DE10046960A1

DE10046960A1 - Verfahren zur Herstellung einer aktiven, heterodimeren AMW-RT in prokaryotischen Zellen

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Publication number: DE10046960A1
Application number: DE10046960A
Authority: DE
Inventors: Harald Sobek; Rainer Mueller; Manfred Schmidt; Bruno Frey; Bernhard Suppmann; Rainer Schmuck; Johann-Peter Thalhofer; Peter Pallua; Markus Pajatsch
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2002-04-11
Also published as: EP1191102B1; JP2002315584A; US20020115147A1; US6902920B2; CA2357540A1; CA2357540C; ES2346511T3; ATE471376T1; EP1191102A2; CN1346889A; DE60142384D1; CN1250728C; EP1191102A3

Abstract

In der vorliegenden Erfindung wird die heterologe Expression der Reserven Transkriptase aus dem Avian Myeloblastosis Virus (AMV-RT) in prokaryotischen Zellen, insbesondere Escherichia coli (E. coli) beschrieben. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls bestimmte Maßnahmen zur vereinfachten Aufreinigung der heterodimeren AMV-RT.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten aktiven heterodi meren AMV-RT durch Expression einer oder mehrerer für die α- und/oder β-Untereinheit(en) der AMV-RT kodierenden DNA-Sequenzen in prokaryotischen Zellen unter bestimmten Wachstums- und Induktionsbedingungen.

Die Entdeckung der Reversen Transkriptasen in den 70er Jahren widerlegte das "zentrale Dog ma" der Molekularbiologie über den Informationstransfer von der DNA über RNA zum Protein als unidirektionalen Prozeß (Termin H. und Mizutani S., 1970 Nature 226: 1211-1213; Baltimore D., 1970, Nature 226: 1209-1211). Die enzymatische Charakterisierung dieser RNA-abhängigen DNA-Polymerasen ist die Basis des derzeitigen Verständnisses über den Vermehrungszyklus von RNA-Viren und somit auch über die Entstehung und Verbreitung von Krankheiten, die durch diese Viren-Gattung verursacht werden (Krebs, AIDS etc.).

Für Molekularbiologen sind diese Reversen Transkriptasen jedoch auch ein Werkzeug zur Syn these, Amplifikation und Klonierung von cDNAs (RT-PCR). Diese Technik erlaubt eine verein fachte und beschleunigte Untersuchung von Genexpression in eukaryontischen Zellen. Nach Isolierung der gesamten mRNA aus Zellextrakten oder Geweben wird durch die Rervese Trans kriptase die mRNA in cDNA "rückübersetzt" und durch den darauffolgenden PCR-Schritt am plifiziert, so daß eine Klonierung und Charakterisierung möglich ist. Dadurch entfällt einerseits die Aufklärung von Intron- und Exon-Strukturen der Gene, andererseits ist auch eine Untersu chung der Genexpression in der Zelle während verschiedener Lebenszyklen oder bei der Entste hung von Krankheiten (wie z. B. Krebs) möglich.

Reverse Transkriptasen (RT) aus drei verschiedenen Retroviren sind bislang genauer untersucht: Die RT aus Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV). Dieses Enzym besteht aus einer einzigen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 78 kDa (Prasad V. R., 1993 reviewed in Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 135). Fer ner ist eine RT aus Human Immunodeficiency Virus (HIV) bekannt. Diese RT ist ein Heterodi mer, das sich aus zwei Untereinheiten, p66 und p51, zusammensetzt, wobei die Untereinheit p51 durch proteolytische Spaltung von p66 entsteht (Le Grice S. F. J., 1993 reviewed in Reverse Trans criptase, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 163). Darüber hinaus sind RT's aus Avian Sarcoma-Leukosis Virus (ASLV) bekannt. Zu der Familie der ASLV gehört auch die aus Avian Myeloblastosis Virus (AMV) erhältliche RT. Diese RT ist ebenfalls ein Heterodimer, das sich aus einer α-Kette mit einem Molekulargewicht von ca. 63 kDa und einer β-Kette mit einem Molekulargewicht von ca. 95 kDa zusammensetzt. Auch hier entsteht die α- Kette durch proteolytische Prozessierung der β-Kette (Golomb M. und Grandgenett D., 1979, J. Biol. Chem. 254: 1606-1613; Weiss R. et al., eds. 1984, Molecular biology of tumor viruses, 2^nd edition: RNA tumor viruses 1/Text. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Während die M-MLV-RT als Monomer und die HIV-RT als Heterodimer in E. coli exprimiert werden können, ist die Expression der AMV-RT als aktivem bzw. löslichem Heterodimeren in E. coli oder anderen Prokaryonten bislang nicht in zufriedenstellendem Maße möglich. Gemäß WO 00/42199 werden zwar bestimmte RT-Varianten in E. coli- bzw. bevorzugt in eukaryotischen Insektenzellen exprimiert, die gewünschte RT wird dabei jedoch mit überwiegend unlöslichem Anteil (ca. 90%) erhalten.

Ferner ist eine rekombinante AMV-RT in Zellrohextrakten von E. coli schwer meßbar, da zum einen eingesetzte RNA-Templates durch E. coli eigene RNasen abgebaut werden und zum an deren E. coli-Stämme eine DNA-Polymerase besitzen, die neben der DNA-Polymerase-Aktivität auch eine RT-Aktivität aufweist (Ricchetti, M. und Huc, H., 1993, EMBO J. 12 (2), 387-396). Diese E. coli eigene RT-Aktivität stört somit die Bestimmung der Aktivität der rekombinanten AMV-RT in E. coli-Rohextrakten und in Fraktionen der Reinigung beträchtlich.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine rekombinante aktive hetero dimere AMV-RT in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer aktiven heterodimeren AMV- RT in prokaryotischen Wirtszellen, wobei eine oder mehrere DNA-Sequenz(en), die für die α- und β-Untereinheit bzw. -Kette der AMV-RT kodieren, in Expressionsplasmide kloniert wer den, die Expressionsplasmide in prokaryotischen Zellen transformiert werden, die Expression der heterodimeren AMV-RT induziert wird und die rekombinante heterodimere AMVR-RT aus den Zellen aufgereinigt, d. h. isoliert wird. Geeignete Gene bzw. DNA-Sequenzen sind unter an derem solche, die nur für eine der AMV-RT-Untereinheiten kodieren. Ein Teil des Expressionsproduktes kann anschließend durch bestimmte Maßnahmen, wie z. B. proteolytische Spaltung der β-Kette, in die jeweils andere Untereinheit überführt werden. Als besonders geeignet haben sich für das erfindungsgemäße Verfahren die Sequenzen SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 er wiesen, welche zu einer aktiven heterodimeren AMV-RT bestehend aus den Untereinheiten SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 führt.

Die für die Untereinheiten der AMV-RT kodierenden Strukturgene bzw. DNA-Sequenzen kön nen entweder auf unterschiedlichen, von einander getrennten Expressionsplasmiden oder einem Expressionsplasmid kloniert, gegebenenfalls in Gegenwart von sogenannten Helferplasmiden und in einer entsprechenden Wirtszelle exprimiert werden. Geeignete Expressionsplasmide sind beispielsweise pDS, pKK177-3 oder pKKT5. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Plasmid pKKT5, in welchem die jeweiligen Strukturgene unter Kontrolle des T5-Promotors insertiert sind. Wei tere mögliche Promotoren, wobei es sich bevorzugt um IPTG induzierbare Promotoren handelt, sind beispielsweise der lac-, lac UV5- oder tac-Promotor. Optional zu verwendende Helferplas mide, wie z. B. das Plasmid pUBS520, und geeignete Selektionsmarker, wie beispielsweise Ampi cillin oder Kanamycin, sind dem Fachmann prinzipiell bekannt.

Die Expressionsplasmide sowie gegebenenfalls weitere Helferplasmide werden in eine geeignete prokaryotische Wirtszelle transformiert. Bevorzugt wird erfindungsgemäß ein E. coli-Stamm, wie beispielsweise E. coli K12 C600, DH5α, LE392, JM83, JM105, NM522, M15, RR1Δ15, UT5600, TG1, A1200 oder die Stämme E. coli B, BL21, HB 101 verwendet. Besonders bevorzugt ist erfin dungsgemäß der E. coli-Stamm LE392.

Die Expression der heterodimeren AMV-RT kann durch verschiedene Maßnahmen induziert werden. Insbesondere positive Auswirkungen auf die Expression von aktiver AMV-RT haben be stimmte Wachstums- und Induktionsbedingungen. Eine Wachstumstempratur im Bereich von 10° bis 25°C bei einer gleichzeitig erniedrigten Induktorkonzentration hat sich erfindungsgemäß als vorteilhaft erwiesen. Als besonders geeignet hat sich eine Wachstumstemperatur von etwa 15°C und eine Induktorkonzentration zwischen 0,1 und 0,5 mM, bevorzugt von etwa 0,15 mM erwiesen. Bevorzugt wird erfindungsgemäß IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) oder Lactose als Induktor eingesetzt.

Ferner hat sich gezeigt, daß die lösliche Expression der AMV-RT in prokaryotischen Zellen durch die Coexpression von Hilfsgenen gesteigert werden kann. Als mögliche Hilfsgene kommen insbesondere das trpT-Gen, das für die Tryptophan-tRNA kodiert, in Frage. Darüber hinaus sind Chaperongene zur löslichen Expression geeignet, wie beispielsweise, die für GroEL und GroES, GrpE, ClpB, Dnak und DnaJ kodierenden Gene. Die Gene für ein oder mehrere Chaperone be finden sich dabei bevorzugt auf einem Helferplasmid mit induzierbarem Promotor, die Gene, die für die Chaperone GroEL und GroES kodieren, befinden sich unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors auf dem Expressionsplasmid, auf dem sich auch die Strukturgene für die α- und/oder β-Kette befinden. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist jedoch, wenn die für GroEL und GroES kodierenden Gene auf dem Expressionsplasmid, das die Gene für die α- und β-Kette trägt, kloniert sind und die für Dnak, DnaJ, GrpE und ClpB kodierenden Gene auf einem Helfer plasmid kloniert sind.

Zur Aufreinigung bzw. Isolierung der rekombinanten heterodimeren AMV-RT aus dem Zellex trakt werden - neben den dem Fachmann allgemein bekannten Maßnahmen - insbesondere ge eignete Affinitätschromatographiematerialien wie metallionen-chelatisierende Materialien oder Kationenaustauscher verwendet. Besonders vorteilhaft für die Reinigung der AMV-RT ist, wenn die Expressionsprodukte, d. h. sowohl α- und β-Kette mit solchen Peptidsequenzen fusioniert sind, die zur reversiblen Bindung an bestimmte Säulenmaterialien, wie z. B. Kationenaustauscher, metallionenchelatisierende Materialien, wie Nickel-, Kupfer- oder Zink-Nitriloessigsäure- (NTA-) Harze, geeignet sind. Erfindungsgemäß geeignete Peptidsequenzen können von zwei bis etwa 100 Aminosäuren bzw. Aminosäurederivate aufweisen. Peptidsequenzen, die aus zwei bis zehn Aminosäuren, z. B. Argininresten oder Histidinresten bestehen, haben sich erfindungsge mäß als besonders geeignet erwiesen. Ferner hat sich als besonders geeignet erwiesen, wenn sol che Peptidsequenzen, die aus acht Arginin- bzw. aus sechs Histidinresten bestehen, verwendet werden. Darüber hinaus sind auch kommerziell erhältliche Peptidsequenzen wie z. B. Strep-tag® (IBA GmbH, Göttingen/Deutschland) oder das GST-tag (Pharmacia, Uppsala/Schweden) für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

1. Beispiel Isolierung der Gene, die für α-Kette und β-Kette kodieren

Zur Isolierung der β-Kette wurden nach der Datenbank-Sequenz (MEDLINE ID 94366722, Ba luda et al., 1994) Oligonukleotide als Primer designed (s. SEQ ID NO: 1 und 2). Am 5'-Ende wurde eine EcoRI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle und am 3'-Ende eine PstI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle für die spätere Klonierung in Vektoren eingebaut. Zusätzlich wurde ein weiterer 3'-primer designed (s. SEQ ID NO: 3), der die Isolierung der α-Kette ermöglicht. Beide Ketten wurden sowohl aus Virus-Lysat (ATCC VR-265) mittels RT-PCR wie auch aus einem E. coli-Klon (ATCC 31990), der die β-Kette auf einem Plasmid trägt, mittels PCR gefischt. Die PCR-Ansätze wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen, die PCR-Fragmente von ca. 1715 Bp für die α-Kette und ca. 2570 Bp für die β-Kette wurden aus dem Agarosegel isoliert (QIAEX II, Gel Extraction Kit, Qiagen/Deutschland), mit den o. a. Restriktionsendonukleasen nachgeschnitten und in ein ebenfalls mit EcoRI und PstI linearisiertes und isoliertes Vektorfrag ment von pUC19 kloniert. Dazu wurden jeweils 1 µl (20 ng) Vektorfragment und 3 µl (100 ng) PCR-Fragment, 1 µl 10 × Ligase-Puffer (Maniatis et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (USA), B.27), 1 µl T4 DNA- Ligase, 4 µl steriles H₂O_bidest. pipettiert, vorsichtig gemischt und über Nacht bei 16°C inkubiert. Die klonierten Gene wurde anschließend mittels Restriktionsanalyse und durch Sequenzierung untersucht. Die Sequenzen sind in SEQ ID NO: 4 (α-Kette) und SEQ ID NO: 5 (β-Kette) darge stellt.

Ein Vergleich mit der Datenbanksequenz (MEDLINE ID 94366722, Baluda, M. A., und Reddy, E. P., 1994, Oncogene 9: 2761-2774) ergab für die α-Kette und für die β-Kette jeweils eine Homo logie von 98,8% auf DNA-Ebene. Wenn die daraus resultierenden Aminosäuresequenzen mit einander verglichen werden, so wird deutlich, daß die meisten Austausche auf DNA-Ebene soge nannte stumme Mutationen sind, d. h. zu keinem Aminosäureaustausch führen. Lediglich drei Basenaustausche führen auch zu Aminosäureaustauschen, sind aber reproduzierbar in jedem isolierten PCR-Produkt zu finden. Es handelt sich dabei um die Austausche Arg273Met, Arg304Gln und Asp495Glu. Die Aminosäuresequenzen beider Ketten sind in SEQ ID NO: 6 (α- Kette) und SEQ ID NO: 7 (β-Kette) dargestellt.

2. Beispiel Expression von α-Kette und β-Kette ohne fusionierte Peptidsequenzen (tags) 2.1. Konstruktion der Expressionsplasmide pAMV-α und pAMV-β

Zur Expression der AMV-RT wurden die Gene für beide Ketten getrennt in Expressionsvektoren so kloniert, daß die Strukturgene jeweils in der richtigen Orientierung unter Kontrolle des T5- Promotors insertiert sind. Dazu wurde das jeweilige Strukturgen für die α- bzw. die β-Kette mittels EcoRI und PstI aus dem Plasmid pUC19 ausgeschnitten, die Restriktionsansätze durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und das 1715 Bp große Fragment der α-Kette bzw. das 2570 Bp große Fragment der β-Kette aus dem Agarosegel isoliert. Zur Expression wurde das Expressionsplasmid pKKT5, welches aus pKK177-3 (Kopetzki et at., 1989, Mol. Gen. Genet. 216: 149-155) durch Austausch des tac-Promotors durch den T5-Promotor aus pDS (Bujard et at., 1987, Methods Enzymol. 155: 416-433) entstanden ist, eingesetzt. Die EcoRI-Restriktionsendo nukleaseschnittstelle in der Sequenz des T5-Promotors wurde durch zwei Punktmutationen ent fernt. Das so entstandene Expressionsplasmid wurde für die Insertion der Gene für die AMV-RT mit EcoRI und PstI geschnitten, der Restriktionsansatz durch Agarosegelelektrophorese aufge trennt und das resultierende Vektorfragment von ca. 2500 Bp aus dem Agarosegel isoliert. Das so gewonnene Vektorfragment wurde wie beschrieben getrennt mit den in Beispiel 1 beschriebenen Genen für die α- und die β-Kette ligiert. Die ordnungsgemäße Insertion der Gene wurde mittels Restriktionskontrolle und Sequenzierung überprüft. Die so entstandenen Plasmide pAMV-α und pAMV-β wurden zunächst getrennt zur Expressionskontrolle in verschiedene E. coli-Stäm me zusammen mit dem Helferplasmid pUBS520 cotransformiert. Denkbar ist hier die Expres sion von α-Kette bzw. β-Kette getrennt voneinander zur Gewinnung von αα- bzw. ββ-Homo dimeren. Das Helferplasmid pUBS520 (Brinkmann et at, 1989, Gene 85: 109-114) trägt u. a. das lacI^q-Gen, das für den Lac-Repressor kodiert, und das dnaY-Gen, das für die in E. coli seltene tRNA^Arg - erkennt die Codons AGA und AGG - kodiert (Garcia et al., 1986, Cell 45: 453-459). Als Selektionsmarker wird das Kanamycin-Resistenzgen aus dem Transposon TN903 verwendet.

2.2. Transformation der Expressionsplasmide pAMV-α bzw. pAMV-β getrennt in E. coli

Kompetente Zellen verschiedener E. coli-Stämme wurden entsprechend der Methode nach Ha nahan (J. Mol. Biol. 1983, Vol. 166, 557) hergestellt. 200 µl derart hergestellter E. coli LE392- Zellen wurden mit 20 ng isolierter Expressionsplasmid-DNA pAMV-α bzw. pAMV-β und 40 ng Helferplasmid-DNA versetzt. Nach 30 min. Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock (90 sec bei 42°C). Anschließend wurden die Zellen in 1 ml LB-Medium überführt und zur phänotypi schen Expression 1 Stunde bei 37°C in LB-Medium inkubiert. Aliquote dieses Transformations ansatzes wurden auf LB-Platten mit Ampicillin und Kanamycin als Selektionsmarker ausplattiert und 15 Stunden bei 37°C inkubiert.

2.3. Expression des Gens der α-Kette in E. coli

Zur Expression des Gens, das für die α-Kette der AMV-RT kodiert, wurden plasmidhaltige Klone in 3 ml LB_ampkan-Medium angeimpft und bei 30°C im Schüttler inkubiert. Bei einer optischen Dichte von 0,5 (gemessen bei 550 nm, OD₅₅₀) wurden die Zellen mit 0,5 mM IPTG induziert und 4 h bei 30°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte der einzelnen Expressionsklone bestimmt, ein Aliquot, das einer OD_{550 nm} von 5.0/ml entspricht, entnommen und die Zellen abzentrifugiert (10 min, 6000 rpm, 4°C). Das Zellpellet wurde in 400 µl TE-Puffer (50 mM TRIS/50 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen und durch Zentrifugation die lösliche Proteinfraktion von der unlöslichen Pro teinfraktion getrennt (10 min, 14000 rpm, 4°C). Alle Fraktionen wurden mit SDS- und β-Mer captoethanol-haltigen Auftragspuffer versetzt und die Proteine durch Kochen (5 min 100°C) denaturiert. Anschließend wurden je 10 µl mittels eines analytisches SDS-Gels (10%) analysiert (Laemmli U. K., 1970, Nature 227: 555-557).

Nach Auswertung des SDS-Gels ist eine klare Überexpression der α-Kette erkennbar. Bei ca. 63 kDa ist eine stark überexprimierte, zusätzliche Bande zu erkennen, die bei den nicht induzierten bzw. induzierten, aber nicht plasmidhaltigen Kontroll-Klonen nicht beobachtet wird. Ein gerin ger Anteil der überexprimierten α-Kette erscheint in der löslichen Proteinfraktion, während der größte Anteil als unlöslich exprimiertes Protein anfällt.

2.4. Expression des Gens der β-Kette in E. coli

Zur Expression des Gens, das für die β-Kette der AMV-RT kodiert, wurden plasmidhaltige Klone in 3 ml LB_ampkan-Medium angeimpft und bei 30°C im Schüttler inkubiert. Bei einer OD_{550 nm} von 0.5 wurden die Zellen mit 0,5 mM IPTG induziert und 4 h bei 30°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte der einzelnen Expressionsklone, bestimmt, ein Aliquot, das einer OD_{550 nm} von 5.0/ml entspricht, entnommen und die Zellen abzentrifugiert (10 min, 6000 rpm, 4°C). Das Zellpellet wurde in 400 µl TE-Puffer (50 mM TRIS/50 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen und durch Zentrifugation die lösliche Proteinfraktion von der unlöslichen Proteinfraktion getrennt (10 min, 14000 rpm, 4°C). Alle Fraktionen wurden mit SDS- und β-Mercaptoethanol-haltigen Auftragspuffer versetzt und die Proteine durch Kochen (5 min 100°C) denaturiert. Anschließend wurden je 10 µl mittels eines analytisches SDS-Gels (8%) analysiert (Laemmli U. K., 1970, Nature 227: 555-557).

Nach Auswertung des SDS-Gels ist eine klare Überexpression der β-Kette erkennbar. Bei ca. 95 kDa ist eine stark überexprimierte, zusätzliche Bande zu erkennen, die bei den nicht induzierten bzw. induzierten, aber nicht plasmidhaltigen Kontroll-Klonen nicht beobachtet wird. Der größte Anteil der überexprimierten β-Kette erscheint in der unlöslichen Proteinfraktion, jedoch ist auch eine geringe Überexpression in der löslichen Proteinfraktion zu erkennen.

2.5. Expression beider Ketten auf getrennten Plasmiden in einer Zelle

Zur Expression beider Ketten in einer Zelle mußten zunächst die lacI^q-Expressionskassette und die dnaY-Expressionskassette aus dem Helferplasmid pUBS520 auf die Expressionsplasmide um kloniert werden. Dabei wurde die lacI^q-Expressionskassette auf pAMV-α und die dnaY-Expres sionskassette auf das Expressionsplasmid pAMV-β kloniert. Um eine stabile Vermehrung der Expressionsplasmide zu gewährleisten, wurde das Ampicillin-Resistenzgen aus pAMV-α durch das Kanamycin-Resistenzgen aus pUBS520 ersetzt. Die so entstandenen Expressionsplasmide pAMV-α_lacIq nd pAMV-β_dnaY wurden anschließend in verschiedene E. coli-Expressionsstämme cotransformiert.

Zur Expression der Gene, die für die α-Kette und die β-Kette der AMV-RT codieren, wurden plasmidhaltige Klone in 3 ml LB_ampkan-Medium angeimpft und bei 30°C im Schüttler inku biert. Bei einer OD_{550 nm} von 0,5 wurden die Zellen mit 0,5 mM IPTG induziert und 4 h bei 30°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte der einzelnen Expressions klone bestimmt, ein Aliquot, das einer OD_{550 nm} von 5.0/ml entspricht, entnommen und die Zellen abzentrifugiert (10 min, 6000 rpm, 4°C). Das Zellpellet wurde in 400 µL TE-Puffer (50 mM TRIS/50 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen und durch Zentrifugation die lösliche Proteinfraktion von der unlöslichen Proteinfraktion getrennt (10 min, 14000 rpm, 4°C). Alle Fraktionen wurden mit SDS- und β-Mercaptoethanol-haltigen Auftragspuffer versetzt und die Proteine durch Kochen (5 min 100°C) denaturiert. Anschließend wurden je 10 µl mittels eines analytisches SDS-Gels (8%) analysiert (Laemmli U. K., 1970, Nature 227: 555-557).

Nach Auswertung des SDS-Gels ist überraschenderweise eine klare Überexpression der α- und der β-Kette erkennbar. Bei ca. 63 kDa und ca. 95 kDa sind stark überexprimierte, zusätzliche Banden zu erkennen, die bei den nicht induzierten bzw. induzierten, aber nicht plasmidhaltigen Kontroll-Klonen nicht zu erkennen sind. Die Verteilung der Banden in der löslichen bzw. der unlöslichen Fraktion ist analog wie bei den Expressionsversuchen der beiden Ketten getrennt voneinander. Insgesamt ist die Expressionsleistung für beide Ketten etwas geringer als bei der getrennten Expression.

3. Beispiel Expression von α-Kette und β-Kette mit fusionierten tags zur vereinfachten Aufreinigung 3.1. Herstellung verschiedener Fusionsproteine

Zur effizienten Reinigung der rekombinanten AMV-RT-Heterodimere wurden beide Ketten am 5'-Ende mit geeigneten Peptidsequenzen, sogenannten tags fusioniert. Die Verwendung von tags ermöglicht dabei die Durchführung von Affinitätschromatographien. Eine Abfolge von zwei Affinitätschromatographien, die jeweils auf eines der beiden tags gerichtet sind, erlaubt darüber hinaus die Isolierung von reinen Heterodimeren (Wende W. et al., 1996, Biol. Chem. 377, 625-632). Über entsprechend entworfene primer wurden an die für die α-Kette acht Argininreste und an die β-Kette sechs Histidinreste mittels PCR-Reaktion angehängt. Die Sequenzen der sense primer sind in SEQ ID NO: 8 (5'-primer für die α-Kette) und SEQ ID NO: 9 (5'-primer für die β-Kette) dargestellt. Als antisense-primer wurden die bereits zur Gen-Isolierung verwendeten Oligonukleotide SEQ ID NO: 2 (β-Kette) und SEQ ID NO: 3 (α-Kette) eingesetzt.

Die PCR-Ansätze wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen, die PCR-Fragmente von 1739 Bp für die α-Kette und 2597 Bp für die β-Kette wurden aus dem Agarosegel isoliert (QIAEX II, Gel Extraction Kit, Qiagen, Germany), mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI nach geschnitten und in ein ebenfalls mit EcoRI und PstI linearisiertes und isoliertes Vektorfragment des bevorzugten Expressionsplasmides kloniert. Dazu wurden jeweils 1 µl (20 ng) Vektorfrag ment und 3 µl (100 ng) PCR-Fragment, 1 µl 10 × Ligase-Puffer (Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press NY (USA), B.27), 1 µl T4 DNA-Ligase, 4 µl steriles H₂O_bidest. pipettiert, vorsichtig gemischt und über Nacht bei 16°C inkubiert. Die klonierten Gene wurde anschließend mittels Restriktionsanalyse und durch Sequenzierung untersucht. Die so entstandenen Expressionsplasmide wurden pAMV- α_lacIq-Arg und pAMV-β_dnaY-His genannt.

3.2. Transformation der Expressionsplasmide pAMV-α_lacIq-Arg und pAMV-β_dnaY-His in verschiedenen E. coli-Expressionsstämmen

Kompetente Zellen verschiedener E. coli-Stämme wurden entsprechend der Methode nach Hanahan (J. Mol. Biol. 1983, Vol. 166 pp. 557) hergestellt (s. Beispiel 2.2).

3.3. Expression beider Ketten mit fusionierten tags auf getrennten Plasmiden in einer Zelle

Zur Expression beider Ketten mit tags in einer Zelle wurden verschiedene E. coli-Expressions stämme mit den Expressionsplasmiden pAMV-α_lacIq-Arg und pAMV-β_dnaY-His cotransfor miert.

Zur Expression der Gene, die für die α-Kette mit Arg-tag und die β-Kette mit His-tag der AMV- RT codieren, wurden plasmidhaltige Klone in 3 ml LB_ampkan-Medium angeimpft und bei 30°C im Schüttler inkubiert. Bei einer OD_{550 nm} von 0,5 wurden die Zellen mit 0,5 mM IPTG indu ziert und 4 h bei 30°C im Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte der ein zelnen Expressionsklone bestimmt, ein Aliquot, das einer OD₅₅₀ von 5/ml entspricht, entnom men und die Zellen abzentrifugiert (10 min, 6000 rpm, 4°C). Das Zellpellet wurde in 400 µl TE- Puffer (50 mM TRIS/50 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, die Zellen durch Ultraschall aufge schlossen und durch Zentrifugation die lösliche Proteinfraktion von der unlöslichen Protein fraktion getrennt (10 min, 14000 rpm, 4°C). Alle Fraktionen wurden mit SDS- und β-Mercap toethanol-haltigen Auftragspuffer versetzt und die Proteine durch Kochen (5 min 100°C) de naturiert. Anschließend wurden je 10 µl über ein 8% analytisches SDS-Gel analysiert (Laemmli U. K., 1970, Nature 227: 555-557).

Nach Auswertung des SDS-Gels ist überraschenderweise eine klare Überexpression der α- und der β-Kette erkennbar. Bei ca. 63 kDa und ca. 95 kDa sind stark überexprimierte, zusätzliche Banden zu erkennen, die bei den nicht induzierten bzw. induzierten, aber nicht plasmidhaltigen Kontroll-Klonen nicht auftauchen. Die Verteilung der Banden in der löslichen bzw. der unlösli chen Fraktion ist analog wie bei den Expressionsversuchen mit beiden Ketten ohne tags in einer Zelle.

3.4. Expression der beiden Ketten mit fusionierten tags auf einem Plasmid

Die Verteilung der "Gene" für die α- und β-Kette der AMV-RT auf zwei Plasmide könnte auf Grund von unterschiedlichen Stabilitäten dieser Plasmide zur Produktion von unterschiedlichen Mengen der jeweiligen Ketten und somit zur einer geringeren Ausbeute an αβ-Ketten Heterodi mer führen. Daher wurde mit Ausnahme des Gens für die β-Lactamase die gesamte genetische Information der beiden Plasmide pAMV-α_lacIq-Arg und pAMV-β_dnaY-His auf einem einzigen Plasmid, pAMVαβ-1 vereinigt. Die Konstruktion dieses Plasmides erfolgte durch Insertion des SspI-AflIII-Fragmentes von pAMV-β_dnaY-His, enthaltend die Sequenz für den T5-Promotor, das Gen kodierend für die β-Kette mit N-terminalen His-tag, die Sequenz für den rrnB-Termi nator und das dnaY-Gen, in die SalI-Schnittstelle von pAMV-α_lacIq-Arg, enthaltend die Se quenz für den T5-Promotor, das Gen kodierend für die α-Kette mit N-terminalen Arg-tag, die Sequenz für den rrnB-Terminator, das Kanamycin-Resistenzgen und das lacI^q-Gen. Zu diesem Zweck wurden je 1 µg der Expressionsplasmide pAMV-α_lacIq-Arg und pAMV-β_dnaY-His mit den oben beschriebenen Restriktionsendonukleasen nach Herstellerangaben geschnitten, die Restriktionsansätze in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und das 4124 Bp große SspI-AflIII- Fragment von pAMV-β_dnaY-His und das 6024 Bp große Fragment von pAMV-α_lacIq-Arg aus dem Agrosegel isoliert (QIAEX II, Gel Extraction Kit, Qiagen/Deutschland). Die nicht kompatiblen Enden wurden mit Klenow-Polymerase (Roche Diagnostics GmbH) nach Herstellerangaben aufbereitet und die beiden Fragmente wie oben beschrieben miteinander ligiert. Das neu ent standene Expressionsplasmid pAMVαβ-1 wurde mittels Restriktionsanalyse untersucht.

Das nach Restriktionsanalyse korrekte Expressionsplasmid wurde wie oben beschrieben in den E. coli-K12-Stamm LE 392 transformiert und einer Expressionskontrolle unterzogen. Der Protein gehalt der Zellen nach 4 Stunden Wachstum unter induzierten Bedingungen wurde anschließend mittels SDS-PAGE untersucht. Nach SDS-PAGE-Analyse ist die Höhe der Expressionsleistung und die Verteilung in löslicher und unlöslicher Fraktion vergleichbar mit der Expression der Gene für α- und β-Kette auf getrennten Plasmiden, jedoch erscheint die Menge an exprimierter α- und β-Kette homogener.

Des weiteren wurde für die Reinigungsprozedur der Arg-tag der α-Kette analog zur β-Kette ge gen einen His-tag ausgetauscht. Zu diesem Zweck wurde ein Zwischenkonstrukt, pAMV-α_lacIq-
His, erstellt, indem das EcoRI-NheI-Fragment aus pAMV-α_lacIq-Arg gegen das EcoRI-NheI-Fragment aus pAMV-β_dnaY-His ausgetauscht wurde. Anschließend wurde analog zur Konstruktion von pAMVαβ-1 mit Ausnahme des Gens für die β-Lactamase die gesamte genetische Information der beiden Plasmide pAMV-α_lacIq-His und pAMV-β_dnaY-His auf einem einzigen Plasmid, pAMVαβ-2 vereinigt. Der neu entstandene Expressionsvektor wurde pAMVαβ-2 genannt. Zellen wurden wie oben beschrieben mit pAMVαβ-2 transformiert und einer Expressionskon trolle nach Standardbedingungen unterzogen. Die Expressionsleistung war unter diesen Bedin gungen nicht erhöht.

4. Beispiel Expressionsoptimierung 4.1. Erhöhung der Expression an aktiver AMV-RT durch Veränderung der Expressionsbedingungen

Insbesondere positive Auswirkungen auf die Expression von aktiver AMV-RT haben besondere Wachstums- und Induktionsbedingungen. Danach wurde die Wachstumstemperatur während der Induktionsphase von 30°G auf 15°C gesenkt, die IPTG-Konzentration zur Induktion der Expression von 0,5 mM auf 0,15 mM erniedrigt und die Induktionszeit von 4 h auf 26 h erhöht. Der Proteingehalt der Zellen nach der Induktionsphase wurden wie oben beschrieben durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese untersucht.

Danach ist in der SDS-PAGE-Analyse wie erwartet die Gesamtexpressionsleistung von α- und β- Kette stark erniedrigt, der Gehalt an löslich exprimierter α- und β-Kette ist jedoch im Vergleich zu den Expressionsversuchen unter Standardwachstums- und Induktionsbedingungen deutlich erhöht. Diese Erhöhung der Expression von aktiver AMV-RT wurde auch bei der anschließen den Aufreinigung und Aktivitätsbestimmung bestätigt.

4.2. Erhöhung der Expression an aktiver AMV-RT durch Coexpression von Hilfsgenen 4.2.1. Coexpression des Gens für die Tryptophan-tRNA (tRNA^trp)

Eine Eigenschaft der AMV-RT besteht darin, nach der Infektion einer eukaryontischen Wirts zelle eine zelleigene tRNA für Tryptophan (tRNA^trp) als "primer" für die Polymerasereaktion zu verwenden (Leis et al., 1993, in: Reverse Transcriptase, Cold Spring Harbor Monograph Series, eds.: Skala, A. M. and Goff, S. P., Cold Spring Harbor NY (USA), 33-48). Ob die E. coli eigene tRNA^trp von der AMV-RT als "primer" verwendet werden kann, ist allerdings nicht nachgewie sen. In E. coli wird die tRNA^trp nur von einem einzigen Gen kodiert, trpT, dessen Expression an die normalen Bedürfnisse der Zelle angepaßt ist. Um eine eventuelle Verarmung der Zelle an tRNA^trp auszuschließen, wurde das trpT-Gen gemäß SEQ ID NO: 10 mittels PCR aus E. coli LE392 isoliert (die dafür verwendeten Primer sind in SEQ ID NO: 11 und 12 dargestellt), für die Insertion in pAMVα_lacIq-His mit PstI nachgeschnitten und mit dem ebenfalls mit PstI lineari sierten Vektorfragment von pAMVα_lacIq-His wie oben beschrieben ligiert. Klone, die das trpT-Gen an der PstI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle integriert haben, wurden mittels Restriktions analyse und Sequenzierung überprüft. In diesem Zwischenkonstrukt pAMVα_{laIq-His-trpT} bilden das Gen für die α-Kette und das Gen für die E. coli tRNA^trp eine Transkriptionseinheit, deren Ex pression durch den IPTG induzierbaren T5-Promotor reguliert wird. Anschließend wurde ana log zur Konstruktion von pAMVαβ-1 bzw. pAMVαβ-2 mit Ausnahme des Gens für die β-Lac tamase die gesamte genetische Information der beiden Plasmide pAMV-α_{lacIq-His-trpT} und pAMV-β_dnaY-His auf einem einzigen Plasmid, pAMVαβ-3 vereinigt. Zellen wurden wie oben beschrieben mit pAMVαβ-3 transformiert und einer Expressionskontrolle nach den modifizier ten Expressionsbedingungen unterzogen. Danach ist die Ausbeute an aktiver AMV-RT signifi kant erhöht.

4.2.2. Coexpression von Chaperongenen

In E. coli gibt es mit der GroESL Maschinerie und einem 4-Komponentensystem, bestehend aus DnaK, DnaJ, GrpE und ClpB, zwei Hauptchaperonsysteme (Kedzierska, 1999). Beide sind so wohl an der korrekten Faltung neu entstehender Proteine, als auch an der Renaturierung streß bedingt aggregierter Proteine entscheidend beteiligt (Hartl F. U., 1996, Nature 381, 571-580; Bukau H. und Horwich A. L., 1998, Cell 92, 351-366; Mogk A. et al., 1999, EMBO J. 18, 6934-6949; Zolkiewski M., 1999, J. Biol. Chem. 274, 28083-28086; Goloubinoff P. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13732-13737).

In einem ersten Schritt sollte in den AMV-RT Produktionsstämmen das groESL-Operon aus E. coli überexprimiert werden. Dazu wurde das EcoRI-HindIII-Fragment aus pOF39 (Fayet O., Louarn J.-M., Georgopoulos C., 1986, Mol. Gen. Genet. Vol. 202, pp. 335-345 in die SspI-Schnitt stelle des Plasmids pAMVβ_dnaY-His integriert. Die nicht kompatiblen Enden wurden vor Ligation mit Klenow-Polymerase (Roche Diagnostics) nach Herstellerangaben aufbereitet. Die Sequenz von groESL ist in SEQ ID NO: 13 dargestellt. In diesem neuen Konstrukt, pAMVβ_{dnaY-His-groESL}, bildet das groESL-Operon eine künstliche Transkriptionseinheit mit dem 3' gelegenen Gen für die β-Lactamase. Die Expression erfolgt entweder in Abhängigkeit vom jetzt 5' des groESL- Operon positionierten, bla eigenen, konstitutiven Promotor und/oder in Abhängigkeit des σ³² abhängigen Promotors des groESL-Operons. Wie oben beschrieben wurde anschließend wie derum mit Ausnahme des Gens für die β-Lactamase die gesamte genetische Information der beiden Expressionsplasmide pAMVα_{lacIq-His-trpT} und pAMVβ_{dnaY-His-groESL} auf einem einzigen Plas mid, pAMVαβ-4, vereinigt.

Zellen wurden wie oben beschrieben mit pAMVαβ-4 transformiert und einer Expressionskon trolle nach den modifizierten Expressionsbedingungen unterzogen. Die Coüberproduktion von GroESL bewirkte eine Steigerung der Biomasse und der Menge an aktiver AMV-RT. Im Ver gleich zu den bisher besten Produktionsstämmen wurden nach Aufreinigung und Aktivitätstest drei bis viermal höhere Werte erzielt.

Nachdem sich die Coüberproduktion von GroESL in den AMV-RT Produktionsstämmen als positive Maßnahme erwiesen hatte, wurde in einem zweiten Schritt zusätzlich das andere Haupt chaperonsystem von E. coli coüberproduziert. Neben den mutmaßlich allgemeinen Vorteilen dieser Coüberproduktion, könnte damit ein Nachteil der GroESL Maschinerie, ihr Ausschluß volumen von circa 65 kDa (Deuerling E. et al., 1999, Nature 400, 693-696), ausgeglichen werden. Dies dürfte vor allem bei der korrekten Faltung der β-Kette der AMV-RT (93 kDa) bedeutend sein, sofern sich diese nicht in einzelne, unabhängig voneinander bildende Domänen, unterteilen läßt. Entsprechend des physiologischen Zusammenspiels (Diamant S. und Goloubinoff P., 1998, Biochemistry 37, 9688-9694; Pierpaoli E. V. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 6643-6649) wurden die Gene für DnaK, DnaJ und GrpE in einem künstlichen Operon zusammengefaßt, während das Gen für ClpB eine eigene Transkriptionseinheit bildet. Für die koordinierte Expression mit den "Genen" für die Untereinheiten der AMV-RT wurden beide Transkriptionseinheiten unter die Kontrolle von IPTG induzierbaren T5-Promotoren gestellt.

Klonierungstechnische Gründe erforderten eine Reihe von Zwischenschritten auf dem Weg zum Endkonstrukt pCHAP-5. So wurden zunächst die pKKT5 Derivate pCHAP-1 und -2 konstruiert. pCHAP-1 enthält die genetische Information für das dnaKJ Operon aus E. coli, vom Startcodon für dnaK bis zum Stopcodon für dnaJ, pCHAP-2 trägt als Insert die künstliche Transkriptionseinheit aus den kodierenden Bereichen der Gene für GrpE und ClpB; die entsprechenden DNA- Fragmente wurden über PCR aus genomischer DNA von E. coli K12 LE392 ampilifiziert. Die Se quenz des dnaKJ Operons ist in SEQ ID NO: 14, die entsprechenden Primer zur Isolierung des dnaKJ-Operons sind in SEQ ID NO: 15 und 16 dargestellt. Die Sequenz des grpE-Gens ist in SEQ ID NO; 17, die entsprechenden Primer zur Isolierung des grpE Gens sind in SEQ ID NO: 18 und 19 dargestellt. Die Sequenz des clpB-Gens ist in SEQ ID NO: 20, die entsprechenden Primer zur Isolierung des clpB-Gens sind in SEQ ID NO: 21 und 22 dargestellt. Zur Konstruktion von pCHAP-1 wurde das PCR-Fragment, enthaltend das dnaKJ-Operon, mit SmaI und BamHI nachgeschnitten und in ein ebenfalls mit SmaI und BamHI linearisiertes Vektorfragment von pKKT5 wie oben beschrieben ligiert. Die Konstruktion von pCHAP-2 erfolgte über eine Drei fachligation mit dem EcoRI-PstI-Fragment des grpE-Gens, dem PstI-HindIII-Fragment des clpB- Gens und dem mit EcoRI und HindIII linearisierten Vektorfragment von pKKT5. pCHAP-3, in der das clpB-Gens alleine als Transkriptionseinheit vorliegt, leitet sich aus pCHAP-2 ab, indem das PstI-HindIII-Fragment aus pCHAP-2 in das mit EcoRI und HindIII linearisierte Vektorfrag ment von pKKT5 wie oben beschrieben ligiert wurde. Vor der Ligationsreaktion wurden die nicht kompatiblen Enden der beiden Fragmente mit Klenow-Polymerase (Roche Diagnostics) nach Herstellerangaben aufbereitet. pCHAP-4 ist ein pCHAP-1 Derivat, dessen Insert um das grpE Gen aus pCHAP-2 erweitert wurde und somit die künstliche Transkriptionseinheit aus den Genen für DnaK, DnaJ und GrpE beinhaltet. Aufgrund der hier suboptimalen "Shine Dalgarno" Sequenz sollte die Expression von grpE im Vergleich zu pCHAP-2 reduziert sein und somit bes ser an die Expression von dnaKJ angepaßt sein (Diamant & Goloubinoff, 1998; Pierpaoli et al., 1998). Zur Konstruktion von pCHAP-4 wurde das EcoRl-AvaI-Fragment aus pCHAP-2 in die BamHI-Schnittstelle von pCHAP-1 inseriert, nachdem die nicht kompatiblen Enden der beiden Fragmente mit Klenow-Polymerase (Roche Diagnostics) nach Herstellerangaben aufbereitet wurden. Das Endkonstrukt pCHAP-5 ist ein pCHAP-4 Derivat, das als zusätzliche genetische Information das Insert von pCHAP-3 beinhaltet. Dazu wurde durch Restriktion und Ligation wie mehrfach beschrieben das BspLU11I-NdeI-Fragment in pCHAP 4 gegen das BspLU11I-SspI- Fragment aus pCHAP-3 ausgetauscht. Um die Kompatibilität der Enden zu gewährleisten, wurde das durch NdeI erzeugte, überhängende Ende zuvor mit Klenow-Polymerase (Roche Diagnostics) nach Herstellerangaben aufgefüllt.

Untersuchungen zur Überproduktion von aktiver AMV-RT wurden in Abhängigkeit des Ex pressionplasmids pAMVαβ-4 in Kombination mit den verschiedenen Helferplasmiden, pCHAP- 1 bis -5, durchgeführt. Zumindest unter den abgeänderten Standardexpressionsbedingungen steigerten alle Helferplasmide die bisherigen Ausbeuten an aktiver AM-RT deutlich, wobei das Helferplasmid pCHAP-5 wie erwartet das beste Ergebnis lieferte. Dies konnte sowohl durch SDS-PAGE wie auch durch die anschließende Aufreinigung mit Aktivtätsbestimmung bestätigt werden.

5. Beispiel Analytische Methoden 5.1. Test auf Reverse Transkriptase-Aktivität (Test A)

Während der Reinigung wurde die Reverse Transkriptase-Aktivität in den Fraktionen mittels eines nicht-radioaktiven Testsystems detektiert. Dazu wurde der "Reverse Transcriptase Assay, non-radioactive" (Roche Molecular Biochemicals, Cat. No. 1468120) verwendet. Die Inkuba tionszeit wurde dabei auf 30 Minuten verkürzt.

5.2. Test auf Reverse Transkriptase-Aktivität (Test B)

Die spezifische Reverse Transkriptase-Aktivität der Pools wurde mittels eines radioaktiven Test systems bestimmt. Reverse Transkriptase-Aktivität wurde in 100 µl Testvolumen (50 mM Tris/HCl, pH 8.3 (37°C), 40 mM KCL, 6 mM MgCl₂, 0.5 mM dTTP, 0.04 OD_{260 nm} Poly (A) × dT₁₅, 0.1 µM [3H]-dTTP) bestimmt. AMV-RT (5 µl) wurde in geeigneten Verdünnungen zuge geben. Nach Inkubation für 10 min. bei 37°C wurde die Reaktion mit 10% TCA-Lösung (500 µl) abgestoppt. Das gebildete, radioaktiv markierte Produkt wurde nach der Fällung auf Nitro cellulose-Filter gewaschen. Die Einbaurate an Radioaktivität wurde im Szintilations-Zähler ge messen und die RT-Aktivität der Probe berechnet. Eine Enzymeinheit wurde dabei als die Menge an AMV-RT definiert, die in 10 min. bei 37°C den Einbau von 1.0 nMol TMP in säureunlösli ches Produkt bewirkt.

5.3. Test auf DNA-Polymerase

Die Aktivität der DNA-Polymerase aus E. coli wurde durch Messung der Nick-Translation be stimmt. Dabei wurde die DNA-Polymerase mittels eines nicht-radioaktiven Nick-Translations- Tests nachgewiesen. Die Nick-Translation wurde in 50 µl Testvolumen durchgeführt (50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 0.1 mM DTE, 28.875 µM DIG-dUTP, 1.444 µM Bio-16-dUTP, 95.865 µM dTTP, 20 µM dATP, 20 µM dCTP, 20 µM dGTP, 1 µg pBR322, 1 pg DNaseI). Nach Zugabe der Proben (1 µl) wurde die Reaktion für 30 min. bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Reaktionsansatz in Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten überführt. Die weitere Behand lung und Auswertung des Tests wurde analog dem "Reverse Transcriptase Assay, non-radio active" (Roche Molecular Biochemicals, Cat. No. 1468120) durchgeführt.

5.4. Test auf kontaminierende Aktivitäten

Der Test auf das Vorhandensein von kontaminierenden Fremdaktivitäten wurde in einer Lösung bestehend aus 10 mM Tris/HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTE durchgeführt.

Geeignete Proben der einzelnen Enzymfraktionen wurden mit den entsprechenden Nuklein säuren inkubiert. Sogenannte Nicking-Aktivität wurde durch Inkubation mit dem Plasmid pBR322 (1 µg) für 2-16 Stunden bei 37°C nachgewiesen. Unspezifische Nukleasen wurden durch Inkubation mit Lambda-DNA/EcoRI, HindIII (1 µg) für 2-16 Stunden bei 37°C nachgewiesen. Unspezifische RNasen wurden durch Inkubation mit MSII-RNA (5 µg) für 2-4 Stunden bei 37°C nachgewiesen.

Für den Test auf Kontamination mit Exonukleasen wurden die Proben mit 4 µg [3H]-markierter DNA für 4 Stunden bei 37°C inkubiert und danach die freigesetzten [3H]-markierten Nukleotide bestimmt.

6. Beispiel Reinigung und Funktionstest 6.1. AMV-RT aus E. coli LE392 pAMV-α_lacIq-Arg/pAMV-β_dnaY-His-Konstrukt 6.1.1. Reinigung

Als Ausgangsmaterial für die Reinigung der rekombinanten AMV-RT wurden E. coli-Zellen ver wendet, die beide Ketten der AMV-RT überexprimieren (siehe oben).

Die Reinigung der AMV-RT erfolgt bei 4°C. Das Reinigungsverfahren erfolgt nach Zellaufschluss und Abtrennung der Nukleinsäuren durch chromatographische Methoden. Das Reini gungsverfahren liefert eine rekombinante AMV-RT, die frei von kontaminierenden Enzymaktivitäten ist und in der RT-PCR die gleiche Funktionalität aufweist wie eine aus nativem Material gereinigte AMV-RT.

Puffer

Puffer A: 50 mM Tris/HCl, pH 7.9, 0.5 M KCl, 0.02% Triton X-100, 20% Glycerin.
Puffer B: 20 mM Tris/HCl, pH 7.9, 0.25 M KCl, 0.02% Triton X-100, 10% Glycerin.
Puffer C: 20 mM Tris/HCl, pH 7.9, 0.25 M KCl, 0.02% Triton X-100, 10% Glycerin, 1 M Imidazol.
Puffer D: 50 mM Tris/HCl, pH 8.2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.02% Triton X-100, 10% Glycerin.
Puffer E: 20 mM Kaliumphosphat, pH 7.1, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.02% Triton X-100, 10% Glycerin.
Lagerpuffer: 200 mM Kaliumphosphat, pH 7,2, 2 mM DTT, 0,2% Triton X-100, 50% Glycerin.

Aufschluß der Zellen

Ca. 50 g Zellen von E. coli LE392 (pAMV-α_lacIq-Arg/pAMV-β_dnaY-His) wurden mit 200 ml Puffer A versetzt, aufgetaut und suspendiert. Die Suspension wurde mit zwei Tabletten Complete (Roche Molecular Biochemicals, Cat. No. 1697498) versetzt. Anschließend erfolgte der Auf schluß der Zellen mittels Ultraschall (Branson Sonicator) unter Kühlung (Temperatur: < 10°C). Der erreichte Aufschlußgrad der Zellsuspension betrug typischerweise 40-50%.

Fällung von Nukleinsäuren

Anschließend erfolgte eine Entfernung der Nukleinsäuren mittels Polyminfällung. 5 ml einer 10 %-igen Polymin-P-Lösung wurden tropfenweise zugegeben. Bei unvollständiger Fällung erfolgte eine weitere tropfenweise Zugabe. Nach Inkubation für 30 min bei 4°C erfolgte eine Zentrifuga tion (30 min, 13000 upm, 4°C).

Chromatographische Reinigungen Affinitätschromatographie an Ni-Chelat-Säule

Der klare Zentrifugationsüberstand wurde mit Puffer B verdünnt (1 + 1) und auf eine mit Puffer B äquilibrierte und mit Nickel beladene Chelating Sepharose ff-Säule (2.6 cm × 10 cm, Phar macia) aufgezogen; danach wurde mit ca. 500 ml Puffer B, danach mit jeweils 200 ml Puffer B + 10 mM Imidazol und 200 ml Puffer B + 20 mM Imidazol gewaschen. Das Enzym wurde mit einem linearen Gradienten aus Puffer B + 20 mM Imidazol und Puffer C in einem Gesamtvolumen von 500 ml eluiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 5 ml pro Minute, die Fraktionsgröße 20 ml pro Fraktion. Das Enzym eluierte zwischen 50 mM und 200 mM Imidazol. Der Pool der akti ven Fraktionen wurde gegen Puffer D dialysiert.

Chromatographie an Heparin-Sepharose

Der dialysierte Pool wurde danach auf eine mit Puffer D äquilibrierte Heparin-Sepharose ff- Säule (1.6 cm × 10 cm, Pharmacia) aufgezogen und mit ca. 200 ml Puffer D, danach mit ca. 200 ml Puffer D + 300 mM KCl gewaschen. Die Elution des Enzyms erfolgte mit einem linearen Gra dienten aus Puffer D + 300 mM KCl und Puffer D + 1 M KCl in einem Gesamtvolumen von 200 ml. Die Fließgeschwindigkeit betrug 2.5 ml pro min, Fraktionsgröße 10 ml. Die AMV-RT elu ierte bei einer KCl-Konzentration von 500 mM bis 700 mM.

Chromatographie an S-Sepharose ff

Die RT-aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen Puffer E dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine mit Puffer E äquilibrierte S-Sepharose ff-Säule (1.6 cm × 10 cm, Pharmacia) geladen. Nach dem Waschen mit ca. 200 ml Puffer E wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten aus Puf fer E und Puffer E + 1 M KCl in einem Gesamtvolumen von 400 ml eluiert. Die Fließgeschwin digkeit war 2.5 ml pro Minute, die Fraktionsgröße 10 ml.

Chromatographie an Hydroxylapatit

Die RT-aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen Puffer E dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine mit Puffer E äquilibrierte HA-Ultrogel-Säule (1.6 cm × 10 cm, Biosepra) geladen. Nach dem Waschen mit ca. 200 ml Puffer E wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten aus Puffer E und Puffer E + 0.5 M Kaliumphosphat in einem Gesamtvolumen von 400 ml eluiert. Die Fließ geschwindigkeit war 2.5 ml pro Minute, die Fraktionsgröße 10 ml.

Die RT-aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen Lagerpuffer dialysiert. Das gereinigte Protein wurde mit SDS- und β-Mercaptoethanol-haltigen Auftragspuffer versetzt und die Probe durch Kochen (5 min 100°C) denaturiert. Anschließend wurde je 20 µl mittels eines analytisches SDS-Gels (4-20%) analysiert (Laemmli U. K., 1970, Nature 227: 555-557). Dabei wurden die α- und β-Untereinheiten der AMV-RT in äquimolaren Verhältnissen gefunden.

Die beschriebene Methode liefert eine stabile AMV-RT mit einer äquimolaren Verteilung der α- und β-Untereinheiten. Das erhaltene Enzym ist in der RT-PCR funktionsfähig.

6.1.2. Funktionstest in RT-PCR

Die erhaltene rekombinante AMV reverse Transkriptase wurde in einem Funktionstest unter sucht. Der Funktionstest bestand aus einer Reversen Transkription (RT), gekoppelt mit einer Polymerasekettenreaktion (PCR). Dazu wurden 5 Einheiten der rekombinanten AMV reverse Transkriptase analog der Enzym-Mischung des Titan TM One Tube PCR System (Cat. No 1888382, Roche Molecular Biochemicals) eingesetzt. Amplifiziert wurde ein 1.8 kb großes Frag ment des humanen Dystrophin-Genes. Als Template wurden 10 ng humane Muskel-RNA ver wendet. Verwendete Primer (400 nM) waren Dys Primer 2rev (5'-GAG TGA ATA CAG TTT GCC CAT GGA TTG-3') und Dys Primer 8for (5'-AAG AAG TAG AGG ACT GTT ATG AAA GAG AAG-3'). Das Target wurde mit folgendem Programm in einer RT-PCR amplifiziert: 50°C für 30 min, 94°C für 2 min, gefolgt von 10 Zyklen (94°C für 10 sec, 58°C für 30 sec, 68°C für 1 min 10 sec) und 20 Zyklen (94°C für 10 sec, 58°C für 30 sec, 68°C für 1 min 10 sec; + 10 sec/Zyklus). Anschließend bei 68°C für 7 min inkubiert. Die Reaktionsprodukte der RT-PCR wurden nach dem Abgestoppen auf einem 1%-igen Agarose-Gel aufgetrennt (Abb. 1).

Abb. 1 zeigt das Amplifikationsprodukt der RT-PCR mit einer Größe von 1.8 kb, erhalten mit nativ gereinigter AMV-RT (Spur 2) und rekombinant erhaltener AMV-RT (Spur 3). Die Spuren 1 und 4 zeigen einen DNA-Molekulargewichtsmarker VI (Cat. No. 1062590, Roche Mo lecular Biochemicals).

6.2. AMV-RT aus E. coli LE392 pAMVαβ-4 + pCHAP-5 Konstrukt 6.2.1. Reinigung

Als Ausgangsmaterial für die Reinigung der rekombinanten AMV-RT wurden E. coli LE392 pAMVαβ-4 + pCHAP-5 Zellen verwendet, die beide Ketten der AMV-RT überexprimieren (siehe oben).

Die Reinigung der AMV-RT erfolgt bei 4°C. Das Reinigungsverfahren erfolgt nach Zellaufschluss und Abtrennung der Nukleinsäuren durch chromatographische Methoden. Das Reinigungsver fahren liefert eine rekombinante AMV-RT, die frei von kontaminierenden Enzymaktivitäten ist und in der RT-PCR die gleiche Funktionalität aufweist wie eine aus nativem Material gereinigte AMV-RT.

Puffer

Puffer A: 50 mM NaPO₄

, pH 7.2, 1 M NaCl, 3 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin.
Puffer B: 50 mM NaPO₄

, pH 5,0, 1 M NaCl, 3 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin
Puffer C: 50 mM NaPO₄

, pH 6,0, 1 M NaCl, 3 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin
0,2 M Imidazol.
Puffer D: 50 mM NaPO₄

, pH 7,7, 1 M NaCl, 3 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin
0,5 M Imidazol.
Puffer E: 50 mM NaPO₄

, pH 6,0, 3 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin
Lagerpuffer: 200 mM Kaliumphosphat pH 7,2, 2 mM DTT, 0,2% Triton X-100, 50% Glycerin.

Aufschluß der Zellen

Ca. 50 g Zellen von E. coli LE392 pAMVαβ-4 + pCHAP-5 wurden mit 400 ml Puffer A versetzt, aufgetaut und suspendiert. Die Suspension wurde mit zwei Tabletten Complete (Roche Molecu lar Biochemicals, Cat. No. 1697498) versetzt. Anschließend erfolgte der Aufschluß der Zellen mittels Ultraschall (Branson Sonicator) unter Kühlung (Temperatur: < 10°C). Der erreichte Auf schlußgrad der Zellsuspension betrug typischerweise 40-50%.

Fällung von Nukleinsäuren

Chromatographische Reinigungen Affinitätschromatographie an Ni-Chelat-Säule

Der klare Zentrifugationsüberstand wurde auf eine mit Puffer A äquilibrierte und mit Nickel beladene Chelating Sepharose ff-Säule (2.6 cm × 10 cm, Pharmacia) aufgezogen; danach wurde mit ca. 500 ml Puffer A, danach mit jeweils 500 ml Puffer B und 500 ml Puffer C gewaschen. Das Enzym wurde mit Puffer D in einem Gesamtvolumen von 500 ml eluiert. Die Fließgeschwindig keit betrug 5 ml pro Minute, die Fraktionsgröße 20 ml pro Fraktion. Der Pool der aktiven Frak tionen wurde gegen Puffer E dialysiert.

Chromatographie an Heparin-Sepharose

Der dialysierte Pool wurde danach auf eine mit Puffer E + 250 mM NaCl äquilibrierte Heparin- Sepharose ff-Säule (1.6 cm × 10 cm, Pharmacia) aufgezogen und mit ca. 200 ml Puffer E + 250 mM NaCl gewaschen. Die Elution des Enzyms erfolgte mit einem linearen Gradienten aus Puffer E und 250 mM NaCl und Puffer E und 1 M NaCl in einem Gesamtvolumen von 200 ml. Die Fließgeschwindigkeit betrug 2.5 ml pro min, Fraktionsgröße 10 ml. Die AMV-RT eluierte bei einer NaCl-Konzentration von 500 mM bis 700 mM.

Die RT-aktiven Fraktionen wurden gepoolt und gegen Lagerpuffer dialysiert. Das gereinigte Protein wurde mit SDS- und 2-Mercaptoethanol-haltigen Auftragspuffer versetzt und die Probe durch Kochen (5 min 100°C) denaturiert. Anschließend wurde je 20 µl mittels eines analytisches SDS-Gels (4-20%) analysiert (Laemmli U. K., 1970, Nature 227: 555-557). Dabei wurden die α- und β-Untereinheiten der AMV-RT in äquimolaren Verhältnissen gefunden. (Abb. 2, Spur 6).

Abb. 2 zeigt ein SDS-Gel mit Proben aus der AMV-RT Aufreinigung.
Spur 1: Molekulargewichtsmarker
Spur 2: AMV nativ
Spur 3: Zellaufschluss
Spur 4: Ni-Chelat Sepharose, Wasch mit Puffer C
Spur 5: Ni-Chelat Pool
Spur 6: AMV-RT rec., Endpräparat.

Die beschriebene Methode liefert eine stabile AMV-RT mit einer äquimolaren Verteilung der α- und β- Untereinheiten. Das erhaltene Enzym ist in der RT-PCR funktionsfähig.

6.2.2. Funktionstest in RT-PCR

Die erhaltene rekombinante AMV reverse Transkriptase wurde in einem Funktionstest unter sucht. Der Funktionstest bestand aus einer reversen Transkription (RT), gefolgt von einer Poly merasekettenreaktion (PCR). Dazu wurden 10 Einheiten der rekombinanten AMV reverse Transkriptase eingesetzt. Amplifiziert wurde ein 8 kb, 10 kb, 12 kb und ein 13,5 kb großes Frag ment des humanen Dystrophin-Genes.

Als Template wurden 1 µg humane Muskel-RNA verwendet. Verwendete Primer (400 nM) wa ren Dys Primer 2 for (5'-CAA TCC ATG GGC AAA CTG TAT TCA CTC-3') und Dys Primer 5 rev (5'-CGT CCC GTA TCA TAA ACA TTC AGC AGC-3') für 8 kb, Dys Primer 8 for (5'-AAG AAG TAG AGG ACT GTT ATG AAA GAG AA-3') und 5 rev für 10 kb, Dys Primer 8 for und Dys Primer 9 rev (5'-AGC AGG TAA GCC TGG ATG ACT GAC TAG AAG-3') für 12 kb und Dys Primer 8 for und 10 rev (5'-AAT CAA TCA ACC AAC CGA AAT CTC ACT CTG- 3') für 13,5 kb. Die cDNA Synthese erfolgt bei 42°C für 60 min.

Die Durchführung der cDNA Synthese erfolgte nach Vorgaben der Produktinformation für AMV reverse Transcriptase (Cat. No. 1495062, Roche Molecular Biochemicals).

Für die PCR wurde das Expand Long Template PCR System (Cat. No. 1681834, Roche Molecular Biochemicals) verwendet. Das Target wurde mit folgendem PCR-Programm amplifiziert: 94°C für 2 min, gefolgt von 10 Zyklen (94°C für 10 sec, 60°C für 30 sec, 68°C für 10 min) und 20 Zyklen (94°C für 10 sec, 60°C für 30 sec, 68°C für 10 min 10 + 10 sec/Zyklus). Anschließend bei 68°C für 5 min inkubiert. Die Reaktionsprodukte der RT-PCR wurden nach dem Abgestoppen auf einem 1%-igen Agarose-Gel aufgetrennt (Abb. 3). Die Spuren 3 und 6 zeigen einen DNA- Molekulargewichtsmarker X (Cat. No. 1498037, Roche Molecular Biochemicals).

Abb. 3 zeigt ein Agarose-Gel, auf dem die Reaktionsprodukte der RT-PCT mit rekomb. AMV-RT aufgetrennt wurden; Spur 1: 8 Kb Amplifikationsprodukt, Spur 2: 10 Kb Amplifika tionsprodukt, Spur 3: DNA Längenstandard X, Spur 4: 12 Kb Amplifikationsprodukt, Spur 5: 13,5 Kb Amplifikationsprodukt, Spur 6: DNA Längenstandard X.

SEQUENCE LISTING

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer aktiven heterodimeren AMV-RT in prokaryotischen Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine oder mehrere DNA-Sequenz(en), die für die α- und/oder β-Kette der AMV-RT kodieren, in Expressionsplasmide kloniert werden,
b) die Expressionsplasmide in prokaryotische Zellen transformiert werden,
c) die lösliche Expression der heterodimeren AMV-RT induziert wird und
d) die rekombinante heterodimere AMV-RT aus den Zellen isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die α- und β-Kette kodierenden DNA-Sequenzen auf getrennten Expressionsplasmiden kloniert in einer Zelle exprimiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für α- und β-Kette ko dierenden DNA-Sequenzen auf einem Expressionsplasmid kloniert in einer Zelle expri miert werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die α- als auch die β-Kette mit einer Peptidsequenz fusioniert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die α- oder β-Kette mit einer Peptidsequenz bestehend aus 2 bis 10 Argininresten und die β- oder α-Kette mit einer Peptidsequenz bestehend aus 2 bis 10 Histidinresten fusioniert sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die für die α- und β-Kette kodierenden DNA-Sequenzen, die mit für zur reversiblen Bindung befähigte Peptidsequenzen kodierenden DNA-Sequenzen verbunden sind, auf einem Expressions plasmid kloniert in einer Zelle exprimiert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß α- und β- Kette mit der gleichen zur reversiblen Bindung befähigten Peptidsequenzen fusioniert sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß α- und β-Kette jeweils mit einer Peptidsequenz bestehend aus 2 bis 10 Histidinresten fusioniert sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Expres sion bei einer Wachstumstemperatur von 10° bis 25°C und einer erniedrigten Induktor konzentration erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Expres sion durch Coexpression von Hilfsgenen gesteigert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Hilfsgen das trpT-Gen, das für die Tryptophan-tRNA kodiert, verwendet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression durch Coex pression von Chaperongenen erhöht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene für GroEL und GroES, Dnak und DnaJ, GrpE und/oder ClpB coexprimiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene für GroEL und GroES auf dem Expressionsplasmid, das auch die Gene für die α- und die β-Kette trägt, kloniert sind und die Gene für Dnak, DnaJ, GrpE und ClpB auf einem Helferplas mid kloniert sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Isolierung bzw. Aufreinigung der rekombinanten heterodimeren AMV-RT geeignete Affinitäts chromatographiematerialien verwendet werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Aufreinigung ver wendeten Affinitätschromatographiematerialien die unterschiedlichen, an die α- und/oder β-Kette gebundenen Peptidsequenzen, reversibel gebunden.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Aufreinigung verwendeten Affinitätschromatographiematerialien metallionenchelatisierende Materialien oder Kationenaustauscher sind.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Sequenz SEQ ID NO: 5 oder die DNA-Sequenzen SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 in einer prokaryotischen Wirtszelle exprimiert werden.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli als Wirtszelle verwendet wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die aktive heterodimere AMV-RT aus den Untereinheiten SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 be steht.

21. Verwendung einer nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 20 erhältlichen AMV-RT zur Amplifikation von RNA-Sequenzen.