CA2227554A1 - Sequences nucleiques codant pour des recepteurs de la melatonine et leurs applications - Google Patents

Abstract

Séquences nucléiques codant pour des récepteurs de la mélatonine de xénope de type MEL1 A, également dénommés Mel1c, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, leurs applications en tant que sonde et pour l'expression de protéines et/ou de fragments de celles-ci ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, vecteurs utiles pour ladite expression, hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs ainsi que modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine. Procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des protéines ayant une action de récepteur de la mélatonine et trousses ou kits pour la détection du degré d'affinité de différentes substances pour lesdites protéines à activité de récepteur de la mélatonine. Lesdites séquences nucléiques codant pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine de type MEL1 A, sont sélectionnées parmi les séquences suivantes: SEQ ID N~ 1, SEQ ID N~ 3, SEQ ID N~ 5 ou SEQ ID N~ 7.

Description

SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR DES RECEPTEURS DE LA MELATONINE ET LEURS
APPLICATIONS

La présente invention est relative à des séquences nucléiques codant pour des récepteurs de la mélatonine de xénope de type MEL 1 A, également dénom-més ci-après Mellr, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, à
leurs applications en tant que sonde et pour l'expression de protéines et/ou de fragments de celles-ci ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, aux vecteurs utiles pour ladite expression, aux hôtes cellulaires contenant lesdits vec-teurs ainsi qu'à un modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des protéines ayant une action de récepteur de la mélatonine et à des trousses ou kits pour la détection du degré
d'affinité de différentes substances pour lesdites protéines à activité de récepteur de la mélatonine.
Un récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis a été décrit (EBISAWA T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6133-6137). II
s'agit d'une protéine de 420 aminoacides.
Toutefois, des amorces localisées dans la partie 3' des séquences nucléiques correspondantes n'ont pas permis d'amplifier la séquence codant pour cette protéine.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de rechercher des séquences nucléiques aptes à coder le récepteur de la mélatonine de type MEL1 A, lesquelles séquences étant aisément amplifiables dans leur intégralité.
La présente invention a pour objet des séquences nucléiques codant pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine, de type MEL1 A et de structure différente de celle du récepteur décrit dans EBISAWA et al. et présentant des proprié-tés de couplage et de régulation différentes de celles du récepteur antérieurement décrit, lesquelles séquences sont sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N
1, SEQ
ID N 3, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 7, telles que présentées dans la liste des séquences incluse dans la présente Demande.
Ces séquences selon l'invention présentent, en 3' une séquence non codante plus ou moins longue (séquences longues : SEQ ID N 1 et SEQ ID N 5 ;

2 séquences courtes : SEQ ID N 3 et SEQ ID N 7), qui intervient de manière cruciale sur la régulation de l'ARN :'/a vie de l'ARN, modifiée par rapport aux séquences de l'Art antérieur.
En particulier, les SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3 codent pour une protéine présentant 65 aminoacides en moins, par rapport à la séquence décrite dans l'Art antérieur, les 2 aminoacides en position C-terminale étant, en outre, différents.
Cette protéine correspond au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Aa ou Mellc(a)=

Les SEQ ID N 5 et SEQ ID N 7 codent pour une protéine présen-tant également 65 aminoacides en moins, par rapport à la séquence décrite dans l'Art antérieur ; en outre, 6 résidus d'aminoacides sont différents, par rapport à
ladite séquence de l'Art antérieur. Cette protéine correspond au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Ab ou Mellc(Q).

Aussi bien la séquence codant pour le récepteur MEL1 Aa ou Mellc(a) que la séquence codant pour le récepteur MEL1 Ab ou Mellc(Q) pourraient entraîner des modifications dans la régulation de l'ARN, en rapport avec la séquence non codante en 3' (régulation par un ligand agoniste, durée de vie de l'ARN).

De manière inattendue, seul le récepteur MEL1 Aa ou Mellc( ) inhibe l'adénylyl cyclase ; en effet, le récepteur MELl Ab ou Mellc(R) est dépourvu de cette propriété à inhiber l'adénylyl cyclase.
En outre, d'autres signaux biologiques sont associés à ces protéines en particulier, ces deux isoformes allèliques sont capables de moduler le GMPc intra-cellulaire (modulation dose-dépendante) et notamment d'inhiber l'accumulation de GMPc induite par un inhibiteur de phosphodiestérase.
La présente invention a également pour objet les fragments desdites séquences, utiles soit pour une expression fonctionnelle du peptide correspondant au récepteur de la mélatonine correspondant, soit à la détection de la séquence codant pour ledit récepteur.
Parmi lesdits fragments, l'invention englobe, entre autres :

3 - une séquence constituée d'un segment de 230 paires de bases nu-cléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1286 des SEQ ID N 1 ou SEQ
ID
N 5;
une séquence const:ituée d'un segment de 69 paires de bases nu-cléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1125 des SEQ ID N 3 ou SEQ
ID
N 7.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidi-ques, caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus.
Des conditions d'hybridation convenables sont notamment les suivan-tes : l'hybridation est réalisée à 42 C dans un tampon comprenant : 4X SSC, 40 % de formamide, 0,2 % de SDS et tampon Denhardt 5X.
De telles sondes ont notamment l'avantage de permettre la caractéri-sation des différents variants du récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A(1V1EL1 Aa ou MEL1 Ab).
La présente invention a également pour objet les protéines et/ou fragments de protéine, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence nucléoti-dique telle que définie ci-dessus et en ce qu'ils présentent une activité de récepteur de la mélatonine de type MELI fonctionnel.
Conformément à l'invention, ladite protéine est sélectionnée parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID N 2 (la SEQ ID N 4 étant identique à la SEQ
ID N 2) ou SEQ ID N 6 (la SEQ ID N 8 étant identique à la SEQ ID N 6), telles que présentées dans la liste de séquences incluse dans la présente Demande.
Les SEQ ID N 2 et N 4 correspondent au récepteur de la mélato-nine dénommé MEL1 Aa ou Mell al ; les SEQ ID N 6 et N 8 correspondent au récepteur de la mélatonine dénommé MEL1 Ab ou Mel1c(R).

Ces deux protéines, dont la structure est différente de celle de la protéine de l'Art antérieur, présentent, de manière inattendue, des réactions et des signaux biologiques différents de ceux antérieurement décrits, notamment en ce qui = 30 concerne le couplage aux protéines G (signalisation).

4 PCT/FR96/01167 La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléo-tidique conforme à l'invention.
On entend au sens de la présente invention, par vecteur recombinant aussi bien un plasmide, un cosmide qu'un phage. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est consti-tué par un vecteur recombinant dans lequel est insérée une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'une protéine ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, conforme à
l'invention.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un plasmide pcDNA3 (Invitrogen), comprenant un promoteur RSV et la SEQ ID N 1.
Un tel plasmide a été dénommé X-MEL1a et a été déposé sous le n I-1583 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un plasmide pcDNA3 (Invitrogen), comprenant un promo-teur RSV et la SEQ ID N 5.
Un tel plasmide a été dénommé X-MEL1b et a été déposé sous le n I-1584 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appro-priée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention.
Une telle cellule est capable d'exprimer une protéine, ayant une acti-vité de récepteur fonctionnel de la mélatonine, de type MELI A.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notam-ment constituée par les cellules de la lignée L.
La présente invention a également pour objet un processus d'expression d'une protéine conforme à l'invention, caractérisé en ce que la cellule hôte, résultant de la transformation par un vecteur contenant une séquence nucléotidi-que selon l'invention codant pour une protéine ayant une activité de récepteur fonc-tionnel de la mélatonine de type MFLl A, est cultivée de manière à produire et à trans-porter ladite protéine exprimée vers la membrane, de telle sorte que les séquences transmembranaires dudit récepteur soient exposées à la surface de la membrane de

5 l'hôte cellulaire transformé.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cellules hôtes conformes à l'invention, c'est-à-dire exprimant un récepteur fonc-tionnel de la mélatonine de type MEL1 A à la surface de leur membrane cellulaire.
Un tel modèle permet l'étude, d'un point de vue pharmacologique, des récepteurs de la mélatonine, notamment en permettant l'identification des ligands spécifiques des récepteurs de type P/IEL1 A (agonistes et antagonistes) et ainsi la mise au point de médicaments actifs sur la régulation de l'horloge biologique, avec des applications particulièrement intéressantes, notamment dans le domaine cardiovascu-laire (lipolyse) et en cancérologie (mise en phase des cellules).
L'invention a également pour objet un procédé de détection de la capacité d'une substance à se comporter comme ligand vis-à-vis d'une protéine conforme à l'invention, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préala-blement transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention, laquelle cellule hôte exprime ladite protéine (récepteur de la mélatonine), et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance et - la détection de la formation éventuelle d'un complexe de type ligand-protéine.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé pour l'étude de l'affinité d'une protéine conforme à l'invention pour un ou plusieurs ligands déter-minés, lequel procédé est caractérisé en ce qu'i1 comprend :
- la transformation d'uiie cellule hôte appropriée par un vecteur con-forme à I'invention ;
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions per-mettant l'expression du récepteur de la mélatonine de type MEL 1 A, codé par la

6 séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur de la mélatonine exprimé
vers la membrane de ladite cellule de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur fonctionnel de la mélatonine soient exposées à la surface de la cellule hôte transfor-mée ;
- la mise en contact de ladite cellule avec les ligands déterminés et - la détection d'une réaction affine entre ladite cellule transformée et lesdits ligands déterminés.
L'invention a, en outre, pour objet un kit pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine conforme à l'invention, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un vecteur d'expression conforme à l'invention ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'une protéine (récepteur de la mélatonine de type MELl A), codée par une séquence nucléotidique conforme à l'invention, contenue dans un vec-teur dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ladite protéine ; et - des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique de la protéine exprimée.
De manière inattendue, les récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A selon l'invention sont effectivement des récepteurs fonctionnels et permettent la réalisation de toutes les applications précitées.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente un schéma de la technique de clonage de =
l'ADNc du récepteur de la mélatonine, à partir de Xenopus laevis ;
- la figure 2 illustre les différents fragments de clonage utilisés ; la localisation des amorces sens (S) (~) et anti-sens (AS) (F-) spécifiques de la séquence d'ADNc codant pour le récepteur de la mélatonine, antérieurement identifiée à
partir

7 de mélanophores de derme de Xenopus ; la localisation des amorces qui ne correspon-dent pas à cette séquence (~=) sont également illustrées à cette figure ;
la figure 3 illustre les étapes de clonage et de séquençage des frag-ments d'ADNc du récepteur de la mélatonine ;
= 5 - la figure 4 correspond à une comparaison des séquences codant respectivement pour les récepteurs de la mélatonine Mell a) et Mel1c(R): la séquence du récepteur de la mélatonine Mell a) est illustrée (O) et les substitutions caractérisant le récepteur de la mélatonine Melir(R) (0) sont indiquées à la figure 4A ; les séquences d'ADN de la région 3' non traduite longue et courte sont illustrées à la figure 4B. Les récepteurs Mellc( ) sont préférentiellement associés à la région 3' non traduite courte (3 :1, court :long), alors que les récepteurs Meli,(R) sont préférentiellement associés à
la région 3' non traduite longue (1 :3). A la figure 4B, les sites de clonage EcoRI sont soulignés.
- la figure 5 illustre la partie codante de séquence d'ADNc codant pour le récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A (a ou b) en comparai-son avec la séquence EBISAWA et al. (référence précitée) ;
- la figure 6 illustre la caractérisation des ADNs codant pour les récepteurs Mellc(a~1VIe11 R) chez différents types de Xenopus. L'amplification PCR
utilisée dans ce test fournit le fragment 3 de la figure 2. Les enzymes de restriction uti-lisées pour la digestion des produits d'amplification PCR obtenus sont : Afl II (1 site à
la fois dans la séquence Mellc(a) et la séquence Mel1c(Q , Bsp120 I(1 site dans la séquence Mellc a), pas de site dans la séquence Melic(p , Pmll (1 site dans la séquence Me11c(R), pas de site dans la séquence Mellc(a . L'analyse de restriction est effectuée à partir des produits PCR. issus des ADN génomiques suivants : 1, X.
tropi-calis ; 2, X. ruwenzoriensis ; 3, individu X. laevis homozygote (ff); 4, ADNc de = Melle(a) cloné ; 5, ADNc de MelI~(Q) cloné ; 6, ADNc de X. laevis amplifié à
partir d'un pool d'ARNm de peau ; 7, individu X. laevis hétérozygote (rf) ; ND, produit de PCR non digéré.

8 - la figure 7 illustre la spécificité pharmacologique de la liaison 2-(125I)-iodomélatonine/récepteurs à la mélatonine, en présence de cellules L
stables exprimant un récepteur selon l'invention (Mellc(a) ou Mel1c(Q ; la figure 7A
montre l'isotherme de saturation de la liaison 2-(125I)iodomélatonine ; la liaison non-spécifique est mesurée en présence de mélatonine 10 M ; cette figure 7A comprend en incrusta-tion la représentation Scatchard des données. La figure 7B représente l'étude des liai-sons par compétition de la 2-(125I)-iodomélatonine (400pM) au récepteur, effectuées sur des membranes de cellules L, exprimant soit le récepteur Mellc(a), soit le récepteur Melic(R), en présence d'I-mélatonine (0), de mélatonine (M), de N-acétyl-5-hydroxy-tryptamine (NAS) (O), de S22153(,&) et de S20098 (M).
- la figure 8 illustre la modulation de l'accumulation d'AMPc, stimu-lée par la forskoline, par les récepteurs Mellc ) et Mel1c(R). Les clones stables de cellu-les L transfectées avec de 1'ADNc codant soit pour le récepteur Melic( ) (0), soit pour le récepteur Mel1cCR1(O) sont stimulés par la forskoline (FK) (10 M) en présence des concentrations indiquées de mélatonine (en abscisse) ; en ordonnée, cette figure comprend le taux d'AMPc intracellulaire en %. La valeur 100 %(O) correspond à
la valeur moyenne d'AMPc en présence de forskoline 10 M ;(a) indique la valeur d'AMPc, en présence de mélatonine (10 M) seule (*P<0,05).
- la figure 9 illustre la modulation de l'accumulation d'AMPc stimu-lée par l'isoprotérénol, par les récepteurs de la mélatonine, dans des essais de transfec-tion transitoire. Le récepteur Mellc(a) ou le récepteur Mel1c(R) est co-exprimé avec le récepteur (32 adrénergique ((32-RA), en quantités égales dans des cellules L
et stimulé
avec de l'isoprotérénol (ISO, 10 .M), en présence ou en l'absence de mélatonine (Mel, 10 M) : les taux d'AMPc sont mesurés ; NT signifie nontransfecté. Le nombre de sites de liaison spécifiques au 125ICYP et à la 2-125I-iodomélatonine [représentés comme suit : (sites de liaison spécifiques ICYP/sites de liaison spécifiques iodo-mélatonine) et exprimés en finol/mg de protéine], dans ces cellules transfectées sont respectivement : NT (24/0) ; Mell al (5/77) ; Melic(R) (13/148) ; (32-RA
(622/0) ; (32-RA/Meltc( ) (386/54), (32-RA/Mel1c(R) (416/151) (*P<0,05).

9 - la figure 10 illustre la modulation de l'accumulation du GMPc par les récepteurs de la mélatonine. A la figure 10A, des cellules L transfectées de façon transitoire avec un ADNc codant soit pour le récepteur Melic(a) (d, (D), soit pour le récepteur Mellc(R) (i, =), sont incubées avec les concentrations indiquées en abscisse de mélatonine, en présence (O, =) ou en l'absence (^, M) de 1 mM d'IlVMX. A la figure 10B, les cellules L transfectées de façon transitoire avec un ADNc codant soit pour le récepteur Meltc(a), soit le récepteur Mellc(p), sont préincubées soit dans un tampon, soit avec de la toxine de Pertussis (PTX, 100 ng/ml) pendant 18 heures, puis incubées en présence de 1 mM d'liBMX et en l'absence ou en présence de 10 M
de mélatonine. Les taux de GMPc intracellulaires (en ordonnée) sont déternùnés.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1: Isolement et identification des 4 séquences fonctionnelles du récepteur de la mélatonine de type MEL1 A.
a) Amplification de la partie codante du récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis.
L'ARN total de la peau de Xenopus laevis est préalablement traité
avec 0,3 U d'une DNAse I sans RNAse (RQ1 DNase, Promega) pendant 20 min à
37 C par mg d'acide nucléique. La synthèse de l'ADNc est réalisée par incubation de 200 ng d'ARN (chauffé à 65 C pendant 5 min avant la réaction) avec 100 unités de MMLV inverse transcriptase "Stratacript RNAse H-" de Stratagène pendant 30 min à
37 C.
Après inactivation à 95 C (5 min), l'ADNc est amplifié par PCR avec différents couples d'oligonucléotides spécifiques du récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis, de l'ADN polymérase lPwo (Boehringer Mannheim) avec son propre tampon, en présence de 2 mM de MgSO4, dans un volume de 50 l. L'ADNc est dénaturé 2 min à 94 C, amplifié 40 fois ; une élongation de 3 min à 72 C est ensuite réalisée. Un cycle correspond à 15 sec. à 94 C ; 30 sec. à la température spécifique du couple d'oligonucléotide et 90 sec. à 72 C (GeneAmp PCR System 9600 de Perkin-Elmer Cefus). Les couples d'oligoniucléotides nùs en oeuvre pour amplifier différents fragments de l'ADNc codant pour le récepteur de la mélatonine de X. laevis (figure 2) sont les suivants :
- fragment 1: 5'AGAAATGATGGAGGTGAATAGCA3' (SEQ ID
N 9) (3S, position 28) et 5'CGGCAATAGACAAACTGACAACA3' (SEQ ID N 10) 5 (3AS, position 241) (température spécifique d'hybridation de 54 C) ; =
- fragment 2: 5'TATTGGTCATTTTGTCTGTC3' (SEQ ID N 11) (5S, position 183) et 5'CCAGGTGCTTCTTTGATTAT3'(SEQ ID N 12) (5AS, position 462) (température spécifique d'hybridation de 50 C) ;
- fragment 3 : 5'CTTCAACATAACAGCCATAGC3' (SEQ ID

10 N 13) (6S, position 391) et 5'TGCTTGATTGTTGTTGGTTAC3' (SEQ ID N 14) (6AS, position 764) (température d'hybridation de 50 C) ;
b) Amplification de l'extrémité 3' du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis.
Le fragment 4, contenant la région 3' non traduite est amplifié en uti-lisant le kit Amp1iFINDERTM RACE (Clontech) et les oligonucléotides suivants :
5'TATGGTGTGCTAAATCAA.AACTTCCGCAAGGAGTA3' (SEQ ID N 15) et 5'TACTGATGTCCTTATTGACTCCAAGACTGTTGTTT3' (SEQ ID N 16) (température d'hybridation de 58 C).
Par ailleurs, l'ADNc codant pour tout le récepteur de la mélatonine peut être amplifié avec les amorces suivantes : 5'AGAAATGATGGAG
GTGAATAGCA3' (SEQ ID N 17) (3S) et 5'TTAGAATGAATGGACAGAA3' (SEQ ID N 18) (12AS) (température d'hybridation de 52 C).
Plusieurs amorces ont été testées pour leur capacité à amplifier l'ADNc du récepteur de la mélatonine (figure 2).
Plus de 80 % de l'ADNc désiré a été amplifié en utilisant 3 paires différentes d'amorces qui comprennent des séquences chevauchantes (fragments 1-3), qui correspondent à la région codant pour le fragment allant jusqu'à Ala 349.
Tous les efforts pour amplifier la dernière portion de région codante en 3' et la région 3' non codante n'ont pas abouti.
Cette partie restante de l'ADNc du récepteur de la mélatonine a été
amplifiée à l'aide d'une réaction PCR modifiée, en utilisant le site de polyadénylation, à
l'extrémité 3' de l'ADNc en tant qu'amorce (principe décrit à la figure 3).

Il Deux fragments d'amplification (estimés à 400 pb (fragment court) et 600 pb (fragment long), respectivement) ont été obtenus en utilisant cette approche. Le fragment court de 400 pb contient 250 bp non-codantes (3' court) et 150 pb codantes ;
le fragment de 600 pb contient 450 pb non-codantes (3' long) et 150 bp codantes.
La digestion de ces fragments avec deux enzymes de restriction montrent le profil de restriction attendu.
Les produits d'ainplification ont été clonés séparément dans un vec-teur et caractérisés par digestion enzymatique et par séquençage par la méthode aux didésoxy (4-6 clones/fragment).
Le fragment 1 correspond à la séquence 28-241 : 3 clones ont été
séquencés, qui sont identiques avec la séquence publiée (EBISAWA et al.).
Parmi les clones des fragments 2 et 3, certains sont identiques à la séquence publiée tandis que d'autres montrent des différences au niveau de la séquence nucléique.
Dans un variant du fragment 2, on observe deux substitutions nucléotidiques silencieuses (pas de modification de la séquence en aminoacides), tandis que les variants du fragment 3 contiennent 26 substitutions nucléotidiques silencieuses et 6 substitutions entraînant une modification de la séquence en aminoacides corres-pondante (voir figures 4 et 5).
A la fois les fornles courtes et longues des fragments 4 présentent une forte homologie avec la séquence publiée du récepteur de la mélatonine jusqu'à la méthionine en position 353.
Pour ce qui concerne le fragment 4 court (voir SEQ ID N 5 et N 7) (fragment C), au-delà de la méthionine 353, deux aminoacides différents ont été détec-tés, c'est-à-dire tyrosine à la place de leucine (position 354) et valine à la place de glycine (position 355), suivis par un codon stop, entraînant la perte de 65 aminoacides, si l'on compare avec la séquence publiée du récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis (figure 4A).
L'alignement en aminoacides dudit récepteur, à partir de Xenopus, de l'Homme et du mouton, montre que la séquence publiée du récepteur de la mélatonine à partir de Xenopus présente une queue C-terminale beaucoup plus longue que le récepteur cies deux autres espèces (REPPERT et al., 1994).

Contrairement à la séquence publiée, le récepteur de la mélatonine selon l'invention obtenue à partir de Xenopus laevis présente la même taille que le récepteur de la mélatonine obtenu à partir de l'Homme ou du mouton.
Pour ce qui concerne le fragment 4 long (fragment L) (voir SEQ ID
N 1 et N 3) : 4 clones ont été séquencés, l'un d'eux correspond à la séquence publiée jusqu'à la méthionine 353, 3 d'entre eux montrent le même changement que celui observé dans le fragment court, jusqu'à la méthionine 353. Dans tous les clones, les aminoacides 354 et 355 sont modifiés par rapport à la séquence publiée et présentent un codon stop en position 356, comme visible dans le fragment court.
En plus, la région non codante en 3' du fragment long est identique avec celle du segment court, jusqu'à la queue de polyadénylation ; il comprend, en outre, 160 pb, suivi par sa propre queue de polyadénylation (voir liste des séquences, SEQ ID N 1 et N 3) (voir figure 2).
Les différences de séquences retrouvées dans toute la séquence sont soulignées dans la figure 5.
De manière inattendue, le séquençage du récepteur de la mélatonine obtenu par PCR-RT révèle donc deux séquences différentes (MEL1 Aa et MEL1 Ab).
En outre, l'ADNc codant pour le récepteur complet de la mélatonine peut être amplifié à partir de l'ADN de peau de xénope, par PCR, utilisant les amorces 3S et 12AS, localisée dans la région 3' non-codante (voir figure 2).
L'analyse de restriction de plusieurs clones confirme que 2 ARNm différents pour le récepteur de la mélatonine sont effectivement présents dans les échantillons analysés.
Les 2 ARNm codent pour des protéines de 354 aniinoacides qui sont très similaires au récepteur Melir de poulet (78 % d'homologie).
Le fragment C(fragment court) a en conséquence également été
dénommé Mell,(a) et le fragment L(fragment long) (comprenant de nombreuses substitutions) a été dénommé Melic((3).

EXEMPLE 2: Construction d'un vecteur pour l'expression du récepteur fonc-tionnel de la mélatonine de type MEL1 A.
Le récepteur de la mélatonine de Xenopus laevis a été cloné confor-mément à la méthode RT-PCR (voir figure 1).
L'ARN est isolé de la peau de Xenopus et transcrit en ADNc à l'aide de la transcriptase inverse.
Une amplification sélective de l'ADNc du récepteur de la mélatonine est réalisée en utilisant des amorces PCR spécifiques de ce récepteur.
Le récepteur amplifié est cloné dans le vecteur d'expression pcDNA3-RSV dérivé du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) et son identité a été
vérifiée par séquençage, comme suit :
Des préligations successives des fragments entre eux, grâce à des enzymes de restriction communes deux à deux, a permis d'insérer la totalité du récep-teur de la mélatonine dans le plasmide pcDNA3/RSV aux sites HindIII/ Bsp120I à
bout franc, sous le contrôle du promoteur du rous sarcoma virus (RSV). Les fragments 2 et 3 sont tout d'abord liés au niveau du site enzymatique commun "HindIII", en position 455 de la séquence codante. Ce dernier est ensuite lié avec le fragment 1 au site commun "Bsu361" en position 202 et avec le fragment 4 au site commun "Xba1" en position 1016. Chaque fragment est préalablement coupé par les deux enzymes indis-pensable pour les ligations successûves. Ce fragment purifié, composé des fragments 1, 2, 3 et 4 dont les extrémités 5' et 3' sont respectivement HindIIl et EcoRI à
bout franc, est enfin inséré dans pcDNA3/RSV'.

EXEMPLE 3: Caractérisation du locus Mell, dans plusieurs espèces de xénopes.
Les récepteurs Meli al (ou Mell Aa) et Mellc(p) (ou Meli Ab) hautement homologues peuvent représenter soit 2 allèles différents au niveau du même locus génomique, soit 2 isoformes codées par différents gènes.
Pour pouvoir répondre à cette question, le fragment 3 codant pour les récepteurs Mellc (ou Mell A) ont été amplifiés par PCR, à partir d'ADN
géno-mique de 43 Xenopus laevis.
Plusieurs de ces animaux sont des animaux consanguins, tandis que d'autres spnt des animaux sauvages importés d'Afrique du Sud.

Les fragments d'ADN amplifiés de la taille attendue sont digérés avec des enzymes de restriction convenable spécifiques des ADNc Mellc(a) ou Mel1,(R) (figure 6).
Chez un individu X. laevis (ff), homozygote pour le complexe majeur d'histocompatibilité et d'autres marqueurs génétiques, seul le gène codant pour le récepteur Mellc(a) est trouvé.

L'analyse PCR d'une seconde grenouille X. laevis (rf), connue pour être hétérozygote pour les marqueurs génétiques mentionnés ci-dessus, révèle la pré-sence des 2 gènes (gène codant pour le récepteur Mell,( ) et gène codant pour le récepteur Mel1c(R (figure 6).

Cette observation confirme l'hypothèse selon laquelle les 2 isoformes du récepteur de la mélatonine sont codées par le même locus génomique.
L'analyse des 41 autres animaux montre la présence soit des 2 gènes (40 individus) soit du gène Mellc(a) seul (1 individu). Aucun animal ne présente que le gène du récepteur Melic(R).

Deux autres espèces de Xenopus ont été étudiées selon la même approche.
L'analyse de l'ADN génomique de X. ruwenzoriensis, une espèce connue pour être polyploïde, révèle la présence du gène codant pour le récepteur Mellc(a). Deux gènes codant pour le récepteur de la mélatonine clairement différents de Mell,(a) et Mel1c(R) ont été révélés par la comparaison des profils de digestion enzymatique de X tropicalis et X. ruwenzoriensis (figure 6).
EXEMPLE 4: Pharmacologie du récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A.
a) Expression stable Le vecteur pcDNA3-RSV contenant la région codante et la région non-codante 3' du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis selon l'exemple 2, est transfecté dans les cellules L de souris.
La veille, 3x105 cellules sont passées dans les flasks de 25 cm2 dans un milieu DMEM 4,5 g/l de glucose; 1 mM glutamax; 1 mM pyruvate; 10 % FCS
(DMEM/PCS). Le jour de la transfection, le milieu est changé (6 ml de DMEM/FCS/flask) et les cellules sont incubées pendant 3 heures à 37 C.
Parallèlement une coprécipitation de l'ADN et du CaPO4 est préparée de la manière suivante :
dans un volume final de 500 l, on mélange 30 g d'ADN carrier (pGEM3Z de Promega), 2 g du vecteur pcDNA3-RSV contenant la région codante et la région non-codante 3' 5 du récepteur de la mélatonine du Xenopus laevis et du CaC12 (250 mM
final)(Solution A). 450 l de cette Solution A sont rajoutés goutte à goutte, en vortexant, à
450 l de HBS 2x (1,64 g NaCI; 1,19 g Hepes; 0,04 g Na2HPO4-12H20 additionnés à 100 ml H20) et le pH est ajusté à 7,12. Le mélange est laissé sans agitation à
température ambiante pendant 45 min. 400 l du coprécipité sont ajoutés dans une flask contenant 10 les cellules L. Après 4 heures d'incubation à 37 C, les cellules sont lavées une fois avec 6 ml de DMEM et ensuite incubées 2:min dans 4 ml de glycérol à 15%. Ensuite les cellules sont lavées deux fois avec du DMEM et laissées dans 6 ml de DMEM/FCS, supplémenté avec 5 mM de nabutyrate à 37 C pendant une nuit. Le lendemain, le milieu est retiré, les cellules sont de nouveau lavées au DMEM/FCS puis incubées pen-15 dant une nuit dans du DMEM/FCS. Le troisième jour les cellules sont distribuées dans des plaques de 96 puits à différentes dilutions (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32) dans un milieu DMEM supplémenté avec : du FBS à 10 % (v/v), 4,5 g/l de glucose, 100 U/inl de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, 1 mM de glutamine et 400 g/ml de (généticine de Gibco Life Technologies). Des clones résistants à la généticine sont testés pour l'expression du récepteur de la mélatonine par liaison avec la (125)Iodo-mélatonine (200 pM) dans un voluine final de 250 l (tampon: 50 mM Tris/HCI pH
7,4 ; 5 mM MgC12 ). La liaison non-spécifique est déterminée en présence de 10 mM
de mélatonine.
b) Expression transitoire Pour l'obtention d'une expression transitoire, les cellules L sont éta-lées soit sur des plaques comportant 6 puits (pour les tests AMPc, 0,5.106 cellu-les/puits), soit dans des boîtes de 10 cm de diamètre (tests GMPc, 2.106 cellules/boîte) et transfectées par la méthode au DEAE-dextran (LOPOTA et al., N.A.R., 1984, 12, 5707-5717), le jour suivant.

Après un lavage avec du PBS, du DMEM sans sérum, contenant de l'Hepès 50 mM, du DEAE-dextran à 200 g/ml et 1 g/ml d'ADN plasmidique plas-mide pcDNA3-RSV), est ajouté.
Après incubation pendant 8 h à 37 C, le milieu est remplacé par du DMSO à 10 % dans du DMEM sans sérum pendant 1,5 min. Les cellules sont lavées avec du PBS et incubées dans un milieu DMEM contenant du sérum de veau foetal à
%. Les essais sont réalisés trois jours après la transfection.
a. Test de liaison du radioligand.
* Méthode 10 Les monocouches de cellules sous-confluentes sont lavées avec du PBS, incubées pendant 5 min à 37 C avec de la trypsine à 20 %, de l'EDTA 2 mM
et remises en suspension dans du DMEM supplémenté avec du sérum de boeuf foetal à
10 % (v/v).
Après centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4 C, les culots cellu-laires sont remis en suspension dans du PBS pH 7,4.
Les suspensions cellulaires sont incubées avec 400 pM de 2-(125I)-iodomélatonine (pour les essais de liaison sur les récepteurs à la mélatonine) ou 200 pM (1251)-CYP (pour les tests de liaison aux récepteurs adrénergiques (32) en l'absence ou en présence de 10 M de ligands froids (mélatonine ou D/L-propranolol, respecti-vement).
Les tests de liaison sont effectués dans les conditions suivantes 60 min à 25 C dans un volume réactionnel final de 0,25 ml. Les réac-tions sont arrêtées à l'aide d'une filtration rapide à travers un filtre de fibre en verre Whatman GF/C, préalablement trempé pendant 30 min dans un tampon PBS contenant 0,3 % de polyéthylène imine (pour réduire les liaisons non-spécifiques).
Les concentrations en protéines sont mesurées sur les homogénats de cellules par la méthode de Bradford (Analytical Biochem., 1976, 72, 248-254), en utilisant le système d'essai des protéines Bio-Rad. La sérum albumine bovine est utili-sée comme standard.

* Résultats Parmi les différents clones exprimant les sites de liaison à la (luI)-iodomélatonine, un clone Mellc(a) exprimant 200 finol de récepteur/mg de protéines totales et un clone Mel1C(R) exprimant 150 finol de récepteur/mg de protéines totales ont été plus particulièrement caractérisés.
Les constantes de dissociation KD de l'agoniste radiomarqué 2-(125 I)-iodomélatonine sont de 160 32 et 143 25 pM respectivement (figure 7A), valeurs qui sont en accord avec celles déterminées pour d'autres récepteurs de la mélatonine de forte affinité, y compris ceux antérieurement clonés, à partir de mélanophores de X.
laevis. Les expériences de compétition ont montré que l'affinité vis-à-vis de différents ligands est caractéristique des récepteurs de la mélatonine (figure 7B et Tableau I).
Tableau I

Ki (nn Ligand Mel lc(a,) Mel1c(R) Xenopus (Ebisawa et al.) Mélatonine-I 0,26 :E 0,25 0,24 0,11 0,11 S20098 0,66 t 0,10 0,41 f 0,14 Mélatonine 1,28 f 0,12 2,10 f 0,56 1,30 6-OH-mélatonine 35,70 f 4,04 46,90 f 1,88 20,00 S22153 195,00 t 6,64 359,00 f 140 NAS 1425,00 327 1771,00 ~ 670 2000,00 Aucune différence significative n'est trouvée entre les récepteurs Mellc a) et Mellc(p) dans les tests de liaison.
b. Détermination des taux intracellulaires d'AMP cyclique.
* Méthode Les cellules mises en croissance dans des plaques contenant 6 puits sont lavées 2 fois avec du DMEM sans sérum, préincubées pendant 15 min à 37 C, puis incubées pendant 15 min à 37 C dans un milieu DMEM contenant 1 mM d'IBMX
(3-isobutyl-1-méthylxanthine) avec ou sans isoprotérénol (10 pM) (essais sur les cellules transfectées transitoires), ou 10 M de forskoline (essais sur les clones cellulaires stables) et des quantités croissantes de mélatonine.

Le tampon d'incubation est éliminé et les cellules sont lysées dans de la soude 1 M pendant 20 min à 37 C. Après neutralisation du pH avec de l'acide acé-tique 1 M, les lysats cellulaires sont centrifugés dans une microcentrifugeuse à 17 000 x g pendant 5 min. Les surnageants sont testés pour leur contenu en AMP cyclique à
l'aide du système AMP cyclique 3H (Amersham). Alternativement, les tests de mesure de l'AMP cyclique peuvent être réalisés dans des plaques contenant 24 puits (0,5 x 106 cellules dans 300 l). Les cellules sont alors incubées pendant 15 min et la réaction est stoppée par l'addition de 100 l d'acide trichloracétique à 20 % et les 'surnageants sont testés pour leur contenu en AMP cyclique.
* Résultats - Les récepteurs de la mélatonine, présentant une forte affinité, sont connus pour participer à l'inhibition de l'activité de l'adénylyl cyclase.

Dans les cellules L exprimant le récepteur Mell al, la mélatonine entraîne l'inhibition de l'accumulation de l'AMPc stimulée par la forskoline (figure 8).
La valeur IC5o de cet effet est d'environ 6.10-10M, ce qui est en accord avec les valeurs obtenues précédemment avec les récepteurs de la mélatonine présentant une forte affinité.
De manière surprenante, dans les cellules exprimant le récepteur Mellc(p), un tel effet ne peut pas être observé même à des concentrations en mélatonine supérieures à 0,1 mM.
Toutefois, les taux de base d'AMPc ne sont affectés par la mélato-nine dans aucune des lignée cellulaires étudiées, même en présence d'IBMX.
L'inhibition de l'accumulation d'AMPc par les récepteurs de la méla-tonine est couplée aux protéines G;., par l'intermédiaire de leurs sous-unités oc.

- Afin de vérifier que le signal produit avec le récepteur Me11c(R) n'est pas dû à un changement quantitatif des sous-unités Gia, des cellules L
contrôles et des clones exprimant soit les récepteurs MellC( ) ou MeliC(R) sont comparés pour ce qui concerne leur contenu en sous-unités Gia, conformément au protocole suivant :

Les cellules sont solubilisées dans un tampon Laemmli contenant 2 %
de SDS et 40 mM de dithiothréitol et soniqué à 4 C. Après centrifugation dans une nzicrocentrifugeuse à 17 000 x g, 50 l de surnageant est séparé en ses composants dans un gel SDS/polyacrylamide à 1.2 %. L'analyse des immunoblots est réalisée comme décrit dans SELZER E. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 1609-1613), avec 84 antisérums qui correspondent aux 3 sous-types de Gia=

L'analyse en Western blot avec un anticorps spécifique reconnaissant les 3 sous-types de Gi , ne permet pas de détecter de différences quantitatives significatives.
- Etude du signal de transduction (signalisation) Il a été étudié après transfection transitoire des 2 isoformes d'ADNc de Mellc dans des cellules L de manière à exclure un artefact potentiel associé à la sélection des clones. Les cellules L sont co-transfectées avec l'ADNc du récepteur adrénergique 02 humain et avec soit l'ADNc du récepteur Mellc(a) ou du récepteur Me11,_(R) ; la co-expression de ces différents récepteurs permet d'étudier sélectivement la sous-population de cellules qui a effectivement internalisé l'ADN exogène.
Trois jours après la transfection, les cellules sont étudiées pour leur inhibition de l'accumulation d'AMP cyclique-mélatonine dépendante, en réponse à
l'isoprotérénol, agoniste (32-RA et pour le nombre de sites de liaison (3 adrénergique et mélatonine (figure 9).
Aucun site de liaison, pour aucun des récepteurs, ne peut être mesuré
dans les cellules contrôles sauvages. Dans les cellules transfectées avec l'ADNc de récepteur adrénergique (32 seul, l'incubation avec de l'isoprotérénol entraîne une aug-mentation d'un facteur 5 de l'AMPc. Dans les cellules co-transfectées avec des quanti-tés identiques (1 g d'ADN plasmidique) d'ADNc codant pour les récepteurs Mellc(a) et adrénergique P2, l'incubation simultanée avec de l'isoprotérénol et de la mélatonine entraîne une diminution significative de l'accumulation d'AMPc (65t5 % du contrôle, p<0,05) (figure 9).

Dans les mêmes conditions, les récepteurs Mel1c(R) ne sont pas capa-bles d'inhiber l'accumulation d'AMPc induite par l'isoprotérénol, malgré
l'expression d'un nombre équivalent de site de liiaison aux récepteurs.

Des résultats similaires sont obtenus, lorsque l'ADNc codant pour le récepteur Mellc-(R) est en excès d'un facteur 10 par rapport à l'ADNc codant pour le récepteur adrénergique (32.

Les récepteurs Mellc( ) inhibent l'accumulation d'AMPc stimulée par 5 la forskoline de manière dose-dépendante avec une valeur IC50 d'environ 6.10-10 M, une valeur en accord avec celle rapportée pour les récepteurs de la mélatonine précé-demment décrite.
En contraste avec ces résultats, la liaison de la mélatonine aux récep-teurs Mell,:(R) ne stimule aucune modulation des taux d'AMPc bien que la forskoline 10 stimule une accumulation d'A.MPc similaire dans les lignées cellulaires exprimant soit les récepteurs Melic(a), soit les récepteurs Mell R).
L'inhibition de la fonction adénylyl cyclase est principalement couplée aux protéines Gi activées.

L'analyse en Western blot montre la présence de quantités similaires 15 de sous-unités a Gil-3 à la fois dans les 2 lignées cellulaires transfectées et dans les cellules L non transfectées contrôles, excluant la sélection potentielle de clones cellu-laires exprimant des quantités peu importantes de protéines Gi. De plus, l'absence de modulation d'AMPc est également observée dans les essais de transfection transitoire, confirmant que le récepteur Meli,:(R) lui-même est incapable d'activer cette voie 20 biologique.

La différence entre les récepteurs Mellr,( ) et Mellc(R), à savoir essentiellement la substitution de 5 aminoacides, localisée dans les domaines intracellu-laires, constitue la base moléculaire de ce phénomène ; dans les récepteurs appartenant à la fan-fflle des récepteurs incluant 7 domaines transmembranaires, ces régions intra-cellulaires sont connues pour être impliquées dans le couplage à la protéine G. Dans des conditions expérimentales appropriées, la mélatonine peut stimuler l'accumulation d'AMPc dans des cellules exprimant l'adénylyl cyclase de type H. Un tel effet n'est pas observable avec les clones stables exprimant le récepteur Meltc(a) ou le récepteur Melic(l3), ni dans les cellules L transfectées de manière transitoire avec les ADNc correspondants.
c. Détermination des taux intracellulaires de GMP çvclique.
* Méthode Les cellules transfectées transitoirement, mises en croissance dans des boîtes ayant un diamètre de 10 cm, sont incubées à 37 C pendant 15 min dans un milieu DMEM sans sérum, en présence ou en l'absence de 1 mM d'IBMX et de quanti-tés croissantes de mélatonine. Le milieu est ensuite remplacé par 1 ml d'éthanol à 65 %
glacé et les extraits cellulaires sont cen,trifugés à 2 000 x g pendant 15 min à 4 C. Les surnageants sont séchés ; les culots sont remis en suspension dans 250 l d'un tampon acétylé.
Le GMP cyclique est dosé conformément au kit EIA (Amersham).
Des voies additionnelles telles que la modulation du contenu en GMPc a été proposée pour le récepteur de la mélatonine (VANECEK J. et al., Brain Res., 1989, 505, 157-159).

Les cellules L exprimant soit les récepteurs Mel1c(a), soit les récep-teurs Mellc(p), sont incubées avec de la mélatonine et les effets sur le GMPc intracellu-laire sont analysés. La mélatonine (jiusqu'à 10 M) n'a aucun effet sur les taux de base de GMPc dans aucune des lignées cellulaires.
Le contenu intracellulaire en GMPc dépend de l'activité opposée des guanylyl cyclases, qui synthétisent le GMPc et des phosphodiestérases (PDE), qui dégradent le GMPc.
L'inhibiteur de PDE, IBMX lorsqu'il est ajouté au milieu, bloque la dégradation du GMPc par le PDE. Dans ces conditions, le taux de GMPc augmente d'un facteur 3, indiquant la présence d'une activité PDE basale dans les cellules L non stimulées.
L'incubation avec de la mélatonine inhibe l'accumulation de GMPc stimulée par le PDE, de manière dose-dépendante dans des cellules L exprimant soit le récepteur Mellc(a), soit le récepteur Mel1c(13) (figure l0A).

La valeur ICso de cet effet (environ 10-9 M) correspond aux valeurs de Ki de la mélatonine obtenues dans les essais de compétition et est proche de la valeur IC50 obtenue lors de l'inhibition de l'adénylyl cyclase par le récepteur Mel1c(a)=
La stimulation par la mélatonine des cellules témoins n'affecte pas l'augmentation de production de GMPc par IBMX. ' La toxine de Pertussis, qui catalyse la ribosylation inactivante d'ADP
des sous-unités a G;/o de protéines G, bloque l'inhibition de l'accumulation d'AMPc liée à la protéine Gi et stimulée par les récepteurs à la mélatonine. La préincubation de cellules avec la toxine de Pertussis abolit complètement l'effet de la mélatonine sur l'accumulation de GMPc, suggérant que cette voie est également dépendante de la protéine Gi/o.

Les 2 ADNc de récepteurs de la mélatonine Mellc( ) et Melic(R) se trouvent soit sous forme longue, soit sous forme courte. L'ADNc du récepteur Melic(a) se présente pour la plupart sous la forme courte (3:1, court:long), alors que l'ADNc du récepteur Mellc(R) est plus abondant sous la forme longue (1:3). Les régions non-traduites en 3' de plusieurs récepteurs de la même famille, tels que le récepteur adrénergique (32 ou le récepteur muscarinique contiennent des déterminants moléculaires impliqués dans la régulation de la stabilité de l'ARNm. Ceci suggère que les ARNm courts et longs codant pour les récepteurs Mell,( ) et Mell,(R) sont soumis à
des régulations différentes.
Dans la mesure où les isoformes du récepteur ont des affinités simi-laires pour la mélatonine mais des signaux biologiques différents, une telle régulation pourrait moduler la réponse cellulaire à la stimulation par la mélatonine.
Le rôle du GMPc comme second messager dans la voie biologique du récepteur à la mélatonine est encore controversé. L'agrégation pigmentaire dans les mélanocytes de Xenopus sont régulés par la mélatonine et par l'AMPc alors que des résultats contradictoires existent en ce qui concerne sa régulation par le GMPc. Le rôle du GMPc dans la stimulation de signaux biologiques liés à la mélatonine dans d'autres systèmes cellulaires n'a pas été approfondie. Un second argument en faveur de la modulation du GMPc par les récepteurs à la mélatonine ressort des essais réalisés sur le tissu d'hypophyse de rat néonatal clans lequel un effet inhibiteur de la mélatonine sur la production de GMPc est observé. Dans les essais tels que rapportés ci-dessus, les récepteurs Mellc(a) et Mel1c(R) activés par la mélatonine inhibent effectivement l'accumulation de GMPc d'une manière dose-dépendante avec une valeur d'IC5o d'environ 10-9 M. Cette inhibition n'est évidente que lorsque l'inhibiteur du PDE
IBMX est inclut dans le milieu d'incubation, sans doute en raison d'une activité basale PDE importante dans les cellules L.
Les données rapportées ci-dessus confirment que les récepteurs de la mélatonine à haute affinité peuvent moduler le GMPc à concentration physiologique de mélatonine et montrent que les récepteurs MeII,,(R) sont fonctionnels en terme de transduction du signal.
L'effet des récepteurs sur le GMPc est complètement aboli par la toxine de Pertussis, indiquant que les protéines G;/o sont impliquées dans la transduc-tion de ce signal.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nul-lement à ceux de ses modes de nûse en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien-nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

LISTE DE SEOUENÇES

(1) INFORMATIONS GENERALES
(i) DEPOSANT:

(A) NOM: ADIR et CIE
(B) RUE: 1 rue Carle Hebert (C) VILLE: COURBEVOIE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92415 CEDEX
(A) NOM: JOCKERS Ralf (B) RUE: 24 rue Lazare Hoche (C) VILLE: PALAISEAU
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 91120 (A) NOM: MARULLO Stefano (B) RUE: 3 Place de l'escadrille Normandie Niemen (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013 (A) NOM: STROSBERG Arthur Donny (B) RUE: 66 rue de Javel (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR DES
RECEPTEURS DE LA MELATONINE ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 95 08947 (B) DATE DE DEPOT: 24-JUL-1995 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1311 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1065 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr I1e Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gin Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr I1e Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn GGG TGG ACG CTT GGA AAT ATC CA7' TGT CAG ATC AGT GGC TTC CTG ATG 336 Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr ACC ATA ACA GTA GTG GTG GTG CAT TT'.C ATA GTC CCT CTT AGT GTT GTG 624 Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gin Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gin Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser 275 280 Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn A].a Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1147 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE:
.(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..1065 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

ATACAAGTTT CTTTTATGGC A.AAAAAAA.AA AAAAAAGAAT TC 1147 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gin Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Tyr Asn Gln Arg Ser Thr Trp Cys Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Gln Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Phe His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Val Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Leu Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1312 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1-.1065 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser,Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gin Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

TTAAAAAAAA P.AAAAAAAAA AGAATTC 1312 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *-(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1147 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARNm (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1...1065 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gin Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gin Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gin Ile Ser Giy Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val Ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leû Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 355 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

Met Met Glu Val Asn Ser Thr Cys Leu Asp Cys Arg Thr Pro Gly Thr Ile Arg Thr Glu Gln Asp Ala Gln Asp Ser Ala Ser Gln Gly Leu Thr Ser Ala Leu Ala Val Val Leu Ile Phe Thr Ile Val Val Asp Val Leu Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ser Val Leu Arg Asn Lys Lys Leu Gln Asn Ala Gly Asn Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Ile Ala Asp Leu Val Val Ala Val Tyr Pro Tyr Pro Val Ile Leu Ile Ala Ile Phe Gln Asn Gly Trp Thr Leu Gly Asn Ile His Cys Gln Ile Ser Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Val Ile Gly Ser Val Phe Asn Ile Thr Ala Ile Ala Ile Asn Arg Tyr Cys Tyr Ile Cys His Ser Leu Arg Tyr Asp Lys Leu Phe Asn Gln Arg Ser Thr Trp Phe Tyr Leu Gly Leu Thr Trp Ile Leu Thr Ile Ile Ala Ile Val Pro Asn Phe Phe Val Gly Ser Leu Gln Tyr Asp Pro Arg Ile Phe Ser Cys Thr Phe Ala Gln Thr Val Ser Ser Ser Tyr Thr Ile Thr Val Val Val Val His Phe Ile Val Pro Leu Ser Val Val Thr Phe Cys Tyr Leu Arg Ile Trp Val Leu Val ile Gln Val Lys His Arg Val Arg Gln Asp Phe Lys Gln Lys Leu Thr Pro Thr Asp Leu Arg Asn Phe Leu Thr Met Phe Val Val Phe Val Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro Leu Asn Phe Ile Gly Leu Ala Val Ala Ile Asn Pro Leu His Val Ala Pro Lys Ile Pro Glu Trp Leu Phe Val Leu Ser Tyr Phe Met Ala Tyr Phe Asn Ser Cys Leu Asn Ala Val Ile Tyr Gly Leu Leu Asn Gln Asn Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Met Ser Leu Trp Thr Pro Arg Leu Leu Phe Leu Asp Thr Ser Arg Gly Gly Thr Glu Gly Leu Lys Ser Lys Pro Ser Pro Ala Val Thr Asn Asn Asn Gln Ala Asp Met Tyr Val *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:

No de la domand= Interntttonale: PCT/

MICRO.ORGANISMES

Fauil4 facuMattre rNaU.s au micro-orpanlsme m..+Uonn1 .n ~o -- 4-- -- . Mn..

da la d.scnptfon t A. IDENTIFICATION Du DâPOT +
D'autrM dlpdta aont -d.ntMls sur un. hultta supplln euakm Nww de t'InaUtutlon I. d,60Ot ~ Collection Nationale de Cultures de Microorganismes AdrvssN d. 19nsUlutfon ds ddpOt (y compris I. cod. oostal .t I. paya) 4 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 oate du dépet = 7 juin 1995 I N- d' fdfe 6 I-1 5 8 3 S. INDICATIONS 3U/pLEMENTA1REf r(l n= r.mpllr au4 al nac.aaus). Un= f.ullle séparla =tt loint= pour La sotte de c.s r.nsNon.m.nts n "En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet européen est demandé, un.échantillon du micro-organisme déposé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant. (règle 28.4) de la CBE)'r.

C. tTATi 0[fItSN[S POUR LIiOUELS LE: )MDICATION3 SONT DONNLE= s(sl Na indluUons n. sont pas donni.s pour tous La Etats dlslpMS) EUROPE JAPON
AUSTRALIE NORVEGE
CANADA NOUVELLE-ZELANDE
CHINE ETATS-UNIS D'AMERIQUE

0. INOICATION= FOURNIES 99PARÉMENT s(à na nenpMr au. fl nlc.ssaln) L.s indlcations Inumiri.a cl-apNs s.ront aoumisas uitérNurnm.nt au Cursau Intsrnatlonal +(spocln.r 14 nsturt pdndralt d.a rndl- catlons p. .+., . No d'orare ou dépOt s) E. C La prla.nts laurlls a/ti rKu. arK la dlmande int.rnationali lorsoue c-tls-cl aét1 daposN (i v{ r r l'ofRce rft.pt.ur) (Fonctlonnalre autorls4) Oate de réception (.n pfo.snance du déposant) par iN Sur.au Intarnatfonal t= P
L
V

(Fonctlonnaln autodal) C
Formulair. PCTlRO/134 (Janrl.r 1Mt) No d4 la domand= Intern4tiondlt: PCT/

MICRO.ORGANIS MES

FWiifd 1iCY1[aUPtl rWtl~a 1Y mICrV-0rpanllm0 mMUpnrti pn ppM .-= =^ __. L~M 21 N Id d~atrtprl0n t A. IOENTIf'1CATION DU DIPOT t O'avtraa ddp6ü sont dantMia sw una hultla suppldmo..taks s U
Nom de t'instRUSf" de 06p0t 4 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Adrsssa de Iinst)tvtlon de dipOt (y compris lo codi roostai N Is pays) 4 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 Datd du dlp0t a N. d'ordra a 7 juin 1995 I-1584 t. (NDICATIONs 3UPPLEM[NTAIR[i (i n= rampilr que d nicassain). Une laui)h Npari= dat )oinl= pour la autt= da cia ranaNpnamenta CD

"En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet européen est demandé, un échantillon du micro-organisme déposé ne sera accessiblé, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant. (règle 28.4) de la CBE)".

C. âTATi DgalliNilf POUR LIiOU[Lf L[f INDICA7IONi :ONT DONN[Es s(si INa indlutlona ne sont pas donnias pow tous laa Etats dldpMa) EUROPE JAPON
AUSTRALIE NORVEGE
CANADA . NOUVELLE-ZELANDE
CHINE ETATS-UNIS D'AMERIQUE

D. INDICATION= FOURNI[s f~PAREM[NT s(~ M rsmpAr t,u~ s~ ndc-ssaln) Laa indlcationa inum{Nss eI.apris st=ront aovmisn ulthNwamdnt au Oursau intarnational r(spdelflar ta nature qdniralo dN indi=
CatiOn= p. =i., a No d'ordré du d1p01 s) . E. C La prtaanta laudlr a dti r.<ua arec la damanda ~ntarnattonala IoraOVa Calla-cl a il/ dipoaN (!t rinn par l'offict= ricaptaur) = (Fonctionnaire sutoriad)N_-~ Dato de rlctrpIJon (an plorananco du diposant) p4r N ffiuraau InldrMtloMl t=
O~
t~
(Fonctlonna)ra autorisl) c O
Formulair= PCTIRO1134 (Janvier 1941)

Claims (17)

Revendications

1~) Séquences nucléiques codant pour des récepteurs fonctionnels de la mélatonine de type MEL1 A ou Mel1c, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées parmi les séquences suivantes : SEQ ID N o 1, SEQ ID N o3, SEQ ID N o5 ou SEQ
ID
N o7.

2~) Fragments des séquences selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe qui comprend :
- une séquence constituée d'un segment de 230 paires de bases nu-cléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1286 des SEQ ID N o 1 ou SEQ
ID
N o5 ;
- une séquence constituée d'un segment de 69 paires de bases nu-cléotidiques, correspondant aux nucléotides 1057-1125 des SEQ ID N o 3 ou SEQ
ID
N o7.

3~) Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques selon la revendication 1 ou la revendication 2.

4~) Protéine et/ou fragments de protéine, caractérisés en ce qu'ils sont codés par une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2 et en ce qu'ils présentent une activité de récepteur de la mélatonine de type MEL1 A
fonctionnel.

5~) Protéine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle pré-sente l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ ID N o2 ou SEQ ID N o6.

6~) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé
en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la reven-dication 2.

7~) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est cons-titué par un plasmide comprenant un promoteur RSV et la SEQ ID N o 1.

8~) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il a été
déposé sous le n o I-1583 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

9~) Vecteur selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est cons-titué par un plasmide comprenant un promoteur RSV et la SEQ ID N o 5.

10~) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il a été
déposé sous le n o I-1584 en date du 7 juin 1995 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

11~) Cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une quel-conque des revendications 6 à 10.

12~) Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par les cellules de la lignée L.

13~) Processus d'expression d'une protéine selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisé en ce que la cellule hôte, résultant de la transforma-tion par un vecteur contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2 codant pour une protéine ayant une activité de récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A, est cultivée de manière à produire et à
transporter ladite protéine exprimée vers la membrane, de telle sorte que les séquences trans-membranaires dudit récepteur soient exposées à la surface de la membrane de l'hôte cellulaire transformé.

14~) Modèle d'étude des récepteurs de la mélatonine de type MEL1 A, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cellules hôtes selon la revendica-tion 11 ou la revendication 12, c'est-à-dire exprimant un récepteur fonctionnel de la mélatonine de type MEL1 A à la surface de leur membrane cellulaire.

15~) Procédé de détection de la capacité d'une substance à se comporter comme ligand vis-à-vis d'une protéine selon la revendication 4 ou la reven-dication 5, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préala-blement transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendi-cations 6 à 10, laquelle cellule hôte exprime ladite protéine (récepteur de la mélato-nine), et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la forma-tion d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance et - la détection de la formation éventuelle d'un complexe de type ligand-protéine.

16~) Procédé pour l'étude de l'affinité d'une protéine selon la reven-dication 4 ou la revendication 5 pour un ou plusieurs ligands déterminés, lequel pro-cédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
- la transformation d'une cellule hôte appropriée par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 ;
- la culture de la cellule hôte transformée, dans des conditions per-mettant l'expression du récepteur de la mélatonine de type MEL1 A, codé par la séquence nucléotidique, et le transfert du récepteur de la mélatonine exprimé
vers la membrane de ladite cellule de sorte que les séquences transmembranaires du récepteur fonctionnel de la mélatonine soient exposées à la surface de la cellule hôte transfor-mée ;
- la mise en contact de ladite cellule avec les ligands déterminés et - la détection d'une réaction affine entre ladite cellule transformée et lesdits ligands déterminés.

17~) Kit pour la détection de l'affinité éventuelle d'un ligand pour une protéine selon la revendication 4 ou la revendication 5, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules hôtes transformées par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 ;
- éventuellement, si nécessaire, des moyens physiques ou chimiques pour induire l'expression d'une protéine (récepteur de la mélatonine de type MEL1 A), codée par une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou la revendication 2, contenue dans un vecteur dont le promoteur est inductible ;
- un ou plusieurs ligands témoins ayant des affinités déterminées pour ladite protéine ; et - des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique de la protéine exprimée.