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝子マップ
のデータと相関させ得る。このようなデータは、例え
ば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉ
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎＭａｎ に見出される（Ｊ
ｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷｅ
ｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライ
ンで入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的
に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
ると、染色体上での配列の物理的な位置を遺伝子マップ
のデータと相関させ得る。このようなデータは、例え
ば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉ
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎＭａｎ に見出される（Ｊ
ｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＷｅ
ｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライ
ンで入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマ
ップされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的
に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。
【０１３０】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡ配列またはゲノム配列の差異を決定する必要があ
る。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察され
るがいずれの正常な個体にも観察されない場合、この変
異は疾患の原因因子であるようである。
ＮＡ配列またはゲノム配列の差異を決定する必要があ
る。変異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察され
るがいずれの正常な個体にも観察されない場合、この変
異は疾患の原因因子であるようである。
【０１３１】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解析度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解析度で、そして２０ｋｂあ
たり１遺伝子と仮定する。）ヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼの正確な染色体位置を決定するため
に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションがヒト中
期染色体スプレッドに対して実施された（Ｌａｗｒｅｎ
ｃｅ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ，５２：５１−６１（１９
８８）およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５：７３−
９９（１９９１（ｂ））。約２０のスプレッドが肉眼で
分析され、そのほとんどが少なくとも１つの染色体（こ
れは第１染色体である）上の真のハイブリダイゼーショ
ンに特徴的な二重（ｄｏｕｂｌｅｔ）のシグナルを有し
ていた。二重のシグナルは、他の染色体のいずれでも検
出されなかった。わずかな長さの測定と蛍光バンディン
グ（ｂａｎｄｉｎｇ）との組合せを使用する、高分解能
画像化分析と組み合わせた２６の個々のスプレッドの詳
細な分析は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼ遺伝子がｌｐ３４．３〜３６．１のバンド内に位置す
ることを示した。これはエピメラーゼ欠損性ガラクトー
ス血症の疾患位置と正確に一致する。
ング技術の現在の解析度では、疾患に関連する染色体領
域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００と
の間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、
１メガベースのマッピング解析度で、そして２０ｋｂあ
たり１遺伝子と仮定する。）ヒトＵＤＰガラクトース−
４−エピメラーゼの正確な染色体位置を決定するため
に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションがヒト中
期染色体スプレッドに対して実施された（Ｌａｗｒｅｎ
ｃｅ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ，５２：５１−６１（１９
８８）およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５：７３−
９９（１９９１（ｂ））。約２０のスプレッドが肉眼で
分析され、そのほとんどが少なくとも１つの染色体（こ
れは第１染色体である）上の真のハイブリダイゼーショ
ンに特徴的な二重（ｄｏｕｂｌｅｔ）のシグナルを有し
ていた。二重のシグナルは、他の染色体のいずれでも検
出されなかった。わずかな長さの測定と蛍光バンディン
グ（ｂａｎｄｉｎｇ）との組合せを使用する、高分解能
画像化分析と組み合わせた２６の個々のスプレッドの詳
細な分析は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼ遺伝子がｌｐ３４．３〜３６．１のバンド内に位置す
ることを示した。これはエピメラーゼ欠損性ガラクトー
ス血症の疾患位置と正確に一致する。
【０１３２】ポリペプチド、そのフラグメントまたは他
の誘導体、またはそのアナログ、あるいはそれらを発現
する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免
疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポ
リクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得
る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化
抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現
ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々
の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生の
ために使用され得る。
の誘導体、またはそのアナログ、あるいはそれらを発現
する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免
疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポ
リクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得
る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化
抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現
ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々
の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生の
ために使用され得る。
【０１３３】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射によるか、または動物（好ましくはヒトではない）へ
のポリペプチドの投与により得られ得る。次いで、この
ようにして得られた抗体は、ポリペプチド自身に結合す
る。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみ
をコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に
結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、
このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織か
らポリペプチドを単離するために使用され得る。
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射によるか、または動物（好ましくはヒトではない）へ
のポリペプチドの投与により得られ得る。次いで、この
ようにして得られた抗体は、ポリペプチド自身に結合す
る。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみ
をコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に
結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、
このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織か
らポリペプチドを単離するために使用され得る。
【０１３４】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６： ４９５−４９７）、トリオーマ
技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４： ７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９
８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６： ４９５−４９７）、トリオーマ
技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４： ７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生す
るためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９
８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。
【０１３５】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体の発現に使用され得る。
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体の発現に使用され得る。
【０１３６】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部分また
は量は、他に明記しない限り重量基準である。
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部分また
は量は、他に明記しない限り重量基準である。
【０１３７】以下の実施例の理解を容易にするために、
頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載され
る。
頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載され
る。
【０１３８】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラ
スミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そ
して当業者には明らかである。
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得るかのいずれかである。さらに、記載されるプラ
スミドと等価のプラスミドが当該分野で公知であり、そ
して当業者には明らかである。
【０１３９】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約
２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築の
ためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的
には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素の
ための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定
される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従っ
て変わり得る。消化後、反応物をアガロースゲル上で直
接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約
２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築の
ためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的
には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素の
ための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定
される。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が
通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に従っ
て変わり得る。消化後、反応物をアガロースゲル上で直
接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。
【０１４０】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された１％
アガロースゲルを使用して行われる。
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された１％
アガロースゲルを使用して行われる。
【０１４１】「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。
【０１４２】「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、ほぼ等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。
【０１４３】別に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７（１９７３）の方法
に記載のように実施された。
ａｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７（１９７３）の方法
に記載のように実施された。
【０１４４】
【実施例】実施例１ ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの細菌発現
および精製 ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードす
るＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号）を、
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子の
５’および３’末端配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて最初に増幅した。ヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子に対応するさら
なるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’末端配列
に付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列５’ＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧ３’
（配列番号３）を有し、これはヒトＵＤＰガラクトース
−４−エピメラーゼコード配列の開始コドンにおいてＮ
ｃｏＩ制限酵素部位を含む。３’配列、５’ＧＣＧＣＡ
ＧＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＣＡ
３’（配列番号４）は、ＢｇｌＩＩ部位に相補的な配列
（太字）を含み、そして続いてヒトＵＤＰガラクトース
−４−エピメラーゼＤＮＡ挿入物の３’に位置するヒト
ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ配列の２０ヌク
レオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐ
ＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ６０
は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒ
ｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ
／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタ
グ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ
６０をＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。増幅配列
をｐＱＥ６０に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲ
ＢＳをコードする配列とともにインフレームで挿入し
た。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株 Ｍ
１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ
１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピー
を含有する。これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、
そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵
素分析により確認した。所望の構築物を含むクローン
を、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μ
ｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養
で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて
１：１００〜１：２５０の比で大規模な培養物に接種し
た。細胞を、光学密度６００（Ｏ．Ｄ．600）が０．４
と０．６との間になるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴ
Ｇ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にした。ＩＰＴＧは、
ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／
Ｏを解放（ｃｌｅａｒ）し遺伝子発現の増加を誘導す
る。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞
を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピ
ック剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化した。澄明化
後、可溶化ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
を、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質により堅く結
合し得る条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのク
ロマトグラフィーによりこの溶液から精製した（Ｈｏｃ
ｈｕｌｉ，Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
４１１： １７７−１８４（１９８４））。ヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼ（純度９０％）を６Ｍ
グアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、
そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元
型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整し
た。この溶液中での１２時間のインキュベーションの
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析した。
および精製 ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードす
るＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号）を、
ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子の
５’および３’末端配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて最初に増幅した。ヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子に対応するさら
なるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’末端配列
に付加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配
列５’ＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧ３’
（配列番号３）を有し、これはヒトＵＤＰガラクトース
−４−エピメラーゼコード配列の開始コドンにおいてＮ
ｃｏＩ制限酵素部位を含む。３’配列、５’ＧＣＧＣＡ
ＧＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＣＡ
３’（配列番号４）は、ＢｇｌＩＩ部位に相補的な配列
（太字）を含み、そして続いてヒトＵＤＰガラクトース
−４−エピメラーゼＤＮＡ挿入物の３’に位置するヒト
ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ配列の２０ヌク
レオチドを含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクターｐ
ＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃｈａｔｓｗｏｒｔ
ｈ，ＣＡ）上の制限酵素部位に対応する。ｐＱＥ６０
は、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製起点（ｏｒ
ｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ
／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−Ｈｉｓタ
グ、および制限酵素部位をコードする。次いで、ｐＱＥ
６０をＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。増幅配列
をｐＱＥ６０に連結し、そしてヒスチジンタグおよびＲ
ＢＳをコードする配列とともにインフレームで挿入し
た。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株 Ｍ
１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＳａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ
１５／ｒｅｐ４はプラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピー
を含有する。これは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、
そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与する。
形質転換体をＬＢプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵
素分析により確認した。所望の構築物を含むクローン
を、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μ
ｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養
で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて
１：１００〜１：２５０の比で大規模な培養物に接種し
た。細胞を、光学密度６００（Ｏ．Ｄ．600）が０．４
と０．６との間になるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴ
Ｇ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド」）を加えて１ｍＭの最終濃度にした。ＩＰＴＧは、
ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、Ｐ／
Ｏを解放（ｃｌｅａｒ）し遺伝子発現の増加を誘導す
る。細胞をさらに３〜４時間増殖させた。次いで、細胞
を遠心分離により収集した。細胞ペレットをカオトロピ
ック剤６ＭグアニジンＨＣｌ中で可溶化した。澄明化
後、可溶化ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ
を、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質により堅く結
合し得る条件下で、ニッケル−キレートカラム上でのク
ロマトグラフィーによりこの溶液から精製した（Ｈｏｃ
ｈｕｌｉ，Ｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
４１１： １７７−１８４（１９８４））。ヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼ（純度９０％）を６Ｍ
グアニジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）でカラムから溶出し、
そして再生の目的で、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍ
Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元
型）、および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整し
た。この溶液中での１２時間のインキュベーションの
後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析した。
【０１４５】実施例２ バキュロウイルス発現系を使用したヒトＵＤＰガラクト
ース−４−エピメラーゼのクローニングおよび発現 全長ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第９７
１１２号）を、この遺伝子の５’および３’配列に対応
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増
幅する。
ース−４−エピメラーゼのクローニングおよび発現 全長ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第９７
１１２号）を、この遺伝子の５’および３’配列に対応
するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増
幅する。
【０１４６】この５’プライマーは、配列５’ＡＡＡＡ
ＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号５）を有し、そしてＢｇ
ｌＩＩ制限酵素部位（太字）を含み、真核生物細胞にお
ける翻訳開始について有効なシグナルに類似する８ヌク
レオチドが続く（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，１９６：９４７−９５０（１９８７））。この
８ヌクレオチドはヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼ遺伝子の最初の１８ヌクレオチドの直後である
（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」について下線が引かれ
る）。
ＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号５）を有し、そしてＢｇ
ｌＩＩ制限酵素部位（太字）を含み、真核生物細胞にお
ける翻訳開始について有効なシグナルに類似する８ヌク
レオチドが続く（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，１９６：９４７−９５０（１９８７））。この
８ヌクレオチドはヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼ遺伝子の最初の１８ヌクレオチドの直後である
（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」について下線が引かれ
る）。
【０１４７】３’プライマーは、配列５’ＡＡＡＴＣＴ
ＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣ
３’（配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレア
ーゼＸｂａＩについての切断部位（太字）およびヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子の３’配列
に相補的な２１ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して１
％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメント
をエンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化
し、次いで、１％アガロースゲル上で再度精製する。こ
のフラグメントをＦ２と称する。
ＡＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣ
３’（配列番号６）を有し、そして制限エンドヌクレア
ーゼＸｂａＩについての切断部位（太字）およびヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子の３’配列
に相補的な２１ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、
市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して１
％アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメント
をエンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化
し、次いで、１％アガロースゲル上で再度精製する。こ
のフラグメントをＦ２と称する。
【０１４８】ベクターｐＡ２（ｐＶＬ９４１ベクターの
改変物、以下に記載）を、バキュロウイルス発現系を使
用したヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタン
パク質の発現のために使用する（総説については：Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．１９
８７，バキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養手
順のための方法のマニュアル，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔ
ｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＮＯ：１５５５を参照のこ
と）。この発現ベクターは、制限エンドヌクレアーゼに
ついての制限部位が続くＡｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーターを含む。シミアンウイ
ルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、有効なポリ
アデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な
選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ
遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入す
る。ポリヘドリン配列の両端には、同時トランスフェク
トした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介相同組換えのた
めのウイルス配列が位置する。多くの他のバキュロウイ
ルスベクターを、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、および
ｐＡｃＩＭ１のようなｐＲＧ１の代わりに使用し得る
（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．
Ｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。
改変物、以下に記載）を、バキュロウイルス発現系を使
用したヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼタン
パク質の発現のために使用する（総説については：Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．１９
８７，バキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養手
順のための方法のマニュアル，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔ
ｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＮＯ：１５５５を参照のこ
と）。この発現ベクターは、制限エンドヌクレアーゼに
ついての制限部位が続くＡｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーターを含む。シミアンウイ
ルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化部位を、有効なポリ
アデニル化のために使用する。組換えウイルスの容易な
選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ
遺伝子を、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルが続くポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入す
る。ポリヘドリン配列の両端には、同時トランスフェク
トした野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介相同組換えのた
めのウイルス配列が位置する。多くの他のバキュロウイ
ルスベクターを、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、および
ｐＡｃＩＭ１のようなｐＲＧ１の代わりに使用し得る
（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．
Ｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。
【０１４９】このプラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＸｂａＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順に
よって子ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化す
る。次いでＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ）を使用して１％アガロースゲルから単離する。こ
のベクターＤＮＡをＶ２と称する。
よびＸｂａＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順に
よって子ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化す
る。次いでＤＮＡを市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ）を使用して１％アガロースゲルから単離する。こ
のベクターＤＮＡをＶ２と称する。
【０１５０】フラグメントＦ２および脱リン酸化したプ
ラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結する。次い
で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そし
てＰＣＲを使用して、細菌がプラスミド（ｐＢａｃ ｈ
ｕｍａｎ ＵＤＰ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−４−ｅｐｉｍ
ｅｒａｓｅ）をヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラ
ーゼ遺伝子と共に含むことを同定した。クローン化フラ
グメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。
ラスミドＶ２をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結する。次い
で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換し、そし
てＰＣＲを使用して、細菌がプラスミド（ｐＢａｃ ｈ
ｕｍａｎ ＵＤＰ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−４−ｅｐｉｍ
ｅｒａｓｅ）をヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラ
ーゼ遺伝子と共に含むことを同定した。クローン化フラ
グメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１５１】５μｇのプラスミドｐＢａｃ ｈｕｍａｎ
ＵＤＰ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−４−ｅｐｉｍｅｒａｓ
ｅを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４
１３−７４１７（１９８７））を使用して、１．０μｇ
の市販の線状化バキュロウイルスで（「Ｂａｃｕｌｏｇ
ｏｌｄTMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇ
ｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）で同時トランスフ
ェクトした。
ＵＤＰ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−４−ｅｐｉｍｅｒａｓ
ｅを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４
１３−７４１７（１９８７））を使用して、１．０μｇ
の市販の線状化バキュロウイルスで（「Ｂａｃｕｌｏｇ
ｏｌｄTMバキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇ
ｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）で同時トランスフ
ェクトした。
【０１５２】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイル
スＤＮＡと５μｇのプラスミドｐＢａｃ ｈｕｍａｎ
ＵＤＰ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ
とを、５０μＬの無血清グレース培地を含むマイクロタ
イタープレートの滅菌ウエル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｐｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）中で混合する。その後、１０μＬのリポフェ
クチンおよび９０μＬのグレース培地を添加し、混合し
てそして室温で１５分間インキュベートする。次いで、
トランスフェクション混合物を、１ｍｌの無血清グレー
ス培地を含む３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ
９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下す
る。このプレートを前後に振盪し、新たに添加した溶液
と混合する。次いで、プレートを２７℃で５時間インキ
ュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液を
プレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充
した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。プレートを
インキュベーターに戻し、そして培養を２７℃で４日間
継続する。
スＤＮＡと５μｇのプラスミドｐＢａｃ ｈｕｍａｎ
ＵＤＰ ｇａｌａｃｔｏｓｅ−４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ
とを、５０μＬの無血清グレース培地を含むマイクロタ
イタープレートの滅菌ウエル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｐｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）中で混合する。その後、１０μＬのリポフェ
クチンおよび９０μＬのグレース培地を添加し、混合し
てそして室温で１５分間インキュベートする。次いで、
トランスフェクション混合物を、１ｍｌの無血清グレー
ス培地を含む３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ
９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下す
る。このプレートを前後に振盪し、新たに添加した溶液
と混合する。次いで、プレートを２７℃で５時間インキ
ュベートする。５時間後、トランスフェクション溶液を
プレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充
した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。プレートを
インキュベーターに戻し、そして培養を２７℃で４日間
継続する。
【０１５３】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記載されたアッセイと
同様にプラークアッセイを行った。改変として、「Ｂｌ
ｕｅＧａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを使用し、これにより青く染色されたプラークの
単離が容易になる。（「プラークアッセイ」の詳細な記
載については、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によ
って配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学
についてのユーザーガイドにも見出される。） 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、そして青
く染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端
で拾い上げる。次いで、組換えウイルスを含む寒天を２
００μＬのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ
中で再懸濁する。寒天を簡単な遠心分離によって除去
し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用し
て３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞を感染させ
る。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、
次いで４℃で保存する。
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記載されたアッセイと
同様にプラークアッセイを行った。改変として、「Ｂｌ
ｕｅＧａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを使用し、これにより青く染色されたプラークの
単離が容易になる。（「プラークアッセイ」の詳細な記
載については、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によ
って配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学
についてのユーザーガイドにも見出される。） 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加し、そして青
く染色されたプラークをエッペンドルフピペットの先端
で拾い上げる。次いで、組換えウイルスを含む寒天を２
００μＬのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ
中で再懸濁する。寒天を簡単な遠心分離によって除去
し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を使用し
て３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞を感染させ
る。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、
次いで４℃で保存する。
【０１５４】Ｓｆ９細胞を１０％熱不活性化ＦＢＳを補
充したグレース培地中で増殖させる。細胞を感染多重度
（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼで感染させる。６時間
後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステイン
を除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）で置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチ
オニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベ
ートし、その後遠心分離によって回収し、そしてＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって標識
されたタンパク質を可視化する。
充したグレース培地中で増殖させる。細胞を感染多重度
（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ヒトＵＤＰ
ガラクトース−４−エピメラーゼで感染させる。６時間
後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステイン
を除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）で置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチ
オニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベ
ートし、その後遠心分離によって回収し、そしてＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって標識
されたタンパク質を可視化する。
【０１５５】実施例３ 組換えヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼのＣ
ＯＳ細胞発現 プラスミド、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼＨＡの発現は、以下を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａ
ｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られる：１）ＳＶ
４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．
ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリンカー領域が続くＣＭＶ
プロモーター、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル
化部位。ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ前
駆体の全体をコードするＤＮＡフラグメント、およびそ
の３’末端にインフレームで融合したＨＡタグを、ベク
ターのポリリンカー領域にクローン化し、それゆえ、組
換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーター下で指向さ
れる。ＨＡタグは以前に記載されたようにインフルエン
ザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する
（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｎｉｍａｎ，Ｒ．Ｈｅｉｇｈ
ｔｅｎ，Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｏｙ，およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ，１９８４，Ｃｅｌｌ
３７：７６７，（１９８４））。ＨＡタグの標的タンパ
ク質への融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体で
の組換えタンパク質の検出が容易になる。
ＯＳ細胞発現 プラスミド、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼＨＡの発現は、以下を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａ
ｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られる：１）ＳＶ
４０複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）Ｅ．
ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリンカー領域が続くＣＭＶ
プロモーター、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル
化部位。ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ前
駆体の全体をコードするＤＮＡフラグメント、およびそ
の３’末端にインフレームで融合したＨＡタグを、ベク
ターのポリリンカー領域にクローン化し、それゆえ、組
換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーター下で指向さ
れる。ＨＡタグは以前に記載されたようにインフルエン
ザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する
（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｈ．Ｎｉｍａｎ，Ｒ．Ｈｅｉｇｈ
ｔｅｎ，Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｏｙ，およびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ，１９８４，Ｃｅｌｌ
３７：７６７，（１９８４））。ＨＡタグの標的タンパ
ク質への融合により、ＨＡエピトープを認識する抗体で
の組換えタンパク質の検出が容易になる。
【０１５６】プラスミド構築方法を以下に記載する：ヒ
トＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードする
ＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号）を２つ
のプライマーを使用するＰＣＲによって構築する：５’
プライマー５’ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣ
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号
７）は、ＢｇｌＩＩ部位（太字）を含み、開始コドンか
ら始まるヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼコ
ード配列の１８ヌクレオチドが続く；３’配列５’ＡＡ
ＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣ
ＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＴ
ＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣ３’（配列番号８）は、Ｘ
ｂａＩ部位に相補的な配列（太字）、翻訳停止コドン、
ＨＡタグ、およびヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼコード配列の最後の１８ヌクレオチド（停止コド
ンを含まない）を含む。従って、ＰＣＲ産物はＢｇｌＩ
Ｉ部位、インフレームで融合したＨＡタグが続くヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼコード配列、ＨＡ
タグに続く翻訳終結停止コドン、およびＸｂａＩ部位を
含む。ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩ
ＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてベクター、ｐｃＤＮ
ＡＩ／ＡｍｐをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消
化し、そして連結する。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ株Ｓ
ＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に形質転換
し、形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートに入
れ、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡ
を形質転換体から単離し、そして正確なフラグメントの
存在について、制限分析によって試験する。組換えヒト
ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの発現のため
に、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ，Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９
８９））によって、発現ベクターでトランスフェクトす
る。ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼＨＡタ
ンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法（Ｅ．Ｈ
ａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））によって検出する。細胞
を、トランスフェクションの２日後に35Ｓ−システイン
で８時間標識する。次いで、培養培地を回収し、そして
細胞を、界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−
４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．
５）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、ＩＤ．３７：７６７（１
９８４））で溶解させる。細胞溶解物および培養培地の
両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿させる。
沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分
析する。
トＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼをコードする
ＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第９７１１２号）を２つ
のプライマーを使用するＰＣＲによって構築する：５’
プライマー５’ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣ
ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号
７）は、ＢｇｌＩＩ部位（太字）を含み、開始コドンか
ら始まるヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼコ
ード配列の１８ヌクレオチドが続く；３’配列５’ＡＡ
ＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣ
ＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＣＴＴ
ＧＣＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣ３’（配列番号８）は、Ｘ
ｂａＩ部位に相補的な配列（太字）、翻訳停止コドン、
ＨＡタグ、およびヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼコード配列の最後の１８ヌクレオチド（停止コド
ンを含まない）を含む。従って、ＰＣＲ産物はＢｇｌＩ
Ｉ部位、インフレームで融合したＨＡタグが続くヒトＵ
ＤＰガラクトース−４−エピメラーゼコード配列、ＨＡ
タグに続く翻訳終結停止コドン、およびＸｂａＩ部位を
含む。ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩ
ＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてベクター、ｐｃＤＮ
ＡＩ／ＡｍｐをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消
化し、そして連結する。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ株Ｓ
ＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に形質転換
し、形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートに入
れ、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡ
を形質転換体から単離し、そして正確なフラグメントの
存在について、制限分析によって試験する。組換えヒト
ＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの発現のため
に、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法（Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ，Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９
８９））によって、発現ベクターでトランスフェクトす
る。ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼＨＡタ
ンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法（Ｅ．Ｈ
ａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，（１９８８））によって検出する。細胞
を、トランスフェクションの２日後に35Ｓ−システイン
で８時間標識する。次いで、培養培地を回収し、そして
細胞を、界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−
４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．
５）（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、ＩＤ．３７：７６７（１
９８４））で溶解させる。細胞溶解物および培養培地の
両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿させる。
沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分
析する。
【０１５７】実施例４ ヒト組織におけるヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメ
ラーゼの発現パターン ノーザンブロット分析を実施して、ヒト組織におけるヒ
トＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの発現のレベ
ルを試験する。全細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ
TMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ．ＴＸ）を使用して単離
する。特定した各ヒト組織から単離した約１０μｇの全
ＲＮＡを１％アガロースゲル上で分離し、そしてナイロ
ンフィルター上にブロットする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ
ｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。標識反応を、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従っ
て５０ｎｇのＤＮＡフラグメントで行う。標識したＤＮ
Ａを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製する（５
Ｐｒｉｍｅ−３ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．Ｂｏｕｌｄｅ
ｒ，ＣＯ）。次いで、フィルターを放射活性標識した全
長ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子
と、０．５Ｍ ＮａＰＯ4（ｐＨ７．４）および７％Ｓ
ＤＳ中、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌで、６５℃で
一晩ハイブリダイズする。０．５×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳで、室温で２回、そして６０℃で２回洗浄後、次い
でフィルターを増感スクリーンに−７０℃で一晩曝露す
る。
ラーゼの発現パターン ノーザンブロット分析を実施して、ヒト組織におけるヒ
トＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼの発現のレベ
ルを試験する。全細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ
TMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ．ＴＸ）を使用して単離
する。特定した各ヒト組織から単離した約１０μｇの全
ＲＮＡを１％アガロースゲル上で分離し、そしてナイロ
ンフィルター上にブロットする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ
ｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））。標識反応を、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキットに従っ
て５０ｎｇのＤＮＡフラグメントで行う。標識したＤＮ
Ａを、Ｓｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０カラムで精製する（５
Ｐｒｉｍｅ−３ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．Ｂｏｕｌｄｅ
ｒ，ＣＯ）。次いで、フィルターを放射活性標識した全
長ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝子
と、０．５Ｍ ＮａＰＯ4（ｐＨ７．４）および７％Ｓ
ＤＳ中、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌで、６５℃で
一晩ハイブリダイズする。０．５×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳで、室温で２回、そして６０℃で２回洗浄後、次い
でフィルターを増感スクリーンに−７０℃で一晩曝露す
る。
【０１５８】実施例５ 遺伝子療法を介したヒトＵＤＰガラクトース−４−エピ
メラーゼの発現 線維芽細胞を、皮膚生検によって被験体から得る。得ら
れた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離す
る。組織の小さな片を組織培養フラスコの湿らせた表面
に置き、約１０の片を各フラスコに置く。フラスコを上
下逆さにし、堅く栓をし、そして室温で一晩放置する。
２４時間後、室温でフラスコを逆さにし、そして組織片
をフラスコの底に固定して留め、そして新鮮な培地（例
えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマ
イシンを含むＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次い
で、これを３７℃で約１週間インキュベートする。この
時点で、新鮮な培地を添加し、続いて２、３日ごとに交
換する。さらに２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現
する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラ
スコに拡大する。
メラーゼの発現 線維芽細胞を、皮膚生検によって被験体から得る。得ら
れた組織を組織培養培地に置き、そして小片に分離す
る。組織の小さな片を組織培養フラスコの湿らせた表面
に置き、約１０の片を各フラスコに置く。フラスコを上
下逆さにし、堅く栓をし、そして室温で一晩放置する。
２４時間後、室温でフラスコを逆さにし、そして組織片
をフラスコの底に固定して留め、そして新鮮な培地（例
えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、およびストレプトマ
イシンを含むＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次い
で、これを３７℃で約１週間インキュベートする。この
時点で、新鮮な培地を添加し、続いて２、３日ごとに交
換する。さらに２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現
する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラ
スコに拡大する。
【０１５９】モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復
側に位置するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，
Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８）
を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて
子ウシ腸ホスファターゼで処理する。線状ベクターをア
ガロースゲル上で細分し、そしてガラスビーズを使用し
て精製する。
側に位置するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，
Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８）
を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて
子ウシ腸ホスファターゼで処理する。線状ベクターをア
ガロースゲル上で細分し、そしてガラスビーズを使用し
て精製する。
【０１６０】ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラー
ゼｃＤＮＡのサブフラグメントをＰＣＲプライマーを使
用して以下のように増幅する：５’コード領域の１８塩
基対が続くＥｃｏＲＩ部位（太字）を含む５’ＡＡＡＧ
ＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号９）、およびＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位（太字）を含みそして３’配列の２１塩基対が
続く配列５’ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣ
ＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣ３’（配列番号１０）を有する
３’プライマー。
ゼｃＤＮＡのサブフラグメントをＰＣＲプライマーを使
用して以下のように増幅する：５’コード領域の１８塩
基対が続くＥｃｏＲＩ部位（太字）を含む５’ＡＡＡＧ
ＡＡＴＴＣＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号９）、およびＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位（太字）を含みそして３’配列の２１塩基対が
続く配列５’ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＣ
ＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣ３’（配列番号１０）を有する
３’プライマー。
【０１６１】同量のモロニーマウス肉腫ウイルス線状骨
格、ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加する。
得られる混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な
条件下で維持する。連結混合物を使用して細菌ＨＢ１０
１を形質転換し、次いでこれを、ベクターが正しく挿入
されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝
子を有することを確認する目的のためにカナマイシン含
有寒天上に置く。
格、ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ントをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加する。
得られる混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な
条件下で維持する。連結混合物を使用して細菌ＨＢ１０
１を形質転換し、次いでこれを、ベクターが正しく挿入
されたヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝
子を有することを確認する目的のためにカナマイシン含
有寒天上に置く。
【０１６２】アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％子ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有
するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でコ
ンフルエントな密度まで組織培養物中で増殖させる。次
いで、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝
子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケ
ージング細胞をベクターで形質導入する。パッケージン
グ細胞がヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺
伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージ
ング細胞をここでプロデューサー細胞という）。
＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％子ウシ血清
（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有
するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でコ
ンフルエントな密度まで組織培養物中で増殖させる。次
いで、ヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺伝
子を含むＭＳＶベクターを培地に添加し、そしてパッケ
ージング細胞をベクターで形質導入する。パッケージン
グ細胞がヒトＵＤＰガラクトース−４−エピメラーゼ遺
伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（パッケージ
ング細胞をここでプロデューサー細胞という）。
【０１６３】新鮮な培地を形質導入したプロデューサー
細胞に添加し、続いて培地を１０ｃｍプレートのコンフ
ルエントなプロデューサー細胞から回収する。感染性ウ
イルス粒子を含む消費した培地をミリポアフィルターで
濾過して分離されたプロデューサー細胞を除去し、次い
でこの培地を使用して線維芽細胞を感染させる。培地を
線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去
し、そして直ちにプロデューサー細胞由来の培地で置き
換える。この培地を除去してそして新鮮な培地で置き換
える。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線維
芽細胞が感染され、そして選択は必要とされない。力価
が非常に低い場合、次いでｎｅｏまたはｈｉｓのような
選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用す
る必要がある。
細胞に添加し、続いて培地を１０ｃｍプレートのコンフ
ルエントなプロデューサー細胞から回収する。感染性ウ
イルス粒子を含む消費した培地をミリポアフィルターで
濾過して分離されたプロデューサー細胞を除去し、次い
でこの培地を使用して線維芽細胞を感染させる。培地を
線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから除去
し、そして直ちにプロデューサー細胞由来の培地で置き
換える。この培地を除去してそして新鮮な培地で置き換
える。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線維
芽細胞が感染され、そして選択は必要とされない。力価
が非常に低い場合、次いでｎｅｏまたはｈｉｓのような
選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用す
る必要がある。
【０１６４】次いで操作した線維芽細胞を、単独でまた
はサイトデックス３ミクロキャリアビーズ上でコンフル
エンスになるまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注
入する。線維芽細胞は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼタンパク質産物を産生し、そしてヒトＵＤ
Ｐガラクトース−４−エピメラーゼの生物学的作用を宿
主に導く。
はサイトデックス３ミクロキャリアビーズ上でコンフル
エンスになるまで増殖させた後のいずれかで、宿主に注
入する。線維芽細胞は、ヒトＵＤＰガラクトース−４−
エピメラーゼタンパク質産物を産生し、そしてヒトＵＤ
Ｐガラクトース−４−エピメラーゼの生物学的作用を宿
主に導く。
【０１６５】本発明の多数の改変および変更は上記教示
を参照することにより可能であり、従って、添付する請
求の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され
得る。
を参照することにより可能であり、従って、添付する請
求の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され
得る。
【０１６６】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包含されるような本発明
の範囲を限定することを意味しない。
あり、そして請求の範囲により包含されるような本発明
の範囲を限定することを意味しない。
【０１６７】
【表１】
【０１６８】
【発明の効果】本発明は、上述した構成であるので、前
述した課題が達成される。
述した課題が達成される。
【図１】図１は、本発明のｃＤＮＡおよび対応するポリ
ペプチドの推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸について
の標準的な１文字略号を使用する。
ペプチドの推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸について
の標準的な１文字略号を使用する。
【図２】図２は、本発明のポリペプチド（上）とラット
ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（下）との間の
アミノ酸配列相同性を示す。
ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（下）との間の
アミノ酸配列相同性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ジ ホンジュン アメリカ合衆国 メリーランド 20874, ジャーマンタウン， カントリー リッ ジ ドライブ 13144 (72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン アメリカ合衆国 メリーランド 20882, レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 HA17
Claims (1)
- 【請求項１】 単離されたポリヌクレオチドであって、
以下： （ａ）図１に示されるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズし
得、かつ少なくとも７０％が同一である、ポリヌクレオ
チド；および （ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のフラグメ
ント、該フラグメントは少なくとも５０塩基対長であ
る、からなる群より選択されるメンバーを包含する、単
離されたポリヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002134760A JP2002369684A (ja) | 2002-05-09 | 2002-05-09 | ヒトウリジンジホスフェートガラクトース−４−エピメラーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002134760A JP2002369684A (ja) | 2002-05-09 | 2002-05-09 | ヒトウリジンジホスフェートガラクトース−４−エピメラーゼ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8534011A Division JPH11505421A (ja) | 1995-05-11 | 1995-05-11 | ヒトウリジンジホスフェートガラクトース−４−エピメラーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002369684A true JP2002369684A (ja) | 2002-12-24 |
Family
ID=19194439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002134760A Pending JP2002369684A (ja) | 2002-05-09 | 2002-05-09 | ヒトウリジンジホスフェートガラクトース−４−エピメラーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002369684A (ja) |
-
2002
- 2002-05-09 JP JP2002134760A patent/JP2002369684A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040907 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050309 |