JP3257120B2 - 遺伝子およびその形質転換体ならびにポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子およびその発現に
関する。より具体的には、本発明は、フミコーラ（Ｈｕ
ｍｉｃｏｌａ）属に属する微生物由来のプロティンジス
ルフィドイソメラーゼ（以下「ＰＤＩ」と略記する）活
性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩
基配列を含む構造蛋白質遺伝子、このような遺伝子を組
み込んだ発現ベクターにより形質転換された形質転換体
およびその形質転換体を用いたＰＤＩ活性を有するポリ
ペプチドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質におけるジスルフィド結合の形成
は、蛋白質の立体構造の保持とそれに伴う活性発現にき
わめて重要な役割を果している。ＰＤＩは、Ａｎｆｉｎ
ｓｅｎらにより始めてジスルフィド結合の形成を触媒す
る酵素として見出され〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
３８，６２８，（１９６３）〕、イン・ビトロ（ｉｎｖ
ｉｔｒｏ）において、還元型やスクランブル型（分子内
部の複数のジスルフィド結合を非天然型に組み換え、不
活性としたもの）のリボヌクレアーゼに作用して、正し
いジスルフィド結合の生成を促進し、活性型とする作用
を持つ。ＰＤＩは哺乳動物の各組織に幅広く分布し、と
くにジスルフィド結合を有する蛋白質の合成や分泌の盛
んな臓器で活性が高い〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ，１０７，２８１，（１９８４）〕。従
って、ＰＤＩはイン・ビトロにおいてもジスルフィド結
合の形成に係わっていると考えられている。

【０００３】現在までに、ＰＤＩは哺乳動物以外にも緑
藻〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ，２６８，６３（１９
９０）〕、酵母〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８，８４６
（１９９０）〕にも存在が知られており、これらの共通
する特徴としては、分子量５２，０００〜６２，０００
の同一なサブユニット２個から成る２量体で等電点４．
０〜４．５という性質を持つことが知られている。ま
た、アミノ酸配列上の特徴としては、サブユニットポリ
ペプチド鎖の中に活性部位と考えられている配列（Trp-
Cys-Gly-His-Cys-Lys)を２個有することが挙げられる。

【０００４】ＰＤＩの産業上の利用性としては、大腸菌
等で生産される組換え蛋白質のリフォールディングへの
適用が考えられる。ここで、リフォールディングとは、
誤ったジスルフィド結合のかかりかたにより本来の生理
活性を示さない蛋白質を、正しいジスルフィド結合にか
け直すことにより活性型に変換することをいう。近年の
急速な遺伝子工学技術の進歩により真核生物の蛋白質が
原核生物で大量生産されるようになってきたが、こうし
て得られる組換え型蛋白質は正しいジスルフィド結合を
欠いていたり、誤った結合のかかり方をもっていたりす
る場合がある。従来、上記のようなジスルフィド結合の
不備を修正するには、化学的な酸化還元反応を利用する
方法（特開平１−１３１１９５号公報）が知られてい
る。しかし、生体内で機能している可能性のあるＰＤＩ
を利用した方が、組換え型蛋白質、特に多数のジスルフ
ィド結合を有する蛋白質の場合にはより有効であると考
えられる。さらに、ＰＤＩをコードする遺伝子を宿主生
物に導入し、目的とする組換え蛋白質とＰＤＩを同時に
発現してリフォールディングさせることも可能である。

【０００５】このようなＰＤＩ自体およびＰＤＩをリフ
ォールディングに利用する手法は、すでに公表されてい
る（特開平４−１９７１７６号、特開平２−４６０号、
特開昭６４−２００８６号および特開昭６３−２９４７
９６号公報）。しかしながら、ここで用いられているＰ
ＤＩは哺乳動物と酵母に由来するものであり、上記のよ
うな目的に使用するには安定性の点で問題がある。そこ
で本発明者らは、従来のＰＤＩに比べ、有意に安定性が
高く、広い温度範囲で使用でき、さらにリフォールディ
ング反応に際して一般的に添加が必要とされるスルフヒ
ドリル基含有還元剤、たとえばジチオスレイトール（以
下「ＤＴＴ」と略記する）に対して幅広い濃度耐性を有
するカビ由来ＰＤＩ活性物質を見い出し、カビ菌体から
の製造法とともに先に提案した（特願平４−１３５２５
４号明細書）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところで、このＰＤＩ
活性物質はリフォールディングに用いる酵素としては従
来のいずれのＰＤＩよりも優れた性質をもつが、生産菌
としてカビを利用するために取得できるＰＤＩの量が限
られており、純度の高いＰＤＩの大量生産技術の開発が
強く望まれていた。

【０００７】従って、本発明の目的は、カビに由来し、
そして上記各種特性に優れたＰＤＩ活性を有す蛋白質
（以下「カビＰＤＩ蛋白質」と略記する場合もある）を
効率よく大量生産できる方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記で得
られたカビＰＤＩ蛋白質のアミノ酸配列について鋭意研
究を行なってきた。その結果、得られた情報をもとにＰ
ＣＲ法によりカビＰＤＩ遺伝子の一部を特異的に増幅
し、得られたＤＮＡ断片をプローブとしてカビＰＤＩ遺
伝子の全長をカビ菌体よりクローニングすることに成功
した。さらに、こうして得られた遺伝子を含む組換えＤ
ＮＡを構築し、かかる組換えＤＮＡで形質転換された形
質転換体を培養すると、カビＰＤＩ活性をもつポリペプ
チドが生産されることを見い出した。

【０００９】従って、本発明によれば、上記カビＰＤＩ
蛋白質をコードする塩基配列を含有する構造遺伝子また
はその誘導体が提供される。カビＰＤＩ蛋白質のうち、
特に優れた特性を有するフミコーラ・インソレンス（Ｈ
ｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の１菌株に由来す
るものは、添付配列表の配列番号１で示されるアミノ酸
配列を有するので、少なくともかかるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を有する遺伝子が好ましいものとして
挙げられる。

【００１０】その一例としては、添付配列表の配列番号
２に示される塩基配列のうち塩基１７０（併記されるア
ミノ酸配列のＳｅｒ（＋１）をコードするコドンの第１
塩基Ｔ）〜１６２４（併記されるアミノ酸配列の前記Ｓ
ｅｒから始まり、アミノ酸４８５個目のＬｅｕをコード
するコドンの第３塩基Ｔ）を少なくとも含んでなるもの
が挙げられる。また、さらなる塩基配列を含むものの具
体例としては、上記配列番号２に示される塩基配列１７
０〜１６２４の５′上流に翻訳開始コドンＡＴＧかまた
はその配列中の１１０（アミノ酸配列−２０のＭｅｔを
コードするコドンの第１塩基Ａ）〜１６９（アミノ酸配
列−１のＡｌａをコードするコドンの第３塩基Ｃ）が付
加された塩基配列の遺伝子が挙げられる。さらに、上記
配列番号２に示される塩基配列１７０〜１６２４の５′
上にＧＡＣまたはＡＴＣＧＡＣが付加された塩基配列の
遺伝子も本発明の範囲内に入る。

【００１１】これらの遺伝子の誘導体としては、それを
発現して得られるポリペプチドが所望のＰＤＩ活性を有
するものであれば限定されるものでなく、例えば、上記
１７０〜１６２４で示される塩基から既知の方法で調製
できるその一部の領域が置換もしくは欠失したものや新
たに一定のオリゴヌクレオチドが挿入されたものが挙げ
られる。また、無論のこと、コドンのゆらぎの範囲内、
すなわち上記配列番号１で示されるアミノ酸配列を変え
ない範囲で上記１７０〜１６２４の塩基配列の塩基が変
化したもの、ならびにそれらの誘導体も本発明の遺伝子
に包含される。したがって、本発明にいう配列表１に示
されるアミノ酸配列の活性同等配列とは、上記誘導体の
発現により生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を意
味する。

【００１２】本発明によれば、上記遺伝子またはその誘
導体を含有するベクターで形質転換された形質転換体が
提供される。かかるベクターは自律増殖し、いわゆる発
現型であることが好ましい。かかる形質転換体は、たと
えば以下のように調製できる。まず、（ｉ）カビ菌体よ
りカビＰＤＩをコードするｍＲＮＡを分離し、（ii）該
ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二
重鎖ＤＮＡを合成し、(iii) 該相補ＤＮＡをファージ又
はプラスミドに組み込み、（iv）得られた組み換えファ
ージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（ｖ）得ら
れた形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、
たとえば抗カビＰＤＩ抗体を用いたイムノアッセイ、放
射性同位元素で標識されたプローブを用いるプラーク・
ハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーシ
ョンにより目的とするＤＮＡを含有するファージ又はプ
ラスミドを単離し、（vi）そのファージまたはプラスミ
ドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、(vii）
該クローン化ＤＮＡをベクター中のプロモーターの下流
に連結し、この発現ベクターで形質転換することにより
調製することができる。

【００１３】カビ菌体からＲＮＡを調製する方法として
は、グアニジンチオシアネート法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９）〕などが挙げられ
る。このようにして得られたＲＮＡを鋳型とし、逆転写
酵素を用いて、たとえばＧｕｂｌｅｒらの方法〔Ｇｅｎ
ｅ，２５，２６３（１９８３）〕に従いｃＤＮＡを合成
し、得られたｃＤＮＡをプラスミドやファージに組み込
む。このようなｃＤＮＡを組み込むプラスミドとして
は、たとえば大腸菌由来のｐＢＲ３２２〔Ｇｅｎｅ，
２，９５（１９７７）〕，ｐＢＲ３２５〔Ｇｅｎｅ，
４，１２１（１９７８）〕，ｐＵＣ１２〔Ｇｅｎｅ，１
９，２５９（１９８２）〕，ｐＵＣ１３〔Ｇｅｎｅ，１
９，２５９（１９８２）〕、枯草菌由来のｐＵＢ１１０
〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ，１１２，６７８（１９８３）〕などが挙げられ、
これらの一部は市販されている。その他のものであって
も、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれをも
用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージ
ベクターとしては、たとえばλｇｔ１１〔Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，１１９４
（１９８３）〕，λＺａｐII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
より入手可）などが挙げられるが、その他のものであっ
ても、宿主内で自律増殖できるものであればよい。プラ
スミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえばＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄＥｄ．Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ．（１９８９）に記載の方法などが挙げられる。ま
たファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法として
は、たとえばＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）に記
載の方法などが挙げられる。このようにして得られたプ
ラスミドやファージベクターは、当業者が容易に入手し
得る適当な宿主たとえば大腸菌、枯草菌などに導入する
ことにより形質転換体を得ることができる。

【００１４】上記大腸菌の例としては、エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ Ｄ
Ｈ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，６０，１６０（１９６８）〕、同ＪＭ１０５〔Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，９，３０９（１９８
１）〕、同ＪＡ２２１〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２
０，５１７（１９７８）〕、同ＨＢ１０１〔Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，４１，４５９（１９６９）〕、同Ｃ６
００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕
などが挙げられる。枯草菌としては、たとえばバチルス
・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ, ２４，２５５（１９８３）〕、
同２０７−２１〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，８７（１
９８４）〕などが挙げられる。

【００１５】プラスミドで宿主を形質転換する方法とし
ては、たとえばＭａｎｉａｔｉｓ．ＴらのＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
（１９８９）に記載のカルシウムクロライド法あるいは
カルシウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが
挙げられる。またファージベクターはたとえば、増殖さ
せた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導入
することができる。こうして得られた形質転換体から既
知の方法、たとえばコロニーハイブリダイゼーション法
〔Ｇｅｎｅ, １０，６３（１９８０）〕、プラークハイ
ブリダイゼーション法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６，１８
０（１９７７）〕およびＤＮＡ塩基配列決定法〔Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５６
０（１９７７）〕を用い、求めるクローンを選抜する。
こうしてクローン化されたカビＰＤＩをコードする塩基
配列を含有するＤＮＡを有するベクターを保持する微生
物を得ることができる。

【００１６】次に、これらの微生物からプラスミドやフ
ァージベクターを単離する。該単離法としては、アルカ
リ抽出法〔Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１，１５１
３（１９７９）〕などが挙げられる。上記クローン化さ
れたカビＰＤＩをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ
を有するプラスミドまたはファージベクターは目的によ
りそのまま、または制限酵素で消化して使用することが
できる。クローン化された遺伝子は、発現に適したベク
ター中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクター
を得ることができる。ベクターとしては、上記大腸菌由
来のプラスミド（たとえば、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐｔｒｐ７８１）、枯草
菌由来プラスミド（たとえば、ｐＵＢ１１０，ｐＴＭ
５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（たとえば、ｐ
ＳＨ１９，ｐＳＨ１５，ｐＧＬＤ９０６，ｐＧＬＤ９０
６−１，ｐＣＤＸ，ｐＫＳＶ−１０）あるいはλファー
ジなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワ
クシニアウィルスなどの動物ウィルスが挙げられる。

【００１７】上述のように、本発明の遺伝子はその５′
末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３′
末端には翻訳終始コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたは
ＴＡＧを有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させ
るにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で用
いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる
宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるも
のでもよい。形質転換する際の宿主が大腸菌である場合
は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
プロモーター、λＰ_L プロモーター、ｌｐｐプロモータ
ーなどが使用できる。また宿主が枯草菌である場合は、
ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎ
ｐプロモーターなどが、そして宿主が酵母である場合
は、ｐ１１０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ
ＡＰ（ＧＬＤ）プロモーター、ＡＤＨプロモーターなど
が都合よく使用される。宿主が動物細胞である場合に
は、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプ
ロモーターなどを使用することができる。

【００１８】このように作製された本発明の遺伝子また
はその誘導体を含有するベクターを用いて、形質転換体
を製造する。宿主としては、当業者が容易に入手し得る
大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物や酵母、カビ、
動物細胞などの真核生物が挙げられる。上記大腸菌、枯
草菌の具体例としては、前記したものと同様のものが挙
げられる。上記酵母の具体例としては、たとえばサッカ
ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、同ＡＨ２２Ｒ- 、同
ＮＡ８７−１１Ａおよび同ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられ
る。上記動物細胞の具体例としては、たとえばサル細胞
ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞、
マウスＬ細胞などが挙げられる。上記大腸菌を形質転換
するには、たとえば、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ. Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）やＧｅｎ
ｅ, １７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従っ
て行うことができる。酵母を形質転換するには、たとえ
ば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７５，１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行う
ことができる。動物細胞を形質転換するには、たとえ
ば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記
載の方法に従って行なわれる。

【００１９】このようにして、本発明の遺伝子またはそ
の誘導体を含有するベクターで形質転換された形質転換
体を得ることができる。また、本発明によれば、上記形
質転換体を栄養培地で培養し、培養物中に前記アミノ酸
配列またはその活性同等配列を含んでなるポリペプチド
を産生蓄積させ、次いでこれを採取することを特徴とす
るＰＤＩ活性を有するポリペプチドの製造方法が提供さ
れる。

【００２０】宿主として大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母
またはカビを使用した形質転換体を培養する場合、培養
に使用される栄養培地としては液体培地が適当であり、
その中には該形質転換体の成育に必要な炭素源、窒素
源、無機物その他必要に応じて微量金属元素もしくはビ
タミンまたは宿主が選択マーカーを有するときはその選
択に寄与する抗生物質、などが添加される。炭素源とし
ては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性でん
ぷん、ショ糖などが、窒素源としては、たとえばアンモ
ニウム塩類、硝酸塩類、ペプトン、肉エキスなどの無機
または有機物質が、無機物としては塩化カルシウム、リ
ン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げら
れる。より具体的には、宿主が大腸菌の場合、用いる培
地は、たとえばグルコースおよびカザミノ酸を含むＭ９
培地〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．ｐ．４３１
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９７２ 〕が好まし
い。培養は通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行い、必
要により通気やかく拌を加える。宿主が枯草菌の場合、
上記培地を用い培養は通常３０〜４０℃で約６〜２４時
間行い、必要により、通気やかく拌を加える。宿主が酵
母の場合、培地としてはたとえばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，７７，４５０５（１９８０）〕、低Ｐｉ培地〔Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．１３８，２６８（１９８６）〕などを使用する。こ
れらの培地のpHは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要
に応じて通気やかく拌を加える。宿主が動物細胞である
形質転換体を培養するさい、培地としては、たとえば約
５〜２０％の牛胎児血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ．１２２，５０１（１９５２）〕、ＲＰＭＩ１６４
０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９，５１
９（１９６７）〕などが挙げられる。pHは約６〜８であ
るのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜
６０時間行い、必要に応じて通気やかく拌を加える。

【００２１】本発明のカビＰＤＩ活性を有するポリペプ
チドは細胞内又は細胞外に産生され、蓄積される。細胞
内の該ポリペプチドを培養物から抽出するにさいして
は、培養後既知の方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや
尿素などの蛋白質変性剤を含む緩衝液やトリトン（Ｔｒ
ｉｔｏｎ）Ｘ−１００（商標）などの界面活性剤を含む
緩衝液中に細胞を懸濁させたのち、遠心分離により該ポ
リペプチドを含む上澄液を得る方法、あるいはガラスビ
ーズによる破砕、超音波処理、リゾチームなどの酵素処
理や凍結融解法によって細胞を破壊したのち、遠心分離
により目的のポリペプチドを含む上澄液を得る方法など
で処理する。これらの上澄液や細胞外に産生され、蓄積
されたポリペプチドを分離、精製するには既知の分離、
精製法を適宜組み合わせて実施すればよい。これらの分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度の
差を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法な
どの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフ
ィーなどの特異的吸着性を利用する方法などが挙げられ
る。上記で得られるポリペプチドの活性は、基質として
スクランブル型リボヌクレアーゼを用いて活性型リボヌ
クレアーゼに変換する速度を測定することにより求めら
れる〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１０７，２８１，（１９８４）〕。

【００２２】

【作用】本発明の製造方法により得られるポリペプチド
は任意の蛋白質中に存在するスルフヒドリルおよびジス
ルフィド間の交換反応を触媒して、天然型のジスルフィ
ド結合を形成する機能を有する。さらに詳しくは、該ポ
リペプチドは溶存酸素や酸化型グルタチオン（ＧＳＳ
Ｇ）−還元型グルタチオン（ＧＳＨ）混合物や、ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール
（２−ＭＥ）などの還元剤の存在下で、還元蛋白質や非
天然型ジスルフィド結合を有する酸化型タンパク質に作
用して天然型のジスルフィド結合を再形成する反応を触
媒する。したがって、本発明により製造されるポリペプ
チドは、分子中にジスルフィド結合を有する蛋白質を、
遺伝子組換え技術を用いて製造する場合に、とりわけ組
み換えＤＮＡの宿主が大腸菌、枯草菌などの原核細胞で
あるときに、その蛋白質分子中に天然型ジスルフィド結
合を効率よく形成する目的で好ましくは使用できる。上
記蛋白質としては、インターフェロン−α、インターフ
ェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン
−１、インターロイキン−２、マクロファージ活性化因
子、リンフォトキシンなどのサイトカインや、トランス
フォーミンググロースファクター、エリスロポエチン、
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、インスリン、ヒト成長ホルモンなどのペプチド
ホルモンや、Ｂ型肝炎ウィルス抗原などの病原微生物抗
原蛋白質や、ペプチダーゼやリゾチームなどの酵素や、
ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンなどの血中蛋白質
成分等が例示される。

【００２３】これらの蛋白質の処理に用いられるポリペ
プチドは、高度に精製されたものでも部分的に精製され
たものでもよい。他方、被処理蛋白質は細胞内や細胞外
に産生され、そして蓄積された状態のものまたはその精
製標品に上記ポリペプチドを直接作用させて処理するこ
とができる。さらに、上記ポリペプチドは水溶性酵素と
して使用してもよいが、それを適当な担体に固定化して
用いることも可能である。また、本発明の形質転換体
に、上記蛋白質をコードする組み換えＤＮＡを二重に感
染させた形質転換体を用いて蛋白質のジスルフィド結合
再形成処理を行うことも可能である。本明細書ならびに
添付の配列表および図面で用いる記号の意味は、次に示
すとおりである。ＰＢＳ：リン酸緩衝溶液、ＤＮＡ：デ
オキシリボ核酸、ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸、
Ａ：アデニン、Ｔ：チミン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシ
ン、ＲＮＡ：リボ核酸、ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮ
Ａ、ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸、ｄＴＴ
Ｐ：デオキシチミジン三リン酸、ｄＧＴＰ：デオキシグ
アノミン三リン酸、ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン
酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、ＥＤＴＡ：エチレン
ジアミン四酢酸、ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム、Ｇ
ｌｙ：グリシン、Ａｌａ：アラニン、Ｖａｌ：バリン、
Ｌｅｕ：ロイシン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｓｅｒ：セ
リン、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｃｙｓ：システィン、Ｍｅ
ｔ：メチオニン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｌｙｓ：リジ
ン、Ａｒｇ：アルギニン、Ｈｉｓ：ヒスチジン、Ｐｈ
ｅ：フェニルアラニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｔｒｐ：ト
リプトファン、Ｐｒｏ：プロリン、Ａｓｎ：アスパラギ
ン、Ｇｌｎ：グルタミン。

【００２４】なお、本発明の製造方法により製造される
活性同等配列を含んでなるポリペプチドは、そのアミノ
酸配列の一部（５％程度まで）が付加、除去、その他の
アミノ酸への置換などがされていてもよい。

【００２５】

【実施例】以下に参考例および実施例を示して本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定される
べきものではない。参考例 ：カビフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏ
ｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓＫＡＳＩ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１２９１１）に由来するＰＤＩの全アミノ酸配列フミコ
ーラ・インソレンスの培養物から単離したＰＤＩの全ア
ミノ酸配列を添付配列表の配列番号１に示す。実施例１ ：フミコーラ・インソレンスのｍＲＮＡ由来ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製 フミコーラ・インソレンス（ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９１
１）（以下、単に「カビ」という）菌体よりグアニジン
イソチオシアネート法（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ，Ｊ．Ｖ．
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ，１８，５２９４（１
９７９））により全ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡよりオ
リゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社）によりポリ（Ａ）ＲＮＡを精製した。
このポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型としてＧｕｂｌｅｒ，Ｕと
Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．の方法（Ｇｅｎｅ，２５，２
６３（１９８３))によりｃＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ
／ＮｏｔＩアダプター（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を付加した後、λＺ
ＡＰII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＥｃｏＲＩ部位に
クローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。実施例２ ：ＲＴ−ＰＣＲ法によるカビＰＤＩ遺伝子の特
異的増幅 ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（宝酒造）を用い、カビＰＤＩ
遺伝子を特異的に増幅した。操作の詳細はメーカーのプ
ロトコールに従った。カビより抽出した全ＲＮＡ（実施
例１）を鋳型に、またランダムヘキサマーをプライマー
としてｃＤＮＡを合成し、次に、得られたｃＤＮＡを鋳
型に、参考例に示された精製カビＰＤＩのアミノ酸配列
の一部(Lys Asp Thr Phe Asp Asp Phe Ile及びGlu Val
Gly HisGln Gln Cys 、配列番号：１参照）に基づいて
合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、Ｐ
ＤＩ遺伝子を特異的に増幅した。プライマーの配列を次
に示す。

【００２６】

【化１】

【００２７】プライマーは、ＤＮＡシンセサイザー（ア
プライドバイオシステムズ社）により合成した。ＰＣＲ
法により、約０．２kbp のＤＮＡを特異的に増幅した。
このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したとこ
ろ、約５０bp及び１５０bpの２つの断片に切断された。
このＤＮＡ断片をそれぞれプラスミドｐＵＣ１１８のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＵＣ１１
８ΔＰＤＩ−１及びｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−２を作製し
た。このプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ，Ｊ.,Ｇｅｎｅ，３３，１１９（１９８５))を
形質転換し、目的とするプラスミドを含有するクローン
ＪＭ１０９／ｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−１及びＪＭ１０９
／ｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−２を選択した。続いて、得ら
れたＪＭ１０９／ｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−１及びＪＭ１
０９／ｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−２よりアルカリ法〔Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．およびＤｏｌｙ，Ｊ．，Ｎｕｃ
ｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１１，１５１３（１９７
９）〕によって、プラスミドｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−１
及びｐＵＣ１１８ΔＰＤＩ−２を抽出精製した。実施例３ ：カビＰＤＩ遺伝子を含むクローンの単離とそ
の塩基配列の決定 大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに実施例１で得たｃＤＮＡラ
イブラリーを感染させ、形質転換プラーク計約４０００
個をＬＢ寒天培地上に形成させた。これをナイロンフィ
ルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）上に
移した後、０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液中で露出変性した組
換えＤＮＡをフィルター上にＵＶ固定した（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎ
ｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）。

【００２８】一方、実施例２に記載のプラスミドｐＵＣ
１１８ΔＰＤＩ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して得
られるＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ
（ベーリンガー社）を用い、メーカーのプロトコールに
従ってジゴキシゲニン標識して、プローブとした。組換
えＤＮＡを固定したフイルターより、ＤＩＧ−ＥＬＩＳ
Ａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガー社）を
用い、メーカーのプロトコールに従って、上記標識プロ
ーブと反応するクローンを検索した。この方法により得
られた陽性クローンλＺＡＰIIＰＤＩ−２の挿入断片を
イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）ｅｘｃｉｓｉｏｎ法（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によりプラスミドＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＳＫ（−)(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にサブク
ローニングし、プラスミドｐＢｌｕｅＰＤＩ−２を作製
した。大腸菌ＸＬ−１ ＢｌｕｅをプラスミドｐＢｌｕ
ｅＰＤＩ−２で形質転換し、得られた組換え体ＸＬ−１
Ｂｌｕｅ／ｐＢｌｕｅＰＤＩ−２よりプラスミドｐＢ
ｌｕｅＰＤＩ−２を上述のアルカリ法により抽出精製し
た。このプラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分は、全長約
１．７kbp であり、その簡単な制限酵素地図を図１に示
す。

【００２９】このｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシ
法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ.,７４，５４６３（１９７７))により決定
した。決定された塩基配列及びこれにより推測される全
アミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。実施例４ ：カビＰＤＩ遺伝子の大腸菌用発現プラスミド
の構築 実施例３で得られたカビＰＤＩｃＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＢｌｕｅＰＤＩ−２を制限酵素ＰｖｕII，ＸｂａＩ
で切断し、カビＰＤＩをコードする領域を含む１．４kb
p ＤＮＡ断片を得た。一方、ｔｒｃプロモーター及びｌ
ａｃレギュレターを有するプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を制限酵素ＮｃｏＩで切断
し、合成オリゴヌクレオチド ５′ ＣＡＴＧＴＣＧＧＡＴＧＴＴＧＴＣＣＡＧ ３′
および ５′ ＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡ ３′を Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合して約４．２kbp ＤＮＡ
断片を得た。次に、このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩ
で切断し、ｔｒｃプロモーター、アンピシリン耐性遺伝
子及びプラスミド複製開始部位を含む約４．２kbp ＤＮ
Ａ断片を分離した。

【００３０】カビＰＤＩ遺伝子を含む前記１．４kbp Ｐ
ｖｕII−ＸｂａＩ断片と、この４．２kbp ＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、カビＰＤＩ発現プラ
スミドｐＴｒｃ９９ＡＰＤＩを構築した（図２）。この
プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０５を形質転換するこ
とによりプラスミドｐＴｒｃ９９ＡＰＤＩを含む形質転
換体ＪＭ１０５／ｐＴｒｃ９９ＡＰＤＩを得た。実施例５ ：大腸菌によるカビＰＤＩ遺伝子の発現 実施例４で得られた形質転換体大腸菌ＪＭ１０５／ｐＴ
ｒｃ９９ＡＰＤＩおよびその対照となる大腸菌ＪＭ１０
５／ｐＴｒｃ９９Ａを１０ｇ／Ｌのバクトトリプトン、
５ｇ／Ｌのバクトイーストエキス、１０ｇ／Ｌの塩化ナ
トリウムおよび５０mg／Ｌのアンピシリンからなる培地
で３７℃で培養し、ＯＤ₆₀₀ が１．０の時、ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を５mMに
なるように添加し、さらに３時間培養した。

【００３１】上記の培養液を遠心分離して菌体を集め、
１／２量の５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH７．４溶液で
洗浄後、菌体を少量のＨ₂ Ｏに懸濁し、これと等量の２
×ＳＤＳ ｇｅｌ−ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９））を加えて、
１００℃，５分間処理した後、超音波処理を行い、遠心
して菌体抽出液を得た。

【００３２】この菌体抽出液について、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い、抗カビＰＤＩ抗体を
用いてウェスタンブロット法により抗原性のあるバンド
を検出し、カビＰＤＩが生成されていることを確認し
た。実施例６ ：大腸菌ＪＭ１０５／ｐＴｒｃ９９ＡＰＤＩに
由来するＰＤＩの精製 実施例４で得られたカビＰＤＩ発現プラスミドｐＴｒｃ
９９ＡＰＤＩを含む大腸菌ＪＭ１０５／ｐＴｒｃ９９Ａ
ＰＤＩを１０ｇ／Ｌのバクトトリプトン、５ｇ／Ｌのバ
クトイーストエキス、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムおよ
び５０mg／Ｌのアンピシリンからなる１Ｌの培地で３７
℃１２時間前培養した。この培養液をさらに、１０ｇ／
Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのカザミノ酸、２mg／Ｌの
ビタミンＢ₁ を含むＭ−９培地２０ｌに移し、さらに３
７℃９時間通気かく拌培養後、ＩＰＴＧを５mMになるよ
うに添加し、さらに４時間培養した。培養液を遠心分離
して菌体３２０ｇを得た。

【００３３】菌体３０ｇを、１０mMＥＤＴＡおよび１mM
ＰＭＳＦを含む２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
５）１５０mLに均一に懸濁し、０℃で１分間ずつ５回超
音波処理を行い、その後遠心分離して菌体抽出液１４５
mLを得た。２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（１０mMＥＤ
ＴＡを含む、pH７．５）で平衡化させたＤＥＡＥ−セル
ロースカラム（２．５×１０cm，５０mL）に添加し、次
いで溶出した。同緩衝液で素通り画分を溶出した後、同
緩衝液に０．５Ｍ ＮａＣｌを添加した溶液による直線
濃度勾配溶出を行った。ＰＤＩ活性を含む分画を集め、
硫酸アンモニウムを加え１Ｍとし、１Ｍ硫酸アンモニウ
ムおよび１０mMＥＤＴＡを含む２０mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH７．５）にて平衡化したブチル−トヨパール
カラム（２．３×５cm ２０mL）に添加し、同緩衝液で
素通り画分を溶出した。その後、硫酸アンモニウムを含
まない同緩衝液による直線濃度勾配溶出を行った。ＰＤ
Ｉ活性画分を集め、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１
０mMＥＤＴＡを含む１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
７．０）に対して一夜透析し、同緩衝液で平衡化させた
ヒドロキシルアパタイトカラム（ＨＡ−１０００；０．
７５×７．５cm、東ソー）に吸着させ、同緩衝液でカラ
ムを洗浄した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１０
mMＥＤＴＡを含む０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH
７．０）による直線濃度勾配溶出によりカビＰＤＩ活性
を有するポリペプチドを溶出した。カビＰＤＩ活性画分
を、１０mMＥＤＴＡを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH
８．０）に対し一夜透析したのち、同緩衝液にて平衡化
したモノＱカラム（０．５×５cm、ファルマシア）に吸
着させ、同緩衝液でカラムを洗浄した後、０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む同緩衝液による直線濃度勾配溶出によ
りカビＰＤＩ活性を有するポリペプチドを溶出した。こ
のようにしてカビＰＤＩ精製標品０．８mg（蛋白質濃
度、０．４mg／mL、容量２mL）を得た。実施例７ ：カビＰＤＩの蛋白化学的性質 実施例６で得られたカビＰＤＩについて以下の蛋白化学
的性質を調べた。 （１）分子量 ２−メルカプトエタノール還元条件下にてＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドスラブゲル電気泳動を行った後〔Ｎａｔ
ｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）〕、クーマシーブ
リリアントブルーＲ２５０染色した結果、カビＰＤＩ活
性を有するポリペプチドは分子量約６００００ダルトン
にバンドを示した（図３）。（対照はそれぞれ６６kDa
：ウシ血清アルブミン、４５kDa ：オボアルブミン、
３０kDa ：カーボニックアンヒドロラーゼ、２２kDa 大
豆トリプシンインヒビターおよび１４kDa リゾチーム：
であった。） （２）アミノ酸組成 上記ポリペプチドを６Ｎ塩酸中にて１１０℃２４時間加
水分解したのちウォーターズ社製アミノ酸組成分析用ピ
コタグシステムにて分析した。システィンについてはあ
らかじめカビＰＤＩを過ギ酸酸化したのち６Ｎ塩酸で加
水分解し、システィン酸として定量した。得られたアミ
ノ酸組成値を表１に示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】（３）アミノ末端アミノ酸配列分析 上記ポリペプチド１２μｇを、気相式自動アミノ末端ア
ミノ酸配列分析機（アプライドバイオシステムズ社製４
７３Ａ型、米国）にて分析した。その結果、カビＰＤＩ
の配列はアミノ末端から順にSer-Asp-Val-Val-Gln-Leu-
Lys-Lys-Asp-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Ile-Lys-Thr-Asn-As
p-Leu であった。 （４）カルボキシル末端アミノ酸分析 上記ポリペプチド１２０μｇをヒドラジン分解法〔Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１７０（１９６６）〕により分
析した。その結果、カルボキシ末端アミノ酸はロイシン
であった。実施例８ ：カビＰＤＩによるスクランブル型リボヌクレ
アーゼのリフォールディング 実施例６で得たカビＰＤＩについて、スクランブル型リ
ボヌクレアーゼのリフォールディング作用を測定した。 （１）材料 スクランブル型リボヌクレアーゼ（Ｓｃ−ＲＮａｓｅ）
は文献〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ．１０７，２８１（１９８４）〕に従ってウシ膵臓リ
ボヌクレアーゼを用い調製した。 （２）リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性の測定 ＲＮａｓｅの活性は文献〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０
８，８４６（１９９０）〕に従って、酵母リボ核酸を基
質として測定した。 （３）測定法 試験管内に５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
５）、１mMＥＤＴＡ中でＳｃ−ＲＮａｓｅ５μＭ、ジチ
オスレイトール５μＭを入れ、カビＰＤＩ １００ngを
加えて５０μＬとし、３０℃で３０分間インキュベーシ
ョンした。インキュベーションの前後で、それぞれ５μ
Ｌのアリコートをとり、ＲＮａｓｅ活性を測定した。こ
の方法によりＳｃＲＮａｓｅの８０％が活性化された。実施例９ ：カビＰＤＩによるスクランブル型組換えニワ
トリリゾチームのリフォールディング 実施例６で得たカビＰＤＩについて、スクランブル型ニ
ワトリリゾチームのリフォールディング作用を測定し
た。 （１）材料 スクランブル型ニワトリリゾチームの調製法はリボヌク
レアーゼの方法に従って行った。 （２）リゾチーム活性の測定法 ０．０５％のエチレングリコールキチンを含む０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液pH５．５ ８０μｌに、リゾチー
ム水溶液２０μｌを添加し、４０℃３０分間反応させ
た。その後、０．５ｇ／Ｌのフェリシアン化カリウム
（０．５Ｍ炭酸２ナトリウム溶液）２００μＬを加え、
１５分間煮沸し、室温に冷却後４２０nmの吸光度を測定
した。 （３）Ｓｃ−リゾチームのリフォールディング ジチオスレイトール５μＭを含む５０mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液（１mMＥＤＴＡ添加、pH７．５）に、カビＰＤ
Ｉ７μｇとＳｃ−リゾチーム３μｇを溶解して２０μＬ
とし、３０℃で１時間インキュベーションした。その
後、リフォールディングされたリゾチームの活性を測定
した。この条件で、Ｓｃ−リゾチームの１２％が再活性
化された。実施例１０ ：カビＰＤＩによる還元型アプロチニンの再
酸化 実施例６で得られたカビＰＤＩについて、還元型アプロ
チニン（ウシ膵臓性トリプシンインヒビター）の酸化作
用を測定した。

【００３６】ジチオスレイトール５μＭを含む５０mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（１mMＥＤＴＡ添加、pH７．５）
１００μＬに、カビＰＤＩ４μｇと還元型アプロチニン
１μｇを溶解し、３０℃で１時間インキュベーションし
た。酸化されたアプロチニンの活性はトリプシンの阻害
作用によって測定した。すなわち、反応液に対し、０．
０５Ｍトリス塩酸緩衝液（０．０２Ｍ塩化カルシウム添
加、pH８．２）７０μＬに溶解したウシトリプシン２．
５μｇを添加し、３７℃で１５分間インキュベーション
した後、２５℃に戻し、トリプシンの合成基質であるベ
ンゾイル−Ｌ−アルギニン−Ｐ−ニトロアニリド（ＢＡ
ＰＡ）４．３５mg／mL、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（０．０２Ｍ塩化カルシウム添加、pH８．２）３０μＬ
を加えた。さらに、２５℃で１０分間インキュベーショ
ンした後、３０％酢酸５０μＬを加え、反応を停止させ
て４１０nmの吸光度を測定した。この条件により還元型
アプロチニンの３％が酸化された。

【００３７】

【発明の効果】本発明は、哺乳動物および酵母などに由
来するプロティンジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）
に比し、安定性が有意に高く、広い温度範囲で使用で
き、しかもリフォールディング反応に際して一般に添加
が必要とされるスルフヒドリル基含有還元剤（たとえ
ば、ジチオスレイトール）に対して幅広い濃度耐性を示
すＰＤＩ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
を提供する。また、このような遺伝子を含有する発現ベ
クターで形質転換された形質転換体およびそれの培養に
よる前記ポリペプチドの製造方法も提供する。本発明に
より前記ポリペプチドを安定に効率よく提供できる。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４８５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ser Asp Val Val Gln Leu Lys Lys Asp Thr Phe Asp Asp Phe Ile 1 5 10 15 Lys Thr Asn Asp Leu Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys 20 25 30 Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Glu Glu Ala Ala Thr 35 40 45 Thr Leu Lys Glu Lys Asn Ile Lys Leu Ala Lys Val Asp Cys Thr 50 55 60 Glu Glu Thr Asp Leu Cys Gln Gln His Gly Val Glu Gly Tyr Pro 65 70 75 Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Asn Val Ser Pro Tyr Lys 80 85 90 Gly Gln Arg Lys Ala Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Met Ile Lys Gln 95 100 105 Ser Leu Pro Ala Val Ser Glu Val Thr Lys Asp Asn Leu Glu Glu 110 115 120 Phe Lys Lys Ala Asp Lys Ala Val Leu Val Ala Tyr Val Asp Ala 125 130 135 Ser Asp Lys Ala Ser Ser Glu Val Phe Thr Gln Val Ala Glu Lys 140 145 150 Leu Arg Asp Asn Tyr Pro Phe Gly Ser Ser Ser Asp Ala Ala Leu 155 160 165 Ala Glu Ala Glu Gly Val Lys Ala Pro Ala Ile Val Leu Tyr Lys 170 175 180 Asp Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Phe Ser Glu Lys Phe Glu Val 185 190 195 Glu Ala Ile Glu Lys Phe Ala Lys Thr Gly Ala Thr Pro Leu Ile 200 205 210 Gly Glu Ile Gly Pro Glu Thr Tyr Ser Asp Tyr Met Ser Ala Gly 215 220 225 Ile Pro Leu Ala Tyr Ile Phe Ala Glu Thr Ala Glu Glu Arg Lys 230 235 240 Glu Leu Ser Asp Lys Leu Lys Pro Ile Ala Glu Ala Gln Arg Gly 245 250 255 Val Ile Asn Phe Gly Thr Ile Asp Ala Lys Ala Phe Gly Ala His 260 265 270 Ala Gly Asn Leu Asn Leu Lys Thr Asp Lys Phe Pro Ala Phe Ala 275 280 285 Ile Gln Glu Val Ala Lys Asn Gln Lys Phe Pro Phe Asp Gln Glu 290 295 300 Lys Glu Ile Thr Phe Glu Ala Ile Lys Ala Phe Val Asp Asp Phe 305 310 315 Val Ala Gly Lys Ile Glu Pro Ser Ile Lys Ser Glu Pro Ile Pro 320 325 330 Glu Lys Gln Glu Gly Pro Val Thr Val Val Val Ala Lys Asn Tyr 335 340 345 Asn Glu Ile Val Leu Asp Asp Thr Lys Asp Val Leu Ile Glu Phe 350 355 360 Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr 365 370 375 Glu Glu Leu Gly Ala Leu Tyr Ala Lys Ser Glu Phe Lys Asp Arg 380 385 390 Val Val Ile Ala Lys Val Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp 395 400 405 Glu Ile Gln Gly Phe Pro Thr Ile Lys Leu Tyr Pro Ala Gly Ala 410 415 420 Lys Gly Gln Pro Val Thr Tyr Ser Gly Ser Arg Thr Val Glu Asp 425 430 435 Leu Ile Lys Phe Ile Ala Glu Asn Gly Lys Tyr Lys Ala Ala Ile 440 445 450 Ser Glu Asp Ala Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr Glu Thr Thr Thr 455 460 465 Glu Thr Ala Thr Lys Ser Glu Glu Ala Ala Lys Glu Thr Ala Thr 470 475 480 Glu His Asp Glu Leu 485 配列番号：２ 配列の長さ：１７５５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：フミコーラ インソレンス (Humicola insolen
s) 株名： 配列： CGCATACCTG CAGGGTATCA ATTGGAATTC AATTCCTTGG TTGCGGTGAT 50 TCCTCCTATC TGTCCTTTTC TGCCTTTACT TTAAGTAGCC CAGAAACAGG 100 AACATCGCG ATG CAT AAG GCC CAG AAG TTC GCG CTC GGC CTG CTT 145 Met His Lys Ala Gln Lys Phe Ala Leu Gly Leu Leu -20 -15 -10 GCC GCG GCG GCA GTT GCC ACA GCT TCG GAT GTT GTC CAG CTG AAG 190 Ala Ala Ala Ala Val Ala Thr Ala Ser Asp Val Val Gln Leu Lys -5 1 5 AAG GAC ACC TTC GAC GAC TTC ATC AAG ACG AAT GAC CTT GTT CTC 235 Lys Asp Thr Phe Asp Asp Phe Ile Lys Thr Asn Asp Leu Val Leu 10 15 20 GCC GAA TTC TTC GCG CCG TGG TGC GGT CAC TGC AAG GCT CTC GCC 280 Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala 25 30 35 CCC GAG TAC GAG GAG GCT GCG ACC ACA CTG AAG GAG AAG AAC ATC 325 Pro Glu Tyr Glu Glu Ala Ala Thr Thr Leu Lys Glu Lys Asn Ile 40 45 50 AAG CTC GCC AAG GTG GAC TGC ACA GAG GAG ACG GAC CTC TGC CAA 370 Lys Leu Ala Lys Val Asp Cys Thr Glu Glu Thr Asp Leu Cys Gln 55 60 65 CAA CAT GGT GTT GAG GGC TAC CCG ACT CTC AAG GTC TTC CGC GGC 415 Gln His Gly Val Glu Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly 70 75 80 CTT GAC AAC GTC TCC CCC TAC AAG GGC CAG CGC AAG GCT GCT GCT 460 Leu Asp Asn Val Ser Pro Tyr Lys Gly Gln Arg Lys Ala Ala Ala 85 90 95 ATC ACC TCG TAC ATG ATC AAG CAG TCT CTG CCC GCC GTG TCC GAG 505 Ile Thr Ser Tyr Met Ile Lys Gln Ser Leu Pro Ala Val Ser Glu 100 105 110 GTC ACG AAG GAC AAC CTG GAG GAG TTC AAG AAG GCC GAC AAG GCC 550 Val Thr Lys Asp Asn Leu Glu Glu Phe Lys Lys Ala Asp Lys Ala 115 120 125 GTC CTT GTC GCC TAT GTG GAT GCT TCC GAC AAG GCG TCC AGT GAG 595 Val Leu Val Ala Tyr Val Asp Ala Ser Asp Lys Ala Ser Ser Glu 130 135 140 GTT TTC ACC CAG GTC GCC GAG AAG CTG CGC GAC AAC TAC CCG TTC 640 Val Phe Thr Gln Val Ala Glu Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Pro Phe 145 150 155 GGC TCC AGC AGC GAT GCT GCG CTG GCC GAG GCT GAG GGC GTC AAG 685 Gly Ser Ser Ser Asp Ala Ala Leu Ala Glu Ala Glu Gly Val Lys 160 165 170 GCT CCC GCT ATC GTC CTT TAC AAG GAC TTT GAT GAG GGC AAG GCG 730 Ala Pro Ala Ile Val Leu Tyr Lys Asp Phe Asp Glu Gly Lys Ala 175 180 185 GTC TTC TCC GAG AAG TTC GAG GTG GAG GCG ATC GAG AAG TTC GCC 775 Val Phe Ser Glu Lys Phe Glu Val Glu Ala Ile Glu Lys Phe Ala 190 195 200 AAG ACG GGC GCC ACC CCG CTC ATT GGC GAG ATT GGC CCC GAA ACC 820 Lys Thr Gly Ala Thr Pro Leu Ile Gly Glu Ile Gly Pro Glu Thr 205 210 215 TAC TCC GAC TAC ATG TCG GCC GGC ATC CCT CTG GCC TAC ATT TTC 865 Tyr Ser Asp Tyr Met Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ile Phe 220 225 230 GCC GAA ACG GCC GAG GAG CGG AAG GAG CTC AGC GAC AAG CTC AAG 910 Ala Glu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Glu Leu Ser Asp Lys Leu Lys 235 240 245 CCG ATC GCC GAG GCT CAG CGC GGC GTC ATT AAC TTT GGT ACT ATT 955 Pro Ile Ala Glu Ala Gln Arg Gly Val Ile Asn Phe Gly Thr Ile 250 255 260 GAC GCC AAG GCT TTT GGT GCC CAC GCC GGC AAC CTG AAC CTG AAG 1000 Asp Ala Lys Ala Phe Gly Ala His Ala Gly Asn Leu Asn Leu Lys 265 270 275 ACC GAC AAG TTC CCC GCC TTC GCC ATC CAG GAG GTC GCC AAG AAC 1045 Thr Asp Lys Phe Pro Ala Phe Ala Ile Gln Glu Val Ala Lys Asn 280 285 290 CAG AAG TTC CCC TTC GAT CAG GAG AAG GAG ATC ACC TTC GAG GCG 1090 Gln Lys Phe Pro Phe Asp Gln Glu Lys Glu Ile Thr Phe Glu Ala 295 300 305 ATC AAG GCT TTC GTC GAC GAC TTT GTC GCC GGT AAG ATC GAG CCC 1135 Ile Lys Ala Phe Val Asp Asp Phe Val Ala Gly Lys Ile Glu Pro 310 315 320 AGC ATC AAG TCG GAG CCG ATC CCT GAG AAG CAG GAG GGC CCC GTC 1180 Ser Ile Lys Ser Glu Pro Ile Pro Glu Lys Gln Glu Gly Pro Val 325 330 335 ACC GTC GTC GTT GCC AAG AAC TAC AAT GAG ATC GTC CTG GAC GAC 1225 Thr Val Val Val Ala Lys Asn Tyr Asn Glu Ile Val Leu Asp Asp 340 345 350 ACC AAG GAT GTG CTG ATT GAG TTC TAC GCC CCG TGG TGC GGC CAC 1270 Thr Lys Asp Val Leu Ile Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His 355 360 365 TGC AAG GCC CTG GCT CCC AAG TAC GAG GAG CTC GGC GCC CTG TAT 1315 Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr Glu Glu Leu Gly Ala Leu Tyr 370 375 380 GCC AAG AGC GAG TTC AAG GAC CGG GTC GTC ATC GCC AAG GTT GAT 1360 Ala Lys Ser Glu Phe Lys Asp Arg Val Val Ile Ala Lys Val Asp 385 390 395 GCC ACG GCC AAC GAC GTT CCC GAT GAG ATC CAG GGA TTC CCC ACC 1405 Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp Glu Ile Gln Gly Phe Pro Thr 400 405 410 ATC AAG CTG TAC CCG GCC GGT GCC AAG GGT CAG CCC GTC ACC TAC 1450 Ile Lys Leu Tyr Pro Ala Gly Ala Lys Gly Gln Pro Val Thr Tyr 415 420 425 TCT GGC TCG CGC ACT GTC GAG GAC CTC ATC AAG TTC ATC GCC GAG 1495 Ser Gly Ser Arg Thr Val Glu Asp Leu Ile Lys Phe Ile Ala Glu 430 435 440 AAC GGC AAG TAC AAG GCC GCC ATC TCG GAG GAT GCC GAG GAG ACG 1540 Asn Gly Lys Tyr Lys Ala Ala Ile Ser Glu Asp Ala Glu Glu Thr 445 450 455 TCG TCC GCA ACC GAG ACG ACC ACC GAG ACG GCC ACC AAG TCG GAG 1585 Ser Ser Ala Thr Glu Thr Thr Thr Glu Thr Ala Thr Lys Ser Glu 460 465 470 GAG GCT GCC AAG GAG ACG GCG ACG GAG CAC GAC GAG CTC TAG 1627 Glu Ala Ala Lys Glu Thr Ala Thr Glu His Asp Glu Leu *** 475 480 485 AAGACTTGTC GTACATGTAT TTTACGAAAT GCTTTCTTGG GTTTTTCATT 1677 AGGGACCATA GGCACGCGGA TCCAGGGGCC CGGTATTCTT GGGATTGGGT 1727 TTTGCCAAAA TACCACCGCG CATCTATG 1755

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で得られるプラスミドに含まれるｃＤ
ＮＡ部分の簡単な制限酵素地図を示す。

【図２】実施例４で得られるプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
ＰＤＩの構築手順を示す。

【図３】実施例７によるＰＤＩ活性を有するポリペプチ
ドのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の泳動パ
ターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 梶野 勉 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 今枝 孝夫 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 皿井 希代子 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/21 C12N 9/90 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列から成る
   ポリペプチドをコードするか、あるいは配列番号１にお
   いて１または数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は他
   のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配
   列を有し且つプロティンジスルフィドイソメラーゼ活性
   を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の遺伝子を含んで成るベ
   クター。
3. 【請求項３】 請求項２の記載のベクターにより形質転
   換された形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の形質転換体を培養し、
   培養物からプロティンジスルフィドイソメラーゼ活性を
   有するポリペプチドを採取することを特徴とする当該ポ
   リペプチドの製造方法。