HU202580B - Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic - Google Patents
Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic Download PDFInfo
- Publication number
- HU202580B HU202580B HU426786A HU426786A HU202580B HU 202580 B HU202580 B HU 202580B HU 426786 A HU426786 A HU 426786A HU 426786 A HU426786 A HU 426786A HU 202580 B HU202580 B HU 202580B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- reverse transcriptase
- coli
- plasmid
- enzyme
- sarcoma virus
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás a Rous sarcoma vírus reverz transzkríptázának előállítására rekombinációs DNStechnikával. A Rous sarcoma vírus eredetű pSRA2 plazmidból származó, reverz transzkriptázt kódoló pol gént egy E. coli baktériumban szaporítható, tökéletesen iepresszálható jól indukálható lac promoter mögé, pUC9 plazmidba ligálják, a ligátummal E. colit transzformáinak, szelekcióval kiválasztanak egy a vitális pol gén represszióját, expresszióját, a mRNS riboszómához kapcsolódását és a transzlációs iniciátor és terminátor szekvenciát egyaránt biztosító szekvenciarészleteket tartalmazó rekombinánst, ezzel E. colit transzformáinak, a baktériumsejteket feltárják, és a kivont, nyers reverz transzkriptáz enzimét kívánt esetben tisztítják. (3. ábra) HU 202 580 A A leírás terjedelme: 6 oldal, 3 rajz -1-The present invention relates to a method for producing reverse transcriptase of a Rous sarcoma virus by recombinant DNA technology. The reverse gene transcriptase encoding the reverse transcriptase from plasmid pSRA2 derived from Rous sarcoma virus is ligated to a perfectly inducible lac promoter that can be propagated in an E. coli bacterium into plasmid pUC9, with E. coli transformations selected by the ligate, and repression and expression of a vital pol gene selected by selection. recombinants containing sequences of mRNA binding to the ribosome and translational initiator and terminator sequences, thereby transforming E. coli, bacterial cells, and purifying the extracted, raw reverse transcriptase, if desired. (Figure 3) EN 202 580 A Scope of the description: 6 pages, 3 drawings -1-
Description
A találmány tárgya eljárás a Rous sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására rekombinációs DNStechnikával.The present invention relates to a method for the production of reverse transcriptase of Rous sarcoma virus by recombinant DNA technology.
A reverz transzkriptáz olyan enzim, amely eukariota sejteket megbetegítő, egyfonalú RNS genommal rendelkező, úgynevezett retrovírusokban található. A reverz transzkriptáz alapvető jelentőségű az ilyen vírusok életciklusában. Segítségével a vírus egyfonalú RNS genomja kettős láncú DNS-re íródik át. A gyűrűvé záródott kettős láncú vfrus-DNS-t a reverz transzkriptáz a gyűrűvé záródás helyén szekvenciaspecifikusan elmetszi, majd a linearizálódott vírus genom beépülhet a gazdasejt genomjába (transzformáció).Reverse transcriptase is an enzyme found in so-called retroviruses that contain a single-stranded RNA genome that infects eukaryotic cells. Reverse transcriptase is essential for the life cycle of such viruses. It is used to transcribe the viral single-stranded RNA genome into double-stranded DNA. The annealed double-stranded vfrus DNA is sequentially cleaved by the reverse transcriptase at the annealing site and the linearized virus genome can be incorporated into the host cell genome (transformation).
A reverz transzkriptáz enzim primer- és templátfüggő reakciót katalizál: dezoxiribonukleozid-trifoszfátokból elkészíti a primerrel ellátott egyfonalú RNS DNS komplementerét, majd az így kialakult RNS/DNS hidridből, ugyanennek az enzimnek a közreműködésével, kettős láncú DNS lesz. Abban, hogy a folyamat így végbemegy, a szintetizáló aktivitás mellett közrejátszik az enzim úgynevezett RNáz H aktivitása is, amely a kettős láncú DNS kiépülését megelőzően, leválasztja illetve hidrolizálja a DNS/RNS hidrid RNS komponensét.The reverse transcriptase enzyme catalyzes a primer- and template-dependent reaction: it produces the complement of single-stranded RNA DNA from the DNA, and the resulting RNA / DNA hydride becomes double-stranded with the same enzyme. In this process, in addition to synthesizing activity, it also contributes to the so-called RNase H activity of the enzyme, which, prior to the formation of double-stranded DNA, removes or hydrolyses the RNA component of the DNA / RNA hydride.
A különböző forrásokból izolált reverz transzkriptázok molekulatömege eltérő, általában 70 000 és 110 000 dalton közötti érték. Ugyancsak forrásfüggőek az enzim egyéb tulajdonságai. így például, az egerekből izolált retrovfrusokból elkülönített reverz transzkriptáz monomer szerkezetű, míg a madár eredetű retrovírusokból kinyert reverz transzkriptáz úgynevezett alegységes enzim, amelynek nagyobb, béta-alegysége proteáz hatásra egy kisebb, alfa-alegységre és egy harmadik proteinre (p32) bomlik szét [Grandgenett és munkatársai, J. Virol. 33, 264, (1980); Schwartz és mtsai, Cell, 22, 853 (1983)]. Közülük a βζ, αβ és a komponensek rendelkeznek reverz transzkriptáz aktivitással.The reverse transcriptases isolated from different sources have different molecular weights, typically between 70,000 and 110,000 daltons. Other properties of the enzyme also depend on the source. For example, reverse transcriptase isolated from mice retroviruses has a monomeric structure and reverse transcriptase derived from avian retroviruses is a subunit with a larger beta subunit protease to a smaller alpha subunit and a third protein (p32). et al., J. Virol. 33, 264 (1980); Schwartz et al., Cell, 22, 853 (1983). Among them, βζ, αβ and its components have reverse transcriptase activity.
A reverz transzkriptáz a molekuláris biológiai kutatások egyik kulcsfontosságú és egyúttal egyik legdrágább enzime. Segítségével gyakorlatilag minden RNS szekvencia DNS szálra írható át (komplementer, azaz cDNS), amely azután alkalmas vektorba klónozható, felszaporítható, szekvenálható, manipulálható stb. Újabban kiterjedten használják egyfonalú DNS „feltöltésére”, továbbá a DNS szekvenáláshoz DNS polimeráz helyett. Az enzim azért költséges, mert a kereskedelemben kapható reverz transzkriptáz enzim preparátumok kivétel nélkül hagyományos módszerrel, vírussal fertőzött sejtekből kiindulva készülnek. A sejtekből első lépésben vírust izolálnak, majd a kapott preparátumból további, hosszadalmas és körülményes tisztítási lépésekkel vonják ki magát az enzimet. Nagyobb mennyiségű enzim előállítása ezen az úton nagyon hosszadalmas, munkaigényes és ezáltal költséges. A kereskedelemben például a következő reverz transzkriptáz preparátumok vannak forgalomban:Reverse transcriptase is one of the key and at the same time one of the most expensive enzymes in molecular biological research. By using it, virtually every RNA sequence can be transcribed into a DNA strand (complementary, i.e., cDNA) which can then be cloned, amplified, sequenced, manipulated, etc. into a suitable vector. More recently, it has been used extensively to "fill" single-stranded DNA, and for DNA sequencing instead of DNA polymerase. The enzyme is expensive because commercially available reverse transcriptase enzyme preparations are prepared by the conventional method from virally infected cells. The virus is first isolated from the cells and the enzyme itself is extracted from the resulting preparation by further, lengthy and laborious purification steps. Producing a larger amount of enzyme in this way is very time consuming, labor intensive and therefore expensive. For example, the following reverse transcriptase preparations are commercially available:
Pharmacia Reverse Transzkriptase, AMV 27-0921-01 200 EPharmacia Reverse Transcriptase, AMV 27-0921-01 200 E
Boehringer Reverse Transcriptase 109-118 1000 EBoehringer Reverse Transcriptase 109-118 1000 E
Amersham Reverse Transcriptase T. 26104 300 E (E = egység)Amersham Reverse Transcriptase T. 26104 300 E (E = Unit)
A legutóbbi időben, tudományos vizsgálatok céljra, rekombinációs DNS-technikával is állítottak elő reverz transzkriptázt. Tanese és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 4944 (1985)] illetve Kotewicz és munkatársai [Gene, 35,249 (1985)] Moloney egér leukémiavírus reverz transzkriptáz génjének (pol gén) kisebb, központi részletét klónozták E. coliban szaporítható expressziós vektorban enzimaktivitást mutató reverz transzkriptáz előállítása céljából. Megfelelő szelekció után a kapott termék enzimaktivitása kielégítő volt ugyan, de a szerzők nem bizonyították, hogy a szintetizált DNS megfelelt-e a templátnak. M. L. Kotewicz szerint még rosszabb eredményre kellene számítani madárfélék retrovírusainak, így a madár myeloblastosis vírusa pol génjénak (AMV) klónozása esetén, elsősorban az ilyen eredetű reverz transzkriptáz enzim alegységes jellege miatt. A natív AMV reverz transzkriptáz szintézise során ugyanis a polimeráz génterméknek egy β-β dimert kell alkotnia, amely azután foszforileződik, és egy specifikus helyen az egyik β-fehérje két alegységre esik szét, az ún. a-alegységre és p32 fehérjére. A fiziológiailag aktív reverz transzkriptáz az a és β alegységekből álló dimer. Ezek olyan folyamatok, amelyek E. coliban nem katalizáltak.Recently, reverse transcriptase has also been produced by recombination DNA techniques for scientific purposes. Tanese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 4944 (1985)] and Kotewicz et al. (Gene, 35,249 (1985)) have cloned a minor central portion of the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase gene (pol gene) to produce a reverse transcriptase having an enzymatic activity in E. coli. After proper selection, the resulting product had satisfactory enzyme activity, but the authors did not prove that the synthesized DNA matched the template. According to M. L. Kotewicz, even worse results should be expected in the case of cloning of avian retroviruses, such as the avian myeloblastosis virus pol gene (AMV), primarily due to the subunit nature of the reverse transcriptase enzyme of this origin. Namely, during the synthesis of native AMV reverse transcriptase, the polymerase gene product must form a β-β dimer, which is then phosphorylated and cleaved at a specific site into one β-protein subunit, the so-called. α-subunit and p32 protein. The physiologically active reverse transcriptase is a dimer of α and β subunits. These are processes that are not catalyzed in E. coli.
Találmányunk kidolgozása során célunk standard minőségű, a natív, legjobbnak tartott és általánosan használt AMV reverz transzkriptáz tulajdonságait maximálisan megközelítő enzim nagytömegű előállítása volt rekombinációs DNS-technikával.In the process of the present invention, our aim was to produce high-quality recombinant DNA technology using standard quality enzymes that closely approximate the properties of native AMV reverse transcriptase, which is considered to be the best and commonly used.
Azt találtuk, hogy - ellentétben azzal, amit a szakirodalom alapján várni lehet - a madárfélékben előforduló Rous sarcoma vírusból származó reverz transzkriptáz gén alkalmasan megválasztott expressziós vektor segítségével E. coliban végzett klónozásával olyan enzim preparátumhoz lehet jutni, amely megfelel a fenti követelménynek.Contrary to what can be expected in the literature, it has been found that cloning the reverse transcriptase gene from avian Rous sarcoma virus with an appropriately selected expression vector in E. coli provides an enzyme preparation that meets the above requirement.
Közelebbről, felismertük, hogy a Rous sarcoma vírusból származó, reverz transzkriptáz kódoló gént [DeLorbe és munkatársai, J. Virol. 36, 50, (1980)] egy megfelelő, E. coliban szaporítható vektorban klónozva a reverz transzkriptáz enzim nagy mennyiségben termelődik az élő baktériumsejtben, ahonnan szokásos technikákkal elkülöníthető, majd viszonylag egyszerű és olcsó eljárással tisztítható.In particular, we have discovered that the reverse transcriptase coding gene from Rous sarcoma virus [DeLorbe et al., J. Virol. 36, 50 (1980)] by cloning in a suitable vector for propagation in E. coli, the reverse transcriptase enzyme is produced in large quantities in the living bacterial cell, from which it can be isolated by conventional techniques and then purified by a relatively simple and inexpensive method.
Találmányunk tárgya tehát eljárás Rous sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására oly módon, hogy a Rous sarcoma vírus eredetű, pSRA2 plazmidból származó reverz transzkriptázt kódoló pol gént egy E. coli baktériumban szaporítható, tökéletesen represszálható, jól indukálható lac promoter mögé, pUC9 plazmidba ligáljuk, a ligátummal E. colit transzformálunk, szelekcióval kiválasztunk egy virális pol gén represszióját, expresszióját, a mRNS riboszómához kapcsolódását és a transzlációs iniciátor és terminátor szekvenciát egyaránt biztosító szekvencia részleteket tartalmazó rekombinánst A rekombináns plazmiddal E. colit transzformálunk, a baktériumsejteket indukciót követően feltárjuk, és a kivont, nyers reverz transzkriptáz enzimet tisztítjuk.Thus, the present invention provides a method for the production of a reverse transcriptase of Rous sarcoma virus by inserting a Rous sarcoma virus reverse transcriptase coding plasmid derived from plasmid pSRA2 into an E. coli bacterial, fully repressible, inducible ligand, lac promoter, E. coli is transformed by selection by selection of a recombinant containing repression, expression, sequence binding to the mRNA ribosome and sequence translational initiator and terminator by selection of a viral pol gene. crude reverse transcriptase enzyme was purified.
A Rous sarcoma vírus genomja a szekvencia szintjén ismert a következő publikációból [Schwartz és munkatársai, Cell, 32 853 (1983)]. A reverz transzkriptáz enzim génje a Schmidt Ruppin A Rous sarcoma vírus kettősláncú NDS kópiáját (SR A2) hordozó pSR A2 plazmidból származik (lásd DeLorbe és munkatársai fent idézett cikkét). A pSRA2 plazmid szerkezetét az 1. ábra szemlélteti.The genome of the Rous sarcoma virus is known at the sequence level from Schwartz et al., Cell, 32, 853 (1983). The reverse transcriptase enzyme gene is derived from pSR A2 plasmid carrying the double-stranded NDS copy (SR A2) of Schmidt Ruppin A Rous sarcoma virus (see DeLorbe et al., Supra). The structure of plasmid pSRA2 is illustrated in Figure 1.
HU 202 580 AHU 202 580 A
A találmány szerinti eljárásban felhasználható nagy kópiaszámú rekombináns plazmiddal szembeni legfontosabb követelmények a kővetkezők:The most important requirements for a high copy number recombinant plasmid for use in the method of the invention are as follows:
- Erős promotert tartalmazzon, mely- Have a strong promoter that
- jól indukálható legyen,- be well inducible,
- tökéletesen represszálható legyen, mert ellenkező esetben a transzformálás során elpusztul a gazdasejt és végül a klónozó helyet- be perfectly repressible, otherwise the host cell and eventually the cloning site will be destroyed during transformation
- megfelelő transzlációs fázisba lehessen hozni a pol gémei.- put the pol herons into a proper translation phase.
Ilyen plazmidok például a következők: pUC-sorozat plazmidjai, pl. pUC7, pUC8, pUC9 stb. [Vieiia és Messing, Gene, 19,259 (1982)]. Ihc-promotert tartalmazó plazmidok:Examples of such plasmids are the plasmids of the pUC series, e.g. pUC7, pUC8, pUC9, etc. (Villeia and Messing, Gene, 19259 (1982)). Plasmids containing the Ihc promoter:
(DeBoer és munkatársai, In Promoter structure and function ed. LR. rodrigez and M. J. Chamberlain, Praegar Publ. N. Y. 1982).(DeBoer et al., In Promoter Structure and Function Ed. LR. Rodrigez and M. J. Chamberlain, Praegar Publ. N. Y. 1982).
PL promoter vektorok [Hedgpeth és mtsai, Mól Gén. Génét 163, 197, (1978)].PL promoter vectors [Hedgpeth et al., Mol. Gene 163, 197, 1978].
Trp E promotert tartalmazó vektorok [Tacan és mtsai, Mól. Gén. GeneL 177, 427, (1980)].Vectors containing the Trp E promoter [Tacan et al., Mol. Gene. GeneL 177, 427 (1980)].
A találmány szerint előnyösen a következőképpen járunk el: A kereskedelemben beszerezhető nagy kópiaszámú pUC 9 (2. ábra) plazmidot polilinkerében Pst I és Sál I enzimekkel felnyitjuk, majd ebbe ligálással beépítjük g fonti vitális pol génnek a Pst I és Xho I hasítási helyek közötti DNS szakaszát. A kapott ligátummalE. coli HB 101 baktériumtörzset transzformálunk. Ezután a következőképpen kiválasztjuk a kívánt rekombináns plazmidot hordozó telepeket:Preferably, the present invention proceeds as follows: The commercially available high copy number plasmid pUC 9 (Figure 2) is opened in its polylinker with Pst I and Sal I, and the DNA between the Pst I and Xho I sites is inserted into this genes. section. With the resulting ligandE. coli strain HB101. Colonies carrying the desired recombinant plasmid are then selected as follows:
A telepek kis mennyiségét lizáljuk és a DNS-t agaróz gélben elektroforetizáljuk Eckhardt szerint [Maniatis és mtsai, a Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. Nehézség nélkül kiválaszthatjuk a mintegy 2,8 kb méretű inszertet hordozó rekombináns plazmidot (pMF 14).A small amount of colonies were lysed and the DNA was electrophoresed on an agarose gel according to Eckhardt (Maniatis et al., 1982, Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.). The recombinant plasmid carrying the insert of about 2.8 kb (pMF 14) can be selected without difficulty.
A kívánt rekombinánst tartalmazó baktériumtörzset oly mértékben szaporítjuk, hogy belőle a térképezéshez elegendő mennyiségű plazmidot preparálhassunk [lásd Maniatis és mtsai fenti közleményét (1982)]. Az üyen plazmidot különféle restrikciós enzimekkel vágjuk, ellenőrizzük, hogy a kívánt konstrukciót kaptuk-e meg [DcLorbe és mtsai, J. Virol. 36,50, (1980)].The bacterial strain containing the desired recombinant is propagated to generate sufficient plasmids for mapping (see Maniatis et al., 1982). Each plasmid was cleaved with various restriction enzymes to verify that the desired construct was obtained [DcLorbe et al., J. Virol. 36.50 (1980)].
Az elvégzett térképezések alapján láthatjuk, hogy a virálá pol gént hordozó pMF 14 konstrukció (3. ábra) rendelkezik mindazon szekvenciarészletekkel, melyek biztosítják a klónozott gén szabályozott átírását, a mRNS riboszómához kapcsolódását, transzlációs iniciátar és terminátor szekvenciát. A klónozott gén expressziójának szabályozó elemei - operátor, promoter, Shine-Dalgamo szekvencia, a transzláció iniciációs tripletje - az E. coli lac operátorból származnak és a pUC9 plazmid komponensei, míg a transzláció stop-kódonját maga a pol gén szolgáltatja. A géntermék N-terroinális vége 25 aminosavból álló pepiiddel egészült ki. Ebből 9 aminosav a vektorból, a többi a pol fehérje természetes kezdetét megelőző szekvenciarészlet átírásából adódik. Az extra peptid szekvenciája a következő: (ÍMet) Thr Met De Thr Pro Ser Leu Alá Alá Gly Pro Arg Alá Pro Leu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Alá Thr Val Leu.Based on the mapping performed, it can be seen that the pMF 14 construct carrying the viral pol gene (Figure 3) has all of the sequence fragments that provide for the regulated transcription of the cloned gene, binding to the mRNA ribosome, translation initiation and terminator sequences. The regulatory elements of the expression of the cloned gene - operator, promoter, Shine-Dalgamo sequence, translation initiation triplet - are derived from the E. coli lac operator and the components of plasmid pUC9, while the translation codon is provided by the pol gene itself. The N-terroinal end of the gene product was supplemented with a 25 amino acid peptide. Of these, 9 are amino acids from the vector, the rest are derived from a transcription of the sequence prior to the natural start of the pol protein. The sequence of the extra peptide is as follows: (See) Thr Met De Thr Pro Ser Leu Ala Gly Pro Arg Ala Pro Leu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Thr Val Leu.
A pMF 14 plazmiddal E. coli HB 101 baktériumtörzset transzformálunk. A plazmidot hordozó sejtek a szokásos folyékony és szilárd táptalajokon, például LB-ben, ületve ezzel készített agar-lemezeken, ampicillin jelenlétében nehézség nélkül szaporíthattak. A plazmid és ezzel a klónozott gén stabilitását úgy biztosítjuk, hogy a táptalajon minden esetben tartalmaznak az előírt komponenseken kívül 0,5% glukózt is. A pol gén maximális expressziója IPTG-vel váltható ki. Ekkor a pMF 14 plazmidot hordozó sejteket 0,5% glukózt tartalmazó gazdag folyékony táptalajon szaporítjuk, míg a táptalajból a glükóz ületve metabolitjai elfogynak. Ez többnyire Eoo = 2,2 denzitásnál következik be. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és glukózmentes, de a HB 101es E. coli törzs számára szükséges egyéb komponenseket tartalmazó minimál (M9) táptalajban (Maniatis és mtsai, 1982 - idézeti közlemény) szuszpendáljuk, az eredeti térfogat 10%-ában. 30 poc 37 *C végzett inkubálás után 10 mM koncentráció eléréséig IPTG-t adunk, és folytatjuk az inkubációt további 90 percig. A centrifugálissal összegyűjtött biomassza azonnal felhasználható enzim preparálásra, vagy szárazjégben fagyasztva felhasználásig -20 *C-on tárolható.Plasmid pMF 14 was used to transform E. coli strain HB101. Plasmid-bearing cells were able to proliferate without difficulty in standard liquid and solid media such as LB, overlaid on agar plates prepared in the presence of ampicillin. The stability of the plasmid and thus of the cloned gene is ensured by always containing 0.5% glucose in addition to the required components in the medium. Maximum expression of the pol gene can be induced by IPTG. Cells carrying plasmid pMF 14 are then grown on a rich liquid medium containing 0.5% glucose, while glucose over-metabolites are depleted of the medium. This usually occurs at Eoo = 2.2 densities. Cells are harvested by centrifugation and resuspended in glucose-free medium (M9) containing 10% of the original volume of glucose-free other components required for E. coli strain HB101 (Maniatis et al., 1982). After incubation at 30 poc at 37 ° C, IPTG is added to 10 mM and incubated for a further 90 minutes. The biomass collected by centrifugation can be used immediately for enzyme preparation or stored in dry ice at -20 ° C until use.
Ezt követi a sejtek feltárása, centrifugálása, ahol az óvatosan leszívott szupematans a kívánt enzimet tartalmazó extraktum. Az extraktumból ioncserélő gyantákon végzett tisztítással és. dialízissel kapjuk meg a tiszta enzimet, amelynek enzim aktivitása a standard reakciókörülmények között meghatározva [(50 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KC1, 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,8 pg poli/rA.dTiS és 0,5 mM pH] dTTP 20 pl-ben 37 ’C-on 20 pácig] 5-20 egység/1 μΐ. 1 1 baktériumkultúrából mintegy 10-20 000 E nyerhető.This is followed by cell digestion and centrifugation, where the carefully aspirated supematant is the extract containing the desired enzyme. Purification of the extract from ion exchange resins and. dialysis to obtain a pure enzyme with enzyme activity determined under standard reaction conditions ((50 mM Tris, pH 8.3), 50 mM KCl, 6 mM MgCl 2 , 5 mM dithiothreitol, 0.8 µg poly / rA.dTi S and 0.5 mM pH] dTTP in 20 µl at 37 ° C for up to 20 stains] 5-20 units / 1 µΐ About 10-20,000 U can be obtained from 1 liter of bacterial culture.
A találmány szerinti eljárás legfontosabb előnyei a következők:The main advantages of the process according to the invention are as follows:
1. A gyakorlatban legaláltalánosabban a madárvírusból (AMV) preparált enzimet használják, amelyről közismert, hogy a legtökéletesebb cDNS készítésére alkalmas. Szerkezetileg az általunk klónozott ugyancsak madár eredetű RSV reverz transzkriptáz közel áll ehhez az enzimhez. Rekombináns enzimünk korlátlan mennyiségben előállítható magas koncentrációban (>20 U/pl), és az előállítás költségei messze alatta maradnak a hagyományos enzim előállítási költségeinek.1. In practice, the most commonly used enzyme is avian virus (AMV), which is well known for producing the most perfect cDNA. Structurally, our bird cloned RSV reverse transcriptase is also close to this enzyme. Our recombinant enzyme can be produced in unlimited amounts in high concentrations (> 20 U / pl) and the cost of production is far below the cost of producing a conventional enzyme.
2. Kotewicz és mtsai 1985. továbbá Thnese és mtsai 1985. A Moloney szarkoma vírus (egér) reverz transzkriptáz génjét klónozták, de annak is csak egy részletét Ezzel szemben mi az egész reverz transzkriptázt kódoló génszakaszt klónoztuk.2. Kotewicz et al. 1985 and Thnese et al. 1985 The Moloney sarcoma virus (mouse) reverse transcriptase gene has been cloned, but only a portion thereof. In contrast, we have cloned the entire reverse transcriptase coding region.
3. Enzim preparátumunk stabü. 6 hónap alatt aktivitásának legalább 85%-át megtartotta. Ezzel szemben mások a termékük nagyfokú labilitásáról számoltak be [M. J. Roth et. al., J. Bioi. Chem. 260, 9326 (1985)].3. Our enzyme preparation is stable. At least 85% of his activity was maintained within 6 months. In contrast, others have reported a high degree of lability of their product [M. J. Roth et al. al., J. Bioi. Chem. 260, 9326 (1985)].
4. Rekombináns enzimünk izolálása nem igényel ionos detergenst (pl. SDS alkalmazása nélkül kvantitave kinyerhető). A denaturáló ágens károsan befolyásolja az enzim minőségét A mi eljárásunkkal szemben Kotewicz et al. [Gene 35,249 (1985)] az enzim nagyobb hányadát SDS alkalmazásával tudja mobilizálni.4. Isolation of our recombinant enzyme does not require ionic detergent (eg quantitatively recovered without SDS). Denaturing agent adversely affects enzyme quality In contrast to our procedure, Kotewicz et al. [Gene 35, 249 (1985)] can mobilize a greater proportion of the enzyme using SDS.
5. Az RSV pol gén klónozása lehetővé teszi, hogy a természetesen vitális αβ alegységet teljes mértékben rekonstruáljuk géntechnológiai úton. Az utóbbinál bizonyították, hogy az a vírusban előforduló élettanüag aktív forma, amely a legpontosabb5. The cloning of the RSV pol gene allows for a complete genetic engineering of the naturally-occurring αβ subunit. The latter has been shown to be the active form of the virus, which is the most accurate
HU 202 580 A cDNS kópiát készíti a vírusról illetve bármelyThe cDNA makes a copy of the virus or whatever
RNS-templátról.RNA template.
A következőkben a találmány szerinti eljárást egy példa útján szemléltetjük, anélkül, hogy eljárásunkat a megadott példára kívánnánk korlátozni. A jobb áttekinthetőség érdekében a példát megelőzően azonban összefoglalva megadjuk az ábrák ismertetését és mindazokat az eszközöket és módszereket, amelyek az eljárás példa szerinti megvalósítása során felhasználásra kerültek.The following is a non-limiting example of the process of the present invention. However, for the sake of clarity, before the example is given, a summary of the figures and all the tools and methods used in the exemplary embodiment of the procedure are given.
ÁBRAISMERTETÉS a cél, mindig kiegészítettük a tápoldatot frissen hígított ampicillinnel, 50--100 pg/ml koncentrációig. Mindazon esetekben, amikor a reverz transzkriptáz génje is jelen volt a plazmidban, glukózt is adalékoltunk 0,5% koncentrációig.FIGURE DESCRIPTION The aim was always to supplement the medium with freshly diluted ampicillin to a concentration of 50-100 pg / ml. In all cases where the reverse transcriptase gene was also present in the plasmid, glucose was added to a concentration of 0.5%.
M9 (u.n. minimál táptalaj):M9 (so-called minimum medium):
Maniatis és mtsai, 1982. szerintManiatis et al., 1982
Az Agár lemezeket (1,5% Bacto-agar) a fenti táptalajokkal öntöttük.Agar plates (1.5% Bacto agar) were stained with the above media.
A tenyésztéseket 37 ’C-on végeztük, folyékony táptalajok esetében intenzív rázatással.Cultures were performed at 37 'C with vigorous shaking in the case of liquid media.
Lábra: Az RSV genomot hordozó pSRA2 plazmid vázlatos szerkezete, a klónozás szempontjából fontos hasítási helyek feltüntetésével. H3 = = Hind ΠΙ. [DeLorbe és mtsai, J. Virol 36, 50, (1980) valamint Grandgenett és mtsai, J. Virol. 33,264 (1980) valamint Grandgenett és mtsai, J. Virol. 33, 264 (1980) adatai alapján]Figure: Schematic structure of the pSRA2 plasmid carrying the RSV genome, showing cleavage sites important for cloning. H3 = = Price ΠΙ. DeLorbe et al., J. Virol. 36, 50 (1980) and Grandgenett et al., J. Virol. 33,264 (1980) and Grandgenett et al., J. Virol. 33, 264 (1980)]
2. ábra: A pUC 9 vázlatos szerkezeteFigure 2: Schematic structure of pUC 9
3. ábra: a pMF 14 plazmid vázlatos szerkezete H3 = =Hind III; Rí. = EcoRI.Figure 3: Schematic structure of plasmid pMF 14 H3 = Hind III; Ri. = EcoRI.
4. ábra: snRNS inkubálása a rekombináns reverz transzkriptázzal 37 ’C, 4 óra = az RNS preparátum inkubálva 10 E reverz transzkriptázzal = az RNS preparátum inkubálva reverz transzkriptáz nélkül = az RNS preparátum inkubálás nélkül.Figure 4: Incubation of snRNA with recombinant reverse transcriptase 37 'C, 4 hours = RNA preparation incubated with 10 U reverse transcriptase = RNA preparation incubated without reverse transcriptase = RNA preparation without incubation.
Plazmid-preparálásPlasmid Preparation
10-20 ml kultúrából az általánosan használt módszer szerint izoláltunk plazmidot (Maniatis és mtsai, 1982).Plasmid was isolated from 10-20 ml of culture according to the commonly used method (Maniatis et al., 1982).
Nagyobb mennyiségű plazmid izolálása esetében [500-1000 ml kultúrából) Norgard szerint járunk el (Norgard, Anal. Biochem. 113, 34, (1981)], amelynek lényege, hogy a baktérium kromoszómális DNS-ének kicentrifugálása után kapott felülúszót tisztítást követően BioGel A 5M oszlopon gélszűrjük, s a plazmidot tartalmazó frakciókat CsCl egyensúlyi sűrűséggrádiensben centrifugáljuk.For the isolation of larger amounts of plasmid (500-1000 ml culture), Norgard (Norgard, Anal. Biochem. 113, 34, (1981)) was used, whereby the supernatant obtained after centrifugation of the bacterial chromosomal DNA was purified by BioGel A. The 5M column was gel-filtered and the fractions containing the plasmid were centrifuged in a CsCl equilibrium density gradient.
Gélelektroforézisgel electrophoresis
A DNS mintákat Tris-borát tartalmú 0,7-0,9% agaróz gélben elektroforetizáltuk (Maniatis és mtsai, 1982).DNA samples were electrophoresed in Tris-borate 0.7-0.9% agarose gel (Maniatis et al., 1982).
mM Na-foszfát, pH 8,0mM Na phosphate, pH 8.0
HU 202 580 AHU 202 580 A
1. példaExample 1
Veszünk 6 |ig pSRA2 DNS-t és egymást követő lépésekben Xmal, Xhol és PstI restrikciós enzimekkel kezeljük. Minőén emésztés után agaióz gélelektrofoiézissel ellenőrizzük a vágás hatékonyságát μΐ pUC9 DNS-t PstI és Sáli enzimekkel emésztjük a fenti módon.6 µg of pSRA2 DNA are taken and treated in succession with restriction enzymes Xma I, Xho I and Pst I. After digestion, agarose gel electrophoresis was performed to check the efficiency of the digestion. Μΐ pUC9 DNA was digested with PstI and SalI as described above.
Mindkét DNS-t etanolos kicsapás és háromszori 70%-oe etanolos mosás után 20-20 pl ligáló pufferben oldjuk (Maniatis és mtsai, 1982). 20 ng vágott pUC9 és 1350 ng vágott pSRA2) DNS-t összekeverünk, kiegészítjük az előírt komponensekkel (Maniatis és mtsai, 1982), 10 egység ligázt adunk a reakcióelegyhez és éjszakán át 8 ‘C-os jégszekrényben tartjuk.Both DNAs are dissolved in 20-20 µl of ligation buffer after ethanol precipitation and three times 70% wash in ethanol (Maniatis et al., 1982). 20 ng of cut pUC9 and 1350 ng of cut pSRA2) DNA are mixed, supplemented with the required components (Maniatis et al., 1982), 10 units of ligase are added to the reaction mixture and kept overnight in an 8 ° C refrigerator.
A ligátum elegyével (5-10 μΐ) kalcium-kloridos módszenei kompetenssé tett E. coli HB 101 baktériumtörzset transzformálunk (Maniatis és mtsai, 1982) és a sejteket LB táptalajjal készített, 05% glukózzal és 20 μΐ/rnl ampicillinnel kiegészített agar-lemezre szélesztjük.An E. coli strain HB101 competent for calcium chloride methods (Maniatis et al., 1982) was transformed with the ligate mixture (5-10 μΐ) and plated on LB medium supplemented with 05% glucose and 20 μΐ / ml ampicillin. .
órás inkubálás után (37 ’C) a kinőtt telepeket a bennük lévő plazmid méretére analizáljuk (Maniatis és mtsai, 1982).after incubation for 1 hour (37 'C), the grown colonies were analyzed for the size of the plasmid contained therein (Maniatis et al., 1982).
Kiválasztjuk azokat a baktériumtörzseket, melyek a várt, mintegy 5,5 kb méretű plazmidot tartalmazzák. Ezeket a sejteket glukóz és ampicillint tartalmazó folyékony táptalajban szaporítjuk és plazmidot izolálunk (Maniatis és mtsai, 1982). A plazmidot restrikciós endonukleázokkal (PstI, Sáli, Bam Hl, Hind Hl), illetve ezek kombinációival ellenőrizzük (Maniatis és mtsai, 1982), és összevetjük az eredeti térképpel (DeLorbe és mtsai, 1980).Bacterial strains containing the expected approximately 5.5 kb plasmid are selected. These cells were grown in liquid medium containing glucose and ampicillin and a plasmid was isolated (Maniatis et al., 1982). The plasmid was screened with restriction endonucleases (PstI, SalI, Bam HI, Hind HI) or combinations thereof (Maniatis et al., 1982) and compared to the original map (DeLorbe et al., 1980).
A kiválasztott kiónt enzim tesztelésre használjuk az alábbiak szerint:The selected clone is used for enzyme testing as follows:
Az éjszakán át glukózzal és ampicillinnel kiegészített LB-táptalajban nőtt kultúra 2 μΐ-ét 20 ml friss fenti táptalaja inokuláljuk és intenzív rázás mellett E^o = 1,0 denzitásig inkubáljuk 37 *C hőmérsékleten.2 μΐ of the overnight culture in LB medium supplemented with glucose and ampicillin was inoculated with 20 ml of fresh medium above and incubated with vigorous shaking at 37 DEG C. to a density of E1.0 = 1.0.
Ekkor vízben frissen feloldott EPTG-t adunk a tenyészethez ImM koncentrációig és folytatjuk az inkubációt további 60 percig.EPTG, freshly dissolved in water, was then added to the culture to an ImM concentration and incubated for an additional 60 minutes.
A ccntrifiigálással összegyűjtött sejteket lizozimmel kezeljük (Maniatis és mtsai, 1982) és lizáló oldattal a szferoplasztokat roncsoljuk (1. Anyagok és Módszerek). A10000 g szupematanst használjuk közvetlenül enzimtesztelésre.Cells harvested by transfection are treated with lysozyme (Maniatis et al., 1982) and lysed with spheroplasts (Materials and Methods 1). 10000 g of supematant is used directly for enzyme testing.
Az ellenőrzött és rcverz transzkriptázt termelő kiónt preparatív méretben szaporítjuk és indukáljuk, a kultúrából az enzim jellemzése céljából a produktumot izoláljuk.The controlled and reverse transcriptase producing clone is grown and induced at a preparative size and the product isolated from the culture for characterization of the enzyme.
2. példaExample 2
A reverz transzkriptáz preparatív izolálásaPreparative isolation of reverse transcriptase
800 ml pMF 14 plazmidot tartalmazó E. coli HB 101 kultúrát glukózzal (0,5%) és ampicillinnal (100 pg/ml) adalékolt LB táptalajban növesztünk, 2,2 denzitás értékig. Centrifugálás után a sejteket 50 ml glukózmentes (ampicillint tartalmazó) M9 táptalajban szuszpendáljuk és erőteljes rázással 30 perc inkubálás után 10 mM-ig IPTG-t adunk, majd az inkubálást további, 15 órán keresztül folytatjuk. A centrifugálással összegyűjtött sejteket folyékony levegőben lefagyasztjuk és -20 ’Con feldolgozásig tároljuk.E. coli HB 101 containing 800 ml of pMF 14 plasmid was grown in LB medium supplemented with glucose (0.5%) and ampicillin (100 pg / ml) to a density of 2.2. After centrifugation, the cells were resuspended in 50 ml glucose-free (ampicillin-containing) M9 medium and incubated with vigorous shaking for 30 minutes to 10 mM IPTG and incubated for an additional 15 hours. Cells collected by centrifugation were frozen in liquid air and stored until -20 'Con processing.
Az enzimpreparálás minden lépése 4 ’C-on történik.Each step of enzyme preparation is carried out at 4 'C.
A lefagyasztott sejteket szuszpendáljuk 8 ml 10 mM Na-foszfátot (pH 8,0) tartalmazó 10% szacharóz oldatban, majd 2 ml 20 mg/ml-es lizozim oldatot adunk hozzá (a fenti pufferben oldva). 10 perc múlva 11 ml lizáló oldatot létegezünk rá és két réteget óvatosan összekeverjük. A kapott oldatot 1 órán keresztül 100 000 g-vel centrifugáljuk és a felül úszóhoz 0,1M végkoncentrációig 5M NaCl oldatot adunk (példánkban 43,5 ml felülúszóhoz 870 μΐ 5M NaCl-t) és ezt az oldatot egy A-pufferrel ekvilibrált 2 x 12 cm-es DE32 oszlopra felvisszük. A reverz transzkriptáz β-alegysége nem kötődik meg az oszlopon, viszont a DNS pohmeráz jelentős része, továbbá a következő kromatográfiát zavaró nukleinsavak igen.Frozen cells were resuspended in 8 ml of 10% sucrose solution containing 10 mM Na phosphate, pH 8.0, and 2 ml of 20 mg / ml lysozyme solution (dissolved in the above buffer) was added. After 10 minutes, 11 ml of the lysing solution was aerated and the two layers were gently mixed. The resulting solution was centrifuged at 100,000 g for 1 hour and 5M NaCl was added to the supernatant to give a final concentration of 0.1M (870 μΐ 5M NaCl in 43.5 ml supernatant) and equilibrated 2 x 12 with A buffer. cm on a DE32 column. The β-subunit of the reverse transcriptase does not bind to the column, but a substantial part of the DNA primerase and nucleic acids that interfere with the following chromatography do.
Az oszlopot addig mossuk az A pufferrel, míg a meg nem kötött anyag teljesen lejön (az eluátum extinkciója A28o < 0,1) és az átfolyt oldatot (140 ml) 3x4 (kán át dializáljuk 3x1 liter B-pufferrel szemben. Az anyagot a dialízis után 2 x 20 cm-es foszfocellulóz (Pl 1) oszlopra visszük fel. Az oszlopot A^ < 0,1 extinkcióig mossuk B-pufferrel (példánkban 200 ml-rel), majd az oszlopot 0-1,0 M gradienssel eluáljuk (B pufferben), 4 ml-es frakciókat gyűjtünk.The column was washed with Buffer A until the unbound material was completely removed (eluent extinction A28 0 <0.1) and the effluent solution (140 mL) was dialyzed 3 x 4 L (3 x 1 L of Buffer B). was applied to a 2 x 20 cm phosphocellulose (P11) column, which was washed with B buffer (200 mL in our example) until extinction of A 1 < 0.1, and eluted with a 0-1.0 M gradient (B). buffer), 4 ml fractions were collected.
A frakciókból 3 μΐ-t tesztelünk és a 0,25-0,33 M között lejövő reverz transzkriptáz aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, majd 3x8 órát dializáljuk 3x21 C-pufferrel szemben.Fractions containing 3 μΐ were tested and fractions containing reverse transcriptase activity between 0.25-0.33 M were collected and dialyzed against 3x21 C buffer for 3x8 hours.
A dialízis után az anyagot 0,6 x 6 cm-es Heparin-Sepharose oszlopra visszük, lemossuk a C-pufferrel a meg nem kötött anyagot és az enzimet az oszlopról 0,01,0 M KC1 tartalmú C oldattal eluáljuk. 0,6 ml-es frakciókat gyűjtünk, melyek 2 μΐ-ében teszteljük a reverz transzkriptáz aktivitását.After dialysis, the material was loaded onto a 0.6 x 6 cm Heparin-Sepharose column, the unbound material was washed with buffer C and the enzyme was eluted from the column with 0.01.0 M KCl. 0.6 ml fractions were collected and assayed for reverse transcriptase activity in 2 μΐ.
Az aktív frakciókat (kb. 2,0 ml) D-pufferrel szemben dializáljuk 18 órán átThe active fractions (about 2.0 mL) were dialyzed against D-buffer for 18 hours
Az enzim összes mennyisége a tisztítás és koncentrálás után mintegy 10 000 E (800 ml kiinduló baktériumkultúrából). A csúcsfrakció az összes enzim aktivitásnak körülbelül egyharmad részét tartalmazza. A koncentrálást követően ennek aktivitása 20-25 U/μΙ.The total amount of enzyme after purification and concentration is about 10,000 U (800 ml of the original bacterial culture). The peak fraction contains about one third of the total enzyme activity. After concentration, its activity is 20-25 U / μΙ.
A kapott enzim jellemzői a következők:The resulting enzyme has the following characteristics:
A preparátum a standard reakcióelegyben minimálisan 2 órán keresztül képes volt a cDNS-t szintetizálni, szemben a kontrollként használt Boehringer enzimmel (RT Lót No: 10396024-25/Oct. 86), amely 20 perc inkubálásidő alatt több cDNS-t szintetizált, mint 1 óra alatt. Ez az adat, valamint az, hogy a mi preparátumunkkal 4 órán keresztül inkubált RNS gélképe nem változott (4. ábra), azt igazolja, hogy a tisztított rekombináns reverz transzkriptáz - szemben egy sor vírusból izolált, kereskedelmi forgalomban kapható reverz transzkriptáz preparátummal - mentes a nem specifikus nukleázoktól.The preparation was able to synthesize cDNA in the standard reaction mixture for a minimum of 2 hours, in contrast to the control Boehringer enzyme (RT Lot No: 10396024-25 / Oct. 86) which synthesized more cDNAs over a 20 minute incubation period. during the lesson. This data, as well as the unchanged gel image of RNA incubated with our preparation for 4 hours (Fig. 4), confirm that the purified recombinant reverse transcriptase is free of a commercially available reverse transcriptase preparation isolated from a number of viruses. from non-specific nucleases.
A rekombináns reverz transzkriptáz mind Mg**, mind pedig Mn** ionok jelenlétében képes az rA/dT13 primertemplát rendszerben poli dT szintézisre.Recombinant reverse transcriptase is capable of poly dT synthesis in the presence of both Mg ** and Mn ** ions in the rA / dT 13 primer system.
A fenti ionok optimális koncentrációja 3 illetve 2 mM. Valamivel alacsonyabb reakciósebesség mérhető 6 mM Mg** vagy Mn** jelenlétében.The optimal concentrations of these ions are 3 and 2 mM, respectively. Slightly lower reaction rates can be measured in the presence of 6 mM Mg ** or Mn **.
Az enzim, szemben a DNS polimerázzal, poli iCn/oligo dG primer-templát rendszerben is működik, de csak Mn** jelenlétében. Ezen a szubsztráton aktivitása mintegy 25%-a a klasszikus poli rA/dT szubsztráton mért aktivitásnak. A fenti rendszerben kapott mérési adatok teljes összhangban vannak az irodalomban más vitálisThe enzyme, unlike DNA polymerase, also functions in the polyCn / oligo dG primer-template system, but only in the presence of Mn **. The activity of this substrate is about 25% of that of the classic poly rA / dT substrate. The measurement data obtained in the above system are in complete agreement with other vital literature
HU 202 580 A reverz transzkriptázzal mért adatokkal [Gerard és mtsai, Biochemistry, 13,1632 (1974)].202,280 with reverse transcriptase data (Gerard et al., Biochemistry, 13,1632 (1974)).
PoliA+ mRNS-oligo dT primer-templát rendszerben (azaz cDNS szintézisnél) az enzim Mg++ optimuma 6mM, Mn** optimuma 2 mM. Ilyen körülmények között 7,5 U enzim 1,5 óra alatt 200 illetve 400 pmol /Ή/άΊΤΡΊ épít be 0,12 pg mRNS-be, ami megfelel 0,8-1,6 nmol cDNS nukleotid keletkezésének. A keletkező termék mérete poliA* Drosophila mRNS esetében 200-1600 nukleotid, míg a lényegesen hosszabb poliA* patkánymáj hnRNS-t használva 400-7000 nukleotid volt (5. ábra).In the PoliA + mRNA-oligo dT primer-template system (i.e., cDNA synthesis), the Mg ++ optimum of the enzyme is 6mM, the Mn ** optimum is 2mM. Under these conditions, 7.5 U enzymes incorporate 200 and 400 pmol / Ή / 1,5 of 0.12 pg mRNA in 1.5 hours, which corresponds to the generation of 0.8-1.6 nmol cDNA nucleotides. The resulting product had a size of 200-1600 nucleotides for polyA * Drosophila mRNA, and 400-7000 nucleotides using the significantly longer polyA * rat liver hnRNA (Figure 5).
A példa adatai a következőket igazolják:The data in this example justifies:
1. A klón által termelt fehérje enzim-aktivitása azonos a virális reverz transzkriptáz aktivitásával.1. The protein produced by the clone has the same enzyme activity as the viral reverse transcriptase.
2. A preparátum mentes minden olyan zavaró szennyezéstől, ami annak molekuláris biológiai felhasználását akadályozná (nukleázok).2. The preparation shall be free from any interfering impurities which would interfere with its molecular biological use (nucleases).
3. A rekombináns reverz transzkriptáz képes templát függően átírni a megfelelő primerrel ellátott RNS-t, bármilyen hosszú is az, de legalább 7000 nukleotid hosszúságig, ami jóval hosszabb, mint egy átlagos mRNS.3. The recombinant reverse transcriptase is capable of template-transcribing RNA with the appropriate primer, however long, but at least 7,000 nucleotides in length, which is much longer than the average mRNA.
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU426786A HU202580B (en) | 1986-10-14 | 1986-10-14 | Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU426786A HU202580B (en) | 1986-10-14 | 1986-10-14 | Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU202580B true HU202580B (en) | 1991-03-28 |
Family
ID=10967496
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU426786A HU202580B (en) | 1986-10-14 | 1986-10-14 | Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
HU (1) | HU202580B (en) |
-
1986
- 1986-10-14 HU HU426786A patent/HU202580B/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5270179A (en) | Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity | |
US6989259B2 (en) | Recombinant methods for making reverse transcriptases and mutants thereof | |
US6063608A (en) | Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking RNase H activity | |
US5716819A (en) | Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'-to-5' exonuclease activity | |
AU2001247413B2 (en) | High fidelity reverse transcriptases and uses thereof | |
CA1314504C (en) | Expression of enzymatically active reverse transcriptase | |
US20110136181A1 (en) | Rna polymerase mutant with improved functions | |
AU2001247413A1 (en) | High fidelity reverse transcriptases and uses thereof | |
Bathurst et al. | Characterization of the human immunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase enzyme produced in yeast | |
US5017488A (en) | Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15 | |
Kishi et al. | Isolation and characterization of two types of cDNA for mitochondrial adenylate kinase and their expression in Escherichia coli. | |
MXPA04005717A (en) | Expression system. | |
Williamson et al. | Delta factor can displace sigma factor from Bacillus subtilis RNA polymerase holoenzyme and regulate its initiation activity | |
Field et al. | Cloning, sequencing, and demonstration of polymorphism in trypanothione reductase from Crithidia fasciculata | |
US9593318B2 (en) | Linker-bridged gene or domain fusion reverse transcriptase enzyme | |
HU202580B (en) | Process for producing reverse transchriptase of virus of pons sarcoma with recombinative dns-technic | |
JP3549210B2 (en) | Plasmid | |
JP2001103973A (en) | Method for producing cytidine 5'-diphosphate choline | |
Levin et al. | Functional organization of the murine leukemia virus reverse transcriptase: characterization of a bacterially expressed AKR DNA polymerase deficient in RNase H activity | |
EP0462833A2 (en) | Process for the preparation of ascorbic acid-2-phosphate | |
Kumar et al. | A dual-specificity isoform of the protein kinase inhibitor PKI produced by alternate gene splicing | |
Nishikimi et al. | Identification by bacterial expression of the yeast genomic sequence encoding L‐galactono‐γ‐lactone oxidase, the homologue of L‐ascorbic acid‐synthesizing enzyme of higher animals | |
US5928925A (en) | Rice ornithine carbamyltransferase gene, and a vector containing said gene and a transformant | |
CN115261363B (en) | Method for measuring RNA deaminase activity of APOBEC3A and RNA high-activity APOBEC3A variant | |
JP2999954B2 (en) | Enzymatic production of 4-carbamoyl-1-β-D-ribofuranosyl-imidazolium-5-oleate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |