JP2002204697A - ヒトｄｎａリガーゼｉｖ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドおよび
そのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）
並びにそのようなポリペプチドを組換え技術により製造
する方法を開示する。 【解決手段】 ＤＮＡリガーゼIＶの欠損に関連する障
害の治療のために遺伝子治療を介してそのようなポリペ
プチドを利用する方法も開示する。そのようなポリペプ
チドに対するアンタゴニストおよび望ましくない細胞を
殺すための治療としての使用も開示する。ＤＮＡリガー
ゼIＶI遺伝子変異体を検出する診断法も開示する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新たに同定されたポリヌクレオチ
ド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの製造に関する。特には本発明のポリペ
プチドはヒトＤＮＡリガーゼIＶである。本発明はその
ようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。

【０００２】ＤＮＡ鎖の中断とギャップは、複製、修
復、組換え中に生じる。哺乳動物の細胞核においてはそ
のような切断の再結合はいくつかの異なるＤＮＡポリメ
ラーゼおよびＤＮＡリガーゼに依存する。３つの異なる
ＤＮＡリガーゼの存在は、精製された酵素の生化学的お
よび免疫学的キャラクタリゼーションにより以前に確立
された（Ｔomkinson，Ａ.Ｅ.等、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.、
２６６：２１７２８−２１７３５（１９９１))。ＤＮＡ
リガーゼは哺乳動物細胞におけるＤＮＡ複製、除去修復
および組換修復を触媒する酵素である（Ｌi，Ｊ.Ｊ.お
よびＫelly，Ｔ.Ｊ.、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８１：６９７
３−７７（１９８４）およびＷook，Ｒ.Ｏ.等、Ｃell，
５３：９７−１０６（１９８８))。細菌においては３つ
のＤＮＡリガーゼ、すなわちＤＮＡリガーゼI、ＤＮＡ
リガーゼII、およびＤＮＡリガーゼＩＩＩが発見され、
ヒトでは３つすべてが見出されているが、ＤＮＡリガー
ゼIのみがクローン化されている。

【０００３】ＤＮＡリガーゼIをコードする完全長のヒ
トcＤＮＡは、Ｓ．cereviasiae cdc温度感受性ＤＮＡ
リガーゼ変異体の機能的相補性により得られた（Ｂake
r，Ｄ.Ｇ.、Ｅur．Ｊ．Ｂiochem.，１６２：６５９−６
７（１９８７))。完全長cＤＮＡは９１９個のアミノ酸
残基よりなる１０２kＤaのタンパク質をコードする。微
生物ＤＮＡリガーゼを除いて他の公知タンパク質と顕著
な配列相同性はない。活性部位リジン残基は位置５６８
に位置している。ＤＮＡリガーゼIは活性のためにマグ
ネシウムとＡＴＰを必要とする。ＤＮＡリガーゼIの主
な機能は、ラギング鎖ＤＮＡ複製の間にオカザキ断片を
結合することである。それはＤＮＡ中の一本鎖破断点を
も有効にシールし、制限酵素ＤＮＡ断片を付着末端に結
合する。該酵素はＤＮＡのブラント末端結合を触媒する
こともできる。ＤＮＡリガーゼIは、poly（dＡ）に水素
結合したオリゴ（dＴ）分子を結合できるが、該酵素
は、オリゴ（dＴ）をポリ（rＡ）相補鎖にライゲートで
きない点でＴ４ＤＮＡリガーゼとは異なる。

【０００４】ヒトＤＮＡリガーゼIIは細胞核とより堅固
に結合している。この酵素は４２℃で急速に不活性する
不安定なタンパク質である。ＤＮＡリガーゼIIは、補因
子としてＡＴＰを必要とする点で他の真核ＤＮＡリガー
ゼと似ているが、ＡＴＰに対してずっと高い会合性を有
する点においてＤＮＡリガーゼIと異なる。ＤＮＡリガ
ーゼIIは、オリゴ（dＴ）・ポリ（rＡ）基質とのホスホ
ジエステル結合の形成を触媒するが、オリゴ（rＡ）・
ポリ（dＴ）基質については触媒しない。従ってこの点
においてＤＮＡリガーゼＩとは完全に異なる（Ａrran
d，Ｊ.Ｅ.等，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２６１：９０７９−
８２（１９８６))。

【０００５】ＤＮＡリガーゼIIより大きく、そのタンパ
ク質とは明らかに関係のない、最近検出された酵素はＤ
ＮＡリガーゼＩＩＩと名付けられた（Ｔomkinson，Ａ.
Ｅ.等，Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２６６：２１７２８−３５
（１９９１))。ＤＮＡリガーゼＩＩＩは、ＡＴＰの場合
低い親和力を有しヒドロキシアパタイトに弱くのみ結合
する点においてＤＮＡリガーゼＩに類似し、ＤＮＡリガ
ーゼIIとは異なる。しかしながらＤＮＡリガーゼＩおよ
びIIIは密接に関係していない。ＤＮＡリガーゼＩＩＩ
はＤＮＡにおける一本鎖破断点を有効に修復するが、ブ
ラント末端結合またはスーパーコイルＤＮＡのＡＭＰ依
存性緩和を行うことができない（Ｅlder,Ｒ.Ｈ.等、Ｅu
r．Ｊ．Ｂiochem.，２０３：５３−５８（１９９２))。

【０００６】ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ鎖中断の結合
についてのメカニズムは広く記載されている。その反応
は共有結合的酵素−アデニレート複合体の形成により開
始される。哺乳動物およびウイルスＤＮＡリガーゼはＡ
ＴＰを補助因子として用い、一方細菌ＤＮＡリガーゼは
アデニリル基を生成するためにＮＡＤを用いる。ＡＴＰ
は、ＡＭＰ、およびタンパク質の活性部位にある特異的
なリジン残基のε−基へホスホルアミデート結合により
結合したアデニリル残基を有するピロホスフェートに切
断される（Ｇumport，Ｒ.Ｉ.等、ＰＮＡＳ，６８：２５
５９−６３（１９７１))。ＤＮＡリガーゼ−アデニレー
ト中間体の再活性化されたＡＭＰ残基は２本鎖ＤＮＡ中
の１本鎖破断点の５'リン酸末端に移され、５'−５'ホ
スホ無水物結合を有する共有結合性ＤＮＡ−ＡＭＰ複合
体を生ずる。この反応中間体は微生物および哺乳動物リ
ガーゼについても単離されたが、アデニル化された酵素
より短命である。ＤＮＡライゲーションの最終段階にお
いて、ホスホジエステル結合の生成に必要なアデニル化
されていないＤＮＡリガーゼは、アデニル化部位の隣接
３'−ヒドロキシル基による攻撃を介してＡＭＰ残基の
置換を触媒する。

【０００７】本発明のポリペプチドはアミノ酸配列相同
性の結果として、ヒトＤＮＡリガーゼIＶと推定的に同
定された。

【０００８】本発明の一態様によればヒトＤＮＡリガー
ゼIＶである新規な成熟ポリペプチド、並びに生物学的
に活性な、そして診断または治療上有用なその断片、ア
ナログ、および誘導体が提供される。本発明の他の態様
によれば、mＲＮＡ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ並
びにそのアナログおよび生物学的に活性で診断または治
療上有用なフラグメントを含む、ヒトＤＮＡリガーゼI
Ｖをコードする単離された核酸分子を提供する。

【０００９】本発明の異なる態様によれば組換え技術に
よるそのようなポリペプチドの製造方法が提供され、そ
の方法は、ヒトＤＮＡリガーゼIＶ核酸配列を有する組
換え原核および／または真核宿主細胞を、該タンパク質
の発現を促進する条件下に培養し、次にそのタンパク質
を回収することを含んでなる。

【００１０】本発明の更なる態様によれば、そのような
ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを、科学的研究、ＤＮＡ合成およ
びＤＮＡベクターの製造に関するインビトロ目的のため
に利用する方法が提供される。

【００１１】本発明の更なる態様によれば、遺伝子治療
によって、不十分なヒトＤＮＡリガーゼIＶ活性に関す
る状態を処置する方法が提供され、その方法はＤＮＡリ
ガーゼIＶ遺伝子を患者の細胞にin vivoまたはex vivo
で入れることを含んでなる。その遺伝子はトランスデュ
ースされた細胞中で発現され、その結果として、該遺伝
子によりコードされるタンパク質を治療に、例えば異常
な細胞増殖、例えば腫瘍等のＤＮＡの欠陥に関連する障
害を防止し、激しい免疫抑制、発育阻止された生長およ
びリンパ腫、並びにＤＮＡ破損剤に対する細胞の過敏性
を治療する。

【００１２】本発明の更なる態様によれば、ヒト配列に
特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子よ
りなる核酸プローブが提供され、ＤＮＡリガーゼIＶを
コードする遺伝子中の変異を検出するのに診断的に使用
し得る。

【００１３】本発明の更なる態様によれば、そのような
ポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、それ
は細胞内で製造されるかまたは遺伝子治療により投与さ
れ、そのようなポリペプチドの作用を阻げ、例えば望ま
しくない細胞、例えば癌細胞を標的にし、破壊する。

【００１４】本発明のこれらのおよび他の態様は本明細
書の教示から当業者に明らかであろう。

【００１５】次の図は本発明の態様の説明であり、請求
の範囲に包含される本発明の範囲を制限することを意図
しない。

【００１６】図１〜１２は、ＤＮＡリガーゼIＶポリペ
プチドのcＤＮＡ配列および対応する推定アミノ配列を
示す。アミノ酸についての標準的な１文字省略を用い
る。図１３〜１５は、ヒトＤＮＡリガーゼＩ（上の列）
およびヒトＤＮＡリガーゼIＶ（下の列）間のアミノ酸
相同性を示す。図１６は、異なるヒト組織におけるＤＮ
ＡリガーゼIＶの存在を説明するゲルのコピーである。
パネルＡはヒトＤＮＡリガーゼIＶ遺伝子のノーザン分
析のオートラジオグラフであり、パネルＢはローディン
グレファレンスとしてのエチジウムブロマイド染色ゲル
である。結果は、ヒトＤＮＡリガーゼIＶが、胸腺、精
巣および心臓で主に発現することを示す。

【００１７】本発明の一態様により、図１〜１２の推定
アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９
４年８月３１日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８８０号とし
てアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣ
Ｃ）に寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポ
リヌクレオチド)を提供する。

【００１８】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、胸腺、精巣および心臓から得ることがで
きる。本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの活性化され
たＴ細胞から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見さ
れた。それは、構造的に、ＤＮＡリガーゼファミリーに
関係がある。それは、８９９個のアミノ酸残基のタンパ
ク質をコードするオープンリーディングフレームを含
む。そのタンパク質は、ウサギＤＮＡリガーゼに対し、
最も大きい相同性を有し、全タンパク質にわたって、２
９％の同一性および５１％の類似性を有する。疎水性ア
ミノ酸残基がいずれかの側で隣接する保存された活性な
リジン残基が存在し、配列Ｅ−ＫＹＤＧ−Ｒは、哺乳動
物細胞、酵母、ワクシニアウイルスおよびバクテリオフ
ァージＴ７等の異なる源からの酵素に共通することも重
要である。

【００１９】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、図１〜１２に示すコード配列または寄託されたクロ
ーンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コ
ードの重複または縮重の結果として、図１〜１２のＤＮ
Ａまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドを
コードする異なったコード配列であってもよい。

【００２０】図１〜１２の成熟ポリペプチドまたは寄託
されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ
得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペ
プチドのコード配列(また場合により、付加的コード配
列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロ
ンまたは非コード配列５'および／または３'といったよ
うな非コード配列。

【００２１】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。

【００２２】本発明はさらに、図１〜１２の推定アミノ
酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローン
のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリ
ヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変
異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異
体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体
であり得る。

【００２３】従って、本発明には、図１〜１２に示すの
と同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポ
リヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、
図１〜１２のポリペプチドまたは寄託されたクローンの
cＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌ
クレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに
付加および挿入変異体が含まれる。

【００２４】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、図１〜１２に示すコード配列の天然に存在するアレ
ル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然
に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。
当業界で知られているように、アレル変異体は、１つま
たはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を
有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これ
は、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変え
ない。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。

【００２６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記
の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、
また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを
意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜１２
のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質
的には保有するポリペプチドをコードする。

【００２７】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は
いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用
し、または販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾は、ここでは付与されない。

【００２８】本発明はさらに、図１〜１２の推定アミノ
酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するＤＮＡリガーゼIＶポリ
ペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体に関する。

【００２９】図１〜１２のポリペプチドまたは寄託され
たcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場
合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」
という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ
生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味
する。

【００３０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。

【００３１】図１〜１２のポリペプチドまたは寄託され
たcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメ
ント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基
(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、ま
たそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコー
ドされるものであってもよく、またはコードされたもの
でなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟
ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる
化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他
の化合物と融合しているもの、または（iv）は成熟ポリ
ペプチドの精製に使用される、付加的アミノ酸が成熟ポ
リペプチドに融合しているものであり得る。そのような
フラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の
教示から当業者の範囲内であると思われる。

【００３２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。

【００３３】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分とな
り得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではな
いという点で、なお単離されている。

【００３４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。

【００３５】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはＤＮＡリガーゼIＶ遺伝子を増幅するのに適する
よう改変された従来の栄養培地で培養することができ
る。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に
選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、
当業者に明らかであろう。

【００３６】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。

【００３７】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。

【００３８】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
Ｐ_Ｌプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。

【００３９】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。

【００４０】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。

【００４１】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella ty
phimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細
胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといったよ
うな動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明
細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。

【００４２】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。以下の
ベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ
６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１０、ファージ
スクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript
ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、p
ＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−
３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharm
acia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、p
ＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他の
いずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中
で複製可能であって、生存可能である限り、使用するこ
とができる。

【００４３】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。

【００４４】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecula
r Ｂiology（１９８６）)。

【００４５】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。

【００４６】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。

【００４７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。

【００４８】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。

【００４９】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typ
himurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。

【００５０】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadis
on、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。

【００５１】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる
期間培養する。

【００５２】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。

【００５３】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。

【００５４】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、お
よびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転
写遺伝要素を与えることができる。

【００５５】ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドは、硫酸
アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオン
または陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロ
ースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキ
シルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンク
ロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培
養物から回収して、精製することができる。必要に応じ
て、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配
置を完成するのに使用することができる。最後に、高性
能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に
使用することができる。

【００５６】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００５７】該ＤＮＡリガーゼポリペプチド、並びにポ
リペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはま
た、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのような
ポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に
従って使用することもできる。 従って、例えば、患者
由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作し
た後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与
える。そのような方法は、当業界で周知であって、本明
細書中の教示から明らかである。例えば、本発明のポリ
ペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子
の使用により、公知の方法により、細胞を操作すること
ができる。

【００５８】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。例えば、
細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン
ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチド
をコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造す
るための産生細胞を患者に投与することができる。その
ような方法により本発明のポリペプチドを投与するため
のこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当
業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための
発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、
適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボ
において操作するために使用することができるアデノウ
イルスであってもよい。

【００５９】ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドが遺伝子
治療を介して細胞内でひとたび発現されると、ＤＮＡ損
壊剤、例えばＵＶ照射により生ずるＤＮＡの一本鎖切断
を修復するのに用い得る。いくつかのヒトの症候群はＤ
ＮＡリガーゼ遺伝子の常染色体劣性遺伝から生ずる。こ
れらの症候群は重篤な免疫不全を起こし、ＤＮＡが修復
されないため異常な細胞分化になりやすさを大いに増加
させ、一方細胞レベルではそれらは染色体の不安定性お
よびＤＮＡ損壊剤に対する過度の感受性により特徴付ら
れる。これらの症候群にはＦanconi貧血およびＢlackfa
n-diamond貧血がある。

【００６０】本発明のポリペプチドを用いて、ＤＮＡI
Ｖ遺伝子の欠陥の結果である重篤な免疫抑制およびＤＮ
Ａ再結合欠陥から生じる発育を妨げられた増殖およびリ
ンパ腫を処置し得る。

【００６１】同様に、本発明のポリヌクレオチドは、同
様の生物学的活性を有する他の分子を同定するのにも有
用である。これについてのスクリーニングの例は、オリ
ゴヌクレオチドプローブを合成するために公知のＤＮＡ
配列を用いることによりＤＮＡリガーゼIＶ遺伝子のコ
ード鎖を単離することである。本発明の遺伝子の配列に
相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを用
いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライ
ブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメン
バーにプローブがハイブリダイズするか決める。

【００６２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、科学研究、ＤＮＡの合成に関して、およびＤＮ
Ａベクターの製造のためにも用い得る。本発明のポリペ
プチドおよび／またはポリヌクレオチドは研究市場で販
売し得る。例えばＤＮＡリガーゼIＶを、他のリガーゼ
に類似する方法でＤＮＡ配列のin vitroinライゲーショ
ンに用い得る。

【００６３】本発明はヒトＤＮＡリガーゼIＶにより触
媒されるＤＮＡ結合反応を促進し（アゴニスト）、また
妨げる（アンタゴニスト）化合物を同定する、化合物ス
クリーニング方法を提供する。そのような方法の例は、
ＡＴＰ、ＤＮＡリガーゼおよび一本鎖破断点を有するＤ
ＮＡを該化合物と、ＤＮＡリガーゼがＡＴＰをＡＭＰに
正常に分解し、そのＡＭＰが二本鎖ＤＮＡの一本鎖破断
点の５'リン酸末端に移り、共有結合性ＤＮＡ−ＡＭＰ
複合体を生じ、一本鎖破断点がその後修復するような条
件下に混合することを含んでなる。一本鎖破断点を有す
るＤＮＡは変異体細胞により上記例で提供され、その細
胞は鎖破断修復に働くタンパク質を欠いており、例えば
ＸＲＣＣＩを欠く変異体ゲッ歯類細胞、およびcdc９Ｓ.
ＣerevisiaeＤＮＡリガーゼ変異体である。この反応の
触媒を促進し、または妨げる化合物の能力を次に測定
し、化合物が有効なアゴニストまたはアンタゴニストで
あるかを決める。

【００６４】ヒトＤＮＡリガーゼIＶは細胞内で産生さ
れ、機能する。それ故いずれのアンタゴニストも細胞内
性でなければならない。ヒトＤＮＡリガーゼIＶに対す
る可能性あるアンタゴニストには、細胞内で産生される
抗体を含む、例えばＤＮＡリガーゼIＶをアンタゴナイ
ズすると同定された抗体を、公知の方法、例えば適当な
細胞を一本鎖抗体をコードするＤＮＡでトランスフォー
ムし、ヒトＤＮＡリガーゼIＶの機能を阻害することに
より、一本鎖抗体として細胞内で産生され得る。 別の
可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス技術を利
用して調製されたアンチセンス構築物である。アンチセ
ンス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセン
スＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御する
ことができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドの
ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明
の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配
列の５'コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基
対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計す
る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝
子領域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−
Ｌeeら、Ｎucl.ＡcidsＲes.、６：３０７３（１９７
９）；Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８
８）；およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０
（１９９１）を参照)、そのことによって、転写および
ＤＮＡリガーゼIＶの産生を妨げる。アンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡに
ハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＤＮＡリガーゼIＶ
への翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ.Ｎ
eurochem.、５６：５６０（１９９１）；Ｏligodeoxynu
cleotides as Ａntisense Ｉnhibitors of Ｇene Ｅxpr
ession、ＣＲＣ Ｐress、ＢocaＲaton、ＦＬ（１９８
８）)。上記のオリゴヌクレオチドをまた、細胞に送り
込み、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡをインビボにお
いて発現させて、ＤＮＡリガーゼIＶの産生を阻害する
ことができる。

【００６５】他の可能性あるアンタゴニストには、ＤＮ
Ａは認識するが一本鎖破断を修復せず、従ってヒトＤＮ
ＡリガーゼIＶが機能するのを妨げるよう機能する、Ｄ
ＮＡリガーゼIＶの変異した形、またはムテインが含ま
れる。

【００６６】アンタゴニストを用いて望ましくない細
胞、例えばがん細胞を標識化し得る。何故ならＤＮＡリ
ガーゼIＶの阻害はＤＮＡにおける一本鎖破断の修復を
妨げ、事実上細胞死をもたらすからである。

【００６７】本発明の小分子アゴニストおよびアンタゴ
ニストは、適当な薬学的担体と組み合わせて使用するこ
とができる。そのような組成物は、治療上有効な量の該
化合物、および薬学上許容され得る担体または賦形剤を
含んでなる。そのような担体には、これに限定されるも
のではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキス
トロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれ
らの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法に適
合すべきである。

【００６８】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、本発明の医薬組成物は、他の
治療化合物と共に使用することができる。

【００６９】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、それらは、少なくとも
約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場
合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量
で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路およ
び症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／k
g〜約１mg／kg(体重)である。

【００７０】完全な長さのヒトＤＮＡリガーゼIＶ遺伝
子のフラグメントは、完全な長さのＤＮＡリガーゼIＶ
遺伝子を単離するために、また該遺伝子に対する高い配
列類似性活性を有する他の遺伝子を単離するために、c
ＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用することができる。この種類のプロー
ブは、例えば、３０、４０、５０、７５、９０、１００
または１５０であり得る。好ましくは、しかし、該プロ
ーブは、３０〜５０塩基対を有する。該プローブはま
た、完全な長さの転写物、並びにゲノムクローン、また
は調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイン
トロンが含まれる、完全な長さの転写物に対応するcＤ
ＮＡクローンを同定するのに使用することもできる。プ
ローブは、ハイブリダイゼーションの同定を容易にする
ため標識してもよい。

【００７１】本発明は診断薬としてのヒトＤＮＡリガー
ゼIＶの使用をも提供する。例えばある病気は固有の遺
伝子欠損から生ずる。これらの遺伝子は欠損遺伝子の配
列を正常なもののそれと比較することにより検出でき
る。すなわち変異体遺伝子をＤＮＡ損壊剤に過度の感受
性、異常な細胞増殖へのかかりやすさの増加、例えば腫
瘍および癌に関連づける。

【００７２】ヒトＤＮＡリガーゼIＶにおいて変異が起
こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで
検出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞か
ら、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料
から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために
直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaik
iら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６）)
を利用することにより、酵素的に増幅することができ
る。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用する
ことができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比
較しての増幅産物のサイズの変化により検出することが
できる。点変異は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化
ＤＮＡリガーゼIＶ ＲＮＡ、あるいはまた、放射能標識
化ＤＮＡリガーゼIＶ アンチセンスＤＮＡ配列にハイブ
リダイズすることにより同定することができる。完全に
対合している配列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化により、また
は融解温度の相違により、対合していない複合物(duple
xes)と区別することができる。

【００７３】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、
変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂
げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高
分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。Ｄ
ＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラ
ジエントゲルを変性することで区別することができ、こ
こでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それら
の特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルに
おける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓc
ience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。

【００７４】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５）)。

【００７５】従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲ
ノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保
護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の
使用(例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およ
びサザンブロッティングといったような方法により成し
遂げることができる。変異体はin situ分析により検出
し得る。

【００７６】更にある病気は、mＲＮＡにおける変化に
より検出できる遺伝子発現の変化の結果であり、または
それにより特徴付けできる。或いはＤＮＡリガーゼIIを
比較として用い、低レベルのＤＮＡリガーゼIＶタンパ
ク質を発現する個体を、例えばＮorthernブロッティン
グにより同定できる。

【００７７】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。

【００７８】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡ
のコンピューター分析を利用して、ゲノムＤＮＡ中の１
つ以上のエキソンをスパン(span)しないプライマーを迅
速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。
次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含
む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用す
る。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらの
ハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与える
であろう。

【００７９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。

【００８０】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０
００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグ
ナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が
高い。ＦＩＳＨは、発現配列タグ(ＥＳＴ)が得られるク
ローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。
例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良
好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を
妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂ
asic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク
（１９８８）を参照。

【００８１】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。本発
明の遺伝子は染色体１３ｑ３３−３４にマップされた。

【００８２】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。

【００８３】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。

【００８４】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。

【００８５】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。

【００８６】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されてい
る技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免
疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するの
に適合し得る。

【００８７】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定さ
れないことを理解すべきである。部または量は全て、特
にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の
理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法
および／または用語を記載する。

【００８８】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。

【００８９】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、
Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。

【００９０】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。

【００９１】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。特にことわらない限り、トランスフォーメーション
は、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、
５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されて
いるようにして行なった。

【００９２】

【実施例】実施例１ ＤＮＡリガーゼIＶの細菌における発現と精製 ＤＮＡリガーゼIＶをコードするＤＮＡ、ＡＴＣＣ＃７
５８８０をプロセシングされたＤＮＡリガーゼIＶタン
パク質の５'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いて最初に増幅する。その５'オリゴヌ
クレオチドプライマーは配列： を有し、Ｂam ＨＩ制限酵素部位（下線）、続いてプロ
セシングされたタンパク質コドンの推定の末端アミノ酸
から出発するＤＮＡリガーゼIＶコード配列の２１ヌク
レオチドを含む。 という３'配列は、ＰstＩ部位（下線）に対する相補的
な配列を含み、ＤＮＡリガーゼＩＶのＣ末端のＤＮＡリ
ガーゼIＶの２１ヌクレオチドが続く。その制限酵素部
位は細菌発現ベクターpＱＥ−９（Ｑiagen，Ｉnc．９２
５９ Ｅton Ａvenue，Ｃhatsworth，ＣＡ，９１３１
１）の制限酵素部位に対応する。pＱＥ−９は抗生物質
耐性（Ａmp^ｒ)、細菌の複製起源（ori)、１ＰＴＧ調節
可能なプロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ)、リボソー
ム結合部位（ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部
位をコードする。pＱＥ−９を次にＢam Ｈ１およびＰＳ
ＴＩで消化する。増幅した配列をpＱＥ−９にライゲー
トし、ヒスチジンのtagおよびＲＢＳをコードする配列
と共に枠内に挿入する。ライゲーション混合物を用い
て、Ｑiagenから商標Ｍ１５／rep４の名前で入手できる
Ｅ．coli株Ｍ１５／rep４を、Ｓambrook，Ｊ等、Ｍolec
ular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual，ＣoldＳp
ring Ｌaboratory Ｐress（１９８９）に記載された
方法によりトランスホームする。Ｍ１５／rep４はプラ
スミドpＲＥＰ４の多重コピーを有し、該プラスミドはl
acＩリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（Ｋa
n^ｒ）も与える。トランスホーマントを、ＬＢプレート
で増殖するその能力により同定し、アンピシリン／カナ
マイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを
単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を有す
るクローンを、Ａmp（１００μg／ml）およびkan（２５
μg／ml）の両方を補ったＬＢ培地で液体培養で一晩
（Ｏ／Ｎ）増殖させる。そのＯ／Ｎ培養を用いて、大量
培養物を１：１００〜１：２５０の割合で接種する。細
胞を０.４〜０.６の間の光学密度６００（Ｏ.
Ｄ.^６００）まで増殖させる。ＩＰＴＧ（イソプロピル
−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１mＭ
になるまで次に加える。ＩＰＴＧはlacＩリプレッサー
を不活性化し、Ｐ／Ｏをクリアリングして遺伝子発現の
増加をもたらすことによって誘導する。細胞をさらに３
〜４時間増殖させる。次に細胞を遠心分離により収穫す
る。細胞ペレットをカオトロピック剤６モルグアニシジ
ンＨＣlで可溶化する。清澄後可溶化タンパク質抽出物
を、以下の条件下にニッケル−キレートカラムでのクロ
マトグラフィーによりこの溶液から精製する。その条件
は６−Ｈis tagを含むタンパク質による強固な結合を可
能にするものであり（Ｈochuli，Ｅ等、Ｊ．Ｃhromatog
raphy ４１１：１７７−１８４（１９８４))、そのカ
ラムから６モルのグアニシジンＨＣl pＨ５で溶出し、
再生のために３モルグアニジンＨＣl、１.００mＭリン
酸ナトリウム、１０ミリモルのグルタチオン（還元
形)、および２ミリモルのグルタチオン（酸化形）で調
節する。この溶液で１２時間インキュベーション後、タ
ンパク質を１０ミリモルのリン酸ナトリウムに対し透析
する。

【００９３】実施例２ バキュロウイルス発現系を用いるＤＮＡリガーゼIＶの
クローニングおよび発現 完全長のＤＮＡリガーゼIＶタンパクをコードするＤＮ
Ａ配列、ＡＴＣＣ＃７５８８０を、その遺伝子の５'お
よび３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて増幅する。 ５'プライマーは配列： を有し、Ｓma Ｉ制限酵素部位（太線)、およびそれに続
く真核細胞中での翻訳開始のための有効シグナルに似た
２１ヌクレオチドが続く（Ｋozak，Ｍ.，Ｊ．Ｍol．Ｂi
ol.，１９６：９４７−９５０，（１９８７))。（翻訳
開始コドンＡＴＧには下線を引く）。 ３'プライマーは配列： を有し、制限エンドヌクレアーゼＡsp７１８開裂部位
（太線）およびＤＮＡリガーゼIＶ遺伝子のＣ末端配列
に相補的な２１ヌクレオチドを有する。増幅した配列を
商業的に入手できるキット（「Ｇeneclean」ＢＩＯ １
０１ Ｉnc.，Ｌa Ｊolla，Ｃa）を用いて１％アガロー
スゲルから単離した。その断片を制限エンドヌクレアー
ゼＳma ＩおよびＡsp７１８で次に消化し、次に１％ア
ガロースゲルで再度精製した。この断片をＦ２と名付け
る。

【００９４】ベクターpＲＧ１（pＶＬ９４１ベクターの
改変物、以下で論ずる）を、バキュロウイルス発現シス
テム（総説については、Ｓummers，Ｍ.Ｄ.およびＳmit
h，Ｇ.Ｅ．１９８７，Ａ manual of methods for
baculovirus rectors andinsect cell culture pr
ocedures，Ｔexas Ａgricultural ＥxperimentalＳta
tion Ｂulletin Ｎo １５５５を参照）を用いるＤＮ
ＡリガーゼＩＶタンパク質発現に用いる。この発現ベク
ターはＡutographa california nuclearpolyhedrosis
virus（ＡcＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモー
ター、およびその後に制限エンドヌクレアーゼＳma Ｉ
およびＡsp７１８の認識部位を含む。サルウイル（Ｓ
Ｖ）４０のポリアデニル化部位を有効なポリアデニル化
のために用いる。組換えウイルスの選択を容易にするた
めにＥ.coliからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリ
ヘドリンプロモーターと同じ方向に挿入し、ポリヘドリ
ン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。そのポリヘ
ドリン配列の両側にコトランスフェクトされる野性型ウ
イルスＤＮＡの細胞媒介ホモロガス組換えのためのウイ
ルス配列を隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベ
クターをpＡc３７３、pＶＬ９４１およびpＡcＩＭ１等p
ＲＧ１の代りに用い得るであろう（Ｌuckow，Ｖ.Ａ.お
よびＳummers，Ｍ.Ｄ.，Ｖirology，１７０：３１−３
９)。そのプラスミドを制限酵素Ｓma ＩおよびＡsp７１
８で消化し、ウシの腸ホスファターゼを用いて公知の方
法により脱ホスホリル化する。そのＤＮＡを商業的に入
手できるキット（「Ｇene clean」ＢＩＯ １０１ Ｉn
c.，Ｌa Ｊolla，Ｃa）を用いて１％アガロースゲルか
ら次に単離できる。このベクターをＶ２と呼ぶ。

【００９５】断片Ｆ２および脱ホスホリル化プラスミド
Ｖ２をＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートした。Ｅ.coli
ＨＢ１０１細胞を次にトランスフォームし、酵素Ｓma
ＩおよびＡsp７１８を用いてＤＮＡリガーゼＩＶ遺伝
子を有するプラスミド（pＢacＤＮＡリガーゼＩＶ）を
含む細菌を同定する。クローン化した断片の配列をＤＮ
Ａ配列決定により確認する。

【００９６】プラスミドpＢacＤＮＡリガーゼIＶ５μg
を、商業的に入手できる線形化バクロウイルス１.０μg
（「Ｂaculo Ｇold、バキュロウイルスＤＮＡ」、Ｐhar
mingen，Ｓan Ｄiego ＣＡ）でリポフェクション法
（Ｆelgner等、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，
８４：７４１３−７４１７（１９８７）を用いてコトラ
ンスフェクトした。

【００９７】１μgのＢaculo ＧoldウイルスＤＮＡおよ
び５μgのプラスミドpＢac ＤＮＡリガーゼＩＶを、５
０μlの血清を含まないＧrace培地（Ｌife Ｔechnolog
iesＩnc，Ｇaithersburg、ＭＤ）を含むマイクロタイタ
ープレートの滅菌ウエル中で混合する。その後１０μl
のリポフェクチンおよび９０μlのＧrace培地を加え、
混合し、室温で１５分インキュベートする。次にトラン
スフェクション混合物を、血清を含まない１mlのＧrace
培地を有する３５mmの組織培養プレートに接種したＳf
９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。
そのプレートを前後にゆすり、新しく加えた溶液を混合
する。そのプレートを次に２７℃で５時間インキュベー
トする。５時間後トランスフェクション溶液をプレート
から除き、１０％ウシ胎児血清を補ったＧraceの昆虫培
地１mlを加える。そのプレートをインキュベートに戻
し、培養を２７℃で４日間続ける。

【００９８】４日後、上清を集め、プラーク検定をＳum
mersおよびＳmith（上記）に記載と同様に行う。一変形
として「Ｂlue Ｇal」（Ｌife Ｔechnologies Ｉn
c.，Ｇaithersburg）を用い、青色に染色されたプラー
クの単離を行う。（「プラーク検定」の詳細な記述は、
Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.，Ｇaithersburg，９−１
０頁により配布された昆虫細胞培養およびbaculovirolo
gyのためのユーザスガイドにも見出すことができる)。

【００９９】ウイルスの連続希釈の４日後、細胞に加
え、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペッ
トのチップで選ぶ。組換えウイルスを有する寒アガーを
次に２００nlのＧrace培地を含むエッペンドルフ管に再
懸濁する。アガーを短時間の遠心分離により取り除き、
組換えバキュロウイルスを含む上清を用いて、３５mmデ
イッシュに接種したＳf９細胞に感染させる。４日後、
これらの培養皿の上清を集めて４℃で貯蔵する。

【０１００】Ｓf９細胞を１０％の熱不活性化ＦＢＳを
補ったＧrace培地中で培養する。その細胞を組換えバキ
ュロウイルスＶ−ＤＮＡリガーゼIＶに感染多重度（Ｍ
ＯＩ）２で感染させる。６時間後、培地を取り除き、メ
チオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００II培地で
置換する（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.,Ｇaithersbur
g）。４２時間後、５μＣiの^３５Ｓ−メチオニンおよび
５μＣiの^３５Ｓ−システイン（Ａmersham）を加える。
更にその細胞を１６時間インキュベートした後、遠心分
離により収穫し、標識化されたタンパク質をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化す
る。

【０１０１】実施例３ ＣＯＳ細胞における組換えＤＮＡリガーゼの発現 プラスミドＤＮＡリガーゼIＶ ＨＡの発現は、１）ＳＶ
４０複製起源 ２）アンピシリン耐性遺伝子 ３）Ｅ．
coli複製起源 ４）ＣＭＶプロモーターとそれに続くポ
リリンカー領域、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニ
ル化部位を含むベクターpcＤＮＡＩ／Ａmp（Ｉnvitroge
n）に由来する。完全なＤＮＡリガーゼIＶ前駆体および
その３'末端に枠内で融合されたＨＡtagをコードするＤ
ＮＡ断片をベクターのポリリンカー領域にクローンし、
それ故組換えタンパク質発現をＣＭＶプロモーター下に
置く。ＨＡtagは上記のようにインフルエンザへマググ
ルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する
（Ｉ.Ｗilson，Ｈ.Ｎiman,Ｒ.Ｈeighten,Ａ.Ｃherenso
n,Ｍ.ＣonnollyおよびＲ.Ｌerner,Ｃell 37:767(198
4))。ＨＡtagの標的タンパク質への融合により、ＨＡエ
ピトープを認識する抗体を用いた組換えタンパク質の検
出が容易になる。

【０１０２】プラスミド構築戦略を次の如く記述でき
る：ＤＮＡリガーゼIＶをコードするＤＮＡ配列 ＡＴＣ
Ｃ#７５８８０を、２つのプライマーを用いてクローン
化された元のＥＳＴ上でのＰＣＲにより構築する。 ５'プライマー： は、ＥcoＲＩ部位（下線）およびそれに続く開始コドン
から出発するＤＮＡリガーゼIＶコード配列の２１のヌ
クレオチドを含む。３'配列： は、ＸhoＩ部位（下線）に相補的な配列、翻訳停止コド
ン、ＨＡtagおよびＤＮＡリガーゼＩＶコード配列（停
止コドンを含まず）の最後の２１ヌクレオチドを含む。
それ故、そのＰＣＲ産物はＥcoＲＩ部位、ＤＮＡリガー
ゼIＶコード配列、それに続く枠内に融合したＨＡtag、
ＨＡtagに隣接した翻訳終了停止コドンおよびＸhoＩ部
位を含む。そのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片およびベクターpc
ＤＮＡＩ／ＡmpをＥcoＲＩおよびＸhoＩ制限酵素で消化
し、ライゲートする。ライゲーション混合物をＥ．coli
株ＳＵＲＥ（Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems,11099 Ｎ
orthＴerrey Ｐines Ｒoad,Ｌa Ｊolla ＣＡ92037から
入手可能）にトランスホームし、トランスホームした培
養物をアンピシリン培地のプレートにプレートし耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡをトランスホーマ
ントから単離し、制限分析により正しい断片の存在につ
いて調べる。組換えＤＮＡリガーゼIＶの発現のために
ＣＯＳ細胞をその発現ベクターでＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲ
ＡＮ法によりトランスフェクトする（Ｊ.Ｓambrook,Ｅ.
Ｆritsch,Ｔ.Ｍaniatis,Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌab
oratory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｌaboratry Ｐress(19
89)）。ＤＮＡリガーゼIＶ ＨＡタンパク質の発現を、
放射標識および免疫沈降法により検出する（E.Harlow,
D.Lane,Antibodies:A Laboratory Mannual,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,(1988)）。細胞をトランス
フェクション２日後に^３５Ｓ−システインで８時間標識
する。媒地を集め、細胞を洗剤で溶菌する（ＲＩＰＡ緩
衝液（１５０mＭ ＮａＣl、０.１％ＳＤＳ、１％ＮＰ
−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭ Ｔris,pＨ７.５）
（Ｗilson,Ｉ等、上書37：767(1984)）。細胞溶菌物お
よび媒地の両方をＨＡ特異的なモノクローナル抗体を用
いて沈殿させる。沈殿したタンパク質を１５％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルで分析する。

【０１０３】実施例４ ヒト組織におけるＤＮＡリガーゼIＶの発現パターン ノーザンブロット分析を行いヒト組織におけるＤＮＡリ
ガーゼIＶの発現レベルを調べ得る。全細胞ＲＮＡ試料
をＲＮＡzol Ｂシステムを用いて単離する（Ｂiotecx
Ｌaboratories,Ｉnc.6023 Ｓouth Ｌoop Ｅast,Ｈousto
n,ＴＸ77033）。特定した各ヒト組織から単離した全Ｒ
ＮＡ約１５μｇを１％アガロースゲルで分離し、ナイロ
ンフィルターにブロットする（Ｓambrook,Ｆrischおよ
びＭaniatis,Ｍolecular Ｃloning,Ｃold Ｓpring Ｈar
bor Ｐress(1989)）。標識化反応を、５０μｇのＤＮＡ
断片を用いてＳtratagene Ｐrime−Ｉtキットに従って
行う。その標識したＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラム
を用いて精製する（５プライム−３プライム,Ｉnc.5603
Ａrapahoe Ｒoad,Ｂoulder,ＣＯ80303）。個々のＲＮ
Ａブロットを含むフィルターを放射活性の標識した完全
長ＤＮＡリガーゼIＶ遺伝子と、1,000,000 cpm／mlで、
０.５Ｍ ＮaＰＯ_４、pＨ７.４および７％ＳＤＳ中で一
晩６５℃でハイブリダイズする。０.５×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳで室温で２回および６０℃で２回洗浄後、その
フィルターを−７０℃で一晩インテンシファイングスク
リーンにさらす。ＤＮＡリガーゼIＶのメッセージＲＮ
Ａは胸腺、精巣および心臓に豊富である（図１６参
照)。本発明の多くの改変および変形が上の教示に照ら
して可能である。それ故請求の範囲内で本発明を特に記
載した方法以外の方法で実施し得る。

【０１０４】

【配列表】

（１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： ウェイ，ワイ （ii） 発明の名称 ： ヒトＤＮＡリガーゼIＶ （iii） 配列の数 ： ２ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラ
ン，セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−２２９ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３３２５塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ９１０アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ：

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図２】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図３】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図４】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図５】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図６】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図７】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図８】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図９】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ配
列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図１０】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ
配列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図１１】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ
配列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図１２】 ＤＮＡリガーゼIＶポリペプチドのcＤＮＡ
配列および対応する推定アミノ配列を示す。

【図１３】 ヒトＤＮＡリガーゼＩ（上の列）およびヒ
トＤＮＡリガーゼIＶ（下の列）間のアミノ酸相同性を
示す。

【図１４】 ヒトＤＮＡリガーゼＩ（上の列）およびヒ
トＤＮＡリガーゼIＶ（下の列）間のアミノ酸相同性を
示す。

【図１５】 ヒトＤＮＡリガーゼＩ（上の列）およびヒ
トＤＮＡリガーゼIＶ（下の列）間のアミノ酸相同性を
示す。

【図１６】 異なるヒト組織におけるＤＮＡリガーゼI
Ｖの存在を説明するゲルのコピーである。パネルＡはヒ
トＤＮＡリガーゼIＶ遺伝子のノーザン分析のオートラ
ジオグラフであり、パネルＢはローディングレファレン
スとしてのエチジウムブロマイド染色ゲルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 9/00 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/60 (72)発明者 イン−フェイ・ウェイ アメリカ合衆国20878メリーランド州ダー ネスタウン、ストロー・ベイル・レイン 13524番 (72)発明者 ウィリアム・エイ・ヘイゼルタイン アメリカ合衆国ワシントン・ディストリク ト・オブ・コロンビア、ノース・ウエス ト、ピー・ストリート3053番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA08 HA17 4B050 CC03 DD11 EE10 LL01 4C084 AA02 AA13 BA44 CA18 DC28 NA14 ZB082 ZB212 ZB261

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本明細書に記載されたいずれかの発明。