CN116064460B - 一种mmlv突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种逆转录酶MMLV突变体，涉及生物技术领域，具体涉及一种MMLV突变体及其应用。本发明的MMLV突变体由于缺失以DNA为模板的DNA聚合酶活性，可以避免在逆转录的过程中提前合成第二链cDNA，进而解决现有技术中链特异性不足的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种MMLV突变体及其应用。
背景技术
总RNA(total RNA)中95％以上都是核糖体RNA(rRNA)，而rRNA在整个人类当中都是非常保守的，而且在人的各个组织器官当中也是极度稳定的。也就是说，rRNA并不能为我们实验者提供什么有用的信息，只占total RNA总量2％-3％的mRNA才是RNA当中信息含量最丰富的那个部分，是人们在科学研究中主要的关注点。比如，对照组和处理组之间的基因表达差异，处理不同时间点之间的基因表达差异，正常组织和肿瘤组织之间的转录组表达差异等等。
由于RNA为单链，但普通的转录组文库测序会同时测到模板链及其反向互补信息，不但无法判断原始的mRNA的方向，同时也会对转录本的定量的准确性产生干扰。而链特异性文库则可以在建库过程中将反向互补序列的文库直接消化掉，不仅保留了原始的mRNA的方向，同时也提高了定量的准确性。
目前最为常用的链特异文库构建方法是dUTP二链法，通过PolyA捕获或去除了rRNA之后的RNA，片段化后用随机引物逆转录合成cDNA第一链，在合成第二链时用dUTP替代dTTP，接头连接后用UDG酶将合成的第二链降解，只留下两端带有不同序列接头的cDNA第一链进入后续的PCR扩增环节，扩增出来的文库就保留了RNA的方向性。链特异性文库除了在二链合成时与普通转录组文库有所不同之外，在一链合成时也会多加入一个试剂——放线菌素D(Actinomycin D，ActD)，它能抑制聚合酶在合成cDNA一链的过程中同时合成cDNA二链。放线菌素D分子中含有一个苯氧环结构，通过它连接两个等位的环状肽链。此肽链可与DNA分子的脱氧鸟嘌呤发挥特异性相互作用，使Actinomycin D嵌入DNA双螺旋的小沟中，与DNA形成复合体，阻碍RNA多聚酶的功能，因此可以实现链特异转录组建库。但是放线菌素D是一个不稳定的物质，遇光容易降解。且是一个毒性物质，长期接触可抑制睾丸或卵巢功能，引起闭经或精子缺乏等。
逆转录酶(Reverse transcriptase)通常具有三种活性：以RNA为模板的DNA聚合酶活性、以DNA为模板的DNA聚合酶活性以及降解RNA-DNA杂合链中RNA的RNase H活性。因此，逆转录酶常用于cDNA文库构建、mRNA测序、RT-PCR定量等，被广泛应用于研究及医学分子诊断领域。MMLV逆转录酶(Moloney Murine Leukemia virus)的RNase H活性限制了合成长cDNA的效率。通过开发出RNase H活性降低，且完整保留了RNA依赖性DNA聚合酶活性的突变体(H-MMLV逆转录酶)，克服了这个问题，同时对于全长cDNA的合成有了很大改善，热稳定性也有了一定的提高，因此目前使用的逆转录酶均为MMLV(H-)。然而，由于逆转录酶的以DNA为模板的DNA聚合酶活性，在逆转录的过程中会提前合成第二链，影响链特异。
因此，设计突变掉以DNA为模板的DNA聚合酶活性的逆转录酶显得尤为重要，其可以避免在逆转录的过程中提前合成第二链，进而在链特异建库流程中免于使用Actinomycin D。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种新型MMLV逆转录酶突变体，该MMLV突变体由于缺失以DNA为模板的DNA聚合酶活性，可以避免在逆转录的过程中提前合成第二链cDNA，进而解决现有技术中链特异性不足的问题。
本发明的第一方面提供一种逆转录酶MMLV突变体，所述MMLV突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本逆转录酶相比，含有选自下组的至少一个位点上的氨基酸取代：第52位、第70位、第160位、第176位、第190位。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含选自下组的至少一个位点取代(例如一个、两个、三个、四个或五个)：K52Q、R70S、H160N、M176C、G190D。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代K52Q和M176C，进一步包含一种或多选自下述的修饰R70S、H160N、G190D。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体与SEQ ID NO.1具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列一致性。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代K52Q或由其组成。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代R70S或由其组成。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代H160N或由其组成。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代M176C或由其组成。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代G190D或由其组成。
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在一些实施方案中，所述MMLV突变体包含取代K52Q、M176C、G190D或由其组成。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10或SEQ ID NO.11所示。
在一些实施方案中，所述MMLV突变体与亲本相比具有改进的以RNA为模板的DNA聚合酶活性，和/或，所述变体与亲本相比缺少以DNA为模板的DNA聚合酶活性。
本发明的第二方面提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明所述的MMLV突变体。
本发明的第三方面提供一种核酸载体，其包含编码本发明所述MMLV突变体的多核苷酸，例如质粒，粘粒或噬菌体。
本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其用于表达本发明所述的MMLV突变体、多核苷酸和/或核酸载体，例如大肠杆菌细胞，酵母细胞或小鼠细胞。
本发明的第五方面提供一种制备本发明所述MMLV突变体的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括在合适的条件下培养本发明第四方面的宿主细胞，提取纯化MMLV突变体。
本发明的第六方面提供本发明所述的MMLV突变体在逆转录中的应用。
在一些实施方案中，所述逆转录反应体系中不包含放线菌素D。
本发明的第七方面提供一种试剂盒，其包含本发明所述的MMLV突变体。
在一些实施方案中，所述试剂盒不包含放线菌素D。
本发明中取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸。
附图说明
图1：实施例2中亲本MMLV逆转录酶及突变体1-10的qPCR实验结果。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
实施例1
对亲本MMLV逆转录酶(SEQ ID NO.1)进行位点突变得到MMLV突变体1-10，具体制备方法参照文献(Kiyoshi Yasukawa,Masaki Mizuno,Atsushi Konishi,et al.Increasein thermal stability of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptaseby site-directed mutagenesis[J].Journal of Biotechnology,2010,150(3).)，亲本MMLV逆转录酶的氨基酸序列如下：
LNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI
其中MMLV突变体1-10及对应的突变位点和氨基酸序列见表1。
表1
实施例2
以293T Total RNA为起始样本，分别使用亲本MMLV逆转录酶、MMLV突变体1-10对Total RNA进行逆转录，并通过qPCR检测样本中GAPDH基因表达量，评价MMLV突变体1-10的逆转录活性，具体步骤如下。
将Total RNA模板稀释至100ng/μl，根据表2配制逆转录反应体系，混匀后瞬时离心收集至管底，25℃5min；50℃15min；85℃2min上机。
表2逆转录反应体系
将上一步获得的cDNA产物稀释100倍，而后分别取1μl作为模板，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(货号Q711)对GAPDH基因进行定量，其中使用的引物序列见表3。
表3引物序列
| 引物名称 | 序列(5'→3') | SEQ ID NO. |
| GAPDH基因上游引物 | AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG | 12 |
| GAPDH基因下游引物 | GGCAGAGATGATGACCCTTTT | 13 |
qPCR检测结果如图1所示，突变之后的逆转录酶在逆转录效率上与亲本MMLV逆转录酶差异不算大，其中突变体6和突变体10效果最佳。
实施例3
以293T Total RNA为模板，起始投入量为1μg，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina(货号NR604)进行链特异转录组建库。
文库构建流程参照说明书进行，其中，分别使用200U MMLV突变体1-10替换试剂盒中的1st Strand Enzyme Mix 2，且一链cDNA合成过程中不使用ActD，二链合成选择2ndStrand Buffer(with dUTP)。每组试验进行两次重复，对获得的文库产物进行质量评价，测定文库产出和链特异情况，结果见表4和表5。
表4不同MMLV突变体对文库产出的影响(单位：ng/μl)
表5不同MMLV突变体对文库链特异情况的影响
| 重复1 | 重复2 | |
| NR604对照(含ActD) | 0.99 | 0.98 |
| NR604对照(不含ActD) | 0.90 | 0.90 |
| 突变体1(不含ActD) | 0.99 | 0.99 |
| 突变体2(不含ActD) | 0.99 | 0.98 |
| 突变体3(不含ActD) | 0.97 | 0.98 |
| 突变体4(不含ActD) | 0.98 | 0.98 |
| 突变体5(不含ActD) | 0.98 | 0.98 |
| 突变体6(不含ActD) | 0.99 | 0.99 |
| 突变体7(不含ActD) | 0.98 | 0.98 |
| 突变体8(不含ActD) | 0.97 | 0.98 |
| 突变体9(不含ActD) | 0.99 | 0.99 |
| 突变体10(不含ActD) | 0.99 | 0.99 |
Claims (9)
1.一种逆转录酶MMLV突变体，所述MMLV突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本逆转录酶相比，包含下列位点取代中的任意一个：
(1)K52Q；
(2)R70S；
(3)H160N；
(4)M176C；
(5)G190D；
(6)K52Q和M176C；
(7)R70S和G190D；
(8)K52Q、R70S和H160N；
(9)H160N、M176C和G190D；
(10)K52Q、M176C和G190D。
2.权利要求1所述的MMLV突变体，所述变体与亲本相比具有增加的以RNA为模板的DNA聚合酶活性，和/或，所述变体与亲本相比缺少以DNA为模板的DNA聚合酶活性。
3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-2任一项所述的MMLV突变体。
4.包含权利要求3所述多核苷酸的载体。
5.一种宿主细胞，其用于表达权利要求1-2任一项所述的MMLV突变体、权利要求3所述的多核苷酸和/或权利要求4所述的载体。
6.权利要求1-2任一项所述的MMLV突变体在逆转录中的应用。
7.权利要求6所述的应用，所述逆转录的反应体系中不包含放线菌素D。
8.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-2任一项所述的MMLV突变体。
9.权利要求8所述的试剂盒，不包含放线菌素D。
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| CN107058258A (zh) * | 2008-04-10 | 2017-08-18 | 赛默飞世尔科技波罗的海Uvb公司 | 一种逆转录酶和编码其的多核苷酸 |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer;Bahram Arezi, et al.;Nucleic Acids Res.;第37卷(第02期);473-481 * |
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