DE3882247T2

DE3882247T2 - Verfahren zur Expressionsregulation eines Fremdgens mittels Kontrolle der Zuckerkonzentration in einem Medium und Verfahren zur Herstellung eines Fremdgenproduktes.

Info

Publication number: DE3882247T2
Application number: DE88301355T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Fukuhara; Nobuyoshi Makiguchi; Yoshiyuki Nakajima; Satori Sone; Setsuo Yoshino
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1987-02-19
Filing date: 1988-02-18
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2008-02-19
Also published as: ES2058250T3; KR880010118A; EP0279664B1; DE3882247D1; KR910001811B1; EP0279664A3; DK88588D0; EP0279664A2; MX168450B; CA1319630C; DK88588A

Description

Die Erfindung betrifft ein nützliches Verfahren zur Regulation der Expression eines gewünschten Fremdgens, wobei ein rekombinantes Plasmid (Hybrid-Plasmid) mit einer Insertion des Fremdgens tragende Escherichia coli wirksam wachsen, während die Expression des Fremdgens wirksam unterdrückt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Fremdgen-Produktes unter Verwendung dieses regulierenden Verfahrens, bei dem die Wachstumsperiode der Escherichia coli, die das Hybrid-Plasmid tragen, van der Expressions- Periode des Fremdgens getrennt ist.
Gegenwärtig ist dank der Fortschritte der rekombinanten DNA- Technologie ein Verfahren für die Herstellung eines gewünschten Fremd-Polypeptids in einem Gastbakterium entwickelt worden, bei dem ein Hybrid-Plasmid durch Insertion eines Strukturgens, das von Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen abgeleitet ist und für das gewünschte Fremd-Polypeptid kodiert, in einen Expressions-Vektor eingebaut wird, der wiederum die Expression des Fremdgens in dem Gastbakterium erlaubt. Dann wird das Gastbakterium gezüchtet, so daß das gewünschte Fremdgen- Produkt in großen Mengen erhalten wird.
Diese Technologie hat die Mittel zur Produktion nützlicher Substanzen wie menschliches Insulin und menschliche Wachstumshormone nahezu etabliert.
Als Gastbakterien zur Herstellung von Produkten der Fremdgene in einer derartigen DNA-Rekombinations-Technologie sind Stämme von Escherichia coli weit verbreitet, da ihre biologischen Merkmale ausreichend untersucht worden sind, da sie bekanntermaßen außerdem keine Pathogenität besitzen und da sie leicht in Kulturmedien relativ einfacher Zusammensetzungen wachsen können.
Im allgemeinen ist die Stabilität des Hybrid-Plasmids, das in Escherichia coli spp. eingebaut wird, jedoch nicht notwendigerweise hoch, so daß während der Zellwachstumsphase das Hybrid-Plasmid aus Escherichia coli verloren geht oder eine Umlagerung des Hybrid-Plasmids erfolgt, was zu erhöhtem Auftreten von Zellen, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, die keine Fähigkeit zur Expression von Fremdgenen haben, führt.
Bei der Herstellung im industriellen Maßstab, wo eine Massenkultur durchgeführt werden muß, ist zum Beispiel im allgemeinen selbst für die Vorkultur, um eine ausreichende Zahl von Bakterienzellen mit hoher Aktivität für die Verwendung in der anschließenden Massenkultur zu erhalten, eine relativ lange Inkubationszeit nötig. Somit kann das häufige Auftreten von Deletionen der Hybrid-Plasmide aus den bakteriellen Zellen, wie oben schon erwähnt, nicht vermieden werden. Als Folge sinkt die Zahl der wirksamen Fremdgene in der Kultur mit dem Anstieg der Zellen, die das Hybrid-Plasmid verloren haben. Dies führt zu einer geringen Ausbeute an dem gewünschten Fremdgen-Produkt in der abschließenden Kultur.
Außerdem können die Zellen in einer gewöhnlichen Kultur neben der Expression eines Fremdgens nicht effizient wachsen.
In Anbetracht des zuvor genannten Problems, das verursacht wird durch die Verwendung des Hybrid-Plasmids in der Kultur, ist das Verfahren, die Zellwachstums-Phase von der Phase der Gen-Expression zu trennen, ins Gespräch gebracht worden.
Genauer gesagt umfaßt das Verfahren das Kultivieren eines Gastbakteriums, das ein Hybrid-Plasmid mit einer Insertion eines Fremdgens trägt, unter solchen Bedingungen, daß die Expression des Fremdgens in dem Hybrid-Plasmid unterdrückt wird, bis eine bestimmte Anzahl von Zellen erhalten worden ist. Danach wird die Suppression aufgehoben, so daß die Expression des Fremdgens erlaubt und das Kultivieren fortgesetzt wird. Als Folge davon ist das Auftreten von Zellen, die das Hybrid- Plasmid verloren haben, weitestgehend unterdrückt, so daß das Fremdgen-Produkt wirksam produziert werden kann.
Ein bekanntes Beispiel für ein Verfahren, die Expression eines Fremdgens zu kontrollieren, umfaßt als solches die Verwendung eines induzierbaren Expressions-Promotors als das Hybrid-Plasmid, so daß die Expression des Fremdgens durch Zugabe eines Inducers, der Repressoren wie den PL-Lambda-Promotor/Operator des Escherichia coli-Lambda-Phagen oder den trp-Promotor/Operator des Escherichia coli Tryptophan-Operons inaktiviert, willkürlich induziert werden kann.
Ein anderes bekanntes Beispiel für ein Verfahren, die Expression eines Fremdgens zu kontrollieren, umfaßt die Verwendung eines Vektors vom temperaturabhängigen Typ, der einen temperaturabhängigen Replikationsursprung (d.h. der Vektor beginnt die Replikation nur im Bereich bestimmter Temperaturen) hat. Damit wird die Expression des Fremdgens durch Veränderung der Temperatur der Kultur reguliert.
Im Fall der Verwendung des induzierbaren Expressions-Promotors neigen die Produktionskosten jedoch dazu, hoch zu sein, da die Inducer der Expression teuer sind, und da außerdem das Auftreten von Bakterien, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, nicht in ausreichender Weise verhindert werden kann. Folglich kann dieses Verfahren im industriellen Maßstab einer Zellkultur nicht verwendet werden.
Außerdem kann im Fall der Verwendung des Vektors vom temperaturabhängigen Typ das Auftreten von Bakterien, die das Hybrid- Plasmid verloren haben, nicht wirksam verhindert werden. Dazu kommt, daß komplizierte Apparaturen für die Kontrolle der Temperatur erforderlich sind.
In Anbetracht der oben geschilderten Probleme und bei der Suche, wirksamere Mittel zu etablieren, um Fremdgen-Produkte zu produzieren, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Untersuchungen bezüglich der Fermentations-Technologie mit Blick auf die Charakteristika von Escherichia coli, die Hybrid-Plasmide tragen, vorgenommen. Im Laufe dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß die Expression eines Fremdgens in Escherichia coli, die ein Hybrid-Plasmid mit dem darin eingebauten Fremdgen tragen, durch Regulation der Konzentration einer Zuckerkomponente wie Glukose, die in einem Kulturmedium für Escherichia coli leicht metabolisiert und als Kohlenstoffquelle verwendet wird, wirksam kontrolliert werden kann.
Außerdem beruht die vorliegende Erfindung auf dem Schluß, daß es bei der Produktion eines Fremdgen-Produktes mittels Kultivieren von Bakterien, die ein Hybrid-Plasmid tragen, möglich ist, eine ausreichende Bakterienmasse zu erhalten, die eine nur geringe Anzahl von Zellen enthält, die ihr Hybrid-Plasmid verloren haben, und danach mittels Änderung der Zuckerkonzentration im Kulturmedium für diese beiden Phasen genügende Mengen des Fremdgen-Produktes als solches zu produzieren, so daß die Phase des bakteriellen Wachstumnsprozesses und die Phase des Prozesses der Expression des Fremdgens zeitlich voneinander getrennt sind.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches und wirksames Verfahren zur Kontrolle der Expression eines gewünschten Fremdgens, das in ein Hybrid-Plasmid eingebaut worden ist, in einer Escherichia coli-Kultur bereitzustellen, wobei die Escherichia coli das Hybrid-Plasmid in aufgenommener Form tragen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein geeignetes Verfahren bereitzustellen, um ein gewünschtes Fremdgen-Produkt in hoher Konzentration in Kultur wirksam herzustellen, insbesondere um ein Fremdgen-Produkt im industriellen Maßstab unter Verwendung von Escherichia coli, die ein Hybrid-Plasmid mit einer Insertion des Fremdgens tragen, herzustellen.
Ein Verfahren zur Regulation der Expression gemäß der vorliegenden Erfindung, um die oben genannten Aufgaben zu lösen, umfast ein Verfahren, die Konzentration eines Zuckers als Kohlenstoffquelle in der Escherichia coli-Kultur bei 0,3% oder höher zu halten, so daß die Expression eines gewünschten Fremdgens in Escherichia coli unterdrückt wird, die das Hybrid-Plasmid tragen, das durch Insertion des gewünschten Fremdgens in einen Expressions-Vektor zusammengebaut worden ist.
Somit wird bei dem Verfahren zur Kontrolle der Expression gemäß der vorliegenden Erfindung die Expression eines Fremdgens in einem Hybrid-Plasmid, das in Escherichia coli eingeführt worden ist, mittels eines so simplen Mittels wie der Kontrolle der Zuckerkonzentration im Medium wirksam kontrolliert.
Bei Anwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Herstellung eines Fremdgen-Produkts können ausreichendes Wachstum der Bakterienzellen und gleichzeitig seltenes Auftreten von Deletionen des Hybrid-Plasmids aus den Bakterien erzielt werden, indem die Phase des Zellwachstums und die Phase der Expression des Fremdgens zeitlich voneinder getrennt werden, so daß beide Prozesse in wirksamer Weise durchgeführt werden können. Bei Verwendung dieses Verfahrens wird das Produkt, das dem gewünschten Fremdgen entspricht, in hoher Konzentration hergestellt, so daß eine wirksame Herstellung des Produkts des Fremdgens erzielt werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht keine Notwendigkeit, teure Inducer, wie sie bei den herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von induzierbaren Plasmiden nötig sind, zu verwenden. Darüber hinaus besteht keinerlei Notwendigkeit für so spezielle Apparaturen, wie sie für das zuvor erwähnte Temperatur-Kontroll-System nötig sind, da die Kontrolle der Expression des Fremdgens mit Hilfe einer so simplen Methode wie der Manipulation der Zuckerkonzentration in dem Medium erreicht werden kann.
Außerdem kann die Massenkultur im industriellen Maßstab zur Herstellung des Produktes eines Fremdgens gemäß der vorliegenden Erfindung leicht ermöglicht werden, da das Auftreten von Bakterien, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, wirksam unterdrückt werden kann.
Figur 1 zeigt die Restriktionskarte der Regionen in pSW11, pSW2 und pSW13, die das Strukturgen für Phenylalanin-Ammoniak- Lyase (PAL) betreffen.
Figur 2, bestehend aus (A) - (D), zeigt die Nukleotidsequenz von DNA einschließlich der Regionen, die für PAL kodieren, wobei die DNA wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert worden ist.
Figur 3 ist ein Schaubild, das die Schritte zur Herstellung von pSW101 zeigt.
Figur 4 ist ein Schaubild, das die Schritte zur Herstellung von pYtrp6 zeigt.
Figuren 5 - 7 zeigen detaillierte Teilansichten des Schaubildes in Figur 4.
Figur 8 zeigt schematische Darstellungen, die die Schritte zur Herstellung von den in Beispiel 2 hergestellten Hybrid-Plasmiden zeigen.
Figuren 9, 10 und 11 zeigen detaillierte Schritte bei der Herstellung der Hybrid-Plasmide pTac11, pPL-PAL-head und pSW115.
Figur 12 ist eine graphische Darstellung, die die Veränderung der Glukose- und Bakterienzell-Konzentration sowie die spezifische PAL-Aktivität der Zellen im Laufe der Kultur in Beispiel 4 zeigt.
Figuren 13 und 14 sind Schaubilder, die die in Beispiel 5 und Vergleichsbeispiel 1 verwendeten Schritte und Kultur-Bedingungen zeigen.
Ein Hybrid-Plasmid (rekombinantes Plasmid), wie es in der vorliegenden Erfindung Verwendung findet, ist dasjenige Plasmid, das durch Insertion eines gewünschten Fremdgens in einen Expressions-Vektor, der derart konstruiert ist, daß er die Expression des Fremdgens in Escherichia coli erlaubt, erhalten wird.
Ein Beispiel für den Expressions-Vektor, der im Hybrid-Plasmid enthalten ist, umfaßt einen Vektor, der in Escherichia coli replizieren kann, und einen mit dem Vektor verknüpften Promotor, wobei der Promotor aus einer Vielzahl von Promotoren wie dem PL-Promotor des Lambda-Phagen (der PL-Lambda-Promotor), dem Promotor des Tryptophan-Operons (trp-Promotor) und einem kombinierten Promotor, umfassend den PL-Lambda-Promotor und den tac-Promotor, der aus der Minus-35-Region des trp-Promotors und der Minus-10-Region des lac-UV-5-Promotors zusammengesetzt ist.
Ein Beispiel für das Fremdgen, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Strukturgen, das für ein Polypeptid kodiert, das gewöhnlicherweise nicht von einem Wildtyp- Stamm von Escherichia coli produziert wird, wie ein Polypeptid, das nicht von Escherichia coli abgeleitet ist, mit im wesentlichen derselben Aminosäure-Sequenz wie das Polypeptid eukaryotischen Ursprungs.
Ein Verfahren zur Regulation der Expression gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt die Kontrolle der Konzentration einer Zuckerkomponente wie Glukose, Fruktose, Mannose, Maltose oder Sorbitol, die leicht metabolisiert wird und in einem Kulturmedium für E. coli als Kohlenstoffquelle verwendet wird, wobei die E. coli ein Hybrid-Plasmid tragen, wodurch die Expression eines Fremdgens, das in das Hybrid-Plasmid eingebaut worden ist, reguliert werden kann.
Insbesondere sollte, um die Expression des Fremdgens zu supprimieren, die Konzentration der Zuckerkomponente im Medium zum Kultivieren der Escherichia coli, die ein Hybrid-Plasmid tragen, bei 0,3% oder höher gehalten werden, während sie bei unter 0,3% gehalten werden sollte, um eine starke Expression des Fremdgens zu ermöglichen.
Wenn Bakterien, die ein Hybrid-Plasmid tragen, in einem Medium, in dem die Zucker-Konzentration bei 0,3% oder höher gehalten wird, kultiviert werden, kann die Expression eines Fremdgens in dem Hybrid-Plasmid wirksam supprimiert werden, und die Bakterien wachsen gut; außerdem wird das Auftreten von Bakterien in der Kultur, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, während des Kultivierens wirksam unterdrückt, bis die gewünschte Zahl von Zellen erhalten worden ist.
Zusätzlich erlaubt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Kontrolle der Expression eines Fremdgens mit einer so simplen Methode wie der Kontrolle der Zucker-Konzentration im Medium, so daß keine Notwendigkeit besteht, besonders teure Reagenzien wie die oben beschriebenen Inducer der Expression zu verwenden. Außerdem sind zusätzliche Vorrichtungen für die Kontrolle der Temperatur nicht erforderlich.
Ein von einem Fremdgen abgeleitetes Fremdgen-Produkt kann auf wirksame Weise hergestellt werden, indem ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bei dem Escherichia coli, die ein Hybrid-Plasmid mit einer Insertion des Fremdgens tragen, unter bestimmten Bedingungen gezüchtet werden, wodurch die Genexpression kontrolliert wird, so daß das Produkt des Fremdgens auf wirksame Weise hergestellt werden kann.
Insbesondere umfaßt das Verfahren zur Regulation der Expression zur Herstellung eines Produkts eines Fremdgens in Escherichia coli, die ein Hybrid-Plasmid tragen, gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte:
a) einen ersten Kultivierungsschritt, bei dem Escherichia coli, die ein Hybrid-Plasmid tragen, in einem Medium mit einer Zuckerkomponente bei einer Konzentration von 0,3% oder höher gezüchtet werden und
(b) einen zweiten Kultivierungsschritt, bei dem Escherichia coli, die in dem ersten Schritt herangezogen worden sind, in einem Medium mit der Zuckerkomponente bei einer Konzentration von weniger als 0,3% gezüchtet werden.
Bei dem ersten Kultivierungsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Zucker-Konzentration im Medium bei 0,3% oder höher gehalten, so daß die Expression des Fremdgens, das in dem in Escherichia coli eingebauten Hybrid-Plasmid enthalten ist, supprimiert wird. Deshalb wachsen die Escherichia coli in ausreichender Weise, so daß die gewünschte Zahl von Zellen in der Kultur des ersten Kultivierungsschrittes zusammenkommt. Das Auftreten von Zellen, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, ist während der Phase des Zellwachstums außerdem fast zu vernachlässigen. Im Fall der Subkulturen zum Erhalten der Zellaktivität über einen langen Zeitraum kann das Auftreten von Zellen, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, mittels dieses Verfahrens der Kontrolle der Expression des Fremdgens auf ähnliche Weise supprimiert werden.
Bei dem zweiten Kultivierungsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung sollte die Zucker-Konzentration im Medium bei weniger als 0,3% gehalten werden, so daß die Suppression der Expression des Fremdgens in den Bakterienzellen, die das Hybrid- Plasmid tragen, aufgehoben wird. Deshalb wird das Fremdgen in den Zellen, die das Hybrid-Plasmid tragen, stark exprimiert, so daß die wirksame Herstellung des Produkts des Fremdgens ermöglicht wird. Bei diesem Schritt ist die Zahl unter den Zellen, die während des ersten Kulturprozesses erhalten worden sind, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, nahezu zu vernachlässigen, so daß die Fremdgene in fast allen Zellen der Kultur wirksam exprimiert werden, wodurch die Herstellung des Produktes des Fremdgens in genügend hoher Konzentration ermöglicht wird.
Als Beispiel für die Bereiche der Zucker-Konzentrationen, die in Kombination verwendet werden, seien 0,3 - 1% für den ersten Kultivierungsschritt und weniger als 0,3% für den zweiten Kultivierungsschritt genannt.
Gemäß der so beschriebenen vorliegenden Erfindung kann die Ausbeute des Fremdgens-Produkts geometrisch erhöht werden, da das Produkt des Fremdgens in hoher Konzentration produziert wird, wenn eine große Zahl von Zellen in einer Massenkultur gezüchtet wird.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann, wie es in dem ersten Kultivierungsschritt erforderlich ist, außerdem über längere Zeiträume auf Kulturen angewendet werden, wohingegen das zuvor erwähnte herkömmliche Verfahren, bei dem das Zellwachstum an die Expression des Fremdgens gekoppelt ist, nicht über längere Zeiträume auf Kulturen angewendet werden kann, da der Anteil der Zellen, die das Hybrid-Plasmid verloren haben, mit wachsender Dauer der Subkultivierung steigt. Dementsprechend ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung speziell für industrielle Massenkulturen geeignet, bei denen für die Vorkulturen relativ lange Kultivierungszeiten erforderlich sind.
Der Zeitpunkt, zu dem von dem ersten zum zweiten Kultivierungsschritt übergewechselt wird, kann willkürlich gewählt werden, wie es erwünscht ist. Es kann jedoch von der Art der Bakterien, die das Hybrid-Plasmid tragen, oder von dem für diese Kultivierungsschritte zu verwendenden Kultivierungsverfahren abhängen. Wenn beispielsweise das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Vorkultur angewandt werden soll, um eine kleine Zahl von Bakterien zum Animpfen zu erhalten, und die Massenkultur im Batchsystem folgen soll, um die Hauptkultur zu erhalten, dann kann der erste Kultivierungsschritt in die Vorkultur und in die erste Hälfte der log-Phase der Hauptkultur übernommen werden, und der zweite Kultivierungsschritt kann dann in die anschließende Kultur übernommen werden.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Referenzbeispiele, Beispiele und Vergleichsbeispiele unter Verwendung der Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (im Nachfolgenden als PAL bezeichnet) spezieller zu verstehen sein.

Referenzbeispiel 1

(1) Isolation und Reinigung der mRNA für PAL

Rhodosporidium toruloides IFO 559 (auch mit der Bezeichnung ATCC 10 788) wurden bei 27ºC unter belüftenden und schüttelnden Bedingungen in einem synthetischen Medium (Tabelle 1), das 2% Glukose enthielt, hochgezogen. Sofort nachdem die Glukose im Medium verbraucht war, wurden die Zellen mittels Zentrifugation abgetrennt. Die Zellen wurden mit einer sterilen 0,85% Natriumchlorid-Lösung gewaschen und erneut mittels Zentrifugation abgetrennt, so daß gewaschene, feuchte Zellen erhalten wurden. Tabelle 1 Glucose Biotin Calcium pantothenat Inositol Niacin p-Aminobenzoesäure Pyridoxin-Hydrochlorid Riboflavin Thiamin-Hydrochlorid
Diese gewaschenen, feuchten Zellen wurden sogleich in einem PAL-Induktionsmedium [d.h. 0,17% Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (Difco Laboratories), ergänzt mit 2% L-Phenylalanin], suspendiert, so daß eine Zell-Konzentration von 0,5 - 0,8% erhalten wurde. Die resultierende Suspension wurde zur Induktion von PAL 2 Stunden bei 27ºC unter Schütteln inkubiert. Nach der Induktion wurden die Zellen mittels Zentrifugation wiedergewonnen. Die wiedergewonnenen, nassen Zellen wurden im gleichen Volumen sterilen Wasser suspendiert, und die resultierende Suspension wurde in flüssigen Stickstoff eingetropft, so daß gefrorene Zellen erhalten wurden.
Zehn Gramm der gefrorenen Zellen, die wie oben beschrieben 2 Stunden auf die PAL-Induktion behandelt worden waren, wurden zu flüssigem Stickstoff in einem Mörser gegeben und mit einem Pistill feinst zerrieben. Der flüssige Stickstoff verdampfte sofort. Sobald das gefrorene Material aufzutauen begann, wurden dem Material 50 ml einer Puffer-Lösung "C" [zusammengesetzt aus 0,1 M Na&sub2;HPO&sub4; (pH 7,4), 0,15 M Natriumchlorid, 1% Natriumdesoxycholat und 1% Triton X-100 (eingetragenes Warenzeichen, Rohm & Haas, USA)], das mit 5% Natriumdodecylsulfat (SDS) supplementiert war, zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 30 Minuten sanft gerührt, um die Bestandteile gut zu mischen.
Nach Beendigung des Mischvorgangs wurden 50 ml eines Phenol- Chloroform-Gemisches (zusammengesetzt aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol in einem Volumenverhältnis von 25:24:1) zugesetzt und mittels 15minütigem Rühren gut vermischt.
Das resultierende Gemisch wurde zentrifugiert, um die wässrige Phase wiederzugewinnen. Dieser wässrigen Phase wurden 50 ml des Phenol-Chloroform-Gemisches zugesetzt und nachfolgend wurde 15 Minuten gerührt. Das resultierende Gemisch wurde dann erneut zentrifugiert, um die wässrige Phase wiederzugewinnen. Diese Exraktionen mit dem Phenol-Chloroform-Gemisch wurden zwei weitere Male wiederholt.
Der schließlich erhaltenen wässrigen Phase wurde 5 M NaCl zugesetzt, so daß die End-Konzentration an Natriumchlorid 0,2 M war. Dann wurden dazu 2,5 Volumina kaltes Ethanol zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde bei Temperaturen von -20ºC oder darunter aufbewahrt, um die Nukleinsäure-Bestandteile zu präzipitieren.
Das derart gebildete Präzipitat wurde mittels Zentrifugation abgetrennt, mit kaltem Ethanol gewaschen und dann unter reduziertem Druck getrocknet.
Das so erhaltene trockene Material wurde in 10 ml sterilem Wasser gelöst, und die resultierende Lösung wurde 5 Minuten auf 65ºC erhitzt. Anschließend wurde nach der Methode von Maniatis unter Verwendung von oligo-d(T)-Cellulose [Maniatis, T., et al., "Molecular Cloning", (1982)] eine mRNA-Komponente isoliert.
Die so erhaltene mRNA-Komponente wurde in einer Proben-Puffer- Lösung (zusammengesetzt aus 5 M Harnstoff, 1 mM EDTA und 0,05% Bromphenolblau) gelöst und dann zur Zerstörung der höheren Strukturen der mRNA 2 Minuten auf 65ºC erhitzt. Anschließend wurde die mRNA-Komponente unter Verwendung eines 8 M Harnstoff-Acrylamid-Slabgels (mit einer Acrylamid-Konzentration von 3% und einem Gehalt von 8 M Harnstoff) 1,5 Stunden bei 100 Volt in einer Elektrophorese-Pufferlösung (zusammengesetzt aus 89 mM Tris, 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA) elektrophoretisiert.
Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Acrylamidgel mit Ethidiumbromid behandelt, und mRNA-Banden wurden unter UV- Licht sichtbar gemacht. Ein Gelstück, von dem angenommen wurde, daß es mRNAs in der Größenordnung von 2,0 bis 3,0 kb enthielt, wurde in Längsrichtung in drei gleiche Teile geteilt, und die Gelsegmente der drei Teile wurden aus dem Slabgel ausgeschnitten.
Jedes Gelsegment wurde in einen Dialyseschlauch gesteckt und abgedichtet, und der Dialyseschlauch wurde in eine Elektrophorese-Puffer-Lösung der vorhin erwähnten Zusammensetzung getaucht. Auf diese Weise wurden die mRNAs aus den Gelsegmenten elektroeluiert.
Zu der Flüssigkeit in den einzelnen Dialyseschläuchen wurde das Phenol-Chloroform-Gemisch zur Extraktion der mRNA gegeben. Das Extraktionsverfahren wurde zweimal wiederholt. Die so erhaltene wässrige Phase wurde weiter mit Ether behandelt, um die Phenol-Rückstände zu entfernen. Zu dieser schließlich erhaltenen wässrigen Phase wurden zunächst 1/10 Volumen einer 3 M wässrigen Natriumacetat-Lösung (pH 5,2) und schließlich 2,5 Volumina kalter Ethanol gegeben. Das so von jedem Gelsegment erhaltene Gemisch wurde bei -20ºC aufbewahrt, um die mRNA zu präzipitieren.
Um auf das Vorhandensein der mRNA für PAL in der aus jedem der drei Gelsegmente extrahierten mRNA-Präparation zu testen, wurde die mRNA in der Präparation in Proteine translatiert, und die derart erhaltenen Proteine wurden mit einem für PAL spezifischen Antikörper getestet.
Genauer gesagt wurden die einzelnen mRNAs der Translation mittels eines zellfreien Translations-Kit unter Verwendung von Kaninchen-Retikulocyten-Lysat [Pelham, H. R. et al., Europ. J. Biochem. 67, 247 - 256 (1976)] unterworfen.
Der verwendete Kaninchen-Retikulocyten-Testkit war ein Produkt von Promega Biotec Co., und die verwendete markierte Aminosäure war ³&sup5;S-Methionin (Amersham Co.).
Die Identifizierung von PAL unter den in vitro synthetisierten Proteinen wurde durch Translation der mRNA in dem Kaninchen- Retikulocyten-Translationssystem wie folgt ausgeführt:
Zum Lösen der Proteine, die mittels Translation hergestellt worden waren, wurde Pufferlösung "C" dem Translations-Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach Entfernen der unlöslichen Substanzen mittels Zentrifugation wurde dem Reaktionsgemisch Anti-PAL-Kaninchen IgG (im Labor hergestellt) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Anschließend wurde dem Reaktionsgemisch Anti-Kaninchen IgG Schafsserum (im Labor hergestellt) zugegesetzt. Das Gemisch wurde dann 30 Minuten auf Eis stehen gelassen, um Proteine zusammen mit den Kaninchen-Antikörper-Komponenten auszufällen. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation wiedergewonnen, zweimal mit der Pufferlösung "C" gewaschen und dann in einer im Volumenverhältnis 3:1 kombinierten Lösung einer gemischten Lösung aus 2% SDS und 10% β-Mercaptoethanol mit einer anderen gemischten Lösung aus 0,1 M Tris-phosphat (pH 6,8), 1% SDS und 50% Glyzerin gelöst. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden auf 95ºC erhitzt, um die Disulfidbrücken in den Proteinmolekülen zu spalten. Die Lösung wurde dann gemäß dem Verfahren von Laemmli [Laemmli, U. K., Nature 227, 680 - 685 (1970)] einer SDS-Polyacrylamid-Slabgel-Elektrophorese (bei einer Acrylamidkonzentration von 10%) unterworfen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet, und die Anwesenheit von PAL wurde autoradiographisch detektiert.
Jede der mRNA-Fraktionen, die den Gelfragmenten entstammten, wurde nach der oben beschriebenen Methode getestet. So wurde die Fraktion, die die für PAL kodierende mRNA enthielt, identifiziert.

(2) Synthese von doppelsträngiger cDNA (ds-cDNA) für PAL unter Verwendung von mRNA für PAL

Die für PAL kodierende mRNA wurde aus dem nach der Elektrophorese der mRNA-Fraktionen, die von den Zellen, die wie in Abschnitt (1) oben beschrieben 2 Stunden der Behandlung für die PAL-Induktion unterworfen waren, erhaltenen Gelsegment gereinigt. Die so erhaltene mRNA wurde mit AMV Reverser Transkriptase zur Synthese von einzelsträngigen cDNA-Transkripten der mRNA für PAL [Gugger, U. et al., Gene 25, 263 - 269 (1983)] behandelt.
Genauer gesagt, wurde zunächst ein cDNA-mRNA-Hybrid synthetisiert, dann wurde die mRNA mittels Behandlung mit RNase H entfernt, und dann wurde die doppelsträngige cDNA (ds-cDNA) durch Behandlung mit DNA Polymerase I und T 4 DNA Ligase gebaut.

(3) Konstruktion der ds-cDNA mit oligo-dC-Schwänzen an den 3'- Enden

Die in Abschnitt (2) erhaltene ds-cDNA wurde mit terminaler Desoxynukleotidyltransferase (TdT) behandelt, um oligo-dC- Schwänze an die 3'-Enden der ds-cDNA zu hängen.
Genauer gesagt, wurden 3 ug der ds-cDNA in einer TdT-Reaktionspuffer-Lösung [zusammengesetzt aus 100 mM Kaliumcacodylat (pH 7,2), 2 mM Kobaltchlorid und 0,2 mM Dithiothreitol und supplementiert mit 0,2 mM dCTP] aufgelöst. Nachdem die Pufferlösung 5 Minuten bei 37ºC vorgewärmt worden war, wurden 50 Einheiten TdT zugesetzt, und das resultierende Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, um den Ablauf der Reaktion zu erlauben. Anschließend wurde EDTA auf eine Endkonzentration von 40 mM zugesetzt. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch auf Eis gesetzt, und das Phenol-Chloroform-Gemisch wurde dem Reaktionsgemisch zugegeben, um die TdT zu denaturieren und zu inaktivieren. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, um denaturierte, unlösliche Proteine zu entfernen, und der so erhaltene Überstand wurde mit Phenol extrahiert. Die wässrige Phase wurde genommen und mit kaltem Ethanol gemischt. Das so gebildete Präzipitat wurde aufgefangen, mit 70% Ethanol gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, so daß die ds-cDNA mit oligo-dC-Schwänzen an den 3'-Enden erhalten wurde.

(4) Konstruktion des Hybrid-Plasmids (Verbindung des oligo-dG-Schwänze aufweisenden Plasmids pUC 9 mit der ds-cDNA mit oligo-dC-Schwänzen)

Die ds-cDNA mit den oligo-dC-Schwänzen, die in Abschnitt (3) erhalten worden war, wurde gemäß der Methode nach Maniatis, die als das dC-dG-Homopolymer-Verfahren bekannt ist, mit dem Plasmid pUC 9 mit den oligo-dG-Schwänzen (kommerziell erhältlich von Pharmacia Co., Schweden) verbunden.

(5) Transformation und Selektion der Klone

Das in Abschnitt (4) erhaltene Hybrid-Plasmid, das aus dem oligo-dG-getailten pUC 9 und der oligo-dC-getailten ds-cDNA bestand, wurde nach dem Kompetente-Zellen-Verfahren in CaCl&sub2;- behandelte Escherichia coli (MC 1061) [Casadaban, M. T. et al., Method in Enzymology, Bd. 100, 293 -308, Acadamic Press, New York (1983)] eingeführt.
Von etwa 40 000 Kolonien, die in der oben beschriebenen Weise erhalten wurden, wurden transformierte Zellen nach dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren auf der Grundlage des Verfahrens von Grunstein et al. [Grunstein, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 3961 (1971)] selektiert.
Die für die Kolonie-Hybridisierung verwendete DNA-Sonde war die ³²P-markierte einzelsträngige cDNA, die wie in Abschnitt (2) beschrieben erhalten wurde, außer daß dem Reaktionsgemisch anstelle von unmarkiertem dCTP α-³²P-dCTP zugesetzt worden war.
Von den so erhaltenen positiven Kolonien wurden Plasmide extrahiert und gereinigt. Die Plasmide wurden mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut, und die resultierenden DNA- Fragmente wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese untersucht.

(6) Konstruktion der das komplette, für PAL kodierende Strukturgen enthaltenden ds-cDNA

Die Plasmide pSW 2 und pSW 11 wurden aus den in Abschnitt (5) erhaltenen Transformanden isoliert.
Als Ergebnis der in Abschnitt (5) mit Hilfe von verschiedenen Restriktionsendonukleasen ausgeführten Analyse wurde außerdem gefunden, daß die komplette cDNA mit der der mRNA für PAL entsprechenden Länge durch Kombination von pSW 2 und pSW 11 zusammengebaut werden konnte. Somit wurden diese beiden Plasmide getrennt aus den sie tragenden Transformanden extrahiert und gereinigt. Das Plasmid, das aus den pSW 2 tragenden Zellen erhalten wurde, wurde erst mit der Restriktionsendonuklease Ban III und dann mit der Restriktionsendonuklease Hind III verdaut. Das resultierende Fragmentgemisch wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert. So wurde ein DNA-Fragment mit der Größe von 4,2 kb wiedergewonnen und gereinigt, indem es mehrfach dem Verfahren unterworfen wurde, das die Behandlung mit dem Phenol-Chloroform-Gemisch und die Präzipitation mit kaltem Ethanol umfaßt.
Getrennt davon wurde das aus den das Plasmid pSW 11 tragenden Zellen gewonnene Plasmid mit den Restriktionsendonukleasen Ban III und Hind III verdaut. Indem das resultierende Fragment-Gemisch der Elektrophorese unterworfen wurde, wurde ein DNA- Fragment von 0,8 kb wiedergewonnen und gereinigt.
Die so erhaltenen 4,2 und 0,8 kb großen Fragmente wurden unter Verwendung von T 4 DNA-Ligase zirkularisiert, und das resultierende Produkt wurde zur Transformation von Escherichia coli (JM 83, ATCC 35607) [Messing, J. und Vieira, J., Gene 19, 259 - 268 (1982)] verwendet.
Die aus den Trasnformanden extrahierten Plasmide, die auf Grund ihrer Ampicillin-Resistenz selektiert worden waren, wurden mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen behandelt, um Restriktionskarten aufzustellen. So wurde das Plasmid pSW 13 mit der DNA voller Länge für PAL erhalten. Die Restriktionskarte der die PAL kodierenden DNA ist in den Fig. 1 und 3 dargestellt.

(7) Ermittlung der Nukleotidsequenz der klonierten DNA

Die klonierte DNA aus dem Plasmid pSW 13, das aus den das Plasmid pSW 13 tragenden Zellen isoliert worden war, wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut. Die Nukleotidsequenzen der resultierenden Restiktionsfragmente wurden entsprechend dem Maxam-Gilbert-Verfahren (Verfahren mit chemischer Zersetzung) und auch mittels biochemischer Verfahren unter Verwendung des Verfahrens von Maat (Didesoxy-Verfahren) [Maat, J. et al., Nucleic Acids Research 5, 4537 - 4545 (1978)] bestimmt. Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden unter Verwendung des von Mitsui Information Development Co. hergestellten GENAS-Programms bearbeitet. Die so bestimmte Nukleotidsequenz ist in Fig. 2 dargestellt, die aus (A) - (D) besteht.
Das für PAL kodierende Strukturgen einschließlich Startkodon und Stopkodon umfaßt die sich von den Nukleotiden 1 bis 2151 erstreckende Nukleotidsequenz.

(8) Konstruktion von pSW 101 (siehe Figur 3)

In 14 ul eines Reaktionsmediums [zusammengesetzt aus 7 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,7 mM EDTA, 7 mM MgCl&sub2;, 175 mM NaCl, 7 mM β-Mercaptoethanol und 0,01% Rinderserumalbumin (RSA)] wurden 0,9 ug pUC 13 (Pharmacia Co.) 16 Stunden bei 37ºC mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease Sal I verdaut. Nachdem die Spaltung beendet war, wurde mittels der Phenol-Chloroform-Behandlung und der Ethanol-Präzipitation ein lineares pUC 13 DNA-Fragment erhalten.
Daraufhin wurde die lineare DNA 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Nick-Translations-Pufferlösung [zusammengesetzt aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM Dithiothreitol, 2% RSA, 80 uM dATP, 80 uM dGTP, 80 uM dTTP und 80 uM dCTP] mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt. So wurden die kohäsiven Enden der linearen DNA in glatte Enden umgewandelt. Nachdem die Proteine mit Phenol entfernt worden waren, wurde das DNA-Fragment mittels Präzipitation mit kaltem Ethanol wiedergewonnen. Nachfolgend wurden die 5'-terminalen Phosphoryl-Gruppen von der linearen pUC 13 DNA durch Behandlung mit Phosphodiesterase aus Kälbermilz (CIP; Boehringer Mannheim) entfernt, um die Selbstzirkularisation der resultierenden linearen pUC 13 DNA zu verhindern.
Getrennt davon wurde das Plasmid pSW 13 aus dem das Plasmid pSW 13 tragenden Klon extrahiert und gereinigt. Das Plasmid pSW 13 wurde 28 Stunden bei 37ºC in einem Reaktionsmedium [zusammengesetzt aus 4 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,4 mM EDTA und 50 mM NaCl] mit der Restriktionsendonuklease Dra I behandelt. Nach Zugabe einer NaCl-Lösung zu dem Medium, um eine Natriumchlorid-Konzentration von 100 mM zu erhalten, wurde das Plasmid pSW 13 für weitere 16 Stunden bei 37ºC mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und Hind III behandelt.
Nach Beendigung der Behandlung wurde das Reaktionsgemisch einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Ein DNA-Fragment mit einer Größe von 2,3 kb wurde aus dem Gel gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde dann dreimal der Prozedur unterworfen, die die Extraktion mit Phenol, die Behandlung mit einem Phenol- Chloroform-Gemisch und die Präzipitation mit kaltem Ethanol umfaßt. Auf diese Weise wurde ein für PAL kodierendes cDNA- Fragment erhalten.
In der zuvor erwähnten Nick-Translationspuffer-Lösung wurde das cDNA-Fragment mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I 45 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und dann dreimal der Prozedur unterworfen, die die Behandlung mit einem Phenol- Chloroform-Gemisch und die Präzipitation mit kaltem Ethanol umfaßt. Auf diese Weise wurde eine cDNA mit glatten Enden erhalten.
Die so erhaltene cDNA mit glatten Enden und das wie oben hergestellte pUC 13-Fragment mit glatten Enden wurden mit Hilfe der T 4 DNA-Ligase miteinander verbunden, so daß das zirkuläre Plasmid pSW 101 erhalten wurde.
Unter Verwendung dieses Hybrid-Plasmids wurde eine Transformation von Escherichia coli (JM 83) gemäß der bekannten Methode ausgeführt. Kolonien wurden auf Grund der Ampicillinresistenz selektiert und auf PAL-Aktivität getestet. Schließlich wurde der Stamm MT-10410 (FERM P-8834) mit dem Plasmid pSW 101 erhalten.

(9) Konstruktion von pYtrp6 und Transformation von Escherichia coli mit diesem Plasmid

Das Plasmid pSW 101, das in der in Abschnitt (8) beschriebenen Weise erhalten worden war, wurde mit den Restriktionsendonukleasen Pst I und BamH I verdaut. Nach der Elektrophorese auf Agarosegel wurde eine eine 370 bp lange DNA enthaltende Fraktion wiedergewonnen. Diese Fraktion wurde in zwei Teile aufgeteilt, wovon der eine Teil mit Ban I und der andere mit Bbe I verdaut wurden.
Nach dem Verdau wurde jede Fraktion der Acrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. So wurden aus dem Verdau mit Ban I ein DNA-Fragment von 70 bp und aus dem Verdau mit Bbe I ein Fragment von 280 bp Länge isoliert.
Das 70 bp Fragment wurde mit DNA-Polymerase I behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und dann mittels Ligation mit T 4 Ligase mit Cla I (Ban III) Linkern verbunden.
Das resultierende DNA-Fragment mit den Cla I Linkern an beiden Enden wurde mit den Restriktionsendonukleasen Ban III und Bbe I verdaut. Nachfolgend wurden das resultierende DNA-Fragment einschließlich der Cla I Linker und das kurz zuvor hergestellte Bbe I-Fragment (280 bp) unter Verwendung von T 4 DNA Ligase mit dem 4,0 kb Fragment, das durch Verdau von pBR 322 (Pharmacia Co.) mit den Restriktionsendonukleasen Ban III und BamH I erhalten worden war, wie in Fig. 5 dargestellt verbunden. Das Plasmid pSYA 1 wurde auf diese Weise erhalten. Mit dem Plasmid pSYA 1 wurde nach der herkömmlichen Calcium-Methode eine Transformation von Escherichia coli (MC 1061) durchgeführt. Die das Plasmid pSYA 1 tragenden Escherichia coli-Zellen wurden über Nacht bei 37ºC in 3 ml mit Ampicillin supplementiertem LB-Medium [zusammengesetzt aus 10 g Bacto-Trypton (eingetragenes Warenzeichen, Difco Laboratories), 5 g Bacto-Yeast- Extrakt (eingetragenes Warenzeichen, Difco Laboratories), 5 g NaCl, 1 g Glukose und 1 l destilliertem Wasser, wobei der pH mit NaOH auf 7,5 eingestellt war] hochgezogen. Die mittels Zentrifugation aufgefangenen Zellen wurden in 60 ul einer aus 50 mM Glukose, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM EDTA zusammengesetzten Lösung suspendiert. Dann wurden 40 ul einer 10 mg/ml Lysozym-Lösung zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurden dem Gemisch 200 ul einer 0,2 M NaOH, die 1% SDS enthielt, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Vortex vorsichtig gemischt, dann auf Eis gestellt und dort 5 Minuten stehen gelassen. Dann wurden dem Gemisch 150 ul einer 5 M Natriumacetat-Lösung (pH 4,8) zugegeben. Nach vorsichtigem Vermischen mit dem Vortex wurde das Gemisch auf Eis gestellt, um die Reaktion zu beenden.
Das resultierende Zell-Lysat wurde 10 Minuten bei 12 000 U/min zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen. Der Überstand wurde dann dreimal der Prozedur unterworfen, die die Behandlung mit dem Phenol-Chloroform-Gemisch und die Präzipitation mit kaltem Ethanol umfaßt.
Aus dem so erhaltenen Präzipitat wurde das Plasmid pSYA 1 nach herkömmlichen Verfahren extrahiert. Das Plasmid pSYA 1 wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamH I und Ban III verdaut, und dann wurde ein DNA-Fragment von 350 bp Größe isoliert.
Getrennt davon wurde das in Abschnitt (6) erhaltene Plasmid pSW 13 mit der Restriktionsendonuklease Xba I verdaut. Die kohäsiven Enden wurden mit DNA Polymerase I behandelt, um glatte Enden zu erhalten. Dann wurden mittels Ligation mit T 4 DNA Ligase HindIII Linker an das Plasmid pSW 13 gehängt, so daß das Plasmid pSW 13H erhalten wurde. Das Plasmid pSW 13H wurde dann mit den Restriktionsendonukleasen BamH I und Hind III verdaut. Nach Agarosegel-Elektrophorese wurde ein DNA- Fragment von 1,9 kb isoliert.
Getrennt davon wurde das Plasmid pVV 1 [Nicols, B. P. und Yanofsky, C., Method in Enzymology 101, 155 (1983)], das einen Teil des trp-Operons von Escherichia coli enthält, mit der Restriktionsendonuklease HinfI verdaut.
Nach Agarosegel-Elektrophorese wurde nach der oben beschriebenen Methode ein DNA-Fragment von 0,9 kb aus dem Gel gewonnen.
Die kohäsiven Enden des 0,9 kb-Fragmentes, das durch den Verdau mit Hinf I hergestellt worden war, wurden nach dem in Abschnitt (8) beschriebenen Verfahren in glatte Enden überführt. EcoR I Linker (GGAATTCC) wurden dann durch Ligation mit T 4 DNA Ligase an die glatten 5'-Enden des DNA-Fragments gehängt.
Das derart hergestellte DNA-Fragment mit den EcoR I Linkern wurde mit der Restriktionsendonuklease EcoR I verdaut, um ein Fragment mit EcoR I geschnittenen kohäsiven Enden zu erhalten [Nicols, B. P. und Yanofsky, C., Methods in Enzymology 101, 155 (1983)].
Unter Verwendung von T 4 DNA Ligase wurde das DNA-Fragment mit den ECoR I kohäsiven Enden mit dem DNA-Fragment verbunden, das durch Behandlung von nach dem in Abschnitt (8) beschriebenen Verfahren EcoRI-verdauten pBR 322 mit CIP erhalten worden war. Das resultierende Produkt wurde dann mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Bgl II verdaut. Der Verdau wurde dann einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen, so daP ein DNA- Fragment von 0,4 kb Größe erhalten wurde.
Dieses 0,4 kb DNA-Fragment mit drei Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Taq I wurde mit Taq I partiell verdaut. Ein DNA-Fragment von 345 bp Größe wurde auf diese Weise erhalten.
Dieses 345 bp DNA-Fragment wurde mit dem 4,3 kb DNA-Fragment verbunden, das durch Verdau von pBR 322 mit der Restriktionsendonuklease EcoRI bzw. Cla I erhalten worden war. So wurde das Plasmid pFtrp2 mit dem trp-Promotor erhalten.
Das wie oben beschrieben zusammengebaute Plasmid pFtrp2 wurde mit den Restriktionsendonukleasen Ban III und Hind III verdaut. Nach Agarosegel-Elektrophorese wurde ein Fragment von 4,7 kb erhalten. Wie es in Fig. 6 dargestellt ist, wurde dieses DNA-Fragment dann durch Ligation mit T 4 DNA Ligase mit dem 350 bp BamHI-BanIII-DNA-Fragment und dem 1,9 kb BamHI- HindIII-DNA-Fragment, die beide zuvor hergestellt worden waren, verbunden. Das zirkuläre Plasmid pSYA 2, das in Fig. 7 gezeigt ist, wurde auf diese Weise erhalten.
Nachfolgend wurde das Plasmid pSYA 2 mit Ban III partiell verdaut, und die resultierenden kohäsiven Enden wurden mit DNA Polymerase I behandelt, um ein DNA-Fragment mit glatten Enden zu erzeugen. Dieses DNA-Fragment wurde dann durch Ligation mit T 4 DNA Ligase zirkularisiert, um das Plasmid pYtrp6 mit einer Schnittstelle für NruI zu erzeugen (Fig. 7).
Escherichia coli (MC 1061) wurden nach dem herkömmlichen Verfahren mit dem Plasmid pYtrp6 transformiert. Klonierte Zellen wurden mittels der Ampicillin-Resistenz selektiert und auf PAL-Aktivität getestet. Die so isolierten, transformierten Escherichia coli-Zellen, die PAL-Aktivität aufwiesen, erhielten die Bezeichnung MT 10414 (FERM P-8876).
Die Schritte, das Plasmid pYtrp6 zu konstruieren, sind in Fig. 4 im Überblick und in den Fig. 5, 6 und 7 im Detail dargestellt.

Referenzbeispiel 2 (Konstruktion des Plasmids pSW 115)

Die Verfahren zur Konstruktion verschiedener Plasmide in Referenzbeispiel 2 sind in Fig. 8 dargestellt.

(1) Konstruktion des Plasmids pTac11 nach dem in Fig. 9 dargestellten Verfahren

Zuerst wurde das Plasmid pYtrp6 aus Escherichia coli MT 10414 (FERM P-8876), die pYtrp6 mit einer Insertion des Strukturgens für PAL enthalten, erhalten nach der in Referenzbeispiel 1 beschriebenen Methode aus Rhodosporidium toruloides, extrahiert. Das so erhaltene Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen NruI und Hind III verdaut. Nach der Elektrophorese wurde ein DNA-Fragment von 2,4 kb Länge erhalten.
Getrennt davon wurde das Plasmid pKK223-3 (Pharmacia Co.), das den tac-Promotor trägt, mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut, so daß ein DNA-Fragment mit kohäsiven Enden erhalten wurde. Das DNA-Fragment wurde dann mit DNA Polymerase I behandelt, um seine kohäsiven Enden in glatte Enden umzuwandeln.
Anschließend wurde das DNA-Fragment mit glatten Enden mit der Restriktionsendonuklease HindIII verdaut, so daß ein DNA-Fragment mit kohäsiven Enden erhalten wurde. Dieses DNA-Fragment wurde dann in Gegenwart von T 4 DNA Ligase mit dem zuvor hergestellten 2,4kb DNA-Fragment ligiert. Das resultierende Produkt wurde nach dem Verfahren von Cohen et al. [Cohen, S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1982)] in Escherichia coli (MC 1061) eingebracht.
Nachfolgend wurden die Escherichia coli, die das Produkt trugen, auf Ampicillin-Platten, die durch Zugabe von 1,5% Agar zu dem zuvor schon erwähnten LB-Medium, supplementiert mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml, hergestellt worden waren, hochgezogen. Nach Beendigung der Inkubation wurden klonierte Zellen auf Grund der Ampicillin-Resistenz selektiert, und die Plasmid-Moleküle wurden anschließend aus den Klonen extrahiert. Die Restriktionskarten der einzelnen Plasmide wurden erstellt. Dann wurden die Klone, die das gewünschte Plasmid pTac11 mit der in Fig. 9 dargestellten Struktur tragen, identifiziert, und das Plasmid pTac11 wurde aus den klonierten Zellen isoliert.

(2) Konstruktion des Plasmids pPL-PAL-head nach der in Fig. 10 dargestellten Methode

Das Plasmid pPL-lambda (Pharmacia Co.) wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und HpaI verdaut. Nach der Elektrophorese wurde ein DNA-Fragment von 470 bp erhalten. Dieses 470 bp DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease partiell verdaut. Nach der Elektrophorese wurde ein DNA-Fragment von 370 bp erhalten.
Außerdem wurde das 370 bp DNA-Fragment mit DNA Polymerase I behandelt, um an seinen 5'-Enden glatte Enden zu erzeugen. Das so erhaltene DNA-Fragment mit glatten Enden wurde in Gegenwart von T 4 DNA Ligase mit Cla I Linkern umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das resultierende Produkt mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und Cla I verdaut, so daß eine Fraktion erhalten wurde, die kleine und grobe EcoRI-ClaI-DNA- Fragmente enthält.
Getrennt davon wurde das Plasmid pSYA 2, das während des Prozesses der Klonierung des PAL-Strukturgens von Rhodosporidium toruloides in Referenzbeispiel 1 hergestellt worden war, mit der Restriktionsendonuklease EcoR I verdaut. Das resultierende DNA-Fragment wurde weiterhin partiell mit der Restriktionsendonuklease ClaI gespalten. Nach der Elektrophorese wurde ein grobes DNA-Fragment separat von einem Gemisch großer und kleiner EcoRI-ClaI-DNA-Fragmente erhalten.
Das so aus dem Plasmid pSYA 2 erhaltene große DNA-Fragment wurde in Gegenwart von T 4 DNA Ligase mit der zuvor hergestellten Fraktion, die das Gemisch aus groben und kleinen DNA- Fragmenten enthält, umgesetzt. Die resultierenden Reaktionsprodukte wurden in Escherichia coli (MC 1061) eingebracht, und die Escherichia coli-Zellen wurden auf Ampicillin-Platten hochgezogen. Nach Beendigung der Inkubation wurden Kolonien auf Grund der Ampicillin-Resistenz selektiert, und aus den individuell klonierten Zellen wurden dann die Plasmide extrahiert. Die Restriktionskarten der einzelnen Plasmide wurden erstellt. Schließlich wurde der Klon, der das gewünschte Plasmid pSYPL-3 mit der in Fig. 10 dargestellten Struktur enthielt, identifiziert, und das Plasmid pSYPL-3 wurde aus den Zellen, die von diesem Klon abstammten, hergestellt.
Dieser Klon bekam die Bezeichnung MT 10424 (FERM P-9024).
Außerdem wurde das so erhaltene Plasmid pSYPL-3 mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und BamH I verdaut. Nach der Elektrophorese wurde aus dem resultierenden Gemisch großer und kleiner EcoRi-BamHI-DNA-Fragmente ein kleines DNA-Fragment erhalten.
Getrennt davon wurde das Plasmid pBR 322 (Pharmacia co.) mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und BamH I gespalten. Nach Elektrophorese wurde ein grobes DNA-Fragment aus dem Gemisch grober und kleiner EcoRI-BamHI-DNA-Fragmente separat isoliert. Das so aus dem Plasmid pBR 322 erhaltene große DNA- Fragment wurde dann in Gegenwart von T 4 DNA Ligase mit dem kleinem DNA-Fragment, das zuvor aus dem Plasmid pSYPL-3 hergestellt worden war, umgesetzt. Schließlich wurde das Plasmid pPL-PAL-head mit der in Figur 10 dargestellten Struktur erhalten. Um zu bestätigen, daß das gewünschte Plasmid erhalten worden war, wurde das resultierende Produkt der zuvor erwähnten, in Gegenwart von T 4 DNA Ligase abgelaufenen Reaktion in E. coli (MC 1061) eingebracht. Dann ließ man die E. coli-Zellen auf einer Ampicillin-Platte wachsen. Klonierte Zellen wurden mit Hilfe der Ampicillin-Resistenz selektiert, und dann wurde aus den Klonen ein Plasmid-Molekül extrahiert. Die Restriktionskarten der einzelnen Plasmide wurden erstellt, um die Anwesenheit des gewünschten Plasmids sicherzustellen.

(3) Konstruktion des Plasmids pSW 115 nach dem in Fig. 11 dargestellten Verfahren

Als erstes wurde das Plasmid pTac 11, das in in Abschnitt (1) erhalten worden war, mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und AatI verdaut. Nach der Elektrophorese wurde ein großes DNA-Fragment getrennt von einem Gemisch aus großen und kleinen EcoRI-AatI-DNA-Fragmenten gewonnen.
Getrennt davon wurde das in Abschnitt (2) erhaltene Plasmid pPL-PAL-head mit den Restriktionsendonukleasen EcoR I und AatI gespalten. Nach der Elektrophorese wurde ein kleines DNA-Fragment getrennt von einem Gemisch aus großen und kleinen EcoR I- AatI-DNA-Fragmenten gewonnen.
Schließlich wurde das zuvor erwähnte grobe DNA-Fragment, das aus dem Plasmid pTac11 stammt, mittels Ligation mit T 4 DNA Ligase an das zuvor erwähnte kleine DNA-Fragment gehängt, das aus dem Plasmid pPL-PAL-head stammt. Das Plasmid pSW 115 wurde auf diese Weise erhalten.
Um zu bestätigen, daß das gewünschte Plasmid erhalten worden war, wurde das Plasmid, hergestellt mittels der zuvor erwähnten Reaktion, in Escherichia coli (MC 1061) eingebracht. Dann wurden die resultierenden Transformanden auf einer Ampicillin- Platte selektiert. Aus der einzelnen klonierten Zelle wurde ein Plasmid-Molekül extrahiert, und die Restriktionskarte des Plasmid-Moleküls wurde erstellt. Gleichzeitig wurde der Transformand nach der anschließend beschriebenen Methode auf PAL- Aktivität getestet. Der transformierte Escherichia coli-Stamm mit der PAL-Aktivität, der auf diese Weise erhalten worden war, wurde als MT 10423 (FERM P-9023) bezeichnet.

(4) Expression von PAL mit Hilfe des Plasmids pSW 115

Die in Abschnitt (3) erhaltenen transformierten Escherichia coli-Zellen, die das Plasmid pSW 115 tragen, wurden in LB-Medium (pH 7,5) inokuliert, das wie schon erwähnt mit 50 ug/ml Ampicillin supplementiert war. Das inokulierte Medium wurde unter Schütteln 20 Stunden bei 30ºC inkubiert.
Nach Beendigung der Inkubation hatte die Kultur eine Zelldichte, die eine optische Dichte (OD bei 660 nm) von 5,40 ausmachte. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation aus der Kultur abgetrennt und dann nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren auf PAL-Aktivität getestet. Die spezifische Aktivität der so erhaltenen Zellen war 630 Einheiten/g Zellen (Trockengewicht).

Bestimmung der PAL-Aktivität

Die PAL-Aktivität des Zellextrakts wurde unter Verwendung der enzymatischen Reaktion, bei der Zimtsäure aus L-Phenylalanin synthetisiert wird, wie folgt bestimmt.
Zuerst wurden die Zellen mittels Zentrifugation aus der Kultur abgetrennt. Die abgetrennten Zellen wurden gewaschen, indem sie in einer 0,85% Natriumchlorid-Lösung suspendiert wurden, und mittels Zentrifugation abgetrennt. Die gewaschenen Zellen wurden dann in einer 25 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,8) so suspendiert, daß eine Zell-Konzentration von, bezogen auf das Feuchtgewicht, etwa 1% erhalten wurde. Die Suspension wurde einem Medium für enzymatische Reaktionen zugesetzt, das eine 25 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,8), supplementiert mit 25 mM L-Phenylalanin und 0,005% Cetylpyridium-Hydrochlorid, enthielt. Das resultierende Reaktionsmedium wurde 20 Minuten bei 30ºC inkubiert. Nach Abschluß der Reaktion durch Zugabe von 1 N HCl wurde die Zimtsäure, die sich in dem Reaktionsgemisch gebildet hatte, mit Flüssig-Chromatographie analysiert, um die PAL-Aktivität abzuschätzen. Eine Einheit (U), wie sie hier definiert ist, entspricht der Menge an Enzym, die pro Minute 1 uMol Zimtsäure bildet.
Die für die Abschätzung verwendete Menge an Zellen war das Trockengewicht der entsprechenden gewaschenen Zellen.
In den oben beschriebenen Referenzbeispielen wurde das Einbringen des rekombinanten Plasmids in Escherichia coli nach dem Verfahren von Cohen et al. [Cohen, S. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1982)] durchgeführt. Wenn es nicht anders angegeben ist, wurden die Plasmide oder DNA-Fragmente mit Restriktionsendonukleasen, T 4 DNA Ligase oder DNA Polymerase I auf die übliche Art und Weise behandelt, die Plasmid-Zubereitungen aus den Bakterien-Zellen wurden in üblicher Weise ausgeführt, und außerdem waren die Restriktionsendonukleasen, die Linker, die T 4 DNA Ligase und die DNA Polymerase I Produkte von Takara Shuzo K. K.

Beispiele und Vergleichsbeispiele

Die vorliegende Erfindung wird im Nachfolgenden an Hand der Beispiele und Vergleichsbeispiele näher beschrieben.
Nachfolgend verwendete Medien wurden wie folgt hergestellt.

LB-AP-Medium:

LB-Medium, bestehend aus den folgenden Bestandteilen, wurde 15 Minuten bei 120ºC autoklaviert und unter sterilen Bedingungen mit Ampicillin (AP) in einer Konzentration von 50 ug/ml supplementiert.

Bestandteile des LB-Mediums

Trypton 10 g
Hefe-Extrakt 5 g
NaCl 5g
Destilliertes Wasser 1 l
(Der pH des Mediums wurde mit KOH auf 7,5 eingestellt)

LB-AP-Agar-Medium:

LB-Medium bestehend aus den zuvor erwähnten Bestandteilen wurde mit Glukose und Agar in einer Konzentration von 15 g/l bzw. 1 g/l ergänzt. Nach Sterilisation durch Autoklavieren wurde das Medium unter sterilen Bedingungen mit Ampicillin (AP) in einer Konzentration von 100 ug/ml supplementiert und dann in Petrischalen verteilt, um LB-AP-Agarplatten zu bereiten.

Synthetisches Medium:

Monokaliumphosphat 3 g
Dikaliumphosphat 7 g
Magnesiumsulfat x 7 H&sub2;O 0,5 g
Ammoniumsulfat 1,5 g
Calciumchlorid 0,02 g
Eisen(II)-sulfat 0,02 g
Natriumcitrat 1 g
Casaminosäuren 12 g
L-Tryptophan 0,1 g
Destilliertes Wasser 1 l

Beispiel 1

Die Kultur von Escherichia coli MT 10424 (FERM P-9024), die das Hybrid-P1asmid pSYPL-3 trägt, wurde auf LB-AP-Agarplatten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert. Das Hybrid-Plasmid pSYPL- 3, das im Lauf von Referenzbeispiel 2 zusammengebaut worden ist, umfaßt den Expressions-Vektor, der das die Ampicillin- Resistenz kodierende Gen mit den Insertionen des PL-Lambda- Promotors/Operators und das abwärts davon insertierte PAL- Strukturgen trägt.
LB-Medien mit Glukose in 5 verschiedenen Konzentrationen (wie in Tabelle 2 angegeben) wurden jeweils in Volumina von 100 ml in einem Sakaguchi-Kolben mit Baumwollstopfen hergestellt. Nach der Sterilisation durch Autoklavieren wurde dem Medium in jedem Kolben unter sterilen Bedingungen Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml zugesetzt um das LB-AP-Medium herzustellen.
Anschließend wurde ein Teil der Bakterien-Zellen, die von einer Kolonie, die auf einer LB-AP-Agarplatte saß, genommen wurden, als Inokulum in jedes der LB-AP-Medien in den Sakaguchi- Kolben transferiert. Die inokulierten Medien wurden dann 25 Stunden bei 30ºC unter Schütteln mit 110 Anschlägen pro Minute inkubiert.
Nach der Inkubation wurden aus den Kulturen Zellextrakte hergestellt und auf PAL-Aktivität wie nachfolgend beschrieben getestet.
Das mittels der OD&sub6;&sub0;&sub0; geschätzte Bakterien-Wachstum und die spezifische PAL-Aktivität der einzelnen Kulturen am Ende der Inkubationszeit sind in Tabelle 2 angegeben.

Zubereitung des Zellextrakts:

Die Zellen wurden mit Hilfe der Zentrifugation aus den einzelnen Kulturen gewonnen, dann suspendiert und in einer 0,85% NaCl-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden wiederum mittels Zentrifugation abgetrennt, in einer 0,05 mM Tris-HCl- Pufferlösung (pH 8,8) bei einer Zell-Konzentration von, bezogen auf das Feuchtgewicht, 2% suspendiert und dann einer Ultraschall-Behandlung unterworfen, um die Zellen zu zerstören. Die resultierenden Zelltrümmer in der Suspension wurden durch Zentrifugation entfernt, so daß der Zellextrakt erhalten wurde.

Bestimmung der PAL-Aktivität:

Die PAL-Aktivität des Zellextraktes wurde unter Verwendung der enzymatischen Reaktion, bei der aus L-Phenylalanin Zimtsäure synthetisiert wird, wie folgt bestimmt.
Zuerst wurde eine Probe des Zellextrakts mit einer 25 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,8) so gelöst, daß eine Zell-Konzentration von, bezogen auf das Feuchtgewicht, etwa 1% erhalten wurde. Ein 1,0 ml-Teil davon wurde 4,0 ml einer 31,25 mM Tris- HCl-Pufferlösung (pH 8,8) zugesetzt, die mit 31,25 mM L-Phenylalanin supplementiert war. Die resultierende Lösung wurde 20 Minuten bei 30ºC inkubiert, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 1 N HCl gestoppt. Die Menge an Zimtsäure, die sich in dem Reaktionsgemisch gebildet hatte, wurde mittels Flüssig-Chromatographie unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen bestimmt, um die PAL-Aktivität abzuschätzen.
Eine Einheit (U), wie sie hier definiert ist, ist die Menge an Enzym, die pro Minute 1 uMol Zimtsäure bildet.

Bedingungen für die Flüssig-Chromatographie:

Eine Isoliersäule YMC Pack A-312 (Yamasura Chemical Laboratories, Japan) mit einer mobilen Phase aus Methanol:Wasser: Phosphorsäure (50:41:0,08 v/v) wurde verwendet, und Zimtsäure wurde mit einem UV-Spektrophotometer bei der Wellenlänge von 260 nm detektiert.
Die für die Abschätzung der PAL-Aktivität verwendete Menge an Zellen war das Trockengewicht der entsprechenden gewaschenen Zellen. Tabelle 2 Glucose (%) Bakterien-Wachstum (OD&sub6;&sub0;&sub0;) spezifische PAL-Aktivität (U/g trockene Zellen)
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wuchsen die Escherichia coli-Zellen, die in dem Medium mit einer Konzentration an Glukose von 0,3% oder höher gewachsen waren, besser und zeigten eine geringere spezifische PAL-Aktivität als solche Zellen, die in dem Medium mit einer Konzentration an Glukose von weniger als 0,3% gewachsen waren. Mit anderen Worten, die Gene für PAL wurden in dem Medium, das Glukose in einer Konzentration von 0,3% oder höher enthielt, nur schwach exprimiert. Somit wurde bestätigt daß die Gen-Expression durch Einstellen der Glukose-Konzentration auf 0,3% oder höher wirksam kontrolliert wird.

Beispiel 2:

Die Kultur von E. coli MT 10414 (FERM P-8876), die das Hybrid- Plasmid pYtrp6 trägt, wurde auf LB-AP-Agarplatten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert. Das Hybrid-Plasmid pYtrp6, das im Lauf von Referenzbeispiel 1 erhalten worden ist, umfaßt den Expressions-Vektor, der das die Ampicillin-Resistenz kodierende Gen mit den Insertionen des trp-Promotors und das abwärts davon insertierte PAL-Strukturgen trägt. Nachfolgend wurden die Bakterien-Zellen, die von der auf der LB-AP-Agarplatte gewachsenen Kolonie genommen worden waren, in etwa gleichen Mengen als Inokulum in je 5 ml LB-Medium, das mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml supplementiert war und, wie in Tabelle 3 angegeben, 5 verschiedene Konzentrationen enthielt, in Probenröhrchen mit einem Baumwollstopfen gegeben. Die Röhrchen wurden dann 25 Stunden bei 30ºC unter Schütteln mit 100 Anschlägen pro Minute inkubiert.
Nach der Inkubation wurden aus den Kulturen Zellextrakte hergestellt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf PAL-Aktivität getestet.
Die Konzentration der Bakterien-Zellen (gemessen bei OD&sub6;&sub0;&sub0;) und die spezifische PAL-Aktivität der Kulturen am Ende der Inkubationszeit sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Glucose (%) Bakterien-Wachstum (OD&sub6;&sub0;&sub0;) spezifische PAL-Aktivität (U/g trockene Zellen)
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 ersichtlich ist, war das Wachstum der Escherichia coli-Zellen, die in dem Medium mit einer Konzentration an Glukose von 0,3% oder höher gewachsen waren, ausreichend, während ihre spezifische PAL-Aktivität ähnlich wie oben in Beispiel 1 in diesem Beispiel 2 im wesentlichen supprimiert war.

Beispiel 3:

Die Kultur von Escherichia coli MT 10423 (FERM P-9023), die das Hybrid-Plasmid pSW 115 trägt, wurde auf LB-AP-Agarplatten ausplattiert und bei 37ºC inkubiert. Das Hybrid-Plasmid pSW 115, das im Lauf von Referenzbeispiel 2 erhalten worden ist, umfaßt den Expressions-Vektor, der das die Ampicillin-Resistenz kodierende Gen mit den Insertionen des kombinierten Promotors umfassend den tac- und den PL-Lambda-Promotor, die miteinander am 3'-Ende des tac-Promotors verknüpft sind, und das abwärts von dem kombinierten Promotor insertierte PAL-Strukturgen trägt.
Zwölf Aliquots des LB-Mediums, das mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml supplementiert war, wurden hergestellt, wobei jedes Aliquot in einem Volumen von 5 ml eine der Zuckerkomponenten wie Glukose, Mannose, Maltose oder Sorbitol in Konzentrationen von 0,1, 0,3 oder 1%, wie in Tabelle 4 angegeben, enthielt.
Zu jedem so hergestellten Medium wurden Bakterien-Zellen, die von der auf der LB-AP-Agarplatte gewachsenen Kolonie genommen worden waren, in etwa gleichen Mengen als Inokulum verteilt. Die inokulierten Medien wurden dann 24 Stunden bei 30ºC unter Schütteln mit 110 Anschlägen pro Minute inkubiert. Nach Beendigung der Kultur wurden die kultivierten Zellen genauso wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt und der Bestimmung der PAL-Aktivität unterworfen.
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, war die Expression von PAL in jeder Kultur mit einer Konzentration der Zuckerkomponente von 0,3% oder höher wirksam unterdrückt.

Beispiel 4:

Zuerst wurden 1,5 l des synthetischen Mediums in eine 2 l-Flasche, ausgerüstet mit einer Apparatur zur Bestimmung der Glukose-Konzentration im Kulturmedium, für die Fermentation im kleinen Maßstab gegeben. Nach dem Autoklavieren wurde dem Medium unter sterilen Bedingungen 0,5% Ampicillin zugesetzt. Tabelle 4 Kohlenstoffquelle Glucose Maltose Mannose Sorbitol Kohlenstoffquelle (%) Bakterien-Wachstum (OD&sub6;&sub0;&sub0;) spezifische PAL-Aktivität (U/g trockene Zellen)
Getrennt davon wurden 100 ml des synthetischen Mediums, supplementiert mit Glukose in einer Konzentration von 1%, in einem Sakaguchi-Kolben hergestellt. Nach dem Autoklavieren wurde dem Medium unter sterilen Bedingungen Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml zugesetzt. Anschließend wurden Escherichia coli MT 10423, wie sie in Beispiel 3 verwendet wurden, in dieses Medium inokuliert und dann 22 Stunden bei 30ºC unter Schütteln mit 110 Anschlägen pro Minute inkubiert, um eine Impfkultur herzustellen. 75 ml der Impfkultur wurden wie oben erwähnt in das Medium in der Fermentationsflasche inokuliert. Das Medium mit dem Inokulum wurde unter sterilen Bedingungen mit 1% Glukose supplementiert, und der pH des Mediums wurde durch Zusatz von wässrigem Ammonium auf 7,0 eingestellt. Die so erhaltene Kultur wurde unter Belüftung bei 30ºC inkubiert. Die Glukose-Konzentration der Kultur wurde aufrecht erhalten, indem kontinuierlich Glukose zugeführt wurde, so daß der Level auf 1% gehalten wurde, bis die gewünschte Zahl von Zellen erhalten wurde. Als die Anzahl der Zellen die gewünschte Höhe erreicht hatte, wurde die Zufuhr der Glukose gestoppt, und anschließend sank die Glukose-Konzentration der Kultur auf Grund des Verbrauchs durch die Bakterien auf einen Level von unter 0,3%, so daß PAL exprimiert wurde.
Die Kulturflüssigkeiten wurden während der Inkubation in Intervallen entnommen, so daß die Glukose-Konzentration und die Bakterien-Konzentration (OD&sub6;&sub0;&sub0;) gemessen werden konnten. Gleichzeitig wurde die spezifische PAL-Aktivität genau so, wie in Beispiel 1 beschrieben, festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt.
Wie aus Figur 12 ersichtlich ist, erfolgte die Expression von PAL wirksam, wenn die Konzentration der Glukose in der Kultur geringer als 0,3% war, so daß ausreichend hohe spezifische PAL- Aktivitäten erhalten wurde.

Beispiel 5:

Die in diesem Beispiel und in Vergleichsbeispiel 1 zu verwendenden Medien wurden wie folgt hergestellt.

LB-Medium:

Zu den zuvor erwähnten Bestandteilen des glukosefreien LB- Mediums wurde Glukose in einer Konzentration von 1 g/l ergänzt. Nach 15 Minuten Autoklavieren bei 120ºC wurde das Medium unter sterilen Bedingungen mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml supplementiert.

"A"-Medium:

Zu den zuvor erwähnten Bestandteilen des glukosefreien LB- Mediums wurde Glukose in einer Konzentration von 10 g/l ergänzt. Nach 15 Minuten Autoklavieren bei 120ºC wurde das Medium unter sterilen Bedingungen mit Ampicillin in einer Konzentration von 50 ug/ml supplementiert.
Zuerst wurde die Kultur von Escherichia coli MT 10423, wie sie in Beispiel 3 verwendet wurde, die das Hybrid-Plasmid pSW 115 trägt, auf LB-AP-Agarplatten ausplattiert. Nach der Inkubation für 16 Stunden bei 37ºC wurden Aliquots der Bakterien-Zellen, die von einer auf der LB-AP-Agarplatte gewachsenen Kolonie genommen wurden, in je 5 ml "A"-Medium und LB-Medium in Teströhrchen mit einem Baumwollstopfen inokuliert. Nach dem Kultivieren der Zellen über 24 Stunden bei 30ºC unter Schütteln mit 110 Anschlägen pro Minute wurden die Kulturen Nr. 1-1 (im "A"- Medium gezüchtet) und Nr. 1-2 (im LB-Medium gezüchtet) erhalten.
Nachfolgend wurden je 15 ul der Kultur Nr. 1-1 (einschließlich der Bakterien-Zellen) in je 5 ml "A"- und LB-Medium in Teströhrchen mit Baumwollstopfen verteilt. Nach der Inkubation, unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben, wurden die Kulturen Nr. 1-3 (im "A"-Medium gezüchtet) und Nr. 1-4 (im LB- Medium gezüchtet) erhalten.
Durch Wiederholen der zuvor erwähnten Prozedur in der Reihenfolge, wie sie in Figur 13 angegeben ist, wurden außerdem die Kulturen Nr. 1-5, 1-6 und 1-7 erhalten.
Die Zellen der Kulturen Nr. 1-2, Nr. 1-4, Nr. 1-6 und Nr. 1-7 wurden sofort nach Bbeendigung der Kultur abzentrifugiert. Die so erhaltenen Zellen wurden in einer 0,85% NaCl-Lösung suspendiert und gewaschen und anschließend mittels Zentrifugation wiedergewonnen und zur Lagerung eingefroren.
Die gefrorenen Zellen der einzelnen Kulturen, die so verwahrt worden waren, wurden aufgetaut und zur Präparation von Zellextrakt, wie in Beispiel 1 beschrieben, bereitgestellt. Die spezifische PAL-Aktivität der Zellextrakte wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Vergleichsbeispiel 1:

Die Kulturen der Nr. 2-1, Nr. 2-2, Nr. 2-3, Nr. 2-4, Nr. 2-5, Nr. 2-6 und Nr. 2-7 wurden erhalten, indem dieselbe Prozedur, wie sie in Beispiel 5 beschrieben ist, in der in Figur 14 angegebenen Reihenfolge wiederholt wurde, jedoch mit der Ausnahme, daß LB-Medium anstelle jedes "A"-Mediums verwendet wurde.
Außerdem wurden die Kulturen der Nr. 2-2, Nr. 2-4, Nr. 2-6 und Nr. 2-7 für die Lagerung eingefroren und dann zur Herstellung der Zellextrakte, wie in Beispiel 5 beschrieben, behandelt. Die spezifische PAL-Aktivität der Kulturen wurde ermittelt, Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Beispiel 5 Vergleichsbeispiel 1 Kultur Nr. spezifischen PAL-Aktivität der für die Expression auf LB-Medium gewachsenen Zellen (U/g trockene Zellen)
Unter den oben erwähnten Stämmen sind diejenigen, die eine ATCC-Nummer haben, bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, USA, hinterlegt worden; diejenigen, die eine IFO-Nummer haben, sind bei dem Fermentation Research Institute (eingetragene Gesellschaft), 17-85, Juso-Motomachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka City, Japan, hinterlegt worden; und diejenigen, die eine FERM- Nummer haben, sind bei dem Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan, hinterlegt worden.
Diejenigen Stämme, die eine ATCC- oder eine IFO-Nummer haben, sind öffentlich zugänglich.
Diejenigen Stämme, die eine FERM-Nummer haben, sind an den folgenden Daten für die Zwecke der Patentanmeldung durch den Anmelder hinterlegt worden.
FERM P-8834 am 4. Juli 1986;
FERM P-8876 am 26. Juli 1986;
FERM P-9023 am 31. Oktober 1986; und
FERM P-9024 am 31. Oktober 1986.

Claims

1. Verfahren zur Regulation der Expression eines Fremdgens in einem Escherichia coli-Bakterium, das ein rekombinantes Plasmid trägt, das durch Insertion des Fremdgens in einen Expressionsvektor zusammengebaut worden ist, um die Expression dieses Fremdgens zu erlauben, wobei das Verfahren den Vorgang umfaßt, die Konzentration einer Zucker-Komponente als Kohlenstoffquelle in einem Medium zur Kultivierung der Escherichia coli bei 0,3% oder höher zu halten, um die Expression zu supprimieren.

2. Das Verfahren zur Regulation der Expression eines Fremdgens wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei das Fremdgen ein Strukturgen ist, das für die L-Phenylalanin-Ammoniak-Lyase kodiert.

3. Das Verfahren zur Regulation der Expression eines Fremdgens wie in Anspruch 2 beschrieben, wobei die L-Phenylalanin-Ammoniak-Lyase die folgende Sequenz aufweist:

4. Das Verfahren zur Regulation der Expression eines Fremdgens wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei das Escherichia coli das Escherichia coli FERM. P-9024 ist, das das rekombinante Plasmid pSYPL-3 trägt.

5. Das Verfahren zur Regulation der Expression eines Fremdgens wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei das Escherichia coli das Escherichia coli FERM P-8876 ist, das das rekombinante Plasmid pYtrp6 trägt.

6. Das Verfahren zur Regulation der Expression eines Fremdgens wie in Anspruch 1 beschrieben, wobei das Escherichia coli das Escherichia coli FERM P-9023 ist, das das rekombinante Plasmid pSW 115 trägt.

7. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Fremdgen-Produkts durch Kultivierung von Escherichia coli, die ein rekombinantes Plasmid tragen, das durch Insertion des gewünschten Fremdgens in einen Expressionsvektor zusammengebaut worden ist, um die Expression dieses gewünschten Fremdgens zu erlauben, das die Schritte umfaßt:

(a) einen ersten Kultivierungsschritt zur Kultivierung der Escherichia coli durchzuführen, bei dem die Konzentration einer Zuckerkomponente als Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium bei 0,3% oder höher gehalten wird, und

(b) einen zweiten Kultivierungsschritt zur Kultivierung der in dem ersten Kultivierungsschritt gewachsenen Escherichia coli durchzuführen, bei dem die Konzentration der Zuckerkomponente in dem Kulturmedium für diesen zweiten Kultivierungsschritt bei weniger als 0,3% gehalten wird.

8. Das Verfahren zur Herstellung eines Fremdgen-Produkts wie in Anspruch 7 beschrieben, wobei das Fremdgen-Produkt L-Phenylalanin-Ammoniak-Lyase ist.

9. Das Verfahren zur Herstellung eines Fremdgen-Produkts wie in Anspruch 8 beschrieben, wobei die L-Phenylalanin-Ammoniak- Lyase die in Anspruch 3 angegebene Sequenz aufweist.

10. Das Verfahren zur Herstellung eines Fremdgen-Produkts wie in Anspruch 7 beschrieben, wobei das Escherichia coli das Escherichia coli FERM P-9024 ist, das das rekombinante Plasmid pSYPL-3 trägt.

11. Das Verfahren zur Herstellung eines Fremdgen-Produkts wie in Anspruch 7 beschrieben, wobei das Escherichia coli das Escherichia coli FERM P-8876 ist, das das rekombinante Plasmid pYtrp6 trägt.

12. Das Verfahren zur Herstellung eines Fremdgen-Produkts wie in Anspruch 7 beschrieben, wobei das Escherichia coli das Escherichia coli FERM P-9023 ist, das das rekombinante Plasmid pSW 115 trägt.