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Metodo para la produccion de una transcriptasa inversa amv heterodimerica activa, en celulas procariotas.
ES2346511T3
Spain
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English - Inventor
Harald Dr. Sobek Rainer Dr. Mueller Manfred Schmidt Bruno Dr. Frey Bernhard Dr. Suppmann Rainer Dr. Schmuck Johann-Peter Dr. Thalhofer Peter Dr. Pallua Markus Dr. Pajatsch - Current Assignee
- HOFFMANN LA ROCHE
- F Hoffmann La Roche AG
Description
translated from
Método para la producción de una transcriptasa
inversa AMV heterodimérica activa, en células procariotas.
La presente invención se refiere a un método
para la producción de una transcriptasa inversa AMV
(AMV-RT) activa, heterodimérica recombinante
mediante la expresión de una o varias secuencias de ADN que
codifican las subunidades \alpha y/o \beta de la
AMV-RT en células procariotas bajo ciertas
condiciones de crecimiento e inducción.
El descubrimiento de estas transcriptasas
inversas en los años setenta demostró que era falso el "dogma
central" de la biología molecular sobre la transferencia de
información desde el ADN a través del ARN a las proteínas como un
proceso unidireccional (Termin H. y Mizutani S., 1970 Nature
226:1211-1213; Baltimore D., 1970, Nature
226:1209-1211). La caracterización enzimática de
estas polimerasas de ADN dependientes de ARN es la base para la
comprensión actual del ciclo de amplificación de los virus ARN y de
este modo también del desarrollo y extensión de enfermedades
provocadas por este tipo de virus (cáncer, SIDA, etc.).
Sin embargo, las transcriptasas inversas también
son una herramienta para los biólogos moleculares para la síntesis,
amplificación y clonación de ADNs complementarios
(RT-PCR). Esta tecnología permite un examen
simplificado y acelerado de la expresión génica en células
eucariotas. Tras aislar el ARNm total a partir de extractos
celulares o tejidos, el ARNm se traduce de nuevo en ADNc mediante la
transcriptasa inversa y se amplifica mediante la etapa subsiguiente
de PCR para permitir la clonación y caracterización. En
consecuencia, no es necesario, por un lado, elucidar las
estructuras de intrones y exones de los genes, pero, por otro lado,
también es posible examinar la expresión génica en la célula
durante varios ciclos vitales o durante el desarrollo de
enfermedades (tales como el
cáncer).
cáncer).
Hasta ahora se han analizado en profundidad las
transcriptasas inversas (RT) de tres retrovirus diferentes: La RT
del Virus de la Leucemia Murina de Moloney
(M-MLV). Este enzima está formado por una única
subunidad con un peso molecular de 78 kDa (Prasad V.R., 1993
revisado en: Reverse Transcriptase ("Transcriptasas inversas"),
Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 135). Además se conoce una RT del Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (HIV). Esta RT es un heterodímero
compuesto por dos subunidades, p66 y p51, formándose la subunidad
p51 por la escisión proteolítica de p66 (Le Grice S.F.J., 1993
revisado en: Reverse Transcriptase ("Transcriptasas
inversas"), Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 163). Además se conocen RTs del Virus del
Sarcoma-Leucosis Aviar (ASLV). La RT obtenible
del Virus de la Mieloblastosis Aviar (AMV) también pertenece a la
familia ASLV. Esta RT también es un heterodímero compuesto de una
cadena-\alpha con un peso molecular de
aproximadamente 63 kDa y una cadena-\beta con un
peso molecular de aproximadamente 95 kDa. En este caso, la
cadena-\alpha también se forma por el
procesamiento proteolítico de la cadena-\beta
(Golomb M. y Grandgenett D., 1979, J. Biol. Chem. 254:
1606-1613; Weiss R. y otros, eds. 1984, Molecular
Biology of tumor viruses ("Biología molecular de los virus
tumorales"), 2ª edición: RNA tumor viruses ("Virus tumorales
ARN") 1/texto. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
Nueva York).
Mientras que la RT de M-MLV se
expresa en E. coli en forma de monómero y la RT de HIV como
un heterodímero, no ha sido posible hasta la fecha expresar de
forma satisfactoria la AMV-RT como un heterodímero
soluble o activo en E. coli u otros procariotas. Aunque
según la patente WO 00/42199 se expresan algunas variantes de la RT
en E. coli o preferentemente en células eucariotas de
insecto, la RT deseada que se obtiene mediante este proceso está
formada principalmente (aproximadamente un 90%) por un componente
insoluble.
Además es difícil medir la
AMV-RT en extractos celulares crudos de E.
coli dado, por un lado, que los moldes de ARN se degradan por
ARNasas intrínsecas de E. coli y, por otro lado, las cepas de
E. coli poseen una polimerasa de ADN que también posee
actividad RT además de la actividad polimerasa de ADN (Ricchetti,
M. y Huc, H., 1993 EMBO J. 12 (2), 387-396). Por
tanto esta actividad RT intrínseca de E. coli interfiere de
forma considerable con la determinación de la actividad de la
AMV-RT recombinante en extractos crudos de E.
coli y en las fracciones de la purificación.
Por ello, el objetivo de la presente invención
es dar a conocer una AMV-RT heterodimérica activa
recombinante en cantidades adecuadas.
El objetivo se consigue mediante un método para
la producción de una AMV-RT heterodimérica activa en
células huésped procariotas en el que se clonan una o varias
secuencias de ADN que codifican las subunidades o cadenas \alpha
y \beta de la AMV-RT en plásmidos de expresión, se
transforman los plásmidos de expresión en células procariotas, se
induce la expresión de la AMV-RT heterodimérica con
una concentración de inductor entre 0,1 y 0,5 mM a una temperatura
de crecimiento de aproximadamente 15ºC, y se purifica la
AMV-RT heterodimérica recombinante, es decir se
aísla de las células. Son genes y secuencias de ADN adecuadas, entre
otras, aquellas que codifican solamente una de las subunidades de
la AMV-RT. A continuación puede convertirse una
parte del producto de expresión mediante algunos procedimientos,
tales como la escisión proteolítica de la cadena \beta dando
lugar a la otra subunidad. Las secuencias con identificador de
secuencia nº4 y nº5 han demostrado ser particularmente adecuadas
para el método de acuerdo con la invención que genera una
AMV-RT heterodimérica activa compuesta por las
subunidades con los identificadores de secuencia nº 6 y nº 7.
\newpage
Los genes estructurales y las secuencias de ADN
que codifican las subunidades de la AMV-RT pueden
clonarse o bien en plásmidos de expresión independientes y
diferentes o bien en un solo plásmido de expresión, opcionalmente
en presencia de los denominados plásmidos colaboradores, y
expresarse en una célula huésped adecuada. Son plásmidos de
expresión adecuados, por ejemplo, pDS, pKK177-3 o
pKKT5. De acuerdo con la presente invención, es preferente el
plásmido pKKT5 en el cual se insertan los correspondientes genes
estructurales bajo el control del promotor T5. Otros promotores
potenciales, que son preferentemente promotores inducibles por IPTG,
son, por ejemplo, los promotores lac, lac UV5 o tac. Plásmidos
colaboradores alternativos, tales como el plásmido pUBS520 y
marcadores de selección como la ampicilina o la kanamicina son en
principio conocidos por los expertos en la técnica.
Los plásmidos de expresión y opcionalmente otros
plásmidos colaboradores se transforman en una célula procariota
huésped adecuada. De acuerdo con la presente invención es preferente
la utilización de una cepa de E. coli tal como E.
coli K12 C600, DH5\alpha, LE392, JM83, JM105, NM522, M15,
RR1\Delta15, UT5600, TG1, A1200 o las cepas de E. coli B,
BL21, HB101. De acuerdo con la presente invención es particularmente
preferente la cepa de E. coli LE392.
La expresión de la AMV-RT
heterodimérica puede inducirse mediante diversos procedimientos. En
particular ciertas condiciones de crecimiento e inducción tienen
efectos positivos sobre la expresión de la AMV-RT
activa. Una temperatura de crecimiento de aproximadamente 15ºC y
una concentración de inductor entre 0,1 mM y 0,5 mM,
preferentemente de aproximadamente 0,15 mM, han demostrado ser
particularmente adecuadas. De acuerdo con la presente invención se
utilizan preferentemente como inductores IPTG
(isopropilo-\beta-D-tiogalactopiranósido)
o lactosa.
Además se ha evidenciado que la expresión
soluble de la AMV-RT en células procariotas puede
aumentarse mediante la expresión concomitante de genes
colaboradores. En particular, son genes colaboradores potenciales el
gen trpT que codifica el ARNt del triptófano. Además son
adecuados para la expresión soluble los genes de chaperonas tales
como los genes que codifican GroEL y GroES, GrpE, ClpB, Dnak y
DnaJ. Los genes de una o varias chaperonas se ubican en un plásmido
colaborador con un promotor inducible; los genes que codifican las
chaperonas GroEL y GroES se encuentran bajo el control de un
promotor constitucional en el plásmido de expresión en el que
también se ubican los genes estructurales de las cadenas \alpha
y/o \beta. Sin embargo, es particularmente preferente, de acuerdo
con la presente invención, que los genes que codifican GroEL y GroES
se clonen en el plásmido de expresión en el que se encuentran los
genes de las cadenas \alpha y \beta y que los genes que
codifican Dnak; DnaJ, GrpE y ClpB se clonen en un plásmido
colaborador.
Además de métodos que son generalmente conocidos
por los expertos en la técnica, es especialmente ventajoso utilizar
materiales de cromatografía de afinidad tales como materiales
quelantes de iones de metal o intercambiadores de cationes para
purificar y aislar la AMV-RT heterodimérica
recombinante del extracto celular. Es particularmente ventajoso
para la purificación de la AMV-RT que los productos
de expresión, es decir la cadena \alpha así como la cadena
\beta se fusionen con secuencias de péptidos capaces de unirse de
forma reversible a materiales de columna concretos tales como
intercambiadores de cationes, materiales quelantes de iones de
metal, tales como resinas de ácido nitriloacético (NTA) de zinc,
níquel o cobre. Las secuencias de péptidos adecuadas, de acuerdo
con la presente invención, pueden poseer entre dos y aproximadamente
100 aminoácidos o derivados de aminoácidos. Las secuencias de
péptidos compuestas por entre dos y diez aminoácidos, por ejemplo,
residuos arginina o histidina, se han demostrado particularmente
adecuadas para la presente invención. Además también se ha
demostrado particularmente ventajoso utilizar aquellas secuencias de
péptidos que contienen ocho residuos arginina o seis residuos
histidina. Además, también son adecuadas para el método, de acuerdo
con la presente invención, secuencias de péptidos disponibles
comercialmente tales como Strep-tag® (IBA GmbH,
Göttingen/Alemania) o GST-tag (Pharmacia,
Uppsala/Suecia).
La invención se describe en mayor detalle
mediante los ejemplos siguientes:
1.
Ejemplo
Se utilizó la secuencia del banco de datos
(identificador MEDLINE 94366722, Baluda y otros, 1994) para diseñar
oligonucleótidos cebadores para el aislamiento de la cadena \beta
(ver identificadores de secuencia nº 1 y 2). Se incorporaron un
sitio de escisión por endonucleasa de restricción EcoRI en el
extremo 5' y un sitio de escisión de restricción PstI en el
extremo 3' para la clonación subsiguiente en vectores. Además se
diseñó un cebador 3' adicional (ver el identificador de secuencia nº
3) que permite el aislamiento de la cadena \alpha. Ambas cadenas
se rescataron mediante PCR a partir de un lisado de virus (ATCC
VR-265) mediante una PCR inversa así como a partir
de una clona de E. coli (ATCC 31990) que porta una cadena
\beta en un plásmido. Las mezclas de PCR se aplicaron a un gel de
agarosa al 1%, los fragmentos de aproximadamente 1715 pares de
bases correspondientes a la cadena \alpha y de aproximadamente
2570 pares de bases correspondientes a la cadena \beta se
aislaron del gel de agarosa (Kit de extracción de geles, QIAEX II,
Qiagen/Alemania), se escindieron con las endonucleasas de
restricción mencionadas anteriormente y se clonaron en un fragmento
de vector pUC19 que también se había linealizado con EcoRI y
PstI y aislado. Para ello se tomaron con pipeta 1 \muL (20
ng) de fragmento de vector y 3 \muL (100 ng) de fragmento de PCR,
1 \muL de tampón ligasa 10x (Maniatis y otros, 1989 Molecular
Cloning: A Laboratory Manual ("Clonación molecular: Un manual de
laboratorio, 1989"), segunda edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York (EE.UU.), vol. 27), 1 \muL de ligasa
de ADN T4, 4 \muL de H_{2}O_{bidestilada} estéril, se
mezclaron cuidadosamente y se incubaron durante una noche a 16ºC. A
continuación se examinaron los genes clonados mediante análisis de
restricción y secuenciación. Las secuencias se muestran con el
identificador de secuencia nº4(cadena \alpha) y con el
identificador de secuencia nº5 (cadena \beta).
La comparación con la secuencia del banco de
datos (identificador MEDLINE 94366722, Baluda M.A., y Reddy, E.P.,
1994, Oncogene 9:2761-2774) rindió una homología del
98,8% a nivel de ADN para la cadena \alpha así como para la
cadena \beta. Cuando se comparan las secuencias de aminoácidos
resultantes, se hace aparente que la mayoría de substituciones a
nivel de ADN son mutaciones de las denominadas silentes es decir no
suponen substituciones de aminoácidos. Solamente tres
substituciones de bases dieron lugar a substituciones de aminoácidos
pero se hallan de forma reproducible en cada producto de PCR
aislado. Estas son las substituciones Arg273Met, Arg304Gln, y
Asp495Glu. Las secuencias de aminoácidos de ambas cadenas se
muestran en los identificadores de secuencia nº 6 (cadena \alpha)
y nº 7 (cadena \beta).
2.
Ejemplo
Para expresar la AMV-RT, se
clonaron separadamente los genes de ambas cadenas en los vectores de
expresión de manera que ambos genes estructurales se insertaron con
la orientación correcta bajo el control del promotor T5. Para ello
los genes correspondientes a la cadena \alpha y a la cadena
\beta se cortaron del plásmido pUC19 mediante EcoRI y
PstI, las mezclas de restricción se separaron mediante
electroforesis en gel de agarosa y se aislaron del gel de agarosa
el fragmento de 1715 pares de bases correspondiente a la cadena
\alpha y el fragmento de 2570 pares de bases correspondiente a la
cadena \beta. Para la expresión se utilizó el plásmido pKKT5, que
se forma a partir de pKK177-3 (Kopetzki y otros,
1989, Mol. Gen. Genet. 216: 149-155) substituyendo
el promotor tac con el promotor T5 de pDS (Bujard y otros, 1987,
Methods Enzymol. 155: 416-433). Se eliminó el sitio
de escisión de la endonucleasa de restricción EcoRI en la
secuencia del promotor T5 mediante mutaciones de dos puntos. El
plásmido de expresión resultante se cortó con EcoRI y
PstI para la inserción de los genes de la
AMV-RT, la mezcla de restricción se separó mediante
electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de vector
resultante de aproximadamente 2500 pares de bases se aisló del gel
de agarosa. El fragmento de vector obtenido de este modo se ligó
separadamente tal como se ha descrito previamente con los genes de
la cadena \alpha y de la cadena \beta descritos en el ejemplo 1.
Se comprobó la inserción correcta de los genes mediante control de
restricción y secuenciación. Primeramente el plásmido resultante
pAMV-\alpha y pAMV-\beta se
transformó concomitantemente por separado con el plásmido
colaborador pUBS520 para controlar la expresión en varias cepas de
E. coli. En este caso es concebible que la cadena \alpha y
la cadena \beta puedan expresarse por separado para obtener
homodímeros \alpha\alpha y \beta\beta. El plásmido
colaborador pUBS520 (Brinkmann y otros., 1989, Gene 85:
109-114) porta entre otros el gen lacl^{q} que
codifica el represor lac y el gen dnaY que codifica el
infrecuente ARNt^{Arg} en E. coli que reconoce los
codones AGA y AGG (García y otros, 1986, Cell 45:
453-459). Como marcador de selección se utilizó el
gen de resistencia a la kanamicina del transposón TN903.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon células competentes de varias
cepas de E. coli de acuerdo con el método de Hanahan (J. Mol.
Biol. 1983, vol. 166, 557). 200 \muL de células E. coli
LE392 preparadas de este modo se mezclaron con 20 ng ADN de
plásmido de expresión pAMV-\alpha o
pAMV-\beta aislado y 40 ng de ADN de plásmido
colaborador. Tras 30 minutos de incubación en hielo se realizó un
choque térmico (90 segundos a 42ºC). A continuación las células se
transfirieron a 1 mL de medio LB y se incubaron durante 1 hora a
37ºC en medio LB para la expresión fenotípica. Se pusieron
alícuotas de esta mezcla de transformación en placas de LB que
contenían ampicilina y kanamicina como marcadores de selección y se
incubaron durante 15 horas a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar el gen que codifica la cadena
\alpha de la AMV-RT, se inocularon clonas que
contenían el plásmido en 3 mL de medio LB_{ampkan} y se incubaron
a 30ºC en un agitador. A una densidad óptica de 0,5 (medida a 550
nm, OD_{550}), las células se indujeron con IPTG 0,5 mM y se
incubaron durante 4 horas a 30ºC en un agitador. A continuación se
determinó la densidad óptica de las clonas de expresión
individuales, se retiró una alícuota correspondiente a una
OD_{550} de 5,0/mL y se centrifugaron las células (10 min, 6.000
rpm, 4ºC). La pastilla de células se resuspendió en 400 \muL de
tampón TE (TRIS 50 mM/EDTA 50 mM, pH 8,0), se rompieron las células
mediante ultrasonidos y se separó la fracción de proteínas solubles
de la fracción de proteínas insolubles mediante centrifugación (10
minutos, 14.000 rpm, 4ºC). Se añadió tampón de aplicación con SDS y
\beta-mercaptoetanol a todas las fracciones y se
desnaturalizaron las proteínas mediante ebullición (5 minutos
100ºC). Tras ello se analizaron 10 \muL de cada fracción mediante
un gel SDS analítico (10%) (Laemmli U.K., 1970, Nature 227:
555-557).
El análisis del gel SDS muestra una clara
sobreexpresión de la cadena \alpha. Se observa una banda adicional
fuertemente sobreexpresada de aproximadamente 63 kDa que no se
observa con las clonas control no inducidas o las clonas control
inducidas que no contienen el plásmido. Una pequeña parte de la
cadena \alpha sobreexpresada aparece en la fracción de proteínas
solubles mientras que la cantidad principal está formada por una
proteína expresada insoluble.
Para expresar el gen que codifica la cadena
\beta de la AMV-RT, se inocularon 3 mL de medio
LB_{ampkan} con clonas que contenían el plásmido y se incubaron a
30ºC en un agitador. A una OD_{550} (densidad óptica) de 0,5, las
células se indujeron con IPTG 0,5 mM y se incubaron durante 4 horas
a 30ºC en un agitador. A continuación se determinó la densidad
óptica de las clonas de expresión individuales, se retiró una
alícuota correspondiente a una OD_{550} de 5,0/mL y se
centrifugaron las células (10 min, 6.000 rpm, 4ºC). La pastilla de
células se resuspendió en 400 \muL de tampón TE (TRIS 50 mM/EDTA
50 mM, pH 8,0), se rompieron las células mediante ultrasonidos y se
separó la fracción de proteínas solubles de la fracción de proteínas
insolubles mediante centrifugación (10 minutos, 14.000 rpm, 4ºC).
Se añadió tampón de aplicación con SDS y
\beta-mercaptoetanol a todas las fracciones y se
desnaturalizaron las proteínas mediante ebullición (5 minutos
100ºC). Tras ello se analizaron 10 \muL de cada fracción mediante
un gel SDS analítico (8%) (Laemmli U.K., 1970, Nature 227:
555-557).
El análisis del gel SDS muestra una clara
sobreexpresión de la cadena \beta. Se observa una banda adicional
fuertemente sobreexpresada de aproximadamente 95 kDa que no se
observa con las clonas control no inducidas o las clonas control
inducidas que no contienen el plásmido. La mayoría de la cadena
\beta sobreexpresada aparece en la fracción de proteínas
insolubles, sin embargo, también se observa una ligera
sobreexpresión en la fracción de proteínas solubles.
Para expresar ambas cadenas en una célula,
primeramente deben volver a clonarse los casetes de expresión
laqI^{q} y dnaY a partir del plásmido colaborador
pUBS520 en los plásmidos de expresión. El casete de expresión
lacl^{q} se clonó en pAMV-\alpha y el casete de
expresión dnaY se clonó en el plásmido de expresión
pAMV-\beta. Para garantizar una multiplicación
estable de los plásmidos de expresión, se substituyó el gen de
resistencia a la ampicilina de pAMV-\alpha por el
gen de resistencia a la kanamicina de pUBS520. A continuación se
transformaron concomitantemente los plásmidos de expresión
resultantes pAMV-\alpha_{lacIq} y
pAMV-\beta_{dnaY} en varias cepas de expresión
de E. coli.
Para expresar los genes que codifican la cadena
\alpha y la cadena \beta de la AMV-RT, se
inocularon 3 mL de medio LB_{ampkan} con clonas que contenían los
plásmidos y se incubaron a 30ºC en un agitador. A una OD_{550 \
nm} de 0,5, las células se indujeron con IPTG 0,5 mM y se incubaron
durante 4 horas a 30ºC en un agitador. A continuación se determinó
la densidad óptica de las clonas de expresión individuales, se
retiró una alícuota correspondiente a una OD_{550} de 5,0/mL y se
centrifugaron las células (10 min, 6.000 rpm, 4ºC). La pastilla de
células se resuspendió en 400 \muL de tampón TE (TRIS 50 mM/EDTA
50 mM, pH 8,0), se rompieron las células mediante ultrasonidos y se
separó la fracción de proteínas solubles de la fracción de
proteínas insolubles mediante centrifugación (10 minutos, 14.000
rpm, 4ºC). Se añadió tampón de aplicación con SDS y
\beta-mercaptoetanol a todas las fracciones y se
desnaturalizaron las proteínas mediante ebullición (5 minutos
100ºC). Tras ello se analizaron 10 \muL de cada fracción mediante
un gel SDS analítico (8%) (Laemmli U.K., 1970, Nature 227:
555-557).
El análisis del gel SDS muestra
sorprendentemente una clara sobreexpresión de la cadena \alpha y
de la cadena \beta. Se observan unas bandas adicionales
fuertemente sobreexpresadas de aproximadamente 63 kDa y 95 kDa que
no se observan en las clonas control no inducidas o en las clonas
control inducidas que no contienen plásmido. La distribución de las
bandas entre la fracción soluble e insoluble es similar a la de los
experimentos en los que se expresan ambas cadenas de forma
separada. El rendimiento de expresión de ambas cadenas es
globalmente algo inferior a la de la expresión por separado.
3.
Ejemplo
Para purificar de forma eficiente los
heterodímeros de AMV-RT recombinantes, se fusionaron
secuencias de péptidos adecuadas, denominadas etiquetas, al extremo
5' de ambas cadenas. Las etiquetas permiten realizar cromatografías
de afinidad. Una serie de dos cromatografías de afinidad específicas
cada una específica para uno de los dos etiquetas permite
adicionalmente el aislamiento de heterodímeros puros (Wende W. y
otros, 1996, Biol. Chem. 377, 625-632). Se
utilizaron diseños de cebadores adecuados para unir ocho residuos
arginina a la cadena \alpha y seis residuos de histidina a la
cadena \beta mediante reacciones de PCR. Las secuencias de los
cebadores sentido se muestran en el identificador de secuencia nº8
(cebador 5' para la cadena \alpha) y el identificador de
secuencia nº9 (cebador 5' para la cadena \beta). Como cebadores
antisentido se utilizaron los oligonucleótidos del identificador de
secuencia nº2 (cadena \beta) y del identificador de secuencia nº3
(cadena \alpha) que ya se habían utilizado en el aislamiento de
los genes.
Las mezclas de PCR se aplicaron a un gel de
agarosa al 1%, se aislaron los fragmentos de PCR de 1739 pares de
bases de la cadena \alpha y de 2597 pares de bases de la cadena
\beta del gel de agarosa (Kit de extracción de geles, QIAEX II,
Qiagen, Alemania), se escindieron con las endonucleasas de
restricción EcoRI y PstI y se clonaron en un
fragmento de vector del plásmido de expresión preferente que también
se había linealizado con EcoRI y PstI y aislado.
Para ello se tomaron con pipeta 1 \muL (20 ng) de fragmento de
vector y 3 \muL (100 ng) de fragmento de PCR, 1 \muL de tampón
ligasa 10x (Maniatis y otros, 1989 Molecular Cloning: A Laboratory
Manual ("Clonación molecular: Un manual de laboratorio, 1989"),
segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York
(EE.UU.), vol. 27), 1 \muL de ligasa de ADN T4, 4 \muL de
H_{2}O_{bidestilada} estéril, se mezclaron cuidadosamente y se
incubaron durante una noche a 16ºC. A continuación, los genes
clonados se examinaron mediante análisis de restricción y
secuenciación. Los plásmidos de expresión resultantes se
denominaron
pAMV-\alpha_{laqI-Arg} y
pAMV-\beta_{dnaY-His}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon células competentes de varias
cepas de E. coli de acuerdo con el método de Hanahan (J. Mol.
Biol. 1983, vol. 166, 557). (ver ejemplo 2.2).
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar ambas cadenas con etiquetas en una
célula, diversas cepas de expresión de E. coli se
transformaron concomitantemente con los plásmidos de expresión
pAMV-\alpha_{laqIq-Arg} y
pAMV-\beta_{dnaY-His}.
Para expresar los genes que codifican la cadena
\alpha con un etiqueta-Arg y la cadena \beta con
un etiqueta-His de la AMV-RT, se
inocularon 3 mL de medio LB_{ampkan} con clonas que contenían los
plásmidos y se incubaron a 30ºC en un agitador. A una OD_{550} de
0,5 las células se indujeron con IPTG 0,5 mM y se incubaron durante
4 horas a 30ºC en un agitador. A continuación se determinó la
densidad óptica de las clonas de expresión individuales, se retiró
una alícuota correspondiente a una OD_{550} de 5,0/mL y se
centrifugaron las células (10 min, 6.000 rpm, 4ºC). La pastilla de
células se resuspendió en 400 \muL de tampón TE (Tris 50 mM/EDTA
50 mM, pH 8,0), se rompieron las células mediante ultrasonidos y se
separó la fracción de proteínas solubles de la fracción de
proteínas insolubles mediante centrifugación (10 minutos, 14.000
rpm, 4ºC). Se añadió tampón de aplicación con SDS y
\beta-mercaptoetanol a todas las fracciones y se
desnaturalizaron las proteínas mediante ebullición (5 minutos,
100ºC). Tras ello se analizaron 10 \muL de cada fracción mediante
un gel SDS analítico (8%) (Laemmli U.K., 1970, Nature 227:
555-557).
El análisis del gel SDS muestra
sorprendentemente una clara sobreexpresión de la cadena \alpha y
de la cadena \beta. Se observan unas bandas adicionales
fuertemente sobreexpresadas de aproximadamente 63 kDa y 95 kDa que
no se observan en las clonas control no inducidas o en las clonas
control inducidas que no contienen plásmidos. La distribución de
las bandas entre la fracción soluble e insoluble es similar a la de
los experimentos en los que se expresan ambas cadenas de forma
independiente sin etiquetas en una célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Si los genes de las cadenas \alpha y \beta
de la AMV-RT se distribuyen en dos plásmidos,
diferencias en la estabilidad de estos plásmidos puede resultar en
la producción de cantidades diferentes de las cadenas respectivas y
con ello a un rendimiento inferior del heterodímero de cadena
\alpha\beta. Por ello, con la excepción del gen de la
\beta-lactamasa, se combinó toda la información
genética de los dos plásmidos
pAMV-\alpha_{laqIq-Arg} y
pAMV-\beta_{dnaY-His} en un solo
plásmido pAMV-\alpha\beta-1.
Este plásmido se construyó insertando el fragmento
Sspl-Afllll de
pAMV-\beta_{dnaY-His} que
contiene la secuencia del promotor T5, el gen que codifica la
cadena \beta con un etiqueta His N-terminal, la
secuencia para el terminal rrnB y el gen dnaY en el
sitio de escisión SaII de
pAMV-\alpha_{laqIq-Arg} que
contiene la secuencia del promotor T5, el gen que codifica la cadena
\alpha con un etiqueta-Arg
N-terminal, la secuencia del finalizador
rrnB, el gen de resistencia a la kanamicina y el gen
lacl^{q}. Para ello se escindió 1 \mug de cada uno de los
plásmidos de expresión
pAMV-\alpha_{laqIq-Arg} y
pAMV-\beta_{dnaY-His} con las
endonucleasas de restricción descritas anteriormente según las
instrucciones del fabricante, las mezclas de restricción se
separaron en un gel de agarosa al 1% y se aislaron del gel de
agarosa (Kit de extracción de geles, QIAEX II, Qiagen/Alemania) el
fragmento Sspl-Afllll de 4124 pares de bases de
pAMV-\beta_{dnaY-His} y el
fragmento de 6024 pares de bases
pAMV-\alpha_{laqI-Arg}. Los
extremos no compatibles se prepararon con polimerasa Klenow (Roche
Diagnostics GmbH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y
se ligaron los dos fragmentos conjuntamente tal como se ha descrito
anteriormente. El nuevo plásmido de expresión resultante
pAMV\alpha\beta-1 se examinó mediante análisis
de restricción.
El plásmido de expresión correcto según el
análisis de restricción se transformó en la cepa E. coli
K-12 LE392 tal como se ha descrito anteriormente y
se sometió a un control de expresión. A continuación se examinó el
contenido de proteína de las células tras 4 horas de crecimiento
bajo condiciones inducidas mediante SDS-PAGE. De
acuerdo con el análisis SDS-PAGE el nivel de
rendimiento de la expresión y la proporción relativa de las
fracciones soluble e insoluble son comparables a la expresión de los
genes de las cadenas \alpha y \beta en plásmidos
independientes, pero la cantidad de cadena \alpha y \beta
expresada parece ser más homogénea. Además el
etiqueta-Arg de la cadena \alpha se substituyó por
un etiqueta-His como el de la cadena \beta para
el procedimiento de purificación. Para ello un se preparó un
constructo intermediario
pAMV-\alpha_{laqIq-His} en el
cual el fragmento EcoRI-NheI de
pAMV-\alpha_{laqIq-Arg} se
substituyó por el fragmento EcoRI-NheI de
pAMV-\beta_{dnaY-His}. A
continuación como en la construcción
pAMV\alpha\beta-1, toda la información genética
de los dos plásmidos
pAMV-\alpha_{laqIq-His} y
pAMV-\beta_{dnaY-His} a
excepción del gen de la \beta-lactamasa se combinó
en un plásmido único pAMV\alpha\beta-2. El nuevo
vector de expresión se denominó
pAMV\alpha\beta-2. Se transformaron células tal
como se ha descrito anteriormente con
pAMV\alpha\beta-2 y se sometieron a control de
expresión bajo condiciones estándar. El rendimiento de expresión no
se incrementó bajo estas condiciones.
4.
Ejemplo
Algunas condiciones de crecimiento e inducción
en particular poseen efectos positivos sobre la expresión de
AMV-RT activa. Tras disminuir la temperatura de
crecimiento de 30ºC a 15ºC durante la fase de inducción, se redujo
la concentración de IPTG de 0,5 mM a 0,15 mM para inducir la
expresión y de incrementó el tiempo de inducción de 4 horas a 26
horas. Se examinó el contenido de proteínas de las células tras la
fase de inducción tal como se ha descrito anteriormente mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.
Tras ello el rendimiento de expresión total de
las cadenas \alpha y \beta fue, como era de esperar,
substancialmente menor en el análisis mediante
SDS-PAGE, pero el contenido de cadenas \alpha y
\beta expresadas solubles se incrementó de forma considerable en
comparación con los experimentos de expresión bajo condiciones de
crecimiento e inducción estándar. Este incremento en la expresión
de AMV-RT activa también se confirmó en la
purificación y determinación de la actividad subsiguientes.
Una propiedad del la AMV-RT es
que utiliza un ARNt endógeno para el triptófano (ARNt^{trp}) como
cebador para la reacción de la polimerasa tras la infección de una
célula huésped eucariota (Leis y otros, 1993, en: Reverse
Transcriptasa (Transcriptasa inversa), Series monográficas Cold
Spring Harbor, editores: Skala, A.M. y Goff, S.P., Cold Spring
Harbor NY (USA), 33-48). Sin embargo, no se ha
demostrado si AMV-RT puede utilizar como cebador el
ARNt^{trp} endógeno de E. coli. En E. coli el
ARNt^{trp} está codificado por un solo gen trpT, cuya
expresión está adaptada a los requisitos normales de la célula. Para
excluir una deficiencia potencial de ARNt^{trp} en la célula, se
aisló el gen trpT según el identificador se secuencia nº: 10
mediante PCR a partir de E. coli LE392 (los cebadores
utilizados para ello se muestran en los identificadores de
secuencia nº: 11 y 12), se volvió a escindir con PstI para
insertarlo en
pAMV-\alpha_{laclq-His} y se
ligó al fragmento de vector de
pAMV-\alpha_{laclq-His} que
también se había linealizado con PstI tal como se ha
descrito anteriormente. Se comprobaron las clonas que habían
integrado el gen trpT en el sitio de escisión de la
endonucleasa de restricción PstI mediante análisis de
restricción y secuenciación. En este constructo intermedio
pAMV-\alpha_{laclq-His-trpT}
el gen de la cadena \alpha y el gen del ARNt^{trp} de E.
coli forman una unidad de trascripción, cuya expresión está
regulada por el promotor T5 inducible por IPTG. A continuación, de
forma similar a la construcción de
pAMV\alpha\beta-1 o
pAMV\alpha\beta-2, se combinó toda la
información genética de los plásmidos
pAMV-\alpha_{laclq-His-trpT}
y pAMV-\beta_{dnaY-His} con
excepción del gen de la \beta-lactamasa en un
único plásmido pAMV\alpha\beta-3. Las células se
transformaron tal como se ha descrito anteriormente
pAMV\alpha\beta-3 y se sometieron a un control
de expresión utilizando condiciones de expresión modificadas. Tras
ello el rendimiento de AMV-RT activa se incrementa
de forma significativa.
En E. coli existen dos sistemas
principales de chaperonas formados por la maquinaria GroESL y un
sistema de 4 componentes formado por DnaK, DnaJ, GrpE y ClpB
(Kedzierska, 1999). Ambos sistemas juegan un papel importante en el
plegamiento correcto de las proteínas de nueva formación así como en
la renaturalización de proteínas que se han agregado como resultado
del estrés (Hartl F.U., 1996, Nature 381, 571-580;
Bukau H. y Horwich A.L., 1998, Cell 92, 351-366;
MogK A. y otros., EMBO J. 18, 6934-6949; Zolkiewski
M., 1999, J. Biol. Chem. 274, 28083-28086;
Goloubinoff P. y otros, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,
13732-13737).
En una primera etapa el operón groESL de
E. coli debe sobreexpresarse en las cepas productoras de
AMV-RT. Para ello, el fragmento
EcoRI-HindIII de pOF39 (Fayet O., Louarn J.-M.,
Georgopoulos C., 1986, Mol. Gen. Genet. vol. 202, pags.
335-345) se integró en el sitio de escisión
SspI del plásmido
pAMV-\beta_{dnaY-His}. Los
extremos no compatibles se prepararon con la polimerasa Klenow
(Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
antes de la ligadura. La secuencia de greESL se muestra en el
identificador de secuencia nº: 13. En este nuevo constructo
pAMV-\beta_{dnaY-His-groESL},
el operón groESL forma una unidad de trascripción artificial
que contiene el gen de la \beta-lactamasa situado
en 3'. La expresión está entonces o bien bajo el control del
promotor constitutivo bla endógeno que se halla ahora en el
lado 5' del operón groESL y/o bajo el control del promotor
dependiente de \sigma^{32} del operón groESL. A
continuación se combinó de nuevo toda la información genética de los
dos plásmidos de expresión
pAMV-\alpha_{lacIq-His-trpT}
y
pAMV-\beta_{dnaY-His-groESL}
a excepción del gen de la \beta-lactamasa tal
como se ha descrito anteriormente para el plásmido único
pAMV\alpha\beta-4.
Las células se transformaron con
pAMV\alpha\beta-4 tal como se ha descrito
previamente y se sometieron a un control de expresión bajo
condiciones de expresión modificadas. La sobreproducción
concomitante de GroESL provoca un incremento de la biomasa y de la
cantidad de AMV-RT activa. Se obtuvieron valores
entre tres y cuatro veces superiores a los de las mejores cepas
productores previas tras la purificación y la evaluación de la
actividad.
Tras demostrarse que la sobreproducción
concomitante de GroESL en las cepas productoras de
AMV-RT es una medida positiva, en una segunda etapa
se procedió adicionalmente a la sobreproducción concomitante del
otro sistema principal de chaperonas de E. coli. Además de
las supuestas ventajas generales de esta sobreproducción
concomitante, ésta puede compensar una desventaja de la maquinaria
GroESL, es decir su volumen de exclusión de aproximadamente 65 kDa
(Deuerling E. y otros, 1999, Nature 400, 693-696).
Ello debería ser particularmente importante para el plegamiento
correcto de la cadena \beta de la AMV-RT (93 kDa)
dado que no puede ser dividida en dominios individuales que se
formen independientemente el uno del otro. Los genes DnaK, DnaJ y
GrpE se combinaron en un operón artificial correspondiente a la
combinación fisiológica (Diamant S. y Goloubinoff P., 1998,
Biochemistry 37, 9688-9694; Pierpaoli E.V. y otros,
1998, J. Biol. Chem. 273, 6643-6649) mientras que
el gen de ClpB forma su propia unidad de trascripción. Ambas
unidades de trascripción se situaron bajo el control de promotores
T5 inducibles por IPTG para coordinar la expresión con los genes de
las subunidades de la AMV-RT.
Por razones técnicas el proceso de clonación
requiere un número de etapas intermedias en la trayectoria hasta el
constructo final pCHAP-5. Así, primeramente se
construyen los derivados pKKT5, pCHAP-1 y
pCHAP-2. pCHAP-1 contiene la
información genética del operón dnaKJ de E. coli empezando en
el codón de inicio de dnaK hasta el codón de finalización de dnaJ;
pCHAP-2 contiene la unidad de trascripción
artificial de las regiones de codificación de los genes de GrpE y
ClpB en forma de inserto; los fragmentos de ADN correspondientes se
amplificaron mediante PCR a partir del ADN genómico de E.
coli K12KE392. La secuencia de operón dnaKJ se muestra en el
identificador de secuencia nº 14, los cebadores correspondientes
utilizados para aislar el operón dnaKJ se muestran en el
identificador de secuencia nº 15 y 16. La secuencia del gen grpE se
muestra en el identificador de secuencia nº: 17, los cebadores
correspondientes utilizados para aislar el gen grpE se muestran en
el identificador de secuencia nº 18 y 19. La secuencia del gen clpB
se muestra en el identificador de secuencia nº 20, los cebadores
correspondientes utilizados para aislar el gen clpB se muestran en
el identificador de secuencia nº 21 y 22. Para construir
pCHAP-1 se volvió a escindir el fragmento PCR que
contenía el operón dnaKJ con SmaI y BamHI tal
como se ha descrito anteriormente, se ligó en un fragmento de vector
de pKKT5 que también se había linealizado con SmaI y
BamHI. pCHAP-2 se construyó mediante una
ligadura triple con el fragmento EcoRI-PstI del gen
grpE, el fragmento PstIHindIII del gen
clpB y un fragmento de vector pKKT5 linealizado con
EcoRI y HindIII. pCHAP-3 en el cual se
encuentre el gen clpB como una unidad de trascripción, se
deriva a partir de pCHAP-2 ligando el fragmento
PstI-HindIII de pCHAP-2 en el
fragmento de vector pKKT5 linealizado con EcoRI y
HindI tal como se ha descrito anteriormente. Previamente a
la ligadura se preparó la reacción de los extremos no compatibles de
los dos fragmentos con la polimerasa Klenow (Roche Diagnostics) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
pCHAP-4 es un derivado de pCHAP-1
cuyo inserto se extiende por el gen grpE de
pCHAP-2 y así, la unidad de trascripción artificial
está formada por los genes DnaK, DnaJ, y GrpE. Como resultado de la
secuencia Shine Dalgarno que en este caso es subóptima, la
expresión de grpE debe reducirse en comparación don
pCHAP-2 para que de este modo se adapte mejor a la
expresión de dnaKJ (Diamant y Goloubinoff, 1998; Pierpaoli y
otros, 1998). Para construir pCHAP-4 se insertó el
fragmento EcoRI-AvaI de pCHAP-2 en el
sitio de escisión de BamHI de pCHAP-1 tras
preparar los extremos no compatibles de los dos fragmentos con la
polimerasa Klenow (Roche Diagnostics) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El constructo final
pCHAP-5 es un derivado de pCHAP-4
que contiene el inserto de pCHAP-3 como información
genética adicional. Para ello el fragmento BspLU11I de
pCHAP-4 se substituyó por el fragmento
BspLU11I-SspI de pCHAP-3 mediante
restricción y ligadura tal como ya se ha descrito varias veces.
Para garantizar la compatibilidad de los extremos, los extremos
sobresalientes generados por NdeI se rellenaron previamente
con la polimerasa Klenow (Roche Diagnostics) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Se examinó el efecto de la expresión combinada
del plásmido pAMV\alpha\beta-4 con los diversos
plásmidos colaboradores pCHAP-1 a -5 sobre la
sobreproducción de AMV-RT. Al menos bajo las
condiciones de expresión estándar modificadas todos los plásmidos
colaboradores incrementaron considerablemente el rendimiento previo
de AMV-RT activa y como era esperable el plásmido
colaborador pCHAP-5 dio el mejor resultado. Ello se
confirmó mediante SDS-PAGE así como por la
subsiguiente purificación y determinación de actividad.
5.
Ejemplo
Durante la purificación se detectó la actividad
de la transcriptasa inversa en las fracciones mediante un sistema
de ensayo no radioactivo. Para ello se utilizó el "ensayo de
transcriptasa inversa no radioactivo" (Roche Molecular
Biochemicals, nº cat. 1468120). El período de incubación se acortó a
30 minutos.
La actividad específica de transcriptasa inversa
de las muestras se determinó mediante un sistema de ensayo
radioactivo. La actividad de transcriptasa inversa se determinó en
un volumen de ensayo de 100 \muL (Tris/HCl 50 mM, pH 8,3 (37ºC),
KCl 40 mM, MgCl_{2} 6 mM, dTTP 0,5 mM, poli (A) x dT_{15} 0,04
OD_{260 \ nm}, [3H]-dTTP 0,1 \muM). Se añadió
AMV-RT (5 \muL) en diluciones adecuadas. Tras
incubar durante 10 minutos a 37ºC, se detuvo la reacción con
solución TCA al 10% (500 \muL). El producto marcado
radioactivamente formado se lavó en un filtro de nitrocelulosa tras
precipitación. La tasa de incorporación de radioactividad se
determinó en un contador de centelleo y se calculo la actividad RT
de la muestra. Se definió una unidad de enzima como la cantidad de
AMV-RT que incorporaba 1,0 nMol de TMP en un
producto insoluble ácido en 10 minutos a 37ºC.
La actividad de la polimerasa de ADN de E.
coli se determinó midiendo el desplazamiento de mella. La
polimerasa de ADN se detectó mediante un ensayo de desplazamiento
de mella no radioactivo. La desplazamiento de mella se realizó en
un volumen de ensayo de 50 \muL (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5,
MgCl_{2} 10 mM, DTE 0,1 mM, DIG-dUTP 28,875
\muM, bio-16-dUTP 1,444 \muM,
dTTP 95,865 \muM, dATP 20 \muM, dCTP 20 \muM, dGTP 20 \muM,
pBR322 1 \mug, ADNasaI 1 pg). Tras añadir las muestras (1 \muL)
se incubó la mezcla de reacción durante 30 minutos a 37ºC. Tras
ello, la mezcla de reacción se transfirió placas de microtitulación
recubiertas de estreptavidina. El tratamiento y la evaluación
subsiguientes del ensayo se llevaron a cabo de forma análoga al
"ensayo de transcriptasa inversa, no radioactivo" (Roche
Molecular Biochemicals, nº cat. 1468120).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de la presencia de actividades
extrañas contaminantes se realizó en una solución compuesta por
Tris/HCl 10 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTE 1 mM.
Se incubaron muestras adecuadas de las
fracciones enzimáticas individuales con los ácidos nucleicos
correspondientes. La denominada actividad de mella se detectó
mediante incubación con el plásmido pBR322 (1 \mug) durante
2-16 horas a 37ºC. Las nucleasas inespecíficas se
detectaron mediante incubación con
lambda-ADN/EcoRI, HindIII (1 \mug)
durante 2-16 horas a 37ºC. Las ARNasas inespecíficas
se detectaron mediante incubación durante 2-4 horas
a 37ºC con MSII-ARN (5 \mug).
Para el ensayo de contaminación por
exonucleasas, las muestras se incubaron durante 4 horas a 37ºC con 4
\mug de ADN marcado con [3H], determinándose a continuación los
nucleótidos marcados con [3H] liberados.
\vskip1.000000\baselineskip
6.
Ejemplo
Como material de partida para purificar la
AMV-RT recombinante se utilizaron las células de
E. coli que sobreexpresaban ambas cadenas de
AMV-RT (ver anteriormente).
La AMV-RT se purificó a 4ºC. La
purificación se llevó a cabo mediante métodos cromatográficos tras
la lisis de las células y la separación de los ácidos nucleicos. El
proceso de purificación proporciona una AMV-RT
recombinante libre de actividades enzimáticas contaminantes y en la
RT-PCR posee la misma funcionalidad que la
AMV-RT purificada de material nativo.
\vskip1.000000\baselineskip
- tampón A:
- Tris/HCl 50 mM, pH 7,9, KCl 0,5 M, Tritón X-100 0,02%, glicerol 20%,
- tampón B:
- Tris/HCl 20 mM, pH 7,9, KCl 0,25 M, Tritón X-100 0,02%, glicerol 10%,
- tampón C:
- Tris/HCl 20 mM, pH 7,9, KCl 0,25 M, Tritón X-100 0,02%, glicerol 10%, imidazol 1M,
- tampón D:
- Tris/HCl 50 mM, pH 8,2, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tritón X-100 0,02%, glicerol 10%,
- tampón E:
- fosfato potásico 20 mM, pH 7,1, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Tritón X-100 0,02%, glicerol 10%,
tampón de almacenamiento: fosfato
potásico 200 mM, pH 7,2, DTT 2 mM, Tritón X-100
0,2%, glicerol
50%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 200 mL de tampón A a
aproximadamente 50 g de células E. coli LE392
(pAMV-\alpha_{lacIq-Arg}/pAMV-\beta_{dnaY-His})
que se descongelaron y suspendieron. Se añadieron a la suspensión
dos comprimidos de Complete (Roche Molecular Biochemicals, nº cat.
1697498). A continuación se lisaron las células mediante
ultrasonidos (sonicador Branson) en frío (temperatura: < 10ºC).
El nivel de lisis de la suspensión celular que se consiguió fue
característicamente del 40-50%.
A continuación se eliminaron los ácidos
nucleicos mediante precipitación con polimina. Se añadieron gota a
gota 5 mL de solución de polimina P al 10%. Si la precipitación era
incompleta, se realizó una adición gota a gota adicional. Tras
incubar durante 30 minutos a 4ºC, se procedió a centrifugar (30
minutos, 13.000 rpm, 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante transparente de la
centrifugación se diluyó con tampón B (1 + 1) y se absorbió en una
columna de sefarosa ff quelante cargada de níquel (2,6 cm x 10 cm,
Pharmacia) que se había equilibrado con tampón B, a continuación se
lavó con aproximadamente 500 mL de tampón B, y a continuación con
200 mL de tampón B + imidazol 10 mM y 200 mL de tampón B + imidazol
20 mM. El enzima se eluyó con un gradiente lineal de tampón B +
imidazol 20 mM y tampón C en un volumen total de 500 mL. La
velocidad de flujo fue de 5 mL por minuto, el tamaño de las
fracciones fue de 20 mL por fracción. El enzima se eluyó entre 50 mM
y 200 mM de imidazol. La acumulación o "pool" de fracciones
activas se dializó frente a tampón D.
\vskip1.000000\baselineskip
El "pool" dializado se absorbió a
continuación en una columna de heparina-sefarosa ff
(1,6 cm x 10 cm, Pharmacia) equilibrada con tampón D y se lavó con
aproximadamente 200 mL de tampón D, a continuación con
aproximadamente 200 mL de tampón D + KCl 300 mM. El enzima se eluyó
con un gradiente lineal de tampón D + KCl 300 mM y tampón D + KCl
1M en un volumen total de 200 mL. La velocidad de flujo fue de 2,5
mL por minuto, el tamaño de las fracciones fue de 10 mL. La
AMV-RT se eluyó a una concentración de KCl de entre
500 mM y 700 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones con actividad RT se agruparon y
dializaron frente a tampón E. El dializado se cargó en una columna
S-sefarosa ff equilibrada con tampón E (1,6 cm x 10
cm, Pharmacia). Tras lavado con aproximadamente 200 mL de tampón E,
se eluyó el enzima con un gradiente lineal de tampón E y tampón E +
KCl 1M en un volumen total de 400 mL. La velocidad de flujo fue de
2,5 mL por minuto, el tamaño de las fracciones fue de 10 mL.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones con actividad RT se agruparon y
dializaron frente a tampón E. El dializado se cargó en una columna
HA-ultrogel equilibrada con tampón E (1,6 cm x 10
cm, Biosepra). Tras lavado con aproximadamente 200 mL de tampón E,
se eluyó el enzima con un gradiente lineal de tampón E y tampón E +
0,5 M de fosfato potásico en un volumen total de 400 mL. La
velocidad de flujo fue de 2,5 mL por minuto, el tamaño de las
fracciones fue de 10 mL.
Las fracciones con actividad RT se agruparon y
dializaron frente a tampón de almacenamiento. Se añadió tampón de
aplicación con SDS y \beta-mercaptoetanol a la
proteína purificada y se desnaturalizó la muestra mediante
ebullición (5 minutos, 100ºC). A continuación se analizaron
alícuotas de 20 \muL con un gel analítico SDS
(4-20%) (Laemmli UK., 1970, Nature 227:
555-557). Las subunidades \alpha y \beta se
hallaron en relación equimolar.
El método descrito proporciona una
AMV-RT estable con una distribución equimolar de las
subunidades \alpha y \beta. El enzima obtenido es funcional en
RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
La transcriptasa inversa de AMV recombinante
obtenida se examinó en un ensayo funcional. El ensayó funcional
consistió en una trascripción inversa (RT) acoplada con una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello, se utilizaron 5
unidades de transcriptasa inversa de AMV recombinante como mezcla
enzimática del Titan TM One Tube PCR System (nº cat. 1888382, Roche
Molecular Biochemicals). Se amplificó un fragmento de 1,8 kb del
gen de la distrofina humana. Como molde se utilizaron 10 ng de ARN
muscular humano. Los cebadores (400 nM) fueron el cebador Dys 2reV
(5'GAG TGA ATA CAG TTT GCC CAT GGA TTG-3) y el
cebador Dys 8 (5'-AAG AAG ETIQUETA AGG ACT GTT ATG
AAA GAG AAG-3'). La diana se amplificó en un
RT-PCR utilizando el programa siguiente: 50ºC
durante 30 minutos, 94ºC durante 2 minutos seguido de 10 ciclos
(94ºC durante 10 segundos, 58ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 1
minuto 10 segundos) y 20 ciclos (94ºC durante 10 segundos, 58ºC
durante 30 segundos, 68ºC durante 1 minuto 10 segundos; +10
segundos/ciclo). A continuación se incubó durante 7 minutos a 68ºC.
Los productos de reacción de la RT-PCR se separaron
tras detener la reacción en un gel de agarosa al 1%
(figura 1).
(figura 1).
La figura 1 muestra el producto de la
amplificación de la RT-PCR que posee un tamaño de
1,8 kb obtenido AMV-RT purificada nativa (carril 2)
y la AMV-RT obtenida mediante medios recombinantes
(carril 3). Los carriles 1 y 4 muestra el marcador de peso
molecular de ADN VI (nº cat. 1062590, Roche Molecular
Biochemicals).
Como material de partida para purificar la
AMV-RT recombinante se utilizaron células E.
coli LE392 pAMV\alpha\beta-4 +
pCHAP-5 que sobreexpresan ambas cadenas de la
AMV-RT (ver más arriba).
La AMV-RT se purificó a 4ºC. La
purificación se realizó mediante métodos cromatográficos tras lisis
celular y separación de los ácidos nucleicos. La purificación dio
lugar a AMV-RT recombinante libre de actividades
enzimáticas contaminantes y que en la RT-PCR posee
la misma funcionalidad que la AMV-RT purificada a
partir de material nativo.
- tampón A:
- NaPO_{4} 50 mM, pH 7,2, NaCl 1 M, 2-mercaptoetanol 3 mM, glicerol 10%,
- tampón B:
- NaPO_{4} 50 mM, pH 5,0, NaCl 1 M, 2-mercaptoetanol 3 mM, glicerol 10%,
- tampón C:
- NaPO_{4} 50 mM, pH 6,0, NaCl 1 M, 2-mercaptoetanol 3 mM, glicerol 10%, imidazol 0,2 M,
- tampón D:
- NaPO_{4} 50 mM, pH 7,7, NaCl 1 M, 2-mercaptoetanol 3 mM, glicerol 10%, imidazol 0,5 M,
- tampón E:
- NaPO_{4} 50 mM, pH 6,0, 2-mercaptoetanol 3 mM, glicerol 10%,
tampón de almacenamiento: fosfato
potásico 200 mM, pH 7,2, DTT 2 mM, Tritón X-100
0,2%, glicerol
50%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclaron aproximadamente 50 g de células
E. coli LE392
pAMV-\alpha\beta-4+pCHAP-5
con 400 mL de tampón A, se descongelaron y suspendieron. Se
añadieron a la suspensión dos comprimidos de Complete (Roche
Molecular Biochemicals, nº cat. 1697498). A continuación se lisaron
las células mediante ultrasonidos (sonicador Branson) en frío
(temperatura: < 10ºC). El nivel de lisis de la suspensión celular
que se consiguió fue característicamente del
40-50%.
A continuación se eliminaron los ácidos
nucleicos mediante precipitación con polimina. Se añadieron gota a
gota 5 mL de solución de polimina P al 10%. Si la precipitación era
incompleta, se realizó una adición gota a gota adicional. Tras
incubar durante 30 minutos a 4ºC, se procedió a centrifugar (30
minutos, 13.000 rpm, 4ºC).
El sobrenadante transparente de la
centrifugación se absorbió en una columna de sefarosa ff quelante
cargada de níquel (2,6 cm x 10 cm, Pharmacia) que se había
equilibrado con tampón A, a continuación se lavó con aproximadamente
500 mL de tampón B, y a continuación con 500 mL de tampón B y 500
mL de tampón C. El enzima se eluyó con tampón D en un volumen total
de 500 mL. La velocidad de flujo fue de 5 mL por minuto, el tamaño
de las fracciones fue de 20 mL por fracción. El "pool" de
fracciones activas se dializó frente a tampón E.
El "pool" dializado se absorbió a
continuación en una columna de heparina-sefarosa ff
(1,6 cm x 10 cm, Pharmacia) equilibrada con tampón E + NaCl 250 mM
y se lavó con aproximadamente 200 mL de tampón E + NaCl 250 mM. El
enzima se eluyó con un gradiente lineal de tampón E + NaCl 250 mM y
tampón E + NaCl 1M en un volumen total de 200 mL. La velocidad de
flujo fue de 2,5 mL por minuto, el tamaño de las fracciones fue de
10 mL. La AMV-RT se eluyó a una concentración de
NaCl de entre 500 mM y 700 mM.
Las fracciones con actividad RT se agruparon y
dializaron frente a tampón de almacenamiento. Se añadió tampón de
aplicación con SDS y \beta-mercaptoetanol a la
proteína purificada y se desnaturalizó la muestra mediante
ebullición (5 minutos, 100ºC). A continuación se analizaron
alícuotas de 20 \muL con un gel analítico SDS
(4-20%) (Laemmli UK., 1970, Nature 227:
555-557). Las subunidades \alpha y \beta de
AMV-RT se hallaron en relación equimolar (figura 2,
carril 6).
La figura 2 muestra un gel SDS con muestras de
la purificación de la AMV-RT
- Carril 1:
- marcador de peso molecular
- Carril 2:
- AMV nativa
- Carril 3:
- lisis celular
- Carril 4:
- Sefarosa quelato de Ni, lavado con tampón C
- Carril 5:
- "Pool" de quelato de Ni
- Carril 6:
- Preparación final de AMV-RT recombinante
El método descrito da lugar a una
AMV-RT estable con una distribución equimolar de las
subunidades \alpha y \beta. El enzima obtenido es funcional en
RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
La transcriptasa inversa de AMV recombinante
obtenida se examinó en un ensayo funcional. El ensayó funcional
consistió en una trascripción inversa (RT) acoplada con una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello, se utilizaron 10
unidades de transcriptasa inversa de AMV recombinante. Se
amplificaron los fragmentos de 8 kb, 10 kb, 12 kb y a 13,5 kb del
gen de la distrofina humana.
Como molde se utilizó 1 \mug de ARN muscular
humano. Los cebadores (400 nM) fueron el cebador 2 Dys (5'CAA TCC
ATG GGC AAA CTG TAT TCA CTC-3') y el cebador Dys 5
rev (5'-CGT CCC GTA TCA TAA ACA TTC AGC
AGC-3') para 8kb, el cebador Dys 8
(5'-AAG AAG ETIQUETA AGG ACT GTT ATG AAA GAG
AA-3') y 5 rev para 10 kb, el cebador Dys 8 y el
cebador Dys 9 (5'-AGC AGG TAA GCC TGG ATG ACT GAC
ETIQUETA AAG-3') para 12 kb y los cebadores Dys 8 y
10 rev (5'-AAT CAA TCA ACC AAC CGA AAT CTC ACT
CTG-3') para 13,5 kb . La síntesis de ADNc se llevó
a cabo durante 60 minutos a 42ºC.
La síntesis de ADNc se realizó según las
instrucciones en la información del producto de la transcritaza
inversa (nº cat. 1495062, Roche Molecular Biochemicals).
Para la PCR se utilizó el Expand Long Template
PCR System (nº cat. 1681834, Roche Molecular Biochemicals). La
diana se amplificó utilizando el siguiente programa de PCR: 94ºC
durante 2 minutos, seguido de 10 ciclos (94ºC durante 10 segundos,
60ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 10 minutos) y 20 ciclos (94ºC
durante 10 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 10
minutos 10 + 10 segundos/ciclo). A continuación se incubó durante 5
minutos a 68ºC. Tras detener la reacción, se separaron los productos
de reacción de la RT-PCR en un gel de agarosa al 1%
(figura 3). Los carriles 3 y 6 muestran el marcador de peso
molecular del ADN X (nº cat. 1498037, Roche Molecular
Biochemicals).
La figura 3 muestra un gel de agarosa en el que
se separaron los productos de la RT-PCR realizada
utilizando AMV-RT recombinante; carril 1: producto
de amplificación de 8 kb, carril 2; producto de amplificación de 10
kb, carril 3: estándar X de longitud de ADN, carril 4: producto de
amplificación de 12 kb, carril 5: producto de amplificación de 13,5
kb, carril 6: estándar X de longitud de ADN.
<110> Roche Diagnostics GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la producción de
AMV-RT heterodimérica activa en células
procariotas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5272/00/DE
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1716
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la mieloblastosis aviar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus de la mieloblastosis aviar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la mieloblastosis aviar
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 858
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Virus de la mieloblastosis aviar
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 62
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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<210> 18
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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<210> 21
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<400> 21
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<400> 22
\hskip1cm25
Claims (19)
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Claims (19)
Hide Dependent
translated from
1. Método para la producción de una
AMV-RT heterodimérica activa en células procariotas,
en el que
(i) se clonan una o varias secuencias de ADN que
codifican las cadenas \alpha y/o \beta de la
AMV-RT en plásmidos de expresión,
(ii) los plásmidos de expresión se transforman
en células procariotas,
(iii) se induce la expresión soluble de la
AMV-RT heterodimérica, y
(iv) se aísla la AMV-RT
heterodimérica recombinante de las células, en el que la expresión
se produce a una temperatura de crecimiento de aproximadamente 15ºC
y a una concentración de inductor entre 0,1 M y 0,5 M.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
las secuencias de ADN que codifican las cadenas \alpha y \beta
se expresan en plásmidos de expresión independientes en una
célula.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que
las secuencias de ADN que codifican las cadenas \alpha y \beta
se expresan en un plásmido de expresión en una célula.
4. Método, según las reivindicaciones 1 a 3, en
el que tanto la cadena \alpha como la \beta se fusionan con una
secuencia de péptido.
5. Método, según la reivindicación 4, en el que
la cadena \alpha o la cadena \beta se fusionan con una
secuencia de péptido compuesta por entre 2 y 10 residuos arginina y
la cadena \beta o la cadena \alpha se fusionan con una
secuencia de péptido compuesta por entre 2 y 10 residuos
histidina.
6. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las secuencias de ADN que
codifican las cadenas \alpha y \beta que están unidas a
secuencias de ADN que codifican secuencias de péptido que son
capaces de unión reversible, se expresan en un plásmido de expresión
en una célula.
7. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que las cadenas \alpha y \beta se
fusionan con la misma secuencia de péptido capaz de unión
reversible.
8. Método, según la reivindicación 7, en el que
las cadenas \alpha y \beta están cada una de ellas fusionadas
con una secuencia de péptido compuesta por entre 2 y 10 residuos
histidina.
9. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la expresión se incrementa
mediante la expresión concomitante de genes colaboradores.
10. Método, según la reivindicación 9, en el que
se utiliza como gen colaborador el gen trpT que codifica el ARNt
del triptófano.
11. Método, según la reivindicación 9, en el que
la expresión se incrementa mediante la expresión concomitante de
genes chaperona.
12. Método, según las reivindicaciones 9 u 11,
en el que se expresan de forma concomitante los genes de GroEL y
GroES, Dnak y DnaJ, GrpE y/o ClpB.
13. Método, según las reivindicaciones 11 o 12,
en el que se clonan los genes GroEL y GroES en el plásmido de
expresión que también porta los genes de las cadenas \alpha y
\beta y en el que los genes de Dnak, DnaJ, GrpE y ClpB se clonan
en un plásmido colaborador.
14. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que se utilizan materiales de
cromatografía de afinidad adecuados para aislar o purificar la
AMV-RT heterodimérica recombinante.
15. Método, según la reivindicación 14, en el
que los materiales de cromatografía de afinidad utilizados para la
purificación se unen de forma reversible a las diferentes secuencias
de péptido unidas a las cadenas \alpha y/o \beta.
16. Método, según las reivindicaciones 14 o 15,
en el que los materiales de cromatografía de afinidad utilizados
para la purificación son materiales quelantes de iones de metal o
intercambiadores de cationes.
17. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que la secuencia de ADN con el
identificador de secuencia nº 5 o las secuencias de ADN con los
identificadores de secuencia nº 4 y nº 5 se expresan en una célula
huésped procariota.
18. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que se utiliza E. coli como
célula huésped.
19. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que la AMV-RT
heterodimérica activa está compuesta por las subunidades con los
identificadores de secuencia nº 6 y nº 7.