EP0850302A1 - Sequences nucleiques codant pour des recepteurs de la melatonine et leurs applications - Google Patents

Sequences nucleiques codant pour des recepteurs de la melatonine et leurs applications

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Publication number
EP0850302A1
EP0850302A1 EP96926457A EP96926457A EP0850302A1 EP 0850302 A1 EP0850302 A1 EP 0850302A1 EP 96926457 A EP96926457 A EP 96926457A EP 96926457 A EP96926457 A EP 96926457A EP 0850302 A1 EP0850302 A1 EP 0850302A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
melatonin
seq
receptor
protein
mel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP96926457A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Ralf Jockers
Stefano Marullo
Arthur Donny Strosberg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ADIR SARL
Original Assignee
ADIR SARL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ADIR SARL filed Critical ADIR SARL
Publication of EP0850302A1 publication Critical patent/EP0850302A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid sequences coding for xenonope melatonin receptors of the MEL1 A type, also hereinafter called Mel 1c , to oligonucleotides included in said sequences, to their applications as a probe and to the expression of proteins and / or fragments thereof having a functional melatonin receptor activity of the MEL1 A type, to the vectors useful for said expression, to the cellular hosts containing said vectors as well as to a model for studying the receptors melatonin.
  • the present invention also relates to a method for screening substances, with agonist or antagonist action against proteins having a melatonin receptor action and with kits or kits for detecting the degree of affinity of different substances for said proteins with melatonin receptor activity.
  • primers located in the 3 ′ part of the corresponding nucleic acid sequences did not make it possible to amplify the sequence coding for this protein.
  • the subject of the present invention is nucleic acid sequences encoding functional melatonin receptors, of the MEL1 A type and of structure different from that of the receptor described in EBISAWA et al. and having coupling and regulatory properties different from those of the previously described receptor, which sequences are selected from the sequences SEQ ID No 1, SEQ ID No 3, SEQ ID No 5 or SEQ ID No 7, such as presented in the list of sequences included in this Request.
  • sequences according to the invention have, in 3 'a more or less long non-coding sequence (long sequences: SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 5; short sequences: SEQ ID N ° 3 and SEQ ID N ° 7), which plays a crucial role in the regulation of RNA: 1 ⁇ 2 life of TARN, modified compared to the sequences of the prior art.
  • SEQ ID N ° 1 and SEQ ID N ° 3 code for a protein having 65 fewer amino acids, compared to the sequence described in the prior art, the 2 amino acids in the C-terminal position being, in addition, different.
  • This protein corresponds to the melatonin receptor called MEL1 Aa or
  • SEQ ID N ° 5 and SEQ ID N ° 7 code for a protein also having 65 amino acids less, compared to the sequence described in the prior art; in addition, 6 amino acid residues are different, with respect to said sequence of the prior art.
  • This protein corresponds to the melatonin receptor called MEL1 Ab or Mel 1c ( ⁇ ) .
  • Both the sequence coding for the MEL1 Aa or Mel 1c ( ⁇ ) receptor and the sequence coding for the MEL1 Ab or Mel 1c ( ⁇ ) receptor could lead to modifications in RNA regulation, related to the non-coding sequence in 3 '(regulation by an agonist ligand, lifespan of the RNA).
  • MEL1 Aa or Mel 1c ( ⁇ ) receptor inhibits adenylyl cyclase; in fact, the MEL1 Ab or Mel 1c ( ⁇ ) receptor lacks this property to inhibit adenylyl cyclase.
  • allelic isoforms are capable of modulating the intracellular cGMP (dose-dependent modulation) and in particular of inhibiting the accumulation of cGMP induced by a phosphodiesterase inhibitor.
  • the present invention also relates to the fragments of said sequences, useful either for functional expression of the peptide corresponding to the corresponding melatonin receptor, or for the detection of the sequence coding for said receptor.
  • the invention includes, among others: - A sequence consisting of a segment of 230 nucleotide base pairs, corresponding to nucleotides 1057-1286 of SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 5;
  • the present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they hybridize with the nucleotide sequences as defined above.
  • Suitable hybridization conditions are in particular the following: the hybridization is carried out at 42 ° C. in a buffer comprising: 4X SSC, 40% formamide, 0.2% SDS and Denhardt 5X buffer.
  • Such probes have the particular advantage of allowing the characterization of the different variants of the functional melatonin receptor of the MEL1 A type (MEL1 Aa or MEL1 Ab).
  • a subject of the present invention is also proteins and / or protein fragments, characterized in that they are coded by a nucleotide sequence as defined above and in that they exhibit melatonin receptor activity of the type MEL1 functional.
  • said protein is selected from any one of the sequences SEQ LD No. 2 (SEQ ID No. 4 being identical to SEQ ID No. 2) or SEQ ID No. 6 (SEQ LD N ° 8 being identical to SEQ ID N ° 6), as presented in the sequence list included in this Request.
  • SEQ ID N ° 2 and N ° 4 correspond to the melatonin receptor called MEL1 Aa or Mel 1c ( ⁇ ) ;
  • SEQ ID N ° 6 and N ° 8 correspond to the melatonin receptor called MEL1 Ab or Mel 1c ( ⁇ ) .
  • the present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • the term “recombinant vector” means both a plasmid, a cosmid and a phage.
  • said vector consists of a recombinant vector into which is inserted a nucleotide sequence as defined above, which vector is an expression vector of a protein having a functional receptor activity of the melatonin type MEL1 A, according to the invention.
  • said vector consists of a plasmid pcDNA3 (Invitrogen), comprising a promoter RSV and SEQ LD No. 1.
  • Such a plasmid was named X-MEL1a and was deposited under the number I-1583 on June 7, 1995 with the National Collection of Cultures of Microorganisms held by the Institut Pasteur.
  • said vector consists of a plasmid pcDNA3 (Invitrogen), comprising a promoter RSV and SEQ ID No. 5.
  • Such a plasmid was named X-MEL1b and was deposited under the number 1-1584 on June 7, 1995 with the National Collection of Cultures of Microorganisms held by the Institut Pasteur.
  • the present invention also relates to an appropriate host cell, obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector in accordance with the invention.
  • Such a cell is capable of expressing a protein, having a functional melatonin receptor activity, of the MEL1 A type.
  • the host cell is in particular constituted by cells of the L line.
  • the present invention also relates to a process for the expression of a protein in accordance with the invention, characterized in that the host cell, resulting from the transformation by a vector containing a nucleotide sequence that according to the invention coding for a protein having a functional melatonin receptor activity of the MEL1 A type, is cultured so as to produce and transport said expressed protein towards the membrane, so that the transmembrane sequences of said receptor are exposed on the surface of the membrane of the transformed cell host.
  • the present invention also relates to a model for studying melatonin receptors of the MEL1 A type, characterized in that it consists of host cells in accordance with the invention, that is to say expressing a receptor functional melatonin type MEL1 A on the surface of their cell membrane.
  • Such a model allows the study, from a pharmacological point of view, of melatonin receptors, in particular by allowing the identification of specific ligands of MEL1 A type receptors (agonists and antagonists) and thus the development of drugs. active on the regulation of the biological clock, with particularly interesting applications, in particular in the cardiovascular field (lipolysis) and in oncology (phasing of cells).
  • the subject of the invention is also a method for detecting the capacity of a substance to behave as a ligand with respect to a protein according to the invention, which method is characterized in that it comprises:
  • the present invention further relates to a method for studying the affinity of a protein according to the invention for one or more determined ligands, which method is characterized in that it comprises:
  • the culture of the transformed host cell under conditions allowing the expression of the melatonin receptor of the MEL1 A type, coded by the nucleotide sequence, and the transfer of the expressed melatonin receptor to the membrane of said cell so that the transmembrane sequences of the functional melatonin receptor are exposed on the surface of the transformed host cell;
  • a further subject of the invention is a kit for detecting the possible affinity of a ligand for a protein according to the invention, which kit is characterized in that it comprises:
  • a protein (melatonin receptor of the MEL1 A type), encoded by a nucleotide sequence in accordance with the invention, contained in a vector whose promoter is inducible;
  • the melatonin receptors of the MEL1 A type according to the invention are effectively functional receptors and allow the realization of all the aforementioned applications.
  • FIG. 1 shows a diagram of the technique of cloning the cDNA of the melatonin receptor, from Xenopus laevis;
  • FIG. 2 illustrates the different cloning fragments used; the localization of the sense (S) ( ⁇ ) and antisense (AS) ( ⁇ ) primers specific for the cDNA sequence coding for the melatonin receptor, previously identified from Xenopus dermis melanophores; the location of the primers which do not correspond to this sequence ( ⁇ ) are also illustrated in this figure;
  • FIG. 3 illustrates the steps for cloning and sequencing the cDNA fragments of the melatonin receptor
  • FIG. 4 corresponds to a comparison of the sequences coding respectively for the melatonin receptors Mel 1c ( ⁇ ) and Mel 1c ( ⁇ ) : the sequence of the melatonin receptor Mel 1c ( ⁇ ) is illustrated (O) and the substitutions characterizing the melatonin receptor Mel 1c ( ⁇ ) ( ⁇ ) are indicated in FIG. 4A; the long and short 3 'untranslated region DNA sequences are shown in Figure 4B.
  • the Mel 1c ( ⁇ ) receptors are preferentially associated with the short 3 'untranslated region
  • FIG. 5 illustrates the coding part of cDNA sequence coding for the functional melatonin receptor of type MEL1 A (a or b) in comparison with the sequence EBISAWA et al. (reference cited above);
  • FIG. 6 illustrates the characterization of the DNAs coding for the Mel 1c ( ⁇ ) / Mel 1c ( ⁇ ) receptors in different types of Xenopus.
  • the PCR amplification used in this test provides fragment 3 of FIG. 2.
  • the restriction enzymes used for the digestion of the PCR amplification products obtained are: Afl II (1 site at a time in the sequence Mel 1c ( ⁇ ) and the sequence Mel 1c ( ⁇ ) ), Bsp120 I (1 site in the sequence Mel 1c ( ⁇ ) , no site in the sequence Mel 1c ( ⁇ ) ), Pm1I (1 site in the sequence Mel 1c ( ⁇ ) , no site in the Mel 1c ( ⁇ ) sequence).
  • the restriction analysis is carried out using PCR products derived from the following genomic DNAs: 1, X. tropicalis; 2, X. ruwenzoriensis; 3, individual X. homozygous laevis (ff); 4, Mel 1c ( ⁇ ) cDNA clone; 5, cDNA of Mel 1c ( ⁇ ) clone; 6, X. laevis cDNA amplified from a pool of skin mRNAs; 7, individual X. heterozygous laevis (rf); ND, undigested PCR product.
  • FIG. 7 illustrates the pharmacological specificity of the 2- ( 125 I) -iodomelatonin / melatonin receptor bond, in the presence of stable L cells expressing a receptor according to the invention (Mel 1c ( ⁇ ) or Mel 1c ( ⁇ ) );
  • FIG. 7A shows the saturation isotherm of the 2- ( 125 I) iodomelatonin bond; non-specific binding is measured in the presence of 10 ⁇ M melatonin; this FIG. 7A includes the Scatchard representation of the data in an overlay.
  • 7B represents the study of the competitive bonds of 2- ( 125 I) -iodomelatonin (400 ⁇ M) to the receptor, carried out on L cell membranes, expressing either the Mel 1c receptor ( ⁇ ) or the Mel 1c receptor ( ⁇ ) , in the presence of I-melatonin ( ⁇ ), melatonin (D), N-acetyl-5-hydroxy ⁇ tryptamine (NAS) (O), S22153 ( ⁇ ) and S20098 (B).
  • FIG. 8 illustrates the modulation of the accumulation of cAMP, stimulated by forskolin, by the receptors Mel 1c ( ⁇ ) and Mel 1c ( ⁇ ) .
  • Stable clones of L cells transfected with cDNA encoding either the Mel 1c receptor ( ⁇ ) ( ⁇ ) or the Mel 1c receptor ( ⁇ ) (O) are stimulated by forskolin (FK) (10 ⁇ M) in the presence of the indicated concentrations of melatonin (on the abscissa); on the ordinate, this figure includes the rate of intracellular cAMP in%.
  • the value 100% ( ⁇ ) corresponds to the average value of cAMP in the presence of forskolin 10 ⁇ M; ( ⁇ ) indicates the cAMP value, in the presence of melatonin (10 ⁇ M) alone (* P ⁇ 0.05).
  • FIG. 9 illustrates the modulation of the accumulation of cAMP stimulated by isoproterenol, by melatonin receptors, in transient transfection trials.
  • the Mel 1c receptor ( ⁇ ) or the Mel 1c receptor ( ⁇ ) is co-expressed with the ⁇ 2 adrenergic receptor ( ⁇ 2-RA), in equal amounts in L cells and stimulated with isoproterenol (ISO, 10 ⁇ M) , in the presence or absence of melatonin (Mel, 10 ⁇ M): cAMP levels are measured; NT means non-transfected.
  • the number of specific binding sites to ICYP and to 2-I-iodomelatonin [represented as follows: (specific ICYP binding sites / specific binding sites iodomelatonin) and expressed in fmol / mg of protein], in these transfected cells are respectively: NT (24/0); Mel 1c ( ⁇ ) (5/77); Mel 1c ( ⁇ ) (13/148); ⁇ 2-RA (622/0); ⁇ 2-RA / Mel 1c ( ⁇ ) (386/54), ⁇ 2-RA / Mel 1c ( ⁇ ) (416/151) (* P ⁇ 0.05).
  • - Figure 10 illustrates the modulation of the accumulation of cGMP by melatonin receptors. In FIG.
  • L cells transiently transfected with a cDNA coding either for the Mel 1c receptor ( ⁇ ) ( ⁇ , O) or for the Mel 1c receptor ( ⁇ ) ( ⁇ , ⁇ ), are incubated with the concentrations indicated on the abscissa of melatonin, in the presence (O, ⁇ ) or in the absence ( ⁇ , ⁇ ) of 1 mM of TMBX.
  • a cDNA coding either for the Mel 1c receptor ( ⁇ ) ( ⁇ , O) or for the Mel 1c receptor ( ⁇ ) ( ⁇ , ⁇ )
  • the L cells transiently transfected with a cDNA coding either for the Mel 1c receptor ( ⁇ ) or the Mel 1c receptor ( ⁇ ) are preincubated either in a buffer or with Pertussis toxin (PTX, 100 ng / ml) for 18 hours, then incubated in the presence of 1 mM IBMX and in the absence or in the presence of 10 ⁇ M of melatonin.
  • the intracellular cGMP levels are determined.
  • EXAMPLE 1 Isolation and identification of the 4 functional sequences of the melatonin receptor of the MELl A type.
  • RNA of the skin of Xenopus laevis is previously treated with 0.3 U of DNAse I without RNAse (RQ1 DNase, Promega) for 20 min at 37 ° C per mg of nucleic acid.
  • the synthesis of the cDNA is carried out by incubation of 200 ng of RNA (heated at 65 ° C. for 5 min before the reaction) with 100 units of MMLV reverse transcriptase "Stratacript RNAse H-" of Stratagene for 30 min at 37 °. vs.
  • cDNA is amplified by PCR with different pairs of oligonucleotides specific for the Xenopus laevis melatonin receptor, Pwo DNA polymerase (Boehringer Mannheim) with its own buffer, in the presence of 2 mM MgSO4, in a volume of 50 ⁇ l.
  • the cDNA is denatured for 2 min at 94 ° C., amplified 40 times; an extension of 3 min at 72 ° C. is then carried out.
  • One cycle corresponds to 15 sec. at 94 ° C; 30 sec. at the specific temperature of the oligonucleotide pair and 90 sec.
  • More than 80% of the desired cDNA was amplified using 3 different pairs of primers which include overlapping sequences (fragments 1-3), which correspond to the region coding for the fragment up to Ala 349.
  • This remaining part of the melatonin receptor cDNA was amplified using a modified PCR reaction, using the polyadenylation site, at the 3 'end of the cDNA as a primer (principle described in Figure 3).
  • Two amplification fragments (estimated at 400 bp (short fragment) and 600 bp (long fragment), respectively) were obtained using this approach.
  • the short 400 bp fragment contains 250 non-coding bp (3 'short) and 150 bp coding; the 600 bp fragment contains 450 bp non-coding (3 'long) and 150 bp coding.
  • the amplification products were cloned separately into a vector and characterized by enzymatic digestion and by sequencing by the dideoxy method (4-6 clones / fragment).
  • Fragment 1 corresponds to the sequence 28-241: 3 clones have been sequenced, which are identical with the published sequence (EBISAWA et al.).
  • Both the short and long forms of the 4 fragments have a strong homology with the published sequence of the melatonin receptor up to methionine at position 353.
  • fragment 4 With regard to fragment 4 short (see SEQ TD No. 5 and No. 7) (fragment C), beyond methionine 353, two different amino acids have been detected, i.e. tyrosine at instead of leucine (position 354) and valine in place of glycine (position 355), followed by a stop codon, causing the loss of 65 amino acids, if compared with the published sequence of the melatonin receptor of Xenopus laevis ( Figure 4 A).
  • fragment 4 long fragment L
  • fragment L see SEQ ID N ° 1 and N ° 3
  • 4 clones have been sequenced, one of them corresponds to the sequence published up to methionine 353, 3 of them show the same change as that observed in the short fragment, up to methionine 353.
  • amino acids 354 and 355 are modified compared to the published sequence and have a stop codon at position 356, as seen in the short fragment.
  • the 3 'non-coding region of the long fragment is identical to that of the short segment, up to the polyadenylation tail; it also comprises 160 bp, followed by its own polyadenylation tail (see list of sequences, SEQ ID N ° 1 and N ° 3) (see Figure 2).
  • the cDNA coding for the complete melatonin receptor can be amplified from the DNA of xenopus skin, by PCR, using the primers 3 S and 12 AS, located in the 3 'non-coding region ( see figure 2).
  • the 2 mRNAs code for proteins of 354 amino acids which are very similar to the Mel lc chicken receptor (78% homology).
  • Fragment C (short fragment) was therefore also called Mel 1c ( ⁇ ) and fragment L (long fragment) (comprising many substitutions) was called Mel 1c ( ⁇ ).
  • EXAMPLE 2 Construction of a vector for the expression of the functional melatonin receptor of the MELl A type.
  • the Xenopus laevis melatonin receptor was cloned according to the RT-PCR method (see Figure 1).
  • RNA is isolated from the skin of Xenopus and transcribed into cDNA using reverse transcriptase.
  • the amplified receptor is cloned into the expression vector pcDNA3-RSV derived from the plasmid pcDNA3 (Invitrogen) and its identity has been verified by sequencing, as follows:
  • the highly homologous Mel 1c ( ⁇ ) (or Mell Aa) and Mel 1c ( ⁇ ) (or Mell Ab) receptors can represent either 2 different alleles at the same genomic locus, or 2 isoforms encoded by different genes.
  • fragment 3 coding for the Mel 1c receptors were amplified by PCR, from genomic DNA of 43 Xenopus laevis.
  • the vector pcDNA3-RSV containing the coding region and the non-coding region 3 'of the melatonin receptor of Xenopus laevis according to Example 2, is transfected into the L cells of mice.
  • a coprecipitation of DNA and CaPO 4 is prepared as follows: in a final volume of 500 ⁇ l, 30 ⁇ g of carrier DNA (pGEM3Z from Promega), 2 ⁇ g of the vector pcDNA3-RSV containing the region are mixed coding and the 3 'non-coding region of the melatonin receptor of Xenopus laevis and CaCl 2 (250 mM final) (Solution A).
  • the cells are washed twice with DMEM and left in 6 ml of DMEM / FCS, supplemented with 5 mM of nabutyrate at 37 ° C overnight. The following day, the medium is removed, the cells are again washed with DMEM / FCS then incubated overnight in DMEM / FCS.
  • the cells are distributed in 96-well plates at different dilutions (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32) in DMEM medium supplemented with: 10% FBS ( v / v), 4.5 g / l glucose, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 1 mM glutamine and 400 ⁇ g / ml G418 (geneticin from Gibco Life Technologies).
  • the L cells are spread either on plates comprising 6 wells (for cAMP tests, 0.5 ⁇ 10 6 cells / well), or in dishes 10 cm in diameter (cGMP tests, 2.10 6 cells / dish) and transfected by the DEAE-dextran method (LOPOTA et al., NAR, 1984, 12, 5707-5717), the following day. After washing with PB S, DMEM without serum, containing Hepes 50 mM, DEAE-dextran at 200 ⁇ g / ml and 1 ⁇ g / ml of plasmid DNA plasmid pcDNA3-RSV), is added.
  • the medium is replaced with 10% DMSO in DMEM without serum for 1.5 min.
  • the cells are washed with PB S and incubated in a DMEM medium containing 10% fetal calf serum. The tests are carried out three days after the transfection.
  • the monolayers of sub-confluent cells are washed with
  • the cell suspensions are incubated with 400 ⁇ M of 2- ( 125 I) -iodomelatonin (for binding tests on melatonin receptors) or 200 ⁇ M ( 125 I) -CYP (for tests of binding to ⁇ 2 adrenergic receptors) in the absence or presence of 10 ⁇ M of cold ligands (melatonin or D / L-propranolol, respectively).
  • Protein concentrations are measured on cell homogenates by the Bradford method (Analytical Biochem., 1976, 72, 248-254), using the Bio-Rad protein assay system. Bovine serum albumin is used as standard. * Results
  • the dissociation constants Ko of the radiolabelled agonist 2- ( 125 I) - iodomelatonin are 160 ⁇ 32 and 143 ⁇ 25 pM respectively (FIG. 7A), values which are in agreement with those determined for other melatonin receptors of high affinity, including those previously cloned, from melanophores of X. laevis.
  • Competitive experiments have shown that the affinity for different ligands is characteristic of the melatonin receptors (FIG. 7B and Table I).
  • the cells grown in plates containing 6 wells are washed twice with DMEM without serum, preincubated for 15 min at 37 ° C., then incubated for 15 min at 37 ° C. in DMEM medium containing 1 mM of TBMX ( 3-isobutyl-1-methylxanthine) with or without isoproterenol (10 ⁇ M) (tests on transient transfected cells), or 10 ⁇ M of forskolin (tests on stable cell clones) and increasing amounts of melatonin.
  • TBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • isoproterenol 10 ⁇ M
  • tests on transient transfected cells tests on transient transfected cells
  • 10 ⁇ M of forskolin tests on stable cell clones
  • the cell lysates are centrifuged in a microcentrifuge at 17,000 xg for 5 min.
  • the supernatants are tested for their content in cyclic AMP using the 3 H cyclic AMP system (Amersham).
  • the tests for measuring cyclic AMP can be carried out in plates containing 24 wells (0.5 ⁇ 10 6 cells in 300 ⁇ l). The cells are then incubated for 15 min and the reaction is stopped by the addition of 100 ⁇ l of 20% trichloroacetic acid and the supernatants are tested for their content in cyclic AMP.
  • the IC 50 value of this effect is approximately 6.10 -10 M, which is in agreement with the values obtained previously with melatonin receptors having a high affinity.
  • baseline levels of cAMP are not affected by melatonin in any of the cell lines studied, even in the presence of LMBX.
  • the inhibition of the accumulation of cAMP by melatonin receptors is coupled to the proteins G i ., Via their ⁇ subunits.
  • the L control cells and clones expressing either the Mel 1c ( ⁇ ) or Mel receptors 1c ( ⁇ ) are compared as regards their content in G i ⁇ subunits, in accordance with the following protocol:
  • the cells are dissolved in Laemmli buffer containing 2% SDS and 40 mM dithiothreitol and sonicated at 4 ° C. After centrifugation in a microcentrifuge at 17,000 xg, 50 ⁇ l of supernatant is separated into its components in a 12% SDS / polyacrylamide gel. The analysis of the immunoblots is carried out as described in SELZER E. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 1609-1613), with 84 antisera which correspond to the 3 subtypes of G i ⁇ .
  • L cells are co-transfected with the cDNA of the human ⁇ 2 adrenergic receptor and with either the cDNA of the Mel 1c ( ⁇ ) receptor or of the Mel 1c ( ⁇ ) receptor; the co-expression of these different receptors makes it possible to selectively study the subpopulation of cells which has effectively internalized exogenous DNA.
  • No binding site, for any of the receptors, can be measured in wild-type control cells.
  • incubation with isoproterenol results in a 5-fold increase in cAMP.
  • in cells co-transfected with identical amounts (1 ⁇ g of plasmid DNA) of cDNA encoding the Mel 1c ( ⁇ ) and adrenergic ⁇ 2 receptors the simultaneous incubation with isoproterenol and melatonin results in a decrease significant of the accumulation of cAMP (65 ⁇ 5% of the control, p ⁇ 0.05) ( Figure 9).
  • the Mel 1c ( ⁇ ) receptors are not capable of inhibiting the accumulation of cAMP induced by isoproterenol, despite the expression of an equivalent number of receptor binding sites. Similar results are obtained when the cDNA coding for the Mel 1c receptor ( ⁇ ) is in excess of a factor of 10 compared to the cDNA coding for the adrenergic receptor ⁇ 2.
  • Mel 1c ( ⁇ ) receptors inhibit the accumulation of forskolin-stimulated cAMP in a dose-dependent manner with an IC 50 value of approximately 6.10 -10 M, a value consistent with that reported for melatonin receptors previously described.
  • the inhibition of the adenylyl cyclase function is mainly coupled to the activated G i proteins.
  • the transiently transfected cells grown in dishes having a diameter of 10 cm, are incubated at 37 ° C for 15 min in DMEM medium without serum, in the presence or in the absence of 1 mM of LMBX and of quantities increasing melatonin.
  • the medium is then replaced with 1 ml of ice-cold 65% ethanol and the cell extracts are centrifuged at 2000 x g for 15 min at 4 ° C.
  • the supernatants are dried; the pellets are resuspended in 250 ⁇ l of an acetylated buffer.
  • the cyclic GMP is dosed in accordance with the EIA kit (Amersham). Additional pathways such as modulation of cGMP content have been proposed for the melatonin receptor (VANECEK J. et al., Brain Res., 1989, 505, 157-159).
  • the L cells expressing either the Mel 1c ( ⁇ ) receptors or the Meli c ( ⁇ ) receptors are incubated with melatonin and the effects on intracellular cGMP are analyzed.
  • Melatonin up to 10 ⁇ M has no effect on baseline cGMP levels in any of the cell lines.
  • the intracellular cGMP content depends on the opposite activity of guanylyl cyclases, which synthesize cGMP and phosphodiesterases (PDE), which degrade cGMP.
  • PDE phosphodiesterases
  • the PDE inhibitor IBMX when added to the medium, blocks the degradation of cGMP by PDE. Under these conditions, the level of cGMP increases by a factor of 3, indicating the presence of basal PDE activity in the unstimulated L cells.
  • the stimulation by melatonin of the control cells does not affect the increase in production of cGMP by TBMX.
  • Pertussis toxin which catalyzes the inactivating ribosylation of ADP of the ⁇ G i / o subunits of G proteins, blocks the inhibition of the accumulation of cAMP linked to the protein G i and stimulated by the receptors to the melatonin. Preincubating cells with Pertussis toxin completely abolishes the effect of melatonin on cGMP accumulation, suggesting that this pathway is also dependent on the G i / o protein.
  • the 2 melatonin receptor cDNAs Mel 1c ( ⁇ ) and Mel 1c ( ⁇ ) are found either in long form or in short form. Most of the Mel 1c receptor ( ⁇ ) cDNA is in the short form (3: 1, short: long), while the Mel 1c receptor cDNA ( ⁇ ) is more abundant in the long form (1 : 3).
  • the 3 'untranslated regions of several receptors of the same family, such as the ⁇ 2 adrenergic receptor or the muscarinic receptor contain molecular determinants involved in the regulation of mRNA stability. This suggests that the short and long mRNAs encoding the Mel 1c ( ⁇ ) and Mel 1c ( ⁇ ) receptors are subject to different regulations.
  • cGMP As a second messenger in the biological pathway of the melatonin receptor is still controversial. Pigmentary aggregation in Xenopus melanocytes is regulated by melatonin and by cAMP whereas contradictory results exist regarding its regulation by cGMP. The role of cGMP in stimulating biological signals linked to melatonin in other cellular systems has not been studied. A second argument in favor of the modulation of cGMP by melatonin receptors emerges from the tests carried out on neonatal rat pituitary tissue in which a melatonin inhibitory effect on cGMP production is observed.

Abstract

Séquences nucléiques codant pour des récepteurs de la mélatonine de xénope de type MEL1 A, également dénommés Mel1c, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, leurs applications en tant que sonde et pour l'expression de protéines et/ou de fragments de celles-ci ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, vecteurs utiles pour ladite expression, hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs ainsi que modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine. Procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des protéines ayant une action de récepteur de la mélatonine et trousses ou kits pour la détection du degré d'affinité de différentes substances pour lesdites protéines à activité de récepteur de la mélatonine. Lesdites séquences nucléiques codant pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine de type MEL1 A, sont sélectionnées parmi les séquences suivantes: SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5 ou SEQ ID N° 7.

Description

SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR DES RECEPTEURS DE LA MELATONINE ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention est relative à des séquences nucléiques codant pour des récepteurs de la mélatonine de xénope de type MEL1 A, également dénommes ci-après Mel1c, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, à leurs applications en tant que sonde et pour l'expression de protéines et/ou de fragments de celles-ci ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, aux vecteurs utiles pour ladite expression, aux hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs ainsi qu'à un modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des protéines ayant une action de récepteur de la mélatonine et à des trousses ou kits pour la détection du degré d'affinité de différentes substances pour lesdites protéines à activité de récepteur de la mélatonine.
Un récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis a été décrit
(EBISAWA T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6133-6137). Il s'agit d'une protéine de 420 aminoacides.
Toutefois, des amorces localisées dans la partie 3' des séquences nucléiques correspondantes n'ont pas permis d'amplifier la séquence codant pour cette protéine.
C'est pourquoi 1a Demanderesse s'est donné pour but de rechercher des séquences nucléiques aptes à coder le récepteur de la mélatonine de type MEL1 A, lesquelles séquences étant aisément amplifiables dans leur intégralité.
La présente invention a pour objet des séquences nucléiques codant pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine, de type MEL1 A et de structure différente de celle du récepteur décrit dans EBISAWA et al. et présentant des propriétés de couplage et de régulation différentes de celles du récepteur antérieurement décrit, lesquelles séquences sont sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°3, SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°7, telles que présentées dans la liste des séquences incluse dans la présente Demande.
Ces séquences selon l'invention présentent, en 3' une séquence non codante plus ou moins longue (séquences longues : SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 5 ; séquences courtes : SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 7), qui intervient de manière cruciale sur la régulation de l'ARN : ½ vie de TARN, modifiée par rapport aux séquences de l'Art antérieur.
En particulier, les SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 3 codent pour une protéine présentant 65 aminoacides en moins, par rapport à la séquence décrite dans l'Art antérieur, les 2 aminoacides en position C-terminale étant, en outre, différents.
Cette protéine correspond au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Aa ou
Mel1c(α).
Les SEQ ID N° 5 et SEQ ID N° 7 codent pour une protéine présen- tant également 65 aminoacides en moins, par rapport à la séquence décrite dans l'Art antérieur ; en outre, 6 résidus d'aminoacides sont différents, par rapport à ladite séquence de l'Art antérieur. Cette protéine correspond au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Ab ou Mel1c(β).
Aussi bien la séquence codant pour le récepteur MEL1 Aa ou Mel1c(α) que la séquence codant pour le récepteur MEL1 Ab ou Mel1c(β) pourraient entraîner des modifications dans la régulation de l'ARN, en rapport avec la séquence non codante en 3' (régulation par un ligand agoniste, durée de vie de l'ARN).
De manière inattendue, seul le récepteur MEL1 Aa ou Mel1c(α) inhibe l'adénylyl cyclase ; en effet, le récepteur MEL1 Ab ou Mel1c(β) est dépourvu de cette propriété à inhiber l'adénylyl cyclase.
En outre, d'autres signaux biologiques sont associés à ces protéines ; en particulier, ces deux isoformes allèliques sont capables de moduler le GMPc intracellulaire (modulation dose-dépendante) et notamment d'inhiber l'accumulation de GMPc induite par un inhibiteur de phosphodiestérase.
La présente invention a également pour objet les fragments desdites séquences, utiles soit pour une expression fonctionnelle du peptide correspondant au récepteur de la mélatonine correspondant, soit à la détection de la séquence codant pour ledit récepteur.
Parmi lesdits fragments, l'invention englobe, entre autres : - une séquence constituée d'un segment de 230 paires de bases nucléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1286 des SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°5 ;
- une séquence constituée d'un segment de 69 paires de bases nucléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1125 des SEQ LD N° 3 ou SEQ ID
N°7.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus.
Des conditions d'hybridation convenables sont notamment les suivantes : l'hybridation est réalisée à 42°C dans un tampon comprenant : 4X SSC, 40 % de formamide, 0,2 % de SDS et tampon Denhardt 5X.
De telles sondes ont notamment l'avantage de permettre la caractérisation des différents variants du récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A (MEL1 Aa ou MEL1 Ab).
La présente invention a également pour objet les protéines et/ou fragments de protéine, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus et en ce qu'ils présentent une activité de récepteur de la mélatonine de type MEL1 fonctionnel.
Conformément à l'invention, ladite protéine est sélectionnée parmi l'une quelconque des séquences SEQ LD N°2 (la SEQ ID N°4 étant identique à la SEQ ID N°2) ou SEQ ID N°6 (la SEQ LD N°8 étant identique à la SEQ ID N°6), telles que présentées dans la liste de séquences incluse dans la présente Demande.
Les SEQ ID N° 2 et N° 4 correspondent au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Aa ou Mel1c(α) ; les SEQ ID N° 6 et N° 8 correspondent au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Ab ou Mel1c(β).
Ces deux protéines, dont la structure est différente de celle de la protéine de l'Art antérieur, présentent, de manière inattendue, des réactions et des signaux biologiques différents de ceux anterieurement décrits, notamment en ce qui concerne le couplage aux protéines G (signalisation). La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
On entend au sens de la présente invention, par vecteur recombinant aussi bien un plasmide, un cosmide qu'un phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant dans lequel est insérée une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'une protéine ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, conforme à l'invention.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un plasmide pcDNA3 (Invitrogen), comprenant un promoteur RSV et la SEQ LD N° 1.
Un tel plasmide a été dénommé X-MEL1a et a été déposé sous le n° I-1583 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un plasmide pcDNA3 (Invitrogen), comprenant un promoteur RSV et la SEQ ID N° 5.
Un tel plasmide a été dénommé X-MEL1b et a été déposé sous le n° 1-1584 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention.
Une telle cellule est capable d'exprimer une protéine, ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine, de type MEL1 A.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment constituée par les cellules de la lignée L.
La présente invention a également pour objet un processus d'expression d'une protéine conforme à l'invention, caractérisé en ce que la cellule hôte, résultant de la transformation par un vecteur contenant une séquence nucléotidi- que selon l'invention codant pour une protéine ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, est cultivée de manière à produire et à transporter ladite protéine exprimée vers la membrane, de telle sorte que les séquences transmembranaires dudit récepteur soient exposées à la surface de la membrane de l'hôte cellulaire transformé.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cellules hôtes conformes à l'invention, c'est-à-dire exprimant un récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A à la surface de leur membrane cellulaire.
Un tel modèle permet l'étude, d'un point de vue pharmacologique, des récepteurs de la mélatonine, notamment en permettant l'identification des ligands spécifiques des récepteurs de type MEL1 A (agonistes et antagonistes) et ainsi la mise au point de médicaments actifs sur la régulation de l'horloge biologique, avec des applications particulièrement intéressantes, notamment dans le domaine cardiovasculaire (lipolyse) et en cancérologie (mise en phase des cellules).
L'invention a également pour objet un procédé de détection de la capacité d'une substance à se comporter comme ligand vis-à-vis d'une protéine conforme à l'invention, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention, laquelle cellule hôte exprime ladite protéine (récepteur de la mélatonine), et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe de type ligand-protéine.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé pour l'étude de l'affinité d'une protéine conforme à l'invention pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un vecteur conforme à l'invention ;
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur de la mélatonine de type MEL1 A, codé par la séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur de la mélatonine exprimé vers la membrane de ladite cellule de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur fonctionnel de la mélatonine soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée ;
- la mise en contact de ladite cellule avec les ligands déterminés et
- la détection d'une réaction affine entre ladite cellule transformée et lesdits ligands déterminés.
L'invention a, en outre, pour objet un kit pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine conforme à l'invention, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un vecteur d'expression conforme à l'invention ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'une protéine (récepteur de la mélatonine de type MEL1 A), codée par une séquence nucléotidique conforme à l'invention, contenue dans un vecteur dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ladite protéine ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique de la protéine exprimée.
De manière inattendue, les récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A selon l'invention sont effectivement des récepteurs fonctionnels et permettent la réalisation de toutes les applications précitées.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente un schéma de la technique de clonage de l'ADNc du récepteur de la mélatonine, à partir de Xenopus laevis ;
- la figure 2 illustre les différents fragments de clonage utilisés ; la localisation des amorces sens (S) (→) et anti-sens (AS) (←) spécifiques de la séquence d'ADNc codant pour le récepteur de la mélatonine, antérieurement identifiée à partir de mélanophores de derme de Xenopus ; la localisation des amorces qui ne correspondent pas à cette séquence (⇐) sont également illustrées à cette figure ;
- la figure 3 illustre les étapes de clonage et de séquençage des fragments d' ADNc du récepteur de la mélatonine ;
- la figure 4 correspond à une comparaison des séquences codant respectivement pour les récepteurs de la mélatonine Mel1c(α) et Mel1c(β) : la séquence du récepteur de la mélatonine Mel1c(α) est illustrée (O) et les substitutions caractérisant le récepteur de la mélatonine Mel1c(β) (●) sont indiquées à la figure 4A ; les séquences d'ADN de la région 3' non traduite longue et courte sont illustrées à la figure 4B. Les récepteurs Mel1c(α) sont préférentiellement associés à la région 3' non traduite courte
(3 :1, court :long), alors que les récepteurs Mel1c(β) sont préférentiellement associés à la région 3' non traduite longue (1 :3). A la figure 4B, les sites de clonage EcoRI sont soulignés.
- la figure 5 illustre la partie codante de séquence d'ADNc codant pour le récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A (a ou b) en comparaison avec la séquence EBISAWA et al. (référence précitée) ;
- la figure 6 illustre la caractérisation des ADNs codant pour les récepteurs Mel1c(α)/ Mel1c(β) chez différents types de Xenopus. L'amplification PCR utilisée dans ce test fournit le fragment 3 de la figure 2. Les enzymes de restriction uti- lisées pour la digestion des produits d'amplification PCR obtenus sont : Afl II (1 site à la fois dans la séquence Mel1c(α) et la séquence Mel1c(β)), Bsp120 I (1 site dans la séquence Mel1c(α), pas de site dans la séquence Mel1c(β)), Pm1I (1 site dans la séquence Mel1c(β), pas de site dans la séquence Mel1c(α)). L'analyse de restriction est effectuée à partir des produits PCR issus des ADN génomiques suivants : 1, X. tropicalis ; 2, X. ruwenzoriensis ; 3, individu X. laevis homozygote (ff) ; 4, ADNc de Mel1c(α) clone ; 5, ADNc de Mel1c(β) clone ; 6, ADNc de X. laevis amplifié à partir d'un pool d'ARNm de peau ; 7, individu X. laevis hétérozygote (rf) ; ND, produit de PCR non digéré. - la figure 7 illustre la spécificité pharmacologique de la liaison 2-(125I)-iodomélatonine/récepteurs à la mélatonine, en présence de cellules L stables exprimant un récepteur selon l'invention (Mel1c(α) ou Mel1c(β)) ; la figure 7A montre l'isotherme de saturation de la liaison 2-(125I)iodomélatonine ; la liaison non-spécifique est mesurée en présence de mélatonine 10 μM ; cette figure 7 A comprend en incrustation la représentation Scatchard des données. La figure 7B représente l'étude des liaisons par compétition de la 2-(125I)-iodomélatonine (400pM) au récepteur, effectuées sur des membranes de cellules L, exprimant soit le récepteur Mel1c(α), soit le récepteur Mel1c(β), en présence d'I-mélatonine (Δ), de mélatonine (D), de N-acétyl-5-hydroxy¬tryptamine (NAS) (O), de S22153(▲) et de S20098 (B).
- la figure 8 illustre la modulation de l'accumulation d'AMPc, stimulée par la forskoline, par les récepteurs Mel1c(α) et Mel1c(β). Les clones stables de cellules L transfectées avec de l'ADNc codant soit pour le récepteur Mel1c(α) (●), soit pour le récepteur Mel1c(β) (O) sont stimulés par la forskoline (FK) (10 μM) en présence des concentrations indiquées de mélatonine (en abscisse) ; en ordonnée, cette figure comprend le taux d'AMPc intracellulaire en %. La valeur 100 % (□) correspond à la valeur moyenne d'AMPc en présence de forskoline 10 μM ; (■) indique la valeur d'AMPc, en présence de mélatonine (10 μM) seule (*P<0,05).
- la figure 9 illustre la modulation de l'accumulation d'AMPc stimulée par l'isoprotérénol, par les récepteurs de la mélatonine, dans des essais de transfection transitoire. Le récepteur Mel1c(α) ou le récepteur Mel1c(β) est co-exprimé avec le récepteur β2 adrénergique (β2-RA), en quantités égales dans des cellules L et stimulé avec de l'isoprotérénol (ISO, 10 μM), en présence ou en l'absence de mélatonine (Mel, 10 μM) : les taux d'AMPc sont mesurés ; NT signifie nontransfecté. Le nombre de sites de liaison spécifiques au ICYP et à la 2- I-iodomélatonine [représentés comme suit : (sites de liaison spécifiques ICYP/sites de liaison spécifiques iodomélatonine) et exprimés en fmol/mg de protéine], dans ces cellules transfectées sont respectivement : NT (24/0) ; Mel1c(α) (5/77) ; Mel1c(β) (13/148) ; β2-RA (622/0) ; β2-RA/Mel1c(α) (386/54), β2-RA/Mel1c(β) (416/151) (*P<0,05). - la figure 10 illustre la modulation de l'accumulation du GMPc par les récepteurs de la mélatonine. A la figure 10 A, des cellules L transfectées de façon transitoire avec un ADNc codant soit pour le récepteur Mel1c(α) (□, O), soit pour le récepteur Mel1c(β) (■,●), sont incubées avec les concentrations indiquées en abscisse de mélatonine, en présence (O,●) ou en l'absence (□,■) de 1 mM d'TMBX. A la figure 10B, les cellules L transfectées de façon transitoire avec un ADNc codant soit pour le récepteur Mel1c(α), soit le récepteur Mel1c(β), sont préincubées soit dans un tampon, soit avec de la toxine de Pertussis (PTX, 100 ng/ml) pendant 18 heures, puis incubées en présence de 1 mM d'IBMX et en l'absence ou en présence de 10 μM de mélatonine. Les taux de GMPc intracellulaires (en ordonnée) sont déterminés.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Isolement et identification des 4 séquences fonctionnelles du récepteur de la mélatonine de type MELl A.
a) Amplification de la partie codante du récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis.
L'ARN total de la peau de Xenopus laevis est préalablement traité avec 0,3 U d'une DNAse I sans RNAse (RQ1 DNase, Promega) pendant 20 min à 37°C par mg d'acide nucléique. La synthèse de l'ADNc est réalisée par incubation de 200 ng d'ARN (chauffé à 65°C pendant 5 min avant la réaction) avec 100 unités de MMLV inverse transcriptase "Stratacript RNAse H-" de Stratagène pendant 30 min à 37°C.
Après inactivation à 95°C (5 min), PADNc est amplifié par PCR avec différents couples d'oligonucléotides spécifiques du récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis, de l'ADN polymérase Pwo (Boehringer Mannheim) avec son propre tampon, en présence de 2 mM de MgSO4, dans un volume de 50 μl. L'ADNc est dénaturé 2 min à 94°C, amplifié 40 fois ; une élongation de 3 min à 72°C est ensuite réalisée. Un cycle correspond à 15 sec. à 94°C ; 30 sec. à la température spécifique du couple d'oligonucléotide et 90 sec. à 72°C (GeneAmp PCR System 9600 de Perkin- Elmer Cefus). Les couples d'oligonucléotides mis en oeuvre pour amplifier différents fragments de l'ADNc codant pour le récepteur de la mélatonine de X. laevis (figure 2) sont les suivants :
Plusieurs amorces ont été testées pour leur capacité à amplifier l'ADNc du récepteur de la mélatonine (figure 2).
Plus de 80 % de l'ADNc désiré a été amplifié en utilisant 3 paires différentes d'amorces qui comprennent des séquences chevauchantes (fragments 1-3), qui correspondent à la région codant pour le fragment allant jusqu'à Ala 349.
Tous les efforts pour amplifier la dernière portion de région codante en 3' et la région 3' non codante n'ont pas abouti.
Cette partie restante de l'ADNc du récepteur de la mélatonine a été amplifiée à l'aide d'une réaction PCR modifiée, en utilisant le site de polyadénylation, à l'extrémité 3' de l'ADNc en tant qu'amorce (principe décrit à la figure 3). Deux fragments d'amplification (estimés à 400 pb (fragment court) et 600 pb (fragment long), respectivement) ont été obtenus en utilisant cette approche. Le fragment court de 400 pb contient 250 bp non-codantes (3' court) et 150 pb codantes ; le fragment de 600 pb contient 450 pb non-codantes (3' long) et 150 bp codantes.
La digestion de ces fragments avec deux enzymes de restriction montrent le profil de restriction attendu.
Les produits d'amplification ont été clones séparément dans un vecteur et caractérisés par digestion enzymatique et par séquençage par la méthode aux didésoxy (4-6 clones/fragment).
Le fragment 1 correspond à la séquence 28-241 : 3 clones ont été séquences, qui sont identiques avec la séquence publiée (EBISAWA et al.).
Parmi les clones des fragments 2 et 3, certains sont identiques à la séquence publiée tandis que d'autres montrent des différences au niveau de la séquence nucléique.
Dans un variant du fragment 2, on observe deux substitutions nucléotidiques silencieuses (pas de modification de la séquence en aminoacides), tandis que les variants du fragment 3 contiennent 26 substitutions nucléotidiques silencieuses et 6 substitutions entraînant une modification de la séquence en aminoacides correspondante (voir figures 4 et 5).
A la fois les formes courtes et longues des fragments 4 présentent une forte homologie avec la séquence publiée du récepteur de la mélatonine jusqu'à la méthionine en position 353.
Pour ce qui concerne le fragment 4 court (voir SEQ TD N° 5 et N° 7) (fragment C), au-delà de la méthionine 353, deux aminoacides différents ont été détectés, c'est-à-dire tyrosine à la place de leucine (position 354) et valine à la place de glycine (position 355), suivis par un codon stop, entraînant la perte de 65 aminoacides, si l'on compare avec la séquence publiée du récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis (figure 4 A).
L'alignement en aminoacides dudit récepteur, à partir de Xenopus, de l'Homme et du mouton, montre que la séquence publiée du récepteur de la mélatonine à partir de Xenopus présente une queue C-terminale beaucoup plus longue que le récepteur des deux autres espèces (REPPERT et al., 1994). Contrairement à la séquence publiée, le récepteur de la mélatonine selon l'invention obtenue à partir de Xenopus laevis présente la même taille que le récepteur de la mélatonine obtenu à partir de l'Homme ou du mouton.
Pour ce qui concerne le fragment 4 long (fragment L) (voir SEQ ID N° 1 et N° 3) : 4 clones ont été séquences, l'un d'eux correspond à la séquence publiée jusqu'à la méthionine 353, 3 d'entre eux montrent le même changement que celui observé dans le fragment court, jusqu'à la méthionine 353. Dans tous les clones, les aminoacides 354 et 355 sont modifiés par rapport à la séquence publiée et présentent un codon stop en position 356, comme visible dans le fragment court.
En plus, la région non codante en 3' du fragment long est identique avec celle du segment court, jusqu'à la queue de polyadénylation ; il comprend, en outre, 160 pb, suivi par sa propre queue de polyadénylation (voir liste des séquences, SEQ ID N° 1 et N° 3) (voir figure 2).
Les différences de séquences retrouvées dans toute la séquence sont soulignées dans la figure 5.
De manière inattendue, le séquençage du récepteur de la mélatonine obtenu par PCR-RT révèle donc deux séquences différentes (MEL1 Aa et MEL1 Ab).
En outre, l'ADNc codant pour le récepteur complet de la mélatonine peut être amplifié à partir de l'ADN de peau de xénope, par PCR, utilisant les amorces 3 S et 12 AS, localisée dans la région 3' non-codante (voir figure 2).
L'analyse de restriction de plusieurs clones confirme que 2 ARNm différents pour le récepteur de la mélatonine sont effectivement présents dans les échantillons analysés.
Les 2 ARNm codent pour des protéines de 354 aminoacides qui sont très similaires au récepteur Mellc de poulet (78 % d'homologie).
Le fragment C (fragment court) a en conséquence également été dénommé Mel1c(α) et le fragment L (fragment long) (comprenant de nombreuses substitutions) a été dénommé Mel1c(β). EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur pour l'expression du récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MELl A.
Le récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis a été clone conformément à la méthode RT-PCR (voir figure 1).
L'ARN est isolé de la peau de Xenopus et transcrit en ADNc à l'aide de la transcriptase inverse.
Une amplification sélective de l'ADNc du récepteur de la mélatonine est réalisée en utilisant des amorces PCR spécifiques de ce récepteur.
Le récepteur amplifié est clone dans le vecteur d'expression pcDNA3-RSV dérivé du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) et son identité a été vérifiée par séquençage, comme suit :
Des préligations successives des fragments entre eux, grâce à des enzymes de restriction communes deux à deux, a permis d'insérer la totalité du récepteur de la mélatonine dans le plasmide pcDNA3/RSV aux sites HindIII/ Bsp120I à bout franc, sous le contrôle du promoteur du rous sarcoma virus (RSV). Les fragments 2 et 3 sont tout d'abord liés au niveau du site enzymatique commun "HindIII", en position 455 de la séquence codante. Ce dernier est ensuite lié avec le fragment 1 au site commun "Bsu36I" en position 202 et avec le fragment 4 au site commun "Xbal" en position 1016. Chaque fragment est préalablement coupé par les deux enzymes indis- pensable pour les ligations successives. Ce fragment purifié, composé des fragments 1, 2, 3 et 4 dont les extrémités 5' et 3' sont respectivement HindIII et EcoRI à bout franc, est enfin inséré dans pcDNA3/RSV.
EXEMPLE 3 : Caractérisation du locus Mel1c dans plusieurs espèces de xénopes.
Les récepteurs Mel1c(α) (ou Mell Aa) et Mel1c(β) (ou Mell Ab) hautement homologues peuvent représenter soit 2 allèles différents au niveau du même locus génomique, soit 2 isoformes codées par différents gènes.
Pour pouvoir répondre à cette question, le fragment 3 codant pour les récepteurs Mel1c (ou Mell A) ont été amplifiés par PCR, à partir d'ADN génomique de 43 Xenopus laevis.
Plusieurs de ces animaux sont des animaux consanguins, tandis que d'autres sont des animaux sauvages importés d'Afrique du Sud. Les fragments d'ADN amplifiés de la taille attendue sont digérés avec des enzymes de restriction convenable spécifiques des ADNc Mel1c(α) ou Mel1c(β) (figure 6).
Chez un individu X. laevis (ff), homozygote pour le complexe majeur d'histocompatibilite et d'autres marqueurs génétiques, seul le gène codant pour le récepteur Mel1c(α) est trouvé.
L'analyse PCR d'une seconde grenouille X. laevis (rf), connue pour être hétérozygote pour les marqueurs génétiques mentionnés ci-dessus, révèle la présence des 2 gènes (gène codant pour le récepteur Mel1c(α) et gène codant pour le récepteur Mel1c(β)) (figure 6).
Cette observation confirme l'hypothèse selon laquelle les 2 isoformes du récepteur de la mélatonine sont codées par le même locus génomique. L'analyse des 41 autres animaux montre la présence soit des 2 gènes (40 individus) soit du gène
Mel1c(α) seu1 (1 individu). Aucun animal ne présente que le gène du récepteur Mel1c(β).
Deux autres espèces de Xenopus ont été étudiées selon la même approche.
L'analyse de l'ADN génomique de X. ruwenzoriensis, une espèce connue pour être polyploïde, révèle la présence du gène codant pour le récepteur Mel1c(α). Deux gènes codant pour le récepteur de la mélatonine clairement différents de Mel1c(α) et Mel1c(β) ont été révélés par la comparaison des profils de digestion enzymatique de X. tropicalis et X. ruwenzoriensis (figure 6).
EXEMPLE 4 : Pharmacologie du récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MELl A
a) Expression stable
Le vecteur pcDNA3-RSV contenant la région codante et la région non-codante 3' du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis selon l'exemple 2, est transfecté dans les cellules L de souris.
La veille, 3×105 cellules sont passées dans les flasks de 25 cm2 dans un milieu DMEM 4,5 g/l de glucose; 1 mM glutamax; 1 mM pyruvate; 10 % FCS (DMEM/FCS). Le jour de la transfection, le milieu est changé (6 ml de DMEM/FCS/flask) et les cellules sont incubées pendant 3 heures à 37°C. Parallèlement une coprécipitation de l'ADN et du CaPO4 est préparée de la manière suivante : dans un volume final de 500 μl, on mélange 30 μg d'ADN carrier (pGEM3Z de Promega), 2 μg du vecteur pcDNA3-RSV contenant la région codante et la région non-codante 3' du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis et du CaCl2 (250 mM final)(Solution A). 450 μl de cette Solution A sont rajoutés goutte à goutte, en vortexant, à 450 μl de HBS 2x (1,64 g NaCl; 1,19 g Hepes; 0,04 g Na2HPO4-12H2O additionnés à 100 ml H2O) et le pH est ajusté à 7,12. Le mélange est laissé sans agitation à température ambiante pendant 45 min. 400 μl du coprécipité sont ajoutés dans une flask contenant les cellules L. Après 4 heures d'incubation à 37°C, les cellules sont lavées une fois avec 6 ml de DMEM et ensuite incubées 2 min dans 4 ml de glycérol à 15%. Ensuite les cellules sont lavées deux fois avec du DMEM et laissées dans 6 ml de DMEM/FCS, supplémenté avec 5 mM de nabutyrate à 37°C pendant une nuit. Le lendemain, le milieu est retiré, les cellules sont de nouveau lavées au DMEM/FCS puis incubées pendant une nuit dans du DMEM/FCS. Le troisième jour les cellules sont distribuées dans des plaques de 96 puits à différentes dilutions (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32) dans un milieu DMEM supplémenté avec : du FBS à 10 % (v/v), 4,5 g/1 de glucose, 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, 1 mM de glutamine et 400 μg/ml de G418 (généticine de Gibco Life Technologies). Des clones résistants à la généticine sont testés pour l'expression du récepteur de la mélatonine par liaison avec la (125)Iodomélatonine (200 pM) dans un volume final de 250 μl (tampon: 50 mM Tris/HCl pH 7,4 ; 5 mM MgCl2 ). La liaison non-spécifique est déterminée en présence de 10 mM de mélatonine.
b) Expression transitoire
Pour l'obtention d'une expression transitoire, les cellules L sont étalées soit sur des plaques comportant 6 puits (pour les tests AMPc, 0,5.106 cellules/puits), soit dans des boîtes de 10 cm de diamètre (tests GMPc, 2.106 cellules/boîte) et transfectées par la méthode au DEAE-dextran (LOPOTA et al., N.A.R., 1984, 12, 5707-5717), le jour suivant. Après un lavage avec du PB S, du DMEM sans sérum, contenant de l'Hepès 50 mM, du DEAE-dextran à 200 μg/ml et 1 μg/ml d'ADN plasmidique plasmide pcDNA3-RSV), est ajouté.
Après incubation pendant 8 h à 37°C, le milieu est remplacé par du DMSO à 10 % dans du DMEM sans sérum pendant 1,5 min. Les cellules sont lavées avec du PB S et incubées dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal à 10 %. Les essais sont réalisés trois jours après la transfection.
a. Test de liaison du radioligand.
* Méthode
Les monocouches de cellules sous-confluentes sont lavées avec du
PBS, incubées pendant 5 min à 37°C avec de la trypsine à 20 %, de l'EDTA 2 mM et remises en suspension dans du DMEM supplémenté avec du sérum de boeuf foetal à 10 % (v/v).
Après centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4°C, les culots cellulaires sont remis en suspension dans du PBS pH 7,4.
Les suspensions cellulaires sont incubées avec 400 pM de 2-(125I)-iodomélatonine (pour les essais de liaison sur les récepteurs à la mélatonine) ou 200 pM (125I)-CYP (pour les tests de liaison aux récepteurs adrénergiques β2) en l'absence ou en présence de 10 μM de ligands froids (mélatonine ou D/L-propranolol, respectivement).
Les tests de liaison sont effectués dans les conditions suivantes :
60 min à 25°C dans un volume réactionnel final de 0,25 ml. Les réactions sont arrêtées à l'aide d'une filtration rapide à travers un filtre de fibre en verre Whatman GF/C, préalablement trempé pendant 30 min dans un tampon PBS contenant 0,3 % de polyéthylène imine (pour réduire les liaisons non-spécifiques).
Les concentrations en protéines sont mesurées sur les homogénats de cellules par la méthode de Bradford (Analytical Biochem., 1976, 72, 248-254), en utilisant le système d'essai des protéines Bio-Rad. La sérum albumine bovine est utilisée comme standard. * Résultats
Parmi les différents clones exprimant les sites de liaison à la (125I)- iodomélatonine, un clone Mel1c(α) exprimant 200 fmol de récepteur/mg de protéines totales et un clone Mel1c(β) exprimant 150 fmol de récepteur/mg de protéines totales ont été plus particulièrement caractérisés.
Les constantes de dissociation Ko de l'agoniste radiomarqué 2-(125I)- iodomélatonine sont de 160 ± 32 et 143 ± 25 pM respectivement (figure 7A), valeurs qui sont en accord avec celles déterminées pour d'autres récepteurs de la mélatonine de forte affinité, y compris ceux antérieurement clones, à partir de mélanophores de X. laevis. Les expériences de compétition ont montré que l'affinité vis-à-vis de différents ligands est caractéristique des récepteurs de la mélatonine (figure 7B et Tableau I).
b. Détermination des taux intracellulaires d'AMP cyclique.
* Méthode
Les cellules mises en croissance dans des plaques contenant 6 puits sont lavées 2 fois avec du DMEM sans sérum, préincubées pendant 15 min à 37°C, puis incubées pendant 15 min à 37°C dans un milieu DMEM contenant 1 mM d'TBMX (3-isobutyl-1-méthylxanthine) avec ou sans isoprotérénol (10 μM) (essais sur les cellules transfectées transitoires), ou 10 μM de forskoline (essais sur les clones cellulaires stables) et des quantités croissantes de mélatonine. Le tampon d'incubation est éliminé et les cellules sont lysées dans de la soude 1 M pendant 20 min à 37°C. Après neutralisation du pH avec de l'acide acétique 1 M, les lysats cellulaires sont centrifugés dans une microcentrifugeuse à 17 000 x g pendant 5 min. Les surnageants sont testés pour leur contenu en AMP cyclique à l'aide du système AMP cyclique 3H (Amersham). Alternativement, les tests de mesure de l'AMP cyclique peuvent être réalisés dans des plaques contenant 24 puits (0,5 × 106 cellules dans 300 μl). Les cellules sont alors incubées pendant 15 min et la réaction est stoppée par l'addition de 100 μl d'acide trichloracétique à 20 % et les surnageants sont testés pour leur contenu en AMP cyclique.
* Résultats
- Les récepteurs de la mélatonine, présentant une forte affinité, sont connus pour participer à l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase.
Dans les cellules L exprimant le récepteur Mel1c(α), la mélatonine entraîne l'inhibition de l'accumulation de l' AMPc stimulée par la forskoline (figure 8).
La valeur ICso de cet effet est d'environ 6.10-10M, ce qui est en accord avec les valeurs obtenues précédemment avec les récepteurs de la mélatonine présentant une forte affinité.
De manière surprenante, dans les cellules exprimant le récepteur Mel1c(β), un tel effet ne peut pas être observé même à des concentrations en mélatonine supérieures à 0, 1 mM.
Toutefois, les taux de base d'AMPc ne sont affectés par la mélatonine dans aucune des lignée cellulaires étudiées, même en présence d'LBMX.
L'inhibition de l'accumulation d'AMPc par les récepteurs de la mélatonine est couplée aux protéines Gi., par l'intermédiaire de leurs sous-unités α.
- Afin de vérifier que le signal produit avec le récepteur Mel1c(β) n'est pas dû à un changement quantitatif des sous-unités Giα, des cellules L contrôles et des clones exprimant soit les récepteurs Mel1c(α) ou Mel1c(β) sont comparés pour ce qui concerne leur contenu en sous-unités Giα, conformément au protocole suivant :
Les cellules sont solubilisées dans un tampon Laemmli contenant 2 % de SDS et 40 mM de dithiothreitol et soniqué à 4°C. Après centrifugation dans une microcentrifugeuse à 17 000 x g, 50 μl de surnageant est séparé en ses composants dans un gel SDS/polyacrylamide à 12 %. L'analyse des immunoblots est réalisée comme décrit dans SELZER E. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 1609- 1613), avec 84 antisérums qui correspondent aux 3 sous-types de Giα.
L'analyse en Western blot avec un anticorps spécifique reconnaissant les 3 sous-types de Giα, ne permet pas de détecter de différences quantitatives significatives.
- Etude du signal de transduction (signalisation)
Il a été étudié après transfection transitoire des 2 isoformes d'ADNc de Melic dans des cellules L de manière à exclure un artefact potentiel associé à la sélection des clones. Les cellules L sont co-transfectées avec l'ADNc du récepteur adrénergique β2 humain et avec soit l'ADNc du récepteur Mel1c(α) ou du récepteur Mel1c(β) ; la co-expression de ces différents récepteurs permet d'étudier sélectivement la sous-population de cellules qui a effectivement internalisé l'ADN exogène.
Trois jours après la transfection, les cellules sont étudiées pour leur inhibition de l'accumulation d'AMP cyclique-mélatonine dépendante, en réponse à l'isoprotérénol, agoniste β2-RA et pour le nombre de sites de liaison β adrénergique et mélatonine (figure 9).
Aucun site de liaison, pour aucun des récepteurs, ne peut être mesuré dans les cellules contrôles sauvages. Dans les cellules transfectées avec l'ADNc de récepteur adrénergique β2 seul, l'incubation avec de l'isoprotérénol entraîne une augmentation d'un facteur 5 de l'AMPc. Dans les cellules co-transfectées avec des quantités identiques (1 μg d'ADN plasmidique) d'ADNc codant pour les récepteurs Mel1c(α) et adrénergique β2, l'incubation simultanée avec de l'isoprotérénol et de la mélatonine entraîne une diminution significative de l'accumulation d'AMPc (65±5 % du contrôle, p<0,05) (figure 9).
Dans les mêmes conditions, les récepteurs Mel1c(β) ne sont pas capables d'inhiber l'accumulation d'AMPc induite par l'isoprotérénol, malgré l'expression d'un nombre équivalent de site de liaison aux récepteurs. Des résultats similaires sont obtenus, lorsque l'ADNc codant pour le récepteur Mel1c(β) est en excès d'un facteur 10 par rapport à l'ADNc codant pour le récepteur adrénergique β2.
Les récepteurs Mel1c(α) inhibent l'accumulation d'AMPc stimulée par la forskoline de manière dose-dépendante avec une valeur IC50 d'environ 6.10-10 M, une valeur en accord avec celle rapportée pour les récepteurs de la mélatonine précédemment décrite.
En contraste avec ces résultats, la liaison de la mélatonine aux récepteurs Mel1c(β) ne stimule aucune modulation des taux d'AMPc bien que la forskoline stimule une accumulation d'AMPc similaire dans les lignées cellulaires exprimant soit les récepteurs Mel1c(α), soit les récepteurs Mel1c(β).
L'inhibition de la fonction adénylyl cyclase est principalement couplée aux protéines Gi activées.
L'analyse en Western blot montre la présence de quantités similaires de sous-unités α Gil-3 à la fois dans les 2 lignées cellulaires transfectées et dans les cellules L non transfectées contrôles, excluant la sélection potentielle de clones cellulaires exprimant des quantités peu importantes de protéines Gi. De plus, l'absence de modulation d'AMPc est également observée dans les essais de transfection transitoire, confirmant que le récepteur Mel1c(β) lui-même est incapable d'activer cette voie biologique.
La différence entre les récepteurs Mel1c(α) et Mel1c(β), à savoir essentiellement la substitution de 5 aminoacides, localisée dans les domaines intracellulaires, constitue la base moléculaire de ce phénomène ; dans les récepteurs appartenant à la famille des récepteurs incluant 7 domaines transmembranaires, ces régions intracellulaires sont connues pour être impliquées dans le couplage à la protéine G. Dans des conditions expérimentales appropriées, la mélatonine peut stimuler l'accumulation d'AMPc dans des cellules exprimant l'adénylyl cyclase de type II. Un tel effet n'est pas observable avec les clones stables exprimant le récepteur Mel1c(α) ou le récepteur Mel1c(β), ni dans les cellules L transfectées de manière transitoire avec les ADNc correspondants.
c. Détermination des taux intracellulaires de GMP cyclique.
* Méthode
Les cellules transfectées transitoirement, mises en croissance dans des boîtes ayant un diamètre de 10 cm, sont incubées à 37°C pendant 15 min dans un milieu DMEM sans sérum, en présence ou en l'absence de 1 mM d'LBMX et de quantités croissantes de mélatonine. Le milieu est ensuite remplacé par 1 ml d'éthanol à 65 % glacé et les extraits cellulaires sont centrifugés à 2 000 x g pendant 15 min à 4°C. Les surnageants sont séchés ; les culots sont remis en suspension dans 250 μl d'un tampon acétylé.
Le GMP cyclique est dosé conformément au kit EIA (Amersham). Des voies additionnelles telles que la modulation du contenu en GMPc a été proposée pour le récepteur de la mélatonine (VANECEK J. et al., Brain Res., 1989, 505, 157-159).
Les cellules L exprimant soit les récepteurs Mel1c(α), soit les récepteurs Melic(β), sont incubées avec de la mélatonine et les effets sur le GMPc intracellulaire sont analysés. La mélatonine (jusqu'à 10 μM) n'a aucun effet sur les taux de base de GMPc dans aucune des lignées cellulaires.
Le contenu intracellulaire en GMPc dépend de l'activité opposée des guanylyl cyclases, qui synthétisent le GMPc et des phosphodiestérases (PDE), qui dégradent le GMPc.
L'inhibiteur de PDE, IBMX lorsqu'il est ajouté au milieu, bloque la dégradation du GMPc par le PDE. Dans ces conditions, le taux de GMPc augmente d'un facteur 3, indiquant la présence d'une activité PDE basale dans les cellules L non stimulées.
L'incubation avec de la mélatonine inhibe l'accumulation de GMPc stimulée par le PDE, de manière dose-dépendante dans des cellules L exprimant soit le récepteur Mel1c(α), soit le récepteur Mel1c(β) (figure 10A). La valeur IC50 de cet effet (environ 10-9 M) correspond aux valeurs de Ki de la mélatonine obtenues dans les essais de compétition et est proche de la valeur IC50 obtenue lors de l'inhibition de l'adénylyl cyclase par le récepteur Mel1c(α).
La stimulation par la mélatonine des cellules témoins n'affecte pas l'augmentation de production de GMPc par TBMX.
La toxine de Pertussis, qui catalyse la ribosylation inactivante d' ADP des sous-unités α Gi/o de protéines G, bloque l'inhibition de l'accumulation d'AMPc liée à la protéine Gi et stimulée par les récepteurs à la mélatonine. La préincubation de cellules avec la toxine de Pertussis abolit complètement l'effet de la mélatonine sur l'accumulation de GMPc, suggérant que cette voie est également dépendante de la protéine Gi/o.
Les 2 ADNc de récepteurs de la mélatonine Mel1c(α) et Mel1c(β) se trouvent soit sous forme longue, soit sous forme courte. L'ADNc du récepteur Mel1c(α) se présente pour la plupart sous la forme courte (3: 1, court: long), alors que l'ADNc du récepteur Mel1c(β) est plus abondant sous la forme longue (1:3). Les régions non-traduites en 3' de plusieurs récepteurs de la même famille, tels que le récepteur adrénergique β2 ou le récepteur muscarinique contiennent des déterminants moléculaires impliqués dans la régulation de la stabilité de l'ARNm. Ceci suggère que les ARNm courts et longs codant pour les récepteurs Mel1c(α) et Mel1c(β) sont soumis à des régulations différentes.
Dans la mesure où les isoformes du récepteur ont des affinités similaires pour la mélatonine mais des signaux biologiques différents, une telle régulation pourrait moduler la réponse cellulaire à la stimulation par la mélatonine.
Le rôle du GMPc comme second messager dans la voie biologique du récepteur à la mélatonine est encore controversé. L'agrégation pigmentaire dans les mélanocytes de Xenopus sont régulés par la mélatonine et par l'AMPc alors que des résultats contradictoires existent en ce qui concerne sa régulation par le GMPc. Le rôle du GMPc dans la stimulation de signaux biologiques liés à la mélatonine dans d'autres systèmes cellulaires n'a pas été approfondie. Un second argument en faveur de la modulation du GMPc par les récepteurs à la mélatonine ressort des essais réalisés sur le tissu d'hypophyse de rat néonatal dans lequel un effet inhibiteur de la mélatonine sur la production de GMPc est observé. Dans les essais tels que rapportés ci-dessus, les récepteurs Mel1c(α) et Mel1c(β) activés par la mélatonine inhibent effectivement l'accumulation de GMPc d'une manière dose-dépendante avec une valeur d'IC50 d'environ 10-9 M. Cette inhibition n'est évidente que lorsque l'inhibiteur du PDE IBMX est inclut dans le milieu d'incubation, sans doute en raison d'une activité basale PDE importante dans les cellules L.
Les données rapportées ci-dessus confirment que les récepteurs de la mélatonine à haute affinité peuvent moduler le GMPc à concentration physiologique de mélatonine et montrent que les récepteurs Mel1c(β) sont fonctionnels en terme de transduction du signal.
L'effet des récepteurs sur le GMPc est complètement aboli par la toxine de Pertussis, indiquant que les protéines Gi/o sont impliquées dans la transduction de ce signal.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

Revendications
1 °) Séquences nucléiques codant pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine de type MEL1 A ou Mel1c, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées parmi les séquences suivantes : SEQ ID N° 1, SEQ ID N°3, SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°7.
2°) Fragments des séquences selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe qui comprend :
- une séquence constituée d'un segment de 230 paires de bases nucléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1286 des SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N°5 ;
- une séquence constituée d'un segment de 69 paires de bases nucléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1125 des SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N°7.
3°) Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques selon la revendication 1 ou la revendication 2.
4°) Protéine et/ou fragments de protéine, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2 et en ce qu'ils présentent une activité de récepteur de la mélatonine de type MEL1 A fonctionnel.
5°) Protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle présente l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°6.
6°) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2.
7°) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide comprenant un promoteur RSV et la SEQ ID N° 1.
8°) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il a été déposé sous le n° 1-1583 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
9°) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est constitué par un plasmide comprenant un promoteur RSV et la SEQ ID N° 5. 10°) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il a été déposé sous le n° 1-1584 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
11°) Cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 6 à 10.
12°) Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par les cellules de la lignée L.
13°) Processus d'expression d'une protéine selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisé en ce que la cellule hôte, résultant de la transformation par un vecteur contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2 codant pour une protéine ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, est cultivée de manière à produire et à transporter ladite protéine exprimée vers la membrane, de telle sorte que les séquences transmembranaires dudit récepteur soient exposées à la surface de la membrane de l'hôte cellulaire transformé.
14°) Modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cellules hôtes selon la revendication 11 ou la revendication 12, c'est-à-dire exprimant un récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A à la surface de leur membrane cellulaire.
15°) Procédé de détection de la capacité d'une substance à se comporter comme ligand vis-à-vis d'une protéine selon la revendication 4 ou la revendication 5, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, laquelle cellule hôte exprime ladite protéine (récepteur de la mélatonine), et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe de type ligand-protéine. 16°) Procédé pour l'étude de l'affinité d'une protéine selon la revendication 4 ou la revendication 5 pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 ;
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions permettant l'expression du récepteur de la mélatonine de type MEL1 A, codé par la séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur de la mélatonine exprimé vers la membrane de ladite cellule de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur fonctionnel de la mélatonine soient exposées à la surface de la cellule hôte transformée ;
- la mise en contact de ladite cellule avec les ligands déterminés et
- la détection d'une réaction affine entre ladite cellule transformée et lesdits ligands déterminés.
17°) Kit pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine selon la revendication 4 ou la revendication 5, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'une protéine (récepteur de la mélatonine de type MEL1 A), codée par une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, contenue dans un vecteur dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ladite protéine ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique de la protéine exprimée.
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