CN111979255B - 低温高产单亚基rna聚合酶及纯化方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开低温高产的单亚基RNA聚合酶：VSW3RNA聚合酶，运用于在低温下高效合成RNA。所述单亚基RNA聚合酶为嗜低温噬菌体VSW‑3表达的RNA聚合酶，能在4℃‑30℃范围内以DNA为模板转录合成RNA，当温度为25℃时，VSW3RNA聚合酶合成RNA的效率最高，其产量甚至超过了目前广泛应用于RNA体外转录合成的T7RP。编码该酶的碱基序列见序列表SEQ ID NO.1，酶的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.2，该酶识别的特异性启动子序列见序列表SEQ ID NO.5。作为目前发现的第一个RNA合成能力能与T7RP媲美甚至超越的单亚基RNA聚合酶，且转录合成RNA的最适合温度为25℃，比T7RP的转录温度37℃低了12℃，这为低温下高效合成RNA提供了一种重要酶工具，能够满足科研与医药市场对RNA产品不断增加的需求。

Description

低温高产单亚基RNA聚合酶及纯化方法和应用

技术领域

本发明属于体外RNA合成研究生产领域，具体涉及低温高产单亚基RNA聚合酶及纯化方法和应用。

背景技术

由于围绕RNA的研究和应用开发不断拓展，对RNA体外合成的质和量都提出了很高的要求，高质量的RNA体外合成目前是RNA研究和应用的最大瓶颈。由于RNA聚合酶转录合成RNA的特点，决定了RNA的酶法合成远不能和DNA合成那么高效，而化学合成RNA仅限于小RNA(几到几十个核苷酸长度)和一些复杂核苷酸修饰RNA，随着RNA长度的增加，化学合成的成本迅速上升(Hogrefe R I，2013；E.Paredes，2017)；而编码蛋白质的RNA通常都长达几千个核苷酸，RNA长度达一百个核苷酸以上化学合成法已不再适用(Gallo S，2005)。目前制备长RNA唯一的方法是体外酶法合成，酶法合成是指在体外以DNA双链为模板利用RNA聚合酶进行转录合成RNA的一种方法(Milligan J F，1987)。目前这种利用DNA依赖的RNA聚合酶进行体外RNA转录合成的技术被广泛应用于生物化学，遗传学研究等领域(Kessler R L，2017)，并逐渐展露出作为临床RNA药物合成工具的巨大潜力(Wilgenhof S，2015；Lint SV，2015)。在过去几十年里，RNA酶法合成基本都是利用来源于大肠杆菌噬菌体T7基因组的RNA合成酶——单亚基T7RNA聚合酶(T7RNA polymerase，简称T7RP)，在体外依靠带有T7启动子序列的DNA模版来转录合成大量所需的RNA(Chamberlin M，1970；Davanloo P，1984)。虽然大部分生物自身都拥有一套RNA聚合酶体系，但是绝大多数由多个亚基组成并且调控转录机制复杂，不适合用作体外合成RNA的酶工具。

由于在上世纪70年代研究技术水平限制，人们所知的噬菌体只有寥寥几种，因而当时选择T7具有很大局限性的，并不代表它是自然界中存在的最好单亚基RNA聚合酶。后来，从自然界中鉴定的这类单亚基RNA聚合酶只有来源于噬菌体T7、T3和SP6三种，后两种在序列和功能上与T7RNA聚合酶高度相似因而基本被摒弃，因此对于RNA合成这样重要的生物技术一直都只有T7RNA聚合酶这唯一的酶工具可用(Morris CE，1986；Krieg PA，1987)。用T7RNA聚合酶体外合成RNA的技术建立于80年代，在随后的数十年中，人们对T7RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，以满足大家提出的对RNA合成的各种需求(Maslak M.，1994；McAllister WT，1993；Martin CT，2005)。但是T7本身的一些特性是很难根本解决的，比如说对起始转录碱基强烈偏好性(“GG”)，未知的转录终止现象，转录产物末端不均一(转录产物3’端非特异性加入若干碱基)和某些修饰性碱基掺入效率低等问题。在2012年，新发现一个与T7噬菌体有亲缘关系但却更加古老的海洋蓝细菌噬菌体Syn5的新的单亚基RNA聚合酶(Zhu B，2013)。Syn5RNA聚合酶被发现后，解决了部分T7RNA聚合酶转录产物容易中断的问题，其较强的RNA转录延伸能力为获得长链RNA(超过10kb)提供了基础；同时Syn5RNA聚合酶及其突变体(Y564F)还能很好的从一些T7RNA聚合酶无法起始转录的碱基序列开启转录，并且能够高效掺入T7RNA聚合酶无法掺入或掺入效率低的修饰性碱基(如2’-F-dCTP/dUTP，5mC和ps-U)；此外，Syn5RNA聚合酶的转录产物末端均一性较好，能保证合成产物的准确性(Zhu B，2014；Zhu B，2015)。由此可见，一种新的RNA聚合酶的发现，解决了很多T7RNA聚合酶存在的缺陷，为更好的满足各类RNA的合成需求提供了保障。

在过去的数十年间，随着siRNA、miRNA、mRNA、长链非编码RNA、RNA适配体、核酶等RNA技术飞速发展，RNA在生物学上越来越受到重视(Burnett J C.，2012)。以往的一些实验方法已逐渐不能满足科研和临床实验对RNA的需求，越来越多的RNA生物学研究中需要用到几十毫克级甚至上百毫克的高纯度RNA；与此同时，越来越多的RNA开始作为药物分子进入临床实验阶段，有的已经被FDA批准上市，作为药物运用于临床无疑对RNA产品的质量也提出了更高的要求(Easton L E.，2010)。然而现有的聚合酶都很难在低温条件下高效合成RNA，而且在高温条件下合成RNA容易造成RNA降解、同时还容易增加合成成本。

发明内容

为了寻找能够在低温下高效合成RNA的单亚基聚合酶，我们找到了能够在低温生长的噬菌体VSW-3，为一种生长于中国西藏纳帕海的低温噬菌体，是昆明理工大学微生物系李秀玲教授课题组分离获得，并进行了较详细的生物学特性表征研究和比较基因组学分析(Qin K，2016；Zhang C，2017)，我们经过大量研究从中合成表达出了一种低温高产的RNA聚合酶，目前我们已经成功克隆并建立了表达纯化低温VSW3 RNA聚合酶的一整套方法，同时，建立了利用VSW3 RNA聚合酶在低温下高效的合成RNA的方法。

本发明是针对RNA高温下容易降解的问题，开发了一种利用低温单亚基RNA聚合酶VSW3 RNA聚合酶在低温下进行RNA转录合成的技术，提供低温高产单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

低温高产单亚基RNA聚合酶，所述单亚基RNA聚合酶来自于嗜低温噬菌体VSW-3基因组的VSW3 RNA聚合酶，或来自与所述VSW3 RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于26％并含有序列表SEQ ID NO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸数目在780至830之间，不包括T7、SP6类RNA聚合酶以及P60类RNA聚合酶的低温噬菌体单亚基RNA聚合酶，其中，序列表SEQID NO.1中每个Xaa独立代表任意氨基酸；

所述VSW3 RNA聚合酶的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述VSW3 RNA聚合酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

本发明公开了所述VSW3 RNA聚合酶的纯化方法，包括以下步骤：

(1)蛋白表达：

a.构建目的酶基因表达载体质粒：合成目的酶基因，通过无缝克隆将所述目的酶基因克隆到原核表达载体pCold的中获得重组质粒；

b.将重组质粒转化BL21DE3感受态细胞，涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，置于37℃培养箱中静置培养过夜，挑取单克隆鉴定获得目的酶表达菌种并保种于-80℃；

c.目的酶表达菌种转接LB培养基中37℃过夜活化，以2％比例稀释后在30℃下放大培养，待OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.05mM-0.2mM的IPTG诱导蛋白表达，在10℃-15℃的温度下诱导表达16-20小时后收集菌体，所述蛋白的氨基端带有如序列表SEQ ID NO.4所示的组氨酸标签，或者FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；

(2)酶的纯化：

ⅰ镍柱亲和层析：将所述步骤c中收集的菌体裂解后使裂解上清液通过镍柱，含标签的目的酶与镍柱结合，依次加入含咪唑浓度为20mM，50mM，100mM洗脱缓冲液与镍柱竞争结合洗脱目的酶蛋白，带有标签的目的酶蛋白被含有100mM咪唑的缓冲液洗脱出来，收集目的酶蛋白；

ⅱ凝胶过滤层析:将镍柱亲和层析收集的酶蛋白溶液通过超滤浓缩后用凝胶过滤层析法进一步纯化，收集洗脱峰溶液，本发明用的柱平衡缓冲液成分：pH7.5、20mM Tris-HCL，300mM NaCL，0.5mM DTT；

ⅲ蛋白透析：将凝胶过滤层析中收集的洗脱峰溶液超滤浓缩后进行多次透析，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

所述步骤ⅲ中透析的具体步骤为：将浓缩后的洗脱峰溶液加入透析袋中密封后置于1L透析液中进行透析，3-4h后更换干净透析液继续透析5-6h，最后更换新鲜透析液透析过夜，透析液成分：pH7.5、50mM Tris-HCL，100mM NaCL，1mM DTT，pH8.0、0.5mM EDTA，1％Triton X-100，50％甘油。

我们还公开了所述低温高产单亚基RNA聚合酶在RNA合成中的应用

所述低温高产单亚基RNA聚合酶的应用，具体包括以下步骤：

Ⅰ设计引物，通过PCR和无缝克隆技术将目的酶的启动子序列插入到pUC19质粒多克隆位点紧邻的5’端获得重组质粒，用NdeI酶切线性化重组质粒作为DNA转录模板，所述启动子序列含有‘NGGNCCNCN’特征性碱基序列；

Ⅱ加入所述目的酶、DNA转录模板、pH7.9Tris-HCl，氯化镁，亚精胺，DTT，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应。转录温度为4-30℃，优选为15-25℃。其中，酶的终浓度为0.2uM，转录模板的终浓度为30ng-50ng/ul，转录时间8-20h。

优选的，所述VSW3 RNA聚合酶的启动子序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与当前通用的T7RP在37℃下合成RNA相比，运用VSW3单亚基RNA聚合酶的最适RNA转录合成温度降低到了15℃-25℃之间，这不仅能够省去购买控温保温设备和仪器使用的成本，还能保证RNA产量；此外，低温反应还可以显著降低RNA在转录合成过程中存在的降解风险，这特别有利于为RNA的规模化生产，满足不断增加的RNA合成市场需求。

附图说明

图1：SDS-PAGE电泳检测VSW3 RNA聚合酶纯度和浓度；

图2：VSW3 RNA聚合酶在不同温度下RNA合成能力的检测；

图3：在25℃下，不同VSW3 RNA聚合酶浓度合成RNA产量的检测；

图4：VSW3 RNA聚合酶在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃下在不同时间点RNA产量的检测；

图5：T7和VSW3 RNA聚合酶进行RNA合成产量比较。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：VSW3 RNA聚合酶基因合成及蛋白表达纯化

低温单亚基RNA聚合酶VSW3 RNA聚合酶的表达纯化，其特征在于VSW3 RNA聚合酶来自于低温噬菌体，正常的表达纯化方法容易形成包涵体，必须严格采用低温表达方法。VSW3 RNA聚合酶的表达纯化生产过程包括以下步骤：

(1)合成VSW3 RNA聚合酶基因，构建VSW3 RNA聚合酶表达载体质粒；

基因合成RNA聚合酶，所述VSW3 RNA聚合酶的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述VSW3 RNA聚合酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，并通过无缝克隆将其克隆到原核表达载体pCold的中，重组质粒将表达一个氨基端带有组氨酸标签的融合蛋白，标签序列见SEQ ID NO.4。

(2)表达质粒转化转化，挑取单克隆进行检验并进行菌落保种:

将重组质粒转化BL21DE3感受态细胞，涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，置于37℃摇床中培养过夜，挑取单克隆鉴定并保种于-80℃。

(3)VSW3 RNA聚合酶表达:

将构建的VSW3 RNA聚合酶表达菌种转接LB液体培养基中37℃过夜活化，以2％比例稀释到新鲜的LB培养基中并以不高于30℃的温度放大培养，待OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.05-0.2mM的IPTG诱导蛋白表达，且在10℃-15℃的温度下诱导表达16-20小时，低温离心收集菌体。

(4)VSW3 RNA聚合酶的镍柱纯化。

利用构建于VSW3 RNA聚合酶氨基端的组氨酸标签(见序列表SEQ ID NO.4)，进行镍柱亲和层析，配制含有50mM磷酸二氢钠(pH8.0)、300mM NaCl的洗脱缓冲液，利用洗脱缓冲液对咪唑进行稀释，得到20uM、50uM、100uM三种浓度的咪唑溶液，依次加入含咪唑浓度为20mM，50mM，100mM洗脱缓冲液与镍柱竞争结合洗脱目的酶蛋白，带有标签的目的酶蛋白被含有100mM咪唑的缓冲液洗脱出来，收集目的酶蛋白；

(5)VSW3 RNA聚合酶的凝胶过滤层析纯化。

凝胶过滤层析法进一步将镍柱亲和层析收集目的蛋白进行纯化，通过超滤等办法将步骤(4)收集的目的蛋白浓缩后进样。将从凝胶过滤柱中收集的目的蛋白峰溶液合并后浓缩到较小体积，加入透析袋中密封后置于1L透析液中进行透析，透析液成分：pH7.5、50mMTris-HCL，100mM NaCL，1mM DTT，pH8.0 0.5mMEDTA，1％Triton X-100，50％甘油，第一轮透析约4h后更换干净的透析液继续透析6h左右，第三轮透析更换新鲜透析液透析过夜，收集透析后的蛋白置于-20℃保存。

(8)SDS-PAGE电泳检测KP34RNA聚合酶纯化效果:

为了检测蛋白纯度，对通过前面步骤纯化的VSW3 RNA聚合酶进行SDS-PAGE电泳，然后利用考马斯亮蓝染色法对透析后的VSW3 RNA聚合酶的进行显色检测，结果如图1所示，由图可见，经过上面所述的表达纯化过程，VSW3RP的纯度与NEB生产的T7RP一致，同时可以判断出NEB的T7RP浓度为1.5-2.0uM之间，可以看出目的蛋白条带单一，无明显杂蛋白条带，说明通过以上纯化步骤我们获得了较高纯度的VSW3 RNA聚合酶。

实施例2：VSW3 RNA聚合酶体外合成RNA

本发明中，我们首先通过软件预测和实验技术获得了VSW3 R NA聚合酶特异性识别的转录启动子，见序列表SEQ ID NO.5，在此基础上证实了VSW3 RNA聚合酶具有在低温下高效合成RNA的能力，这有利于RNA合成过程的稳定。为了将来的产业化应用，我们鉴定了VSW3 RNA聚合酶在各温度下个酶浓度下的RNA合成效率(见图2，图3，图4)，并将之与T7RP作比较(见图5)，由图2可见，VSW3 RP能够在4℃到30℃下合成RNA，并且RNA产量随着温度增加而增加，在25℃时达到产量的顶峰，说明VSW3RP的最适合的RNA转录合成温度为25℃，由图3可见，在酶的重浓度为0.15uM时，RNA产量最高，与T7RP的最佳酶使用浓度非常接近，由图4可见，VSW3RP非常适合常温过夜转录合成RNA的需求，显著降低了RNA转录合成温度，保证RNA合成过程的稳定性，由图5可见，VSW3RP在最终RNA产量上超过了T7RP。

(1)转录模板构建和制备

A.设计引物通过PCR和无缝克隆技术分别将将T7RNA聚合酶和VSW3 RNA聚合酶的启动子序列插入到pUC19质粒多克隆位点紧邻的5’端。引物序列如下：

pUC19-VSW3p-F：TTAATTGGGCCACCTATAGGGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG(SEQ ID NO.6)

pUC19-VSW3p-R：TATAGGTGGCCCAATTAAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCC(SEQ ID NO.7)

pUC19-T7p-F：TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG(SEQID NO.8)

pUC19-T7p-R：TAGTGAGTCGTATTAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCC(SEQ IDNO.9)

PCR反应体系如下表：

2X PrimeSTAR Max	10ul
		正向引物(10uM)	1ul
反向引物(10uM)	1ul
		pUC19质粒(1ng/ul)	1ul
补足去离子水至总体积	20ul

PCR扩增程序：98℃预变性3min、98℃变性15s、62℃退火15s、72℃延伸50s、35个循环、72℃终延伸5min，4℃保存2min。

B.使用AXYGEN公司的PCR产物纯化试剂盒(货号：AP-PCR-50)对PCR产物进行纯化，具体纯化步骤可参考对应的试剂盒说明书。

C.将回收的PCR产物采用无缝克隆技术进行末端连接，无缝克隆试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(货号：D7010S)，具体纯化步骤可参考对应的试剂盒说明书。

D.将上一步的反应产物取5ul转化到DH5α感受态细胞中，涂布含100mg/ml氨苄青霉素LB平板上37℃静置培养过夜，第二天挑取单克隆测序鉴定。

E.制备线性化转录模板：将测序正确的分别含有T7和VSW3启动子的两种pUC19质粒用NdeI限制性内切酶进行酶切线性化，并用酚氯仿法对酶切产物进行回收。

(2)RNA转录合成特性鉴定和效率比较

A.筛选VSW3 RNA聚合酶的最适合RNA转录反应酶浓度。

我们采用了与T7RP相同的5X转录缓冲液：20mM Tris-HCl(pH7.9、25℃)，30mMMgCl2，50mM DTT，50mM NaCl，10mM spermidine。

RNA体外转录体系为：

转录缓冲液5X	2.0ul
		rNTP Mixture(25mM each)	3.2ul
线性pUC19模板DNA	0.4ul
		RNA酶抑制剂(40U/ul)	0.5ul
VSW3 RNA聚合酶(1uM)	0.4ul
		补充经DEPC处理的去离子水	至20ul

根据上面的转录反应体系，在室温下我们同时对了7个梯度的酶浓度(终浓度uM：0.001，0.003，0.01，0.03，0.1，0.15，0.3)进行了转录反应，转录反应时间为12小时，琼脂糖电泳结果如附图2所示，VSW3 RNA聚合酶的最终使用浓度在0.15uM左右是RNA产量最高。

B.筛选VSW3 RNA聚合酶的最适合RNA转录反应温度

根据前面的转录反应体系，我们同时检测了7个不同转录温度(包含：4℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，37℃)下VSW3RP的转录效率，见图3；同时在(10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，37℃)6个温度下分别收集了5个时间点的样品(包含：2h，4h，6h，8h，16h)，琼脂糖电泳结果如附图4所示，在不高于30℃下和不低于15℃的温度下(属于室温/常温范围)，VSW3 RNA聚合酶都能够合成大量的RNA，25℃是VSW3 RNA聚合酶合成RNA的最佳转录温度。另外，可以看到VSW3 RNA聚合酶无法在37℃保持高活性，RNA产量甚至会随着时间增加而降低。

C.VSW3 RNA聚合酶与T7RP的RNA合成产量比较

根据前面A和B步骤的研究结果，我们选择了VSW3 RNA聚合酶的最适合转录温度25℃和最佳酶浓度0.15uM来同T7RP作比较，T7RP分别再25℃和37℃进行转录反应，在25℃的转录时间都为12小时，在37℃的转录时间为1小时和2小时，琼脂糖电泳结果如附图5所示，VSW3 RNA聚合酶在25℃转和合成RNA的产量都超过了T7RP在25℃和37℃的RNA合成产量。

总结，本发明中VSW3 RNA聚合酶能够在常温或室温下高效合成RNA，其最佳的RNA合成温度为25℃，最佳的酶终浓度为0.15uM，最佳的RNA转录合成时间为12小时。VSW3RNA聚合酶在其最佳的转录条件下合成RNA的产量超过了相同条件下T7RP的产量，也超过了T7RP在其自身最佳转录条件下的RNA产量。此外，如果要想在更低温度下合成RNA，比如15℃下，只需要延长转录时间到20-24小时，最终依然可以获得高产量的RNA，且能够有效保证RNA不降解。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉核圣生物技术有限公司

<120> 低温高产单亚基RNA聚合酶及纯化方法和应用

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(14)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(17)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Leu Pro Phe Xaa Xaa Val Xaa Gln Tyr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Ala Xaa

1 5 10 15

Xaa Asn Thr Arg

20

<210> 2

<211> 2394

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaccaga tcgagctaga acaggaaatg attgacggtg gccgggcgaa gatgttcggc 60

tcattcaatc gcaacgaaga gcaaggagcg gcgcacaaca acccatacgc cgcagcggtg 120

taccggcgat tcgtgcaacc tctggccgat caaatcgacg cctactgcgg tgaggtcaag 180

cgcggcgtga tggcggcagg caaagccctg ctgcgcccgc atgacccgat ggtgttggcg 240

ttcatgaccg ttcgcatggt catggacacc acgctgcaat cgaaggacaa cgcaccaacc 300

gctgtggccc gagccttggg ccagagcatc tacggggaga ctctgctcgc caagtttgag 360

caggtcgaac ccgacctata cttcacgctg gtcaatgact ttgagcggcg tatgaccaag 420

tcggagcggc accggctgac ggttttcaag atgcaggccg agaagaacgg cgtaccgctg 480

cctgtgtggt cgccagagga caagttggcc atcggcacta tcttgctcta ccttgcccgc 540

gatgtcgggc tggtggagat cacagaggtg cgcaagggca agaagactgt gcgcgagtac 600

aacatgacgc cggatgtggc gggcatgctt gacaacatca aggactttgt ggcaggggcc 660

agcccgatgg tgctgccttg tgtggtgcct ccggtgccat ggactgatgc caacaacgga 720

ggataccaca caccgggcat gcgccgcata agcccctgct gcatccgtgg gcgaccgcga 780

gtcgaagacc tgaccgatgt accggacatc ccgttgcgtg cgctcaacat cctccagagc 840

cgcccatggc gcatcaatcg catggtgttg gacgcggtgg atctggtggg ccagcggttc 900

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gacgatgtgc cgaaggaaga aatgaacccc gcgcaactgg ccgagttcgg tgcgtggaag 1020

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tacgactacc gaggccgagc atatgcgaac acgaggggcg ttagcccgca aggttcagat 1200

ctccagaagg cgctgcttat ggcagacgtt ggcgtcccaa tcgccgacga acgagccaag 1260

ttctggttct acacagccgg agcaaaccgg ttcgggtacg acaaagccac actggcagag 1320

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ttcgcccagt acacggcaat gcccgagagc ttcttatctc gcctcgctct tggacaggat 1500

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gcgaccaact tagtgccctc tacaacgcag caggacatct atcgactggt agctgtggag 1620

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acgaggttca gttgtgctga cttcatctac accgagtaca tggcgaagca caaggcgccg 1800

gagttcgcca agggcgacta ccagaaggcc gctcgctggc tgagcgtacc ggtgtgggac 1860

gcaatcggca acgtagtggt caaggcaaga gaggcgatgg catggcttca gaacgcctct 1920

gacgagctga tagacgccgg gatcgacgag atctactggc ggtcgccaag cggattcatg 1980

gttcggcaac ggtacggcaa ggaagaattc gttcttgtca agactcgatt ggctggcgga 2040

gtcagaattc ggccaaccat caagctggag ctagaggaac catgcaagcg ccggcaccgg 2100

aacgggatag ctcccaactt cgttcacagc cacgacgccg cgcacatgca cctcctgatc 2160

tgcgccgccg aggatcatgg gctgggccat ctggcattca tccatgacga ctacggtacg 2220

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gagcaagggt gcccattgac cgcattccgc gacacatacg gcatcacaga agatctcccg 2340

gaacgcggtg atctcgacct gaatctggtt cacgattcca cgtatttctt cgcc 2394

<210> 3

<211> 798

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asn Gln Ile Glu Leu Glu Gln Glu Met Ile Asp Gly Gly Arg Ala

1 5 10 15

Lys Met Phe Gly Ser Phe Asn Arg Asn Glu Glu Gln Gly Ala Ala His

20 25 30

Asn Asn Pro Tyr Ala Ala Ala Val Tyr Arg Arg Phe Val Gln Pro Leu

35 40 45

Ala Asp Gln Ile Asp Ala Tyr Cys Gly Glu Val Lys Arg Gly Val Met

50 55 60

Ala Ala Gly Lys Ala Leu Leu Arg Pro His Asp Pro Met Val Leu Ala

65 70 75 80

Phe Met Thr Val Arg Met Val Met Asp Thr Thr Leu Gln Ser Lys Asp

85 90 95

Asn Ala Pro Thr Ala Val Ala Arg Ala Leu Gly Gln Ser Ile Tyr Gly

100 105 110

Glu Thr Leu Leu Ala Lys Phe Glu Gln Val Glu Pro Asp Leu Tyr Phe

115 120 125

Thr Leu Val Asn Asp Phe Glu Arg Arg Met Thr Lys Ser Glu Arg His

130 135 140

Arg Leu Thr Val Phe Lys Met Gln Ala Glu Lys Asn Gly Val Pro Leu

145 150 155 160

Pro Val Trp Ser Pro Glu Asp Lys Leu Ala Ile Gly Thr Ile Leu Leu

165 170 175

Tyr Leu Ala Arg Asp Val Gly Leu Val Glu Ile Thr Glu Val Arg Lys

180 185 190

Gly Lys Lys Thr Val Arg Glu Tyr Asn Met Thr Pro Asp Val Ala Gly

195 200 205

Met Leu Asp Asn Ile Lys Asp Phe Val Ala Gly Ala Ser Pro Met Val

210 215 220

Leu Pro Cys Val Val Pro Pro Val Pro Trp Thr Asp Ala Asn Asn Gly

225 230 235 240

Gly Tyr His Thr Pro Gly Met Arg Arg Ile Ser Pro Cys Cys Ile Arg

245 250 255

Gly Arg Pro Arg Val Glu Asp Leu Thr Asp Val Pro Asp Ile Pro Leu

260 265 270

Arg Ala Leu Asn Ile Leu Gln Ser Arg Pro Trp Arg Ile Asn Arg Met

275 280 285

Val Leu Asp Ala Val Asp Leu Val Gly Gln Arg Phe Asp Val Gly Glu

290 295 300

Val Leu Ala Gln Ala Glu Leu Pro Lys Pro Lys Ser Leu Leu Trp Leu

305 310 315 320

Asp Asp Val Pro Lys Glu Glu Met Asn Pro Ala Gln Leu Ala Glu Phe

325 330 335

Gly Ala Trp Lys Ile Glu Met Arg Glu Trp Tyr Thr Glu Asn Lys Ser

340 345 350

Arg Gly Val Gln Trp Gly Arg Tyr Tyr Glu Ala Leu Arg Val Ala Arg

355 360 365

Lys Phe Lys Asp Leu Pro Phe Trp Phe Val Tyr Gln Tyr Asp Tyr Arg

370 375 380

Gly Arg Ala Tyr Ala Asn Thr Arg Gly Val Ser Pro Gln Gly Ser Asp

385 390 395 400

Leu Gln Lys Ala Leu Leu Met Ala Asp Val Gly Val Pro Ile Ala Asp

405 410 415

Glu Arg Ala Lys Phe Trp Phe Tyr Thr Ala Gly Ala Asn Arg Phe Gly

420 425 430

Tyr Asp Lys Ala Thr Leu Ala Glu Arg Tyr Glu Trp Thr Val Glu Arg

435 440 445

Ser Glu Met Ile Cys Ala Ile Ala Ala Asp Pro Val Ala Asn Arg Gln

450 455 460

Trp Thr Glu Ala Asp Asn Pro Phe Gln Phe Leu Ala Trp Cys Phe Glu

465 470 475 480

Phe Ala Gln Tyr Thr Ala Met Pro Glu Ser Phe Leu Ser Arg Leu Ala

485 490 495

Leu Gly Gln Asp Gly Ser Cys Asn Gly Leu Gln His Phe Ser Ala Met

500 505 510

Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Leu Ala Thr Asn Leu Val Pro Ser Thr

515 520 525

Thr Gln Gln Asp Ile Tyr Arg Leu Val Ala Val Glu Thr Thr Arg Leu

530 535 540

Leu Gln Ala Met Pro His Glu Asn Cys Glu Phe Thr Leu Lys Trp Lys

545 550 555 560

Leu His Ser Leu Ser Arg Asp Leu Val Lys Arg Ser Val Met Thr Leu

565 570 575

Pro Tyr Gly Ser Thr Arg Phe Ser Cys Ala Asp Phe Ile Tyr Thr Glu

580 585 590

Tyr Met Ala Lys His Lys Ala Pro Glu Phe Ala Lys Gly Asp Tyr Gln

595 600 605

Lys Ala Ala Arg Trp Leu Ser Val Pro Val Trp Asp Ala Ile Gly Asn

610 615 620

Val Val Val Lys Ala Arg Glu Ala Met Ala Trp Leu Gln Asn Ala Ser

625 630 635 640

Asp Glu Leu Ile Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ile Tyr Trp Arg Ser Pro

645 650 655

Ser Gly Phe Met Val Arg Gln Arg Tyr Gly Lys Glu Glu Phe Val Leu

660 665 670

Val Lys Thr Arg Leu Ala Gly Gly Val Arg Ile Arg Pro Thr Ile Lys

675 680 685

Leu Glu Leu Glu Glu Pro Cys Lys Arg Arg His Arg Asn Gly Ile Ala

690 695 700

Pro Asn Phe Val His Ser His Asp Ala Ala His Met His Leu Leu Ile

705 710 715 720

Cys Ala Ala Glu Asp His Gly Leu Gly His Leu Ala Phe Ile His Asp

725 730 735

Asp Tyr Gly Thr Thr Ala Asp Gly Thr Glu Thr Leu His Lys Leu Ile

740 745 750

Arg Ala Thr Phe Val Ala Met Tyr Glu Gln Gly Cys Pro Leu Thr Ala

755 760 765

Phe Arg Asp Thr Tyr Gly Ile Thr Glu Asp Leu Pro Glu Arg Gly Asp

770 775 780

Leu Asp Leu Asn Leu Val His Asp Ser Thr Tyr Phe Phe Ala

785 790 795

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Asn His Lys Val His His His His His His Ser Gly Val Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taattgggcc acctata 17

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttaattgggc cacctatagg gtctagagtc gacctgcagg catgcaagct tg 52

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tataggtggc ccaattaagg atccccgggt accgagctcg aattcactgg cc 52

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taatacgact cactataggg tctagagtcg acctgcaggc atgcaagctt g 51

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagtgagtcg tattaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcactggcc 49

Claims (3)

1.一种用于RNA体外合成的启动子，其特征在于，所述启动子与VSW3 RNA聚合酶共同使用于RNA体外合成过程中；所述启动子的序列如序列表SEQ ID NO.5所示；所述VSW3 RNA聚合酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

2.一种体外合成RNA的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的启动子和VSW3RNA聚合酶共同使用，方法如下：

Ⅰ、设计引物，通过PCR和无缝克隆技术将所需转录合成目的RNA对应的基因序列和所述启动子序列插入到pUC19质粒多克隆位点紧邻的5’端，用NdeI酶切线性化重组质粒作为DNA转录模板；

Ⅱ、加入所述VSW3 RNA聚合酶、DNA转录模板、pH7.9 Tris-HCl，氯化镁，亚精胺，DTT，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应。

3.如权利要求2所述的体外合成RNA的方法，其特征在于，所述步骤Ⅱ中转录反应的温度为4-30℃。