JP2004502443A - 高忠実度ポリメラーゼおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、忠実度が増加した(または誤取り込み率が低下した)DNAおよびRNAポリメラーゼに関する。特に、本発明は、ポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を上昇または増強させることにより、例えば、あるポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを、別のポリメラーゼに由来する望ましい活性を備えた3’−5’エキソヌクレアーゼドメインで置換することにより、このようなポリメラーゼを作製する方法に関する。本発明は、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むDNA分子、このようなDNA分子を含む宿主細胞、および、このような宿主細胞を用いてポリメラーゼを作製するための方法にも関する。本発明のポリメラーゼは、核酸合成、配列決定、増幅、およびcDNA合成に特に適している。
Description
【0001】
発明の背景
発明の分野
本発明は、忠実度の高い実質的に純粋なポリメラーゼに関する。特に、本発明のポリメラーゼは、ポリメラーゼの忠実度が増加し(非改変型または非変異型のポリメラーゼと比べて)、それによって誤取り込み率(misincorporation rate)が低いポリメラーゼが得られるように改変されたポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ)である。本発明のポリメラーゼは耐熱性または中温性のポリメラーゼであることが好ましい。本発明は、本発明のポリメラーゼのクローニングおよび発現、クローニングされた遺伝子を含むDNA分子、ならびに前記遺伝子を発現する宿主にも関する。本発明のポリメラーゼは、DNA配列決定、増幅反応、核酸合成およびcDNA合成に用いうる。
【0002】
本発明は、1つまたは複数の追加的な変異または改変を有する本発明のポリメラーゼにも関する。このような変異または改変には、(1)ポリメラーゼが、ジデオキシヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドをデオキシヌクレオチドと同程度の効率でDNA分子に取り込む能力を増強または増大させるもの;ならびに(2)5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下させるものが含まれる。本発明のポリメラーゼは、これらの特性の1つまたは複数を有しうる。これらのポリメラーゼを、DNA配列決定、増幅反応、核酸合成およびcDNA合成に用いてもよい。
【0003】
関連技術
DNAポリメラーゼは、DNAテンプレートに対して相補的なDNA分子の形成を司る。プライマーが一本鎖DNAテンプレートとハイブリダイズすると、ポリメラーゼはDNAを5’から3’の向きに合成し、成長する鎖の3’−ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的に付加する。このようにして、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)およびプライマーの存在下で、一本鎖DNAテンプレートに対して相補的な新たなDNA分子の合成が可能になる。
【0004】
多数のDNAポリメラーゼが大腸菌(E.coli)などの中温性微生物から単離されている。これらの中温性DNAポリメラーゼの多くに対してはクローニングも行われている。リン(Lin)らは、T4 DNAポリメラーゼをクローニングし、大腸菌(E.coli)で発現させている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7000〜7004(1987))。タボール(Tabor)ら(米国特許第4,795,699号)はクローニングしたT7 DNAポリメラーゼを記載しており、ミンクレー(Minkley)ら(J Biol. Chem. 259:10386〜10392(1984))およびチャタジー(Chatterjee)(米国特許第5,047,342号)はそれぞれ大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI、およびT5 DNAポリメラーゼのクローニングを記載している。
【0005】
好熱菌由来のDNAポリメラーゼも記載されている。チェン(Chien)ら、J. Bacteriol. 127:1550〜1557(1976)は、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(Taq)からポリメラーゼを入手するための精製方法を記載している。この結果得られたタンパク質の分子量はゲル濾過分析によれば約63,000ダルトンであり、ショ糖勾配遠心分離によれば68,000ダルトンであった。カレージン(Kaledin)ら、Biokhymiya 45:644〜51(1980)は、T.アクアティカス(T. aquaticus)YT1株からDNAポリメラーゼを単離するための精製手順を開示している。精製された酵素は62,000ダルトンの単量体タンパク質であると報告されている。ゲルファント(Gelfand)ら(米国特許第4,889,818号は)は、サーマス・アクアティカスの耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングした。このタンパク質の分子量は約86,000〜90,000ダルトンであることが判明した。シンプソン(Simpson)らは、テルモトーガ属(Thermotoga species)由来の耐熱性DNAポリメラーゼを精製し、その特徴を一部明らかにしている(Biochem. Cell. Biol. 86:1292〜1296(1990))。シンプソンらによって単離された精製DNAポリメラーゼの分子量は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーによる評価では85,000ダルトンであった。この酵素の基質非存在下における半減期は95℃で3分間、50℃で60分間であり、至適pHはpH 7.5〜8.0の範囲であった。トリトンX−100はこの酵素の耐熱性を強めるように思われた。シンプソンらによって記載された耐熱性DNAポリメラーゼの入手のために用いられた菌株は、テルモトーガ属FjSS3−B.1株であった(Hussarら、FEMS Microbiology Letters 37:121〜127(1986))。また別の研究者らは、テルモトーガ・マリティマ(Thermotoga maritima)の耐熱性DNAポリメラーゼをクローニングし、その配列を決定している(米国特許第5,374,553号、これは明確に参照として本明細書に組み入れられる)。
【0006】
その他のDNAポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus steraothermophilus)を含む好熱菌(Steneshら、Biochim. Biophys. Acta 272:156〜166(1972);およびKaboevら、J. Bacteriol. 145:21〜26(1981))およびいくつかの古細菌から同定されている(Rossiら、System. Appl. Microbiol. 7:337〜341(1986);Klimczakら、Biochemistry 25:4850〜4855(1986);およびElieら、Eur. J Biochem. 178:619〜626(1989))。最も高度に精製された古細菌DNAポリメラーゼの半減期は87℃で15分間と報告されている(Elieら(1989)、前記)。イニス(Innis)ら、「PCRプロトコール:方法および増幅の手引き(PCR Protocol:A Guide To Methods and Amplfication)」、Academic Press、Inc.、San Diego(1990)は、超高温で生育可能な超好熱性の真正細菌および古細菌がいくつか存在することを指摘し(Bergquistら、Biotech. Genet. Eng. Rev. 5:199〜244(1987);およびケリー(Kelly)ら、Biotechnol. Prog. 4:47−62(1988))、これらの生物が極めて耐熱性の強いDNAポリメラーゼを含む可能性を示唆している。
【0007】
既知のポリメラーゼの多くには、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有する1つのドメイン、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するもう1つのドメイン、ポリメラーゼ活性を有する第3のドメインという、3つのドメインが存在する。
【0008】
5’−3’エキソヌクレアーゼドメインはポリメラーゼのN末端領域に存在する(Ollisら、Nature 313:762〜766(1985);Freemontら、Proteins 1:66〜73(1986);Joyce、Cur. Opin. Struct. Biol. 1:123〜129(1991))。いくつかのアミノ酸は、その変異によって大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を低下させると考えられている(Gutman & Minton、Nucl. Acids Res. 21:4406〜4407(1993))。これらのアミノ酸には、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIのTyr77、Gly103、Gly184およびGly192が含まれる。5’−エキソヌクレアーゼドメインは必須ではないことが知られている。その最もよく知られた例は、大腸菌(E.coli)ポリメラーゼIのクレノー断片である。クレノー断片は、5’−エキソヌクレアーゼ活性のない天然のタンパク質分解性断片である(Joyceら、J. Biol. Chem. 257:1958〜64(1990))。この活性を持たないポリメラーゼはDNA配列決定に有用である。
【0009】
dNTP結合ドメインを含むポリメラーゼの活性部位は通常、ポリメラーゼのカルボキシ末端領域に存在する(Ollisら、Nature 313:762〜766(1985);Freemontら、Proteins 1:66〜73(1986))。大腸菌(E.coli)ポリメラーゼIのPhe762はヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸の1つであることが示されている(Joyce & Steitz、Ann. Rev. Biochein. 63:777〜822(1994);Astatke、J Biol. Chem. 270:1945〜54(1995))。このアミノ酸をTyrに変換することにより、ジデオキシヌクレオチドを識別しない変異型DNAポリメラーゼが生じる。米国特許第5,614,365号、第5,912,155号、第5,939,301号、第6,015,668号および第5,948,614号、ならびに本明細書に参照として明確に組み入れられる、1995年9月8日に提出された「変異型DNAポリメラーゼおよびその使用(Mutant DNA Polymerases and the Use Thereof)」と題するチャタジー(Deb K. Chatterjee)による同時係属出願中の米国特許出願第08/525,057号を参照されたい。
【0010】
ほとんどのDNAポリメラーゼは3’−5’エキソヌクレアーゼ活性も含む。このエキソヌクレアーゼ活性はDNAポリメラーゼにプルーフリーディング能力を与える。サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)由来のTaq DNAポリメラーゼは、核酸合成反応に最も用いやすく、このためポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に最も広く用いられているが、プルーフリーディング能力はない。他の酵素と比較した場合、Taqポリメラーゼの相対平均誤り率をプルーフリーディング能力のあるPfu、VentおよびDeep Ventポリメラーゼと比べるとそれぞれ8×10− 6、1.3×10− 6、2.8×10− 6および2.7×10− 6である(Clineら、Nucleic Acids Res. 24:3546〜3551(1996))。これは、Taq DNAポリメラーゼには3’−5’エキソヌクレアーゼ活性に必要な重要な3つのモチーフのすべてに欠失があるという事実に起因する(Lawyerら、J. Biol. Chem. 6427〜6437(1989))。興味深いことに、これらの欠失があるにもかかわらず、Taq DNAポリメラーゼはクレノー断片と比べて、残存する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインには非常に大きな変化があるものの、全体的な三次元構造は維持している(Kimら、Nature 376:612〜616(1995);Eomら、Nature 382:278〜281(1996))。
【0011】
複数のポリメラーゼが知られているものの、当技術分野には、核酸合成、配列決定および増幅の目的にさらに適したポリメラーゼを開発することに対する需要が存在する。このようなポリメラーゼは、誤り率が低い、すなわち核酸合成時のヌクレオチドの誤取り込み率が低い、および/または重合の忠実度が高いと考えられる。
【0012】
発明の概要
本発明は、分子生物学において有用なさらなるポリメラーゼを提供することにより、当技術分野における需要を満たす。特に、本発明は、忠実度が高められた耐熱性および中温性のポリメラーゼを含む。このようなポリメラーゼは、酵素の忠実度が増加または向上するように3’−5’エキソヌクレアーゼドメインが改変されている。改変には、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の上昇をもたらす3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの変異、または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼに由来する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインによる3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの部分的もしくは完全な置換が含まれる。
【0013】
本発明において、本発明者らは、Taqポリメラーゼの不活性型3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインが別の耐熱性DNAポリメラーゼの活性型3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインによって置換された、ハイブリッド型Taqポリメラーゼを作製した。本発明者らは最近、テルモトーガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)由来の耐熱性DNAポリメラーゼであるTne DNAポリメラーゼを報告した(米国特許第5,912,155号、第5,939,301号、第6,015,668号および第5,948,614号)。Taqポリメラーゼと同様に、TneポリメラーゼもPol Iファミリーに属する。しかし、Taqポリメラーゼとは異なり、Tneポリメラーゼには活性型3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインがある。本発明者らは、ハイブリッド型Taqポリメラーゼが5’−3’−エキソヌクレアーゼ活性、3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性という3つの活性をすべて発揮することを示しており、このことからドメインの再編成を行っても構造的な完全性が損なわれない可能性が示唆された。本発明者らは、プルーフリーディング活性およびポリメラーゼの両者が協調的に作用することも示しており、このことはハイブリッド型ポリメラーゼが真の高忠実度ポリメラーゼのように作用することを意味する。このため、ハイブリッド型ポリメラーゼはPCRまたは他の用途に極めて有用であると考えられる。
【0014】
本発明において特に関心が持たれるDNAポリメラーゼ(耐熱性DNAポリメラーゼを含む)には、Taq DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tbr DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ、VENT(商標)DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIII、クレノー断片DNAポリメラーゼ、シュトッフェル断片DNAポリメラーゼおよびそれらの変異体、断片または誘導体が含まれる。本発明によれば、関心対象の酵素の忠実度を高めるために、このようなポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを改変または変異させる。
【0015】
本発明は特に、核酸合成、配列決定および増幅における酵素の正確性を向上させる(忠実度を高くする)1つまたは複数のアミノ酸の変化が3’−5’エキソヌクレアーゼドメインに加えられた、変異型PolI型DNAポリメラーゼ(好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼ)に関する。3’−5’エキソヌクレアーゼドメインは、触媒性アミノ酸のすべてを含む領域と定義される(Derbyshireら、Methods in Enzymology 262:363〜385(1995);Blancoら、Gene 112:139〜144(1992))。特に、DNAポリメラーゼのサブドメインにはExoI、ExoIIおよびExoIIIの3つがある。ExoIはpolI型DNAポリメラーゼの場合、350Pから360Sまでの領域と定義され、ExoIIは416Kから429Aまで、ExoIIIは492Eから505Tからまでの領域と定義される。他のDNAポリメラーゼにも対応する領域が認められる。完全な3’−5’活性のためには、3’−5’エキソドメインにある3つのサブドメインがすべて存在する必要がある。本発明によれば、当技術分野で周知の技法を用いて、これらのサブドメインにおける特定のアミノ酸または領域を変異させることにより、エキソ活性を修飾することが可能である。
【0016】
本発明に従って、忠実度が高められたポリメラーゼに対して、他の機能的な変化を加えることもできる。例えば、5’エキソヌクレアーゼ活性を低下させるため、および/またはddNTPに対する識別性を低下させるために、ポリメラーゼを改変してもよい。
【0017】
特に、本発明は、
(a)ポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇する様式;
(b)ポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性が低下または消失する様式;
(c)ジデオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドに対する識別的挙動が低下または消失する様式、および
(d)核酸合成時の不正確なヌクレオチドの誤取り込みが低下または消失する様式、
からなる群から選択される、少なくとも1つの様式で改変された、変異型または改変型のDNAポリメラーゼに関する。
【0018】
本発明は、本発明の変異型または改変型のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むDNA分子(好ましくはベクター)、およびこのようなDNA分子を含む宿主細胞にも向けられる。関心対象の遺伝子を発現させるためには、原核細胞および真核細胞を含むさまざまな宿主を用いてよい。本発明のポリメラーゼを発現させるためには原核細胞を用いることが好ましい。本発明による好ましい原核生物宿主は大腸菌(E.coli)である。
【0019】
本発明は、本発明のポリメラーゼを生産する方法であって、
(a)本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する段階;
(b)前記遺伝子を発現させる段階;および
(c)前記宿主細胞から前記ポリメラーゼを単離する段階
を含む方法にも関する。
【0020】
本発明は、核酸分子を合成する方法であって、
(a)核酸テンプレート(例えば、RNAまたはDNA)を1つまたは複数の本発明のポリメラーゼと混合する段階;および
(b)前記テンプレートの全体または一部に対して相補的な核酸分子が合成されるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする段階
を含む方法にも関する。このような条件には、1つまたは複数のデオキシ−またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸とのインキュベーションが含まれる。このようなデオキシ−およびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸には、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7−デアザ−dGTP、7−デアザ−dATP、dUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、ddTTP、[α−S]dATP、[α−S]dTTP、[α−S]dGTPおよび[α−S]dCTPが含まれる。
【0021】
本方法は、DNA分子の配列を決定する方法であって、
(a)プライマーを第1のDNA分子とハイブリダイズさせる段階;
(b)段階(a)の前記分子をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、1つまたは複数の本発明のDNAポリメラーゼ、および1つまたは複数のターミネーターヌクレオチドと接触させる段階;
(c)合成されるDNA分子の長さが前記第1のDNA分子よりも短く、合成されるDNA分子が3’末端にターミネーターヌクレオチドを含む、前記第1のDNA分子に対して相補的なDNA分子の無作為な集団が合成されるのに十分な条件下で、段階(b)の混合物をインキュベートする段階;ならびに
(d)前記第1のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、前記合成されたDNA分子をサイズ別に分離する段階
を含む方法にも関する。このようなターミネーターヌクレオチドには、ddTTP、ddATP、ddGTP、ddITPまたはddCTPが含まれる。
【0022】
本発明は、二本鎖DNA分子を増幅するための方法であって、
(a)前記DNA分子の第1鎖の3’末端の内部または3’末端または近傍の配列に対して相補的な第1のプライマー、および前記DNA分子の第2鎖の3’末端の内部または3’末端または近傍の配列に対して相補的な第2のプライマーである、第1および第2のプライマーを提供する段階;
(b)前記第1鎖の全体または一部に対して相補的な第3のDNA分子、および前記第2鎖の全体または一部に対して相補的な第4のDNA分子が合成される条件下で、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼの存在下において、前記第1のプライマーを前記第1鎖と、前記第2のプライマーを前記第2鎖とハイブリダイズさせる段階;
(c)前記第1および第3鎖、ならびに前記第2および第4鎖を変性させる段階;ならびに
(d)(a)から(c)までの段階を1回または複数回繰り返す段階
を含む方法にも関する。
【0023】
したがって、本発明は一般に、
(a)配列決定を行おうとする1つまたは複数のテンプレートまたは核酸分子を、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼと混合する段階、および
(b)前記テンプレートの全体もしくは一部の増幅、または前記核酸分子の全体もしくは一部の配列決定が十分に行われる条件下で、前記混合物をインキュベートする段階
を含む、核酸分子の増幅または配列決定に関する。
【0024】
本発明は、核酸分子の配列決定、増幅または合成のためのキットであって、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼ、ならびに
(a)1つまたは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸;
(b)1つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸;
(c)1つまたは複数のプライマー;
(d)1つまたは複数の適した緩衝液または緩衝塩;
(e)1つまたは複数のヌクレオチド;および
(f)本発明の方法を実施するための指示
からなる群から選択される1つまたは複数の他の構成要素(またはそれらの組み合わせ)を含むキットにも関する。
【0025】
本発明は、本発明の方法を実施するために生成された組成物、および本発明の方法の実施時に生成された組成物にも関する。このような組成物は、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼ、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のテンプレート、1つまたは複数の反応緩衝液または緩衝塩、1つまたは複数のプライマー、本発明の方法によって生成された1つまたは複数の核酸生成物などから選択される、1つまたは複数の構成要素を含みうる。
【0026】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明には、組換えDNA技術において用いられるさまざまな用語を頻繁に用いる。明細書および特許請求の範囲に関して明確かつ一貫した理解が得られるように、このような用語に与えられる範囲を含め、以下の定義を提示する。
【0027】
クローニングベクター
宿主細胞における自律複製が可能であり、ベクターの本質的な生物機能を失わずにその箇所で確定的な様式でDNA配列を切断しうる1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位があることを特徴とし、複製およびクローニングを行うために内部にDNAをスプライス挿入することができる、プラスミド、コスミドまたはファージDNAまたは他のDNA分子。クローニングベクターは、クローニングベクターによる形質転換がなされた細胞の同定に用いるのに適したマーカーをさらに含んでもよい。マーカーは例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。
【0028】
発現ベクター
クローニングベクターと類似しているが、宿主に形質転換導入された後に、内部にクローニングされた遺伝子の発現を増強させうるベクター。クローニングされる遺伝子は通常、プロモーター配列などの特定の制御配列の制御下に置かれる(すなわち、機能的に結合される)。
【0029】
組換え宿主
発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のDNA分子中に望ましいクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物または真核生物または微生物。「組換え宿主」という用語は、宿主染色体またはゲノムに望ましい遺伝子を含むように遺伝的に操作された宿主細胞も含むものとする。
【0030】
宿主
複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のDNA分子のレシピエントである、任意の原核生物性または真核生物性微生物。DNA分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび/または複製起点を非制限的に含みうる。
【0031】
プロモーター
遺伝子の5’領域として一般に説明され、開始コドンの近位部に位置するDNA配列。隣接する遺伝子の転写はプロモーター領域で開始される。
【0032】
遺伝子
ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むDNA配列。これはプロモーターおよび構造遺伝子のほか、タンパク質の発現に関与する他の配列を含む。
【0033】
構造遺伝子
メッセンジャーRNAへと転写され、続いて特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳されるDNA配列。
【0034】
機能的に結合している
本明細書で用いる場合、プロモーターが、構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現開始を制御する位置にあることを意味する。
【0035】
発現
発現とは、遺伝子がポリペプチドを産生する過程のことである。これには、遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)への転写、およびこのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【0036】
実質的に純粋である
本明細書で用いる「実質的に純粋である」とは、望まれる精製タンパク質に、望まれるタンパク質に自然下で付随している細胞性混入物が本質的に混入していないことを意味する。混入性の細胞成分には、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは望ましくないDNAポリメラーゼ酵素が非制限的に含まれる。
【0037】
プライマー
本明細書で用いる「プライマー」とは、DNA分子の増幅または重合の際にヌクレオチド単量体の共有結合によって伸長する一本鎖オリゴヌクレオチドのことを指す。
【0038】
テンプレート
本明細書で用いる「テンプレート」という用語は、増幅、合成または配列決定を行おうとする、二本鎖または一本鎖の核酸(DNAまたはmRNAなどのRNA)分子のことを指す。二本鎖核酸分子の場合には、これらの分子の増幅、合成または配列決定を行う前に、第1および第2鎖を形成させるためにその鎖を変性させる。テンプレートの一部に対して相補的なプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせると、続いて本発明のポリメラーゼが前記テンプレートまたはその一部に対して相補的な分子を合成する。本発明に従って新たに合成された分子の長さは、元のテンプレートと同じまたはより短いと考えられる。さらに、新たに合成された核酸分子は本発明に従ってさらに合成を行うためのテンプレートとしても役立つと思われる。新たに合成される分子の合成時または伸長時のミスマッチ取り込みは、1つまたは複数のミスマッチ塩基対をもたらすと思われる。したがって、合成される分子はテンプレートに対して厳密に相補的であるとは限らない。
【0039】
取り込み
本明細書で用いる「取り込み」という用語は、DNA分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【0040】
増幅
本明細書で用いる「増幅」とは、DNAポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増やすことを目的とする任意のインビトロの方法のことを指す。核酸の増幅により、DNA分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みが起こり、それによってDNAテンプレートに対して相補的な新たなDNA分子が形成される。形成されたDNA分子およびそのテンプレートは、別のDNA分子を合成するためのテンプレートとして用いることができる。本明細書で用いる場合、1つの増幅反応は、多数回のDNA複製から構成されうる。DNA増幅反応には例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が含まれる。1つのPCR反応は、20〜100「サイクル」にわたるDNA分子の変性および合成から構成されうる。
【0041】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」とは、1つのヌクレオチドのペントースの3’位と隣接するヌクレオチドのペントースの5’位との間のホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成性または天然の分子のことを指す。
【0042】
ヌクレオチド
本明細書で用いる「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組み合わせのことを意味する。ヌクレオチドは核酸配列(DNAおよびRNA)の単量体単位である。ヌクレオチドという用語には、dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはそれらの誘導体が含まれる。このような誘導体には、例えば、[αS]dATP、7−デアザ−dGTPおよび7−デアザ−dATPが含まれる。本明細書で用いるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)およびそれらの誘導体のことも指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の具体的な例には、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPが非制限的に含まれる。本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されていないものでもよく、または周知の技法によって直接標識されたものでもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識が含まれる。
【0043】
耐熱性
本明細書で用いる「耐熱性」とは、熱による失活に対する耐性のあるDNAポリメラーゼのことを指す。DNAポリメラーゼは、5’から3’の向きにプライマーを伸長させることにより、一本鎖DNAテンプレートに対して相補的なDNAの形成を司る。中温性DNAポリメラーゼの場合、この活性は熱処理によって失活する可能性がある。例えば、T5 DNAポリメラーゼの活性は本酵素を90℃の温度に30秒間曝露させることによって完全に失活する。本明細書で用いる場合、耐熱性DNAポリメラーゼの活性は、中温性DNAポリメラーゼよりも熱失活に対する耐性が強い。しかし、耐熱性DNAポリメラーゼは熱失活に対して完全に耐性のある酵素を指すものではなく、このため、熱処理によってDNAポリメラーゼ活性がある程度低下する可能性はある。また、耐熱性DNAポリメラーゼの至適温度は一般に中温性DNAポリメラーゼよりも高い。
【0044】
ハイブリダイゼーション
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズすること」という用語は、相補的一本鎖核酸分子(RNAおよび/またはDNA)の対合によって二本鎖分子が生じることを指す。本明細書で用いる場合、塩基対合が完全に相補的でなくとも2つの核酸分子はハイブリダイズしうる。したがって、当技術分野で周知の適切な条件を用いるという前提であれば、ミスマッチ塩基は2つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【0045】
3’→5’(3’−to−5’)エキソヌクレアーゼ活性
「3’→5’エキソヌクレアーゼ活性」は、当技術分野で周知の酵素活性である。この活性はDNAポリメラーゼにしばしばみられ、DNA複製の「編集」または修正機構に関与すると考えられている。
【0046】
「3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇したDNAポリメラーゼ」は、本明細書において、対応する変異していない野生型酵素と比べて、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が約10%もしくはそれ以上高い、または好ましくは約25%、30%、50%、100%、150%、200%もしくは300%もしくはそれ以上高い、変異型DNAポリメラーゼと定義される。本発明のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を、対応する非改変型または野生型ポリメラーゼとの比較による相対的活性によって評価してもよい。好ましくは、このような相対的活性の上昇は、本発明のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を対応する非変異型または非改変型の酵素と比較して、1.5、2、5、10、25、50、75、100、150、200または300倍である。または、本発明のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を比活性として直接測定してもよく、その範囲は約0.005、0.01、0.05、0.75、0.1、0.15、0.4、0.5、0.75、0.9、1.0、1.2、1.5、1.75、2.0、3.0、5.0、7.5、10、15、20、30単位/mgタンパク質でよい。3’→5’エキソヌクレアーゼの活性の1単位は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT)によって3’末端を[3H]dTTPで標識したλDNAのHhaI断片を用いる、「BRL 1989年版カタログおよび参考文献の手引き(BRL 1989 Catalogue & Reference Guide)」の5ページに記載されたアッセイで、10ナノモルの基質末端が37℃、60分間で溶解する活性の量と定義される。タンパク質はブラッドフォード(Bradford)、Anal. Biochem. 72:248(1976)の方法によって測定する。比較の手段として、天然の野生型T5−DNAポリメラーゼ(DNAP)またはpTTQ19−T5−2によってコードされるT5−DNAPの比活性は約10単位/mgタンパク質であるが、一方、pTTQ19−T5−2(Exo−)(米国特許第5,270,179号)によってコードされるDNAポリメラーゼの比活性は約0.0001単位/mgタンパク質であり、すなわち非改変型酵素の0.001%、105分の1に低下する。
【0047】
5’→3’エキソヌクレアーゼ活性
「5’→3’エキソヌクレアーゼ活性」も当技術分野で周知の酵素活性である。この活性は、大腸菌(E.coli)PollIおよびPolIIIなどのDNAポリメラーゼでしばしばみられる。
【0048】
「5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下したDNAポリメラーゼ」は、(1)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が対応する変異していない野生型酵素の約10%もしくはそれ未満、または好ましくは約1%もしくはそれ未満である変異型DNAポリメラーゼ、または(2)5’→3’エキソヌクレアーゼ比活性が約1単位/mgタンパク質未満、または好ましくは約0.1単位/mgタンパク質もしくはそれ未満であるDNAポリメラーゼ、のいずれかと定義される。
【0049】
3’→5’および5’→3’エキソヌクレアーゼ活性はいずれも、配列決定用ゲル上で観察することができる。活性の高い5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、伸長するプライマーの5’末端からヌクレオチドを除去することにより、配列決定用ゲル中に非特異的な梯子状パターン(ladder)を生じさせると考えられる。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、配列決定用ゲル中の放射標識プライマーの分解を追跡することによって測定可能である。このため、例えば野生型ポリメラーゼと変異型ポリメラーゼを比較することにより、これらの相対的な量をルーチンの実験の範囲内で決定することができる。
【0050】
忠実度
忠実度とは、テンプレートに対して相補的な核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)を合成する際の、重合の正確性、またはポリメラーゼが正しい基質(例えば、ヌクレオチド)を不正確な基質と識別する能力のことを指す。ポリメラーゼの忠実度が高いほど、ポリメラーゼが核酸合成時に伸長する鎖中にヌクレオチドの誤取り込みを行うことが少なくなる;すなわち、忠実度の増加または向上は、誤り率の低い(誤取り込み率の低い)正確なポリメラーゼにつながる。
【0051】
忠実度が増加した/向上した/高いDNAポリメラーゼは、任意の長さの任意の核酸分子の合成時に誤取り込みされるヌクレオチドの数が、約2〜約10,000分の1、約2〜約5,000分の1または約2〜約2000分の1(好ましくは約5分の1未満、より好ましくは約10分の1未満、さらにより好ましくは約50分の1未満、さらに好ましくは約100分の1未満、さらにより好ましくは約500分の1未満、最も好ましくは約1000分の1未満)に減少したヌクレオチドと定義される。例えば、変異型ポリメラーゼが1000塩基の合成時に1つのヌクレオチドを誤取り込みし、これに対して、非変異型ポリメラーゼが10ヌクレオチドを誤取り込みする場合が考えられる。このような変異型ポリメラーゼは忠実度が10倍に増大したと言える。
【0052】
誤取り込みが減少したDNAポリメラーゼは、本明細書において、対応する変異していない非改変型または野生型酵素と比べて、誤取り込みが約50%もしくはそれ未満、または好ましくは約25%もしくはそれ未満、より好ましくは約10%もしくはそれ未満、最も好ましくは約1%もしくはそれ未満である、変異型または改変型のDNAポリメラーゼと定義される。忠実度の低いDNAポリメラーゼも、不正確なヌクレオチド取り込みを伴うDNA合成を開始しうる(Perrion & Loeb、1989、J. Biol. Chem. 264:2898〜2905)。
【0053】
ポリメラーゼの忠実度または誤取り込み率は、配列決定または当技術分野で知られた他の方法によって評価可能である(EckertおよびKunkel、Nucl. Acids Res. 3739〜3744(1990))。1つの例では、非変異型および変異型ポリメラーゼによって合成されたDNA分子の配列を、予想される(既知の)配列を比較することができる。これにより、誤り(誤取り込み)の数を各酵素に関して決定し、比較することができる。もう1つの例では、非変異型および変異型ポリメラーゼを用いて、既知の配列を有するDNA分子の配列を決定する。配列決定の誤り(誤取り込み)の数を比較することにより、酵素の忠実度または誤取り込み率を決定可能である。忠実度または誤取り込み率を決定する他の手段も当業者は認識していると考えられる。
【0054】
1.ポリメラーゼの由来
ポリメラーゼ活性を有する種々のポリペプチドが、本発明によれば有用である。これらのポリペプチドに含まれるものには、核酸ポリメラーゼ(DNAポリメラーゼを含む)などがある。このようなポリメラーゼには、テルムス・テルモフィラス(Thermus thermophilus)(Tth)DNAポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(Taq)DNAポリメラーゼ、テルモトーガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)(Tne)DNAポリメラーゼ、テルモトーガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Tma)DNAポリメラーゼ、テルモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(TliまたはVENT(商標))DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオース(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNAポリメラーゼ、DEEP VENT(商標)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・ウージ(Pyrococcus woosii)(Pwo)DNAポリメラーゼ、バチルス・ステロテルモフィラス(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNAポリメラーゼ、バチルス・カルドフィラス(Bacillus caldophilus)(Bca)DNAポリメラーゼ、スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)DNAポリメラーゼ、テルモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)(Tac)DNAポリメラーゼ、テルムス・フラバス(Thermus flavus)(Tfl/Tub)DNAポリメラーゼ、テルムス・ルベル(Thermus ruber)(Tru)DNAポリメラーゼ、テルムス・ブロキアヌス(Thermus brockianus)(DYNAZYME(商標))DNAポリメラーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNAポリメラーゼ、マイコバクテリウムDNAポリメラーゼ(Mtb、Mlep)、ならびにそれらの変異体、および変種、および誘導体が非制限的に含まれる。
【0055】
本発明に従って用いられるポリメラーゼは、典型的には5’から3’の向きに、核酸テンプレートから核酸分子を合成することができる任意の酵素でありうる。本発明に用いる核酸ポリメラーゼは中温性でも好熱性でもよく、好熱性であることが好ましい。好ましい中温性DNAポリメラーゼには、T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、クレノー断片DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIIIなどが含まれる。本発明の方法に用いうる好ましい耐熱性DNAポリメラーゼには、Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、シュトッフェル断片、VENT(商標)およびDEEPVENT(商標)DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種、および誘導体が含まれる(米国特許第5,436,149号;米国特許第4,889,818号;米国特許第4,965,188号;米国特許第5,079,352号;米国特許第5,614,365号;米国特許第5,374,553号;米国特許第5,270,179号;米国特許第5,047,342号;米国特許第5,512,462号;国際公開公報第92/06188号;国際公開公報第92/06200号;国際公開公報第96/10640号;Barnes, W.M.、Gene 112:29〜35(1992);Lawyer, F.C.ら、PCR Meth. Appl. 2:275〜287(1993);Flaman, J.−Mら、Nucl. Acids Res. 22(15):3259〜3260(1994))。長い核酸分子(例えば、約35Kb長よりも長い核酸分子)の増幅のためには、少なくとも2つのDNAポリメラーゼ(一方は3’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、もう一方は3’エキソヌクレアーゼ活性を有する)が一般に用いられる。米国特許第5,436,149号;米国特許第5,512,462号;ファーン(Farnes, W.M.)、Gene 112:29〜35(1992);および2000年12月21日に提出された、同時係属中の米国特許出願第09/741,664号を参照されたい(これらの開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。3’エキソヌクレアーゼを実質的に欠くDNAポリメラーゼの例には、Taq、Tne(exo−)、Tma(exo−)、Pfu(exo−)、Pwo(exo−)およびTth DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種、および誘導体が非制限的に含まれる。
【0056】
核酸ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを、本方法では、溶液中にて約0.1〜200単位/ml、約0.1〜50単位/ml、約0.1〜40単位/ml、約0.1〜3.6単位/ml、約0.1〜34単位/ml、約0.1〜32単位/ml、約0.1〜30単位/ml、または約0.1〜20単位/mlの最終濃度で用いることが好ましく、最も好ましくは約20単位/mlの濃度で用いる。当然ながら、本発明における使用に適した核酸ポリメラーゼの他の適した濃度は、当業者には明らかであると考えられる。
【0057】
本発明の1つの好ましい面においては、変異型または改変型ポリメラーゼを組換え法によって作製する。クローニングされたさまざまなポリメラーゼ遺伝子が入手可能である、または標準的な組換え法を用いて入手することができる。
【0058】
本発明に従って改変されるDNAポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングのためには、ポリメラーゼ遺伝子を含む単離されたDNAを用いて、ベクター中に組換えDNAライブラリーを構築する。当技術分野で周知の任意のベクターを、関心対象のDNAポリメラーゼのクローニングに用いることができる。しかし、用いるベクターは、組換えDNAライブラリーによる形質転換を行う予定の宿主と適合性がある必要がある。
【0059】
プラスミドライブラリーの構築用の原核生物ベクターには、大腸菌(E.coli)における複製が可能なプラスミド、例えばpBR322、ColE1、pSC101、pUCベクターなどが含まれる(pUC18、pUC19など:「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(1982);およびサムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(1989))。桿菌プラスミドにはpC194、pC221、pC217などが含まれる。この種のプラスミドは、グリチャン(Glyczan, T)、「桿菌の分子生物学(The Molecular Biology Bacilli)」、Academic Press、York(1982)、307〜329に開示されている。適したストレプトミセス属プラスミドには、pIJ101(Kendallら、J. Bacteriol 169:4177〜4183(1987))が含まれる。シュードモナス属プラスミドに関しては、ジョン(John)ら(Rad. Insec. Dis. 8:693〜704(1986))およびイガキ(Igaki)(Jpn. J. Bacteriol. 33:729〜742(1978))に総説がある。pCP13(DarzinsおよびChakrabarbary、J. Bacteriol. 159:9〜18、1984)などの宿主範囲の広いプラスミドまたはコスミドを、本発明のために用いることもできる。本発明の遺伝子のクローニングのために好ましいベクターは原核生物ベクターである。好ましくは、本発明の遺伝子のクローニングには、pCP13およびpUCベクターを用いることが好ましい。
【0060】
関心対象のポリメラーゼ遺伝子のクローニングの目的に好ましい宿主は原核生物宿主である。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌(E.coli)である。しかし、本発明の望ましいポリメラーゼ遺伝子を、エシェリキア属(Escherichia)、バシラス属(Bacillus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)およびプロテウス属(Proteus)を非制限的に含む、他の原核生物宿主にクローニングしてもよい。特に関心が持たれる細菌宿主には、インビトロジェン社(Invitrogen Corporation)のライフテクノロジー部門(Life Technologies Division)(Rockville、MD)から入手可能な大腸菌(E.coli)DH10Bが含まれる。
【0061】
関心対象のポリメラーゼのクローニングおよび発現を目的とする真核生物宿主には、酵母、真菌および哺乳動物細胞が含まれる。このような真核細胞における望ましいポリメラーゼの発現には、真核生物プロモーターを含む真核生物調節領域を用いることが必要な場合がある。真核細胞におけるポリメラーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、周知の真核生物ベクター系を用いる周知の技法によって行える。
【0062】
DNAライブラリーが特定のベクター中に構築されたところで、周知の技法により、適切な宿主への形質転換導入を行う。形質転換されたコロニーをペトリ皿1枚当たり約200〜300コロニーの密度で播く。耐熱性ポリメラーゼの選択の場合には、続いて、形質転換がなされた大腸菌(E.coli)コロニーをニトロセルロース膜に移すことにより、コロニーを熱安定性のあるDNAポリメラーゼの発現に関してスクリーニングする。移した細胞をニトロセルロース上で増殖させた後(約12時間)に、細胞を標準的な方法によって溶解し、続いて内因性大腸菌(E.coli)酵素を失活させるために膜を95℃で5分間処理する。用いる宿主およびクローニングするポリメラーゼの温度安定性によっては、宿主ポリメラーゼを失活させるために他の温度を用いてもよい。続いて、当技術分野で周知の技法を用いるポリメラーゼ活性の存在に関するアッセイにより、安定なポリメラーゼ活性を検出する。サグナー(Sagner)ら、Gene 97:119〜123(1991)(これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子は、サグナー(Sagner)ら、前記によって記載された手順を用いてクローニング可能である。
【0063】
2.ポリメラーゼの改変または変異
本発明によれば、忠実度が増加または向上した(誤取り込み率が低下した)変異型または改変型のポリメラーゼが生じるような様式で、関心対象のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを改変または変異させる。3’−5’エキソヌクレアーゼドメインは、exoI、exoIIおよびexoIIIという3つのサブドメインから構成され(Blancoら、Gene 112:139〜144(1992))、それらの中にエキソヌクレアーゼ活性にとって重要な触媒性アミノ酸が見いだされている。これらの触媒性アミノ酸は金属イオンと相互作用する。エキソヌクレアーゼドメインに変異を導入する際には、触媒性アミノ酸が金属イオンとの相互作用を維持することが好ましい。本発明による酵素の忠実度を高めるために、任意のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメインに1つまたは複数の変異を加えることができる。このような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が含まれる。本発明による、忠実度が向上もしくは増大した、または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇もしくは向上したポリメラーゼを作製するためには、1つまたは複数のアミノ酸置換が生じる1つまたは複数の点変異を用いることが好ましい。本発明の1つの好ましい面においては、望ましい結果を得るために1つまたは複数の変異を加える。
【0064】
3.3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの置換
新たな特性を1つの酵素から関連性のある別の酵素に新たに加えることは、タンパク質工学の興味深い可能性の一つである。新たな特性を得るために用いられてきた従来のある種のアプローチは、無作為変異誘発、および関心対象のわずかな変異体を分離するための多数の変異体のスクリーニングを必要とした。もう1つのアプローチは、構造情報に基づいて、新しくはあるが関連性はあるタンパク質または酵素に特定のドメインを組み込むことである(Pierre Beguinによる総説、Curr. Opin. Biotech. 10:336〜340(1999))。
【0065】
当技術分野で周知の技法を用いて(Sambrookら(1989)、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning、Laboratory Manual)」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY)、DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを、望ましい3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する、別のポリメラーゼに由来する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインと置換することができる。種々のポリメラーゼのドメインを表1に示す。
【0066】
【表1】種々のポリメラーゼの近似したドメイン
【0067】
本発明は、1つのドメインの全体または一部と、異なるドメインとのドメイン置換を考えている。ある種のポリメラーゼの任意のドメイン(またはその部分)を、第2のポリメラーゼのドメイン(またはその部分)と置換することができる。このような置換は、望ましい3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が生じるタンパク質の正しいフォールディングが置換によってもたらされるように行うことが好ましい。
【0068】
4.ポリメラーゼのそのほかの改変または変異
本発明によれば、誤取り込みが少ない、または忠実度が向上したポリメラーゼを作製するための上記の変異に加えて、1つまたは複数のそのほかの変異または改変(またはそれらの組み合わせ)を関心対象のポリメラーゼに加えてもよい。特に関心が持たれる変異または改変には、(1)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が消失または低下する;および(2)ジデオキシヌクレオチドの識別性が低下する(すなわち、ジデオキシヌクレオチドの取り込みが増える)、改変または変異が含まれる。
【0069】
ポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼ遺伝子を変異させることにより、または5’→3’エキソヌクレアーゼドメインを除去することにより、低下または消失させることができる。このような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が含まれる。5’−3’エキソヌクレアーゼ活性をコードする領域を、当技術分野で周知の技法を用いて除去することが好ましい。本発明の態様では、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性にかかわる6つの保存的なアミノ酸の任意の1つを変異させることができる。Tne DNAポリメラーゼに関するこれらの保存的なアミノ酸の例には、Asp8、Glu112、Asp114、Asp115、Asp137およびAsp139が含まれる。変異が考えられる他の部位にはGly102、Gly187およびGly195がある。
【0070】
他のポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を低下または消失させるための標的となる、対応するアミノ酸は以下の通りである:
【0071】
Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国特許第5,079,352号に列挙された通りである。テルモトーガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Tma)DNAポリメラーゼのアミノ酸残基は米国特許第5,374,553号に列挙された通りである。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる標的になりうる、他のアミノ酸の例
【0072】
肺炎球菌、T.フラバス(T. flavus)、D.ラジオデュランス(D. radiodurans)、B.カルドテナクス(B. caldotenax)と同等のもの(coordinates)は、ガットマン(Gutman)およびミントン(Minton)(Nucleic Acids Res. 21:4406〜4407(1993))から入手した。T.テルモフィラス(T. thermophilus)の座標は国際公開公報第92/06200号から入手した。
【0073】
ジデオキシヌクレオチドなどの非天然型ヌクレオチドに対する識別性を持たないような、ポリメラーゼ変異体を作製することもできる(米国特許第5,614,365号)。ポリメラーゼを非識別性とするために、O−ヘリックスの内部に他の点変異、欠失および挿入などの変化を加えることができる。例えば、この特性を有するTne DNAポリメラーゼの一種では、O−ヘリックス内のPhe730がTyrなどの天然でないアミノ酸によって置換されている。
【0074】
一般に、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性、識別活性および忠実度は、異なる特性を一般に有するアミノ酸の置換によって影響を受ける。例えば、Aspなどの酸性アミノ酸を塩基性、中性または極性非荷電アミノ酸残基、例えばLys、Arg、His(塩基性);Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp(中性);またはGly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnもしくはGln(極性非荷電)に変化させてもよい。GluをAsp、Ala、Val 、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnまたはGlnに変化させてもよい。
【0075】
コード性DNA分子に沿った任意の規定された部位に、すべての可能な種類の塩基対変化を生じさせることが可能な変異型ポリメラーゼを作製するためには、オリゴヌクレオチド指定変異誘発法を用いることが好ましい。一般に、この技法は、関心対象のDNAポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に対して相補的な(1つまたは複数のミスマッチを除く)オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることを含む。続いて、このミスマッチのあるオリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼによって伸長させ、一方の鎖の配列に望ましい変化を含む二本鎖DNA分子を生成させる。この配列の変化は、当然ながら、アミノ酸の欠失、置換または挿入を引き起こす。続いて、この二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中に挿入し、変異型ポリペプチドを産生させることができる。上記のオリゴヌクレオチド指定変異誘発法は、当然ながら、PCRによって行うことができる。【0076】
5.ポリメラーゼの発現の増強
本発明のポリメラーゼの発現を最適化するためには、誘導性または構成性のプロモーターが周知であり、組換え宿主においてポリメラーゼ構造遺伝子を高レベルに発現させるために用いることができる。同様に、高い発現レベルを実現するために、当技術分野で周知の高コピー数ベクターを用いてもよい。誘導性の高コピー数を有するベクターは、組換え宿主における本発明のポリメラーゼの発現を増強するためにも有用と思われる。
【0077】
原核細胞(大腸菌、枯草菌、シュードモナス菌など)内で望ましい構造遺伝子を発現させるためには、望ましい構造遺伝子を機能的な原核生物プロモーターと機能的に結合させることが必要である。しかし、ポリメラーゼ遺伝子の天然のプロモーターは、原核生物宿主内で作用してポリメラーゼ遺伝子を発現させる可能性がある。このため、ポリメラーゼ遺伝子を発現させるために天然プロモーターまたは他のプロモーターを用いてもよい。このような他のプロモーターは発現を増強させるために用いてもよく、構成性または調節性(すなわち、誘導性または抑制性)プロモーターのいずれでもよい。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのintプロモーター、およびpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーターが含まれる。誘導性原核生物プロモーターの例には、バクテリオファージλの主要な右側および左側プロモーター(PRおよびPL)、ならびに大腸菌(E.coli)のtrp、recA、lacZ、lad、tet、gal、trcおよびtacプロモーターが含まれる。枯草菌プロモーターには、α−アミラーゼ(Ulmanenら、J. Bacteriol 162:176〜182(1985))および桿菌バクテリオファージプロモーター(Gryczan, T.、「桿菌の分子生物学(Molecular Biology Of Bacilli)」、Academic Press、New York(1982))が含まれる。ストレプトミセス属プロモーターは、ワード(Ward)ら、Mol. Gen. Genet. 203:468478(1986)に記載されている。原核生物プロモーターに関しては、グリック(Glick)、J. Ind. Microbiol. 1:277〜282(1987);セナティエンプト(Cenatiempto, Y.)、Biochimie 68:505〜516(1986);およびゴッテスマン(Gottesman)、Ann. Rev. Genet. 18:415〜442(1984)にも総説がある。原核細胞における発現のためには、遺伝子コード配列の上流にリボソーム結合部位の存在も必要である。このようなリボソーム結合 部位は、例えば、ゴールド(Gold)ら、Ann. Rev. Microbiol. 35:365404(1981)に開示されている。
【0078】
真核細胞における本発明のポリメラーゼの発現を増強させるために、周知の真核生物プロモーターおよび宿主を用いてもよい。しかし、ポリメラーゼの増強発現は原核生物宿主において行うことが好ましい。本酵素を過剰発現させるのに好ましい原核生物宿主は大腸菌(E.coli)である。
【0079】
6.ポリメラーゼの単離および精製
本発明の酵素は、望ましいDNAポリメラーゼ遺伝子を含有および発現している、組換え宿主の発酵によって生産することが好ましい。しかし、本発明のDNAポリメラーゼを、本発明のポリメラーゼを産生する任意の菌株から単離することもできる。ポリメラーゼの断片も本発明に含まれる。このような断片には、タンパク質分解による断片およびポリメラーゼ活性を有する断片が含まれる。
【0080】
クローニングされたポリメラーゼ遺伝子を含む宿主によって同化されうる任意の栄養分を培地に添加してよい。最適な培養条件は、用いる菌株および培地の組成に応じて個別的に選択する必要がある。発現させようとする望ましい遺伝子を含むベクターDNAが確実に維持されるように、増殖培地に抗生物質を加えてもよい。培地の配合は、DSMまたはATCCのカタログおよびサムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、Laboratory Manual)」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)に記載されている。
【0081】
本発明のポリメラーゼを産生する組換え宿主細胞は、例えば遠心分離により、液体培養物から分離することができる。一般には、収集した微生物細胞を適した緩衝液中に分散させた後に、緩衝液による酵素の抽出が可能となるように、超音波処理または他の周知の手順によって破壊する。超遠心または遠心分離によって細胞片を除去した後に、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの標準的なタンパク質精製法により、ポリメラーゼを精製することができる。精製中にポリメラーゼの存在を検出するためのアッセイは当技術分野で周知であり、これらの酵素の存在を判定するために従来の生化学的な精製法の際に用いることができる。
【0082】
7.ポリメラーゼの用途
本発明のポリメラーゼは、周知の核酸の合成、配列決定、標識、増幅およびcDNA合成反応に用いうる。3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性が上昇している、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性がない、もしくは実質的に低下しており、または酵素のdNTPおよびddNTPに対する識別性をなくす、1つもしくは複数の変異をO−ヘリックス内に含むか、または誤取り込みが減少したもしくは忠実度が高くなった酵素を生じる、3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの変異を含む、ポリメラーゼ変異体は、合成、配列決定、標識、増幅およびcDNA合成のために特に有用である。さらに、これらの特性の2つまたはそれ以上を含む本発明のポリメラーゼも、合成、配列決定、標識、増幅またはcDNA合成反応に特に有用である。よく知られているように、配列決定反応(等温DNA配列決定およびDNAのサイクル配列決定)には、ポリメラーゼを用いる必要がある。ジデオキシ法による配列決定は、DNAポリメラーゼによる伸長のための特異的プライマー、塩基特異的連鎖ターミネーターを用いる連鎖停止法の使用、および、元のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、新たに合成された連鎖停止後のDNA分子をサイズ別に分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用を伴う。特に、DNA分子の配列決定は、異なる塩基特異的ターミネーターをそれぞれが含む、4種の別々のDNA配列反応(または、蛍光ターミネーターを用いる場合には1つの反応)を用いることによって行われる。例えば、第1の反応物がG特異的ターミネーターを含み、第2の反応物がT特異的ターミネーターを含み、第3の反応物がA特異的ターミネーターを含み、第4の反応物がC特異的ターミネーターを含むことが考えられる。好ましいターミネーターヌクレオチドには、ddATP、ddTTP、ddGTP、ddITPおよびddCTPなどのジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)が含まれる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の類似体を用いてもよく、これらは当技術分野で周知である。
【0083】
DNA分子の配列決定を行う場合、ddNTPにはデオキシリボース塩基の3’位にヒドロキシル残基がなく、このため、それらは伸長するDNA鎖にDNAポリメラーゼによって組み込まれても、3’ヒドロキシル残基がないために次のホスホジエステル結合の形成が妨げられ、その結果、DNA分子の伸長が停止する。したがって、配列決定用の反応混合物中に少量の1種類のddNTPを含めると、連鎖の伸長と塩基特異的停止との競合が起こり、配列決定を行おうとするDNAテンプレートよりも長さが短い合成DNA分子の集団が生じる。4種の異なるddNTPを4つの別々の酵素反応に用いることにより、元のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように合成DNA分子の集団をサイズ別に分離することができる。ジデオキシ−ヌクレオチドによるDNA配列決定は周知であり、サムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)に記載されている。容易に認識されるであろうが、本発明のポリメラーゼを、このような配列決定反応に用いてもよい。
【0084】
よく知られているように、配列決定反応には一般に、検出可能な標識がなされたヌクレオチドが含まれる。放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識を非制限的に含むさまざまな標識ヌクレオチドを、配列決定(または標識)反応に用いることができる。例えば、本発明のポリメラーゼは、配列決定(または標識)反応時にαSヌクレオチド([αS]dATP、[αS]dTTP、[αS]dCTPおよび[αS]dGTP)を取り込ませるために有用と思われる。
【0085】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は周知のDNA増幅法であり、DNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて標的DNAテンプレートを増幅する工程である。この種のPCR反応では、増幅しようとするDNA分子の第1鎖の3’末端(または3’末端の近傍)に対して相補的な1つのプライマー、および増幅しようとするDNA分子の第2鎖の3’末端(または3’末端の近傍)に対して相補的な第2のプライマーという2つのプライマーを、それぞれのDNA鎖とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼにより、増幅しようとするDNA分子の第1鎖の全体または一部に対して相補的な第3のDNA分子、および第2鎖の全体または一部に対して相補的な第4のDNA分子を合成させる。この合成により、2つの二本鎖DNA分子が生じる。続いて、このような二本鎖DNA分子は、DNAポリメラーゼ、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供することにより、別のDNA分子の合成のためのDNAテンプレートとして役立つ。よく知られているように、追加的な合成は最初の反応の「サイクリング」によって(過剰なプライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いる)、変性および合成の段階を多数行うことによって行われる。一般に、一本鎖DNAテンプレートを形成させるための二本鎖DNA分子の変性は高温で行われる。本発明のDNAポリメラーゼは熱安定性のあるDNAポリメラーゼであることが好ましく、このため、DNA増幅反応時のこのような熱サイクリングにも耐えると考えられる。このように、本発明のDNAポリメラーゼは、PCR反応のために、特に増幅時にDNA分子を変性させるために高温を用いる場合に、理想的に適している。
【0086】
8.キット
DNAの配列決定用のキットは、さまざまな容器手段を含みうる。第1の容器手段は、例えば、本発明のポリメラーゼの実質的に精製された試料を含む。第2の容器手段は、DNAテンプレートに対して相補的なDNA分子を合成するために必要な1つまたは複数の種類のヌクレオチドを含みうる。第3の容器手段は、1つまたは複数の異なる種類のターミネーター(ジデオキシヌクレオシド三リン酸など)を含みうる。第4の容器手段は、ピロフォスターゼを含みうる。以上の容器手段に加えて、1つまたは複数のプライマーおよび/または適した配列決定緩衝液を含む別の容器手段をキットに含めてもよい。
【0087】
核酸の増幅または合成のために用いられるキットは、例えば、実質的に純粋な本発明のポリメラーゼを含む第1の容器手段、および一種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物を含む1つまたは複数の追加的な容器手段を含むと考えられる。キットには、適した増幅用または合成用の緩衝液に加えて、種々のプライマーを含めてもよい。
【0088】
必要に応じて、本発明のキットに、核酸分子の合成または配列決定の際に用いうる検出可能な標識がなされたヌクレオチドを含む容器手段を含めてもよい。複数の標識のうち1つはこのようなヌクレオチドを検出するために用いてよい。標識の例には、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識が非制限的に含まれる。
【0089】
本発明の一般的な説明を行ってきたが、これは以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されると考えられる。これらは例示のために提供するものであり、別に特記する場合を除き、本発明を制限することを意図したものではない。
【0090】
実施例 1
ハイブリッド型Taq DNAポリメラーゼの構築
Taqポリメラーゼの3つのドメインはすべて、キム(Kim)らにより、結晶構造を元に記載されている(Nature 376:612〜616(1995))。活性のある5’−3’エキソヌクレアーゼドメインは1〜289アミノ酸に位置し、活性のない3’−5’エキソヌクレアーゼドメインは294〜422アミノ酸に、活性のあるポリメラーゼドメインは424〜831アミノ酸に位置する。TaqおよびTne DNAポリメラーゼの間のアミノ酸アライメントにより、本発明者らは、Tneポリメラーゼに関する対応領域は以下の通りであると推定した:1〜291アミノ酸(5’−3’−エキソヌクレアーゼ)、292〜485アミノ酸(3’−5’−エキソヌクレアーゼ)および486〜893アミノ酸(ポリメラーゼ)。第1に、本発明者らは、Tne DNAポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインをTaqポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインによって置換しようと考えた。Tneポリメラーゼの5’−3−エキソヌクレアーゼドメイン内には好都合なBsrGIがあったため (アミノ酸204〜206)、本発明者らはこの部位をドメイン交換のために利用した。Taqポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインは以下のオリゴを用いて増幅した:
【0091】
オリゴ#1はSstI(太い下線を付した)およびNdeI(太字のイタリック体)という2つの制限部位を含み、オリゴ#2はPCR断片のクローニングが容易になるBsrGI部位を含む。増幅にはPCR Supermix(Invitrogen Corporation、Life Technologies Division)を用い、各プライマーの濃度は1μMとした。94℃ 2分間(1サイクル)、94℃ 15秒間、55℃ 15秒間、72℃ 45秒間(15サイクル);72℃ 2分間(1サイクル)というPCRプログラムを、パーキンエルマー(Perkin Elmer)社のサーマルサイクラーにて用いた。PCR産物をSstIおよびBsrGIで消化し、pTTQTne(PTTQ、Pharmacia、California)中にクローニングした。このプラスミドをpTne79と命名した。このプラスミドは3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性を失活させる変異を含む。3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性を回復させるために、pTne79のBsrGI−HindIII断片を、野生型Tneポリメラーゼ遺伝子由来の同一の断片によって置換した。このプラスミドをpTne80と呼んだ。このクローンは、Taqポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメイン、ならびにTneポリメラーゼ由来の活性のある3’−5’エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインを含む。pTne80由来のポリメラーゼドメインを置換するために、本発明者らはTneポリメラーゼのアミノ酸515〜893をTaqポリメラーゼアミノ酸454〜831によって置換した。Taqポリメラーゼドメインは以下のオリゴを用いて増幅した:
【0092】
PCR産物のクローニングによってpTne80のEcoRI−HinDIII断片を置換しうるように、オリゴ#3にEcoRI部位を作製し、オリゴ#4にはHindIII部位を作製した。Tneポリメラーゼドメインには2つのEcoRI部位がある(それぞれアミノ酸516〜517および621〜622内)。HindIII部位はポリメラーゼ遺伝子の外側にあり、ベクター中に存在する。PCRは上記の通りに行った。PCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、EcoRI+HindIIIで消化したpTne 80中にクローニングした。このプラスミドをpTne86と呼んだ。これはTaqポリメラーゼ由来の5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメイン、ならびにTneポリメラーゼ由来の3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインを含む。オリゴ#3には、TaqポリメラーゼにおけるAGG(アミノ酸457)の代わりにアルギニンとなるCGGを用いた。本構築物において、ポリメラーゼドメインの接合部はβ−シート6とヘリックスHとの間にある。もう1つのハイブリッドも異なる位置に作製した(実施例4参照)。
【0093】
3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインの接合部の配列は以下の通りである:
【0094】
太字イタリック体の配列はTaqポリメラーゼに由来し、他のものはTneポリメラーゼに由来する。数字はそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸番号に対応する。
【0095】
実施例 2
ハイブリッドのポリメラーゼ活性に関する予備的スクリーニング
以下の通りに構築物を耐熱性ポリメラーゼ活性に関してアッセイした:アンピシリン(100μg/ml)を含むサークルグロー(CG)培地中にて培養物を30℃で一晩培養した(2ml)。40mlのCG+Amp100に対して、一晩培養したもの1mlを添加し、O.Dが約1.0(A590)に到達するまで培養物を37℃で増殖させた。この培養物を20mlずつの2つのアリコートに分け、第1のアリコート(非誘導)は37℃に保った。もう一方のアリコートには、IPTGを最終濃度が2mMになるように添加し、培養物を37℃でインキュベートした。3時間後に培養物を卓上遠心機により4℃、3500rpmで20分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを−70℃で保存した。細胞ペレットを、10mM Tris pH 8.0、1mM Na2EDTA、10mMβ−メルカプトエタノール(β−ME)を含む緩衝液中に懸濁した。細胞懸濁液(500μl)を水浴中で74℃に20分間加熱した。チューブを氷上に10分間置いた後、4℃、13000rpmで10分間遠心した。この清澄な上清を72℃でのポリメラーゼ活性のアッセイのために採取した。ポリメラーゼ活性アッセイ用の反応混合物は、25mM TAPS緩衝液(pH 9.3)、2mM MgCl2、15mM KCl、1mM EDTA、0.2mM dNTPs、500μg/ml DNアーゼI処理サケ精子DNA、21mCi/ml α32PdCTP、および各実施例に明記した種々の量の酵素を最終容積25μl中に含む。72℃で10分間インキュベートした後、5μlの0.5M EDTAをチューブに添加した。25μlの反応混合物を用いてGF/CフィルターにおけるTCA沈殿カウント(TCA precipitable count)を測定した。
【0096】
実施例 3
pTne86からのハイブリッド型ポリメラーゼの精製
細胞をサークルグロー(Circle Grow)培地(Bio 101、California)中にて30℃で増殖させ、1mM IPTGで誘導を加えた。クローニングした変異型Tne DNAポリメラーゼを発現する細胞2〜3グラムを15〜20mlの超音波処理用緩衝液(50mM Tris−HCl、pH 8.0、10%グリセロール、5mM β−Me、50MM NaCl、1mM EDTAおよび0.5mM PMSF)中に再懸濁し、550型ソニックディスメンブレーター (550 Sonic Dismembrator)により超音波処理を行った。超音波処理を行った試料を75℃に30分間加熱した。塩化ナトリウム溶液を試料に添加して濃度を200mMに増大させ、5%PEI(ポリエチルイミン)溶液を最終濃度0.2%となるように滴下した。この試料を13,000rpmで10分間遠心した。硫酸アンモニウム(305mg/ml)を上清に添加した。ペレットを遠心処理によって採取し、5mlのMonoQカラム用緩衝液(50mM Tris−HCl pH8.0、10%グリセロール、5mM β−ME、50mM NaClおよび1mM EDTA)中に再懸濁した。試料を250mlのMonoQ緩衝液に対して一晩透析した。不溶性物質を除去するために試料を13,000rpmで遠心した後に、MonoQカラム(HR5/5、Pharmacia)に載せた。A280がベースラインになるまでカラムをMonoQカラム用緩衝液で洗浄し、続いてカラム20倍量の50〜300mM NaCl(MonoQカラム用緩衝液中)の直線勾配により、溶出させた。画分をSDS−PAGEによって分析し、上記の通りに耐熱性ポリメラーゼ活性に関してアッセイした。
【0097】
実施例 4
ポリメラーゼドメインの新たな接合部からのハイブリッド型Taqポリメラーゼ
この場合には、接合部をヘリックスFとヘリックスGとの間に作製する。2つのドメインを連結するためにClaI部位を作製する。PCR用のオリゴは以下の通りとした:
【0098】
このオリゴはTne 3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインのアミノ末端とアニーリングする。
【0099】
このオリゴはTne 3’エキソドメインのカルボキシル末端とアニーリングする。
【0100】
このオリゴはTaqポリメラーゼドメインのアミノ末端とアニーリングする。
【0101】
オリゴの中の制限酵素部位は太字イタリック体としている。オリゴ#5はBsrGI部位を含み、オリゴ#6および#7はClaI部位を含む。PCRスーパーミックス(PCR Supermix)(Invitrogen Corporation、Life Technologies Division、Rockville、Maryland)を増幅に用い、各プライマーの濃度は1μMとした。94℃ 2分間;94℃ 15秒間、55℃ 15秒間、72℃ 45秒間(15回);72℃ 2分間というPCRプログラムを、パーキンエルマー(Perkin Elmer)社(California)のサーマルサイクラーにて用いた。Tne DNAポリメラーゼ遺伝子をテンプレートとして用いるオリゴ#5および#6による増幅では850bpの産物が得られ、Taq DNAポリメラーゼ遺伝子をテンプレートとして用いるオリゴ#7および#4による増幅では、1300bpのPCR産物が得られる。これらをそれぞれ、制限酵素BsrGI/ClaIおよびClaI/HindIIIで消化した。ベクターpTne86をBsrGI/HindIIIで消化し、3つの断片をT4DNAリガーゼを用いて連結した。クローンを制限酵素分析によって分析した。このクローンはpTne173と命名され、上記の活性型ポリメラーゼを産生する。
【0102】
3’−5’−エキソヌクレアーゼドメイン接合部の配列はpTne86と類似している。ポリメラーゼ接合部の配列は以下の通りである:
【0103】
本発明者らは、3’−5’−エキソヌクレアーゼ接合部のpTne86との類似性を保ちながらポリメラーゼドメインを異なる接合部をする類似の技法を用いて他のハイブリッドも作製した。いくつかの構築物のポリメラーゼ接合部の配列は以下の通りである:
【0104】
pTne87およびpTne90は上記のアッセイによる活性型ポリメラーゼを産生する。
【0105】
実施例 5
ハイブリッド型Taqポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性アッセイ
pTne86から精製したハイブリッド型ポリメラーゼを触媒活性に関して詳細に検討した。組換えポリメラーゼの編集機能(3’−5’エキソヌクレアーゼ活性)は、プライマーの3’末端に4つのミスマッチ塩基対がある36/60量体プライマー/テンプレートである二本鎖DNAを用いて定量的に測定した。野生型Taqポリメラーゼおよびキメラ酵素の3’−5’エキソヌクレアーゼ活性は60℃でアッセイした。対照として、2つのTneポリメラーゼ変異体の3’−5’エキソヌクレアーゼ活性もアッセイした。第1の変異型誘導体はD137Aの変異のために5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、第2のものはそれぞれD323AおよびD137Aでの二重置換のために、3’−5’および5’−3’エキソヌクレアーゼ活性がいずれもない。
【0106】
4塩基のミスマッチがある以下のDNA基質をアッセイに用いた:
【0107】
MgCl2の存在下でポリメラーゼを添加することにより、プライマー鎖の3’末端の分解を開始させた。反応混合物は約20nMのDNAを20mM Tris−HCl、pH 8.4、1.5mM MgCl2および50mM KCl中に含む。前定常状態条件下でホスホジエステル結合の切断を触媒するように、ポリメラーゼはDNA基質に対して大過剰量とした。ポリメラーゼの添加から20秒後、1分後および2分後に1.5μlの試料を採取し、ホルムアミド、EDTA、SDS、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールFFを含む停止液3μlと混合することによって反応を停止させた。最後に試料を変性8%ポリアクリルアミドゲルにより分画した。
【0108】
DNA基質の調製
オリゴヌクレオチド(プライマー鎖およびテンプレート鎖)は、インビトロジェン社ライフテクノロジー部門(Invitrogen Corporation、Life Technologies Division)のカスタムプライマー(Custom Primer)を利用して注文した。プライマー鎖はHPLC精製し、テンプレート鎖はPAGEで精製した。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーを5’標識し、テンプレートとアニーリングさせた。
【0109】
結果
キメラ型ポリメラーゼは、本発明者らの実験条件下で、Tneポリメラーゼと同程度の効率でミスマッチ塩基を分解する(図1)。予想された通り、野生型TaqおよびTne(3’−5’エキソヌクレアーゼを欠く変異型)ポリメラーゼはプライマーの切断を触媒しなかった。この結果はキメラ型ポリメラーゼが酵素活性を持つことを示しており、Taqポリメラーゼがミスマッチを編集しうることを示唆する。
【0110】
実施例 6
3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の定量アッセイ
野生型Taq DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ(5’−exo−、3’−5’−exo+)およびTaq/Tneハイブリッド型DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を、3’標識二本鎖DNAを用いて測定した。用いた基質はTaqI制限酵素で消化し、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIの存在下で3HdGTPおよび3HdCTPにより3’末端を標識したλDNA断片とした。20mM Tris−HCl、pH 8.0、50mM KCl、2mM MgCl2、5mMジチオトレイトール(DTT)を、約2.5単位の種々のポリメラーゼとともに含む50μlの反応物に対して、1pmolの基質を用いた。野生型Taq DNAポリメラーゼの場合には、約21単位も含めた。反応物を72℃で1時間インキュベートした。チューブを氷上に置き、10μlの各反応物をPEIプレート上に滴下した。薄層クロマトグラフィーを2N HCl中で行った。末端標識の遊離を液体シンチレーションによって測定した。
【0111】
結果
予想された通り、2.6単位または21単位の酵素を用いた場合、Tneポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ変異体および野生型Taqポリメラーゼによって遊離した、標識ヌクレオチドの量は、無視しうる程度であった(表2)。しかし、3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性の高いTneポリメラーゼおよびTaq/Tneハイブリッド型DNAポリメラーゼ(またはpTne86から産生されるTaqハイブリッド)は、ほぼ等量の標識ヌクレオチドを遊離させた。ハイブリッド型ポリメラーゼではTneポリメラーゼの完全な3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が回復していることが明らかである。ハイブリッド型ポリメラーゼにおける3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の上昇は野生型Taqポリメラーゼの40倍と推定された。
【0112】
【表2】3’二本鎖DNA基質に対するエキソヌクレアーゼアッセイ
【0113】
実施例 7
ポリメラーゼ/エキソヌクレアーゼ共役活性の測定
本発明者らは、ハイブリッド型ポリメラーゼがミスマッチプライマー末端を分解すると同時に、相補的テンプレートとアニーリングしたプライマーを伸長させる能力を調べるための実験を設計した。エキソヌクレアーゼにより導かれるプライマーの分解に引き続いて起こる重合反応を、上記とほぼ同じ条件下で上記のDNA基質を用いてアッセイした。異なる点は、プライマーを伸長させるためにこの反応混合物にはdNTPが存在することである。dNTPの最終濃度は250μMとした。
【0114】
結果
キメラ型ポリメラーゼは、本発明者らの実験条件下では、Tneポリメラーゼとほぼ同様の効率でプライマー3’末端のミスマッチ塩基を分解し、それを伸長させる(図2)。予想された通り、野生型Taq(3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く)およびTne(3’−5’エキソヌクレアーゼを欠く変異型)ポリメラーゼはプライマーの3’末端を切断しなかった。この結果もキメラ型ポリメラーゼが酵素活性を持つことを示しており、正しくフォールディングが行われたことを示唆する。
【0115】
実施例 8
定常状態Kcatの測定
キメラ型DNAポリメラーゼの定常状態Kcatを、ポレスキー(Polesky)ら、1990年の記載の通りに60℃で測定した。(dG)35が約1に対してテンプレートG残基が100のモル比で(dG)35をポリ(dC)とアニーリングさせることによってDNA基質を調製した。速度を測定したDNAおよびdNTPの濃度は、それぞれ2.5μMおよび250μM dNTPであった。
【0116】
結果
キメラ型DNAポリメラーゼのdGTP取り込みに関する定常状態k(cat)は約25/秒である。この結果はTneおよびTaq DNAポリメラーゼから得られる値と同じであり、キメラDNAポリメラーゼが親タンパク質の本来の構造と同様にフォールディングしたことを示唆する。
【0117】
理解を容易にする目的で、本発明を例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、本発明の範囲またはその何らかの特定の態様に影響を及ぼさずに、幅広い等価な条件、配合および他のパラメーターの範囲内で、本発明を修正または変更することによって同じことを行えることは当業者には明らかであると考えられ、このような修正または変更は添付する特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【0118】
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示すものであり、すべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図1】36/64量体プライマー−テンプレート基質を用いて60℃で定量的に評価した、Tne DNAポリメラーゼ、およびプライマー鎖の3’末端に4塩基のミスマッチがある変異型誘導体の、相対的3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示すゲルを図示したものである。TneAは、D137AおよびD323Aを有するTne DNAポリメラーゼ変異体(5’−3’エキソヌクレアーゼ活性および3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く)を表す;TneBは、D137Aを有し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne DNAポリメラーゼ変異体を表す;Chiは以下に述べるTaq/Tneキメラ型DNAポリメラーゼを表し、Taqは野生型Taq DNAポリメラーゼである。各図の3つのレーンは、左から右の順に、反応を停止させる20秒前、1分前および2分前である。Pはプライマーの位置を表し、C(2つのレーン)は反応混合物に酵素を添加しなかった対照である。
【図2】36/64量体プライマー−テンプレート基質を用いて60℃で定量的に評価した、Tne DNAポリメラーゼ、およびプライマー鎖の3’末端に4塩基のミスマッチがある変異型誘導体が、プライマー末端からのミスマッチを分解してdNTPを取り込む能力を示したグラフを図示したものである。TneAは、D137AおよびD323Aを有し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性および3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne DNAポリメラーゼ変異体を表す;TneBは、D137Aを有し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne DNAポリメラーゼ変異体を表す;Taqは野生型Taq DNAポリメラーゼであり、Chiは以下に述べるTne−Taqキメラ型DNAポリメラーゼを表す。各図の4つのレーンは、左から右の順に、反応を停止させる20秒前、1分前、2分前および5分前である。Pはプライマーの位置を表し、C(2つのレーン)は反応混合物に酵素を添加しなかった対照である。
発明の背景
発明の分野
本発明は、忠実度の高い実質的に純粋なポリメラーゼに関する。特に、本発明のポリメラーゼは、ポリメラーゼの忠実度が増加し(非改変型または非変異型のポリメラーゼと比べて)、それによって誤取り込み率(misincorporation rate)が低いポリメラーゼが得られるように改変されたポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ)である。本発明のポリメラーゼは耐熱性または中温性のポリメラーゼであることが好ましい。本発明は、本発明のポリメラーゼのクローニングおよび発現、クローニングされた遺伝子を含むDNA分子、ならびに前記遺伝子を発現する宿主にも関する。本発明のポリメラーゼは、DNA配列決定、増幅反応、核酸合成およびcDNA合成に用いうる。
【0002】
本発明は、1つまたは複数の追加的な変異または改変を有する本発明のポリメラーゼにも関する。このような変異または改変には、(1)ポリメラーゼが、ジデオキシヌクレオチドおよび他の修飾ヌクレオチドをデオキシヌクレオチドと同程度の効率でDNA分子に取り込む能力を増強または増大させるもの;ならびに(2)5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下させるものが含まれる。本発明のポリメラーゼは、これらの特性の1つまたは複数を有しうる。これらのポリメラーゼを、DNA配列決定、増幅反応、核酸合成およびcDNA合成に用いてもよい。
【0003】
関連技術
DNAポリメラーゼは、DNAテンプレートに対して相補的なDNA分子の形成を司る。プライマーが一本鎖DNAテンプレートとハイブリダイズすると、ポリメラーゼはDNAを5’から3’の向きに合成し、成長する鎖の3’−ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的に付加する。このようにして、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)およびプライマーの存在下で、一本鎖DNAテンプレートに対して相補的な新たなDNA分子の合成が可能になる。
【0004】
多数のDNAポリメラーゼが大腸菌(E.coli)などの中温性微生物から単離されている。これらの中温性DNAポリメラーゼの多くに対してはクローニングも行われている。リン(Lin)らは、T4 DNAポリメラーゼをクローニングし、大腸菌(E.coli)で発現させている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7000〜7004(1987))。タボール(Tabor)ら(米国特許第4,795,699号)はクローニングしたT7 DNAポリメラーゼを記載しており、ミンクレー(Minkley)ら(J Biol. Chem. 259:10386〜10392(1984))およびチャタジー(Chatterjee)(米国特許第5,047,342号)はそれぞれ大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI、およびT5 DNAポリメラーゼのクローニングを記載している。
【0005】
好熱菌由来のDNAポリメラーゼも記載されている。チェン(Chien)ら、J. Bacteriol. 127:1550〜1557(1976)は、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(Taq)からポリメラーゼを入手するための精製方法を記載している。この結果得られたタンパク質の分子量はゲル濾過分析によれば約63,000ダルトンであり、ショ糖勾配遠心分離によれば68,000ダルトンであった。カレージン(Kaledin)ら、Biokhymiya 45:644〜51(1980)は、T.アクアティカス(T. aquaticus)YT1株からDNAポリメラーゼを単離するための精製手順を開示している。精製された酵素は62,000ダルトンの単量体タンパク質であると報告されている。ゲルファント(Gelfand)ら(米国特許第4,889,818号は)は、サーマス・アクアティカスの耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングした。このタンパク質の分子量は約86,000〜90,000ダルトンであることが判明した。シンプソン(Simpson)らは、テルモトーガ属(Thermotoga species)由来の耐熱性DNAポリメラーゼを精製し、その特徴を一部明らかにしている(Biochem. Cell. Biol. 86:1292〜1296(1990))。シンプソンらによって単離された精製DNAポリメラーゼの分子量は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーによる評価では85,000ダルトンであった。この酵素の基質非存在下における半減期は95℃で3分間、50℃で60分間であり、至適pHはpH 7.5〜8.0の範囲であった。トリトンX−100はこの酵素の耐熱性を強めるように思われた。シンプソンらによって記載された耐熱性DNAポリメラーゼの入手のために用いられた菌株は、テルモトーガ属FjSS3−B.1株であった(Hussarら、FEMS Microbiology Letters 37:121〜127(1986))。また別の研究者らは、テルモトーガ・マリティマ(Thermotoga maritima)の耐熱性DNAポリメラーゼをクローニングし、その配列を決定している(米国特許第5,374,553号、これは明確に参照として本明細書に組み入れられる)。
【0006】
その他のDNAポリメラーゼは、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus steraothermophilus)を含む好熱菌(Steneshら、Biochim. Biophys. Acta 272:156〜166(1972);およびKaboevら、J. Bacteriol. 145:21〜26(1981))およびいくつかの古細菌から同定されている(Rossiら、System. Appl. Microbiol. 7:337〜341(1986);Klimczakら、Biochemistry 25:4850〜4855(1986);およびElieら、Eur. J Biochem. 178:619〜626(1989))。最も高度に精製された古細菌DNAポリメラーゼの半減期は87℃で15分間と報告されている(Elieら(1989)、前記)。イニス(Innis)ら、「PCRプロトコール:方法および増幅の手引き(PCR Protocol:A Guide To Methods and Amplfication)」、Academic Press、Inc.、San Diego(1990)は、超高温で生育可能な超好熱性の真正細菌および古細菌がいくつか存在することを指摘し(Bergquistら、Biotech. Genet. Eng. Rev. 5:199〜244(1987);およびケリー(Kelly)ら、Biotechnol. Prog. 4:47−62(1988))、これらの生物が極めて耐熱性の強いDNAポリメラーゼを含む可能性を示唆している。
【0007】
既知のポリメラーゼの多くには、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有する1つのドメイン、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するもう1つのドメイン、ポリメラーゼ活性を有する第3のドメインという、3つのドメインが存在する。
【0008】
5’−3’エキソヌクレアーゼドメインはポリメラーゼのN末端領域に存在する(Ollisら、Nature 313:762〜766(1985);Freemontら、Proteins 1:66〜73(1986);Joyce、Cur. Opin. Struct. Biol. 1:123〜129(1991))。いくつかのアミノ酸は、その変異によって大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を低下させると考えられている(Gutman & Minton、Nucl. Acids Res. 21:4406〜4407(1993))。これらのアミノ酸には、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIのTyr77、Gly103、Gly184およびGly192が含まれる。5’−エキソヌクレアーゼドメインは必須ではないことが知られている。その最もよく知られた例は、大腸菌(E.coli)ポリメラーゼIのクレノー断片である。クレノー断片は、5’−エキソヌクレアーゼ活性のない天然のタンパク質分解性断片である(Joyceら、J. Biol. Chem. 257:1958〜64(1990))。この活性を持たないポリメラーゼはDNA配列決定に有用である。
【0009】
dNTP結合ドメインを含むポリメラーゼの活性部位は通常、ポリメラーゼのカルボキシ末端領域に存在する(Ollisら、Nature 313:762〜766(1985);Freemontら、Proteins 1:66〜73(1986))。大腸菌(E.coli)ポリメラーゼIのPhe762はヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸の1つであることが示されている(Joyce & Steitz、Ann. Rev. Biochein. 63:777〜822(1994);Astatke、J Biol. Chem. 270:1945〜54(1995))。このアミノ酸をTyrに変換することにより、ジデオキシヌクレオチドを識別しない変異型DNAポリメラーゼが生じる。米国特許第5,614,365号、第5,912,155号、第5,939,301号、第6,015,668号および第5,948,614号、ならびに本明細書に参照として明確に組み入れられる、1995年9月8日に提出された「変異型DNAポリメラーゼおよびその使用(Mutant DNA Polymerases and the Use Thereof)」と題するチャタジー(Deb K. Chatterjee)による同時係属出願中の米国特許出願第08/525,057号を参照されたい。
【0010】
ほとんどのDNAポリメラーゼは3’−5’エキソヌクレアーゼ活性も含む。このエキソヌクレアーゼ活性はDNAポリメラーゼにプルーフリーディング能力を与える。サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)由来のTaq DNAポリメラーゼは、核酸合成反応に最も用いやすく、このためポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に最も広く用いられているが、プルーフリーディング能力はない。他の酵素と比較した場合、Taqポリメラーゼの相対平均誤り率をプルーフリーディング能力のあるPfu、VentおよびDeep Ventポリメラーゼと比べるとそれぞれ8×10− 6、1.3×10− 6、2.8×10− 6および2.7×10− 6である(Clineら、Nucleic Acids Res. 24:3546〜3551(1996))。これは、Taq DNAポリメラーゼには3’−5’エキソヌクレアーゼ活性に必要な重要な3つのモチーフのすべてに欠失があるという事実に起因する(Lawyerら、J. Biol. Chem. 6427〜6437(1989))。興味深いことに、これらの欠失があるにもかかわらず、Taq DNAポリメラーゼはクレノー断片と比べて、残存する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインには非常に大きな変化があるものの、全体的な三次元構造は維持している(Kimら、Nature 376:612〜616(1995);Eomら、Nature 382:278〜281(1996))。
【0011】
複数のポリメラーゼが知られているものの、当技術分野には、核酸合成、配列決定および増幅の目的にさらに適したポリメラーゼを開発することに対する需要が存在する。このようなポリメラーゼは、誤り率が低い、すなわち核酸合成時のヌクレオチドの誤取り込み率が低い、および/または重合の忠実度が高いと考えられる。
【0012】
発明の概要
本発明は、分子生物学において有用なさらなるポリメラーゼを提供することにより、当技術分野における需要を満たす。特に、本発明は、忠実度が高められた耐熱性および中温性のポリメラーゼを含む。このようなポリメラーゼは、酵素の忠実度が増加または向上するように3’−5’エキソヌクレアーゼドメインが改変されている。改変には、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の上昇をもたらす3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの変異、または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼに由来する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインによる3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの部分的もしくは完全な置換が含まれる。
【0013】
本発明において、本発明者らは、Taqポリメラーゼの不活性型3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインが別の耐熱性DNAポリメラーゼの活性型3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインによって置換された、ハイブリッド型Taqポリメラーゼを作製した。本発明者らは最近、テルモトーガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)由来の耐熱性DNAポリメラーゼであるTne DNAポリメラーゼを報告した(米国特許第5,912,155号、第5,939,301号、第6,015,668号および第5,948,614号)。Taqポリメラーゼと同様に、TneポリメラーゼもPol Iファミリーに属する。しかし、Taqポリメラーゼとは異なり、Tneポリメラーゼには活性型3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインがある。本発明者らは、ハイブリッド型Taqポリメラーゼが5’−3’−エキソヌクレアーゼ活性、3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性という3つの活性をすべて発揮することを示しており、このことからドメインの再編成を行っても構造的な完全性が損なわれない可能性が示唆された。本発明者らは、プルーフリーディング活性およびポリメラーゼの両者が協調的に作用することも示しており、このことはハイブリッド型ポリメラーゼが真の高忠実度ポリメラーゼのように作用することを意味する。このため、ハイブリッド型ポリメラーゼはPCRまたは他の用途に極めて有用であると考えられる。
【0014】
本発明において特に関心が持たれるDNAポリメラーゼ(耐熱性DNAポリメラーゼを含む)には、Taq DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tbr DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ、VENT(商標)DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIII、クレノー断片DNAポリメラーゼ、シュトッフェル断片DNAポリメラーゼおよびそれらの変異体、断片または誘導体が含まれる。本発明によれば、関心対象の酵素の忠実度を高めるために、このようなポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを改変または変異させる。
【0015】
本発明は特に、核酸合成、配列決定および増幅における酵素の正確性を向上させる(忠実度を高くする)1つまたは複数のアミノ酸の変化が3’−5’エキソヌクレアーゼドメインに加えられた、変異型PolI型DNAポリメラーゼ(好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼ)に関する。3’−5’エキソヌクレアーゼドメインは、触媒性アミノ酸のすべてを含む領域と定義される(Derbyshireら、Methods in Enzymology 262:363〜385(1995);Blancoら、Gene 112:139〜144(1992))。特に、DNAポリメラーゼのサブドメインにはExoI、ExoIIおよびExoIIIの3つがある。ExoIはpolI型DNAポリメラーゼの場合、350Pから360Sまでの領域と定義され、ExoIIは416Kから429Aまで、ExoIIIは492Eから505Tからまでの領域と定義される。他のDNAポリメラーゼにも対応する領域が認められる。完全な3’−5’活性のためには、3’−5’エキソドメインにある3つのサブドメインがすべて存在する必要がある。本発明によれば、当技術分野で周知の技法を用いて、これらのサブドメインにおける特定のアミノ酸または領域を変異させることにより、エキソ活性を修飾することが可能である。
【0016】
本発明に従って、忠実度が高められたポリメラーゼに対して、他の機能的な変化を加えることもできる。例えば、5’エキソヌクレアーゼ活性を低下させるため、および/またはddNTPに対する識別性を低下させるために、ポリメラーゼを改変してもよい。
【0017】
特に、本発明は、
(a)ポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇する様式;
(b)ポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性が低下または消失する様式;
(c)ジデオキシヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドに対する識別的挙動が低下または消失する様式、および
(d)核酸合成時の不正確なヌクレオチドの誤取り込みが低下または消失する様式、
からなる群から選択される、少なくとも1つの様式で改変された、変異型または改変型のDNAポリメラーゼに関する。
【0018】
本発明は、本発明の変異型または改変型のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むDNA分子(好ましくはベクター)、およびこのようなDNA分子を含む宿主細胞にも向けられる。関心対象の遺伝子を発現させるためには、原核細胞および真核細胞を含むさまざまな宿主を用いてよい。本発明のポリメラーゼを発現させるためには原核細胞を用いることが好ましい。本発明による好ましい原核生物宿主は大腸菌(E.coli)である。
【0019】
本発明は、本発明のポリメラーゼを生産する方法であって、
(a)本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する段階;
(b)前記遺伝子を発現させる段階;および
(c)前記宿主細胞から前記ポリメラーゼを単離する段階
を含む方法にも関する。
【0020】
本発明は、核酸分子を合成する方法であって、
(a)核酸テンプレート(例えば、RNAまたはDNA)を1つまたは複数の本発明のポリメラーゼと混合する段階;および
(b)前記テンプレートの全体または一部に対して相補的な核酸分子が合成されるのに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする段階
を含む方法にも関する。このような条件には、1つまたは複数のデオキシ−またはジデオキシリボヌクレオシド三リン酸とのインキュベーションが含まれる。このようなデオキシ−およびジデオキシリボヌクレオシド三リン酸には、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7−デアザ−dGTP、7−デアザ−dATP、dUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、ddTTP、[α−S]dATP、[α−S]dTTP、[α−S]dGTPおよび[α−S]dCTPが含まれる。
【0021】
本方法は、DNA分子の配列を決定する方法であって、
(a)プライマーを第1のDNA分子とハイブリダイズさせる段階;
(b)段階(a)の前記分子をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、1つまたは複数の本発明のDNAポリメラーゼ、および1つまたは複数のターミネーターヌクレオチドと接触させる段階;
(c)合成されるDNA分子の長さが前記第1のDNA分子よりも短く、合成されるDNA分子が3’末端にターミネーターヌクレオチドを含む、前記第1のDNA分子に対して相補的なDNA分子の無作為な集団が合成されるのに十分な条件下で、段階(b)の混合物をインキュベートする段階;ならびに
(d)前記第1のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、前記合成されたDNA分子をサイズ別に分離する段階
を含む方法にも関する。このようなターミネーターヌクレオチドには、ddTTP、ddATP、ddGTP、ddITPまたはddCTPが含まれる。
【0022】
本発明は、二本鎖DNA分子を増幅するための方法であって、
(a)前記DNA分子の第1鎖の3’末端の内部または3’末端または近傍の配列に対して相補的な第1のプライマー、および前記DNA分子の第2鎖の3’末端の内部または3’末端または近傍の配列に対して相補的な第2のプライマーである、第1および第2のプライマーを提供する段階;
(b)前記第1鎖の全体または一部に対して相補的な第3のDNA分子、および前記第2鎖の全体または一部に対して相補的な第4のDNA分子が合成される条件下で、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼの存在下において、前記第1のプライマーを前記第1鎖と、前記第2のプライマーを前記第2鎖とハイブリダイズさせる段階;
(c)前記第1および第3鎖、ならびに前記第2および第4鎖を変性させる段階;ならびに
(d)(a)から(c)までの段階を1回または複数回繰り返す段階
を含む方法にも関する。
【0023】
したがって、本発明は一般に、
(a)配列決定を行おうとする1つまたは複数のテンプレートまたは核酸分子を、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼと混合する段階、および
(b)前記テンプレートの全体もしくは一部の増幅、または前記核酸分子の全体もしくは一部の配列決定が十分に行われる条件下で、前記混合物をインキュベートする段階
を含む、核酸分子の増幅または配列決定に関する。
【0024】
本発明は、核酸分子の配列決定、増幅または合成のためのキットであって、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼ、ならびに
(a)1つまたは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸;
(b)1つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸;
(c)1つまたは複数のプライマー;
(d)1つまたは複数の適した緩衝液または緩衝塩;
(e)1つまたは複数のヌクレオチド;および
(f)本発明の方法を実施するための指示
からなる群から選択される1つまたは複数の他の構成要素(またはそれらの組み合わせ)を含むキットにも関する。
【0025】
本発明は、本発明の方法を実施するために生成された組成物、および本発明の方法の実施時に生成された組成物にも関する。このような組成物は、1つまたは複数の本発明のポリメラーゼ、1つまたは複数のヌクレオチド、1つまたは複数のテンプレート、1つまたは複数の反応緩衝液または緩衝塩、1つまたは複数のプライマー、本発明の方法によって生成された1つまたは複数の核酸生成物などから選択される、1つまたは複数の構成要素を含みうる。
【0026】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明には、組換えDNA技術において用いられるさまざまな用語を頻繁に用いる。明細書および特許請求の範囲に関して明確かつ一貫した理解が得られるように、このような用語に与えられる範囲を含め、以下の定義を提示する。
【0027】
クローニングベクター
宿主細胞における自律複製が可能であり、ベクターの本質的な生物機能を失わずにその箇所で確定的な様式でDNA配列を切断しうる1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位があることを特徴とし、複製およびクローニングを行うために内部にDNAをスプライス挿入することができる、プラスミド、コスミドまたはファージDNAまたは他のDNA分子。クローニングベクターは、クローニングベクターによる形質転換がなされた細胞の同定に用いるのに適したマーカーをさらに含んでもよい。マーカーは例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。
【0028】
発現ベクター
クローニングベクターと類似しているが、宿主に形質転換導入された後に、内部にクローニングされた遺伝子の発現を増強させうるベクター。クローニングされる遺伝子は通常、プロモーター配列などの特定の制御配列の制御下に置かれる(すなわち、機能的に結合される)。
【0029】
組換え宿主
発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のDNA分子中に望ましいクローニングされた遺伝子を含む、任意の原核生物または真核生物または微生物。「組換え宿主」という用語は、宿主染色体またはゲノムに望ましい遺伝子を含むように遺伝的に操作された宿主細胞も含むものとする。
【0030】
宿主
複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは任意のDNA分子のレシピエントである、任意の原核生物性または真核生物性微生物。DNA分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび/または複製起点を非制限的に含みうる。
【0031】
プロモーター
遺伝子の5’領域として一般に説明され、開始コドンの近位部に位置するDNA配列。隣接する遺伝子の転写はプロモーター領域で開始される。
【0032】
遺伝子
ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むDNA配列。これはプロモーターおよび構造遺伝子のほか、タンパク質の発現に関与する他の配列を含む。
【0033】
構造遺伝子
メッセンジャーRNAへと転写され、続いて特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳されるDNA配列。
【0034】
機能的に結合している
本明細書で用いる場合、プロモーターが、構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現開始を制御する位置にあることを意味する。
【0035】
発現
発現とは、遺伝子がポリペプチドを産生する過程のことである。これには、遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)への転写、およびこのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【0036】
実質的に純粋である
本明細書で用いる「実質的に純粋である」とは、望まれる精製タンパク質に、望まれるタンパク質に自然下で付随している細胞性混入物が本質的に混入していないことを意味する。混入性の細胞成分には、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは望ましくないDNAポリメラーゼ酵素が非制限的に含まれる。
【0037】
プライマー
本明細書で用いる「プライマー」とは、DNA分子の増幅または重合の際にヌクレオチド単量体の共有結合によって伸長する一本鎖オリゴヌクレオチドのことを指す。
【0038】
テンプレート
本明細書で用いる「テンプレート」という用語は、増幅、合成または配列決定を行おうとする、二本鎖または一本鎖の核酸(DNAまたはmRNAなどのRNA)分子のことを指す。二本鎖核酸分子の場合には、これらの分子の増幅、合成または配列決定を行う前に、第1および第2鎖を形成させるためにその鎖を変性させる。テンプレートの一部に対して相補的なプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせると、続いて本発明のポリメラーゼが前記テンプレートまたはその一部に対して相補的な分子を合成する。本発明に従って新たに合成された分子の長さは、元のテンプレートと同じまたはより短いと考えられる。さらに、新たに合成された核酸分子は本発明に従ってさらに合成を行うためのテンプレートとしても役立つと思われる。新たに合成される分子の合成時または伸長時のミスマッチ取り込みは、1つまたは複数のミスマッチ塩基対をもたらすと思われる。したがって、合成される分子はテンプレートに対して厳密に相補的であるとは限らない。
【0039】
取り込み
本明細書で用いる「取り込み」という用語は、DNA分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【0040】
増幅
本明細書で用いる「増幅」とは、DNAポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増やすことを目的とする任意のインビトロの方法のことを指す。核酸の増幅により、DNA分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みが起こり、それによってDNAテンプレートに対して相補的な新たなDNA分子が形成される。形成されたDNA分子およびそのテンプレートは、別のDNA分子を合成するためのテンプレートとして用いることができる。本明細書で用いる場合、1つの増幅反応は、多数回のDNA複製から構成されうる。DNA増幅反応には例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が含まれる。1つのPCR反応は、20〜100「サイクル」にわたるDNA分子の変性および合成から構成されうる。
【0041】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」とは、1つのヌクレオチドのペントースの3’位と隣接するヌクレオチドのペントースの5’位との間のホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成性または天然の分子のことを指す。
【0042】
ヌクレオチド
本明細書で用いる「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組み合わせのことを意味する。ヌクレオチドは核酸配列(DNAおよびRNA)の単量体単位である。ヌクレオチドという用語には、dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはそれらの誘導体が含まれる。このような誘導体には、例えば、[αS]dATP、7−デアザ−dGTPおよび7−デアザ−dATPが含まれる。本明細書で用いるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)およびそれらの誘導体のことも指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の具体的な例には、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPが非制限的に含まれる。本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されていないものでもよく、または周知の技法によって直接標識されたものでもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識が含まれる。
【0043】
耐熱性
本明細書で用いる「耐熱性」とは、熱による失活に対する耐性のあるDNAポリメラーゼのことを指す。DNAポリメラーゼは、5’から3’の向きにプライマーを伸長させることにより、一本鎖DNAテンプレートに対して相補的なDNAの形成を司る。中温性DNAポリメラーゼの場合、この活性は熱処理によって失活する可能性がある。例えば、T5 DNAポリメラーゼの活性は本酵素を90℃の温度に30秒間曝露させることによって完全に失活する。本明細書で用いる場合、耐熱性DNAポリメラーゼの活性は、中温性DNAポリメラーゼよりも熱失活に対する耐性が強い。しかし、耐熱性DNAポリメラーゼは熱失活に対して完全に耐性のある酵素を指すものではなく、このため、熱処理によってDNAポリメラーゼ活性がある程度低下する可能性はある。また、耐熱性DNAポリメラーゼの至適温度は一般に中温性DNAポリメラーゼよりも高い。
【0044】
ハイブリダイゼーション
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズすること」という用語は、相補的一本鎖核酸分子(RNAおよび/またはDNA)の対合によって二本鎖分子が生じることを指す。本明細書で用いる場合、塩基対合が完全に相補的でなくとも2つの核酸分子はハイブリダイズしうる。したがって、当技術分野で周知の適切な条件を用いるという前提であれば、ミスマッチ塩基は2つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【0045】
3’→5’(3’−to−5’)エキソヌクレアーゼ活性
「3’→5’エキソヌクレアーゼ活性」は、当技術分野で周知の酵素活性である。この活性はDNAポリメラーゼにしばしばみられ、DNA複製の「編集」または修正機構に関与すると考えられている。
【0046】
「3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇したDNAポリメラーゼ」は、本明細書において、対応する変異していない野生型酵素と比べて、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が約10%もしくはそれ以上高い、または好ましくは約25%、30%、50%、100%、150%、200%もしくは300%もしくはそれ以上高い、変異型DNAポリメラーゼと定義される。本発明のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を、対応する非改変型または野生型ポリメラーゼとの比較による相対的活性によって評価してもよい。好ましくは、このような相対的活性の上昇は、本発明のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を対応する非変異型または非改変型の酵素と比較して、1.5、2、5、10、25、50、75、100、150、200または300倍である。または、本発明のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を比活性として直接測定してもよく、その範囲は約0.005、0.01、0.05、0.75、0.1、0.15、0.4、0.5、0.75、0.9、1.0、1.2、1.5、1.75、2.0、3.0、5.0、7.5、10、15、20、30単位/mgタンパク質でよい。3’→5’エキソヌクレアーゼの活性の1単位は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT)によって3’末端を[3H]dTTPで標識したλDNAのHhaI断片を用いる、「BRL 1989年版カタログおよび参考文献の手引き(BRL 1989 Catalogue & Reference Guide)」の5ページに記載されたアッセイで、10ナノモルの基質末端が37℃、60分間で溶解する活性の量と定義される。タンパク質はブラッドフォード(Bradford)、Anal. Biochem. 72:248(1976)の方法によって測定する。比較の手段として、天然の野生型T5−DNAポリメラーゼ(DNAP)またはpTTQ19−T5−2によってコードされるT5−DNAPの比活性は約10単位/mgタンパク質であるが、一方、pTTQ19−T5−2(Exo−)(米国特許第5,270,179号)によってコードされるDNAポリメラーゼの比活性は約0.0001単位/mgタンパク質であり、すなわち非改変型酵素の0.001%、105分の1に低下する。
【0047】
5’→3’エキソヌクレアーゼ活性
「5’→3’エキソヌクレアーゼ活性」も当技術分野で周知の酵素活性である。この活性は、大腸菌(E.coli)PollIおよびPolIIIなどのDNAポリメラーゼでしばしばみられる。
【0048】
「5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下したDNAポリメラーゼ」は、(1)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が対応する変異していない野生型酵素の約10%もしくはそれ未満、または好ましくは約1%もしくはそれ未満である変異型DNAポリメラーゼ、または(2)5’→3’エキソヌクレアーゼ比活性が約1単位/mgタンパク質未満、または好ましくは約0.1単位/mgタンパク質もしくはそれ未満であるDNAポリメラーゼ、のいずれかと定義される。
【0049】
3’→5’および5’→3’エキソヌクレアーゼ活性はいずれも、配列決定用ゲル上で観察することができる。活性の高い5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、伸長するプライマーの5’末端からヌクレオチドを除去することにより、配列決定用ゲル中に非特異的な梯子状パターン(ladder)を生じさせると考えられる。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、配列決定用ゲル中の放射標識プライマーの分解を追跡することによって測定可能である。このため、例えば野生型ポリメラーゼと変異型ポリメラーゼを比較することにより、これらの相対的な量をルーチンの実験の範囲内で決定することができる。
【0050】
忠実度
忠実度とは、テンプレートに対して相補的な核酸分子(例えば、RNAまたはDNA)を合成する際の、重合の正確性、またはポリメラーゼが正しい基質(例えば、ヌクレオチド)を不正確な基質と識別する能力のことを指す。ポリメラーゼの忠実度が高いほど、ポリメラーゼが核酸合成時に伸長する鎖中にヌクレオチドの誤取り込みを行うことが少なくなる;すなわち、忠実度の増加または向上は、誤り率の低い(誤取り込み率の低い)正確なポリメラーゼにつながる。
【0051】
忠実度が増加した/向上した/高いDNAポリメラーゼは、任意の長さの任意の核酸分子の合成時に誤取り込みされるヌクレオチドの数が、約2〜約10,000分の1、約2〜約5,000分の1または約2〜約2000分の1(好ましくは約5分の1未満、より好ましくは約10分の1未満、さらにより好ましくは約50分の1未満、さらに好ましくは約100分の1未満、さらにより好ましくは約500分の1未満、最も好ましくは約1000分の1未満)に減少したヌクレオチドと定義される。例えば、変異型ポリメラーゼが1000塩基の合成時に1つのヌクレオチドを誤取り込みし、これに対して、非変異型ポリメラーゼが10ヌクレオチドを誤取り込みする場合が考えられる。このような変異型ポリメラーゼは忠実度が10倍に増大したと言える。
【0052】
誤取り込みが減少したDNAポリメラーゼは、本明細書において、対応する変異していない非改変型または野生型酵素と比べて、誤取り込みが約50%もしくはそれ未満、または好ましくは約25%もしくはそれ未満、より好ましくは約10%もしくはそれ未満、最も好ましくは約1%もしくはそれ未満である、変異型または改変型のDNAポリメラーゼと定義される。忠実度の低いDNAポリメラーゼも、不正確なヌクレオチド取り込みを伴うDNA合成を開始しうる(Perrion & Loeb、1989、J. Biol. Chem. 264:2898〜2905)。
【0053】
ポリメラーゼの忠実度または誤取り込み率は、配列決定または当技術分野で知られた他の方法によって評価可能である(EckertおよびKunkel、Nucl. Acids Res. 3739〜3744(1990))。1つの例では、非変異型および変異型ポリメラーゼによって合成されたDNA分子の配列を、予想される(既知の)配列を比較することができる。これにより、誤り(誤取り込み)の数を各酵素に関して決定し、比較することができる。もう1つの例では、非変異型および変異型ポリメラーゼを用いて、既知の配列を有するDNA分子の配列を決定する。配列決定の誤り(誤取り込み)の数を比較することにより、酵素の忠実度または誤取り込み率を決定可能である。忠実度または誤取り込み率を決定する他の手段も当業者は認識していると考えられる。
【0054】
1.ポリメラーゼの由来
ポリメラーゼ活性を有する種々のポリペプチドが、本発明によれば有用である。これらのポリペプチドに含まれるものには、核酸ポリメラーゼ(DNAポリメラーゼを含む)などがある。このようなポリメラーゼには、テルムス・テルモフィラス(Thermus thermophilus)(Tth)DNAポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(Taq)DNAポリメラーゼ、テルモトーガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)(Tne)DNAポリメラーゼ、テルモトーガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Tma)DNAポリメラーゼ、テルモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)(TliまたはVENT(商標))DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオース(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNAポリメラーゼ、DEEP VENT(商標)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・ウージ(Pyrococcus woosii)(Pwo)DNAポリメラーゼ、バチルス・ステロテルモフィラス(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNAポリメラーゼ、バチルス・カルドフィラス(Bacillus caldophilus)(Bca)DNAポリメラーゼ、スルホロバス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)DNAポリメラーゼ、テルモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)(Tac)DNAポリメラーゼ、テルムス・フラバス(Thermus flavus)(Tfl/Tub)DNAポリメラーゼ、テルムス・ルベル(Thermus ruber)(Tru)DNAポリメラーゼ、テルムス・ブロキアヌス(Thermus brockianus)(DYNAZYME(商標))DNAポリメラーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNAポリメラーゼ、マイコバクテリウムDNAポリメラーゼ(Mtb、Mlep)、ならびにそれらの変異体、および変種、および誘導体が非制限的に含まれる。
【0055】
本発明に従って用いられるポリメラーゼは、典型的には5’から3’の向きに、核酸テンプレートから核酸分子を合成することができる任意の酵素でありうる。本発明に用いる核酸ポリメラーゼは中温性でも好熱性でもよく、好熱性であることが好ましい。好ましい中温性DNAポリメラーゼには、T7 DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、クレノー断片DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIIIなどが含まれる。本発明の方法に用いうる好ましい耐熱性DNAポリメラーゼには、Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、シュトッフェル断片、VENT(商標)およびDEEPVENT(商標)DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種、および誘導体が含まれる(米国特許第5,436,149号;米国特許第4,889,818号;米国特許第4,965,188号;米国特許第5,079,352号;米国特許第5,614,365号;米国特許第5,374,553号;米国特許第5,270,179号;米国特許第5,047,342号;米国特許第5,512,462号;国際公開公報第92/06188号;国際公開公報第92/06200号;国際公開公報第96/10640号;Barnes, W.M.、Gene 112:29〜35(1992);Lawyer, F.C.ら、PCR Meth. Appl. 2:275〜287(1993);Flaman, J.−Mら、Nucl. Acids Res. 22(15):3259〜3260(1994))。長い核酸分子(例えば、約35Kb長よりも長い核酸分子)の増幅のためには、少なくとも2つのDNAポリメラーゼ(一方は3’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、もう一方は3’エキソヌクレアーゼ活性を有する)が一般に用いられる。米国特許第5,436,149号;米国特許第5,512,462号;ファーン(Farnes, W.M.)、Gene 112:29〜35(1992);および2000年12月21日に提出された、同時係属中の米国特許出願第09/741,664号を参照されたい(これらの開示内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。3’エキソヌクレアーゼを実質的に欠くDNAポリメラーゼの例には、Taq、Tne(exo−)、Tma(exo−)、Pfu(exo−)、Pwo(exo−)およびTth DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種、および誘導体が非制限的に含まれる。
【0056】
核酸ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを、本方法では、溶液中にて約0.1〜200単位/ml、約0.1〜50単位/ml、約0.1〜40単位/ml、約0.1〜3.6単位/ml、約0.1〜34単位/ml、約0.1〜32単位/ml、約0.1〜30単位/ml、または約0.1〜20単位/mlの最終濃度で用いることが好ましく、最も好ましくは約20単位/mlの濃度で用いる。当然ながら、本発明における使用に適した核酸ポリメラーゼの他の適した濃度は、当業者には明らかであると考えられる。
【0057】
本発明の1つの好ましい面においては、変異型または改変型ポリメラーゼを組換え法によって作製する。クローニングされたさまざまなポリメラーゼ遺伝子が入手可能である、または標準的な組換え法を用いて入手することができる。
【0058】
本発明に従って改変されるDNAポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングのためには、ポリメラーゼ遺伝子を含む単離されたDNAを用いて、ベクター中に組換えDNAライブラリーを構築する。当技術分野で周知の任意のベクターを、関心対象のDNAポリメラーゼのクローニングに用いることができる。しかし、用いるベクターは、組換えDNAライブラリーによる形質転換を行う予定の宿主と適合性がある必要がある。
【0059】
プラスミドライブラリーの構築用の原核生物ベクターには、大腸菌(E.coli)における複製が可能なプラスミド、例えばpBR322、ColE1、pSC101、pUCベクターなどが含まれる(pUC18、pUC19など:「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(1982);およびサムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、A Laboratory Manual)」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York(1989))。桿菌プラスミドにはpC194、pC221、pC217などが含まれる。この種のプラスミドは、グリチャン(Glyczan, T)、「桿菌の分子生物学(The Molecular Biology Bacilli)」、Academic Press、York(1982)、307〜329に開示されている。適したストレプトミセス属プラスミドには、pIJ101(Kendallら、J. Bacteriol 169:4177〜4183(1987))が含まれる。シュードモナス属プラスミドに関しては、ジョン(John)ら(Rad. Insec. Dis. 8:693〜704(1986))およびイガキ(Igaki)(Jpn. J. Bacteriol. 33:729〜742(1978))に総説がある。pCP13(DarzinsおよびChakrabarbary、J. Bacteriol. 159:9〜18、1984)などの宿主範囲の広いプラスミドまたはコスミドを、本発明のために用いることもできる。本発明の遺伝子のクローニングのために好ましいベクターは原核生物ベクターである。好ましくは、本発明の遺伝子のクローニングには、pCP13およびpUCベクターを用いることが好ましい。
【0060】
関心対象のポリメラーゼ遺伝子のクローニングの目的に好ましい宿主は原核生物宿主である。最も好ましい原核生物宿主は大腸菌(E.coli)である。しかし、本発明の望ましいポリメラーゼ遺伝子を、エシェリキア属(Escherichia)、バシラス属(Bacillus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)およびプロテウス属(Proteus)を非制限的に含む、他の原核生物宿主にクローニングしてもよい。特に関心が持たれる細菌宿主には、インビトロジェン社(Invitrogen Corporation)のライフテクノロジー部門(Life Technologies Division)(Rockville、MD)から入手可能な大腸菌(E.coli)DH10Bが含まれる。
【0061】
関心対象のポリメラーゼのクローニングおよび発現を目的とする真核生物宿主には、酵母、真菌および哺乳動物細胞が含まれる。このような真核細胞における望ましいポリメラーゼの発現には、真核生物プロモーターを含む真核生物調節領域を用いることが必要な場合がある。真核細胞におけるポリメラーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、周知の真核生物ベクター系を用いる周知の技法によって行える。
【0062】
DNAライブラリーが特定のベクター中に構築されたところで、周知の技法により、適切な宿主への形質転換導入を行う。形質転換されたコロニーをペトリ皿1枚当たり約200〜300コロニーの密度で播く。耐熱性ポリメラーゼの選択の場合には、続いて、形質転換がなされた大腸菌(E.coli)コロニーをニトロセルロース膜に移すことにより、コロニーを熱安定性のあるDNAポリメラーゼの発現に関してスクリーニングする。移した細胞をニトロセルロース上で増殖させた後(約12時間)に、細胞を標準的な方法によって溶解し、続いて内因性大腸菌(E.coli)酵素を失活させるために膜を95℃で5分間処理する。用いる宿主およびクローニングするポリメラーゼの温度安定性によっては、宿主ポリメラーゼを失活させるために他の温度を用いてもよい。続いて、当技術分野で周知の技法を用いるポリメラーゼ活性の存在に関するアッセイにより、安定なポリメラーゼ活性を検出する。サグナー(Sagner)ら、Gene 97:119〜123(1991)(これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子は、サグナー(Sagner)ら、前記によって記載された手順を用いてクローニング可能である。
【0063】
2.ポリメラーゼの改変または変異
本発明によれば、忠実度が増加または向上した(誤取り込み率が低下した)変異型または改変型のポリメラーゼが生じるような様式で、関心対象のポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを改変または変異させる。3’−5’エキソヌクレアーゼドメインは、exoI、exoIIおよびexoIIIという3つのサブドメインから構成され(Blancoら、Gene 112:139〜144(1992))、それらの中にエキソヌクレアーゼ活性にとって重要な触媒性アミノ酸が見いだされている。これらの触媒性アミノ酸は金属イオンと相互作用する。エキソヌクレアーゼドメインに変異を導入する際には、触媒性アミノ酸が金属イオンとの相互作用を維持することが好ましい。本発明による酵素の忠実度を高めるために、任意のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメインに1つまたは複数の変異を加えることができる。このような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が含まれる。本発明による、忠実度が向上もしくは増大した、または3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇もしくは向上したポリメラーゼを作製するためには、1つまたは複数のアミノ酸置換が生じる1つまたは複数の点変異を用いることが好ましい。本発明の1つの好ましい面においては、望ましい結果を得るために1つまたは複数の変異を加える。
【0064】
3.3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの置換
新たな特性を1つの酵素から関連性のある別の酵素に新たに加えることは、タンパク質工学の興味深い可能性の一つである。新たな特性を得るために用いられてきた従来のある種のアプローチは、無作為変異誘発、および関心対象のわずかな変異体を分離するための多数の変異体のスクリーニングを必要とした。もう1つのアプローチは、構造情報に基づいて、新しくはあるが関連性はあるタンパク質または酵素に特定のドメインを組み込むことである(Pierre Beguinによる総説、Curr. Opin. Biotech. 10:336〜340(1999))。
【0065】
当技術分野で周知の技法を用いて(Sambrookら(1989)、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning、Laboratory Manual)」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY)、DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼドメインを、望ましい3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する、別のポリメラーゼに由来する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインと置換することができる。種々のポリメラーゼのドメインを表1に示す。
【0066】
【表1】種々のポリメラーゼの近似したドメイン
【0067】
本発明は、1つのドメインの全体または一部と、異なるドメインとのドメイン置換を考えている。ある種のポリメラーゼの任意のドメイン(またはその部分)を、第2のポリメラーゼのドメイン(またはその部分)と置換することができる。このような置換は、望ましい3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が生じるタンパク質の正しいフォールディングが置換によってもたらされるように行うことが好ましい。
【0068】
4.ポリメラーゼのそのほかの改変または変異
本発明によれば、誤取り込みが少ない、または忠実度が向上したポリメラーゼを作製するための上記の変異に加えて、1つまたは複数のそのほかの変異または改変(またはそれらの組み合わせ)を関心対象のポリメラーゼに加えてもよい。特に関心が持たれる変異または改変には、(1)5’→3’エキソヌクレアーゼ活性が消失または低下する;および(2)ジデオキシヌクレオチドの識別性が低下する(すなわち、ジデオキシヌクレオチドの取り込みが増える)、改変または変異が含まれる。
【0069】
ポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼ遺伝子を変異させることにより、または5’→3’エキソヌクレアーゼドメインを除去することにより、低下または消失させることができる。このような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が含まれる。5’−3’エキソヌクレアーゼ活性をコードする領域を、当技術分野で周知の技法を用いて除去することが好ましい。本発明の態様では、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性にかかわる6つの保存的なアミノ酸の任意の1つを変異させることができる。Tne DNAポリメラーゼに関するこれらの保存的なアミノ酸の例には、Asp8、Glu112、Asp114、Asp115、Asp137およびAsp139が含まれる。変異が考えられる他の部位にはGly102、Gly187およびGly195がある。
【0070】
他のポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を低下または消失させるための標的となる、対応するアミノ酸は以下の通りである:
【0071】
Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国特許第5,079,352号に列挙された通りである。テルモトーガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Tma)DNAポリメラーゼのアミノ酸残基は米国特許第5,374,553号に列挙された通りである。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる標的になりうる、他のアミノ酸の例
【0072】
肺炎球菌、T.フラバス(T. flavus)、D.ラジオデュランス(D. radiodurans)、B.カルドテナクス(B. caldotenax)と同等のもの(coordinates)は、ガットマン(Gutman)およびミントン(Minton)(Nucleic Acids Res. 21:4406〜4407(1993))から入手した。T.テルモフィラス(T. thermophilus)の座標は国際公開公報第92/06200号から入手した。
【0073】
ジデオキシヌクレオチドなどの非天然型ヌクレオチドに対する識別性を持たないような、ポリメラーゼ変異体を作製することもできる(米国特許第5,614,365号)。ポリメラーゼを非識別性とするために、O−ヘリックスの内部に他の点変異、欠失および挿入などの変化を加えることができる。例えば、この特性を有するTne DNAポリメラーゼの一種では、O−ヘリックス内のPhe730がTyrなどの天然でないアミノ酸によって置換されている。
【0074】
一般に、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性、識別活性および忠実度は、異なる特性を一般に有するアミノ酸の置換によって影響を受ける。例えば、Aspなどの酸性アミノ酸を塩基性、中性または極性非荷電アミノ酸残基、例えばLys、Arg、His(塩基性);Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp(中性);またはGly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnもしくはGln(極性非荷電)に変化させてもよい。GluをAsp、Ala、Val 、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnまたはGlnに変化させてもよい。
【0075】
コード性DNA分子に沿った任意の規定された部位に、すべての可能な種類の塩基対変化を生じさせることが可能な変異型ポリメラーゼを作製するためには、オリゴヌクレオチド指定変異誘発法を用いることが好ましい。一般に、この技法は、関心対象のDNAポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に対して相補的な(1つまたは複数のミスマッチを除く)オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることを含む。続いて、このミスマッチのあるオリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼによって伸長させ、一方の鎖の配列に望ましい変化を含む二本鎖DNA分子を生成させる。この配列の変化は、当然ながら、アミノ酸の欠失、置換または挿入を引き起こす。続いて、この二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクター中に挿入し、変異型ポリペプチドを産生させることができる。上記のオリゴヌクレオチド指定変異誘発法は、当然ながら、PCRによって行うことができる。【0076】
5.ポリメラーゼの発現の増強
本発明のポリメラーゼの発現を最適化するためには、誘導性または構成性のプロモーターが周知であり、組換え宿主においてポリメラーゼ構造遺伝子を高レベルに発現させるために用いることができる。同様に、高い発現レベルを実現するために、当技術分野で周知の高コピー数ベクターを用いてもよい。誘導性の高コピー数を有するベクターは、組換え宿主における本発明のポリメラーゼの発現を増強するためにも有用と思われる。
【0077】
原核細胞(大腸菌、枯草菌、シュードモナス菌など)内で望ましい構造遺伝子を発現させるためには、望ましい構造遺伝子を機能的な原核生物プロモーターと機能的に結合させることが必要である。しかし、ポリメラーゼ遺伝子の天然のプロモーターは、原核生物宿主内で作用してポリメラーゼ遺伝子を発現させる可能性がある。このため、ポリメラーゼ遺伝子を発現させるために天然プロモーターまたは他のプロモーターを用いてもよい。このような他のプロモーターは発現を増強させるために用いてもよく、構成性または調節性(すなわち、誘導性または抑制性)プロモーターのいずれでもよい。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのintプロモーター、およびpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーターが含まれる。誘導性原核生物プロモーターの例には、バクテリオファージλの主要な右側および左側プロモーター(PRおよびPL)、ならびに大腸菌(E.coli)のtrp、recA、lacZ、lad、tet、gal、trcおよびtacプロモーターが含まれる。枯草菌プロモーターには、α−アミラーゼ(Ulmanenら、J. Bacteriol 162:176〜182(1985))および桿菌バクテリオファージプロモーター(Gryczan, T.、「桿菌の分子生物学(Molecular Biology Of Bacilli)」、Academic Press、New York(1982))が含まれる。ストレプトミセス属プロモーターは、ワード(Ward)ら、Mol. Gen. Genet. 203:468478(1986)に記載されている。原核生物プロモーターに関しては、グリック(Glick)、J. Ind. Microbiol. 1:277〜282(1987);セナティエンプト(Cenatiempto, Y.)、Biochimie 68:505〜516(1986);およびゴッテスマン(Gottesman)、Ann. Rev. Genet. 18:415〜442(1984)にも総説がある。原核細胞における発現のためには、遺伝子コード配列の上流にリボソーム結合部位の存在も必要である。このようなリボソーム結合 部位は、例えば、ゴールド(Gold)ら、Ann. Rev. Microbiol. 35:365404(1981)に開示されている。
【0078】
真核細胞における本発明のポリメラーゼの発現を増強させるために、周知の真核生物プロモーターおよび宿主を用いてもよい。しかし、ポリメラーゼの増強発現は原核生物宿主において行うことが好ましい。本酵素を過剰発現させるのに好ましい原核生物宿主は大腸菌(E.coli)である。
【0079】
6.ポリメラーゼの単離および精製
本発明の酵素は、望ましいDNAポリメラーゼ遺伝子を含有および発現している、組換え宿主の発酵によって生産することが好ましい。しかし、本発明のDNAポリメラーゼを、本発明のポリメラーゼを産生する任意の菌株から単離することもできる。ポリメラーゼの断片も本発明に含まれる。このような断片には、タンパク質分解による断片およびポリメラーゼ活性を有する断片が含まれる。
【0080】
クローニングされたポリメラーゼ遺伝子を含む宿主によって同化されうる任意の栄養分を培地に添加してよい。最適な培養条件は、用いる菌株および培地の組成に応じて個別的に選択する必要がある。発現させようとする望ましい遺伝子を含むベクターDNAが確実に維持されるように、増殖培地に抗生物質を加えてもよい。培地の配合は、DSMまたはATCCのカタログおよびサムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、Laboratory Manual)」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)に記載されている。
【0081】
本発明のポリメラーゼを産生する組換え宿主細胞は、例えば遠心分離により、液体培養物から分離することができる。一般には、収集した微生物細胞を適した緩衝液中に分散させた後に、緩衝液による酵素の抽出が可能となるように、超音波処理または他の周知の手順によって破壊する。超遠心または遠心分離によって細胞片を除去した後に、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの標準的なタンパク質精製法により、ポリメラーゼを精製することができる。精製中にポリメラーゼの存在を検出するためのアッセイは当技術分野で周知であり、これらの酵素の存在を判定するために従来の生化学的な精製法の際に用いることができる。
【0082】
7.ポリメラーゼの用途
本発明のポリメラーゼは、周知の核酸の合成、配列決定、標識、増幅およびcDNA合成反応に用いうる。3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性が上昇している、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性がない、もしくは実質的に低下しており、または酵素のdNTPおよびddNTPに対する識別性をなくす、1つもしくは複数の変異をO−ヘリックス内に含むか、または誤取り込みが減少したもしくは忠実度が高くなった酵素を生じる、3’−5’エキソヌクレアーゼドメインの変異を含む、ポリメラーゼ変異体は、合成、配列決定、標識、増幅およびcDNA合成のために特に有用である。さらに、これらの特性の2つまたはそれ以上を含む本発明のポリメラーゼも、合成、配列決定、標識、増幅またはcDNA合成反応に特に有用である。よく知られているように、配列決定反応(等温DNA配列決定およびDNAのサイクル配列決定)には、ポリメラーゼを用いる必要がある。ジデオキシ法による配列決定は、DNAポリメラーゼによる伸長のための特異的プライマー、塩基特異的連鎖ターミネーターを用いる連鎖停止法の使用、および、元のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、新たに合成された連鎖停止後のDNA分子をサイズ別に分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用を伴う。特に、DNA分子の配列決定は、異なる塩基特異的ターミネーターをそれぞれが含む、4種の別々のDNA配列反応(または、蛍光ターミネーターを用いる場合には1つの反応)を用いることによって行われる。例えば、第1の反応物がG特異的ターミネーターを含み、第2の反応物がT特異的ターミネーターを含み、第3の反応物がA特異的ターミネーターを含み、第4の反応物がC特異的ターミネーターを含むことが考えられる。好ましいターミネーターヌクレオチドには、ddATP、ddTTP、ddGTP、ddITPおよびddCTPなどのジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)が含まれる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の類似体を用いてもよく、これらは当技術分野で周知である。
【0083】
DNA分子の配列決定を行う場合、ddNTPにはデオキシリボース塩基の3’位にヒドロキシル残基がなく、このため、それらは伸長するDNA鎖にDNAポリメラーゼによって組み込まれても、3’ヒドロキシル残基がないために次のホスホジエステル結合の形成が妨げられ、その結果、DNA分子の伸長が停止する。したがって、配列決定用の反応混合物中に少量の1種類のddNTPを含めると、連鎖の伸長と塩基特異的停止との競合が起こり、配列決定を行おうとするDNAテンプレートよりも長さが短い合成DNA分子の集団が生じる。4種の異なるddNTPを4つの別々の酵素反応に用いることにより、元のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように合成DNA分子の集団をサイズ別に分離することができる。ジデオキシ−ヌクレオチドによるDNA配列決定は周知であり、サムブルック(Sambrook)ら、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning、Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)に記載されている。容易に認識されるであろうが、本発明のポリメラーゼを、このような配列決定反応に用いてもよい。
【0084】
よく知られているように、配列決定反応には一般に、検出可能な標識がなされたヌクレオチドが含まれる。放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識を非制限的に含むさまざまな標識ヌクレオチドを、配列決定(または標識)反応に用いることができる。例えば、本発明のポリメラーゼは、配列決定(または標識)反応時にαSヌクレオチド([αS]dATP、[αS]dTTP、[αS]dCTPおよび[αS]dGTP)を取り込ませるために有用と思われる。
【0085】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は周知のDNA増幅法であり、DNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて標的DNAテンプレートを増幅する工程である。この種のPCR反応では、増幅しようとするDNA分子の第1鎖の3’末端(または3’末端の近傍)に対して相補的な1つのプライマー、および増幅しようとするDNA分子の第2鎖の3’末端(または3’末端の近傍)に対して相補的な第2のプライマーという2つのプライマーを、それぞれのDNA鎖とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼにより、増幅しようとするDNA分子の第1鎖の全体または一部に対して相補的な第3のDNA分子、および第2鎖の全体または一部に対して相補的な第4のDNA分子を合成させる。この合成により、2つの二本鎖DNA分子が生じる。続いて、このような二本鎖DNA分子は、DNAポリメラーゼ、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供することにより、別のDNA分子の合成のためのDNAテンプレートとして役立つ。よく知られているように、追加的な合成は最初の反応の「サイクリング」によって(過剰なプライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いる)、変性および合成の段階を多数行うことによって行われる。一般に、一本鎖DNAテンプレートを形成させるための二本鎖DNA分子の変性は高温で行われる。本発明のDNAポリメラーゼは熱安定性のあるDNAポリメラーゼであることが好ましく、このため、DNA増幅反応時のこのような熱サイクリングにも耐えると考えられる。このように、本発明のDNAポリメラーゼは、PCR反応のために、特に増幅時にDNA分子を変性させるために高温を用いる場合に、理想的に適している。
【0086】
8.キット
DNAの配列決定用のキットは、さまざまな容器手段を含みうる。第1の容器手段は、例えば、本発明のポリメラーゼの実質的に精製された試料を含む。第2の容器手段は、DNAテンプレートに対して相補的なDNA分子を合成するために必要な1つまたは複数の種類のヌクレオチドを含みうる。第3の容器手段は、1つまたは複数の異なる種類のターミネーター(ジデオキシヌクレオシド三リン酸など)を含みうる。第4の容器手段は、ピロフォスターゼを含みうる。以上の容器手段に加えて、1つまたは複数のプライマーおよび/または適した配列決定緩衝液を含む別の容器手段をキットに含めてもよい。
【0087】
核酸の増幅または合成のために用いられるキットは、例えば、実質的に純粋な本発明のポリメラーゼを含む第1の容器手段、および一種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物を含む1つまたは複数の追加的な容器手段を含むと考えられる。キットには、適した増幅用または合成用の緩衝液に加えて、種々のプライマーを含めてもよい。
【0088】
必要に応じて、本発明のキットに、核酸分子の合成または配列決定の際に用いうる検出可能な標識がなされたヌクレオチドを含む容器手段を含めてもよい。複数の標識のうち1つはこのようなヌクレオチドを検出するために用いてよい。標識の例には、放射性同位体、蛍光性標識、化学発光性標識、生物発光性標識および酵素標識が非制限的に含まれる。
【0089】
本発明の一般的な説明を行ってきたが、これは以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されると考えられる。これらは例示のために提供するものであり、別に特記する場合を除き、本発明を制限することを意図したものではない。
【0090】
実施例 1
ハイブリッド型Taq DNAポリメラーゼの構築
Taqポリメラーゼの3つのドメインはすべて、キム(Kim)らにより、結晶構造を元に記載されている(Nature 376:612〜616(1995))。活性のある5’−3’エキソヌクレアーゼドメインは1〜289アミノ酸に位置し、活性のない3’−5’エキソヌクレアーゼドメインは294〜422アミノ酸に、活性のあるポリメラーゼドメインは424〜831アミノ酸に位置する。TaqおよびTne DNAポリメラーゼの間のアミノ酸アライメントにより、本発明者らは、Tneポリメラーゼに関する対応領域は以下の通りであると推定した:1〜291アミノ酸(5’−3’−エキソヌクレアーゼ)、292〜485アミノ酸(3’−5’−エキソヌクレアーゼ)および486〜893アミノ酸(ポリメラーゼ)。第1に、本発明者らは、Tne DNAポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインをTaqポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインによって置換しようと考えた。Tneポリメラーゼの5’−3−エキソヌクレアーゼドメイン内には好都合なBsrGIがあったため (アミノ酸204〜206)、本発明者らはこの部位をドメイン交換のために利用した。Taqポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインは以下のオリゴを用いて増幅した:
【0091】
オリゴ#1はSstI(太い下線を付した)およびNdeI(太字のイタリック体)という2つの制限部位を含み、オリゴ#2はPCR断片のクローニングが容易になるBsrGI部位を含む。増幅にはPCR Supermix(Invitrogen Corporation、Life Technologies Division)を用い、各プライマーの濃度は1μMとした。94℃ 2分間(1サイクル)、94℃ 15秒間、55℃ 15秒間、72℃ 45秒間(15サイクル);72℃ 2分間(1サイクル)というPCRプログラムを、パーキンエルマー(Perkin Elmer)社のサーマルサイクラーにて用いた。PCR産物をSstIおよびBsrGIで消化し、pTTQTne(PTTQ、Pharmacia、California)中にクローニングした。このプラスミドをpTne79と命名した。このプラスミドは3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性を失活させる変異を含む。3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性を回復させるために、pTne79のBsrGI−HindIII断片を、野生型Tneポリメラーゼ遺伝子由来の同一の断片によって置換した。このプラスミドをpTne80と呼んだ。このクローンは、Taqポリメラーゼの5’−3’−エキソヌクレアーゼドメイン、ならびにTneポリメラーゼ由来の活性のある3’−5’エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインを含む。pTne80由来のポリメラーゼドメインを置換するために、本発明者らはTneポリメラーゼのアミノ酸515〜893をTaqポリメラーゼアミノ酸454〜831によって置換した。Taqポリメラーゼドメインは以下のオリゴを用いて増幅した:
【0092】
PCR産物のクローニングによってpTne80のEcoRI−HinDIII断片を置換しうるように、オリゴ#3にEcoRI部位を作製し、オリゴ#4にはHindIII部位を作製した。Tneポリメラーゼドメインには2つのEcoRI部位がある(それぞれアミノ酸516〜517および621〜622内)。HindIII部位はポリメラーゼ遺伝子の外側にあり、ベクター中に存在する。PCRは上記の通りに行った。PCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、EcoRI+HindIIIで消化したpTne 80中にクローニングした。このプラスミドをpTne86と呼んだ。これはTaqポリメラーゼ由来の5’−3’−エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメイン、ならびにTneポリメラーゼ由来の3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインを含む。オリゴ#3には、TaqポリメラーゼにおけるAGG(アミノ酸457)の代わりにアルギニンとなるCGGを用いた。本構築物において、ポリメラーゼドメインの接合部はβ−シート6とヘリックスHとの間にある。もう1つのハイブリッドも異なる位置に作製した(実施例4参照)。
【0093】
3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインの接合部の配列は以下の通りである:
【0094】
太字イタリック体の配列はTaqポリメラーゼに由来し、他のものはTneポリメラーゼに由来する。数字はそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸番号に対応する。
【0095】
実施例 2
ハイブリッドのポリメラーゼ活性に関する予備的スクリーニング
以下の通りに構築物を耐熱性ポリメラーゼ活性に関してアッセイした:アンピシリン(100μg/ml)を含むサークルグロー(CG)培地中にて培養物を30℃で一晩培養した(2ml)。40mlのCG+Amp100に対して、一晩培養したもの1mlを添加し、O.Dが約1.0(A590)に到達するまで培養物を37℃で増殖させた。この培養物を20mlずつの2つのアリコートに分け、第1のアリコート(非誘導)は37℃に保った。もう一方のアリコートには、IPTGを最終濃度が2mMになるように添加し、培養物を37℃でインキュベートした。3時間後に培養物を卓上遠心機により4℃、3500rpmで20分間遠心した。上清を廃棄し、細胞ペレットを−70℃で保存した。細胞ペレットを、10mM Tris pH 8.0、1mM Na2EDTA、10mMβ−メルカプトエタノール(β−ME)を含む緩衝液中に懸濁した。細胞懸濁液(500μl)を水浴中で74℃に20分間加熱した。チューブを氷上に10分間置いた後、4℃、13000rpmで10分間遠心した。この清澄な上清を72℃でのポリメラーゼ活性のアッセイのために採取した。ポリメラーゼ活性アッセイ用の反応混合物は、25mM TAPS緩衝液(pH 9.3)、2mM MgCl2、15mM KCl、1mM EDTA、0.2mM dNTPs、500μg/ml DNアーゼI処理サケ精子DNA、21mCi/ml α32PdCTP、および各実施例に明記した種々の量の酵素を最終容積25μl中に含む。72℃で10分間インキュベートした後、5μlの0.5M EDTAをチューブに添加した。25μlの反応混合物を用いてGF/CフィルターにおけるTCA沈殿カウント(TCA precipitable count)を測定した。
【0096】
実施例 3
pTne86からのハイブリッド型ポリメラーゼの精製
細胞をサークルグロー(Circle Grow)培地(Bio 101、California)中にて30℃で増殖させ、1mM IPTGで誘導を加えた。クローニングした変異型Tne DNAポリメラーゼを発現する細胞2〜3グラムを15〜20mlの超音波処理用緩衝液(50mM Tris−HCl、pH 8.0、10%グリセロール、5mM β−Me、50MM NaCl、1mM EDTAおよび0.5mM PMSF)中に再懸濁し、550型ソニックディスメンブレーター (550 Sonic Dismembrator)により超音波処理を行った。超音波処理を行った試料を75℃に30分間加熱した。塩化ナトリウム溶液を試料に添加して濃度を200mMに増大させ、5%PEI(ポリエチルイミン)溶液を最終濃度0.2%となるように滴下した。この試料を13,000rpmで10分間遠心した。硫酸アンモニウム(305mg/ml)を上清に添加した。ペレットを遠心処理によって採取し、5mlのMonoQカラム用緩衝液(50mM Tris−HCl pH8.0、10%グリセロール、5mM β−ME、50mM NaClおよび1mM EDTA)中に再懸濁した。試料を250mlのMonoQ緩衝液に対して一晩透析した。不溶性物質を除去するために試料を13,000rpmで遠心した後に、MonoQカラム(HR5/5、Pharmacia)に載せた。A280がベースラインになるまでカラムをMonoQカラム用緩衝液で洗浄し、続いてカラム20倍量の50〜300mM NaCl(MonoQカラム用緩衝液中)の直線勾配により、溶出させた。画分をSDS−PAGEによって分析し、上記の通りに耐熱性ポリメラーゼ活性に関してアッセイした。
【0097】
実施例 4
ポリメラーゼドメインの新たな接合部からのハイブリッド型Taqポリメラーゼ
この場合には、接合部をヘリックスFとヘリックスGとの間に作製する。2つのドメインを連結するためにClaI部位を作製する。PCR用のオリゴは以下の通りとした:
【0098】
このオリゴはTne 3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインのアミノ末端とアニーリングする。
【0099】
このオリゴはTne 3’エキソドメインのカルボキシル末端とアニーリングする。
【0100】
このオリゴはTaqポリメラーゼドメインのアミノ末端とアニーリングする。
【0101】
オリゴの中の制限酵素部位は太字イタリック体としている。オリゴ#5はBsrGI部位を含み、オリゴ#6および#7はClaI部位を含む。PCRスーパーミックス(PCR Supermix)(Invitrogen Corporation、Life Technologies Division、Rockville、Maryland)を増幅に用い、各プライマーの濃度は1μMとした。94℃ 2分間;94℃ 15秒間、55℃ 15秒間、72℃ 45秒間(15回);72℃ 2分間というPCRプログラムを、パーキンエルマー(Perkin Elmer)社(California)のサーマルサイクラーにて用いた。Tne DNAポリメラーゼ遺伝子をテンプレートとして用いるオリゴ#5および#6による増幅では850bpの産物が得られ、Taq DNAポリメラーゼ遺伝子をテンプレートとして用いるオリゴ#7および#4による増幅では、1300bpのPCR産物が得られる。これらをそれぞれ、制限酵素BsrGI/ClaIおよびClaI/HindIIIで消化した。ベクターpTne86をBsrGI/HindIIIで消化し、3つの断片をT4DNAリガーゼを用いて連結した。クローンを制限酵素分析によって分析した。このクローンはpTne173と命名され、上記の活性型ポリメラーゼを産生する。
【0102】
3’−5’−エキソヌクレアーゼドメイン接合部の配列はpTne86と類似している。ポリメラーゼ接合部の配列は以下の通りである:
【0103】
本発明者らは、3’−5’−エキソヌクレアーゼ接合部のpTne86との類似性を保ちながらポリメラーゼドメインを異なる接合部をする類似の技法を用いて他のハイブリッドも作製した。いくつかの構築物のポリメラーゼ接合部の配列は以下の通りである:
【0104】
pTne87およびpTne90は上記のアッセイによる活性型ポリメラーゼを産生する。
【0105】
実施例 5
ハイブリッド型Taqポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性アッセイ
pTne86から精製したハイブリッド型ポリメラーゼを触媒活性に関して詳細に検討した。組換えポリメラーゼの編集機能(3’−5’エキソヌクレアーゼ活性)は、プライマーの3’末端に4つのミスマッチ塩基対がある36/60量体プライマー/テンプレートである二本鎖DNAを用いて定量的に測定した。野生型Taqポリメラーゼおよびキメラ酵素の3’−5’エキソヌクレアーゼ活性は60℃でアッセイした。対照として、2つのTneポリメラーゼ変異体の3’−5’エキソヌクレアーゼ活性もアッセイした。第1の変異型誘導体はD137Aの変異のために5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、第2のものはそれぞれD323AおよびD137Aでの二重置換のために、3’−5’および5’−3’エキソヌクレアーゼ活性がいずれもない。
【0106】
4塩基のミスマッチがある以下のDNA基質をアッセイに用いた:
【0107】
MgCl2の存在下でポリメラーゼを添加することにより、プライマー鎖の3’末端の分解を開始させた。反応混合物は約20nMのDNAを20mM Tris−HCl、pH 8.4、1.5mM MgCl2および50mM KCl中に含む。前定常状態条件下でホスホジエステル結合の切断を触媒するように、ポリメラーゼはDNA基質に対して大過剰量とした。ポリメラーゼの添加から20秒後、1分後および2分後に1.5μlの試料を採取し、ホルムアミド、EDTA、SDS、ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールFFを含む停止液3μlと混合することによって反応を停止させた。最後に試料を変性8%ポリアクリルアミドゲルにより分画した。
【0108】
DNA基質の調製
オリゴヌクレオチド(プライマー鎖およびテンプレート鎖)は、インビトロジェン社ライフテクノロジー部門(Invitrogen Corporation、Life Technologies Division)のカスタムプライマー(Custom Primer)を利用して注文した。プライマー鎖はHPLC精製し、テンプレート鎖はPAGEで精製した。T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーを5’標識し、テンプレートとアニーリングさせた。
【0109】
結果
キメラ型ポリメラーゼは、本発明者らの実験条件下で、Tneポリメラーゼと同程度の効率でミスマッチ塩基を分解する(図1)。予想された通り、野生型TaqおよびTne(3’−5’エキソヌクレアーゼを欠く変異型)ポリメラーゼはプライマーの切断を触媒しなかった。この結果はキメラ型ポリメラーゼが酵素活性を持つことを示しており、Taqポリメラーゼがミスマッチを編集しうることを示唆する。
【0110】
実施例 6
3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の定量アッセイ
野生型Taq DNAポリメラーゼ、Tne DNAポリメラーゼ(5’−exo−、3’−5’−exo+)およびTaq/Tneハイブリッド型DNAポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を、3’標識二本鎖DNAを用いて測定した。用いた基質はTaqI制限酵素で消化し、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIの存在下で3HdGTPおよび3HdCTPにより3’末端を標識したλDNA断片とした。20mM Tris−HCl、pH 8.0、50mM KCl、2mM MgCl2、5mMジチオトレイトール(DTT)を、約2.5単位の種々のポリメラーゼとともに含む50μlの反応物に対して、1pmolの基質を用いた。野生型Taq DNAポリメラーゼの場合には、約21単位も含めた。反応物を72℃で1時間インキュベートした。チューブを氷上に置き、10μlの各反応物をPEIプレート上に滴下した。薄層クロマトグラフィーを2N HCl中で行った。末端標識の遊離を液体シンチレーションによって測定した。
【0111】
結果
予想された通り、2.6単位または21単位の酵素を用いた場合、Tneポリメラーゼの3’−5’エキソヌクレアーゼ変異体および野生型Taqポリメラーゼによって遊離した、標識ヌクレオチドの量は、無視しうる程度であった(表2)。しかし、3’−5’−エキソヌクレアーゼ活性の高いTneポリメラーゼおよびTaq/Tneハイブリッド型DNAポリメラーゼ(またはpTne86から産生されるTaqハイブリッド)は、ほぼ等量の標識ヌクレオチドを遊離させた。ハイブリッド型ポリメラーゼではTneポリメラーゼの完全な3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が回復していることが明らかである。ハイブリッド型ポリメラーゼにおける3’−5’エキソヌクレアーゼ活性の上昇は野生型Taqポリメラーゼの40倍と推定された。
【0112】
【表2】3’二本鎖DNA基質に対するエキソヌクレアーゼアッセイ
【0113】
実施例 7
ポリメラーゼ/エキソヌクレアーゼ共役活性の測定
本発明者らは、ハイブリッド型ポリメラーゼがミスマッチプライマー末端を分解すると同時に、相補的テンプレートとアニーリングしたプライマーを伸長させる能力を調べるための実験を設計した。エキソヌクレアーゼにより導かれるプライマーの分解に引き続いて起こる重合反応を、上記とほぼ同じ条件下で上記のDNA基質を用いてアッセイした。異なる点は、プライマーを伸長させるためにこの反応混合物にはdNTPが存在することである。dNTPの最終濃度は250μMとした。
【0114】
結果
キメラ型ポリメラーゼは、本発明者らの実験条件下では、Tneポリメラーゼとほぼ同様の効率でプライマー3’末端のミスマッチ塩基を分解し、それを伸長させる(図2)。予想された通り、野生型Taq(3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く)およびTne(3’−5’エキソヌクレアーゼを欠く変異型)ポリメラーゼはプライマーの3’末端を切断しなかった。この結果もキメラ型ポリメラーゼが酵素活性を持つことを示しており、正しくフォールディングが行われたことを示唆する。
【0115】
実施例 8
定常状態Kcatの測定
キメラ型DNAポリメラーゼの定常状態Kcatを、ポレスキー(Polesky)ら、1990年の記載の通りに60℃で測定した。(dG)35が約1に対してテンプレートG残基が100のモル比で(dG)35をポリ(dC)とアニーリングさせることによってDNA基質を調製した。速度を測定したDNAおよびdNTPの濃度は、それぞれ2.5μMおよび250μM dNTPであった。
【0116】
結果
キメラ型DNAポリメラーゼのdGTP取り込みに関する定常状態k(cat)は約25/秒である。この結果はTneおよびTaq DNAポリメラーゼから得られる値と同じであり、キメラDNAポリメラーゼが親タンパク質の本来の構造と同様にフォールディングしたことを示唆する。
【0117】
理解を容易にする目的で、本発明を例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、本発明の範囲またはその何らかの特定の態様に影響を及ぼさずに、幅広い等価な条件、配合および他のパラメーターの範囲内で、本発明を修正または変更することによって同じことを行えることは当業者には明らかであると考えられ、このような修正または変更は添付する特許請求の範囲に含まれることを意図している。
【0118】
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者のレベルを示すものであり、すべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参照として組み込まれるように特定的および個別に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図1】36/64量体プライマー−テンプレート基質を用いて60℃で定量的に評価した、Tne DNAポリメラーゼ、およびプライマー鎖の3’末端に4塩基のミスマッチがある変異型誘導体の、相対的3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を示すゲルを図示したものである。TneAは、D137AおよびD323Aを有するTne DNAポリメラーゼ変異体(5’−3’エキソヌクレアーゼ活性および3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く)を表す;TneBは、D137Aを有し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne DNAポリメラーゼ変異体を表す;Chiは以下に述べるTaq/Tneキメラ型DNAポリメラーゼを表し、Taqは野生型Taq DNAポリメラーゼである。各図の3つのレーンは、左から右の順に、反応を停止させる20秒前、1分前および2分前である。Pはプライマーの位置を表し、C(2つのレーン)は反応混合物に酵素を添加しなかった対照である。
【図2】36/64量体プライマー−テンプレート基質を用いて60℃で定量的に評価した、Tne DNAポリメラーゼ、およびプライマー鎖の3’末端に4塩基のミスマッチがある変異型誘導体が、プライマー末端からのミスマッチを分解してdNTPを取り込む能力を示したグラフを図示したものである。TneAは、D137AおよびD323Aを有し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性および3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne DNAポリメラーゼ変異体を表す;TneBは、D137Aを有し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne DNAポリメラーゼ変異体を表す;Taqは野生型Taq DNAポリメラーゼであり、Chiは以下に述べるTne−Taqキメラ型DNAポリメラーゼを表す。各図の4つのレーンは、左から右の順に、反応を停止させる20秒前、1分前、2分前および5分前である。Pはプライマーの位置を表し、C(2つのレーン)は反応混合物に酵素を添加しなかった対照である。
Claims (35)
- 忠実度が増加または向上するように改変または変異が加えられたポリメラーゼ。
- 核酸合成時のヌクレオチドの誤取り込み(misincorporation)が減少または消失するように、改変または変異が加えられたポリメラーゼ。
- DNAポリメラーゼである、請求項1または2記載のポリメラーゼ。
- 中温性または耐熱性である、請求項3記載のポリメラーゼ。
- Tne DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Tma DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Tli、VENT(商標)DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、DEEPVENT(商標)DNAポリメラーゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、変種(variant)、および誘導体からなる群から選択される、請求項3記載のポリメラーゼ。
- (a)ポリメラーゼの5’−3’エキソヌクレアーゼ活性;および(b)1つまたは複数のジデオキシヌクレオチドに対する識別活性
からなる群から選択される活性を低下または消失させる、1つまたは複数の改変または変異をさらに含む、請求項1または2記載のポリメラーゼ。 - 3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が上昇するように改変または変異が加えられた、請求項6記載のポリメラーゼ。
- 識別活性が低下または消失するように改変または変異が加えられた、請求項6記載のポリメラーゼ。
- 5’−3’エキソヌクレアーゼ活性が低下または消失するように、改変または変異が加えられた、請求項6記載のポリメラーゼ。
- ポリメラーゼの3’−5’ドメインに1つまたは複数の変異または改変を含む、請求項3記載のポリメラーゼ。
- 変異または改変が、高い3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインによる、3’−5’−エキソヌクレアーゼドメインの置換である、請求項10記載のポリメラーゼ。
- Taqである、請求項11記載のポリメラーゼ。
- 高い活性を有する3’−5’エキソヌクレアーゼドメインがTneポリメラーゼに由来する、請求項12記載のポリメラーゼ。
- 請求項1および2のいずれか一項記載のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むベクター。
- 遺伝子がプロモーターと機能的に結合している、請求項14記載のベクター。
- プロモーターが、λ−PLプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターからなる群から選択される、請求項15記載のベクター。
- 請求項14記載のベクターを含む宿主細胞。
- ポリメラーゼを生産する方法であって、
(a)請求項17記載の宿主細胞を培養する段階;
(b)該遺伝子を発現させる段階;および
(c)該宿主細胞から該ポリメラーゼを単離する段階
を含む方法。 - 宿主細胞が大腸菌(E.coli)である、請求項18記載の方法。
- 核酸分子を合成する方法であって、
(a)核酸テンプレートを請求項1または2記載の1つまたは複数のポリメラーゼと混合する段階;および
(b)該テンプレートの全体または一部に対して相補的な核酸分子を生成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする段階
を含む方法。 - 混合物が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7−デアザ(deaza)−dGTP、dUTP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、ddTTP、[α−S]dATP、[α−S]dTTP、[α−S]dGTPおよび[α−S]dCTPからなる群から選択される、1つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項20記載の方法。
- ヌクレオチドの1つまたは複数が検出可能なように標識される、請求項21記載の方法。
- DNA分子の配列を決定する方法であって、
(a)プライマーを第1のDNA分子とハイブリダイズさせる段階;
(b)段階(a)のDNA分子をデオキシリボヌクレオシド三リン酸、請求項1または2のいずれか一項記載のDNAポリメラーゼ、およびターミネーターヌクレオチドと接触させる段階;
(c)合成されるDNA分子の長さが該第1のDNA分子よりも短く、該合成されるDNA分子が5’末端にターミネーターヌクレオチドを含み、該第1のDNA分子に対して相補的なDNA分子の無作為な集団を合成するのに十分な条件下で、段階(b)の混合物をインキュベートする段階;ならびに
(d)該第1のDNA分子のヌクレオチド配列の、少なくとも一部を決定できるように、該合成されたDNA分子をサイズにより分離する段階
を含む方法。 - デオキシリボヌクレオシド三リン酸が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7−デアザ−dGTP、dUTP、[α−S]dATP、[α−S]dTTP、[α−S]dGTPおよび[α−S]dCTPからなる群から選択される、請求項23記載の方法。
- ターミネーターヌクレオチドがddTTP、ddATP、ddGTP、ddITPまたはddCTPである、請求項23記載の方法。
- デオキシリボヌクレオシド三リン酸の1つまたは複数に検出可能な標識がなされている、請求項23記載の方法。
- ターミネーターヌクレオチドの1つまたは複数が検出可能なように標識される、請求項23記載の方法。
- 二本鎖DNA分子を増幅するための方法であって、
(a)第1および第2のプライマーを提供する段階であって、第1のプライマーは該DNA分子の第1鎖の3’末端の内部または3’末端または近傍の配列に対して相補的であり、かつ第2のプライマーは該DNA分子の第2鎖の3’末端の内部または3’末端または近傍の配列に対して相補的である段階;
(b)該第1鎖の全体または一部に対して相補的な第3のDNA分子、および該第2鎖の全体または一部に対して相補的な第4のDNA分子が合成される条件下で、請求項1または2のいずれか一項記載のDNAポリメラーゼの存在下において、該第1のプライマーを該第1鎖に、該第2のプライマーを該第2鎖にハイブリダイズさせる段階;
(c)該第1および第3鎖、ならびに該第2および第4鎖を変性させる段階;ならびに
(d)(a)から(c)までの段階を1回または複数回繰り返す段階
を含む方法。 - 条件が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、7−デアザ−dGTP、dUTP、[α−S]dATP、[α−S]dTTP、[α−S]dGTP、および[α−S]dCTPからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在を含む、請求項28記載の方法。
- 請求項1または2のいずれか一項記載の1つまたは複数のポリメラーゼを含む、DNA分子の配列を決定するためのキット。
- 1つもしくは複数のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および/または1つもしくは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項30記載のキット。
- 請求項1および2のいずれか一項記載の1つまたは複数のポリメラーゼを含む、核酸分子の増幅または合成のためのキット。
- 1つまたは複数のデオキシリボヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項32記載のキット。
- mRNAからcDNAを調製する方法であって、
(a)1つまたは複数のmRNAテンプレートを、請求項1または2記載の1つまたは複数のポリメラーゼと混合する段階;および
(b)該テンプレートの全体または一部に対して相補的なcDNA分子を合成するのに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする段階
を含む方法。 - 合成されたcDNAを二本鎖cDNAが生成される条件下でインキュベートする段階をさらに含む、請求項34記載の方法。
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