CN100390275C

CN100390275C - 高保真逆转录酶及其用途

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Publication number: CN100390275C
Application number: CNB018065147A
Authority: CN
Inventors: R·J·波特; K·罗森托尔
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2000-03-15
Filing date: 2001-03-15
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2021-03-15
Also published as: EP1266024A4; US8541219B2; AU4741301A; US20110165651A1; NZ520908A; US20030003452A1; AU2001247413B2; US7056716B2; US20060094050A1; WO2001068895A1; JP5148799B2; EP1266024A1; CA2401417A1; CN1422336A; JP2003526378A

Abstract

本发明涉及保真度增加(或错掺率降低)和/或末端脱氧核苷酸转移酶活性的逆转录酶。具体而言，本发明涉及通过修饰或突变逆转录酶中的特定位置来生成这些逆转录酶的方法。本发明还涉及包含编码本发明逆转录酶的基因的核酸分子、包含这些核酸分子的宿主细胞、和使用宿主细胞生产逆转录酶的方法。本发明的逆转录酶特别适用于核酸合成、测序、扩增、和cDNA合成。

Description

高保真逆转录酶及其用途

发明领域

本发明属于分子和细胞生物学领域。一般而言，本发明涉及逆转录酶，和用于逆转录核酸分子(尤其是信使RNA分子)的方法。具体而言，本发明涉及经突变或经修饰增加了保真度和/或降低了末端脱氧核苷酸转移酶活性的逆转录酶，和使用这些逆转录酶或组合物来生成、扩增核酸分子(特别是cDNA分子)、或测序的方法。本发明还涉及通过这些方法生成的核酸分子，和这些核酸分子用于生成期望多肽的用途。本发明还关注包含这些酶或组合物的试剂盒。

发明背景

cDNA和cDNA文库

在检查生物体、组织、或细胞的结构和生理学时，常常希望测定它的遗传内容。生物体的遗传构架编码在生物体的体细胞和生殖细胞所含脱氧核糖核苷酸(DNA)的核苷酸碱基双链序列中。特定DNA区段的遗传内容或基因只有在生成基因所编码的蛋白质时才显现出来。为了生成蛋白质，通过聚合酶生成DNA双螺旋的一条链(“编码”链)的互补拷贝，产生具有特定序列的核糖核酸(RNA)。由于它包含来自DNA的、用于生成蛋白质的遗传信息，因此将RNA的这种特定类型称为信使RNA(mRNA)。

在指定的细胞、组织、或生物体中，存在无数种mRNA，每一种都编码一种单独的和特定的蛋白质。这一事实为对研究组织或细胞中的遗传表达感兴趣的研究人员提供了有力工具--可以分离mRNA分子，并通过多种分子生物学技术进行进一步操作，从而能够阐明细胞、组织、或生物体的全部功能遗传内容。

研究基因表达的一种常用方法是生成互补DNA(cDNA)克隆。在此技术中，由生物体的细胞或组织的提取物分离来自生物体的mRNA分子。这种分离常常采用复合了胸苷(T)聚合物的固相层析基质，诸如纤维素或琼脂糖。由于大多数真核mRNA分子的3’末端包含一串腺苷(A)碱基，而且A结合T，因此可以快速的将mRNA分子与组织或细胞提取物中的其它分子和物质纯化分开。可以使用逆转录酶(RT)由这些纯化的mRNA分子生成cDNA拷贝，产生单链cDNA分子。然后可以通过DNA聚合酶的作用将单链cDNA转变成最初mRNA的(从而也是生物体基因组中所包含的、编码该mRNA的最初双链DNA序列的)完整双链DNA拷贝(即双链cDNA)。然后可以将蛋白质特异的双链cDNA插入质粒或病毒载体，并将其导入宿主细菌、酵母、或植物细胞。然后在培养基中培养宿主细胞，产生包含(或在许多情况中表达)目的基因的宿主细胞群。

由分离mRNA至将cDNA插入质粒或载体以培养包含分离基因的宿主细胞群的这整个过程称为“cDNA克隆”。若由许多不同的mRNA制备cDNA，则生成的一批cDNA称为“cDNA文库”。这一术语适当的说明这批cDNA代表了包含来源细胞、组织、或生物体中存在的功能遗传信息的基因“群”。这些cDNA文库的基因型分析可以产生关于衍生它们的生物体的结构和功能的许多信息。

逆转录病毒的逆转录酶

已经深入研究了逆转录病毒RT的3种原型形式。莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)RT包含具有依赖RNA的DNA聚合酶和RNA酶H活性的78kDa单一亚基。已经克隆了该酶，并在大肠杆菌中表达成完全有活性的形式(回顾见Prasad，V.R.，《Reverse Transcriptase》即逆转录酶，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社，第135页，1993)。人免疫缺陷病毒(HIV)RT是p66和p51亚基的异二聚体，其中小亚基通过蛋白水解切割衍生自大亚基。p66亚基具有依赖RNA的DNA聚合酶和RNA酶H结构域二者，而p51亚基只具有DNA聚合酶结构域。已经克隆了有活性的HIVp66/p51亚基，并在许多表达宿主(包括大肠杆菌)中成功表达(回顾见Le Grice，S.F.J.，《Reverse Transcriptase》即逆转录酶，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社，第163页，1993)。在HIV p66/p51异二聚体中，51kD亚基没有催化活性，而66kD亚基具有DNA聚合酶和RNA酶H活性二者(Le Grice，S.F.J.等人，EMBO Journal，10：3905，1991；Hostomsky，Z.等人，J.Virol，66：3179，1992)。禽类肉瘤-白血病病毒(ASLV)RT，包括但不限于劳斯肉瘤病毒(RSV)RT、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)RT、禽类成红细胞增生病毒(AEV)辅助病毒MCAVRT、禽类髓细胞增生病毒MC29辅助病毒MCAV RT、禽类网状内皮增生病毒(REV-T)辅助病毒REV-A RT、禽类肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV RT、禽类肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV RT、劳斯伴随病毒(RAV)RT、和成髓细胞瘤伴随病毒(MAV)RT，也是两种亚基即α(大约62kDa)和β(大约94kDa)的并二聚体，其中α通过蛋白水解切割衍生自β(回顾见Prasad，V.R.，《Reverse Transcriptase》即逆转录酶，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社，第135页，1993)。ASLV RT还可以额外存在两种有催化活性的结构形式，即ββ和α(Hizi，A.和Joklik，W.K.，J.Biol.Chem.，252：2281，1977)。沉降分析提出，αβ和ββ是二聚体，而且α形式在单体与二聚体形式之间存在平衡(Grandgenett，D.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，70：230，1973；Hizi，A.和Joklik，W.K.，J.Biol.Chem.，252：2281，1977；和Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3372，1988)。ASLV αβ和ββ RT是在相同蛋白质复合物中包含3种不同活性即DNA聚合酶、RNA酶H、和DNA内切核酸酶(整合酶)活性的逆转录病毒RT的唯一已知范例(回顾见Skalka，A.M.，《ReverseTranscriptase》即逆转录酶，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社，第193页，1993)。α形式缺乏整合酶结构域和活性。

已经克隆并表达了ASLV RT各个亚基的多种形式，包括通常通过蛋白水解加工成β的98kDa前体多肽以及由β羧基末端切下的4kDa多肽(Alexander，F.等人，J.Virol.，61：534，1987；和Anderson，D.等人，FOCUS，17：53，1995)，和成熟β亚基(Weis，J.H.和Salstrom，J.S.，美国专利号4,663,290，1987；和Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3372，1988)。还已经由表达克隆RSV β基因的大肠杆菌细胞纯化了异二聚体RSVαβRT(Chernov，A.P.等人，Biomed.Sci.，2：49，1991)。

还已经鉴定了逆转录酶的多种结构域，例如拇指、指、和掌区。拇指区特别重要，因为据显示该区中的突变可降低移码发生率。

逆转录效率和保真度

如上所述，由RT介导的逆转录进行的mRNA至cDNA的转变是研究由克隆基因表达的蛋白质的必需步骤。然而，由于至少两个原因，使用未修饰RT催化逆转录是低效的。一是，主要由于RT中存在内在的RNA酶H活性，在起始或完成逆转录前，RT有时使RNA模板不能被拷贝。二是，RT通常具有低保真度。换言之，RT在cDNA合成过程中掺入错配碱基，从而生成具有序列错误的cDNA产物。事实上，据显示，在cDNA合成过程中，HIV RT每3000-6000个核苷酸掺入一个碱基错误，AMV RT每10,000个核苷酸掺入一个碱基错误(Berger，S.L.等人，Biochemistry，22：2365-2372，1983；Krug，M.S.和Berger，S.L.，Meth.Enzymol.，152：316，1987；和Berger等人，Meth.Enzymol.，275：523，1996)。

消除RT的RNA酶H活性可以排除第一个问题并改进逆转录效率(Gerard，G.F.等人，FOCUS，11(4)：60，1989；和Gerard，G.F.等人，FOCUS，14(3)：91，1992)。然而，这些RT(“RNA酶H^-”形式)没有解决第二个问题即改进逆转录的保真度。本发明着手解决这一要求。

发明概述

本发明提供了逆转录酶、包含这些酶的组合物、和可用于克服逆转录效率限制的方法。一般而言，本发明提供了包含一种或多种具有逆转录酶活性的本发明多肽、用于高保真的逆转录核酸分子的组合物。这些组合物还可包含一种或多种核苷酸、合适的缓冲液、和/或一种或多种DNA聚合酶。本发明的组合物还可包含一种或多种寡核苷酸引物。

优选修饰或突变本发明的逆转录酶从而增加或增强酶的保真度。本发明的其它实施方案包括经修饰降低或消除了末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的逆转录酶。本发明的逆转录酶优选单链(单亚基)的或多链(多亚基)的，而且降低或充分降低了RNA酶H活性，最优选的是选自下组的酶：莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)H^-逆转录酶、劳斯肉瘤病毒(RSV)H^-逆转录酶、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)H^-逆转录酶、劳斯伴随病毒(RAV)H^-逆转录酶、成髓细胞瘤伴随病毒(MAV)H^-逆转录酶、和人免疫缺陷病毒(HIV)H^-逆转录酶或其它ASLVH^-逆转录酶。在优选组合物中，逆转录酶以工作浓度存在。

本发明的酶包括在形成多聚体后(如二聚体)或作为单个蛋白质分子(即单体形式)展示逆转录酶活性的逆转录酶。在形成多聚体后展示逆转录酶活性的逆转录酶的范例包括AMV、RSV、和HIV逆转录酶。作为单独的和个别的蛋白质展示逆转录酶活性的逆转录酶的范例包括M-MLV和RSV逆转录酶。

本发明的多聚体逆转录酶可以形成同多聚体或异多聚体。换言之，多聚体蛋白质复合物的亚基可以是相同的或不同的。异二聚体逆转录酶的一个范例是AMV逆转录酶，它由一级氨基酸序列不同的两种亚基组成。更具体的说，如上所述，AMV逆转录酶可能由两种亚基组成，其中一种亚基是通过另一种亚基的蛋白水解加工生成的。因而，二聚体AMV逆转录酶可能由共享具有氨基酸序列同一性的区域、不同大小的亚基组成。

具体而言，本发明涉及突变型或经修饰的逆转录酶，其中进行了一个或多个氨基酸变化，使得酶在核酸合成中更忠实(更高保真度)。表1列出了一些逆转录酶中优选用于生成具有更高保真度的聚合酶的突变或修饰位点。可以突变其它逆转录酶中的相似或等同位点或者相应位点以生成具有更高保真度的逆转录酶。

表1：

RT 氨基酸

M-MLV Y64，R116，K152，Q190，T197，V223，D124，H126，Y133

AMV W25，R76，K110，Q149，T156，M182

RSV W25，R76，K110，Q149，T156，M182

HIV W24，R78，G112，Q151，A158，M184

本发明还包括具有下列突变的M-MLV RT：V223H、Q190F、T197A、T197E、Y64W、R116M、和K152R，以及具有相应突变或修饰的RT。

本发明还致力于突变型或经修饰的逆转录酶，其中进行一个或多个氨基酸变化，从而降低或消除了末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性。优选用于这些突变的位点包括但不限于M-MLV RT的F309、T197、和Y133。M-MLV RT的具体突变或修饰包括T197E，它将TdT活性降低至本文所述测定方法不可检测的水平；和T197A，它将TdT活性降低至较低程度。可以突变其它逆转录酶中的相似或等同位点或者相应位点以生成TdT活性降低、充分降低、或消除的逆转录酶。这些等同位点的范例包括但不限于HIV RT的W266和I94、AMV RT的W267和A95、RSV RT的W267和A95。

在具体实施方案中，本发明的逆转录酶可能不包括M-MLV RT、HIVRT、AMV RT、或RSV RT。因而，例如，本发明的某些实施方案包括保真度增加但不是HIV RT的RT。

本发明还致力于包含编码本发明突变型或经修饰逆转录酶的基因或核酸分子的DNA分子(优选载体)，和包含这些DNA分子的宿主细胞。可以使用任何数目的宿主来表达目的基因或核酸分子，包括原核和真核细胞。优选将原核细胞用于表达本发明的聚合酶。依照本发明的优选原核宿主是大肠杆菌。

本发明还涉及生成本发明逆转录酶的方法，所述方法包括：(a)培养包含编码本发明逆转录酶的基因或核酸分子的宿主细胞(优选的是这些RT基因包含于宿主细胞内的载体中)；(b)表达所述基因或核酸分子；并(c)由所述宿主细胞分离所述逆转录酶。

本发明还致力于生成一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括：(a)将一种或多种核酸模板(优选一种或多种RNA模板，最优选一种或多种信使RNA模板)与一种或多种本发明逆转录酶混合；并(b)在足以生成与所述一种或多种核酸模板的整个或部分互补的第一核酸分子的条件下将混合物保温。在一个优选的实施方案中，第一核酸分子是单链cDNA。依照本发明这一方面适合于逆转录的核酸模板包括任何核酸分子或核酸分子群(优选RNA，最优选mRNA)，特别是那些衍生自细胞或组织的核酸分子。在一个优选方面，依照本发明将mRNA分子群(许多不同mRNA分子，通常得自细胞或组织)用于构建cDNA文库。核酸模板的优选细胞来源包括细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、和动物细胞。

本发明还涉及用于生成一种或多种双链核酸分子的方法，所述方法包括：(a)将一种或多种核酸模板(优选RNA或mRNA，更优选mRNA模板群)与一种或多种本发明逆转录酶混合；(b)在足以生成与所述一种或多种模板的整个或部分互补的第一核酸分子的条件下将混合物保温；并(c)在足以生成与第一核酸分子的整个或部分互补的第二核酸分子的条件下将第一核酸分子保温，由此形成包含第一和第二核酸分子的一种或多种双链核酸分子。这种方法可以包括使用一种或多种DNA聚合酶作为生成一种或多种双链核酸分子的过程的一部分。本发明还关注可用于生成这些双链核酸分子的组合物。这些组合物包含一种或多种本发明逆转录酶，任选一种或多种DNA聚合酶、合适的缓冲液、一种或多种引物、和/或一种或多种核苷酸。

本发明还涉及用于扩增核酸分子的方法，所述方法包括：(a)将如上所述生成的双链核酸分子与一种或多种DNA聚合酶混合；并(b)在足以扩增双链核酸分子的条件下将混合物保温。在第一个优选实施方案中，本发明关注用于扩增核酸分子的方法，所述方法包括：(a)将一种或多种核酸模板(优选一种或多种RNA或mRNA模板，更优选mRNA模板群)与一种或多种本发明逆转录酶和一种或多种DNA聚合酶混合；并(b)在足以扩增与一种或多种模板的整个或部分互补的核酸分子的条件下将混合物保温。优选的是，逆转录酶的RNA酶H活性是降低的或充分降低的，而且DNA聚合酶包括具有3’外切核酸酶活性的第一DNA聚合酶和3’外切核酸酶活性充分降低的第二DNA聚合酶。本发明还关注包含一种或多种本发明逆转录酶和一种或多种DNA聚合酶、用于扩增反应的组合物。这些组合物还可包含一种或多种核苷酸和/或适用于扩增的缓冲液。本发明的组合物还可包含一种或多种寡核苷酸引物。

本发明还致力于依照上述方法生成的核酸分子(特别是单链或双链cDNA分子)或扩增核酸分子，和包含这些核酸分子或扩增核酸分子的载体(特别是表达载体)。

本发明还致力于包含上述核酸分子、扩增核酸分子、或载体的重组宿主细胞。优选的宿主细胞包括细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、和动物细胞(包括昆虫细胞和哺乳动物细胞)。

本发明还致力于生成由本发明方法生成的核酸分子所编码的多肽的方法，和由这些方法生成的多肽。这种方法包括培养上述重组宿主细胞，并分离编码的多肽。

本发明还关注使用本发明的组合物或酶对一种或多种核酸分子测序的方法。在具体实施方案中，所述方法包括：(a)将待测序核酸分子(如RNA或DNA分子)与一种或多种引物、一种或多种本发明逆转录酶、一种或多种核苷酸、和一种或多种终止剂(诸如一种或多种双脱氧核苷三磷酸)混合；(b)在足以合成与一种或多种待测序核酸分子的整个或部分互补的核酸分子群的条件下将混合物保温；并(c)将核酸分子群的成员分开以测定一种或多种待测序核酸分子的整个或部分的核苷酸序列。

在其它实施方案中，所述方法包括：(a)将待测序核酸分子(如RNA或DNA分子)与一种或多种引物、一种或多种本发明逆转录酶、一种或多种核苷酸、和一种或多种终止剂(诸如一种或多种双脱氧核苷三磷酸)混合；(b)在足以合成与待测序核酸分子的整个或部分互补的核酸分子群的条件下将混合物保温；并(c)将核酸分子群分开以测定待测序核酸分子的整个或部分的核苷酸序列。

本发明还致力于本发明方法中使用的试剂盒。这些试剂盒可用于生成、扩增核酸分子(单链或双链)、或测序。本发明的试剂盒包括载体(诸如盒子或硬纸盒)，其中密闭的装有一种或多种容器(诸如小瓶、管子、瓶子、诸如此类)。在本发明的试剂盒中，第一容器装有一种或多种本发明逆转录酶。本发明的试剂盒还可在相同或不同容器中装有一种或多种DNA聚合酶(优选热稳定的DNA聚合酶)、一种或多种适用于核酸合成的缓冲液、和一种或多种核苷酸。或者，可以将试剂盒的成分分装到单独的容器中(如一种容器用于一种酶和/或成分)。本发明的试剂盒还可包含用于进行本发明方法的指示或方案。在本发明的优选试剂盒中，逆转录酶经修饰或经突变而增加或增强了cDNA合成保真度、降低或充分降低了RNA酶H活性，最优选的是选自下组的酶：M-MLVH^-逆转录酶、RSVH^-逆转录酶、AMVH^-逆转录酶、RAV H^-逆转录酶、MAVH^-逆转录酶、和HIVH^-逆转录酶。在本发明的其它优选试剂盒中，容器中的酶(逆转录酶和/或DNA聚合酶)以工作浓度存在。

本发明的逆转录酶包括(1)保真度增强或(2)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性降低或消除的任何逆转录酶。逆转录酶可以是单链的或多链的。这些逆转录酶包括逆转录病毒的逆转录酶、细菌的逆转录酶、逆转座子的逆转录酶、和具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。本发明的优选逆转录酶包括单亚基逆转录酶(如M-MLV RT)和多亚基逆转录酶(如AMV RT)，且优选逆转录病毒RT。具体而言，本发明涉及M-MLV RT和ASLV RT(诸如AMV-RT和RSV-RT)。本发明的这些逆转录酶优选具有降低或充分降低的RNA酶H活性。

根据下文的图、描述、和权利要求，本发明的其它优选实施方案对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。

图的简述

通过参照下文附图、描述、和权利要求将更好的理解本发明的这些和其它特征、方面、和优点。

图1呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript II(1)和突变型蛋白质V223H(2)、V223F(3)、和R110M(4)与DNA模板的错误插入实验。正如在使用所有4种核苷酸的延伸反应中所看到的，用相同单位的RT蛋白质将能够使与47聚体DNA模板(5nM)退火的³²P标记18聚体引物于37℃延伸30分钟。还在只存在3种互补dNTP(-dCTP、-dATP、-dTTP、和-dGTP)时进行延伸反应。通过6％变性凝胶电泳来分析延伸反应。在此实验中，终止的引物在只存在3种核苷酸时的延伸效率越高，反映了所测定的M-MLV RNA酶H^-蛋白质的保真度越低。T：完全延伸的引物。P：未延伸的引物。

图2呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript II(1)和突变型R116M(7)的错插实验。还显示了ThermoScript^TM I(2)和SuperScriptII突变型F115Y(3)、K193T(4)、F156H(5)、D153N(6)、和V223R(8)。反应条件与图1相同。

图3呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript II(1)和突变型V223H(2)、Q190F(4)、K152R(5)、T197A(7)、和Y64W(8)以及突变型V223I(3)和K193C(6)的错插实验。反应条件与图1相同。

图4呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript II RT(1)和F309N(2)的延伸实验。正如在使用所有4种核苷酸的延伸反应中所看到的，用相同单位的RT使与47聚体DNA模板(5nM)退火的³²P标记18聚体引物于37℃延伸30分钟。通过变性6％凝胶电泳来分析延伸反应。P：未延伸的引物。

图5呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript^TM II(SS II)RT和突变型F309N、T197E、和Y133A的TdT延伸实验。使用所有4种核苷酸，用递减单位的RT(见方法)使与47聚体DNA模板(5nM)退火的³²P标记18聚体引物于37℃延伸30分钟。通过变性6％凝胶电泳来分析延伸反应。在此实验中，认为越过47个核苷酸模板的延伸是非模板指导的添加或TdT活性。P：未延伸的引物。

图6呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript II RT(1)和突变型蛋白质F309N RT(2)的DNA模板错插实验。正如在使用所有4种核苷酸的延伸反应中所看到的，用相同单位的RT使与47聚体DNA模板(5nM)退火的³²P标记18聚体引物于37℃延伸30分钟。还在只存在3种互补dNTP(-dCTP、-dATP、-dTTP、和-dGTP)时进行延伸反应。通过变性6％凝胶电泳来分析延伸反应。在此实验中，终止引物在只存在3种核苷酸时的延伸效率越高，反映了测定的SuperScript II RT的保真度越低。P：未延伸的引物。

图7呈现的扫描磷光图象显示了SuperScript II RT(1)和突变型蛋白质T197A/F309N RT(2)和V223H/F309N(3)的DNA模板错插实验。正如在使用所有4种核苷酸的延伸反应中所看到的，用相同单位的RT使与47聚体DNA模板(5nM)退火的³²P标记18聚体引物于37℃延伸30分钟。还在只存在3种互补dNTP(-dCTP、-dATP、-dTTP、和-dGTP)时进行延伸反应。通过变性6％凝胶电泳来分析延伸反应。在此实验中，终止引物在只存在3种核苷酸时的延伸效率越高，反映了测定的SuperScript II RT的保真度越低。P：未延伸的引物。

发明详述

在下文描述中，广泛使用了重组DNA、病毒学、和免疫学的许多术语。为了更加清楚且一致的理解说明书和权利要求书，包括这些术语的指定范围，因而提供下列定义。

克隆载体。能够在宿主细胞中自主复制且表征为一个或少数限制性内切核酸酶识别位点的质粒、粘粒、或噬菌体DNA或其它DNA分子。可以可决定方式在所述位点处切割这些DNA序列而不损失载体的实质性生物学功能，并在所述位点剪接DNA以进行它的复制和克隆。克隆载体还可包含可用于鉴定包含克隆载体的转化细胞的合适标记，例如四环素抗性或氨苄青霉素抗性。

表达载体。与克隆载体相似但能够在转化到宿主中后增强克隆于其中的基因或核酸分子的表达的载体。通常将克隆的基因或核酸分子置于某些控制序列(诸如启动子序列)的控制之下(即可操作连接)。

重组宿主。在表达载体、克隆载体、或任何DNA分子中包含克隆的期望基因或核酸分子的任何原核或真核细胞或微生物。术语“重组载体”还意欲包括那些经遗传工程改造而在宿主染色体或基因组中包含期望基因或核酸分子的宿主细胞。

宿主。作为可复制的表达载体、克隆载体、或任何DNA分子的受体的任何原核或真核微生物。DNA分子可以包含但不限于结构基因、启动子、和/或复制起点。

启动子。通常描述成基因的5’区、位于起始密码子附近的DNA序列。相邻基因的转录是在启动子区起始的。

基因。包含表达多肽或蛋白质所必需的信息的DNA序列。它包括启动子和结构基因，以及参与蛋白质表达的其它序列。

结构基因。转录成信使RNA、然后翻译成特定多肽特征性氨基酸序列的DNA序列。

可操作连接。在用于本文时，指将启动子置于能够控制结构基因或其它核酸分子所编码的多肽的表达起始的位置。

表达。表达指基因或其它核酸分子生成多肽的过程。它包括基因或核酸分子转录成信使RNA(mRNA)和这些mRNA翻译成多肽。

充分纯的。在用于本文时，“充分纯的”指纯化的期望蛋白质基本上不含在自然界中与期望蛋白质相关的污染性细胞杂质。污染性细胞成分可以包括但不限于磷酸酶、外切核酸酶、内切核酸酶、或非期望DNA聚合酶。本发明的优选逆转录酶是充分纯的。

引物。在用于本文时，“引物”指在DNA分子的扩增或聚合过程中通过核苷酸单体的共价键合而延伸的单链寡核苷酸。

模板。在用于本文时，术语“模板”指将要扩增、拷贝、或测序的双链或单链核酸分子。在双链DNA分子的情况中，在可以扩增、拷贝这些分子、或测序前进行变性以形成第一和第二单链。与核酸模板的一部分互补的引物在适当条件下发生杂交，然后本发明的逆转录酶可以合成与所述模板或其部分互补的DNA分子。依照本发明，新合成的DNA分子的长度可以等于或短于最初的模板。新合成DNA分子的合成或延伸过程中的错配掺入可以导致一个或多个错配碱基对。因而，合成的DNA分子不必与模板完全互补。

掺入。在用于本文时，术语“掺入”指成为DNA分子或引物的一部分。

寡核苷酸。“寡核苷酸”指包含通过一个核苷酸的戊糖的3’位置与相邻核苷酸的戊糖的5’位置之间的磷酸二酯碱而连接起来的共价连接核苷酸序列的合成或天然分子。

核苷酸。在用于本文时，“核苷酸”指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单位，而且通过DNA聚合酶将脱氧核糖核苷酸“掺入”DNA。术语“核苷酸”包括脱氧核糖核苷三磷酸，诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这些衍生物包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP、和7-脱氮-dATP。在用于本文时，术语“核苷酸”还包括双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的例示性范例包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、和ddTTP。依照本发明，“核苷酸”可以是未标记的，或者通过众所周知的技术进行可检测标记。可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、和酶标记。

杂交。术语“杂交”指两种互补单链核酸分子(RNA和/或DNA)配对产生双链分子。在用于本文时，尽管碱基配对并非完全互补，也可以将两种核酸分子杂交。因此，如果使用本领域众所周知的适当条件，错配碱基将不阻止两种核酸分子的杂交。

末端延伸。在用于本文时，指逆转录酶越过mRNA模板的5’末端向新合成的cDNA链的3’末端添加额外碱基的能力。该活性可以特异的(具有核苷酸倾向)或随机的添加碱基。

末端延伸活性也称为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性。TdT活性降低或消除的逆转录酶定义为TdT活性低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的任何逆转录酶，具体而言，低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约75％、低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约50％、低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约25％、低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约15％、低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约10％、低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约5％、或低于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的比活的大约1％。TdT活性消除定义为通过实施例3中使用的测定方法检测不到的活性水平。

链跳跃。在用于本文时，链跳跃指由RT“跳读”mRNA模板上的超过一个(如2个、5个、10个、50个、100个、等)核苷酸引起的一类随机突变，导致在生成的cDNA中缺失相应的核苷酸。

手结构域。在用于本文时，手结构域指那些位于逆转录酶中控制模板、引物、或核苷酸相互作用的区域内的氨基酸。该结构域还表征为逆转录酶中二级结构的一组三个区域，即拇指、指、和掌区。拇指结构域定义为位于HIV RT的第240-315位氨基酸之间或M-MLV RT的第280-355位氨基酸之间。指结构域定义为位于HIV RT的第1-85位和第120-154位氨基酸之间或M-MLV RT的第1-124位和第161-193位氨基酸之间。掌结构域定义为位于HIV RT的第86-199位和第155-239位氨基酸之间或M-MLV RT的第125-160位和第193-279位氨基酸之间。这些区域已普遍定义，而且定义N端和C端的氨基酸是近似的。还可以为其它逆转录酶定义相应的区域。

保真度。保真度指聚合的正确度，或逆转录酶在合成与模板互补的核酸分子时区别正确与错误底物(如核苷酸)的能力。逆转录酶的保真度越高，逆转录酶在核酸合成过程中向成长链中错掺的核苷酸越少；即保真度的增加或增强导致错误率降低或错掺率降低的更忠实的逆转录酶。

保真度增加/增强/更高的逆转录酶定义为保真度增加的聚合酶，在指定长度的任何指定核酸分子的合成过程中相对于对照逆转录酶而言错掺核苷酸的数目降低了优选大约1.5-大约10,000倍、大约2-大约5000倍、大约2-大约2000倍(优选超过大约5倍、更优选超过大约10倍、仍更优选超过大约50倍、仍更优选超过大约100倍、仍更优选超过大约500倍、最优选超过大约100倍)。优选的是，将本发明的突变型或经修饰RT与相应的未修饰或野生型RT进行比较，以测定保真度的相对增强或增加。例如，经突变逆转录酶可以在合成1000个碱基的核酸分子区段时错掺1个核苷酸，比较而言，未突变逆转录酶在相同大小的区段中错掺10个核苷酸。则说这种突变型逆转录酶的保真度增加了10倍。

如实施例5所述，还可以通过移码发生率的降低来测量保真度。保真度增加的逆转录酶定义为相对于对照逆转录酶(如野生型RT)而言在移码方面保真度增加的聚合酶或逆转录酶，例如在移码方面的保真度超过增加大约1.5倍、在移码方面的保真度超过增加大约5倍、在移码方面的保真度超过增加大约10倍、在移码方面的保真度超过增加大约20倍、在移码方面的保真度超过增加大约30倍、或在移码方面的保真度超过增加大约40倍的逆转录酶。

在移码方面的保真度增加/增强/更高的逆转录酶还可以定义为保真度任意增加的逆转录酶或聚合酶，诸如大约1.5-大约10,000倍、大约2-大约5000倍、大约2-大约2000倍、大约1.5-大约40倍、大约5-大约40倍、大约10-大约40倍、大约20-大约40倍、大约30-大约40倍、大约5-大约30倍、大约10-大约30倍、大约15-大约30倍、大约20-大约30倍、大约5-大约20倍、大约10-大约20倍、大约15-大约20倍、大约10-大约100倍、大约15-大约100倍、大约20-大约100倍、大约30-大约100倍、或大约50-大约100倍。

错掺减少的逆转录酶在本文中定义为相对于相应的未突变、未修饰、或野生型酶的相对错掺优选大约或低于50％、或优选大约或低于25％、更优选大约或低于10％、最优选大约或低于1％的经突变或经修饰的逆转录酶。

可以通过测序或本领域其它已知方法来测定逆转录酶的保真度或错掺率(Eckert和Kunkel，1990，Nuc.Acids Res.，3739-3744)。在一个实施例中，可以将通过未突变和经突变逆转录酶合成的DNA分子的序列与预期(已知)序列进行比较。由此，可以为每种酶测定错误(错掺或移码)数目并进行比较。在另一个实施例中，可以将未突变和经突变逆转录酶用于对具有已知序列的DNA分子测序。可以比较测序错误(错掺或移码)数目以测定酶的保真度或错掺率。测定保真度或错掺率的其它手段包括使用RNA模板的正向互补实验，见下文和先前Boyer，J.C.等人，Methods Enzymol.，275：523，1996所述，并叙述于实施例。本领域技术人员将领会测定保真度或错掺率的其它方法。

一般而言，本发明提供了包含逆转录酶、用于逆转录核酸分子的组合物，所述逆转录酶具有一处或多处突变或修饰，使得逆转录酶更有效，即具有更高保真度。本发明还提供了包含逆转录酶、用于逆转录核酸分子的组合物，所述逆转录酶具有一处或多处突变或修饰，使得TdT活性降低。

这些组合物中的酶优选以工作浓度存在，而且RNA酶H活性降低或充分降低。或者，本发明组合物中使用的逆转录酶可以具有RNA酶H活性。优选的经突变或经修饰逆转录酶衍生自M-MLV逆转录酶、HIV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV逆转录酶、和MAV逆转录酶或其它ASLV逆转录酶或其相应的RNA酶H衍生物。

依照本发明，可以对RT进行任何数目的突变，而且在优选方面，可以进行多处突变，导致加成性保真度增加。这些突变包括点突变、移码突变、删除、和插入，优选一处或多处点突变。优选的是，将由寡核苷酸指导的诱变用于构建在沿编码DNA分子的任何确定位点允许所有可能类型的碱基对变化的突变型聚合酶。一般而言，这种技术包括将与编码目的RT的单链核苷酸序列互补但具有一处或多处错配的寡核苷酸进行退火。然后用DNA聚合酶延伸错配的寡核苷酸，生成在一条链的序列中具有期望变化的双链DNA分子。序列中的变化当然可以导致氨基酸的删除、替代、或插入。然后可以将双链多核苷酸插入适当的表达载体，从而可以生成突变型或经修饰多肽。上述由寡核苷酸指导的诱变当然可以通过PCR来进行。

本发明还致力于逆转录一种或多种核酸分子的方法，包括将一种或多种核酸模板(优选RNA或信使RNA(mRNA)，更优选mRNA分子群)与本发明的突变型逆转录酶混合，并在足以生成与所述一种或多种模板的整个或部分互补的核酸分子的条件下将混合物保温。为了生成与该一种或多种模板互补的核酸分子，将引物(如寡聚dT引物)和一种或多种核苷酸用于3’向5’方向的核酸合成。依照本发明这一方面适用于逆转录的核酸分子包括任何核酸分子，特别是那些衍生自原核或真核细胞的核酸分子。这些细胞可以包括正常细胞、患病细胞、转化细胞、确立细胞(established cells)、祖细胞、前身细胞、胎儿细胞、胚细胞、细菌细胞、酵母细胞、动物细胞(包括人细胞)、禽类细胞、植物细胞、诸如此类，或由植物或动物(如人、牛、猪、小鼠、绵羊、马、猴、犬、猫、大鼠、兔、鸟、鱼、昆虫、等)分离的组织。这些核酸分子还可分离自病毒。

本发明还提供了用于核酸分子的扩增或测序的方法，包括使核酸分子接触本发明的逆转录酶。优选的是这些方法包括一个或多个聚合酶链式反应(PCR)。

逆转录酶的来源

在本发明的组合物、方法、和试剂盒中使用的酶包括具有逆转录酶活性的任何酶。这些酶包括但不限于逆转录病毒的逆转录酶、逆转座子的逆转录酶、乙肝病毒的逆转录酶、花椰菜花叶病毒的逆转录酶、细菌的逆转录酶、TthDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Saiki，R.K.等人，Science，239：487-491，1988；美国专利号4,889,818和4,965,188)、Tne DNA聚合酶(WO 96/10640)、7ma DNA聚合酶(美国专利号5,374,553)及其突变体、片段、变体、或衍生物(参阅例如共同拥有的美国专利号5,948,614和6,015,668，将其完整收入本文作为参考)。优选在本发明中使用的逆转录酶包括M-MLV RT、AMV RT、RSV RT、RAV RT、MAVRT和一般而言的ASLV逆转录酶。正如本领域普通技术人员将领会的，可以通过本领域常规的且众所周知的重组或遗传工程技术来获得经修饰的逆转录酶。例如，可以通过定点或随机诱变而突变编码目的逆转录酶的基因，由此获得突变型逆转录酶。这些突变可以包括点突变、删除突变、和插入突变。优选的是，使用一处或多处点突变(如用一个或多个不同氨基酸替代一个或多个氨基酸)来构建本发明的突变型逆转录酶。可以通过本领域常规的且众所周知的重组技术来进行删除突变，或者使用任意数目的众所周知的蛋白水解酶酶促消化目的逆转录酶，由此获得逆转录酶的片段。

优选在本发明中使用的酶包括那些RNA酶H活性降低或充分降低的酶。可以通过突变目的逆转录酶中的RNA酶H结构域来获得RNA酶H活性降低或充分降低的这些酶，如上所述，优选通过一处或多处点突变、一处或多处删除突变、和/或一处或多处插入突变。“RNA酶H活性充分降低的”酶指相对于相应的野生型或RNA酶H⁺酶(诸如野生型莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)、或劳斯肉瘤病毒(RSV)逆转录酶)而言酶的RNA酶H活性低于大约30％、低于大约25％、低于大约20％、更优选低于大约15％、低于大约10％、低于大约7.5％、或低于大约5％、最优选低于大约5％或低于大约2％、或缺乏该活性。先前已经描述了RNA酶H活性降低或充分降低的RT(参阅美国专利号5,244,797、5,405,776、5,668,005、和6.063,608；和WO98/47912)。可以通过多种测定法来测定任何酶的RNA酶H活性，诸如美国专利号5,244,797、5,405,776、5,668,005、和6,063,608；Kotewicz，M.L.等人，Nucl.Acids Res.，16：265，1988；和Gerard，G.F.等人，FOCUS，14(5)：91，1992中所述(将它们的公开书完整收入本文作为参考)。

特别优选在本发明中使用的经突变或经修饰的酶包括但不限于M-MLVH^-逆转录酶、RSVH^-逆转录酶、AMVH^-逆转录酶、RAVH^-逆转录酶、MAVH^-逆转录酶、和HIVH^-逆转录酶。然而，本领域普通技术人员将领会，在本发明的组合物、方法、和试剂盒中可以等同的使用RNA酶H活性降低或充分降低的、能够由核糖核酸分子生成DNA分子(即具有逆转录酶活性)的任何酶。

可以依照本领域普通技术人员众所周知的用于分离并纯化天然蛋白的标准流程由天然病毒或细菌来源分离可用于本发明的具有逆转录酶活性的多肽(参阅例如Houts，G.E.等人，J.Virol.，29：517，1979)。另外，可以通过本领域普通技术人员熟悉的重组DNA技术来制备具有逆转录酶活性的多肽(参阅例如Kotewicz，M.L.等人，Nucl.Acids Res.，16：265，1988；Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3372-3376，1988)。

在本发明的一个优选方面，突变型或经修饰的逆转录酶是通过重组技术生成的。有许多克隆逆转录酶基因可供利用或可以使用标准重组技术获得(参阅美国专利号5,244,797、5,405,776、5,668,005、和6,063,608和WO 98/47912)。

为了克隆将依照本发明进行修饰的逆转录酶编码基因，将包含逆转录酶基因的分离DNA用于在载体中构建重组DNA文库。可以使用本领域众所周知的任何载体来克隆目的逆转录酶。然而，所用载体必须与将用重组DNA文库转化的宿主相容。

用于构建质粒文库的原核载体包括质粒，诸如那些能够在大肠杆菌中复制的质粒，诸如pBR322、ColE1、pSC101、pUC载体(pUC18、pUC19、等；《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》即分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1982；和Sambrook等人，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》即分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。芽孢杆菌质粒包括pC194、pC221、pC217、等。这些质粒是由Glyczan，T.公开的(《The Molecular Biology of Bacilli》即芽孢杆菌的分子生物学，Academic出版社，纽约，1982，第307-329页)。合适的链霉菌质粒包括pIJ101(Kendall等人，J.Bacteriol.，169：4177-4183，1987)。假单胞菌质粒的回顾见John等人(Rad.Insec.Dis.，8：693-704，1986)；和Igaki，(Jpn.J.Bacteriol.，33：729-742，1978)。还可以将宿主范围广泛的质粒或粘粒诸如pCP13(Darzins和Chakrabarbary，J.Bacteriol.，159：9-18，1984)用于本发明。优选用于克隆本发明基因的载体是原核载体。优选的是，将pCP13和pUC载体用于克隆本发明基因。

优选用于克隆目的逆转录酶基因的宿主是原核宿主。最优选的原核宿主是大肠杆菌。然而，可以在其它原核宿主中克隆本发明的期望逆转录酶基因，包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和变形杆菌属(Proteus)。特别感兴趣的细菌宿主包括大肠杆菌DH10B，可以由Life Technologies(Invitrogen公司的一个部门，Rockville，MD)获得。

用于克隆并表达目的逆转录酶的真核宿主包括酵母、真菌、和哺乳动物细胞。期望逆转录酶在这些真核细胞中的表达可能需要使用包含真核启动子的真核调控区。可以通过众所周知的技术使用众所周知的真核载体系统来实现逆转录酶基因在真核细胞中的克隆和表达。

一旦在特定载体中构建了DNA文库，则通过众所周知的技术转化适当的宿主。将转化菌落以大约200-300菌落/培养皿的密度进行涂板。为了选择逆转录酶，如下文实施例所述对菌落筛选逆转录酶的表达。简而言之，使用经标记脱氧核苷酸对各个转化菌落的过夜培养物直接测定RT，并分析经标记产物的存在与否。若检测到RT活性，则将突变体测序以测定维持可检测RT活性的氨基酸。可以使用本领域技术人员知道的技术来克隆编码本发明逆转录酶的基因。

聚合酶的修饰或突变

优选的是，修饰或突变聚合酶结构域即本文定义的指、掌、拇指区，尤其是那些位于目的逆转录酶中控制模板、引物、或核苷酸相互作用的区域内的氨基酸，从而生成保真度增加或增强(错掺率降低)和/或TdT活性降低的经突变或经修饰逆转录酶。还可以在依照本发明的其它区域中进行修饰或突变。可以在任何逆转录酶中进行一处或多处突变，从而使本发明的酶增加保真度或降低TdT活性。这些突变包括点突变、移码突变、删除、和插入。优选的是，将导致一个或多个氨基酸替代的一处或多处点突变用于生成保真度增强或增加或者TdT活性降低或消除的逆转录酶。M-MLV逆转录酶中的氨基酸编号基于成熟肽，其中N末端甲硫氨酸已经通过蛋白水解而切除。在本发明的一个优选方面，可以在M-MLV位置Y64、R116、D152、Q190、T197、D124、H126、Y133、和V223的等同或对应位置进行一处或多处突变以生成保真度增加的RT。更优选的是，聚合酶掌区内位置T197的突变导致保真度增加和/或错掺率降低的逆转录酶。在本发明的另一个优选方面，在F309、T197、或Y133的等同或对应位置进行一处或多处突变以生成TdT活性降低或消除的RT。在这一优选方面，在上述标识位置之一处或多处进行氨基酸替代。因而，可以用任何其它氨基酸替代这些位置的氨基酸，包括Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、和Val。

本领域技术人员可以容易的为其它逆转录酶鉴定出上文标识的M-MLV RT对应位置。因而，考虑到本申请中定义的区域和描述的实验，本领域技术人员能够进行一处或多处修饰，导致任何目的逆转录酶的保真度增加。下表例示了已知逆转录酶的已鉴定目的区域。

表1

逆转录酶高保真突变体的序列定位

M-MLV Y64，R116，K152，Q190，T197，V223，D124，

H126，Y133

AMV W25，R76，K110，Q149，T156，M182

RSV W25，R76，K110，Q149，T156，M182

HIV W24，R78，G112，Q151，A158，M184

已经知道M-MLV(Shinnick等人，Nature，293：543，1981)、AMV(Joliot等人，Virology，195：812，1993)、RSV(Haseltine等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：989，1977)、和HIV(Wong-Staal等人，Natur e，313：277，1985)的核苷酸序列。

本发明还涉及逆转录酶突变体，其中在逆转录酶的已鉴定区域中进行突变或替代。这些区域包括但不限于指、掌、和/或拇指区(或其联合)。在本发明的一个优选实施方案中，在拇指区中进行突变或替代，据显示该区中的突变可降低移码发生率。用于测量移码率的方法描述于实施例。

可用于替代Tyr的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Arg的氨基酸包括Tyr、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Phe、Asn、或Gln。可用于替代Lys的氨基酸包括Tyr、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Glu的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Tyr、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Thr的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Tyr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Val的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Tyr、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可以通过众所周知的方法即定点诱变且如本文所述来制备这些突变体。

优选的是，将由寡核苷酸指导的诱变用于构建在沿编码DNA分子的任何确定位点允许所有可能类型的碱基对变化的突变型逆转录酶。一般而言，这种技术包括将与编码目的逆转录酶的单链核苷酸序列互补但具有一处或多处错配的寡核苷酸进行退火。然后用DNA聚合酶延伸错配的寡核苷酸，生成在一条链的序列中具有期望变化的双链DNA分子。序列中的变化当然可以导致氨基酸的删除、替代、或插入。然后可以将双链多核苷酸插入适当的表达载体，从而可以生成突变型多肽。上述由寡核苷酸指导的诱变当然可以通过PCR来进行。

逆转录酶表达的增强

为了优化本发明逆转录酶的表达，可以将众所周知的诱导性或组成性启动子用于在重组宿主中表达高水平的逆转录酶结构基因。相似的，可以使用本领域众所周知的高拷贝载体来实现高水平的表达。具有诱导性高拷贝数目的载体也可用于增强本发明逆转录酶在重组宿主中的表达。

为了在原核细胞(诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、等)中表达期望结构基因，必需将期望结构基因可操作连接有功能的原核启动子。然而，逆转录酶基因的天然启动子可能在原核宿主中也有功能，从而表达逆转录酶基因。因而，可以使用天然启动子或其它启动子来表达逆转录酶基因。可用于增强表达的其它启动子包括组成性或可调控(即诱导性或去抑制性)启动子。组成性启动子的范例包括噬菌体λ的int启动子和pBR332中β-内酰胺酶的bla启动子。诱导性原核启动子的范例包括噬菌体λ的主要右和左启动子(P_R和P_L)、大肠杆菌的trp、recA、lacZ、lacI、tet、gal、trc、和tac启动子。枯草芽孢杆菌启动子包括α-淀粉酶启动子(Ulmanen等人，J.Bacteriol.，162：176-182，1985)和芽孢杆菌噬菌体启动子(Gryczan，T.，《TheMolecular Biology of Bacilli》即芽孢杆菌的分子生物学，Academic出版社，，纽约，1982)。链霉菌启动子描述于Ward等人，Mol.Gen.Genet.，203：468-478，1986。原核启动子的回顾还可以参阅Glick，J.Ind.Microbiol.，1：277-282，1987；Cenatiempto，Y.，Biochimie，68：505-516，1986；和Gottesman，Ann.Rev.Genet.，18：415-442，1984。原核细胞中的表达还要求在基因编码序列上游存在核糖体结合位点。这些核糖体结合位点公开于例如Gold等人，Ann.Rev.Microbiol.，35：365-404，1981。

为了增强本发明聚合酶在真核细胞中的表达，可以使用众所周知的真核启动子和宿主。然而，优选的是，在原核宿主中实现聚合酶的增强表达。优选用于过度表达这种酶的原核宿主是大肠杆菌。

逆转录酶的分离和纯化

优选通过包含并表达期望逆转录酶基因的重组宿主的发酵来生产本发明的酶。然而，可以由生成本发明逆转录酶的任何菌株分离本发明的逆转录酶。本发明还包括逆转录酶的片段。这些片段包括蛋白水解片段和具有逆转录酶活性的片段。

可以向培养基中添加可以被包含克隆逆转录酶基因的宿主同化的任何营养物。应当根据使用的菌株和培养基的组成来选择最佳培养条件。可以向生长培养基中添加抗生素以确保包含待表达期望基因的载体DNA的维持。培养基配方描述于DSM或ATCC目录和Sambrook等人，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》即分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989。

可以通过例如离心将生成本发明逆转录酶的重组宿主细胞与液体培养基分开。一般而言，将收集的微生物细胞散布于合适的缓冲液中，然后通过超声处理或其它众所周知的流程破坏细胞，从而能够由缓冲液提取酶。通过超速离心或离心除去细胞碎片后，可以通过标准蛋白质纯化技术来纯化逆转录酶，诸如抽提、沉淀、层析、亲和层析、电泳、诸如此类。在纯化过程中检测逆转录酶的存在的实验在本领域是众所周知的，而且可以在传统生化纯化方法中用于测定这些酶的存在。

本发明的逆转录酶优选具有特异DNA聚合酶活性，且比活超过大约5U/mg，更优选超过大约50U/mg，仍更优选超过大约100U/mg、250U/mg、500U/mg、1000U/mg、5000U/mg、10,000U/mg，最优选超过大约15,000U/mg、超过大约16,000U/mg、超过大约17,000U/mg、超过大约18,000U/m g、超过大约19,000U/mg、和超过大约20,000U/mg。本发明RT的比活的优选范围包括大约5U/mg-大约140,000U/mg、大约5U/mg-大约125,000U/mg、大约50U/mg-大约100,000U/mg、大约100U/mg-大约100,000U/mg、大约250U/mg-大约100,000U/mg、大约500U/mg-大约100,000U/mg、大约1000U/mg-大约100,000U/mg、大约5000U/mg-大约100,000U/mg、大约10,000U/mg-大约100,000U/mg、和大约25,000U/mg-大约75,000U/mg。比活的其它范围包括大约20,000U/mg-大约140,000U/mg、大约20,000U/mg-大约130,000U/mg、大约20,000U/mg-大约120,000U/mg、大约20,000U/mg-大约110,000U/mg、大约20,000U/mg-大约100,000U/mg、大约20,000U/mg-大约90,000U/mg、大约25,000U/mg-大约140,000U/mg、大约25,000U/mg-大约130,000U/mg、大约25,000U/mg-大约120,000U/mg、大约25,000U/mg-大约110,000U/mg、大约25,000U/mg-大约100,000U/mg、和大约25,000U/mg-大约90,000U/mg。优选的是，比活范围的下限可以是30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、和80,000U/mg等，而比活范围的上限可以是150,000、140,000、130,000、120,000、110,000、100,000、和90,000U/mg等。依照本发明，比活是蛋白质或酶的酶活性(U)相对于反应中所用蛋白质或酶的总量的度量。可以通过本领域普通技术人员众所周知的标准技术来测定比活的度量。

本发明的RT可用于由一种或多种模板生成核酸分子。这些方法包括：(a)将一种或多种核酸模板(如mRNA，更优选mRNA分子群)与一种或多种本发明RT混合，并(b)在足以生成与一种或多种核酸模板的整个或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下将混合物保温。

本发明还涉及用于扩增一种或多种核酸分子的方法，包括：(a)将一种或多种核酸模板与一种本发明RT混合，并(b)在足以扩增与一种或多种核酸模板的整个或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下将混合物保温。

本发明还关注用于将一种或多种核酸分子测序的方法，包括(a)将一种或多种待测序核酸分子与一种或多种引物核酸分子、一种或多种本发明RT、一种或多种核苷酸、和一种或多种终止剂混合；(b)在足以合成与一种或多种待测序核酸分子的整个或部分互补的核酸分子群的条件下将混合物保温；并(c)将核酸分子群分开以测定一种或多种待测序核酸分子的整个或部分的核苷酸序列。

本发明还关注通过这些方法生成的核酸分子(可以是全长cDNA分子)、包含这些核酸分子的载体(特别是表达载体)、和包含这些载体和核酸分子的宿主细胞。

DNA聚合酶的来源

依照本发明，多种DNA聚合酶是有用的。这些聚合酶包括但不限于Thermus thermophilus即嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、Thermusaquaticus即水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、Thermotoga neapolitana即那不勒斯栖热袍菌(Tne)DNA聚合酶、Thermotoga maritime即海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis即海滨热球菌(Tli或VENT^TM)DNA聚合酶、Pyrococcus furiosis即激烈热球菌(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENT^TM DNA聚合酶、Pyrococcus woosii即沃斯氏热球菌(Pwo)DNA聚合酶、Bacillus sterothermophilus即嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、Bacillus caldophilus即嗜热芽孢杆菌(Bca)DNA聚合酶、Sulfolobus acidocaldarius即嗜酸热硫化叶菌(Sac)DNA聚合酶、Thermoplasma acidophilum即嗜酸热原体(Tac)DNA聚合酶、Thermus flavus即黄栖热菌(Tfl/Tub)DNA聚合酶、Thermusruber即红栖热菌(Tru)DNA聚合酶、Thermus brockianus(DYNAZYME^TM)DNA聚合酶、热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum，Mth)DNA聚合酶、Mycobacterium spp.即分枝杆菌之种DNA聚合酶(Mtb、Mlep)及其突变体、变体、和衍生物。

依照本发明使用的DNA聚合酶可以是能够由核酸模板合成DNA分子(通常是5’向3’方向)的任何酶。这些聚合酶可以是嗜温的或嗜热的，但是优选嗜热的。嗜温聚合酶包括T5DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Klenow片段DNA聚合酶、DNA聚合酶III、诸如此类。优选的DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶，诸如Taq、Tne、Tma、Pfu、VENT^TM、DEEPVENT^TM、Tth及其突变体、变体、和衍生物(美国专利号5,436,149；美国专利号5,512,462；WO 92/06188；WO 92/06200；WO 96/10640；Barnes，W.M.，Gene，112：29-35，1992；Lawyer，F.C.等人，PCR Meth.Appl.，2：275-287，1993；Flaman，J.-M.等人，Nucl.Acids Res.，22(15)：3259-3260，1994)。为了扩增长核酸分子(如长度大于大约3-5kb的核酸分子)，通常使用至少2种DNA聚合酶(一种实质性缺乏3’外切核酸酶活性，另一种具有3’外切核酸酶活性)。参阅美国专利号5,436,149；美国专利号5,512,462；Barnes，W.M.，Gene，112：29-35，1992；和共同拥有的、共同未决的2000年12月21日提交的美国专利申请号09/741,664和相应的欧洲申请0942917(将它们的公开书完整收入本文作为参考)。实质性缺乏3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的范例包括但不限于Taq、Tne(exo^-)、Tma、Pfu(exo^-)、Pwo、Tth DNA聚合酶及其突变体、变体、和衍生物。具有3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的非限制性范例包括Pfu/DEEPVENT^TM和Tli/VENT^TM及其突变体、变体、和衍生物。

酶组合物的配方

为了形成本发明的组合物，优选在缓冲盐溶液中混合一种或多种逆转录酶。任选添加一种或多种DNA聚合酶和/或一种或多种核苷酸和/或一种或多种引物以生成本发明的组合物。更具体的说，在稳定的缓冲盐溶液中提供工作浓度的酶。在用于本文时，术语“稳定的”和“稳定性”通常指将酶或包含酶的组合物于大约4℃保存大约1周后、于大约-20℃保存大约2-6个月后、和于大约-80℃保存大约6个月或更长时间后，组合物(诸如酶组合物)保留最初酶活性(以单位计)的至少70％、优选至少80％、最优选至少90％。在用于本文时，术语“工作浓度”指酶在溶液中的浓度处于或接近发挥特定功能(诸如逆转录核酸)的最佳浓度。

在配制本发明组合物时使用的水优选经过蒸馏、去离子、和无菌过滤(通过0.1-0.2μm滤膜)，而且不含DNA酶和RNA酶污染。可以通过商业途经获得这些水，例如Sigma Chemical公司(圣路易，密苏里州)，或者依照本领域技术人员众所周知的流程根据需要制备。

除了酶成分以外，本发明的组合物优选还包含合成核酸分子(诸如cDNA分子)所必需的一种或多种缓冲盐和辅助因子。特别优选在配制本发明组合物时使用的缓冲盐是醋酸盐、硫酸盐、氢氯化物、磷酸盐、或Tris-(羟甲基)氨基甲烷(TRIS^TM)的游离酸形式，但是使用与TRIS^TM具有相同或相似的离子强度和pKa的其它缓冲液也可以获得等同的结果。除了缓冲盐以外，组合物中还包含辅助因子的盐，诸如钾盐(优选氯化钾或醋酸钾)和镁盐(优选氯化镁或醋酸镁)。为了支持组合物和/或反应混合液在保存后的增强稳定性，向组合物和/或合成反应混合液中添加一种或多种碳水化合物和/或糖可能也是有利的。优选在本发明的组合物和/或合成反应混合液中包含的这些碳水化合物或糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、诸如此类。另外，可以向用于生成本发明酶组合物和/或试剂盒的酶的保存缓冲液中添加这些碳水化合物和/或糖。可以通过商业途经由许多来源获得这些碳水化合物和/或糖，包括Sigma(圣路易，密苏里州)。

常常优选首先在水中溶解工作浓度的缓冲盐、辅助因子的盐、和碳水化合物或糖，并在加入酶之前调整溶液的pH。由此，对pH敏感的酶将在配制本发明组合物的过程中经历较少的由酸或碱介导的失活。

为了配制缓冲盐溶液，将缓冲盐(优选Tris-(羟甲基)氨基甲烷(TRIS^TM)，最优选它的氢氯化物盐)溶于足量的水以生成TRIS^TM浓度5-150mM、优选10-60mM、最优选20-60mM的溶液。可以向此溶液中加入镁盐(优选它的氯化物或醋酸盐)以提供它的工作浓度即1-10mM、优选1.5-8.0mM、最优选大约3-7.5mM。还可以向溶液中加入钾盐《优选它的氯化物或醋酸盐)，工作浓度10-100mM、最优选大约75mM。可以向溶液中加入还原剂诸如二硫苏糖醇，优选终浓度大约1-100mM、更优选5-50mM或大约7.5-20mM、最优选大约10mM。本发明组合物中包含碳水化合物和/或糖的优选浓度范围是大约5％(w/v)-大约30％(w/v)、大约7.5％(w/v)-大约25％(w/v)、大约10％(w/v)-大约25％(w/v)、大约10％(w/v)-大约20％(w/v)、优选大约10％(w/v)-大约15％(w/v)。还可以添加少量的乙二胺四乙酸(EDTA)的盐诸如EDTA二钠(优选大约0.1mM)，尽管EDTA似乎并非本发明组合物的功能或稳定性所必需的。在加入所有缓冲液和盐类后，将该缓冲盐溶液混匀直至所有盐类都溶解了，并使用本领域知道的方法将pH调至7.4-9.2、优选8.0-9.0、最优选大约8.4。

向这些缓冲盐溶液中加入酶(逆转录酶和/或DNA聚合酶)以生成本发明的组合物。向溶液中加入M-MLV RT的工作浓度优选大约1,000-大约50,000U/ml、大约2,000-大约30,000U/ml、大约2,500-大约25,000U/ml、大约3,000-大约22,500U/ml、大约4,000-大约20,000U/ml、最优选大约5,000-大约20,000U/ml。向溶液中加入AMVRT、RSV RT、和HIV RT(包括上文所述本发明的RT)的工作浓度优选大约100-大约5000U/ml、大约125-大约4000U/ml、大约150-大约3000U/ml、大约200-大约2500U/ml、大约225-大约2000U/ml、最优选大约250-大约1000U/ml。向溶液中加入嗜热DNA聚合酶组(Taq、Tne、Tma、Pfu、VENT、DEEPVENT、Tth及其突变体、变体、和衍生物)中的酶的工作浓度优选大约100-大约1000U/ml、大约125-大约750U/ml、大约150-大约700U/ml、大约200-大约650U/ml、大约225-大约550U/ml、最优选大约250-大约500U/ml。可以任何顺序或同时向溶液中加入酶。

本发明的组合物还可包含一种或多种核苷酸，优选脱氧核苷三磷酸(dNTP)或双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。本发明组合物的dNTP成分担当新合成核酸的“构件”，即通过聚合酶的作用掺入新合成的核酸；而ddNTP可用于依照本发明的测序方法。适用于本发明组合物的核苷酸的范例包括但不限于dUTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dITP、7-脱氮-dGTP、α-硫代-dATP、α-硫代-dTTP、α-硫代-dGTP、α-硫代-dCTP、ddUTP、ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP、ddITP、7-脱氮-ddGTP、α-硫代-ddATP、α-硫代-ddTTP、α-硫代-ddGTP、α-硫代-ddCTP或其衍生物，所有这些都可以通过商业途经获得，包括Life Technologies(Invitrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)、New EnglandBioLabs(Beverly，马萨诸塞)、和Sigma Chemical公司(圣路易，密苏里)。核苷酸可以是未标记的，或者可以通过本领域知道的方法将它们偶联放射性同位素(如3H、14C、32P、或35S)、维生素(如生物素)、荧光模块(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红、或藻红蛋白)、化学发光标记(如使用PHOTO-GENE^TM或ACES^TM化学发光系统，可以由Life Technologies(Invitrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)购买)、洋地黄毒苷、诸如此类，从而进行可检测标记。也可以通过商业途经获得经标记的核苷酸，例如Life Technologies(Invitrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)或Sigma Chemical公司(圣路易，密苏里)。在本发明的组合物中，以工作浓度加入核苷酸，即每种核苷酸为大约10-4000μM、大约50-2000μM、大约100-1500μM、或大约200-1200μM、最优选大约1000μM。

为了降低成分的变质，优选将试剂组合物于大约4℃保存多达1天，最优选于-20℃保存多达1年。

另一方面，可以干燥形式在存在一种或多种碳水化合物、糖、或合成聚合物时制备并保存本发明的组合物和逆转录酶。优选用于制备干燥组合物或逆转录酶的碳水化合物、糖、或聚合物包括但不限于蔗糖、海藻糖、和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其组合。参阅例如美国专利号5,098,893、4,891,319、和5,556,771(将它们的公开书完整收入本文作为参考)。这些干燥的组合物和酶可于各种温度保存较长时间且本发明的酶或组合物成分没有显著变质。优选将干燥的逆转录酶或组合物保存于4℃或-20℃。

cDNA分子的生成

核酸分子的来源

依照本发明，可以由多种核酸模板分子制备cDNA分子(单链或双链)。优选用于本发明的核酸分子包括单链或双链DNA和RNA分子，以及双链DNA:RNA杂种分子。更优选的核酸分子包括信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、和核糖体RNA(rRNA)分子，但是mRNA分子是依照本发明的优选模板。

可以依照本领域普通技术人员熟悉的标准有机化学合成法制备可用于制备依照本发明的cDNA分子的核酸分子。更优选的是，可以由天然来源获得核酸分子，诸如多种细胞、组织、器官、或生物体。可用作核酸分子来源的细胞可以是原核的(细菌细胞，包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、密螺旋体属(Treponema)、枝原体属(Mycoplasm)、疏螺旋体属(Borrelia)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、和链霉菌属(Streptomyces)的物种的细胞)或真核的(包括真菌(尤其是酵母)、植物、原生动物和其它寄生虫、和动物(包括昆虫，特别是果蝇种细胞；线虫，特别是Caenorhabitis elegans细胞；和哺乳动物，特别是人细胞))。

可用作核酸分子来源的哺乳动物体细胞包括血细胞(网状细胞和白细胞)、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞(来自中枢或外周神经系统)、肌肉细胞(包括来自骨骼肌、平滑肌、或心肌的肌细胞或成肌细胞)、结缔组织细胞(包括成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、和成骨细胞)、和其它基质细胞(如巨噬细胞、树突细胞、施旺细胞)。哺乳动物生殖细胞(精母细胞和卵母细胞)也可作为核酸来源用于本发明，产生上述体细胞和生殖细胞的祖细胞、前身细胞、和干细胞同样也可以。适合用作核酸来源的还有哺乳动物的组织或器官，诸如那些衍生自脑、肾、肝、胰、血液、骨髓、肌肉、神经、皮肤、泌尿生殖、循环、淋巴、胃肠、和结缔组织来源的组织或器官，以及那些衍生自哺乳动物(包括人)胚或胎儿的组织或器官。

任何上述原核或真核细胞、组织、和器官可以是正常的、患病的、转化的、确立的、祖细胞、前身细胞、胎儿的、或胚胎的细胞、组织、和器官。患病细胞可以例如包括那些参与传染病(由细菌、真菌、酵母、病毒(包括AIDS、HIV、HTLV、疱疹、肝炎、诸如此类)、或寄生虫引起的)、遗传或生化病理学(如囊性纤维化、血友病、阿尔茨海默氏病、肌肉萎缩、或多发性硬化)、或癌症过程的细胞。经转化或已确立的动物细胞系可以包括例如COS细胞、CHO细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、K562细胞、293细胞、L929细胞、F9细胞、诸如此类。适合作为核酸来源用于本发明的其它细胞、细胞系、组织、器官、和生物体对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

一旦获得了起始细胞、组织、器官、或其它样品，可以通过本领域众所周知的方法由其分离核酸分子(诸如mRNA)(参阅例如Maniatis，T.等人，Cell，15：687-701，1978；Okayama，H.和Berg，P.，Mol.Cell.Biol.，2：161-170，1982；和Gubler，U.和Hoffman，B.J.，Gene，25：263-269，1983)。然后可以将由此分离的核酸分子用于制备依照本发明的cDNA分子和cDNA文库。

在实践本发明时，cDNA分子或cDNA文库是如下生成的：在有利于通过酶或组合物的作用逆转录核酸分子而形成cDNA分子(单链或双链)的条件下，将如上所述获得的一种或多种核酸分子(优选一种或多种mRNA分子，诸如mRNA分子群)与具有逆转录酶活性的本发明多肽或者与一种或多种本发明组合物混合。因而，本发明的方法包括：(a)将一种或多种核酸分子模板(优选一种或多种RNA或mRNA模板，诸如mRNA分子群)与一种或多种本发明逆转录酶混合，并(b)在足以生成与一种或多种模板的整个或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下将混合物保温。这些方法可以包括使用一种或多种DNA聚合酶、一种或多种核苷酸、一种或多种引物、一种或多种缓冲液、诸如此类。可以将本发明联合cDNA合成方法以生成cDNA分子或文库，诸如下文实施例中描述的那些方法或本领域众所周知的其它方法(参阅例如Gubler，U.和Hoffman，B.J.，Gene，25：263-269，1983；Krug，M.S.和Berger，S.L.，Meth.Enzymol.，152：316-325，1987；Sambrook，J.等人，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》即分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社，第8.60-8.63页，1989：WO99/15702；WO 98/47912；和WO 98/51699)。

可有利的用于本发明的其它cDNA合成方法对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。

在获得了依照本发明的cDNA分子或文库后，可以分离这些cDNA用于进一步的分析或操作。GENETRAPPER^TM手册(Life Technologies，Invitrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰；将其完整收入本文作为参考)传授了用于纯化cDNA的详细方法，但是也可以使用本领域知道的用于分离cDNA的其它标准技术(参阅例如Sambrook，J.等人，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》即分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社，第8.60-8.63页，1989。

在本发明的其它方面，本发明可用于核酸分子的扩增和测序。依照本发明这一方面的核酸扩增方法可以是一步的(如一步RT-PCR)或两步的(如两步RT-PCR)反应。依照本发明，可以在一个管中实现一步RT-PCR型反应，从而降低污染的可能性。这种一步反应包括：(a)将核酸模板(如mRNA)与一种或多种本发明逆转录酶和一种或多种DNA聚合酶混合，并(b)在足以扩增与模板的整个或部分互补的核酸分子的条件下将混合物保温。可以单独通过逆转录酶活性或者联合DNA聚合酶活性来实现这种扩增。可以两个分开的步骤来实现两步RT-PCR反应。这种方法包括：(a)将核酸模板(如mRNA)与本发明的逆转录酶混合，(b)在足以生成与模板的整个或部分互补的核酸分子(如DNA分子)的条件下将混合物保温，(c)将核酸分子与一种或多种DNA聚合酶混合，并(d)在足以扩增核酸分子的条件下将步骤c的混合物保温。为了扩增长核酸分子(即长度超过大约3-5kb)，可以使用DNA聚合酶的组合，诸如具有3’外切核酸酶活性的一种DNA聚合酶与3’外切核酸酶活性充分降低的另一种DNA聚合酶。

依照本发明这一方面的核酸测序方法可以包括循环测序(测序联合扩增)和标准测序反应二者。本发明的测序方法因而包括：(a)将待测序的核酸分子与一种或多种引物、一种或多种本发明逆转录酶、一种或多种核苷酸、和一种或多种终止剂混合，(b)在足以合成与待测序分子的整个或部分互补的核酸分子群的条件下将混合物保温，并(c)将核酸分子群分开以测定待测序分子的整个或部分的核苷酸序列。依照本发明，可以将一种或多种DNA聚合酶(优选热稳定的DNA聚合酶)与本发明的逆转录酶联合或分开使用。

可依照本发明使用的扩增方法包括PCR(美国专利号4,683,195和4,683,202)、链取代扩增(SDA；美国专利号5,455,166；EP 0684315)、和基于核酸序列的扩增(NASBA；美国专利号5,409,818；EP 0329822)，以及更复杂的基于PCR的核酸指纹技术，诸如随机扩增多态DNA(RAPD)分析(Williams，J.G.K.等人，Nucl.Acids Res.，18(22)：6531-6535，1990)、任意引发PCR(AP-PCR；Welsh，J.和McClelland，M.，Nucl.AcidsRes.，18(24)：7213-7218，1990)、DNA扩增指纹(DAF；Caetano-Anollés等人，Bio/Technology，9：553-557，1991)、微卫星PCR或小卫星区DNA的定向扩增(DAMD；Heath，D.D.等人，Nucl.Acids Res.，21(24)：5782-5785，1993)、和扩增片段长度多态性(AFLP)分析(EP 0 534 858；Vos，P.等人，Nucl.Acids Res.，23(21)：4407-4414，1995；Lin，J.J.和Kuo，J.，FOCUS，17(2)：66-70，1995)。可采用本发明组合物的核酸测序技术包括双脱氧测序法，诸如美国专利号4,962,022和5,498,523中描述的那些方法。在一个特别优选的方面，本发明可用于核酸分子的扩增或测序方法，包括一个或多个聚合酶链式反应(PCR)，诸如任何上述基于PCR的方法。

试剂盒

在另一个实施方案中，可以将本发明装配成用于逆转录或扩增核酸分子的试剂盒或者装配成用于核酸分子测序的试剂盒。依照本发明这一方面的试剂盒包括载体手段(诸如盒子、硬纸盒、管等等)，其中密封的装有一种或多种容器手段(诸如小瓶、管子、安瓿、瓶于、诸如此类)，其中第一容器手段装有具有逆转录酶活性的一种或多种本发明多肽。当使用超过一种具有逆转录酶活性的多肽时，可以将它们作为两种或多种多肽的混合物装在单一容器中，或者装在分开的容器中。本发明的试剂盒还可(在相同的或分开的容器中)包含一种或多种DNA聚合酶、合适的缓冲液、一种或多种核苷酸、和/或一种或多种引物。

在本发明的一个具体方面，逆转录和扩增试剂盒可以包含一种或多种成分(混合的或分开的)，包括具有逆转录酶活性的一种或多种本发明多肽、合成核酸分子所必需的一种或多种核苷酸、和/或一种或多种引物(如用于逆转录的寡聚dT)。这些逆转录和扩增试剂盒还可包含一种或多种DNA聚合酶。本发明的测序试剂盒可包含具有逆转录酶活性的一种或多种本发明多肽，任选包含一种或多种DNA聚合酶、核酸分子测序所需要的一种或多种终止剂(如双脱氧核苷三磷酸分子)、一种或多种核苷酸、和/或一种或多种引物。适用于本发明的逆转录、扩增、和测序试剂盒的具有逆转录酶活性的优选多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物、和其它成分包括上文所述。本发明这一方面涵盖的试剂盒还可包含进行标准核酸逆转录、扩增、或测序方案所必需的额外试剂和化合物。可以将这些具有逆转录酶活性的本发明多肽、DNA聚合酶、核苷酸、引物、和额外试剂、成分、或化合物装在一个或多个容器中，而且可以两种或多种上述成分的混合物的形式装在这些容器中，或者装在本发明试剂盒的分开的容器中。

核酸分子的使用

可以进一步表征通过本发明方法制备的核酸分子或cDNA文库，例如通过克隆和测序(即测定核酸分子的核苷酸序列)、通过本发明的测序方法、或通过本领域其它标准方法(参阅例如涉及DNA测序方法的美国专利号4,962,022和5,498,523)。或者，可以通过本领域众所周知的方法将这些核酸分子用于在工业过程中制造各种材料，诸如杂交探针。例如由cDNA生成杂交探针使得医学领域从业人员能够对患者细胞或组织检查特定遗传标记，诸如癌症、传染病或遗传病、或胚胎发育的标记的存在与否。另外，这些杂交探针可用于由自不同细胞、组织、或生物体制备的基因组DNA或cDNA文库分离DNA片段用于进一步表征。

本发明的核酸分子还可用于制备可用于重组DNA方法学的组合物。因此，本发明涉及包含本发明cDNA或扩增核酸分子的重组载体、通过遗传工程用重组载体改造的宿主细胞、使用这些载体和宿主细胞生成重组多肽的方法、和使用这些方法生成的重组多肽。

可以依照本发明这一方面使用本领域众所周知的方法通过将依照本发明方法制备的一种或多种cDNA分子或经扩增核酸分子插入载体来生成重组载体。用于本发明这一方面的载体可以是例如噬菌体或质粒，优选质粒。优选的是包含作用于目的多肽编码核酸的顺式作用控制区的载体。可以由宿主、互补载体、或载体自身导入宿主后提供适当的反式作用因子。

在这一方面的某些优选实施方案中，载体提供特异表达(因而称为“表达载体”)，它可以是诱导性的和/或细胞类型特异的。特别优选的是可被易于操作的环境因素，诸如温度和营养添加剂的诱导的那些载体。

可用于本发明的表达载体包括由染色体、附加体、和病毒衍生的载体，如由细菌质粒或细菌噬菌体衍生的载体和由其组合衍生的载体，诸如粘粒和噬菌粒，优选包含用于在细菌宿主细胞中培养的至少一种选择标记，诸如四环素或氨苄青霉素抗性基因。在插入这些表达载体前，应当将本发明的cDNA或扩增核酸分子可操作连接适当的启动子，诸如噬菌体λP_L启动子、大肠杆菌lac、trp、和tac启动子。本领域熟练技术人员知道其它合适的启动子。

优选用于本发明的载体包括pQE70、pQE60、和pQE-9(可以由Qiagen获得)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(可以由Stratagene获得)；pcDNA3(可以由Invitrogen公司获得)；pGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(可以由Pharmacia获得)；以及pSPORT1、pSPORT2和pSV·SPORT1(可以由Life Technologies(Invitrogen公司的一个部门)获得)。其它合适的载体对于本领域熟练技术人员而言将是显而易见的。

本发明还提供了生成包含本发明cDNA分子、扩增核酸分子、或重组载体的重组宿主细胞的方法，以及通过这些方法生成的宿主细胞。可以依照本发明生成的代表性宿主细胞(原核或真核)包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、和动物细胞。优选的细菌宿主细胞包括大肠杆菌细胞(最优选大肠杆菌菌株DH10B和Stb12，可以通过商业途经获得(Life Technologies，Invitrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰))、枯草芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、链霉菌种细胞、欧文氏菌种细胞、克雷伯氏菌种细胞、和鼠伤寒沙门氏菌细胞。优选的动物宿主细胞包括昆虫细胞(最优选Spodopterafrugiperda Sf9和Sf21细胞和Trichoplusa High-Five细胞)和哺乳动物细胞(最优选CHO、COS、VERO、BHK、和人细胞)。可以通过本领域普通技术人员熟悉的众所周知的转化、电传孔、或转染技术来制备这些宿主细胞。

另外，本发明提供了用于生成重组多肽的方法，和通过这些方法生成的多肽。依照本发明的这一方面，可以通过在有利于生成多肽的条件下培养任何上述重组宿主细胞，并分离多肽，由此生成重组多肽。用于培养重组宿主细胞和用于由此生成并分离多肽的方法对于本领域普通技术人员而言是众所周知的。

对于相关领域普通技术人员而言显而易见的是，可以对本文所述方法和应用进行其它合适的修改和改动而不违背本发明或其任何实施方案的范围。现在已经详细描述了本发明，通过参照下文实施例将能够更清楚的理解本发明，本文只是为了例示目的而包含这些实施例，并非意欲限制本发明。

实施例

下文实施例中使用了下列材料和方法。

使用RNA模板的LacZ正向实验

如Boyer，J.C.等人，“Analyzing the fidelity of reversetranscription and transcription”即逆转录和转录的保真度分析，Methods Enzymol.，275：523，1996所述进行实验，但具有下列不同处。

RNA模板的制备。将第112-113位核苷酸之间插入了T7RNA启动子的pUC19克隆(lacZ区与M13mp 19同源)用作RNA模板。

含缺口M13底物的构建。使用M13mp19(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)替代M13mp2。

感受态细胞的制备。使用Electromax DH12S感受态细胞(LifeTechnologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)替代MC1061。

诱变。如Kunkel，T.A.等人，Methods Enzymol.，204：125，1991所述通过由寡聚物指导的诱变来生成突变体。简而言之，将SuperScript II基因(RNA酶H结构域中包含点突变的M-MLV RT基因，见下文)插入pBADhisA(Invitrogen，Carlsbad，CA)载体，并命名为pBAD-SS II。将该质粒转化到DH11S细胞(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)中，并用M13K07辅助噬菌体进行感染，由此分离单链DNA。对应于每一种突变设计寡聚物：Y64W、R116M、K152R、Q190F、T197A、和V223H。使用T4多核苷酸激酶(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)和正向Rxn缓冲液(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)将100μM每种寡聚物³²P标记。将寡聚物与单链pBAD-SS II退火。在冰上向退火反应中加入天然T7DNA聚合酶(USB，克利夫兰，OH)和T4DNA连接酶(LifeTechnologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)及合成缓冲液(0.4mM dNTP、17.5mM Tris-HCl pH7.5、5mM MgCl₂、2.5mM DTT、和1mM ATP)。将反应于37℃保温30分钟，然后加入1μl 0.5MEDTA(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门，Rockville，马里兰)终止反应。将反应转化到DH10B细胞中并涂板。挑取菌落，通过限制性分析来测定突变体，并通过测序进行确认。测序使用ABI 377和ABI Big Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction即大染料终止剂循环测序简易反应试剂盒(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)。

突变体的蛋白质纯化。将包含诱导的RT的细胞沉淀以1g/2ml的比率悬浮于裂解缓冲液(40mM Tris-HCl pH8.0、0.1M KCl、1mM PMSF)。将悬浮液在冰上超声处理，然后以27,000xg离心30分钟。将无细胞提取物滤过0.45μm注射滤器。将无细胞提取物以1ml/min的流速应用于用5倍体积溶于缓冲液A(40mM Tris-HCl pH8.0、10％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1M KCl)的5mM咪唑预平衡的5ml Ni²⁺ HI-TRAP柱(Pharmacia)。用10倍体积溶于缓冲液A的5mM咪唑清洗柱子。通过20倍体积溶于缓冲液A的5mM-1M咪唑梯度的清洗来洗脱RT。将包含RT蛋白质的洗脱液以1.0ml/min的流速应用于用10倍柱床体积溶于缓冲液B(40mM Tris-HCl pH8.0、10％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1mMEDTA、1mM DTT)的50mM KCl预平衡的1ml Mono-S柱(Pharmacia)。用10倍体积溶于缓冲液B的50mM KCl清洗柱子。用20倍体积溶于缓冲液B的50mM-1M KCl梯度洗脱RT。对各个级分分析RT活性。将包含波峰RT活性的级分对储存缓冲液(40mM Tris-HCl pH8.0、50％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.1M KCl)进行透析。根据SDS-PAGE的判断，分离的蛋白质超过95％纯。使用Biorad比色法试剂盒测定蛋白质浓度，以BSA作为标准。

实施例1：M-MLV高保真突变体的突变频率

突变频率数据和错误率的计算。将突变体蚀斑(淡蓝或白色)数目除以蚀斑总数，然后减去起始DNA的背景突变频率，由此测定突变频率(mutation frequency，MF)。

正如SuperScript II(SS II，美国专利号5,244,797、5,405,776、5,668,005、和6,063,608)，测试的所有突变型逆转录酶都包含消除RNA酶H活性的点突变。在M-MLV RT基因中进行点突变以消除RNA酶H活性。点突变包括D524G、D583N、和E562Q。简而言之，将来自pRT601的RT基因插入pUC质粒，然后在RT基因的RNA酶H结构域中进行上述点突变。pRT601描述于美国专利号5,244,797、5,405,776、5,668,005、和6,063,608，并保藏于ATCC，编号67007(参阅美国专利号5,017,492)。本文将该RNA酶H^-突变体称为SuperScript II或SuperScript II基因。

表2

RT 总蚀斑突变体蚀斑 MF(x10^-4)

AMV 11195 71 58

表2：

RT 总蚀斑突变体蚀斑 MF(x10^-4)

AMV 11195 71 58

RSV 11435 46 35

M-MLV 10737 40 32

SS II(H^-RT) 17771 87 44

M-MLV Y64W 9007 30 28

M-MLV R116M 9834 32 28

M-MLV K152R 13988 45 27

M-MLV Q190F 10693 26 19

M-MLV T197A 15399 50 27

M-MLV V223H 17260 46 21

M-MLV V223F 6963 71 97

lacZα实验采用提供的RT将lacZαRNA拷贝成cDNA。在与M13退火、转染、并表达后，该cDNA克隆将具有正常的野生型表型即深蓝色蚀斑；或者，若RT在拷贝时出错，则它将具有突变型表型即浅蓝色或清亮的蚀斑。错误可以是插入、删除、或错掺的形式。突变型RT相对于M-MLV RNA酶H^- RT(SuperScript II)的任何突变频率降低指示保真度增加。如表2所示，选择的突变体证明了突变频率降低1.5-2.3倍。突变体V223F具有比SS II高2.2倍的突变频率，因而具有较低保真度。

实施例2：DNA模板错插实验

Y64W、R116M、K152R、Q190F、T197A、V223H M-MLV RNase H ^- RT 的DNA模板错插实验。该实验用于比较突变体与SuperScript II(M-MLVRNA酶H^-RT)的错掺能力。该实验即使用合成DNA模板-引物和只包含4种dNTP之3种的偏倚dNTP集合的引物延伸实验。反应展示于图1-3的凝胶上。在该实验中，在缺乏一种dNTP时引物的延伸效率越高指示保真度越低。如图1-3所示，在存在所有4种dNTP时，SuperScript II和所有选定突变体都能够大致相等的延伸引物，只是在向引物末端添加非模板指导的核苷酸时有些不同。然而，在与核苷酸的偏倚集合一起保温时，SS II能够催化越过模板核苷酸的充分延伸，此时错过一个互补dNTP，指示错误核苷酸的使用和较低保真度。在图1中，V223H突变体(指定泳道2)在每一种3种dNTP偏倚集合中显示比SS II更短的延伸产物，指示掺入错误核苷酸的能力较低，因而保真度较高。这符合lacZα实验的结果，其中V223H突变体具有比SS II低的突变频率，分别是21x10^-4对44x10^-4。另一方面，在lacZα实验中具有比SS II高的突变频率(97x10^-4)的V223F(泳道3)，在每一种偏倚集合中也具有比SS II长或相等大小的延伸产物，指示它具有较低保真度。这些数据显示了在DNA上进行的错插实验与在RNA上进行的lacZα实验之间的相关性，其中具有较高保真度的突变体在偏倚dNTP集合中具有较短延伸产物，且在lacZα实验中具有较低突变频率。图2和图3显示了突变体R116M、Q190F、K152R、T197A、和Y64W的相似结果，其中每一种在偏倚核苷酸集合中都具有比SS II短的引物延伸产物。

实施例3：TdT逆转录酶突变体

在3dNTP实验中检查逆转录酶(RT)的保真度突变体以发现错延(misextension)时，观察到SS II RT在存在3种和4种dNTP时越过模板末端延伸了2-3个碱基。这种非模板指导的延伸或TdT活性在许多突变体中降低了，但是在少数突变体诸如F309N和T197E中，这种活性似乎剧烈降低或消除。根据这些突变体与HIV逆转录酶的同源性及其与结合的模板-引物的晶体结构的测定，可能这些突变体与模板-引物紧密接近或相接触。

方法

诱变

对于F309N：

根据突变型位置F309设计引物，且在第310-311位氨基酸处沉默插入NgoMIV限制性位点。引物在该位置编码随机NNK序列，生成F309突变体的随机文库，其中N是4种碱基之任一，K是T或G。将引物与位于上游SstI限制性位点和下游SalI限制性位点的内部SS II RT引物一起用于标准PCR反应(10ng SS II RT模板、2μM每种引物、48μlSupermix(Life Technologies，Invitrogen公司的一个部门)，20个循环：94℃15sec、55℃15sec、72℃30sec)，生成两种PCR片段，即240bp SstI-NgoMIV片段和200bp NgoMIV-SalI片段。将片段分离、消化、并连接到一起，然后插入经SstI和SalI切割的最初SS II RT克隆。将生成的连接产物转化到Max Efficiency DH10B(LifeTechnologies，Invitrogen公司的一个部门)感受态细胞中以生成F309位点的突变体文库。然后将该文库涂板过夜用于选择。

对于T197E和Y133A：

如Kunkel，T.A.等人，Methods Enzymol.，204：125，1991所述通过由寡聚物指导的诱变来生成突变体T197E和Y133A。简而言之，将SuperScript II RT基因插入pBADhisA(Invitrogen公司)载体，并命名为pBAD-SS II。将该质粒转化到DH11S细胞中，并用M13K07辅助噬菌体感染细胞，由此分离单链DNA。设计对应于每一种突变的寡聚物：T197E和Y133A。使用T4DNA激酶(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门)和正向Rxn缓冲液(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门)将100μM每种寡聚物激活(即磷酸化)。将寡聚物与单链pBAD-SS II DNA退火。在冰上向退火反应中加入天然T7DNA聚合酶(USB)和T4DNA连接酶(Life Technologies，Invitritrogen公司的一个部门)及合成缓冲液(0.4mM dNTP、17.5mMTris-HCl pH7.5、5mM MgCl₂、2.5mM DTT、和1mM ATP)。将反应于37℃保温30分钟，然后加入1μl0.5M EDTA终止反应。将反应转化到DH10B细胞中并涂板。挑取菌落，通过限制酶分析来测定突变体，并通过测序进行确认。测序使用ABI 377仪器和ABI Big Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction即大染料终止剂循环测序简易反应试剂盒。

选择包含有活性RT的菌落。将各个转化菌落接种到96孔培养板的单个孔中。每个孔装有120μl包含0.2％阿拉伯糖的培养基(EG-Ap)。优选首先接种装有不含诱导剂的选择培养基的96孔板，将母板培养过夜，然后将母板复制到包含诱导剂的96孔板并将后者培养过夜。将培养物于37℃静置培养过夜。将过夜培养物与等体积的2x PLD(1.8％葡萄糖、50mM Tris-HCl pH8.0、20mM EDTA、20mM DTT、1％屈立通X-100、2mg/ml溶菌酶)于室温混合。通过混合10μl提取物与40μl 1.25x RT反应混合液(62.5mM Tris-HCl pH8.4、62.5mM KCl、12.5mM MgCl₂、12.5mM DTT、1.25mM dGTP、多聚C/寡聚dG(3.75mM/1.5mM，以核苷酸计)、[³²P]dGTP)，对这些提取物直接测定RT活性。将该反应置于37℃水浴中达10分钟。将少量反应混合液(5μl)点到带电尼龙膜(Genescreen+，NEN)上。将膜用10％TCA+1％焦磷酸钠清洗2次，用乙醇漂洗，干燥，并贴在磷光屏上。使用ImageQuant软件(MolecularDevices)通过分析Phosphorimager即磷光成像仪的屏幕来检测滤膜上捕获的放射性产物。选择显示RT活性(放射性)的候选者。再次筛选这些候选者以确认表型。然后将确认后的候选者测序以测定维持可检测RT活性的氨基酸。

RT突变体的纯化

将包含诱导的RT的细胞沉淀以1g/2ml的比率悬于裂解缓冲液(40mM Tris-HCl pH8.0、0.1M KCl、1mM PMSF)。将悬浮液在冰上超声处理，然后以27,000xg离心30分钟。将无细胞提取物滤过0.45μm注射滤器。将无细胞提取物以1ml/min的流速应用于用5倍体积溶于缓冲液A(40mM Tris-HCl pH8.0、10％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1M KCl)的5mM咪唑预平衡的5ml Ni²⁺ HI-TRAP柱(Pharmacia)。用10倍体积溶于缓冲液A的5mM咪唑清洗柱子。通过20倍体积溶于缓冲液A的5mM-1M咪唑梯度的清洗来洗脱RT。将包含RT蛋白质的洗脱液以1.0ml/min的流速应用于用10倍柱床体积溶于缓冲液B(40mM Tris-HClpH8.0、10％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1mM EDTA、1mM DTT)的50mM KCl预平衡的1ml Mono-S柱(Pharmacia)。用10倍体积溶于缓冲液B的50mM KCl清洗柱子。用20倍体积溶于缓冲液B的50mM-1M KCl梯度洗脱RT。对各个级分分析RT活性。将包含波峰RT活性的级分对储存缓冲液(40mM Tris-HCl pH8.0、50％甘油、0.01％屈立通X-100、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.1M KCl)进行透析。根据SDS-PAGE的判断，纯化的RT超过95％纯。使用Biorad比色法试剂盒测定蛋白质浓度。

3种dNTP实验方法。对Preston，B.D.等人，Science，242：1168，1988的流程进行了修改。通过47聚体模板(5’-GAGTTACAGTGTTTTTGTTCCAGTCTGTAGCAGTGTGTGAATGGAAG-3’)(SEQ IDNO：1)与18聚体引物(5’-CTTCCATTCACACACTGC-3’，SEQ ID NO：2)(用T4多核苷酸激酶在5’末端[³²P]标记)(模板：引物为3∶1)的退火来制备DNA模板-引物。实验混合液(10μl)包含5nM模板-引物、50-200nM图例中指定的RT、3或4种dNTP(每种250μM)、50mMTris-HCl pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl₂、10mM DTT。将反应于37℃保温30分钟，然后加入5μl 40mM EDTA、99％甲酰胺终止反应。通过于95℃保温5分钟使反应产物变性，并通过尿素6％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

为了测定3dNTP实验的对照反应(使用所有4种dNTP)中是否存在任何TdT活性，重复对照反应，但改变酶量，由＞600单位至20单位，于37℃保温30分钟。对于SS II、T197E、和Y133A，使用200、100、50、和20单位。对于F309N，使用646、200、50、和20单位。

结果

我们进行了F309N(H204R、T306K)SuperScript II RT(以下称为F309N)的DNA模板错插(misinsertion)实验。该实验用于比较突变体与SuperScript II的错掺(misincorporation)能力。该实验即使用合成DNA模板-引物和只包含4种dNTP之3种的偏倚dNTP集合的引物延伸实验。反应展示于图4的凝胶上。在进行该流程以筛选具有较低错插/错延(misextension)率的突变体时，观察到SS II RT越过模板末端延伸了2-3个碱基，而且有些突变降低或似乎消除了这种非模板指导的延伸或TdT活性。如图4所示，在存在所有4种dNTP时，SuperScript IIRT和突变体F309N能够大致相等的延伸引物，只是SS II RT越过模板添加2个核苷酸，而F309N并不越过模板末端添加核苷酸。为了进一步评估这种非模板指导的延伸，用SS II、F309N、T197E、和Y133A RT进行3dNTP错延实验的对照反应(包含所有4种dTNP)达30分钟，但改变酶量。3种突变体在先前筛选中显示水平降得很低的TdT活性。既然观察到使用20个单位的酶进行5分钟即超过足够完成引物延伸的时间，那么保温30分钟和200-646个单位的RT都大大超过完成反应所必需的量。如图5所示，使用最低测试量的所有RT反应都具有与使用最高单位浓度的反应相似的延伸产物，证明反应进行完全了。SS II RT越过模板末端添加2个核苷酸，F309N和T197E并不越过模板末端延伸，Y133A似乎具有越过模板末端添加1个核苷酸的少量产物。

实施例4：热稳定和TdT双重突变体

M-MLV逆转录酶(RT)中的F309氨基酸位置对应HIV逆转录酶中的W266位置。该位置位于拇指结构域的基部，而且被认为是与模板-引物小沟相互作用的小沟结合束的一部分。据显示，突变H204R和T306K增加酶的热稳定性。这些突变描述于2000年5月26日提交的美国申请号60/207,197(将其公开书完整收入本文作为参考)。与SuperScript IIRT或SuperScript II RT中的H204R/T306K相比，H204R/T306K克隆中的F309N突变在RNA模板lacZ正向实验(表3)中展示低2.3倍的突变频率，且在3dNTP延伸实验中展示较短的延伸产物。这两项发现均说明酶具有较高保真度(表4)。

表3：SuperScript II RT和点突变体的突变频率。

通过将突变体蚀斑(浅蓝或白色)数目除以蚀斑总数，由此测定突变频率(MF)。关于起始DNA的背景突变体频率，前3种构建物是17x10^-4，最后一种构建物是20x10^-4。

方法

诱变。如实施例3所述，使用标准定点诱变方案，将包含V223H突变的引物与具有下列突变的SuperScript II的单链DNA退火：H204R、T306K、F309N。对菌落测序以确认V223H、H204R、T306K、和F309N的新组合。

选择包含有活性RT的菌落。如实施例3所述进行菌落选择。

RT突变体的纯化。如实施例3所述进行纯化。

蚀斑测序。将来自lacZ正向实验的蚀斑由软琼脂板转移至Whatmann 3MM纸上，随后干燥至少1小时。然后取出蚀斑，并将蚀斑/纸片直接加到包含4-8μl ABI PRISM Dye Terminator CycleSequencing Ready Reaction即染料终止剂循环测序简易反应(PerkinElmer)、1μl引物(GAAGATCGCACTCCAGCCAGC)(SEQ ID NO：3)、和蒸馏水(总体积20μl)的测序反应混合液中。使用ABI循环测序方案：96℃ 10sec、50℃5sec、60℃4min，25个循环。除去纸片，并将反应物沉淀，然后重悬于上样染料，并在ABI 377测序仪上运行。

将序列与野生型lacZα序列进行比较，然后归类为移码(插入或删除1个核苷酸)、错配、或链跳跃(重复序列之间的插入或删除)。通过将突变频率除以可检测位点(即其改变导致表型变化的位点)的数目(116)，乘以0.5(以排除最初单链的贡献)，然后乘以观察到的每一类突变体的百分比，由此测定每一类的整体错误率。ER＝MF/(可检测位点x0.5)x(每一类的％)。

3dNTP测定法。如实施例3所述进行3dNTP实验。

结果

我们进行了F309N(H204R、T306K)SuperScript逆转录酶(以下称为F309N)和V223H F309N(H204R T306K)(以下称为V223H/F309N)的DNA模板错插实验。该实验用于比较突变体与SuperScript II的错掺能力。该实验即使用合成DNA模板-引物和只包含4种dNTP之3种的偏倚dNTP集合的引物延伸实验。反应展示于图6和图7的凝胶上。在该实验中，引物延伸效率越高指示保真度越低。如图6和7所示，在存在所有4种dNTP时，SuperScript II RT和突变体F309N和V223H/F309N能够大致相等的延伸引物，只是在向引物末端添加非模板指导的核苷酸时有些不一致。然而，在与核苷酸的偏倚集合一起保温时，SuperScript IIRT能够催化越过模板核苷酸的充分延伸，此时错过一个互补dNTP，指示错误核苷酸的使用和较低保真度。在图6中，F309N突变体(2)在每一种3种dNTP偏倚集合中显示比SS II更短的延伸产物，指示掺入错误核苷酸的能力较低，因而保真度较高。在图7中，V223H/F309N突变体只在dATP和dCTP集合中延伸。在每种情况中，V223H/F309N还具有比SuperScript II短的延伸产物。这符合lacZα实验的结果，其中F309N和V223H/F309N突变体具有比SS II RT低的突变频率(17x10^-4和14x10^-4对39x10^-4)。包含H204R T306K突变但不含F309N突变的RT具有与SS IIRT相似的突变频率(41x10^-4对39x10^-4)，说明这些突变不影响保真度。这些数据显示了在DNA上进行的错插实验与在RNA上进行的lacZα实验之间的相关性，其中具有较高保真度的突变体在使用dNTP集合时具有较短延伸产物，且在lacZα实验中具有较低突变频率。

实施例5：错误率测定

为了测定错误率，使用已知方法将来自lacZ正向实验的突变体蚀斑测序。然后将突变归类为下列类型之一：错配(即错插事件)、移码(即单个插入或删除事件)、或跳跃(由相似序列之间的跳跃引起的大段插入或删除)。然后使用下面的方程为编码l acZ α肽的核酸测定整体错误率：

ER(错误率)＝MF(突变频率)/(可检测位点数目x0.5)，其中可检测位点数目是116。

并非lacZ正向实验中突变的所有碱基都导致可检测的表型变化。为了测定错配、移码、和跳跃的具体错误率，需要修改突变频率，即乘以每一类突变体的总％，然后用于测定具体错误率。下面是来自SuperScript II RT和高保真SuperScript II H203R T306K F309N逆转录酶实验的M13mp19中的lacZα肽的序列图谱。下划线指示删除；“∧”指示插入上面所示碱基A、T、C、或G；完整序列上面所示A、LC、或G指示错配。

SuperScriptII图谱

T C

T T TC C

AGCGCAACGC AATTAATGTG AGTTAGCTCA CTCATTAGGC ACCCCAGGCT TTACACTTTA

1 1 4

CG C CC

TGCTTCCGGC TCGTATGTTG TGTGGAATTG TGAGCGGATA ACAATTTCAC ACAGGAAACA

1

C

CC CG C

GCTATG ACC ATG ATT ACG^CCA AGC TTG CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG

1

T AAAA

T A AAA

T T A A

T T T A T A C

GTA CCG AGC TCG AAT TCA CTG GCC GTC GTT^TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC CCT GGC

7 1 1 1

TTTTT

C TTTTT

C TTT

A T T

TC C C T TC T C T T C G T

GTT ACC CAA CTT AAT CGC CTT GCA GCA CAT CCC^CCT^TTC^GCC AGC TGG CGT

1 4

AAT AGC G (SEQ ID NO：4)

本说明书中提及的所有发表物、专利、和专利申请指示了适合于进行本发明的本领域技术人员的技术水平，并将它们收入本文作为参考，就像明确的且个别的指示收入每一项个别发表物、专利、或专利申请作为参考。

在为了清楚理解本发明而通过例示和实施例的方式较为详细的完整描述本发明之后，对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的，可以通过在广泛且等同的范围内更改或改变条件、配方、和其它参数来进行本发明而不影响本发明或其任何具体实施方案的范围，而且意欲将这些更改或改变涵盖在所附权利要求的范围之内。

序列表

<110>Invitrogen公司

<120>高保真逆转录酶及其用途

<130>0942.503PC01

<140>待转让

<141>同此

<150>US 60/189,454

<151>2000-03-15

<160>4

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>1

gagttacagt gtttttgttc cagtctgtag cagtgtgtga atggaag 47

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>2

cttccattca cacactgc 18

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>寡核苷酸

<400>3

gaagatcgca ctccagccag c 21

<210>4

<211>298

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>SuperScript II

<400>4

agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta 60

tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 120

gctatgacca tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg 180

gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 240

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcg 298

Claims

1.一种莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)逆转录酶，其中所述逆转录酶包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：Tyr64、Arg116、Lys152、Gln190、Thr197和Phe309；并且该逆转录酶增加或增强了保真度、降低或消除了核酸合成过程中的核苷酸错掺和/或降低或消除了末端脱氧核苷酸转移酶活性。

2.权利要求1的逆转录酶，其中所述突变位于Tyr64处。

3.权利要求2的逆转录酶，其中Try64被色氨酸替代。

4.权利要求1的逆转录酶，其中所述突变位于Arg116处。

5.权利要求4的逆转录酶，其中Arg116被甲硫氨酸替代。

6.权利要求1的逆转录酶，其中所述突变位于Lys152处。

7.权利要求6的逆转录酶，其中Lys152被精氨酸替代。

8.权利要求1的逆转录酶，其中所述突变位于Gln190处。

9.权利要求8的逆转录酶，其中Gln190被苯丙氨酸替代。

10.权利要求1的逆转录酶，其中所述突变位于Thr197处。

11.权利要求10的逆转录酶，其中Thr197被丙氨酸替代。

12.权利要求1的逆转录酶，其中所述突变位于Phe309处。

13.权利要求12的逆转录酶，其中Phe309被天冬酰胺替代。

14.包含突变的MMLV逆转录酶，其中Val223被组氨酸替代。

15.权利要求1或14的逆转录酶，其中所述逆转录酶具有实质性降低的RNaseH活性。

16.权利要求15的逆转录酶，其中所述逆转录酶包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：Asp583和Glu562。

17.权利要求16的逆转录酶，其中Asp583被天冬酰胺所替代。

18.权利要求16的逆转录酶，其中Glu562被谷氨酰胺所替代。

19.权利要求1或14的逆转录酶，其在RNaseH结构域内包含至少一个突变。

20.权利要求1或14的逆转录酶，其中所述逆转录酶包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：Asp583和Glu562。

21.权利要求20的逆转录酶，其中Asp583被天冬酰胺所替代。

22.权利要求20的逆转录酶，其中Glu562被谷氨酰胺所替代。

23.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的保真度是未突变逆转录酶的1.5-50倍。

24.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的保真度是未突变逆转录酶的10-50倍。

25.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的保真度是未突变逆转录酶的20-50倍。

26.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的保真度是未突变逆转录酶的30-50倍。

27.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的错掺率是未突变逆转录酶的50％。

28.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的错掺率是未突变逆转录酶的25％。

29.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的错掺率是未突变逆转录酶的10％。

30.权利要求1的逆转录酶，其中修饰位于逆转录酶的指区。

31.权利要求1的逆转录酶，其中修饰位于逆转录酶的拇指区。

32.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的末端脱氧核苷酸转移酶比活低于未突变逆转录酶比活的75％。

33.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的末端脱氧核苷酸转移酶比活低于未突变逆转录酶比活的50％。

34.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的末端脱氧核苷酸转移酶比活低于未突变逆转录酶比活的25％。

35.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的末端脱氧核苷酸转移酶比活低于未突变逆转录酶比活的10％。

36.权利要求1的逆转录酶，其中所述经突变的逆转录酶的末端脱氧核苷酸转移酶比活低于未突变逆转录酶比活的1％。

37.包含编码权利要求1-36中任一项的逆转录酶的核酸分子的载体。

38.权利要求37的载体，其中所述核酸分子可操作连接了启动子。

39.权利要求38的载体，其中所述启动子选自下组：1-P_L启动子、tac启动子、trp启动子、和trc启动子。

40.包含权利要求37-39中任一项的载体的宿主细胞。

41.逆转录酶的生产方法，所述方法包括：

a)培养权利要求40的宿主细胞；

b)表达所述核酸分子；并

c)由所述宿主细胞分离所述逆转录酶。

42.权利要求41的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

43.用于逆转录一种或多种第一核酸分子的方法，所述方法包括：

a)将一种或多种核酸模板与权利要求1-36中任一项的一种或多种逆转录酶混合；并

b)在足以生成与所述一种或多种模板的整个或部分互补的一种或多种第一核酸分子的条件下将(a)的混合物保温。

44.权利要求43的方法，其中所述核酸模板是mRNA分子或mRNA分子群。

45.权利要求43的方法，还包括在足以生成与所述一种或多种第一核酸分子的整个或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下将所述一种或多种第一核酸分子保温。

46.依照权利要求43-45中任一项的方法生成的cDNA分子。

47.用于扩增一种或多种核酸分子的方法，所述方法包括：

a)将一种或多种核酸模板与权利要求1-36中任一项的逆转录酶和一种或多种DNA聚合酶混合；并

b)在足以扩增与所述一种或多种模板的整个或部分互补的一种或多种核酸分子的条件下将(a)的混合物保温。

48.用于将一种或多种核酸分子测序的方法，所述方法包括：

a)将一种或多种待测序核酸分子与一种或多种引物、权利要求1-36中任一项的逆转录酶、一种或多种核苷酸、和一种或多种终止剂混合；

b)在足以合成与所述一种或多种待测序分子的整个或部分互补的核酸分子群的条件下将(a)的混合物保温；并

c)将所述群与所述群中的其它分子分开以测定所述一种或多种待测序分子的整个或部分的核苷酸序列。

49.用于核酸分子的逆转录、扩增、或测序的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-36中任一项的一种或多种逆转录酶。

50.权利要求49的试剂盒，还包含选自下组的一种或多种成分：一种或多种核苷酸、一种或多种DNA聚合酶、一种或多种缓冲液、一种或多种引物、和一种或多种终止剂。

51.权利要求50的试剂盒，其中所述终止剂是双脱氧核苷酸。