DE69531023T2

DE69531023T2 - Hochgereinigte rekombinante reverse Transkriptase

Info

Publication number: DE69531023T2
Application number: DE69531023T
Authority: DE
Inventors: Daniel Louis San Diego Kacian; Michael Garth San Diego Riggs; James Garfield San Diego Putnam
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1994-04-01
Filing date: 1995-04-03
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: CA2186018A1; KR100262258B1; US5998195A; US5935833A; EP0688870B1; JPH09508806A; WO1995027047A3; AU2237195A; WO1995027047A2; JP3808501B2; ATE242811T1; DE69531023D1; AU696497B2; KR970702362A; ES2199967T3; EP0688870A1; CA2186018C

Description

Hintergrund der Erfindung
Retroviren sind eine Gruppe von Viren, deren genetisches Material aus Einzelstrang-RNA besteht. Nach Adsorption und Eintritt der retroviralen RNA in die Wirtszelle dient die virale RNA als Template für die Synthese eines komplementären DNA-Strangs. Die DNA wird dann durch die Aktion eines Enzyms mit DNA-Polymeraseaktivität doppelsträngig gemacht; es ist diese Doppelstrang-DNA, die sich in das Wirtsgenom einfügt. Die RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, die für die Synthese der komplementären DNA aus dem viralen RNA-Template verantwortlich ist, wird allgemein „reverse Transkriptase" genannt.
Retroviren sind von besonderem Interesse, weil eine Anzahl von Retroviren als verursachende Wirkstoffe mit verschiedenen Krebsarten und anderen Krankheiten in Verbindung gebracht wurden. Ein Retrovirus, das menschliche Immunschwächevirus, ist der ursächliche Wirkstoff des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS). Zusätzlich sind die reversen Transkriptaseenzyme selbst wichtige Reagenzien in der molekularen Biologie aufgrund ihrer Fähigkeit, komplementäre DNA aus nahezu jedem RNA-Template zu bilden, geworden. Daher wird die reverse Transkriptase allgemein verwendet, um Nukleinsäuren für Hybridisationsproben herzustellen und um eine einzelsträngige RNA in eine doppelsträngige DNA für anschließendes Klonen und Expression umzuwandeln.
Kürzlich sind reverse Transkriptasen als eine Komponente von Transkriptions-basierten Amplifikationssystemen verwendet worden. Diese Systeme amplifizieren RNA- und DNA-Zielsequenzen bis zu einer billiardemal. Siehe z. B. Burg et al., PCT Patentanmeldung WO 89/01050 (1988); Gingeras et al., PCT Patentanmeldung WO 88/10315 (1988); Davey und Malek, Europäische Patentanmeldung EPO 0329822 (1988); Gingeras et al., Europäische Patentanmeldung EPO 0373960 (1989); Malek und Davey, PCT Patentanmeldung WO 91/02814 (1989); Kacian und Fultz, Europäische Patentanmeldung EPO 0408295 A2 (1990).
Einige der Transkriptions-basierten Amplifikationsverfahren sind außergewöhnlich komfortabel, da die Amplifikationsreaktion nach diesen Verfahren isotherm ist. Daher sind diese Systeme besonders für den routinemäßigen klinischen Laboratoriumsgebrauch in diagnostischen Tests geeignet. Der Nachweis von Pathogenen, die infektiöse Krankheiten verursachen und von Gensequenzen, die mit Krebs oder genetischen Defekten im Zusammenhang stehen, sind die wichtigsten Anwendungen von solchen Tests. Reverse Transkriptasen werden auch als Anfangsschritt in einigen Protokollen eingesetzt, wenn die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet wird, um ein RNA-Ziel zu amplifizieren. Siehe Malek et al., U.S. Patent Nr. 5,130,238 (1992); und Mocharla et al., Gene 99: 271–275 (1990). In diesen „RT-PCR"-Verfahren wird die reverse Transkriptase verwendet, um eine Kopie einer anfänglich komplementären DNA (cDNA) des RNA-Ziels, das dann durch sukzessive Cyclen der DNA-Replikation amplifiziert wird, zu bilden.
Die retroviralen reversen Transkriptasen haben drei enzymatische Aktivitäten: eine RNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität, eine DNA-gerichtete DNA-Polymeraseaktivität und eine RNAse-H-Aktivität. Siehe Verma, The Reverse Transcriptase, Biochim. Biophys. Acta 473: 1–38 (1977). Die letztgenannte Aktivität baut spezifisch die in einem RNA : DNA-Doppelstrang enthaltene RNA ab. Der Abbau des RNA-Strangs aus RNA : DNA-Intermediaten durch RNAse-H ist ein wichtiger Bestandteil von einigen Transkriptions-basierten Amplifikationssystemen und ist von einem ungewolltem Abbau durch verunreinigende Nukleasen, die die Amplifikation beeinflussen, zu unterscheiden.
Ein Nachteil der Transkriptions-basierten Amplifikationssysteme ist deren Empfindlichkeit selbst gegenüber Spurenmengen von Nukleasen. Da eine Anzahl bedeutender Krankheiten Proben hervorbringen kann, die sehr wenige Zielnukleinsäuremoleküle enthalten, ist der Nachweis kleiner Mengen dieses Ziels für eine sorgfältige und zeitige Diagnose oft schwierig. Tatsächlich ist der Wert von Ziel-Amplifikationsverfahren am bedeutendsten, wenn die Anzahl der Zielmoleküle klein ist. Bei kleinen Eingabemengen der Zielnukleinsäuren kann ein ungewollter Abbau von RNA-Zielen oder RNA- oder DNA-Reaktionsintermediaten zu Amplifikationsfehlern und anschließend zur Falschdiagnose führen. Eine Ribonuklease-Kontamination ist auch in RT-PCR-Reaktionen ein Problem, da der Verlust des RNA-Ziels zu einem Amplifikationsfehler führen kann.
Ribonukleasen sind relativ allgegenwärtig und werden insbesondere in einer Reihe von biologischen Materialien in hohen Konzentrationen gefunden, einschließlich in Präparaten von Retroviren und in Zellen, die allgemein zur Expression rekombinanter Proteine verwendet werden. Ribonukleasen verunreinigen häufig reverse Transkriptase-Präparate aus einer Reihe von Quellen und es wurde berichtet, daß sie die Synthese von cDNAs, die Herstellung von Proben und andere Anwendungen neben der Ziel-Amplifikation alleine beeinflussen. Oft ist ein RNase-Inhibitor in der Reaktion enthalten, um die schädlichen Effekte dieser Verunreinigung zu minieren. Siehe z. B., Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 8.11–8.13 (2. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Jedoch sind eine Anzahl von Substanzen, die gewöhnlich verwendet werden, um RNAsen zu hemmen oder zu inaktivieren, einschließlich Detergentien, Chaotrope, organische Materialien, Metalle, Proteasen und Metalle, nicht zur Anwendung in Amplifikationssystemen geeignet, da sie auch die Enzyme, die für die Amplifikation verwendet werden, hemmen. RNAse-hemmende Proteine wie menschlicher Plazenta-RNAse-Inhibitor, Blackburn et al., J. Biol. Chem. 252: 5904 (1977), oder Rattenleber RNAse-Inhibitor, Gribnau et al., Arch. Biochem. Biophys. 130: 48–52 (1969), können zersetzlich sein, sind teuer und können zusätzliche beeinflussende Substanzen wie Nukleinsäuren und RNAsen, die nicht durch den Inhibitor gehemmt werden, mit einbringen.
Zusätzlich zu den Nukleasen können Spuren von anderen Enzymen, Nukleinsäuren und verschiedene Puffersalze die Amplifikationsreaktionen beeinflussen. Da diese Substanzen aufgrund der Natur der Amplifikationsreaktion für viele Anwendungen der reversen Transkriptase lediglich unerwünscht sind, ist es entscheidend, daß das Enzym-Präparat eine so geringe Menge von ihnen wie möglich enthält.
Die Isolierung und Reinigung reverser Transkriptase aus verschiedenartigen Quellen wurde berichtet. In den Fällen, wo das Enzym direkt aus Virenpartikeln, Zellen oder Geweben isoliert wird, sind die Kosten für eine breite kommerzielle Anwendung in diagnostischen Tests zu hoch. Siehe z. B. Kacian et al., Biochim. Biophys. Acta 46: 365–83 (1971); Yang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 47: 505–11 (1972); Gerard, et al., J. Virol. 15: 785–97 (1975); Liu et al., Arch. Virol. 55 187–200 (1977); Kato et al., J. Virol. Methods 9: 325–39 (1984); Luke, et al. Biochemistry 29: 1764–69 (1990); Le Grice et al., J. Virol. 65: 7004–07 (1991). Außerdem haben diese Verfahren die Entfernung von Substanzen, die wesentliche Inhibitoren oder Verunreinigungen sind und die die Anwendung reverser Transkriptase in Zielamplifikations-Reaktionen beeinflussen, nicht sichergestellt. Eine andere wichtige Überlegung bei der Anwendung reverser Transkriptasen für eine Reihe von Zwecken ist die mit dem Enzym verbundene RNAse-H-Aktivität. Das Ausmaß der RNAse-H-Aktivität und die Art, in der die RNAse-H-Aktivität in Koordination mit den RNA- und DNA-abhängigen reversen Transkriptaseaktivitäten arbeitet, sind wichtige Merkmale, die die Brauchbarkeit des Enzyms für verschiedene Zwecke einschließlich der Transkriptions-basierten Amplifikationssysteme beeinflussen. Zuviel oder zuwenig Aktivität, die falsche Art von Aktivität (wie etwa nichtspezifische RNAsen), oder Aktivitäten, die wenig mit der DNA-Synthese koordiniert sind, können alle zu einem verminderten Ergebnis in einer bestimmten Anwendung führen. Die richtige Balance der synthetisierenden und abbauenden Aktivitäten muss eingehalten werden; dies ist nicht nur eine Funktion des speziell verwendeten reversen Transkriptaseenzyms, sondern ist auch von der Fähigkeit des Reinigungsprotokolls, die RNA- und/oder DNA-abbauenden Aktivitäten zu entfernen, abhängig.
Das Klonen und die Expression von reversen Transkriptasen in bakteriellen Wirten ist kürzlich berichtet worden. Versuche, reverse Transkriptase vom Vogel-Myeloblastosis-Virus (AMV-RT) zu klonen und exprimieren, führten nicht zur Produktion bedeutender Mengen des gereinigten Enzyms. Das ist offensichtlich aufgrund der Tatsache so, daß das AMV-RT aus zwei Polypeptidketten, den α- und β-Ketten, besteht, die eine dimere Struktur bilden und spezifische post-translationale Modifikationen durchlaufen müssen, um ein vollaktives Enzym zu produzieren. Diese gleichen Modifikationen treten nicht auf, wenn das Gen in E. coli exprimiert wird.
Im Gegensatz zu den Vogel-viralen RTs bestehen viele von Säugetierviren abgeleitete reverse Transkriptasen aus nur einer Polypeptidkette; Bemühungen, diese Enzyme zu klonen und zu exprimieren, sind erfolgreicher gewesen. Insbesondere Goff et al., U.S. Patent 4,943,531 (1990) und Kotewicz et al., U.S. Patent Nr. 5,017,492, haben Verfahren für die Reinigung einer reversen Transkriptase, die vom Moloney-Murine-Leukämie-Virus (MMLV-RT) abgeleitet und in E. coli exprimiert wurde, beschrieben, wobei die Verfahren die Grundlage für die Mehrzahl der kommerziellen reversen Transkriptasepräparate bilden.
Viele kommerzielle reverse Transkriptase-Präparate erwiesen sich für die Anwendung in der Zielamplifikation und für andere Zwecke aufgrund von Nukleaseverunreinigung als ungeeignet. Siehe Sambrook, oben; Ryskov et al., Mol. Biol. Rep. 8: 213–16 (1982). Andere Probleme mit kommerziellen Präparaten von MMLV-RT können mit einer veränderten Koordination zwischen der DNA-Synthese und den RNAse-H-Aktivitäten des gereinigten Enzyms, mit einer verminderten Fähigkeit sich an der Primerstelle anzubinden und eine Synthese zu initiieren oder sich durch Regionen mit dichter Sekundärstruktur zu lesen in Verbindung stehen oder können alternativ auf DNAse oder eine andere Proteinverunreinigung zurückzuführen sein. Siehe Agronovsky, A. A., Anal. Biochem. 203: 163–65 (1992). Außerdem zeigen kommerzielle Präparate, die unter Anwendung der früher verfügbaren Verfahren zur Reinigung hergestellt wurden, signifikante lot-to-lot-Variabilität.
Ferner ist teilweise aufgrund der angewendeten sehr langen und laborintensiven Reinigungen, der Unkosten für die für den Scale-up verwendeten Reagenzien und der Ausrüstung und der geringen Ausbeuten der Enzyme der Preis solcher Enzyme für ihre breite kommerzielle Anwendung in Zielamplifikations-Systemen hinderlich.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Form der reversen Transkriptase bereitzustellen, die die richtige Balance von DNA-Syntheseaktivitäten und RNAse-H-abbauenden Aktivitäten hat und dabei insbesondere für die Anwendung in Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahren geeignet ist.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, eine geeignete reverse Transkriptase-Quelle, die geringe Mengen Verunreinigungen, wie etwa unerwünschte RNAsen, die die Transkriptions-basierten Amplifikationsreaktionen beeinflussen, enthält, durch Klonen und Exprimieren eines für ein MMLV-RT-Enzym kodierendes Gen mit diesen Eigenschaften in einem E. coli-Wirt, bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die mit dem Enzym vor und nach der Reinigung verknüpften RNAse-Aktivitäten durch Klonen und Exprimieren des MMLV-RT-Gens in einem Ribonuklease-aktivitätsarmen Stamm von E. coli zu reduzieren.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Reinigungsschema für die Isolierung des Enzyms zu entwickeln.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren für die Reinigung des Enzyms, die hohe Reinheits-Grade der RT bei niedrigen Kosten erreichen, bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zum Herstellen einer reversen Transkriptase, das die Schritte umfasst:

a. Konstruieren eines Plasmids, welches eine Nukleinsäuresequenz, die vom Moloney-Murine-Leukämie-Virus (MMLV) abgeleitet ist und die für ein einzelnes kovalent gebundenes Aminosäure-Kettenpolypeptid mit RNA-gerichteten und DNA-gerichteten DNA-Polymeraseaktivitäten und mit der gleichen Anzahl von Aminosäureresten, wie sie in reifer nativer MMLV-Reverser Transkriptase vorhanden sind, kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz degenerierte Codons, bevorzugt von E. coli und kodierend für Aminosäuren an den Positionen 2, 3 und 4 der reifen nativen MMLV-Reversen Transkriptase, umfasst, mindestens einen auswählbaren Gen-Marker, eine Promotorsequenz, und einen Replikationsanfang, der geeignet ist, eine autonome Replikation des Plasmids innerhalb einer Wirtszelle zu fördern, umfasst;
b. Einbringen des Plasmids in eine Wirtszelle mit reduzierter Expression der RNAse-Aktivität;
c. Wachsenlassen der das Plasmid enthaltenden Wirtszelle in einem flüssigen Kulturmedium unter Bedingungen, die geeignet sind, die Zellteilung und Expression der Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid kodieren, zu fördern;
d. dann Lysieren einer Vielzahl von Wirtszellen, um ein Zelllysat zu formen; und
e. Abtrennen des Polypeptids von dem Zelllysat.

Die vorliegende Erfindung bietet auch das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Enzym sowie eine das Enzym umfassende Zusammensetzung.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren zur Reinigung des aus den Wirtszellen erhaltenen Enzyms ein, wobei solche Verfahren geeignete Wachstumsmedien, Fermentations-Bedingungen, Ernten und Lagerung der Zellen, Zelllyse und Chromatographie umfassen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch das durch die Expressionsvektoren produzierte Enzym, Wirtszellen und Reinigungsprozeduren der vorliegenden Erfindung. Das Enzym ist hochgereinigt und zur Anwendung in der Nukleinsäure-Amplifikation und andere gentechnische Prozeduren geeignet.
Schließlich bietet die vorliegende Erfindung den Gebrauch des durch die hierin beschriebenen Verfahren produzierten Enzyms für die Synthese von komplementärer DNA für eine Reihe von Zwecken, erwähnenswerterweise in Transkriptions-basierten Amplifikation- und RT-PCR-Reaktionen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Konstruktion des Plasmids pUC18N.
2: Verwendete Oligonukleotide, um das Plasmid pUC18N zu konstruieren.
3: Ausrichtungen der Ribosom-Bindungsstellen.
4: Verwendete Oligonukleotide, um die Ribosombindungsstelle und die Spacerregion zu modifizieren.
5: Konstruktion des Plasmids pUC18 MMLV Sst-Hind.
6: Konstruktion des Plasmids pUC18 MMLV III tailed.
7: Verwendete Oligonukleotide, um das Plasmid pUC18 MMLV tailed zu konstruieren.
8: Konstruktion des Plasmids pUC18N MMLV Gly und pUC18N MMLV Gly Tet(-).
9: Konstruktion des Plasmids pUC18N SD9D MMLV Gly und pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(-).
10: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gel-Photo von P-11 und Sephacryl-S-200-Fraktionen gereinigter MMLV-RT.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Die folgenden hierin verwendeten Ausdrücke haben die angezeigten Bedeutungen, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
Mit „selektierbares Marker-Gen" ist ein für ein Gen kodierendes DNA-Fragment gemeint, das, wenn es von einer Wirtszelle getragen und exprimiert wird, dieser Wirtszelle im Vergleich mit Zellen, die das selektierbare Markergen nicht enthalten, einen Vorteil im Wachstum verleihen kann, wenn beide in einem Kulturmedium mit gegebener Zusammensetzung gezüchtet werden. Zum Beispiel wird das für β-Lactamase kodierende Gen eine Ampicillinresistenz auf die Wirtszellen, die dieses Gen enthalten, übertragen, wohingegen Zellen, die nicht dieses Gen enthalten, empfindlich gegenüber Ampicillin sein werden; daher werden nur Zellen, die das Gen für β-Lactamase exprimieren, in Medien, die Ampicillin enthalten, wachsen. Ähnlich werden Zellen, die nicht fähig sind, eine essentielle Aminosäure zu katabolisieren, nicht in Medien, die nicht diese Aminosäure enthalten, wachsen, wohingegen Zellen, die ein Gen enthalten, das der Zelle erlaubt, die essentielle Aminosäure herzustellen, in den gleichen Medien wachsen werden.
Ein selektierbares Marker-Gen kann an ein oder mehrere andere Gene oder ein genetisches Element, z. B. in einem Plasmid oder einem Expressionsvektor, als Mittel zur Identifizierung von Zellen, die sowohl das selektierbare Gen als auch das(die) „stille(n)" Gen (e) und/oder das(die) genetisch(en) Element (e) enthalten, kovalent gebunden sein.
Mit einer „gereinigten" Nukleinsäure oder Protein ist eine Nukleinsäure oder ein Protein gemeint, die/das mindestens einem Schritt unterworfen wurde, der zelluläre Komponenten wie etwa Kohlenhydrate, Fette, unerwünschte Nukleinsäuren oder unerwünschte Proteine von der genannten Nukleinsäure oder dem Protein entfernt.
Mit „aufwärts" ist die Richtung zur 5'-Seite eines gegebenen Ortes auf einem Nukleinsäurestrang oder im Falle eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls die Richtung zur 5'-Seite eines bestimmten Ortes unter Berücksichtigung der Richtung der Gentranskription in dieser Region des Nukleinsäuremoleküls gemeint.
Mit „abwärts" ist die Richtung zur 3'-Seite eines gegebenen Ortes auf einem Nukleinsäurestrang oder im Falle eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls die Richtung zur 3'-Seite eines bestimmten Ortes unter Berücksichtigung der Richtung der Gentranskription in dieser Region des Nukleinsäuremoleküls gemeint.
Mit „T_m" ist die Temperatur gemeint, bei der 50% einer Population von doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle oder von Nukleinsäuremolekülen mit einer doppelsträngigen Region einzelsträngig oder thermisch zersetzt werden.
Mit „rekombinant" ist gemeint, dass ein Nukleinsäuremolekül oder Protein mindestens teilweise das Resultat einer in vitro-biochemischen Technik ist. Ein "rekombinantes DNA-Molekül" ist daher ein nicht natürlicherweise auftretendes Molekül. Solche rekombinanten Moleküle enthalten Moleküle, aber sind nicht darauf beschränkt, die Restriktions-Endonuklease-Fragmente, in-vitro- Nukleinsäure-Ligationsprodukte, in-vitro-Exonuklease-Fragmente und Expressionsvektoren, die heterologe genetische Elemente wie etwa ein oder mehrere der folgenden umfassen: Promotoren, Repressor-Gene, selektierbare Marker-Gene, temperaturempfindliche DNA-Replikationselemente, strukturelle Gene und ähnliches.
„Rekombinante" Proteine oder Enzyme sind solche, die nicht in der Natur gefunden werden. Diese schließen gereinigte Proteinpräparate und von rekombinanten DNA-Molekülen hergestellte Proteine ein. Die letztgenannten Proteine werden üblicherweise in einer heterologen Wirtszelle exprimiert, d. h. in einer zu dem in Frage kommenden Protein oder Enzym nicht-Nativen. Jedoch kann das für ein rekombinantes Protein kodierende Gen auf einem Expressionsvektor angeordnet sein, der in einer Wirtszelle der gleichen Art enthalten ist wie jener Organismus, von welchem das in Frage kommende Protein abgeleitet wurde.
Mit „trunkiert" ist eine kleinere Version des in Frage kommenden Gens oder Proteins gemeint; hinsichtlich der primären Nukleotid- oder Aminosäuresequenz ist eine beschnittene Form einer Referenznukleinsäure oder eines Proteins eine, der ein oder mehrere Nukleotide oder Aminosäuren im Vergleich zum Referenzmolekül fehlen.
Mit „wesentlicher Sequenzhomologie" ist gemeint, dass eine erste Nukleinsäure oder ein Proteinmolekül eine erkennbare, nicht zufällige Ähnlichkeit mit einer zweiten Referenznukleinsäure oder einem Protein über mindestens etwa 89% seiner Nukleotid- oder Aminosäuresequenz hat.
Mit Nukleinsäure- oder Protein-„Domäne" ist mindestens eine definierte Region von kontinuierlichen Nukleotid- oder Aminosäureresten gemeint.
Mit „Ursprung der Replikation" ist eine spezifische DNA-Region, an der die Primer-Produktion und die Initiation der DNA-Polymeraseaktivität beginnt, gemeint. In dieser Beschreibung wird der Ausdruck verwendet, um ein auf einem DNA-Expressionsvektor vorhandenes Nukleinsäureelement, das dem Expressionsvektor ermöglicht, in der Anzahl der Kopien innerhalb einer gegebenen Wirtszelle anzusteigen, zu bezeichnen.
Mit „Promotor" ist ein Genelement gemeint, das eine spezifische DNA-Region umfasst, an der ein RNA-Polymeraseenzym binden und die Transkription eines DNA-Templates beginnen kann, und somit den ersten Schritt der Translation der in der Nukleinsäuresequenz enthaltenen genetischen Information für die Produktion eines Proteins mit einer Aminosäuresequenz, die der Nukleinsäuresequenz entspricht, bereitstellt.
Mit „Expression", „Genexpression" oder „Proteinexpression" ist die Produktion von Proteinen aus Informationen, die innerhalb eines Gens enthalten sind, durch einen Wirtsorganismus gemeint.
Mit „Transformation" ist eine biochemische Methode gemeint, die eine Wirtszelle so induziert, daß sie ein Nukleinsäuremolekül in sich aufnimmt. Solche Nukleinsäuremoleküle sind üblicherweise genetische Elemente, die mindestens einen Replikationsanfang, ein selektierbares Marker-Gen und einen Promotor für die Expression des selektierbaren Marker-Gens in der Wirtszelle umfassen.
Mit „heterolog" ist nicht von der gleichen Spezies gemeint. Daher wird ein Enzym, das in einer heterologen Wirtszelle exprimiert wird, in einer Wirtszelle einer anderen als derjenigen Spezies, von der das Enzym ursprünglich abgeleitet wurde, produziert.
Mit „Gen" ist eine Nukleinsäureregion mit eine Nukleotidsequenz, die für ein exprimierbares Protein oder Polypeptid kodiert, gemeint. Ein Gen kann ein oder mehrere „Kodiersequenzen" umfassen, die den Aminosäureresten des exprimierten Proteins entsprechende Kodons enthalten. Das Gen kann auch umfassen, muss aber nicht umfassen, ein oder mehrere nicht kodierende Nukleotidsequenzregionen, die keine den Aminosäureresten des exprimierten Proteins entsprechende Kodons enthalten.
Alle biochemischen Techniken, die für die Konstruktion und Evaluation des MMLV-RT-Expressionsvektors verwendet werden, einschließlich von, aber nicht darauf beschränkt, Restriktions-Verdauungsprotokollen, Gelelektrophorese, Southern-blot und DNA-Modifikationsreaktionen, sind dem Durchschnittsfachman bekannt und werden bei Sambrock et al., oben, beschrieben. Zusätzlich werden viele von diesen Techniken in der WO-Anmeldung 95/27067 beschrieben.
I. Konstruktion des Klonvektors
a. Plasmid pUC18N
Das Plasmid pUC18 (Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) wurde als Stammvektor verwendet. Die Klone wurden durch Restriktions-Kartierungs-Techniken auf Agarosegelen gescreent; solche Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt. Eine Nco-I-Restriktonsstelle wurde zwischen der lac Z Ribosombindungsstelle und der Eco RI Restriktionsstelle von pUC18 durch die Schaffung einer Substitution von zwei Nukleotidbasen, wie in 1 gezeigt, eingeführt. Die Mutationen wurden durch Verwendung der zwei synthetischen Oligonukleotide, in 2 als Oligonukleotide 1 und 2 (SEQ ID NO: 1 and 2) gezeigt, eingefügt. Wie gezeigt, überlappen die Oligonukleotide mit 30 Basenpaaren an ihrem 3'-Ende. Die Oligonukleotide läßt man hybridisieren, eingefügt mittels des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase I und abgebaut mit Pvu II und Eco RI. Das Plasmid pUC18 wurde mit Eco RI abgebaut und teilweise mit Pvu II abgebaut, um zwei DNA-Fragmente zu erhalten: Ein größeres Fragment, das das intakte Ampicillin-Resistenzgen (Amp), den Ursprung der Replikation (Ori) und einen Teil des lac-Z-Gens einschließt. Das kleinere Eco RI-Pvu II Fragment bestand aus dem Teil des lac Z-Gens, der den Positionen 450 bis 628 der pUC18-Karte entspricht. Das synthetische Eco RI-Pvu II Fragment wurde in das größere Vektorfragment eingefügt, ligiert und verwendet, um den E. coli-Stamm JM 109 zu transfomieren. Klone, die sorgfältig konstruierte Vektoren enthalten, produzieren eine blaue Farbe mittels eines X-gal-Substrats (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) als ein Substrat, das anzeigt, dass das lac-Z-Gen sorgfältig rekonstruiert wurde. Diese Ergebnisse wurden ferner durch Restriktions-Kartierung bestätigt. Dieser Vektor wurde pUC18N genannt. (Siehe 1).
b. Konstruktion von Plasmiden, die das reverse Transkriptasegen enthalten.
Das intakte MMLV-Gen wurde als ein Sst I-Hind III Fragment des pMMLV-L-Klons, beschriebenen bei Miller und Verma, J. Virol. 49: 214–222 (1984), isoliert. Dieses Fragment enthielt die Nukleotidsequenz, die der Region von MMLV-Position 2558 (Sst I Stelle) bis Position 4894 (Hind III Stelle) entspricht, und enthielt das gesamte RT-Gen zwischen 40 zusätzlichen Basen aufwärts und 284 zusätzlichen Basen abwärts. Der Plasmidvektor PUC18 wurde mit Sst I und Hind III abgebaut, und der Vektor und das RT-Gen wurden zusammen ligiert und verwendet, um kompetente E. coli DH5αf'-Zellen zu transformieren. Das resultierende Plasmid wurde pUC18 MMLV Sst-Hind genannt (5). Dieses Plasmid wurde dann mit Eco RI und Bgl I abgebaut, wobei ein 2013 bp-Fragment des MMLV-RT-Gens, dem die terminale 3'-Sequenz des RT-Gens fehlt, erhalten wurde. Das RT-Gen-Fragment wurde an seiner Bgl I Stelle an einem doppelsträngigen Linker, der mit Bgl I-Hind III Überhängen (7) aus den zwei synthetischen Oligonukleotiden 8 und 9 (SEQ ID NOS: 11 bzw. 12) entworfen wurde, ligiert. Der synthetische Linker enthielt die Codesequenz für das Carboxylende der MMLV reversen Transkriptase und ein Stoppcodon. Das Plasmid pUC18 wurde mit Eco RI und Hind III abgebaut und das große Vektorfragment wurde an Gel gereinigt und mit dem rekonstruierten RT-Gen ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pUC18 MMLV III tailed genannt und enthielt das MMLV-Gen mit der zusätzlichen 3'-Sequenz, die entfernt wurde.
c. Konstruktion von pUC18N MMLV Gly und pUC18N MMLV Gly Tet(-).
Die zusätzliche 5'-Sequenz des geklonten RT-Gens wurde wie folgt entfernt. Ein 1997 by Mam I-Hind III Fragment wurde aus pUC18N MMLV III tailed (8) isoliert. Dieses Nukleinsäurefragment enthielt das RT Gen ohne die dreiundzwanzig 5'-Nukleotide der MMLV-RT Gensequenz. Zwei komplementäre Oligonukleotide wurden synthetisiert und hybridisiert, um den 5'-Teil des RT Gens (aber mit für ein Glycin in der zweiten Aminosäureposition kodierenden Nukleotiden) und einen ein Initiationscodon enthaltenden Nco I 5'-Überhang wiederherzustellen, wie unten gezeigt.
Das Plasmid pUC18N wurde mit Nco I und Hind III abgebaut, und das kleinere der zwei resultierenden Fragmente wurde entfernt. Die hybridisierten Oligonukleotide (SEQ ID NO: 3 und 4) wurden an das größere pUC18N-Fragment an der Nco-I-Stelle ligiert, und das 1992 by MMLV-RT Mam I-Hind III Gen wurde dann eingefügt, wobei der Expressionsvektor pUC18N MMLV Gly (8) erhalten wurde. Das Tet-Gen von PUC18 Tet(+), das wie unten beschrieben konstruiert wurde, wurde an der Rat II Stelle eingefügt, und das resultierende Plasmid wurde pUC18N MMLV Gly Tet(-) genannt. Das Minuszeichen bezieht sich auf die Orientierung des Tet-Gens innerhalb des Vektors.
Das geklonte MMLV-RT der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dem nativen Enzym in zwei Hinsichten. Erstens, das für den Threoninrest kodierende Codon, das die Position 1 des nativen Enzyms (das zweite Codon des RT-Gens) besetzt, wurde durch ein Glycincodon in der klonierten RT der vorliegenden Erfindung ersetzt; zweitens, die Codons für die Leucin-, Asparagin- und Isoleucinreste, die die Aminosäurepositionen 2, 3 und 4 der reifen nativen Proteinsequenz besetzen, wurden mit stärker von E. coli bevorzugten Codons ersetzt. Das für Leucin kodierende CTA Codon wurde durch ein degeneriertes Codon CTG ersetzt; das für Asparagin kodierende AAT Codon wurde durch ein degeneriertes Codon AAC ersetzt, und das für kodierende ATA Codon wurde durch ein degeneriertes Codon ATC ersetzt. (Siehe Wada, K. et al., Nucl. Acids Res. 19 (supp.): 1981–1986 (1991)).
d. Konstruktion des Plasmids pUC18N SD9D
Um die Expression von klonierten MMLV-RTs zu optimieren, wurde die lac Z Ribosombindungsstelle (RBS) von pUC18N modifiziert, um 9 Basen zu enthalten, die eher zu E. coli 16S rRNA als zu solchen 4 Basen, die in dem pUC18 Stammvektor vorhanden sind, komplementär sind. Zur gleichen Zeit wurden Plasmide mit Spacerregionen, die das RBS und das RTG-Initiationskodon entweder um 7, 8 oder 9 Basenpaare trennen, konstruiert, wie für einen der Stämme in 3 als SD7, SD8 und SD9 gezeigt. Übliche Elemente beim Entwurf dieser Spacersequenzen waren 1) Adenosin (A) in der dritten Position 5' zum ATG Inititationscodon, 2) kein Guanin (G) oder Cytosin (C) in der Spacerregion außer an der Nco I Stelle, und 3) eine 5'-RRTTTRR-3' Sequenz, die den RBS und den Spacer umspannt, wobei T Thymin ist und R ein Purinnukleotid (Adenin oder Guanin) ist. Diese für die heterologe Genexpression üblichen Elemente wurden bei Jay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5543–48 (1981) und Jespers et al., Protein Engineering 4: 485–92 (1991) erwähnt.
Die Oligonukleotide, die verwendet werden, um diese Modifikationen einzuführen, werden in 4 gezeigt. Jedes der Oligonukleotide 5, 6 und 7 (SEQ ID NO: 5, 6 und 7) wurde in Verbindung mit dem Oligonukleotid 1 verwendet, gezeigt in 2. Die Basen des Nukleotids 4 auf der 5'-Seite des ATG Startcodons des Oligonukleotids 6 und die Basen von 4 und 5 auf der 5'-Seite am ATG Startcodon in Oligonukleotid 7 wurden mit einer Mischung aus A und T synthetisiert, da keines von beiden theoretisch bevorzugt war. Siehe Jespers et al., siehe oben. Wie bei der Konstruktion von pUC18N, existierte eine Region von 30 Basenpaaren mit Komplementarität zwischen Oligonukleotid 1 und jedem der Oligonukleotide 3, 4 und 5. Wie vorher ließ man jedes Paar der Oligonukleotide hybridisieren, unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli DNA Polymerase I eingefügt, mit Pvu II und Eco RI abgebaut und in das gleiche pUC18 Pvu II-Eco RI Fragment, das in der Konstruktion von pUC18N verwendet wurde, eingefügt. Das MMLV-RT-Gen wurde dann wie unten beschrieben in diesen Vektor als ein Nco I-Hind III Fragment hinein kloniert.
Diese Konstruktionen wurden durch Messen der Grade der MMLV-RT-Expression untersucht. Die Zellen, die das Plasmid mit dem 9-Basen-Spacer (SD9; Oligonukleotid 7) enthalten, zeigten den höchsten Grad an reverser Transkriptase- Expression. Das Plasmid wurde isoliert und sequenziert; bei beiden der degenerierten Nukleotide erwiesen sich 4 und 5 Basen auf der 5'-Seite des ATG Startcodons als Adenosin (A) Reste. Der Expressionsvektor wurde pUC18N SD9D genannt.
e. Einfügen des Tetracyclin-Resistenzgens
Das Ampicillin-Resistenz-(β-Lactamase)-Gen von pUC18 wurde als ein genetischer Selektionsmarker in den frühen Vektorkonstruktionen verwendet. Dennoch kann aufgrund der Tatsache, dass β-Lactamase relativ schnell wirkt, um das Antibiotikum zu zerstören, eine messbare Plasmid-Minus revertante Population in einer Kultur, in der Ampicillin das einzige selektive Kriterium ist, vorhanden sein.
Um die Zellpopulation in den Kulturen eng zu regulieren, wurde der Vektor so modifiziert, daß er ein Tetracyclin-Resistenzgen enthielt. Weil Tetracyclin so wirkt, daß die zelluläre Aufnahme des Antibiotikums blockiert wird anstelle es zu Inaktivieren, sollte die Kultur in der Gegenwart von Tetracyclin stabiler sein als mit Ampicillin.
Das Tetracyclin-Resistenzgen wurde von pBR322 als ein 1427 pb Eco RI-Ava I Fragment isoliert. Die Einzelstrang-Überhänge wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNA Polymerase I eingefügt, wobei ein stumpfendiges Fragment erhalten wurde. Aat II Linker wurden zum Tetracyclin Resistenzgenfragment ligiert und mit Aat II abgebaut. Das Plasmid pUC18 wurde mit Aat II abgebaut, und der lineare Vektor wurde zum das Tetracyclin-Resistenzgen enthaltende Aat II Fragment ligiert. Die Ligaturmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli JM109 Zellen zu transformieren, und die Transformate wurden durch Tetracyclinresistenz selektiert. Die Struktur des Plasmids wurde durch Restriktions-Kartierung verifiziert. Klone mit in beiden Richtungen eingefügtem Tetracyclin-Resistenzgen wurden selektiert; die Plasmide wurden pUC Tet(+) und pUC Tet(–) genannt.
Die beiden Plasmide wurden zur Bereitstellung des Tetracyclin-Resistenzgens (Tet) für Insertion in die Plasmide, die klonierte MMLV reverse Transkriptase enthalten, verwendet. Dieser Versuch war bevorzugt, um das Insertieren des reversen Transkriptasegens (RT) in einen Vektor, der bereits das Tet-Gen enthält, zu erreichen, da das Tet-Gen Restriktionsstellen für Enzyme, die beim reverse Transkriptase-Klonieren verwendet werden, enthält, während das RT-Gen keine Aat II Stelle enthält.
f. Konstruktion von pUC18N SD9D MMLV Gly und pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–).
Das intakte modifizierte reverse Transkriptasegen von PUC18N MMLV Gly Tet(–) wurde als ein 2018 by Nco I-Hind III Fragment isoliert und mit dem Vektor pUC18N SD9D, von dem die Nco I-Hind III Polylinkerregion entfernt wurde, ligiert. Das resultierende Plasmid, pUC18N SD9D MMLV Gly genannt, enthielt das MMLV-RT-Gen, das nach den drei Möglichkeiten, die oben beschrieben wurden, modifiziert wurde und zusätzlich die verbesserte Ribosombindungsstelle und die wie oben beschriebene Spacerregion aufweist. Dieses Plasmid wurde an seiner einzigen Aat II Stelle gespalten, und das Aat II Tet-Genfragment von pUC18 Tet(+) wurde in diesen Vektor eingefügt und ligiert. Plasmide, die das eingefügte Tet-Gen enthalten, wurden in beiden möglichen Orientierungen isoliert, und der Grad der RT-Expression wurde für Klone, die jedes Plasmid enthalten, getestet. Es wurde gefunden, daß der Klon mit (–) Orientierung des Tet-Gens (mit dem Kodierstrang in der gleichen Orientierung wie MMLV-RT) höhere RT-Grade produziert als der Klon, der das Tet-Gen in der gegenteiligen Orientierung hat, und wurde daher als der bevorzugte Klon ausgesucht.
II. Auswahl des Wirtszellstamms
Die folgenden E. coli-Stämme wurden zur Expression und Reinigung von MMLV-RT getestet: JM109, DH5αf', XL1 Blue (Stratagene, San Diego, California), JM105, ER 1458, NM 522, Invαf' (Invitrogen, San Diego, California), TOPP^TM Stamm 1–6 (Stratagene), 1200, MRE 600, Q 13, und A 19. Einige dieser Stämme sind Mutanten, die an Rnase I (Stränge 1200, MRE 600, Q 13, und A 19) arm sind, während andere übliche Laborstämme sind. Einige dieser Stämme enthalten den lacI^q Repressor und benötigen eine Induktion mit Isopropylthiogalactosid (IPTG). Der Grad der RT-Expression der Wirtszellen, die das RT-Gen enthalten, wurde durch Sichtbarmachung des resultierenden Proteins auf SDS-Polyacrylamidgelen und in den meisten Fällen auch durch Enzymaktivitätsassays auf rohen Zelllysaten bestimmt. Von den Rnase I-armen Stämmen zeigt besonders E. coli 1200 (Yale University E. coli Genetic Stock Center, Stamm 4449) hohe Grade der Enzymexpression bei Verwendung dieser Assays; wenn nicht anders angezeigt, wurden alle hierin beschriebenen Experimente unter Verwendung dieser Arten durchgeführt.
III. Wachstum von pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–) enthaltenden E. coli 1200
Das Fermentationskulturmedium (A-Z Amin Media) enthielt die folgenden Komponenten in einem Volumen von 200 Litern:

N-Z Amine A (Sheffield Products, Norwich, N. Y. I) 2 kg

Hefe-Extrakt (Difco) 1 kg

NaCl 1 kg

NaOH 8 g

Tetracyclin (12 mg/ml in 70% Ethanol) 200 ml
Die Mischung wurde in einem Fermentationsbehälter bei 121°C für 20 Minuten autoklaviert, dann zum Abkühlen, stehen gelassen. Das Tetracyclin wurde nach erreichen der Temperatur von 37°C hinzugefügt.
Das Inoculum von E. coli 1200, das pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–) enthält, wurde durch Einimpfen von 2 ml N-Z Amin plus 12 μg/ml Tetracyclin (LB + Tet) mit einer gefrorenen Stammkultur der vektorenthaltenden Rasse und Inkubieren über Nacht bei 35°C unter Schütteln hergestellt. Die resultierende 2 ml Kultur wurde dann verwendet, um 20 Ein-Liter-Kulturen anzuimpfen, die wiederum bei Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert wurden.
Der 200 Liter Fermenter wurde dann mit 20 Liter Saatkultur angeimpft, und die Zellen konnten bei 37°C innerhalb von 30 Minuten nachdem die Kultur die maximale Dichte, die durch Messung der Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt wurde, erreicht hatte, wachsen. Dies tritt üblicherweise 7.5 Stunden nach der Animpfung auf. Während der Animpfung wurde die Kultur bei 150 RPM für die ersten 3 Stunden kontinuierlich und dann bei 180 RPM gerührt. Der Behälter wurde mit Luft bei 45 l/min besprüht. Der pH-Wert des Mediums wurde während der Fermentation nicht kontrolliert und stieg während dieser Zeit auf ungefähr 8.2.
Die Kultur wurde auf 20°C abgeschreckt und die Zellen wurden durch Zentrifugieren in einer Sharples-Zentrifuge gesammelt. Die Zellen wurden nicht gewaschen. Die Zellpaste wurde in 200 g Portionen geteilt und in flüssigem N₂ eingefrorenen. Während des Einfrierens wurde die Zellmaste in kleinere Portionen geteilt, um ein schnelles und gründliches Gefrieren zu sichern. Die gefrorene Zellpaste wurde dann bei –70°C gelagert.
IV. Reinigung der MMLV reversen Transkriptase von E. coli 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–)
1. Untersuchung der reversen Transkriptaseaktivität und Proteinkonzentration
Verfahren zum Analysieren der reversen Transkriptaseaktivität sind im Stand der Technik bekannt. Für die hier beschriebene Arbeit wurde der dT : rA-Assay von Kacian verwendet (Kacian, Methods for Assaying Reverse Transkriptase, in Methods in Virology (Academic Press 1977).
Kurz gesagt, der Assay verwendete eine 0.1 ml Reaktionsmischung von Oligo(dT) und Poly(rA), zusammen etwa 1 μg in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 8 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothrietol, [³H] dTTP und eine auf reverse Transkriptaseaktivität zu testende Probe enthielt. Der Reaktionspuffer kann optional 0.002–0.2% (v/v) nichtionische Detergentien enthalten. Die Reaktionen wurden bei 37°C bis 40°C inkubiert und die Proben wurden in Intervallen entnommen und mit einem gleichen Volumen TCA Reagenz (bestehend aus gleichen Volumen von 100% (w/v) Trichloracetatsäure (TCA), gesättigtem monobasischen Natriumphosphat und gesättigtem Natriumpyrophosphat) gemischt, bei 0°C für 10 Minuten gelagert und die sauer ausfällbare Radioaktivität wurde auf Membranfiltern, die dann 3x mit kaltem, 5% (v/v) TCA gewaschen wurden, gesammelt, getrocknet und in einer Scintillationsflüssigkeit gezählt. Eine Einheit der reversen Transkriptaseaktivität wandelt 1 nmol dTTP zur sauer ausfällbaren Form in 10 Minuten unter diesen Bedingungen um.
2. Zelllyse
Elfhundert Gramm gefrorener Zellpasten wurden in Stücke gebrochen und in 3.3 Lysispuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA), 10% (v/v) Glycerol, 5 mM Dithiolthreitol (DTT), 1% (v/v) Triton X-100, 10 mM NaCl, 1 mM Phenylmethylsufonylfluorid (PMSF)) durch Rühren bei 4°C suspendiert. Die Zellen wurden dann durch zwei Durchläufe durch einen APV Gaulin 15MR Homogenisierer bei einem kontinuierlichen Druck von 8000 psi lysiert. Der Aufnahmebehälter wurde in ein Eiswasserbad gestellt, und das anfängliche Homogenat konnte für 30 Minuten vor dem zweiten Durchlauf abschrecken. Das Lysat wurde dann durch Zentrifugieren bei 4500 × g für 1 Stunde bei 4°C gereinigt und die Pellets wurden verworfen. Die gereinigten Lysate wurden entweder sofort verwendet oder bei –70°C gefroren gelagert und vor der Verwendung auf 4°C gebracht.
3. Phosphorcellulose-Kolonnenchromatographie
Phosphorcellulose (Whatrian P11, 100 g) wurde mit 2.5 l 0.5 N NaOH, gefolgt von 2.5 1 0.5 N HCL, wie vom Hersteller bezogen, behandelt. Nach abschließendem Waschen mit Wasser, wurde die Phosphorcellulose in 1.0 l 1.0 M Tris-HCL (pH 7.5) suspendiert, wurde für 5 bis 10 Minuten stehengelassen und in einen Büchner-Trichter transferiert. Der Puffer wurde durch Vakuumfiltration entfernt, und die Phosphorcellulose wurde solange mit 1. M Tris-HCl (pH 7.5) gewaschen bis der pH des Auslaufs den pH der Waschlösung erreichte. Die Phosphorcellulose wurde dann in ein Becherglas überführt und in 1.0 l Kolonnenpuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 10% (v/v) Glycerol, 1 mM DTT, 0.1% (v/v) Triton X-100 und 1 mM PMSF), der 0.05 M NaCl enthielt, suspendiert. Nach 5 bis 10 Minuten wurde der Puffer durch Vakuumfiltration wie oben beschrieben entfernt. Die Phosphorcellulose wurde dann in 700 ml Kolonnenpuffer, der 0.05 M NaCl enthielt, suspendiert und auf 4°C gekühlt.
Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Chromatographie wurde unter Verwendung einer Pharmacia FPLC-Ausrüstung durchgeführt. Ein Pharmacia XK 50/30 (5.0 cm × 26.0 cm) wurde mit der gewaschenen und equilibrierten Phosphorcellulose gepackt, um ein Bett von 500 ml zu ergeben. Die Kolonne wurde dann mit 1 l Kolonnenpuffer, der 0.05 M NaCl enthielt, bei einer Durchflussrate von 60 ml pro Stunde gewaschen. Kolonnenadapter (Pharmacia AK 50) wurden verwendet, um das Totvolumen am Ende einer Kolonne zu minimieren. Sechshundert ml gereinigten Zelllysats wurden auf die Kolonne bei einer Durchflussrate von 30 ml pro Stunde aufgetragen. Die Kolonne wurde dann mit 650 ml Kolonnenpuffer, der 0.2 M NaCl enthielt, bei der selben Durchflussrate gewaschen. Aufgrund der Schrumpfung des Kolonnenbettes wurde überschüssiger Puffer vom Raum überhalb des Kolonnenbettes entfernt, und der obere Flussadapter wurde readjustiert, um den Kontakt mit der Bettoberfläche sicherzustellen.
Die Kolonne wurde mit einem 1500 ml linearen Salzgradienten, von 0.2 M NaCl bis 0.7 M NaCl in einem Kolonnenpuffer bei 30 ml pro Stunde, eluiert. Der Ausfluss wurde auf die Anwesenheit von Protein durch dessen Absorbierung bei 280 nm beobachtet. Es wurden Fraktionen von 25 ml gesammelt, außer während der Eluation des Proteinpeaks, bei dem 15 ml Fraktionen gesammelt wurden.
Die Kolonnenfraktionen wurden durch Verwendung der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt durch Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung analysiert. SDS-PAGE ist im Stand der Technik gut bekannt und wird bei Laemmli, U. K., Nature 227: 680 (1970) beschrieben. Zehn Mikroliter jeder Fraktion wurden in jeder Gelbahn analysiert. Eine Kontrollbahn enthielt eine bekannte Menge gereinigter MMLV-RT. Jene Fraktionen, die eine signifikante Menge Protein, das mit einem offensichtlich ähnlichen oder gleichen Molekulargewicht wie jenes der MMLV-RT Kontrolle wanderte und das geringe sichtbare Proteinbanden enthält, enthalten, wurden vereinigt. Ungefähr 95% des Proteins, das mit dem Hauptproteinpeak eluiert wurde, konnte ohne eine signifikante Menge von verunreinigenden Proteinen zu enthalten vereinigt werden. Aktivitäts-Assays können ebenfalls verwendet werden, um das Maximum der MMLV-RT-Enzymfraktionen zu lokalisieren und zu vereinigen; solche Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
4. Sephacryl 5200 Gelfiltration
Die vereinigten Phosphorcellulosefraktionen, die ein Volumen von 80–100 ml haben, wurden auf weniger als 25 ml durch Ultrafiltration in einer Amicon Ultrafiltrations-Zelle unter Verwendung einer Amicon P30 Membran bei 20 psi Stickstoff auf konzentriert. Zwei 2.6 cm × 94 cm Pharmacia XK 26/100 Kolonnen wurden mit Sephacryl 5200 (Pharmacia) nach Herstellerangaben gepackt. Kolonnenadapter wurden verwendet, um das Totvolumen zu minimieren. Beide Kolonnen wurden in Serie verbunden. Die Kolonnen wurden mit 2 l Kolonnenpuffer, der 0.2 M NaCl enthielt, bei einer Durchflussrate von 90 ml pro Stunde gewaschen. Die konzentrierte Phosphorcellulosevereinigung (etwa 25 ml) wurde auf die Aufwärtskolonne geladen, und die Kolonne wurde mit dem gleichen Puffer bei einer Durchflussrate von 90 ml pro Stunde entwickelt. Wieder wurde der Ausfluss auf seine Absortion bei 280 nm hin beobachtet; die anfänglichen 200 ml Ausfluss wurden in einem einzelnen Pool gesammelt und 4 ml Fraktionen wurden während des Ausflusses des Proteinpeaks gesammelt. Die MMVL-RT eluierte, nachdem ungefähr 290–300 ml Puffer auf die Kolonne aufgetragen wurde.
Die Fraktionen wurden wieder unter Verwendung von SDS-PAGE wie oben analysiert. Drei Mikroliter jeder Fraktion in der Peakregion wurden in jeder Gelbahn laufen gelassen; wie vorher enthielt eine Kontrollbahn gereinigte MMLV-RT bekannter Masse. Jene Fraktionen, die eine signifikante Menge Protein, das mit der gereinigten MMLV-RT wanderte, enthielten und die geringe sichtbare verunreinigende Proteine enthielten, wurden vereinigt. Vorzugsweise wurden jene Fraktionen, die überwiegend Banden von offensichtlich höherem Molekulargewicht als das von MMLV-RT enthielten, nicht in den Pool eingeschlossen. Zwischen 95–98% des Proteins in dem Haupt-S200-Peak wurde in dem Pool eingeschlossen. Obwohl Assays für reverse Transkriptaseaktivität verwendet werden können, um die MMLV-RT in den Fraktionen zu lokalisieren und zu identifizieren, schließt die Analyse vorzugsweise SDS-PAGE ein, um das Einschließen von Kontaminationen mit höherem Molekulargewicht in den Pool zu verhindern.
Die vereinigten 5200 Fraktionen werden für die meisten Verwendungen auf geeignete Weise konzentriert. Das Enzym kann in 50%-igem Glycerol bei –20°C gelagert werden.
Beispiel 1: Expression von MMLV-RT durch E. coli, das pUC18N MMLV Gly Tet(–) oder pUC18N MMLV Gly Tet(–) mit einer modifizierten Ribosombindungsstelle und Spacersequenzen verschiedener Längen enthält
Das MMLV-RT-Gen, das die Glycinaminosäure-Substitution in der ersten Position enthält, wurde im Vektor pUC18N und pUC18N mit den Spacern und der modifizierten Ribosombindungsstelle wie oben beschrieben untersucht. Alle Vektoren enthielten das Tet-Gen und wurden in der E. coli Art 1200 untersucht.
Fünfzig ml Kulturen von E. coli 1200, die eine dieser zwei Konstruktionen enthielten, wuchsen für 16.5 Stunden bei 37°C unter Schütteln. Aliquots von 0.5 ml wurden gesammelt, für 2 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, und die Überstände wurden entfernt. Die Zellpellets wurden in 0.5 ml eines Waschpuffers (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 5 mM EDTA und 0.25 M Sucrose) resuspendiert und dann wie vorher zentrifugiert. Die Zellpellets wurden bei –80°C gefroren und dann in 200 μl Lysispuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Glycerol, 5 mM DTT, 0.2 mM PMSF und 100 μg/ml Lysozym) resuspendiert und für 20 Minuten auf Eis belassen. Einhundert Mikroliter 0.75% (v/v) Triton X-100 wurden zu jeder Probe gegeben und die Mischung wurde gefroren und zweimal aufgetaut. Das Lysat wurde durch Zentrifugation gereinigt, und das Gesamtprotein wurde durch die Methode von Read und Northcote (Anal. Biochem. 116: 53–64 (1981)) untersucht.
Die Aliquote des Lysats wurden auf reverse Transkriptaseaktivität hin untersucht. Der Grad der reversen Transkriptaseaktivität in jedem Klon wurde in Einheiten pro Mikrogramm des Gesamtproteins in dem Lysat als auch in Einheiten pro ml der Bakterienkultur berechnet. Die in Tabelle 1 gezeigten Resultate zeigen an, dass der Vektor, der die modifizierte Ribosombindungsstelle (RBS) und die 9 Basen Spacersequenz enthält, die höchsten Grade an Enzym exprimierte.
Tabelle 1
Beispiel 2: Vergleich der modifizierten MMLV-RT in E. coli 1200 und JM 109 Wirtsstämme
Das Plasmid pUC18 wurde verwendet, um Plasmide, die für MMLV-RT mit Glycin-, Alanin- oder Valinsubstitutionen in der ersten nativen Aminosäureposition kodieren, zu bilden. Diese Substitutionen wurden unter Verwendung von Oligonukleotiden, die den Oligos 3 und 4 ähnlich sind, aber mit einem Codon der Sequenz 5'-GTT-3' oder 5'-GCT-3' (kodierend für Valin oder Alanin) in der zweiten Position des RT-Gens, dem Initiationscodon folgend, gebildet. Das Tet-Gen von pUC18 Tet(+) wurde zum Vergleich in das resultierende Plasmid in jeder Orientierung insertiert. Diese Plasmide wurden verwendet, um E. coli JM109 Wirtszellen, die eine Episomalkopie des lac-Repressors lac-I^q-Gen enthalten, zu transformieren. Die transformanten Zellen wuchsen über Nacht wie in Beispiel 1, außer wenn die Zellen das Log-Phase-Wachstum erreichten, wurde der lac Promotor durch die Zugabe von 0.5 mM (IPTG) für ungefähr 22 Stunden induziert. Die Aliquote wurden gesammelt und auf reverse Transkriptase- Aktivität hin untersucht wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 2 gezeigt. Wie man sieht, zeigt die Gly Tet(–) Konstruktion den höchsten Grad an Enzymexpression.
Tabelle 2
In einem separaten Experiment wurden die Gly Tet(–) und die Val Tet(–) Konstruktionen in E. coli Wirten 1200 und JM 109 untersucht. Die JM 109 Kulturen wurden wie oben induziert, während die 1200 Kulturen nicht induziert wurden. Die unten in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die Expressions-Grade in beiden Stämmen vergleichbar für die Glysubstituierte MMLV-RT und höher im Stamm 1200 für das Valsubstituierte Plasmid sind.
Tabelle 3
Beispiel 3: Wachstum von E. coli 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–) und Expression von MMLV-RT
Ein Liter Wachstummedium enthielt 10 g N-Z Amin A, 5 g Hefeextrakt, 5 g Natriumchlorid und 0.1 ml 10 N NaOH. Ein Milliliter 12 mg/ml Tetracyclin in 70%-igem Ethanol wurde dem gekühlten autoklavierten Medium zugegeben.
Zwei ml des Mediums wurden mit einer gefrorenen Stammkultur der E. coli Transformante angeimpft. Diese ließ man unter Schütteln über Nacht bei 37°C wachsen. Die zwei ml Bakterienkultur wurden verwendet, um 500 ml des Mediums anzuimpfen, und diese Kultur wurde wie oben über Nacht wachsengelassen. Die 500 ml Kultur wurde im Gegenzug verwendet, um 5 Liter des Mediums in einem New Brunswick BioFlo III Fermenter anzuimpfen. Die Kultur ließ man bei 37 °C unter Rühren bei 350 RPM wachsen. Die Kultur wurde während der Fermentation mit 4 Liter/Minute mit Luft besprüht. Fünf bis Zehn Milliliter Proben wurden jede Stunde zur Untersuchung des pH-Werts, der optischen Dichte, der Proteinkonzentration und reversen Transkriptaseaktivität entnommen. Diese Resultate werden unten in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Beispiel 4: Großmaßstab-Reinigung von geklonter MMLV-RT
Das Enzym wurde wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Volumina der Reagenzien wurden im Verhältnis zum Gewicht der pelletierten Zellen zu Beginn des Verfahrens eingestellt. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde hochgereinigtes Enzym mit einer 48%igen Ausbeute wiedergewonnen.
Tabelle 5
Beispiel 5: SDS-PAGE der gereinigten MMLV-RT des 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–) Klons
Der Fortschritt der Reinigung wurde durch SDS-PAGE-Analyse des Proteins in dem P-11 Pool und dem Sephacryl-Pool des obigen Beispiels 4 überwacht. SDS-PAGE wurde in einem 10% reduzierenden Gel betrieben, im wesentlichen wie bei Laemmli beschrieben, siehe oben. Die Proben wurden wie folgt hergestellt. Ein Aliquot des P-11 Pools wurde 50-fach in einen Gelprobenpuffer verdünnt (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% (v/v) Glycerol, 5% β-Mercaptoethanol (BME), 2% (w/v) SDS und 0.05% (w/v) Bromphenol-Blau) und bei 95°C für fünf Minuten erhitzt. Ein Aliquot des Sephacryl Kolonnenpools wurde 10-fach mit Gelprobenpuffer verdünnt und in der gleichen Weise erhitzt. Eine Probe kommerziell erhaltener MMLV-RT (USB, Cleveland, OH) wurde auf identische Weise präpariert. Die letzte Probe hatte nach Lieferantenangabe eine spezifische Aktivität von 187000 U/mg und wurde mit einer anfänglichen Konzentration von 1500 U/μl bereitgestellt. Vorgefärbte molekulare Gewichtsmarker (Bio Rad Laboratories, San Rafael, CA) wurden verwendet, um die Molekulargewichte der Proteine, die in dem Probenpool enthalten sind, abzuschätzen. Die offenbaren Molekulargewichte des Markerproteins waren 18.500 Da (Eiweißlysozym), 27.500 Da (Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor), 32.500 Da (Rinderserum Albomin) und 106.000 Da (Phosphorylase B aus Hasenmuskel). Das Gel wurde wie in Tabelle 5 gezeigt beladen, und wird in 10 gezeigt.
Tabelle 5
Beispiel 6. Kontaminierende Ribonukleaseaktivität in einer kommerziellen Präparation von MMLV-RT
Eine 24 cm × 0.4 cm Kolonne Sephadex G75 wurde mit folgendem Puffer äquilibriert (1X Kolonnenpuffer): 20 mM Tris-HCL (pH 7.6), 0.1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 1 mM Dithiothrietol (DTT), 0.01% (v/v) Nonidet P-40 und 10% (v/v) Glycerol.
Die RNase-Untersuchungen wurden unter Verwendung einer Nukleinsäurehybridisierung durchgeführt, um den Verlust an mit dem Enzym inkubiererter RNA zu messen. Details dieses Verfahrens können bei Arnold, et al., (U.S. Patent-Nr. 5,283, 174) und bei Nelson, et al., (U.S. Patent Anmelde-Nr. 08/094,577) gefunden werden. Fünf ml jeder Enzymprobe wurden in ein Teströhrchen überführt. Zehn ml eines in-vitro synthetisierten RNA-Transkripts (ungefähr 1–4 fmol) in Wasser wurden hinzugefügt und die Reaktionen wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Fünfzig ml einer zu einer Region des RNA-Transkripts komplementären Acridiniumester-markierten DNA-Probe wurden zu 0.1 M Lithiumsuccinat (pH 4.7), 1.1 M Lithiumchlorid, 2% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 20 mM EDTA, 20 mM Ethylenglycol-bis(beta-aminoethylether)-N,N,N¹,N¹- tetraessigsäure (EGTA), 15 mM Aldrithiol (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin) hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde bei 60°C für 20 Minuten inkubiert. 300 ml einer Lösung von 0.6 M Natriumborat (pH 8.5), 1% (v/v) Triton X-100 wurden hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde bei 60°C für 7 Minuten inkubiert, um den in der unmarkierten Probe anwesendrn Acridiniumester zu zerstören. Die Menge der verbleibenden Markierungen wurde mit einem Luminometer bestimmt.
Ähnliche Methoden zur Untersuchung der RNAse-Aktivität, die radiomarkierte Proben oder direkte Messungen des Abbaus radiomarkierter RNA durch Überwachen der Umwandlung von sauer ausfällbar zu säurelöslichen Formen verwenden, sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt und können in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Andere Verfahren zur Untersuchung schwacher RNAse-Aktivität sind in der wissenschaftlichen Literatur erhältlich, und ihre Anwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung kann durch den Durchschnittsfachmann leicht erkannt werden.
Fünfundzwanzig Mikroliter einer kommerziellen Präparation MMLV-RT (U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio) wurden mit 12.5 μl 10X Kolonnenpuffer ohne Glycerol, 10 μl einer 10 mg/ml Blue-Dextran-Lösung, und 77.5 μl Wasser gemischt. Vor Gebrauch wurde das Wasser mit Diethylpyrocarbonat wie bei Sambrook et al. beschrieben, siehe oben, behandelt, um kontaminierende RNAsen zu zerstören. Das Enzym wurde auf die Kolonne aufgetragen und mit Kolonnenpuffer bei einer Durchflussrate von 1.8 ml pro Stünde eluiert. Zweihundertdreißig μl Fraktionen wurden gesammelt und auf reverse Transkriptase- und RNAse-Aktivitäten hin untersucht, wie oben beschrieben.
Die Ergebnisse von zwei identischen Kolonnendurchläufen werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 6
Wie diese Tabelle veranschaulicht, enthalten die kommerziellen Enzympräparate eine signifikante endogene RNAse-Aktivität. Diese RNAse-Aktivität ist anders als die mit dem MMLV-RT-Enzym verknüpfte RNAse-H-Aktivität, da sie einzelsträngige RNA abbaut. Analysiert man durch Gel-Filtrations-Chromatographie, erhält man mindestens 4 Peaks der Nicht-RNAse-H-RNAse-Aktivität. Diese Peaks können 4 einzelne Enzyme repräsentieren. Alternativ können sie eine Aggregation von einem oder mehreren Proteinen, eine Dissoziation eines solchen Proteins in Untereinheiten, oder andere chromatographische Artefakte repräsentieren. Mindestens einer dieser Peaks von Nicht-RNAse-H-RNAse-Aktivität co-eluiert mit der MMLV-RT.
Beispiel 7: Vergleich der kontaminierenden Ribonukleasen in teilweise gereinigter rekombinanter MMLV-RT der E. coli Wirtszellen JM 109 und 1200
Um die Menge an kontaminierenden Ribonukleaseaktivitäten, die in den MMLV-RT enthaltenden Zelllysaten nach der P11 Kolonnenreinigung anwesend sind, zwischen den Wirtszellen JM 109 und 1200, die mit dem Plasmid PUC18N SD9D MMLV Gly Tet(-) transformiert wurden, zu vergleichen, wurden Fraktionen jeder Kolonne auf reverse Transkriptaseaktivität unter Verwendung des bei Kacian, Meth. Virol., siehe oben beschriebenen dT : rA-Assays und für Nicht-RNAse-H-RNAse-Aktivitäten unter Verwendung des in dem vorherigen Beispiel beschriebenen Assays hin untersucht.
Die für jeden Zelltyp erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen gezeigt:
Tabelle 7
Tabelle 8
Die Daten zeigen, dass das aus JM 109-Zellen hergestellte Enzym signifikante Mengen von Nicht-RNAse-H-Ribonukleaseaktivität durch das P11 Kolonnenprofil hindurch enthält. Signifikante Mengen RNAse-Aktivität eluierten mit der reversen Transkriptaseaktivität. Im Gegensatz dazu war die von den E. coli 1200 Zellen gereinigte reverse Transkriptase frei von nachweisbaren kontaminierenden RNAseaktivitäten nachdem der rohe Extrakt durch Phosphocellulose-Kolonnenchromatographie gereinigt wurde.
Beispiel 8: Amplifikation der Myobakterium-tuberculosis-Ribosomal-RNA-Zielsequenz unter Verwendung gereinigter rekombinanter MMLV reverser Transkriptasen von E. coli-1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–)
Die Nukleinsäureamplifikation wurde unter Anwendung des bei Kacian und Fultz, EPO 0 408 295 A2, beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Eine Reagenzmischung wurde wie folgt hergestellt: In 768 Mikroliter Wasser wurden gegeben, in der Reihenfolge, 25 μl 1 M Tris-HCl, (pH 8.0), 50 μl 1 M MgCl₂, 44 μl KCl, 500 μl 40 mM rNTPs, 500 μl 10 mM dNTPs, 9 μl T7 Promotor-Primer (84 pmoles/μl), und 5 μl nicht-T7 Primer (150 pmole/μl) und gemischt. Das Volumen dieser Mischung (Lösung A) wurde passend für 50 Assays berechnet. Vierzig μl der Lösung A wurden zu jedem Reaktionsröhrchen gegeben. Zehn Mikroliter der gereinigten Ziel-rRNA (0.05–25 fg/μl verdünnt in Template-Verdünnungspuffer (0.2% (w/v) Rinderserumalbumin in 150 mM NaCl)) wurden zu jedem Röhrchen gegeben. Die Ziel-rRNA hatte zum Primer und dem Promotor-Primer ausreichend komplementäre Nukleinsäuresequenzen, um eine Hybridisierung, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen eintritt, zu ermöglichen. Die Herstellung von rRNA ist dem Durchschnittsfachmann bekannt. Zweihundert Mikroliter Silikonöl wurden auf die Oberfläche jeder Reaktionsmischung geschichtet, und die Reaktionsröhrchen wurden bei 95°C für 15 Minuten in einem Heizblock erhitzt. Die Reaktionsröhrchen wurden dann in ein 42°C Wasserbad überführt und für 5 Minuten zum Abkühlen stehengelassen.
Eine Enzymmischung wurde durch Überführen von 46.8 μl Verdünnungspuffer in ein Röhrchen und Hinzufügen von 1.1 μl (900 U) MMLV-RT und 2 μl (400 U) T7 RNA-Polymerase hergestellt. Diese Mischung wurde dann in jedes Röhrchen gegeben. Die Reaktionen wurden dann für 2 Stunden bei 42°C inkubiert. Die Menge der hergestellten amplifizierten RNA wurde dann unter Verwendung einer auf die Zielsequenz gerichteten Acridiniumester-markierten DNA-Probe, wie bei Arnold et al., PCT WO89/02476 and Arnold et al., Clin. Chem. 35: 1588–1594 (1989) beschrieben, gemessen. Alle Reaktionen ließ man in vierfacher Ausführung laufen außer der Negativkontrolle, die man doppelt laufen ließ. Die Ergebnisse, die unten in Tabelle 9 gezeigt werden, zeigen, dass gesättigte Grade der amplifizierten Zielsequenz mit etwas weniger als 2.5 fg des eingesetzten RNA-Templates am Anfang des Experiments erhalten werden.
Tabelle 9
Beispiel 9: Synthese von cDNA unter Verwendung von gereinigter rekombinanter MMLV-RT von E. coli 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–)
Die Fähigkeit der rekombinanten gereinigten MMLV-RT cDNA zu synthetisieren wurde mit jener einer kommerziell erhältlichen reversen Transkriptase-Präparation (U.S. Biochemicals) in einer RNA-Sequenzreaktion verglichen.
Ein TTE Puffer wurde durch Mischen von 20 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.4 mM EDTA (pH 8.0) and 281.7 μl Triethylamin hergestellt. Die Primer hatten die folgende Sequenz
Die Primer wurden mit ³²P an ihrem 5'-Ende unter Verwendung von Polynukleotidkinase markiert; Verfahren zur Endmarkierung von Nukleinsäuren sind im Stand der Technik generell bekannt. Nach ihrer Endmarkierung werden die Primer durch Chromatographie auf Nensorb^TM-Kolonnen (New England Nuklear) entsprechend der Herstellerspezifikationen gereinigt, gefolgt durch eine Ethanol-Ausfällung.
Die Reaktionen wurden unter Verwendung von entweder gereinigter rekombinanter MMLV-RT von E. coli 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(-) oder reverser Transkriptase, die von einem kommerziellen Verkäufer bezogen wurde, durchgeführt.
Die Reaktionsmischungen enthielten die folgenden Reagenzien in 100 μl Endvolumen: Zehn Mikroliter GPE Puffer (500 mM Tris-HCl (pH 7.6), 175 mM MgCl₂, 250 mM KCl, 20 mM Spermidin), 8 μl Stamm-rNTPs (25 mM rCTP und rUTP; 65 mM rATP und rGTP), 4 μl Stamm-dXTPs (10 mM), 0.5 μl 1 M DTT, 20 pmol ³²P-markierten, 20 pmol unmarkierten Primer, 20 pmol gereinigte E. coli rRNA, 600 U reverse Transkriptase. Die Reaktionen wurden durch Mischen aller Komponenten ohne der reversen Transkriptase und anschließendem Erhitzen der Mischung auf 95°C für 5 Minuten, um die Template RNA Sekundärstruktur zu denaturieren, durchgeführt. Die Reaktionen wurden dann bei 60°C für 30 Minuten stehengelassen, um dem Primer das Reassozieren mit dem rRNA-Ziel zu ermöglichen. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und die reverse Transkriptase wurde hinzugefügt. Die DNA-Synthese wurde für 60 Minuten bei 42°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden auf 7%igen Polyacrylamidgelen analysiert, wie im wesentlichen bei Williams et al., BioTechniques 4: 138–147 (1986), beschrieben.
Es wurde gefunden, daß beide Enzyme cDNA aus dem RNA-Template mit der gleichen Effizienz synthetisieren, wie durch die Gel-Elektrophoretogramme vermutet.
Beispiel 10: Reverse Transkriptase-vermittelte PCR unter Verwendung von rekombinanter MMLV-RT von E. coli 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(–)
Alle PCR-Reaktionen wurden in einem Perkin Elmer-Cetus Modell 9600 DNA Thermalzyklisierer betrieben. Der Thermalzyklisierer wurde so programmiert, daß die Reaktion in der folgenden Art und Reihenfolge inkubiert werden:
94°C für 3 Minuten;
35 Zyklen zwischen 51°C für 30 Sekunden, 72°C für
2 Minuten und 94°C für 1 Minute;
72°C für 5 Minuten;
4°C über Nacht.
Zwei getrennte Präparationen der MMLV-RT, als auch eine Menge des gleichen kommerziellen Verkäufers wie oben wurden für dieses Experiment verwendet. Verschiedene Mengen RT wurden getestet, aber es wurde gefunden, daß 50 U des Enzyms für alle verwendeten Enzympräparate optimal sind. Die verwendeten Reagenzien in dem Experiment waren wie folgt: 5X RT-Puffer (50 mM Tris HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 5 mM DTT); 10X PCR-Puffer (Perkin Elmer) (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0.1% Gelatine); RT-Vormischung (für jede Reaktion) (4 μl 5X RT-Puffer, 0.8 μl einer 25 mM Lösung von jeder dNTP, 50 Einheiten RT, 100 mol(–) Sense-Primer, Wasser in einem Gesamtvolumen von 20 μl); PCR-Vormischung (für jede Reaktion) (8 μl 10X PCR-Puffer, 100 pmol (+) Sense-Primer, 2.5 Einheiten Taq DNA Polymerase, und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 80 μl). Die Proben wurden in 10 mM Lithiumsuccinat-Puffer (pH 5.0), 0,1% Lithiumlaurylsulfat (LLS) gelagert.
Die für dieses Experiment verwendeten Proben und Primer wurden so entworfen, daß sie zu den Sequenzen des menschlichen Papillomavirus (HPV) Genoms komplementär sind. Diese Proben wurden mit Acridiniumester markiert, wie es bei Arnold und Nelson, PCT Patent Anmelde-Nr. WO89/02476, offenbart wurde.
Rohpräparationen ungesplissener Template-RNA wurden durch Suspendierung von SiHA-Zellen (die in ihr Genom integrierte HPV Nukleinsäuresequenzen enthalten) bei einer Konzentration von 1.6 × 10⁷ Zellen/ml in 10 mM Natriumphosphat (pH 7.6), 100 mM Natriumchlorid hergestellt. Die Zellen wurden für 15 Minuten auf 95°C erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und dann in Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnt. RNA-Transkripte des E6-Gens wurden durch in vitro-Transkription der DNA von einem das HPV16 E6-Gen enthaltenden Plasmid hergestellt. Dieses Plasmid wurde durch Klonieren eines DNA-Fragments des von Matsukura et al., J. Virol. 58: 979–982 (1986), beschriebenen HPV-Klons in pBluescript^TM II SK (+) und (–) Sense-Klonvektoren konstruiert (Stratagene, San Diego, CA.). Die RNA-Transkripte wurden wie durch den Hersteller angegeben hergestellt.
Die Amplifikationsreaktionen wurden wie folgt durchgeführt. Die Ziel-Nukleinsäuren wurden zu der MMLV-RT Vormischung gegeben. Diese Mischung wurde bei 95°C für 2 Minuten erhitzt. Die Primer wurden hinzugefügt und konnten mit der Zielnukleinsäure für 10 Minuten bei 60°C reassoziieren. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Eis gekühlt. Die reverse Transkriptase wurde hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde dann bei 95°C für 10 Minuten erhitzt, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die Mischung wurde in Eis gekühlt, und zwei Tropfen Mineralöl wurden auf die Oberfläche von jedem Röhrchen geschichtet.
Die Taq-DNA-Polymerase wurde in die PCR-Vormischung bei der oben angezeigten Konzentration verdünnt. Achtzig Mikroliter PCR-Vormischung wurden dann zu jeder Probe gegeben. Die Proben wurden in den thermischen Zyklisierer bei 95°C gestellt und die Zyklisierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Hybridisierung und Detektion wurde wie bei Arnold und Nelson, siehe oben, beschrieben durchgeführt. Für jeden Hybridisierungs-Assay wurden 30 μl Wasser 10 μl einer PCR-Reaktionsmischung gegeben. Die DNA wurde bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Zehn Mikroliter einer verdünnter Probe wurden zugegeben und gemischt. Die Röhrchen wurden dann bei 60°C für 15 Minuten inkubiert. Dreihundert Mikroliter des Selektionsreagenzes wurden zugegeen, die Röhrchen wurden gemischt und bei 60°C für 5 Minuten inkubiert. Die Röhrchen wurden dann in Eis gekühlt und die zurückbleibende Acridiniumester-Markierung wurde in einem LEADER^TM Luminometer (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) gemessen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zur Herstellung einer reversen Transkriptase, das die Schritte umfasst: a. Konstruieren eines Plasmids, welches eine Nukleinsäuresequenz, die vom Moloney-Murine-Leukämie-Virus (MMLV) abgeleitet ist und die für ein einzelnes kovalent gebundenes Aminosäure-Kettenpolypeptid mit RNA-gerichteten und DNA-gerichteten DNA-Polymeraseaktivitäten und mit der gleichen Anzahl von Aminosäureresten, wie sie in reifer nativer MMLV-Reverser Transkriptase vorhanden sind, kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz degenerierte Codons, bevorzugt von E. coli und kodierend für Aminosäuren an den Positionen 2, 3 und 4 der reifen nativen MMLV-Reversen Transkriptase, umfasst, mindestens einen auswählbaren Gen-Marker, eine Promotorsequenz, und einen Replikationsanfang, der geeignet ist, eine autonome Replikation des Plasmids innerhalb einer Wirtszeile zu fördern, umfasst; b. Einbringen des Plasmids in eine RNAse-I-aktivitätsarme Wirtszelle; c. Wachsenlassen der das Plasmid enthaltenden Wirtszelle in einem flüssigen Kulturmedium unter Bedingungen, die geeignet sind, die Zellteilung und Expression der Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid kodieren, zu fördern; d. dann Lysieren einer Vielzahl von Wirtszellen, um ein Zelllysat zu formen; und e. Abtrennen des Polypeptids von dem Zelllysat.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Konstruktionsschritt eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die für einen aminoterminalen Rest des Polypeptids, der aus der Gruppe, die aus Methionin, Glycin, Valin und Alanin besteht, ausgewählt wird, kodiert.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Konstruktionsschritt eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die für ein aminoterminales Glycin des Polypeptids kodiert.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Konstruktionsschritt eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die Codons, die vorzugsweise durch E. coli tRNA gebunden werden, beinhaltet, um für fünf aminoterminale Aminosäurereste des Polypeptids zu kodieren.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Codons, die für die fünf aminoterminalen Aminosäurereste kodieren, aus der Sequenz 5' ATGGGTCTGAACATC 3' (SEQ ID NO: 10) bestehen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Konstruktionsschritt des weiteren das Einbauen einer Ribosom-Bindungsstelle, die 7 bis 9 Nukleotide aufwärts eines Initiations-Codons der für das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz lokalisiert ist, in das Plasmid beinhaltet.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Ribosom-Bindungsstelle eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz von E. coli rRNA ist.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Ribosom-Bindungsstelle die Nukleinsäuresequenz 5' TAAGGAGGT 3' umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei. die Ribosom-Bindungsstelle 9 Nukleotide aufwärts eines Initiations-Codons der für das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz lokalisiert ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der Konstruktionsschritt weiterhin das Einbauen einer Spacer-Nukleinsäuresequenz von etwa 7 bis etwa 9 Basen, die zwischen der Ribosom-Bindungsstelle und dem Initiations-Codon lokalisiert ist, in das Plasmid beinhaltet, wobei die Spacer-Nukleinsäuresequenz einen Adeninrest, der drei Nukleotide aufwärts von dem Initiations-Codon lokalisiert ist, umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Ribosom-Bindungsstelle und die Spacer-Nukleinsäuresequenz zusammen eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus 5' RRTTTRR 3', umfassen und die Nukleinsäuresequenz mit der Ribozym-Bindungsstelle überlappt.
Das Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Spacer-Nukleinsäuresequenz aus der Sequenz 5' TTAAAAACC 3' besteht.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Konstruktionsschritt einen auswählbaren Gen-Marker verwendet, der der Wirtszelle Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum verleiht.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Konstruktionsschritt einen auswählbaren Gen-Marker, der der Wirtszelle Tetracyclin-Resistenz verleiht, verwendet.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Konstruktionsschritt den auswählbaren Gen-Marker so in das Plasmid einfügt, dass sein Kodierstrang in einer Ausrichtung ist, die identisch zu einer Kodierstrangausrichtung der Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid kodiert, ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Einfügeschritt eine Wirtszelle, die eine E. coli Art ist, die für die Expression von RNase I mutant ist, verwendet.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Einfügeschritt eine Wirtszelle, die aus der Gruppe, die die E. coli Arten 1200, MRE 600, Q 13 und A 19 umfasst, ausgewählt wird, verwendet.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Einfügeschritt die E. coli Art 1200 verwendet.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Reinigungsschritt umfasst: e1. Auftragen des Zelllysats auf ein Kationaustauscher-Medium in der Gegenwart einer Lösung, die eine Leitfähigkeit von nicht mehr als etwa 0,05 M NaCl hat, wodurch das Polypeptid an das Kationaustauscher-Medium gebunden wird; e2. Eluieren des an das Kationaustauscher-Medium gebundenen Polypeptids durch Auftragen eines Salzgradienten, der eine Anfangsleitfähigkeit von etwa 0,2 M NaCl und eine Endleitfähigkeit von etwa 0,7 M NaCl hat, auf das Kationaustauscher-Medium; e3. Rückgewinnen von mindestens einer das Polypeptid enthaltenden Fraktion des Eluats; e4. Auftragen von mindestens einer das Polypeptid enthaltenden Fraktion des Eluats auf eine Gelfiltrationsmatrix; und e5. Rückgewinnen von mindestens einer das Polypeptid enthaltenden Fraktion von der Gelmatrix.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Kationaustauscher-Medium des Auftragungsschritts e1. und des Elutionsschritts e2. ein Phosphozellulose-Derivat ist.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei das in Schritt e3. oder Schritt e5. wiedergewonnene Polypeptid ein mutmaßliches, durch SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmtes, Molekulargewicht von etwa 70.000 Daltons.
Ein Polypeptid, das durch Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder Ansprüche 19 bis 21 aus dem Rückgewinnungsschritt e3. bzw. e5 direkt erhalten wurde.
Eine Zusammensetzung, die das Polypeptid, das durch Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 19 bis 21 aus dem Rückgewinnungsschritt e3. oder e5. in einem Medium, das von anderen Nukleaseaktivitäten als der RNase-Aktivität des Polypeptids im wesentlichen frei ist, direkt erhalten wurde, umfasst.