CN112662642B - 突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒逆转录酶及其应用 - Google Patents

突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒逆转录酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(WDSV)逆转录酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，是通过将野生型WDSV逆转录酶类似物的氨基酸序列的第175位甘氨酸分别置换为精氨酸或组氨酸或赖氨酸得到的。同时本发明还公开了该突变型WDSV逆转录酶用于体外逆转录RNA合成cDNA的应用，具体步骤包括：利用重组微生物诱导培养得到突变型WDSV逆转录酶；突变型WDSV逆转录酶的纯化；制备逆转录反应的模板；利用所述WDSV逆转录酶进行体外逆转录反应。本发明的有益效果是：提供了一种具有较高逆转录催化效率和较强热稳定性的新的逆转录酶，并将其用于逆转录RNA以合成cDNA，对研究和开发新颖的更具优势的逆转录酶具有重要的指示作用和应用前景。

Description

突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒逆转录酶及其应用
技术领域
本发明属于微生物核酸代谢酶技术领域，具体涉及突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒逆转录酶及其应用。
背景技术
逆转录酶，又称反转录酶，是依赖于RNA模板的DNA聚合酶的统称。它们由逆转录酶病毒编码，将病毒RNA基因组复制成DNA，再整合进宿主细胞中。目前最常见的两种逆转录酶是来自Moloney小鼠白血病病毒M-MLV逆转录酶和来自鸟类成髓细胞性白血病病毒的AMV逆转录酶，这两种酶具有相同的基本活性，但在许多特性包括最适温度和最适pH值上有所不同(Baranauskas,A.，2012)。由于耐热性低、保真性低、延伸能力低、产量低等等缺陷，以致很多情况下无法得到全长cDNA，因此它们都不是最理想的RNA反转录合成cDNA的工具酶。在随后的数十年中，人们对这两种逆转录酶进行了大量的优化和改造，在提高耐热性和产量等方面取得了一些进展(Arezi,B.，2009)，然而这两种酶都不是天然为RNA体外逆转录合成cDNA而设，其主要缺点越来越成为其研究和应用领域的限制因素。
目前被广泛应用的逆转录酶为M-MLV逆转录酶，该酶可合成较长的cDNA，并且其逆转录效率高，然而该酶的热稳定性较差，高温下易失活，影响逆转录催化效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种新的逆转录酶，即对鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(WDSV)来源的逆转录酶类似物的氨基酸序列进行突变，得到一种突变型WDSV逆转录酶，该酶的逆转录催化效率显著高于原逆转录酶类似物，并且具有较强的热稳定性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种突变型WDSV逆转录酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示，是通过将野生型WDSV逆转录酶类似物的氨基酸序列的第175位甘氨酸分别置换为精氨酸或组氨酸或赖氨酸得到，所述野生型WDSV逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其原理是：突变位点为该酶的RNA结合位点，对其进行定向突变，即用带正电的组氨酸或赖氨酸或精氨酸替换掉该位点的甘氨酸，导致该逆转录酶的构象发生了变化，由于RNA带负电，该突变会增加逆转录酶对底物RNA的亲和性，从而增强了该逆转录酶的逆转录催化效率，同时该逆转录酶的热稳定性也显著增强了。
优选地，所述突变型WDSV逆转录酶的蛋白质氨基端含有组氨酸标签，用于后续进行镍柱亲和层析纯化，以得到不含RNA酶污染的应用级蛋白质。
一种突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用。
优选地，该突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用包括以下步骤：
S1.构建导入有编码突变型WDSV逆转录酶基因的重组微生物，然后经诱导培养得到突变型WDSV逆转录酶；
S2.纯化步骤S1中得到的突变型WDSV逆转录酶；
S3.制备逆转录反应的模板；
S4.以步骤S3的模板和步骤S2的纯化突变型WDSV逆转录酶进行体外逆转录反应。
优选地，步骤S1中，所述重组微生物的构建方法具体为：将合成的突变型WDSV逆转录酶基因克隆到冷休克表达载体pCold中，得到重组载体，并将所述重组载体转化到大肠杆菌中。
优选地，步骤S1中，所述诱导培养条件为25℃，至菌液的OD值为0.8～1.0，然后加入IPTG使其终浓度为0.05mmol/L，诱导表达条件为10℃摇床诱导表达20h。
优选地，步骤S2中，所述突变型WDSV逆转录酶纯化方法包括镍柱亲和层析和蛋白透析，其中所述镍柱亲和层析的方法为：将诱导表达后的菌液进行裂解并将上清液通过镍柱，其中所述WDSV逆转录酶的蛋白质由于其氨基端带有组氨酸标签，因此可与镍柱结合，再分别加入20mmol/L、50mmol/L和200mmol/L的咪唑溶液洗脱蛋白质以获得目的蛋白。咪唑溶液可与镍柱竞争结合以洗脱蛋白，其中带有组氨酸标签的目的蛋白在加入高浓度的咪唑溶液时被洗脱，收集洗脱液以获得目的蛋白质，然后将其加入到透析袋中并置于透析液中进行多次透析以得到纯化的突变型WDSV逆转录酶的蛋白质。
优选地，步骤S3中，逆转录反应的模板的制备方法为：利用RNA聚合酶将DNA转录为RNA，除去DNA并进行RNA纯化，得到所述逆转录反应的模板。
优选地，步骤S4中，所述体外逆转录反应的方法为：利用所述模板和所述突变型WDSV逆转录酶进行体外逆转录，然后通过琼脂糖凝胶电泳对逆转录反应产物进行检测和鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：在原有的逆转录酶类似物的基础上进行了氨基酸的定点突变，得到了一种突变型WDSV逆转录酶，并将其应用于逆转录过程以合成cDNA，发现其逆转录效率显著提高，并且相比于现有的逆转录酶，该突变型WDSV逆转录酶具有较强的热稳定性。
附图说明
图1为本申请实施例1中SDS-PAGE电泳检测突变型WDSV逆转录酶的纯化效果图；M代表蛋白Marker。
图2为本申请实施例1中利用突变型WDSV逆转录酶逆转录sox7 mRNA得到的cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测图。
图3为本申请实施例1中利用突变型WDSV逆转录酶逆转录cas9 mRNA得到的cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例合成了突变型WDSV逆转录酶的基因并通过质粒构建、转化、蛋白表达、蛋白纯化的方法获得了所述突变型WDSV逆转录酶，然后用其进行体外逆转录反应。具体步骤如下：
S1.构建导入有编码突变型WDSV逆转录酶基因的重组微生物，然后经诱导培养得到突变型WDSV逆转录酶：通过基因合成和定点突变，将SEQ ID NO.1所示的鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(WDSV)来源的逆转录酶类似物的氨基酸序列的第175位的甘氨酸突变为精氨酸，得到所述突变型WDSV逆转录酶的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，并在其氨基端加上组氨酸标签。利用PCR和无缝克隆的方法将合成的WDSV逆转录酶的基因克隆到冷休克表达载体pCold中，得到重组载体后将其转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株中；然后将菌置于37℃含有50μg/ml氨苄的LB培养基中摇床培养进行活化，然后将菌液在25℃放大培养，至OD600值为0.8～1.0，然后加入终浓度为0.05mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)于10℃摇床诱导表达20h。
S2.突变型WDSV逆转录酶的纯化：
(1)细菌裂解：将步骤S1中表达后的菌液于5000rpm、4℃离心10min，收集菌体沉淀，将菌体重悬于含有50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、300mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑的裂解液中，超声破碎，然后将其置于冷冻高速离心机中13000rpm、4℃离心40min，收集上清液。
(2)镍柱亲和层析：配制含有50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、300mmol/L NaCl的洗脱缓冲液，利用洗脱缓冲液对咪唑进行溶解和稀释，得到20mmol/L、50mmol/L、200mmol/L三种浓度的咪唑溶液备用，使用10倍镍柱填料体积的洗脱缓冲液平衡镍柱，然后将上述离心后的上清液缓慢加入镍柱中，再按照由低浓度到高浓度的顺序分批加入20mmol/L、50mmol/L、200mmol/L的咪唑溶液过柱，洗脱非特异性结合的杂蛋白并最终将与镍柱结合的蛋白竞争性的洗脱下来；在加入不同浓度梯度的咪唑溶液洗脱时，每一浓度洗脱下来的蛋白液需用若干干净的冻存管保存，并按洗脱的先后顺序及加入的咪唑浓度作好标记。最后将所有洗脱下的蛋白液通过SDS-PAGE电泳检测，选择含有较高浓度的突变型WDSV逆转录酶的溶液。
(3)蛋白透析：剪取一段10-15cm透析袋，底部用重力夹夹紧，将上述含有较高浓度的突变型WDSV逆转录酶溶液加入透析袋中然后用塑料夹封口，将该透析袋置于1L含有20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、2mmol/L DTT、0.1mmol/L EDTA、100mmol/L KCl、0.02％NP-40(细胞组织裂解液)、50％甘油的透析液中，加入磁珠后置于磁力搅拌器上搅拌促进溶液交换，透析约3h后更换干净透析液继续透析3h以上，最后再次更换透析液透析过夜，收集透析后蛋白置于-20℃保存，即得纯化后的突变型WDSV逆转录酶。然后利用SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色对纯化后的突变型WDSV逆转录酶的纯度进行检测。结果如图1所示，可以看出纯化后蛋白条带单一，说明该突变型WDSV逆转录酶经过以上纯化步骤后得到的纯度较高。
S3.制备逆转录反应的模板：通过体外转录方法得到逆转录反应所需sox7 mRNA和cas9mRNA模板，体外转录反应的体系成分如下：40mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，6mmol/LMgCl2，2mmol/L亚精胺，10mmol/L DTT，200mmol/L ATP、GTP、CTP、UTP，0.2μl RNase抑制剂，0.2μl焦磷酸酶，1μmol/L RNA聚合酶，20-60ng PCR模板，补DEPC水至10μl，混匀，反应1小时。转录完成中，用DNA酶除去DNA模板，然后使用RNA Clean&ConcentratorTM-5(ZYMOResearch)试剂盒纯化法(适用于小量检测型)对转录产物进行纯化，得到纯化后的sox7mRNA和cas9 mRNA模板。通过琼脂糖凝胶电泳检测转录产物，以保证条带单一，DNA被完全除去且RNA未被降解。
S4.体外逆转录反应：利用所述突变型WDSV逆转录酶和上述sox7 mRNA、cas9 mRNA模板进行体外逆转录反应。体外逆转录反应的体系成分如下：＞10nmol/L sox7 mRNA或cas9mRNA，20μmol/L基因特异性引物,10mmol/L dNTPs，200mmol/L DTT，0.2μl RNase抑制剂，200nmol/L突变型WDSV逆转录酶，50mmol/L Tris–HCl(pH 8.3)，75mmol/L KCl和3mmol/L MgCl2，补DEPC水至20μl。将反应体系混合好后置于37℃或42℃进行逆转录反应，反应完后加0.1mol/L NaOH除去RNA模板。通过琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行检测，结果如图2和图3所示。所述突变型WDSV逆转录酶成功催化了逆转录反应，合成得到了sox7 cDNA和cas9cDNA。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第175位的甘氨酸突变为组氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第175位的甘氨酸突变为赖氨酸得到突变型WDSV逆转录酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：采用的逆转录酶为未进行定向突变的逆转录酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于：采将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第175位的甘氨酸突变为苏氨酸。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于：采用的逆转录酶为本领域常规的逆转录酶，即采用Promega公司的M-MLV逆转录酶。
应用例1：逆转录效率测定
将实施例1-3、对比例1-3中合成得到的sox7 cDNA和cas9 cDNA的同时进行琼脂糖凝胶电泳检测，并利用Image J软件分别测定其条带亮度与Marker的条带亮度的比值，从而分别得到其相对逆转录效率，结果如表1所示。
表1相对逆转录效率测定结果
sox7 mRNA逆转录效率 cas9 mRNA逆转录效率
实施例1 95.2％ 93.3％
实施例2 85.6％ 84.8％
实施例3 89.3％ 86.9％
对比例1 43.5％ 41.2％
对比例2 35.1％ 32.7％
对比例3 96.3％ 94.4％
根据表1结果可知，本申请得到的所述突变型WDSV逆转录酶，其逆转录效率显著高于原逆转录酶类似物的转录效率，与本领域常规的逆转录酶的逆转录效率相差不大。由对比例2可知，只有将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第175位的甘氨酸突变为精氨酸或组氨酸或赖氨酸时，其逆转录效率得到显著提高，突变为其他氨基酸时反而会降低其逆转录效率，并且将其突变为精氨酸时逆转录效率最高，即本申请通过定点突变得到了一种新的逆转录酶，这对研究和开发新颖的更具优势的逆转录酶具有重要的指示作用和应用前景。
应用例2：高温稳定性
取实施例1-3、对比例1-2中经步骤S2得到的纯化后的逆转录酶及对比例3中本领域常规的M-MLV逆转录酶，利用常规的逆转录反应体系，在60℃条件下，对sox7 mRNA和cas9mRNA进行逆转录反应，合成得到sox7 cDNA和cas9 cDNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并利用Image J软件分别测定其条带亮度与Marker的条带亮度的比值，从而分别得到其相对逆转录效率，结果如表2所示。
表2高温条件下的相对逆转录效率测定结果
sox7 mRNA逆转录效率 cas9 mRNA逆转录效率
实施例1 65.4％ 63.1％
实施例2 60.2％ 57.8％
实施例3 59.6％ 58.1％
对比例1 33.2％ 30.6％
对比例2 25.3％ 23.7％
对比例3 22.3％ 20.5％
据表2结果可知，本申请得到的所述突变型WDSV逆转录酶，在高温下的酶活性即逆转录催化效率显著高于原逆转录酶类似物和本领域常规的M-MLV逆转录酶的转录效率。由对比例2可知，只有将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第175位的甘氨酸突变为精氨酸或组氨酸或赖氨酸时，其热稳定性显著提高，突变为其他氨基酸时热稳定性会降低，同时将其突变为精氨酸时热稳定性最强，即本申请通过定点突变得到了一种逆转录效率较高，具有较强热稳定性的逆转录酶。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 武汉核圣生物技术有限公司
<120> 突变型鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒逆转录酶及其应用
<141> 2019-10-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 651
<212> PRT
<213> 鱼大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(Walleye dermal sarcoma virus)
<400> 1
Met Ser Cys Gln Thr Lys Asn Thr Leu Asn Ile Asp Glu Tyr Leu Leu
1 5 10 15
Gln Phe Pro Asp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Pro Thr Asp Ile Gly Arg
20 25 30
Met Leu Val Pro Pro Ile Thr Ile Lys Ile Lys Asp Asn Ala Ser Leu
35 40 45
Pro Ser Ile Arg Gln Tyr Pro Leu Pro Lys Asp Lys Thr Glu Gly Leu
50 55 60
Arg Pro Leu Ile Ser Ser Leu Glu Asn Gln Gly Ile Leu Ile Lys Cys
65 70 75 80
His Ser Pro Cys Asn Thr Pro Ile Phe Pro Ile Lys Lys Ala Gly Arg
85 90 95
Asp Glu Tyr Arg Met Ile His Asp Leu Arg Ala Ile Asn Asn Ile Val
100 105 110
Ala Pro Leu Thr Ala Val Val Ala Ser Pro Thr Thr Val Leu Ser Asn
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Leu His Trp Phe Thr Val Ile Asp Leu Ser Asn Ala
130 135 140
Phe Phe Ser Val Pro Ile His Lys Asp Ser Gln Tyr Leu Phe Ala Phe
145 150 155 160
Thr Phe Glu Gly His Gln Tyr Thr Trp Thr Val Leu Pro Gln Gly Phe
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Val Gly Tyr Cys Arg His Trp Ile Pro Glu Phe Ser Ile His Ser
290 295 300
Lys Phe Leu Glu Lys Gln Leu Lys Lys Asp Thr Ala Glu Pro Phe Gln
305 310 315 320
Leu Asp Asp Gln Gln Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Lys His Ala Ile
325 330 335
Thr Thr Ala Pro Val Leu Val Val Pro Asp Pro Ala Lys Pro Phe Gln
340 345 350
Leu Tyr Thr Ser His Ser Glu His Ala Ser Ile Ala Val Leu Thr Gln
355 360 365
Lys His Ala Gly Arg Thr Arg Pro Ile Ala Phe Leu Ser Ser Lys Phe
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Leu Ile Ile Tyr Thr Thr His Ala Ile Cys Thr Leu Leu Gln Arg Asp
420 425 430
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Gly Ala Ala Val Val Met His Arg Pro Val
515 520 525
Thr Asp Asp Phe Ile Ile Ile His Gln Gln Pro Gly Gly Ala Ser Ala
530 535 540
Gln Thr Ala Glu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Cys His Leu Ala Thr
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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485 490 495
Asp Leu Pro Ile Pro Asp Pro Asp Met Thr Leu Phe Ser Asp Gly Ser
500 505 510
Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Gly Ala Ala Val Val Met His Arg Pro Val
515 520 525
Thr Asp Asp Phe Ile Ile Ile His Gln Gln Pro Gly Gly Ala Ser Ala
530 535 540
Gln Thr Ala Glu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Cys His Leu Ala Thr
545 550 555 560
Asp Lys Thr Val Asn Ile Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Tyr Gly Val
565 570 575
Val His Asp Phe Gly His Leu Trp Met His Arg Gly Phe Val Thr Ser
580 585 590
Ala Gly Thr Pro Ile Lys Asn His Lys Glu Ile Glu Tyr Leu Leu Lys
595 600 605
Gln Ile Met Lys Pro Lys Gln Val Ser Val Ile Lys Ile Glu Ala His
610 615 620
Thr Lys Gly Val Ser Met Glu Val Arg Gly Asn Ala Ala Ala Asp Glu
625 630 635 640
Ala Ala Lys Asn Ala Val Phe Leu Val Gln Arg
645 650
<210> 3
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Cys Gln Thr Lys Asn Thr Leu Asn Ile Asp Glu Tyr Leu Leu
1 5 10 15
Gln Phe Pro Asp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Pro Thr Asp Ile Gly Arg
20 25 30
Met Leu Val Pro Pro Ile Thr Ile Lys Ile Lys Asp Asn Ala Ser Leu
35 40 45
Pro Ser Ile Arg Gln Tyr Pro Leu Pro Lys Asp Lys Thr Glu Gly Leu
50 55 60
Arg Pro Leu Ile Ser Ser Leu Glu Asn Gln Gly Ile Leu Ile Lys Cys
65 70 75 80
His Ser Pro Cys Asn Thr Pro Ile Phe Pro Ile Lys Lys Ala Gly Arg
85 90 95
Asp Glu Tyr Arg Met Ile His Asp Leu Arg Ala Ile Asn Asn Ile Val
100 105 110
Ala Pro Leu Thr Ala Val Val Ala Ser Pro Thr Thr Val Leu Ser Asn
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Leu His Trp Phe Thr Val Ile Asp Leu Ser Asn Ala
130 135 140
Phe Phe Ser Val Pro Ile His Lys Asp Ser Gln Tyr Leu Phe Ala Phe
145 150 155 160
Thr Phe Glu Gly His Gln Tyr Thr Trp Thr Val Leu Pro Gln His Phe
165 170 175
Ile His Ser Pro Thr Leu Phe Ser Gln Ala Leu Tyr Gln Ser Leu His
180 185 190
Lys Ile Lys Phe Lys Ile Ser Ser Glu Ile Cys Ile Tyr Met Asp Asp
195 200 205
Val Leu Ile Ala Ser Lys Asp Arg Asp Thr Asn Leu Lys Asp Thr Ala
210 215 220
Val Met Leu Gln His Leu Ala Ser Glu Gly His Lys Val Ser Lys Lys
225 230 235 240
Lys Leu Gln Leu Cys Gln Gln Glu Val Val Tyr Leu Gly Gln Leu Leu
245 250 255
Thr Pro Glu Gly Arg Lys Ile Leu Pro Asp Arg Lys Val Thr Val Ser
260 265 270
Gln Phe Gln Gln Pro Thr Thr Ile Arg Gln Ile Arg Ala Phe Leu Gly
275 280 285
Leu Val Gly Tyr Cys Arg His Trp Ile Pro Glu Phe Ser Ile His Ser
290 295 300
Lys Phe Leu Glu Lys Gln Leu Lys Lys Asp Thr Ala Glu Pro Phe Gln
305 310 315 320
Leu Asp Asp Gln Gln Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Lys His Ala Ile
325 330 335
Thr Thr Ala Pro Val Leu Val Val Pro Asp Pro Ala Lys Pro Phe Gln
340 345 350
Leu Tyr Thr Ser His Ser Glu His Ala Ser Ile Ala Val Leu Thr Gln
355 360 365
Lys His Ala Gly Arg Thr Arg Pro Ile Ala Phe Leu Ser Ser Lys Phe
370 375 380
Asp Ala Ile Glu Ser Gly Leu Pro Pro Cys Leu Lys Ala Cys Ala Ser
385 390 395 400
Ile His Arg Ser Leu Thr Gln Ala Asp Ser Phe Ile Leu Gly Ala Pro
405 410 415
Leu Ile Ile Tyr Thr Thr His Ala Ile Cys Thr Leu Leu Gln Arg Asp
420 425 430
Arg Ser Gln Leu Val Thr Ala Ser Arg Phe Ser Lys Trp Glu Ala Asp
435 440 445
Leu Leu Arg Pro Glu Leu Thr Phe Val Ala Cys Ser Ala Val Ser Pro
450 455 460
Ala His Leu Tyr Met Gln Ser Cys Glu Asn Asn Ile Pro Pro His Asp
465 470 475 480
Cys Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Pro Arg Pro Asp Leu Ser
485 490 495
Asp Leu Pro Ile Pro Asp Pro Asp Met Thr Leu Phe Ser Asp Gly Ser
500 505 510
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515 520 525
Thr Asp Asp Phe Ile Ile Ile His Gln Gln Pro Gly Gly Ala Ser Ala
530 535 540
Gln Thr Ala Glu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Cys His Leu Ala Thr
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Thr Lys Gly Val Ser Met Glu Val Arg Gly Asn Ala Ala Ala Asp Glu
625 630 635 640
Ala Ala Lys Asn Ala Val Phe Leu Val Gln Arg
645 650
<210> 4
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ser Cys Gln Thr Lys Asn Thr Leu Asn Ile Asp Glu Tyr Leu Leu
1 5 10 15
Gln Phe Pro Asp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Pro Thr Asp Ile Gly Arg
20 25 30
Met Leu Val Pro Pro Ile Thr Ile Lys Ile Lys Asp Asn Ala Ser Leu
35 40 45
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50 55 60
Arg Pro Leu Ile Ser Ser Leu Glu Asn Gln Gly Ile Leu Ile Lys Cys
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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625 630 635 640
Ala Ala Lys Asn Ala Val Phe Leu Val Gln Arg
645 650

Claims (9)

1.一种突变型WDSV逆转录酶，其特征在于，所述突变型WDSV逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，通过将野生型WDSV逆转录酶类似物的氨基酸序列的第175位甘氨酸分别置换为精氨酸或组氨酸或赖氨酸得到，所述野生型WDSV逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种突变型WDSV逆转录酶，其特征在于，所述突变型WDSV逆转录酶的蛋白质氨基端含有组氨酸标签。
3.一种权利要求1所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用。
4.根据权利要求3所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建导入有编码突变型WDSV逆转录酶基因的重组微生物，然后经诱导培养得到突变型WDSV逆转录酶；
S2.纯化步骤S1中得到的突变型WDSV逆转录酶；
S3.制备逆转录反应的模板；
S4.以步骤S3的模板和步骤S2的纯化突变型WDSV逆转录酶进行体外逆转录反应。
5.根据权利要求4所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用，其特征在于，步骤S1中，所述重组微生物的构建方法具体为：将合成的突变型WDSV逆转录酶基因克隆到冷休克表达载体pCold中，得到重组载体，并将所述重组载体转化到大肠杆菌中。
6.根据权利要求4所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用，其特征在于，步骤S1中，所述诱导培养条件为25℃，至菌液的OD值为0.8～1.0，然后加入IPTG使其终浓度为0.05mmol/L，诱导表达条件为10℃摇床诱导表达20h。
7.根据权利要求4所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用，其特征在于，步骤S2中，所述突变型WDSV逆转录酶纯化方法包括镍柱亲和层析和蛋白透析，其中所述镍柱亲和层析的方法为：将诱导表达后的菌液进行裂解并将上清液通过镍柱，再分别加入20mmol/L、50mmol/L和200mmol/L的咪唑溶液洗脱蛋白质以获得目的蛋白。
8.根据权利要求4所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用，其特征在于，步骤S3中，逆转录反应的模板的制备方法为：利用RNA聚合酶将DNA转录为RNA，除去DNA并进行RNA纯化，得到所述逆转录反应的模板。
9.根据权利要求4所述的突变型WDSV逆转录酶在逆转录反应中的应用，其特征在于，步骤S4中，所述体外逆转录反应的方法为：利用所述模板和所述突变型WDSV逆转录酶进行体外逆转录，然后通过琼脂糖凝胶电泳对逆转录反应产物进行检测和鉴定。
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