JP3182243B2 - 一本鎖ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド分子の合成方法 - Google Patents
一本鎖ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド分子の合成方法Info
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Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は、組換えＤＮＡの分野に関す
る。より詳細には、本発明は包括的には、本明細書でｍ
ｓＤＮＡと称する、多コピー一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリッド構造という独特かつ珍しい遺伝的構造に関する
ものである。本発明は、ＲＮＡ鋳型から、ｃＤＮＡ分子
を独特な過程で合成することのできる逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）にも関する。本発明はまた、この逆転写酵素を用い
たｍｓＤＮＡの無細胞合成にも関するものである。
る。より詳細には、本発明は包括的には、本明細書でｍ
ｓＤＮＡと称する、多コピー一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリッド構造という独特かつ珍しい遺伝的構造に関する
ものである。本発明は、ＲＮＡ鋳型から、ｃＤＮＡ分子
を独特な過程で合成することのできる逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）にも関する。本発明はまた、この逆転写酵素を用い
たｍｓＤＮＡの無細胞合成にも関するものである。
【０００２】
【発明の背景】ｍｓＤＮＡの個々の種、ならびにそれら
を合成する際に必要となる逆転写酵素については、我々
の継続中の特許出願、ならびに我々の刊行物に説明して
ある。我々は、この種のｍｓＤＮＡの種が極めて多岐に
わたるにもかかわらず、各種のｍｓＤＮＡには、本質的
かつ共通で、保存された構造的、機能的諸要素があるこ
とを見いだした。したがって、本発明は、公知である
か、我々の以前の特許出願で説明した個々の種である
か、これら以外の将来特定されるであろうｍｓＤＮＡで
あるかにかかわらず、こうした共通の特徴を共有する限
りは、この種のＤＮＡに関するものである。
を合成する際に必要となる逆転写酵素については、我々
の継続中の特許出願、ならびに我々の刊行物に説明して
ある。我々は、この種のｍｓＤＮＡの種が極めて多岐に
わたるにもかかわらず、各種のｍｓＤＮＡには、本質的
かつ共通で、保存された構造的、機能的諸要素があるこ
とを見いだした。したがって、本発明は、公知である
か、我々の以前の特許出願で説明した個々の種である
か、これら以外の将来特定されるであろうｍｓＤＮＡで
あるかにかかわらず、こうした共通の特徴を共有する限
りは、この種のＤＮＡに関するものである。
【０００３】つい最近まで、逆転写酵素（ＲＴ）をコー
ドするレトロ要素は、真核生物に排他的に見いだされ、
細菌の集団はレトロ要素を含まないと一般に考えられて
いた。原核生物中にレトロ要素が存在し、ｍｓＤＮＡの
合成に逆転写酵素（ＲＴ）が必要であるという知見は、
逆転写酵素（ＲＴ）をコードするレトロ要素の起源や進
化の可能性、ｍｓＤＮＡ合成の分子的メカニズム、そし
て細胞中でのｍｓＤＮＡの機能に関して、根本的な科学
上の疑問を投げかけるものであった。
ドするレトロ要素は、真核生物に排他的に見いだされ、
細菌の集団はレトロ要素を含まないと一般に考えられて
いた。原核生物中にレトロ要素が存在し、ｍｓＤＮＡの
合成に逆転写酵素（ＲＴ）が必要であるという知見は、
逆転写酵素（ＲＴ）をコードするレトロ要素の起源や進
化の可能性、ｍｓＤＮＡ合成の分子的メカニズム、そし
て細胞中でのｍｓＤＮＡの機能に関して、根本的な科学
上の疑問を投げかけるものであった。
【０００４】逆転写酵素によるｍｓＤＮＡの合成のメカ
ニズムの可能性についても、新規な知見が見いだされ
た。このように、実施し研究、ならびにその際に見いだ
されたさまざまな知見は、科学上重要な異議を有するも
のである。
ニズムの可能性についても、新規な知見が見いだされ
た。このように、実施し研究、ならびにその際に見いだ
されたさまざまな知見は、科学上重要な異議を有するも
のである。
【０００５】ｍｓＤＮＡは、以下でも説明するように、
重要な用途を有するものである。したがって、この種の
構造は、分子生物学、医学、免疫学をはじめとする種々
の用途の実践上の観点からしても重要である。
重要な用途を有するものである。したがって、この種の
構造は、分子生物学、医学、免疫学をはじめとする種々
の用途の実践上の観点からしても重要である。
【０００６】各種のｍｓＤＮＡならびに逆転写酵素に関
する米国の特許出願としては、以下のものがある。
する米国の特許出願としては、以下のものがある。
【０００７】米国特許出願第０７／３１５、４２７号
（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，０７９，１５１ １９９２年
１月７日）には、各種のｍｓＤＮＡをインビトロで合成
する方法が開示されている。この方法を用いると、各種
の合成ｍｓＤＮＡを、効率的かつ実践的に製造すること
ができる。米国特許出願第０７／３１５、３１６号に
は、原核生物であるＭ．キサンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）由来のｍｓＤＮＡ分子が開示さ
れている。この発明は、この一連の知見の中でも特に注
目に値する前進であった。米国特許出願第０７／３１
５、４３２号には、別の原核生物である大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）由来のｍｓＤＮＡ分子が開示されている。この
発明は、その合成に際して原核生物中の逆転写酵素に依
存しているｍｓＤＮＡが有する構造についての包括的な
知見に貢献したものである。米国特許出願第０７／５１
７、９４６号には、レトロンと名づけたＤＮＡ断片から
合成した、原核生物のｍｓＤＮＡが開示されている。米
国特許出願第０７／５１８、７４９号には、レトロンと
名づけた組換えＤＮＡ構築物から合成した、さらに別の
ｍｓＤＮＡが開示されている。米国特許出願第０７／７
５３、１１０号には、真核生物、たとえば酵母、植物細
胞、および哺乳類の細胞中で、インビボにて合成され
た、極めて多岐にわたるｍｓＤＮＡが開示されている。
（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，０７９，１５１ １９９２年
１月７日）には、各種のｍｓＤＮＡをインビトロで合成
する方法が開示されている。この方法を用いると、各種
の合成ｍｓＤＮＡを、効率的かつ実践的に製造すること
ができる。米国特許出願第０７／３１５、３１６号に
は、原核生物であるＭ．キサンサス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ）由来のｍｓＤＮＡ分子が開示さ
れている。この発明は、この一連の知見の中でも特に注
目に値する前進であった。米国特許出願第０７／３１
５、４３２号には、別の原核生物である大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）由来のｍｓＤＮＡ分子が開示されている。この
発明は、その合成に際して原核生物中の逆転写酵素に依
存しているｍｓＤＮＡが有する構造についての包括的な
知見に貢献したものである。米国特許出願第０７／５１
７、９４６号には、レトロンと名づけたＤＮＡ断片から
合成した、原核生物のｍｓＤＮＡが開示されている。米
国特許出願第０７／５１８、７４９号には、レトロンと
名づけた組換えＤＮＡ構築物から合成した、さらに別の
ｍｓＤＮＡが開示されている。米国特許出願第０７／７
５３、１１０号には、真核生物、たとえば酵母、植物細
胞、および哺乳類の細胞中で、インビボにて合成され
た、極めて多岐にわたるｍｓＤＮＡが開示されている。
【０００８】背景技術としては、当業者は、ダンデール
（Dhundale）、細胞（Cell）、５１、第１１０５−１１
１２頁（１９８７）；ワイナー（Weiner）ら、生化学年
報（Ann. Rev. Biochem.）、５５、第６３１−６６１頁
（１９８６）；イェー（Yee）ら、細胞（Cell）、３８
──２０３−２０９頁（１９８４）；およびリムら（Li
m およびMaas）、細胞（Cell）、５６、第８９１−９０
４頁（１９８９年３月１０日）を参照することができ
る。背景についてのこれら以外の重要な参考文献は、上
掲の特許出願中にも記載されているし、本出願の参考文
献の頁にも記載してある。
（Dhundale）、細胞（Cell）、５１、第１１０５−１１
１２頁（１９８７）；ワイナー（Weiner）ら、生化学年
報（Ann. Rev. Biochem.）、５５、第６３１−６６１頁
（１９８６）；イェー（Yee）ら、細胞（Cell）、３８
──２０３−２０９頁（１９８４）；およびリムら（Li
m およびMaas）、細胞（Cell）、５６、第８９１−９０
４頁（１９８９年３月１０日）を参照することができ
る。背景についてのこれら以外の重要な参考文献は、上
掲の特許出願中にも記載されているし、本出願の参考文
献の頁にも記載してある。
【０００９】
【関連特許出願】本出願は、ランプソンら（Bert C. La
mpson 、井上まさより、および井上すみ子）の、「枝分
かれＲＮＡに結合した多コピー一本鎖ＤＮＡを合成する
にあたっての逆転写酵素の使用（The Use of Reverse T
ranscriptase to Synthesize Branched-RNA Linked Mul
ti-Copy Single-Stranded DNA ）」という名称の、すで
に許可となった米国特許出願第０７／３１５、４２７号
（１９８９年２月２４日出願）、
mpson 、井上まさより、および井上すみ子）の、「枝分
かれＲＮＡに結合した多コピー一本鎖ＤＮＡを合成する
にあたっての逆転写酵素の使用（The Use of Reverse T
ranscriptase to Synthesize Branched-RNA Linked Mul
ti-Copy Single-Stranded DNA ）」という名称の、すで
に許可となった米国特許出願第０７／３１５、４２７号
（１９８９年２月２４日出願）、
【００１０】井上ら（井上まさより、井上すみ子、Mei-
Yin Hsu 、Susan Eagle ）の、「粘液細菌由来の逆転写
酵素（Reverse Transcriptase from Myxobacteria ）」
という名称の、係続中の米国特許出願第０７／３１５、
３１６号（１９８９年２月２４日出願）、
Yin Hsu 、Susan Eagle ）の、「粘液細菌由来の逆転写
酵素（Reverse Transcriptase from Myxobacteria ）」
という名称の、係続中の米国特許出願第０７／３１５、
３１６号（１９８９年２月２４日出願）、
【００１１】ランプソンら（Bert C. Lampson 、Jing S
un、Mei-Yin Hsu 、Jorge Vallejo-Ramirez 、井上まさ
より、および井上すみ子）の、「大腸菌由来の逆転写酵
素（Reverse Transcriptase from E. coli）」という名
称の、米国特許出願第０７／３１５、４３２号（１９８
９年２月２４日出願）、
un、Mei-Yin Hsu 、Jorge Vallejo-Ramirez 、井上まさ
より、および井上すみ子）の、「大腸菌由来の逆転写酵
素（Reverse Transcriptase from E. coli）」という名
称の、米国特許出願第０７／３１５、４３２号（１９８
９年２月２４日出願）、
【００１２】井上ら（井上まさより、井上すみ子、Bert
C. Lampson 、Mei-Yin Hsu 、Susan Eagle 、Jing Su
n、およびJorge Vallejo-Ramirez ）の、「原核生物の
逆転写酵素（Prokaryotic Reverse Transcriptase ）」
という名称の、米国特許出願第０７／５１７、９４６号
（１９９０年５月２日出願）、
C. Lampson 、Mei-Yin Hsu 、Susan Eagle 、Jing Su
n、およびJorge Vallejo-Ramirez ）の、「原核生物の
逆転写酵素（Prokaryotic Reverse Transcriptase ）」
という名称の、米国特許出願第０７／５１７、９４６号
（１９９０年５月２日出願）、
【００１３】井上ら（井上まさよりおよび井上すみ子）
の、「大腸菌のｍｓＤＮＡ合成系、産生物、および使用
（E.coli msDNA Synthesizing System, Products and U
ses）」という名称の、米国特許出願第０７／５１８、
７４９号（１９９０年５月２日出願）、および
の、「大腸菌のｍｓＤＮＡ合成系、産生物、および使用
（E.coli msDNA Synthesizing System, Products and U
ses）」という名称の、米国特許出願第０７／５１８、
７４９号（１９９０年５月２日出願）、および
【００１４】宮田ら（宮田しょうへい、大島あつし、井
上まさより、および井上すみ子）の、「細菌性レトロン
の真核生物手段での安定な一本鎖ｃＤＮＡの合成方法、
その産生物、および使用（Method for Synthesizing St
able Single-Stranded cDNAin Eukaryotes Means of a
Bacterial Retron, Products and Uses Therefore）」
という名称の、米国特許出願第０７／７５３、１１０号
（１９９１年８月３０日出願）の一部継続出願である。
これらの出願は、本明細書に、参考文献として組み込ん
である。
上まさより、および井上すみ子）の、「細菌性レトロン
の真核生物手段での安定な一本鎖ｃＤＮＡの合成方法、
その産生物、および使用（Method for Synthesizing St
able Single-Stranded cDNAin Eukaryotes Means of a
Bacterial Retron, Products and Uses Therefore）」
という名称の、米国特許出願第０７／７５３、１１０号
（１９９１年８月３０日出願）の一部継続出願である。
これらの出願は、本明細書に、参考文献として組み込ん
である。
【００１５】上掲のダンデール（Dhundale）らは、ｍｓ
ＤＮＡが合成される際の可能な合成メカニズムを考察し
ている。この刊行物では、ｍｓＤＮＡをコードしている
と推定されるヌクレオチド断片について論じている。こ
の断片は、ｍｓＤＮＡをコードするのに必要な要素の部
分を含んでいるものの、ｍｓＤＮＡを合成する際に必要
な逆転写酵素（逆転写酵素）をコードするオープン・リ
ーディング・フレームを含んでいない。
ＤＮＡが合成される際の可能な合成メカニズムを考察し
ている。この刊行物では、ｍｓＤＮＡをコードしている
と推定されるヌクレオチド断片について論じている。こ
の断片は、ｍｓＤＮＡをコードするのに必要な要素の部
分を含んでいるものの、ｍｓＤＮＡを合成する際に必要
な逆転写酵素（逆転写酵素）をコードするオープン・リ
ーディング・フレームを含んでいない。
【００１６】本発明は、「枝分かれＲＮＡに結合した多
コピー一本鎖ＤＮＡの、透過性とした細胞を使用した産
生（Production of Branched RNA-Linked Multi-Copy S
ingle-Stranded DNA Using Permeabilized Cells）」と
いう名称の、係続中の米国特許出願第０７／３１５、４
２７号（１９８９年２月２４日出願）をはじめとする上
掲の出願のこれまでの開示内容を、包含するものであ
る。これらの３つの最初の出願には、逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）をコードするオープン・リーディング・フレーム、
ならびにリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）領域（存
在する場合）も含め、ｍｓＤＮＡ分子全体をコードする
のに必要なＤＮＡおよびＲＮＡ要素がすべて開示されて
いる。
コピー一本鎖ＤＮＡの、透過性とした細胞を使用した産
生（Production of Branched RNA-Linked Multi-Copy S
ingle-Stranded DNA Using Permeabilized Cells）」と
いう名称の、係続中の米国特許出願第０７／３１５、４
２７号（１９８９年２月２４日出願）をはじめとする上
掲の出願のこれまでの開示内容を、包含するものであ
る。これらの３つの最初の出願には、逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）をコードするオープン・リーディング・フレーム、
ならびにリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）領域（存
在する場合）も含め、ｍｓＤＮＡ分子全体をコードする
のに必要なＤＮＡおよびＲＮＡ要素がすべて開示されて
いる。
【００１７】この時点では、オープン・リーディング・
フレームが、最終的なｍｓＤＮＡ分子のＲＮＡおよびＤ
ＮＡ部分をコードしている遺伝子と同じＤＮＡ断片中に
位置していることが発見されることになるとは予見でき
なかった。この観察結果は、最近、本件とは別の研究グ
ループであるリースら（Lease および Yee）が、生物化
学雑誌（ＪＢＣ）、２６６、１４４９７−１４５０３
（１９９１年８月）に発表した「ミクソコッカス・キサ
ンサスが多コピー一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡ枝分かれ共重合
体を合成する際の初期の事象（Early Events in the Sy
nthesis of the Multicopy Single-stranded DNA-RNA B
ranched Copolymer of Myxococcus xanthus ）」によっ
ても裏付けられている。リースらは、逆転写酵素のみ単
独でも、ＲＮＡ鋳型上でｍｓＤＮＡを完全かつ直接的に
合成することができるとの知見に疑義を呈し、ｍｓＤＮ
Ａの合成についての別のモデルを提起した。リースらが
提起したｍｓＤＮＡの合成のモデルは、ｍｓＤＮＡのＤ
ＮＡ部分に対応する一本鎖ＤＮＡが、３’から５’に向
かうプライミング反応によって通常の過程でまず合成さ
れ、その後、このＤＮＡ鎖が、ｍｓｄＲＮＡの５’末端
の枝分かれグアノシン残基の２’−ＯＨ基にライゲーシ
ョンされて、２’，５’−ホスホジエステル結合が形成
されるというものであった。一方、上述の本出願以前の
特許出願の開示内容ならびに本明細書の開示内容に基づ
くと、ｍｓＤＮＡ合成についてのこのモデルは明確に排
除される。すなわち、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の合成は、
単一のｄＮＴＰ塩基によって、ＲＮＡ前駆体分子を使用
して新規にプライミングされていることが見いだされ
た。さらに、最初のデオキシヌクレオチドの付加ならび
にＤＮＡ鎖の最初の塩基からの伸長は、鋳型ＲＮＡの配
列ならびに逆転写酵素に絶対的に依存している。ｍｓＤ
ＮＡが、逆転写酵素によって、ＲＮＡ鋳型上で直接合成
されていることは確実なようである。ｍｓｒ−ｍｓｄ転
写産物の５’末端の配列（塩基１−１３）は、同じ転写
産物の３’末端の配列と二重螺旋を形成することによ
り、逆転写酵素によるｍｓＤＮＡの合成の際の鋳型とな
るばかりでなく、プライマーの役目も果たしている。し
たがって、以前の特許出願ならびに本特許出願で列挙し
た研究者のグループが扱っている逆転写酵素は、独特な
もののようである。この逆転写酵素は、各ｍｓＤＮＡ分
子の全体を合成するうえで必須であり、また単独で各ｍ
ｓＤＮＡ分子の全体を合成することができる。この合成
は、ｍｓｄＲＮＡ分子の内部グアノシン残基の２’−Ｏ
ＨにｄＴ残基が結合するという、折りたたまれたｍｓｒ
鋳型上での２’，５’−枝分かれプライミングという新
規な事象によって開始される。この点については以下で
さらに説明する。
フレームが、最終的なｍｓＤＮＡ分子のＲＮＡおよびＤ
ＮＡ部分をコードしている遺伝子と同じＤＮＡ断片中に
位置していることが発見されることになるとは予見でき
なかった。この観察結果は、最近、本件とは別の研究グ
ループであるリースら（Lease および Yee）が、生物化
学雑誌（ＪＢＣ）、２６６、１４４９７−１４５０３
（１９９１年８月）に発表した「ミクソコッカス・キサ
ンサスが多コピー一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡ枝分かれ共重合
体を合成する際の初期の事象（Early Events in the Sy
nthesis of the Multicopy Single-stranded DNA-RNA B
ranched Copolymer of Myxococcus xanthus ）」によっ
ても裏付けられている。リースらは、逆転写酵素のみ単
独でも、ＲＮＡ鋳型上でｍｓＤＮＡを完全かつ直接的に
合成することができるとの知見に疑義を呈し、ｍｓＤＮ
Ａの合成についての別のモデルを提起した。リースらが
提起したｍｓＤＮＡの合成のモデルは、ｍｓＤＮＡのＤ
ＮＡ部分に対応する一本鎖ＤＮＡが、３’から５’に向
かうプライミング反応によって通常の過程でまず合成さ
れ、その後、このＤＮＡ鎖が、ｍｓｄＲＮＡの５’末端
の枝分かれグアノシン残基の２’−ＯＨ基にライゲーシ
ョンされて、２’，５’−ホスホジエステル結合が形成
されるというものであった。一方、上述の本出願以前の
特許出願の開示内容ならびに本明細書の開示内容に基づ
くと、ｍｓＤＮＡ合成についてのこのモデルは明確に排
除される。すなわち、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の合成は、
単一のｄＮＴＰ塩基によって、ＲＮＡ前駆体分子を使用
して新規にプライミングされていることが見いだされ
た。さらに、最初のデオキシヌクレオチドの付加ならび
にＤＮＡ鎖の最初の塩基からの伸長は、鋳型ＲＮＡの配
列ならびに逆転写酵素に絶対的に依存している。ｍｓＤ
ＮＡが、逆転写酵素によって、ＲＮＡ鋳型上で直接合成
されていることは確実なようである。ｍｓｒ−ｍｓｄ転
写産物の５’末端の配列（塩基１−１３）は、同じ転写
産物の３’末端の配列と二重螺旋を形成することによ
り、逆転写酵素によるｍｓＤＮＡの合成の際の鋳型とな
るばかりでなく、プライマーの役目も果たしている。し
たがって、以前の特許出願ならびに本特許出願で列挙し
た研究者のグループが扱っている逆転写酵素は、独特な
もののようである。この逆転写酵素は、各ｍｓＤＮＡ分
子の全体を合成するうえで必須であり、また単独で各ｍ
ｓＤＮＡ分子の全体を合成することができる。この合成
は、ｍｓｄＲＮＡ分子の内部グアノシン残基の２’−Ｏ
ＨにｄＴ残基が結合するという、折りたたまれたｍｓｒ
鋳型上での２’，５’−枝分かれプライミングという新
規な事象によって開始される。この点については以下で
さらに説明する。
【００１８】
【発明の開示】本発明は、３つの主要な態様、すなわ
ち、包括的な特徴を有するｍｓＤＮＡ、２’，５’−プ
ライミングという独特な事象によって鋳型からｃＤＮＡ
を合成する能力を有する逆転写酵素、そしてこの種の逆
転写酵素を用いてｍｓＤＮＡを合成する際の無細胞系に
関するものである。
ち、包括的な特徴を有するｍｓＤＮＡ、２’，５’−プ
ライミングという独特な事象によって鋳型からｃＤＮＡ
を合成する能力を有する逆転写酵素、そしてこの種の逆
転写酵素を用いてｍｓＤＮＡを合成する際の無細胞系に
関するものである。
【００１９】これらの態様の説明では、第一に、ｃＤＮ
Ａの合成が、ＲＮＡ鎖中の内部グアノシン残基の２’−
ＯＨ基からプライミングされ、第二に、原核生物に逆転
写酵素が存在するという、２つの分子生物学上新規な側
面が示される。
Ａの合成が、ＲＮＡ鎖中の内部グアノシン残基の２’−
ＯＨ基からプライミングされ、第二に、原核生物に逆転
写酵素が存在するという、２つの分子生物学上新規な側
面が示される。
【００２０】本発明は、広義には、本明細書でｍｓＤＮ
Ａと称する、一本鎖ＤＮＡ部分が一本鎖ＲＮＡ部分と結
合し、一体の部分を形成しているＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッド構造を包含するものである。このｍｓＤＮＡは、
本明細書で「レトロン」と称する遺伝的要素によって数
百個のコピーが産生されるので、多コピー一本鎖（ｍｕ
ｌｔｉｃｏｐｙ，ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）Ｄ
ＮＡ、すなわちｍｓＤＮＡと称される。本発明のｍｓＤ
ＮＡが有する共通の性質を以下に包括的に示す。
Ａと称する、一本鎖ＤＮＡ部分が一本鎖ＲＮＡ部分と結
合し、一体の部分を形成しているＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リッド構造を包含するものである。このｍｓＤＮＡは、
本明細書で「レトロン」と称する遺伝的要素によって数
百個のコピーが産生されるので、多コピー一本鎖（ｍｕ
ｌｔｉｃｏｐｙ，ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）Ｄ
ＮＡ、すなわちｍｓＤＮＡと称される。本発明のｍｓＤ
ＮＡが有する共通の性質を以下に包括的に示す。
【００２１】ｍｓＤＮＡは、一本鎖であるにもかかわら
ず著しく安定であるという重要かつ有用な特徴を有する
ので、幾つかの用途に極めて適している。特に重要なの
は、タンパク質をコードする標的遺伝子のｍＲＮＡに対
するアンチセンスとしてｍｓＤＮＡを使用するという用
途である。この点については後述する。
ず著しく安定であるという重要かつ有用な特徴を有する
ので、幾つかの用途に極めて適している。特に重要なの
は、タンパク質をコードする標的遺伝子のｍＲＮＡに対
するアンチセンスとしてｍｓＤＮＡを使用するという用
途である。この点については後述する。
【００２２】ｍｓＤＮＡの共通の特徴を包括的に示す下
記の図からもわかるように、ｍｓＤＮＡは、安定なＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド分子で、その枝分かれＲＮＡ部
分は、ＲＮＡ鎖の内部グアノシン残基の２’−ＯＨ基と
ＤＮＡ鎖の５’−燐酸基との間に形成された２’，５’
−ホスホジエステル結合を介して一本鎖ＤＮＡ部分に共
有結合しており、しかも、ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子の相
補的な３’末端同士の塩基の対合によってＤＮＡ部分に
非共有結合的に結合している。ｍｓＤＮＡ分子では、Ｒ
ＮＡ部分ならびにＤＮＡ部分が、１つ以上の安定なステ
ム・ループ二次構造を形成している。ｍｓＤＮＡは、単
一の一次転写産物であるプレｍｓｄＲＮＡによってコー
ドされ、このプレｍｓｄＲＮＡは、さらにレトロンと称
される遺伝的要素によってコードされている。このレト
ロンは、ハイブリッド分子のＲＮＡ部分をコードする領
域であるｍｓｒと、ｍｓＤＮＡ分子のＤＮＡ部分をコー
ドする領域であるｍｓｄをそれぞれ含み、オープン・リ
ーディング・フレーム（ＯＲＦ）も含む遺伝的要素であ
る。プレｍｓｄＲＮＡも、オープン・リーディング・フ
レーム、ｍｓｒ、およびｍｓｄ領域を含んでいる。ｍｓ
ＤＮＡの合成の際には、ｍｓｒおよびｍｓｄ領域ならび
にオープン・リーディング・フレームを包括する領域を
転写することが必要になる。しかし、オープン・リーデ
ィング・フレームとｍｓｒ−ｍｓｄ領域は、必ずしも同
じ転写単位上に存在しなくてもかまわない。
記の図からもわかるように、ｍｓＤＮＡは、安定なＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリッド分子で、その枝分かれＲＮＡ部
分は、ＲＮＡ鎖の内部グアノシン残基の２’−ＯＨ基と
ＤＮＡ鎖の５’−燐酸基との間に形成された２’，５’
−ホスホジエステル結合を介して一本鎖ＤＮＡ部分に共
有結合しており、しかも、ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子の相
補的な３’末端同士の塩基の対合によってＤＮＡ部分に
非共有結合的に結合している。ｍｓＤＮＡ分子では、Ｒ
ＮＡ部分ならびにＤＮＡ部分が、１つ以上の安定なステ
ム・ループ二次構造を形成している。ｍｓＤＮＡは、単
一の一次転写産物であるプレｍｓｄＲＮＡによってコー
ドされ、このプレｍｓｄＲＮＡは、さらにレトロンと称
される遺伝的要素によってコードされている。このレト
ロンは、ハイブリッド分子のＲＮＡ部分をコードする領
域であるｍｓｒと、ｍｓＤＮＡ分子のＤＮＡ部分をコー
ドする領域であるｍｓｄをそれぞれ含み、オープン・リ
ーディング・フレーム（ＯＲＦ）も含む遺伝的要素であ
る。プレｍｓｄＲＮＡも、オープン・リーディング・フ
レーム、ｍｓｒ、およびｍｓｄ領域を含んでいる。ｍｓ
ＤＮＡの合成の際には、ｍｓｒおよびｍｓｄ領域ならび
にオープン・リーディング・フレームを包括する領域を
転写することが必要になる。しかし、オープン・リーデ
ィング・フレームとｍｓｒ−ｍｓｄ領域は、必ずしも同
じ転写単位上に存在しなくてもかまわない。
【００２３】包括的構造としてのｍｓＤＮＡは、いずれ
も、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖を形成する、この独特な枝
分かれ結合を有している。さらに、枝分かれ残基は、い
ずれの場合も、ＲＮＡ転写産物の５’末端に位置する内
部グアノシン残基である。
も、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖を形成する、この独特な枝
分かれ結合を有している。さらに、枝分かれ残基は、い
ずれの場合も、ＲＮＡ転写産物の５’末端に位置する内
部グアノシン残基である。
【００２４】ｍｓＤＮＡが常に有するもう一つの特徴
は、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分の３’末端同士が塩基対を
形成していることである。ｍｓＤＮＡを常に特徴づける
さらに別の特徴は、一組の逆方向反復（ＩＲ）塩基配列
で、この逆方向反復塩基配列の位置については後述す
る。逆方向反復塩基配列が存在することは、典型的なス
テム・ループ構造を有するｍｓＤＮＡが合成される上で
必須で、逆方向反復塩基配列が存在することによって、
ＲＮＡ転写産物が折りたたまれて、重要な意味をもつ二
次構造をとることが可能となるのである。
は、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分の３’末端同士が塩基対を
形成していることである。ｍｓＤＮＡを常に特徴づける
さらに別の特徴は、一組の逆方向反復（ＩＲ）塩基配列
で、この逆方向反復塩基配列の位置については後述す
る。逆方向反復塩基配列が存在することは、典型的なス
テム・ループ構造を有するｍｓＤＮＡが合成される上で
必須で、逆方向反復塩基配列が存在することによって、
ＲＮＡ転写産物が折りたたまれて、重要な意味をもつ二
次構造をとることが可能となるのである。
【００２５】なお、本明細書の説明では本発明のｍｓＤ
ＮＡを包括的に示したが、本発明のｍｓＤＮＡは、必要
に応じて共通の二次構造、たとえばステム・ループ構造
を有するものである。ステム・ループ構造は、存在する
場合には、ｍｓＤＮＡ分子の一本鎖ＤＮＡ部分の一部と
して存在し、そしてｍｓＤＮＡ分子の一本鎖ＲＮＡ部分
は、少なくとも１つのステム・ループ構造を有するもの
である。さらに、本発明のｍｓＤＮＡは、ＤＮＡ部分お
よびＲＮＡ部分のいずれについても、ヌクレオチドの長
さを各種のものとすることができる。ｍｓＤＮＡの他の
変数については、以下の記載から明らかとなるはずであ
る。
ＮＡを包括的に示したが、本発明のｍｓＤＮＡは、必要
に応じて共通の二次構造、たとえばステム・ループ構造
を有するものである。ステム・ループ構造は、存在する
場合には、ｍｓＤＮＡ分子の一本鎖ＤＮＡ部分の一部と
して存在し、そしてｍｓＤＮＡ分子の一本鎖ＲＮＡ部分
は、少なくとも１つのステム・ループ構造を有するもの
である。さらに、本発明のｍｓＤＮＡは、ＤＮＡ部分お
よびＲＮＡ部分のいずれについても、ヌクレオチドの長
さを各種のものとすることができる。ｍｓＤＮＡの他の
変数については、以下の記載から明らかとなるはずであ
る。
【００２６】本発明は、単独で、鋳型からｍｓＤＮＡ全
体を合成することができ、その際、鋳型分子とｃＤＮＡ
鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドとの間に独特な
２’，５’−結合が形成されるプライミングによって合
成が開始する逆転写酵素にも関するものである。逆転写
酵素には、重要な実践上の用途がある。
体を合成することができ、その際、鋳型分子とｃＤＮＡ
鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドとの間に独特な
２’，５’−結合が形成されるプライミングによって合
成が開始する逆転写酵素にも関するものである。逆転写
酵素には、重要な実践上の用途がある。
【００２７】本発明は、逆転写酵素によってＲＮＡ鋳型
からｃＤＮＡを合成し、ｍｓＤＮＡ構造全体を形成する
無細胞合成にも関するものである。無細胞系を用いるこ
とによって、逆転写酵素が有する独特の特性がさらに確
実なものとなる。
からｃＤＮＡを合成し、ｍｓＤＮＡ構造全体を形成する
無細胞合成にも関するものである。無細胞系を用いるこ
とによって、逆転写酵素が有する独特の特性がさらに確
実なものとなる。
【００２８】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明はＤＮ
Ａ部分およびＲＮＡ部分とを含む一本鎖ｍｓＤＮＡ分子
を合成するにあたり、レトロンのｍｓｒ−ｍｓｄ領域の
一次転写産物である単離されたＲＮＡ画分、レトロンに
コードされた精製された逆転写酵素、ならびに４種のｄ
ＮＴＰを混合し、該混合物をｍｓＤＮＡが生成するよう
な反応条件でインキュベートすることを包含するｍｓＤ
ＮＡの合成方法を提供する。ここで、一次転写産物がｍ
ｓｒ−ｍｓｄ領域を有するプラスミドを発現させること
により得られる方法、レトロンがレトロン−Ｅｃ６７で
ある方法、生成したｍｓＤＮＡを分離する工程をさらに
包含する方法、インキュベーション後に、混合物をさら
にＲＮａｓｅＨとともにインキュベーションする工程を
包含する方法が好ましい。
Ａ部分およびＲＮＡ部分とを含む一本鎖ｍｓＤＮＡ分子
を合成するにあたり、レトロンのｍｓｒ−ｍｓｄ領域の
一次転写産物である単離されたＲＮＡ画分、レトロンに
コードされた精製された逆転写酵素、ならびに４種のｄ
ＮＴＰを混合し、該混合物をｍｓＤＮＡが生成するよう
な反応条件でインキュベートすることを包含するｍｓＤ
ＮＡの合成方法を提供する。ここで、一次転写産物がｍ
ｓｒ−ｍｓｄ領域を有するプラスミドを発現させること
により得られる方法、レトロンがレトロン−Ｅｃ６７で
ある方法、生成したｍｓＤＮＡを分離する工程をさらに
包含する方法、インキュベーション後に、混合物をさら
にＲＮａｓｅＨとともにインキュベーションする工程を
包含する方法が好ましい。
【００２９】
【００３０】
【００３１】
【００３２】下記の式Ｉに示す特徴を有し、
【化１】 ここで、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｌ、Ｓ、Ｗ、Ｖ、およびＱが各種
の長さを有するヌクレオチド鎖であるｍｓＤＮＡが好ま
しい。
の長さを有するヌクレオチド鎖であるｍｓＤＮＡが好ま
しい。
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】プライミングされたＲＮＡ鋳型からｃＤＮ
Ａ鎖を合成することができ、この合成が、鋳型分子と、
ｃＤＮＡ鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドとの間の
２’，５’−結合の形成から開始されるものである逆転
写酵素が好ましい。
Ａ鎖を合成することができ、この合成が、鋳型分子と、
ｃＤＮＡ鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドとの間の
２’，５’−結合の形成から開始されるものである逆転
写酵素が好ましい。
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分を有する一本
鎖ｍｓＤＮＡで、一本鎖ｍｓＤＮＡのＤＮＡおよびＲＮ
Ａ部分をそれぞれコードするｍｓｄ−ｍｓｒ領域、なら
びに逆転写酵素（ＲＴ）をコードするオープン・リーデ
ィング・フレーム（ＯＲＦ）を含むレトロンから誘導さ
れ、ＲＮＡ鎖の内部グアノシン残基の２’−ＯＨ基とＤ
ＮＡ鎖の５’燐酸基との間に形成された２’，５’−ホ
スホジエステル結合を介して一本鎖ＤＮＡに共有結合
し、ＲＮＡ鎖の３’末端とＤＮＡ鎖の３’末端の互いに
相補的なヌクレオチド鎖同士が重なりあうことによって
ＤＮＡ鎖に非共有結合的に結合している一本鎖ＲＮＡか
ら構成され、上記ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分が、それ
ぞれ二次構造を形成しており、上記ＤＮＡ部分あるいは
ＲＮＡ部分が、それぞれ、外来のＤＮＡ配列あるいはＲ
ＮＡ配列を含んでおり、そして上記ｍｓＤＮＡが、標的
タンパク質のｍＲＮＡに対してアンチセンス分子となり
うるものであるｍｓＤＮＡ分子が好ましい。
鎖ｍｓＤＮＡで、一本鎖ｍｓＤＮＡのＤＮＡおよびＲＮ
Ａ部分をそれぞれコードするｍｓｄ−ｍｓｒ領域、なら
びに逆転写酵素（ＲＴ）をコードするオープン・リーデ
ィング・フレーム（ＯＲＦ）を含むレトロンから誘導さ
れ、ＲＮＡ鎖の内部グアノシン残基の２’−ＯＨ基とＤ
ＮＡ鎖の５’燐酸基との間に形成された２’，５’−ホ
スホジエステル結合を介して一本鎖ＤＮＡに共有結合
し、ＲＮＡ鎖の３’末端とＤＮＡ鎖の３’末端の互いに
相補的なヌクレオチド鎖同士が重なりあうことによって
ＤＮＡ鎖に非共有結合的に結合している一本鎖ＲＮＡか
ら構成され、上記ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分が、それ
ぞれ二次構造を形成しており、上記ＤＮＡ部分あるいは
ＲＮＡ部分が、それぞれ、外来のＤＮＡ配列あるいはＲ
ＮＡ配列を含んでおり、そして上記ｍｓＤＮＡが、標的
タンパク質のｍＲＮＡに対してアンチセンス分子となり
うるものであるｍｓＤＮＡ分子が好ましい。
【００４１】はじめに、本発明に係る図面を以下に説明
する。
する。
【００４２】図１は、ｐＣ１−１ＥＰ５の制限地図、ｍ
ｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の推定二次構造、ならびにＲＮＡ前
駆体分子の推定二次構造を示す。
ｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の推定二次構造、ならびにＲＮＡ前
駆体分子の推定二次構造を示す。
【００４３】図１Ａは、ｐＣ１−１ＥＰ５（ランプソン
（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）の制限地図を示
す。ＢａｍＨＩ部位に変わったＢｓｓＨＩ部位を矢印で
示し、部位特異的突然変異誘発によって生じたＸｂａＩ
部位も矢印で示す。ｍｓｒおよびｍｓｄ、ならびに逆転
写酵素遺伝子の位置および向きを矢印で示す。ｐ６７−
ＢＨＯ．６およびｐ６７−ＲＴにクローニングされた領
域を、それぞれ、白い矩形で示す。
（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）の制限地図を示
す。ＢａｍＨＩ部位に変わったＢｓｓＨＩ部位を矢印で
示し、部位特異的突然変異誘発によって生じたＸｂａＩ
部位も矢印で示す。ｍｓｒおよびｍｓｄ、ならびに逆転
写酵素遺伝子の位置および向きを矢印で示す。ｐ６７−
ＢＨＯ．６およびｐ６７−ＲＴにクローニングされた領
域を、それぞれ、白い矩形で示す。
【００４４】図１Ｂは、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７（ランプ
ソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）の構造を示
す。枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲み、ＲＮＡを
矩形で囲んで示す。ＲＮＡもＤＮＡも、５’末端から番
号をふってある。
ソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）の構造を示
す。枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲み、ＲＮＡを
矩形で囲んで示す。ＲＮＡもＤＮＡも、５’末端から番
号をふってある。
【００４５】図１Ｃは、ＲＮＡ前駆体分子の推定二次構
造を示す。ＲＮＡ転写産物の５’末端は、プライマー伸
長法で決定した（フスー（Ｈｓｕ）ら、M.Y.Hsu, S.Eag
le,M.Inouye and S.Inouye, J.B.C.,267 No.26 pp.1382
3〜13829 ）。ＲＮＡ分子の３’末端は、ＲＮＡ一次転
写産物中の逆方向反復塩基配列ａ１およびａ２（矢印）
を利用して、ステム構造を形成していると考えられる。
枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲んで示す。突然変
異によって変化した塩基を、各突然変異の名称ととも
に、矢印で示す。白および黒の三角は、ｍｓＤＮＡのＲ
ＮＡおよびＤＮＡのそれぞれの３’末端の位置を示す。
造を示す。ＲＮＡ転写産物の５’末端は、プライマー伸
長法で決定した（フスー（Ｈｓｕ）ら、M.Y.Hsu, S.Eag
le,M.Inouye and S.Inouye, J.B.C.,267 No.26 pp.1382
3〜13829 ）。ＲＮＡ分子の３’末端は、ＲＮＡ一次転
写産物中の逆方向反復塩基配列ａ１およびａ２（矢印）
を利用して、ステム構造を形成していると考えられる。
枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲んで示す。突然変
異によって変化した塩基を、各突然変異の名称ととも
に、矢印で示す。白および黒の三角は、ｍｓＤＮＡのＲ
ＮＡおよびＤＮＡのそれぞれの３’末端の位置を示す。
【００４６】図２は、インビトロでｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６
７を合成する際のプライミング反応の特異性を示す。最
初の塩基の付加反応は、実験方法に記載したようにして
実施した。反応混合物は、１０μｌの逆転写酵素緩衝液
中に、１mlの培養液から得たＲＮＡ分画と、反応ごと
に、５μＣｉの各〔α32−Ｐ〕ｄＮＴＰとを含有してい
る。２μｌの部分精製逆転写酵素を加えることによって
反応を開始し、混合物を３７℃で３０分間インキュベー
トした。レーン１−４：反応を、ｐ６７−ＢＨＯ．６を
有するＣＬ８３細胞（野生型）由来のＲＮＡを用いて行
った。レーン５−８：ｐ６７−ｍｕｔ−１（突然変異
１：図１Ｃの１１８の位置でのＡからＴへの突然変異）
を有する細胞を用いた。レーン９−１２：ｐ６７−ｍｕ
ｔ−２（突然変異２：図１Ｃの１１８の位置でのＡから
Ｇへの突然変異）を有する細胞を用いた。レーン１３−
１６：ｐ６７−ｍｕｔ−３（図１Ｃの１５の位置でのＧ
からＡへの突然変異）を有する細胞を用いた。各レーン
の上側に、各レーンで使用した〔α32−Ｐ〕ｄＮＴＰを
示してある。分子量マーカーとして、一番左側のレーン
で、クレノウ断片と〔α32−Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したｐ
ＢＲ３２２のＭｓｐＩによる消化物を泳動した。数字は
断片のサイズを塩基数で示す。矢印は、各ＲＮＡ調製物
ごとに、ｄＮＴＰで特異的に標識したＲＮＡ前駆体の位
置を示す。
７を合成する際のプライミング反応の特異性を示す。最
初の塩基の付加反応は、実験方法に記載したようにして
実施した。反応混合物は、１０μｌの逆転写酵素緩衝液
中に、１mlの培養液から得たＲＮＡ分画と、反応ごと
に、５μＣｉの各〔α32−Ｐ〕ｄＮＴＰとを含有してい
る。２μｌの部分精製逆転写酵素を加えることによって
反応を開始し、混合物を３７℃で３０分間インキュベー
トした。レーン１−４：反応を、ｐ６７−ＢＨＯ．６を
有するＣＬ８３細胞（野生型）由来のＲＮＡを用いて行
った。レーン５−８：ｐ６７−ｍｕｔ−１（突然変異
１：図１Ｃの１１８の位置でのＡからＴへの突然変異）
を有する細胞を用いた。レーン９−１２：ｐ６７−ｍｕ
ｔ−２（突然変異２：図１Ｃの１１８の位置でのＡから
Ｇへの突然変異）を有する細胞を用いた。レーン１３−
１６：ｐ６７−ｍｕｔ−３（図１Ｃの１５の位置でのＧ
からＡへの突然変異）を有する細胞を用いた。各レーン
の上側に、各レーンで使用した〔α32−Ｐ〕ｄＮＴＰを
示してある。分子量マーカーとして、一番左側のレーン
で、クレノウ断片と〔α32−Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したｐ
ＢＲ３２２のＭｓｐＩによる消化物を泳動した。数字は
断片のサイズを塩基数で示す。矢印は、各ＲＮＡ調製物
ごとに、ｄＮＴＰで特異的に標識したＲＮＡ前駆体の位
置を示す。
【００４７】図３は、バンドａおよびｂの生成を図式的
に示した図である。細線および太線は、それぞれＲＮＡ
およびＤＮＡを示し、矢印は３’末端を示す。白と黒の
三角は、それぞれ、ｍｓＤＮＡ中のＲＮＡ鎖の３’末端
とＤＮＡ鎖の３’末端とを示す。破線は、ｍｓｄＲＮＡ
の５’末端の二本鎖ＲＮＡ構造における塩基の対合を示
す。まず、構造Ｉが、レトロン−Ｅｃ６７からの一次転
写産物から形成される。ハイブリダイズしていない３’
末端は、おそらく細胞内で取り除かれており、生じた構
造は、図１Ｃに示すものと同一である。無細胞反応混合
物に、ＲＴ−Ｅｃ６７とともにｄＴＴＰを加えると、ｄ
Ｔが、２’，５’−ホスホジエステル結合によって、内
部グアノシン残基（図中丸印）の２’−ＯＨ基に結合す
る（構造ＩＩ）。後の３種のｄＮＴＰを加えると、ＲＮ
Ａ鋳型に沿ってＤＮＡ鎖が延びる。ＤＮＡ鎖が伸長する
のと同時に、ＲＮＡ鋳型が取り除かれる（構造ＩＩ
Ｉ）。ＤＮＡの合成は、黒い三角で示す位置で停止し、
３’末端に塩基７個のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが残
り、構造ＩＶａあるいはＩＶｂが得られる。構造ＩＶを
ＲＮアーゼＡで処理すると、構造Ｖが得られる。構造Ｖ
を沸騰水浴中でインキュベートすると、構造ＶＩが形成
する。構造ＶＩａおよびＶＩｂは、それぞれ、図２のバ
ンドａおよびｂに相当する。
に示した図である。細線および太線は、それぞれＲＮＡ
およびＤＮＡを示し、矢印は３’末端を示す。白と黒の
三角は、それぞれ、ｍｓＤＮＡ中のＲＮＡ鎖の３’末端
とＤＮＡ鎖の３’末端とを示す。破線は、ｍｓｄＲＮＡ
の５’末端の二本鎖ＲＮＡ構造における塩基の対合を示
す。まず、構造Ｉが、レトロン−Ｅｃ６７からの一次転
写産物から形成される。ハイブリダイズしていない３’
末端は、おそらく細胞内で取り除かれており、生じた構
造は、図１Ｃに示すものと同一である。無細胞反応混合
物に、ＲＴ−Ｅｃ６７とともにｄＴＴＰを加えると、ｄ
Ｔが、２’，５’−ホスホジエステル結合によって、内
部グアノシン残基（図中丸印）の２’−ＯＨ基に結合す
る（構造ＩＩ）。後の３種のｄＮＴＰを加えると、ＲＮ
Ａ鋳型に沿ってＤＮＡ鎖が延びる。ＤＮＡ鎖が伸長する
のと同時に、ＲＮＡ鋳型が取り除かれる（構造ＩＩ
Ｉ）。ＤＮＡの合成は、黒い三角で示す位置で停止し、
３’末端に塩基７個のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが残
り、構造ＩＶａあるいはＩＶｂが得られる。構造ＩＶを
ＲＮアーゼＡで処理すると、構造Ｖが得られる。構造Ｖ
を沸騰水浴中でインキュベートすると、構造ＶＩが形成
する。構造ＶＩａおよびＶＩｂは、それぞれ、図２のバ
ンドａおよびｂに相当する。
【００４８】図４は、無細胞系でのｍｓＤＮＡ合成時の
鎖伸長停止反応を示す。ｍｓＤＮＡ合成の際の鎖伸長反
応は、実験方法に記載したようにして、ジデオキシＮＴ
Ｐの存在下で行った。ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴ
ＴＰ、あるいはｄｄＣＴＰを含有する個々の鎖伸長停止
反応混合物を、それぞれレーンＧ、Ａ、Ｔ、およびＣで
泳動した。得られたはしご状のバンド（ラダー）を右側
で読み取ったところ、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の塩基２４
−５４のＤＮＡ配列に相当していた（図１ｃ；ランプソ
ン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ参照）。一番左側
のレーンでは、図２と同じ分子量マーカーを泳動した。
サイズ（塩基数）を左側に示す。図３に図式的に示した
４つの主要な生成物を、ａ、ｂ、ｃ、およびｄと記した
矢印で示す。
鎖伸長停止反応を示す。ｍｓＤＮＡ合成の際の鎖伸長反
応は、実験方法に記載したようにして、ジデオキシＮＴ
Ｐの存在下で行った。ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴ
ＴＰ、あるいはｄｄＣＴＰを含有する個々の鎖伸長停止
反応混合物を、それぞれレーンＧ、Ａ、Ｔ、およびＣで
泳動した。得られたはしご状のバンド（ラダー）を右側
で読み取ったところ、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の塩基２４
−５４のＤＮＡ配列に相当していた（図１ｃ；ランプソ
ン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ参照）。一番左側
のレーンでは、図２と同じ分子量マーカーを泳動した。
サイズ（塩基数）を左側に示す。図３に図式的に示した
４つの主要な生成物を、ａ、ｂ、ｃ、およびｄと記した
矢印で示す。
【００４９】図５は、バンドｂおよびａの生成物の、リ
ボヌクレアーゼ処理を示す。生成物は、無細胞系（ｄｄ
ＮＴＰ含有せず）で十分な伸長反応を行った後に、ＤＮ
Ａ配列決定用ゲルで泳動した（レーン２）。バンドｂ
（レーン３）およびバンドａ（レーン４）は、分離用ゲ
ル電気泳動で単離し、ＲＮアーゼＡでそれぞれ消化した
（レーン５および６）。分子量マーカー（レーン１）
は、図２と同一である。
ボヌクレアーゼ処理を示す。生成物は、無細胞系（ｄｄ
ＮＴＰ含有せず）で十分な伸長反応を行った後に、ＤＮ
Ａ配列決定用ゲルで泳動した（レーン２）。バンドｂ
（レーン３）およびバンドａ（レーン４）は、分離用ゲ
ル電気泳動で単離し、ＲＮアーゼＡでそれぞれ消化した
（レーン５および６）。分子量マーカー（レーン１）
は、図２と同一である。
【００５０】図６は、各種の代表的なｍｓＤＮＡの完全
なヌクレオチド配列を示す。Ｙｅ１１７は、プラスミド
ＹＥｐ５２１−Ｍ４中のｍｓｄ領域内にＥｃ６７にＸｈ
ｏＩサイトをつくり５０ｂｐのｃｐｃ２８アンチセンス
ＤＮＡを挿入したもの（米国特許０７／７５３，１１０
およびS.Miyata et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA8
9, 5735-5739, 1992参照）。
なヌクレオチド配列を示す。Ｙｅ１１７は、プラスミド
ＹＥｐ５２１−Ｍ４中のｍｓｄ領域内にＥｃ６７にＸｈ
ｏＩサイトをつくり５０ｂｐのｃｐｃ２８アンチセンス
ＤＮＡを挿入したもの（米国特許０７／７５３，１１０
およびS.Miyata et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA8
9, 5735-5739, 1992参照）。
【００５１】図７は、別のｍｓＤＮＡであるＥｃ７４を
示す。
示す。
【００５２】図８および図９は、２種のさらに別のｍｓ
ＤＮＡであるＥｃ１００およびＥｃ１０１を示す。
ＤＮＡであるＥｃ１００およびＥｃ１０１を示す。
【００５３】図１０は、合成ｍｓＤＮＡ１００を構築す
る際のプロトコールを示す。
る際のプロトコールを示す。
【００５４】図１１は、合成ｍｓＤＮＡの遺伝子ならび
に構成成分を示す。
に構成成分を示す。
【００５５】図１２は、ｍｓＤＮＡ１０１を構築する際
のプロトコールを示す。
のプロトコールを示す。
【００５６】図１３は、ＲＮＡあるいはＤＮＡ鋳型から
のｃＤＮＡの生成を示す。
のｃＤＮＡの生成を示す。
【００５７】
【好適実施態様の説明】ｍｓＤＮＡは、一般に、一本鎖
ＤＮＡ部分と枝分かれ一本鎖ＲＮＡ部分とから構成さ
れ、枝分かれ一本鎖ＲＮＡ部分が、ＲＮＡ鎖内に位置す
る枝分かれグアノシン残基の２’−ＯＨ基とＤＮＡ分子
の５’燐酸基との間に形成された２’−５’−ホスホジ
エステル結合を介して共有結合で一本鎖ＤＮＡ部分に結
合されている分子であるとして記載することができる。
ｍｓＤＮＡのさらに別の共通の特徴としては、ＤＮＡ分
子とＲＮＡ分子の相補的な３’末端同士が塩基対を形成
することによって、３’末端に非共有結合的に結合され
たＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成されていること、
そしてＤＮＡ鎖ならびにＲＮＡ鎖の双方が、安定な二次
構造を形成していることが挙げられる。
ＤＮＡ部分と枝分かれ一本鎖ＲＮＡ部分とから構成さ
れ、枝分かれ一本鎖ＲＮＡ部分が、ＲＮＡ鎖内に位置す
る枝分かれグアノシン残基の２’−ＯＨ基とＤＮＡ分子
の５’燐酸基との間に形成された２’−５’−ホスホジ
エステル結合を介して共有結合で一本鎖ＤＮＡ部分に結
合されている分子であるとして記載することができる。
ｍｓＤＮＡのさらに別の共通の特徴としては、ＤＮＡ分
子とＲＮＡ分子の相補的な３’末端同士が塩基対を形成
することによって、３’末端に非共有結合的に結合され
たＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成されていること、
そしてＤＮＡ鎖ならびにＲＮＡ鎖の双方が、安定な二次
構造を形成していることが挙げられる。
【００５８】ＤＮＡ鎖の３’末端は、ＲＮＡ鎖の３’末
端の配列と相補的な配列を含んでいる。このことによっ
て、ＤＮＡの３’末端とＲＮＡの３’末端とが重なりあ
って、ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合領域を形成することが可
能となる。この短いＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、逆
転写酵素によってｍｓＤＮＡが合成されるメカニズムの
結果として存在するものである。
端の配列と相補的な配列を含んでいる。このことによっ
て、ＤＮＡの３’末端とＲＮＡの３’末端とが重なりあ
って、ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対合領域を形成することが可
能となる。この短いＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、逆
転写酵素によってｍｓＤＮＡが合成されるメカニズムの
結果として存在するものである。
【００５９】ｍｓＤＮＡ分子は、細胞質中で染色体から
遊離した状態で存在し、プラスミドを単離する際に使用
するのと同じ方法で単離することができる。ｍｓＤＮＡ
は、この分子が一本鎖のＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分か
ら構成されているという事実にもかかわらず、安定であ
る。ｍｓＲＮＡがこのように安定なのは、枝分かれ構造
によって、ＤＮＡの５’末端、ならびに枝分かれグアノ
シン残基以降のＲＮＡ分子が保護され、そして、３’末
端にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成されているため
であると考えられる。各種のｍｓＤＮＡ分子を分析する
と、そのヌクレオチド配列が極めて多岐にわたってお
り、ＤＮＡ鎖にもＲＮＡ鎖にも、一次的な配列の類似性
がほとんど、あるいはまったくないことがわかる。しか
し、ｍｓＤＮＡは、構造は異なっていても、本明細書に
記載したような重要な一次構造ならびに二次構造をいず
れも共通に有している。
遊離した状態で存在し、プラスミドを単離する際に使用
するのと同じ方法で単離することができる。ｍｓＤＮＡ
は、この分子が一本鎖のＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分か
ら構成されているという事実にもかかわらず、安定であ
る。ｍｓＲＮＡがこのように安定なのは、枝分かれ構造
によって、ＤＮＡの５’末端、ならびに枝分かれグアノ
シン残基以降のＲＮＡ分子が保護され、そして、３’末
端にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成されているため
であると考えられる。各種のｍｓＤＮＡ分子を分析する
と、そのヌクレオチド配列が極めて多岐にわたってお
り、ＤＮＡ鎖にもＲＮＡ鎖にも、一次的な配列の類似性
がほとんど、あるいはまったくないことがわかる。しか
し、ｍｓＤＮＡは、構造は異なっていても、本明細書に
記載したような重要な一次構造ならびに二次構造をいず
れも共通に有している。
【００６０】本発明のｍｓＤＮＡは、レトロンと称する
遺伝的要素によってコードされている。このレトロン
は、３つの別々の領域、すなわち、ｍｓＤＮＡのＲＮＡ
部分をコードするｍｓｒ領域、ｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分
をコードするｍｓｄ領域、そして逆転写酵素（ＲＴ）活
性を有するポリペプチドをコードするオープン・リーデ
ィング・フレーム（ＯＲＦ）から構成されている。ｍｓ
ＤＮＡの一種（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７）では、オープン
・リーディング・フレームは、リボヌクレアーゼＨ（Ｒ
ＮアーゼＨ）活性を有する逆転写酵素をコードしてい
る。なお、今後発見されるｍｓＤＮＡが、同様に、ＲＮ
アーゼＨ領域を含む逆転写酵素によって合成されること
を排除するものではない。上述の３種の要素は、単一の
オペロン上に位置していてもよいし、また、ｍｓｒ−ｍ
ｓｄ領域が逆転写酵素遺伝子とは離れた位置にあって、
なおかつ逆転写酵素遺伝子と協調して作用してｍｓＤＮ
Ａを合成してもよい。ｍｓｒ−ｍｓｄ領域、ならびにｍ
ｓｒ−ｍｓｄ領域および逆転写酵素遺伝子は、単一のプ
ロモーターの制御のもとで発現しても、逆転写酵素遺伝
子が別のプロモーターによって発現してもよい。
遺伝的要素によってコードされている。このレトロン
は、３つの別々の領域、すなわち、ｍｓＤＮＡのＲＮＡ
部分をコードするｍｓｒ領域、ｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分
をコードするｍｓｄ領域、そして逆転写酵素（ＲＴ）活
性を有するポリペプチドをコードするオープン・リーデ
ィング・フレーム（ＯＲＦ）から構成されている。ｍｓ
ＤＮＡの一種（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７）では、オープン
・リーディング・フレームは、リボヌクレアーゼＨ（Ｒ
ＮアーゼＨ）活性を有する逆転写酵素をコードしてい
る。なお、今後発見されるｍｓＤＮＡが、同様に、ＲＮ
アーゼＨ領域を含む逆転写酵素によって合成されること
を排除するものではない。上述の３種の要素は、単一の
オペロン上に位置していてもよいし、また、ｍｓｒ−ｍ
ｓｄ領域が逆転写酵素遺伝子とは離れた位置にあって、
なおかつ逆転写酵素遺伝子と協調して作用してｍｓＤＮ
Ａを合成してもよい。ｍｓｒ−ｍｓｄ領域、ならびにｍ
ｓｒ−ｍｓｄ領域および逆転写酵素遺伝子は、単一のプ
ロモーターの制御のもとで発現しても、逆転写酵素遺伝
子が別のプロモーターによって発現してもよい。
【００６１】ｍｓｒおよびｍｓｄ領域が転写されること
によって、一次転写産物であるプレ−ｍｓｄＲＮＡが得
られる。この一次転写産物は、レトロンの３つの領域、
すなわち、ｍｓｒ領域、ｍｓｄ領域、およびオープン・
リーディング・フレーム領域のすべてを包含している。
この点については以下でさらに説明する。
によって、一次転写産物であるプレ−ｍｓｄＲＮＡが得
られる。この一次転写産物は、レトロンの３つの領域、
すなわち、ｍｓｒ領域、ｍｓｄ領域、およびオープン・
リーディング・フレーム領域のすべてを包含している。
この点については以下でさらに説明する。
【００６２】ｍｓＤＮＡが有する共通の特徴である、
ａ）連続したＲＮＡ鎖内のグアノシン残基との間に形成
された２’，５’−ホスホジエステル結合、ｂ）ＲＮＡ
部分ならびにＤＮＡ部分が有する安定した二次構造、そ
してｃ）ＲＮＡ鎖ならびにＤＮＡ鎖の３’末端に位置す
るＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド構造が、下記の式Ｉ：
ａ）連続したＲＮＡ鎖内のグアノシン残基との間に形成
された２’，５’−ホスホジエステル結合、ｂ）ＲＮＡ
部分ならびにＤＮＡ部分が有する安定した二次構造、そ
してｃ）ＲＮＡ鎖ならびにＤＮＡ鎖の３’末端に位置す
るＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド構造が、下記の式Ｉ：
【００６３】
【化３】 から見てとれる。式中の記号は以下に示す意味を有する
ものである。Ｘは、ＲＮＡ鎖ならびにＤＮＡ鎖の相補的
な塩基同士が重なりあった３’末端を示す。Ｙは、ＲＮ
Ａ部分の枝分かれグアノシン残基に結合したＤＮＡ鎖の
５’末端の、ステム・ループ構造のステムに含まれない
（別の塩基に対して相補的でない）最初のヌクレオチド
から、５’末端の最後のヌクレオチドまでで画定される
部分を示す。Ｚは、ステム・ループ構造のステムの一部
で、グアノシン残基を含む部分を示す。Ｓは、ＤＮＡ部
分の代表的なステム・ループ構造の部分を示す。Ｌは、
ＲＮＡ部分のステム・ループ構造の部分を示す。Ｗは、
ｍｓＤＮＡ分子のＲＮＡ部分の、内部グアノシン残基か
ら、ステム・ループ構造（すなわち、２つ以上のステム
・ループ構造が存在する場合には最初のステム・ループ
構造）の最初のヌクレオチドまでのＲＮＡ鎖部分を示
す。Ｗ1 、Ｗ2 、Ｗ3 等は、ＲＮＡ鎖のＷ部分に２つ以
上のステム・ループ構造が存在する場合に、ＲＮＡ鎖の
２つの隣接したステム・ループ構造の間のＲＮＡ鎖部分
を示す。鎖の長さはいずれもヌクレオチドの数で測定し
たものである。Ｖは、相補的塩基部分（Ｘ）と、（ＲＮ
Ａ部分のステム・ループ構造の）ステムの最初のヌクレ
オチド、すなわち、ＲＮＡ鎖の３’末端に最も近接した
ステム・ループ構造の最初のヌクレオチドと、ＲＮＡ鎖
の３’末端の最初の相補的塩基との間に延在（あるいは
位置）するＲＮＡ鎖部分を示す。鎖の長さはいずれもヌ
クレオチドの数で測定したものである。Ｑは、ＤＮＡ鎖
の３’末端の相補的塩基部分（Ｘ）と、（ＤＮＡ部分の
ステム・ループ構造の）ステムの最初のヌクレオチドと
の間に延在（あるいは位置）するＤＮＡの、最後の
（３’末端と最も離れた）相補的塩基から、最初のステ
ム・ループ構造の最初のヌクレオチドまでのＤＮＡ鎖部
分を示す。Ｑ1 、Ｑ2 、Ｑ3 等は、ｍｓＤＮＡ分子のＤ
ＮＡ鎖のＱ部分に２つ以上のステム・ループ構造が存在
する場合に、Ｑ部分の２つの隣接したステム・ループ構
造の間の鎖部分を示す。鎖の長さはいずれもヌクレオチ
ドの数で測定したものである。
ものである。Ｘは、ＲＮＡ鎖ならびにＤＮＡ鎖の相補的
な塩基同士が重なりあった３’末端を示す。Ｙは、ＲＮ
Ａ部分の枝分かれグアノシン残基に結合したＤＮＡ鎖の
５’末端の、ステム・ループ構造のステムに含まれない
（別の塩基に対して相補的でない）最初のヌクレオチド
から、５’末端の最後のヌクレオチドまでで画定される
部分を示す。Ｚは、ステム・ループ構造のステムの一部
で、グアノシン残基を含む部分を示す。Ｓは、ＤＮＡ部
分の代表的なステム・ループ構造の部分を示す。Ｌは、
ＲＮＡ部分のステム・ループ構造の部分を示す。Ｗは、
ｍｓＤＮＡ分子のＲＮＡ部分の、内部グアノシン残基か
ら、ステム・ループ構造（すなわち、２つ以上のステム
・ループ構造が存在する場合には最初のステム・ループ
構造）の最初のヌクレオチドまでのＲＮＡ鎖部分を示
す。Ｗ1 、Ｗ2 、Ｗ3 等は、ＲＮＡ鎖のＷ部分に２つ以
上のステム・ループ構造が存在する場合に、ＲＮＡ鎖の
２つの隣接したステム・ループ構造の間のＲＮＡ鎖部分
を示す。鎖の長さはいずれもヌクレオチドの数で測定し
たものである。Ｖは、相補的塩基部分（Ｘ）と、（ＲＮ
Ａ部分のステム・ループ構造の）ステムの最初のヌクレ
オチド、すなわち、ＲＮＡ鎖の３’末端に最も近接した
ステム・ループ構造の最初のヌクレオチドと、ＲＮＡ鎖
の３’末端の最初の相補的塩基との間に延在（あるいは
位置）するＲＮＡ鎖部分を示す。鎖の長さはいずれもヌ
クレオチドの数で測定したものである。Ｑは、ＤＮＡ鎖
の３’末端の相補的塩基部分（Ｘ）と、（ＤＮＡ部分の
ステム・ループ構造の）ステムの最初のヌクレオチドと
の間に延在（あるいは位置）するＤＮＡの、最後の
（３’末端と最も離れた）相補的塩基から、最初のステ
ム・ループ構造の最初のヌクレオチドまでのＤＮＡ鎖部
分を示す。Ｑ1 、Ｑ2 、Ｑ3 等は、ｍｓＤＮＡ分子のＤ
ＮＡ鎖のＱ部分に２つ以上のステム・ループ構造が存在
する場合に、Ｑ部分の２つの隣接したステム・ループ構
造の間の鎖部分を示す。鎖の長さはいずれもヌクレオチ
ドの数で測定したものである。
【００６４】以上の各部分の長さは、いずれも、個々の
ｍｓＤＮＡ分子によって相当程度変わるものである。
ｍｓＤＮＡ分子によって相当程度変わるものである。
【００６５】ＤＮＡ部分ならびにＲＮＡ部分に存在する
ステム・ループ構造の数は、レトロンのｍｓｄ領域なら
びにｍｓｒ領域中に存在する逆方向反復塩基配列の数に
応じて変化する。しかし、ステム・ループ構造が存在す
ることは、必ずしも必須ではない。逆方向反復塩基配列
が非相補的な塩基を有する場合には、この事実は、図中
で、ステムのループあるいは非対合塩基で示されるよう
に、各ステム・ループ構造のステム部分に反映されるこ
とになる。このような非対合ループが一つ以上存在して
も構わない。
ステム・ループ構造の数は、レトロンのｍｓｄ領域なら
びにｍｓｒ領域中に存在する逆方向反復塩基配列の数に
応じて変化する。しかし、ステム・ループ構造が存在す
ることは、必ずしも必須ではない。逆方向反復塩基配列
が非相補的な塩基を有する場合には、この事実は、図中
で、ステムのループあるいは非対合塩基で示されるよう
に、各ステム・ループ構造のステム部分に反映されるこ
とになる。このような非対合ループが一つ以上存在して
も構わない。
【００６６】Ｘの長さは、本明細書でも説明するよう
に、各鎖の３’末端を構成する逆方向反復塩基配列がど
の程度重なっているかに応じて変化する。同様に、Ｚお
よび／またはＹおよび／またはＬの長さも、個々のｍｓ
ＤＮＡによって相当程度変化するものである。
に、各鎖の３’末端を構成する逆方向反復塩基配列がど
の程度重なっているかに応じて変化する。同様に、Ｚお
よび／またはＹおよび／またはＬの長さも、個々のｍｓ
ＤＮＡによって相当程度変化するものである。
【００６７】公知のｍｓＤＮＡのＸの長さ（ヌクレオチ
ドの数）は、５−１１の範囲である。Ｘの長さは、Ｅｃ
７３では５、Ｍｓ６５およびＥｃ１０７では６、Ｅｃ６
７では７、Ｍｘ１６２およびＳａ１６３では８、そして
Ｅｃ８６では１１である。Ｘの長さ（ヌクレオチドの
数）は、上述の範囲を越えて変化することもある。
ドの数）は、５−１１の範囲である。Ｘの長さは、Ｅｃ
７３では５、Ｍｓ６５およびＥｃ１０７では６、Ｅｃ６
７では７、Ｍｘ１６２およびＳａ１６３では８、そして
Ｅｃ８６では１１である。Ｘの長さ（ヌクレオチドの
数）は、上述の範囲を越えて変化することもある。
【００６８】公知のｍｓＤＮＡのＹの長さ（ヌクレオチ
ドの数）は、７−６９の範囲である。Ｙの長さは、Ｅｃ
７３およびＥｃ１０７では７、Ｍｘ１６２およびＳａ１
６３では１３、Ｅｃ８６では１５、Ｍｓ６５では１６、
そしてＥｃ６７では１９である。Ｙの長さ（ヌクレオチ
ドの数）は、Ｙｅ１１７では６９である。
ドの数）は、７−６９の範囲である。Ｙの長さは、Ｅｃ
７３およびＥｃ１０７では７、Ｍｘ１６２およびＳａ１
６３では１３、Ｅｃ８６では１５、Ｍｓ６５では１６、
そしてＥｃ６７では１９である。Ｙの長さ（ヌクレオチ
ドの数）は、Ｙｅ１１７では６９である。
【００６９】基本的な共通の一定の特徴に影響が及ぶこ
とがないならば、他のｍｓＤＮＡが、これより長い、あ
るいは短いＹを有することもできると考えられる。
とがないならば、他のｍｓＤＮＡが、これより長い、あ
るいは短いＹを有することもできると考えられる。
【００７０】公知のｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分に存在する
ステム・ループ構造（Ｓ）の数は１である。公知のｍｓ
ＤＮＡのＳの長さ（ヌクレオチドの数）は、３４−１３
６の範囲である。Ｓの長さ（ヌクレオチドの数）は、Ｅ
ｃ６７およびＹｅ１１７では３４、Ｍｘ６５では３５、
Ｅｃ８６では５３、Ｅｃ７３では５６、そしてＥｃ１０
７では８９である。Ｓの長さ（ヌクレオチドの数）は、
Ｍｘ１６２およびＳａ１６３では１３６である。
ステム・ループ構造（Ｓ）の数は１である。公知のｍｓ
ＤＮＡのＳの長さ（ヌクレオチドの数）は、３４−１３
６の範囲である。Ｓの長さ（ヌクレオチドの数）は、Ｅ
ｃ６７およびＹｅ１１７では３４、Ｍｘ６５では３５、
Ｅｃ８６では５３、Ｅｃ７３では５６、そしてＥｃ１０
７では８９である。Ｓの長さ（ヌクレオチドの数）は、
Ｍｘ１６２およびＳａ１６３では１３６である。
【００７１】本発明のｍｓＤＮＡのＲＮＡ部分に存在す
るステム・ループ構造（Ｌ）の数は１以上である。本発
明のｍｓＤＮＡのＬの長さ（ヌクレオチドの数）は、９
−２６の範囲である。Ｌの長さは、Ｅｃ８６では９およ
び１８、Ｍｘ６５では１８、Ｅｃ６７およびＹｅ１１７
では２６、Ｍｘ１６２およびＳａ１６３では１５および
２０、Ｅｃ１０７では２０および２０、そしてＥｃ７３
では１０および１５である。他のｍｓＤＮＡが、ＤＮＡ
部分および／またはＲＮＡ部分に、さらに多くの、そし
て／または長さの異なったステム・ループ構造を有する
こともできると考えられる。
るステム・ループ構造（Ｌ）の数は１以上である。本発
明のｍｓＤＮＡのＬの長さ（ヌクレオチドの数）は、９
−２６の範囲である。Ｌの長さは、Ｅｃ８６では９およ
び１８、Ｍｘ６５では１８、Ｅｃ６７およびＹｅ１１７
では２６、Ｍｘ１６２およびＳａ１６３では１５および
２０、Ｅｃ１０７では２０および２０、そしてＥｃ７３
では１０および１５である。他のｍｓＤＮＡが、ＤＮＡ
部分および／またはＲＮＡ部分に、さらに多くの、そし
て／または長さの異なったステム・ループ構造を有する
こともできると考えられる。
【００７２】ｍｓＤＮＡ中のヌクレオチドの総数は、極
めて広い範囲に及ぶものである。現在のところ、公知の
ｍｓＤＮＡのヌクレオチド数は１１４−２３９の範囲で
ある。同様に、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分のヌクレオ
チドの数も、それぞれ４９−８２、および６５−１６３
の範囲で変化する。ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分の一方
あるいは双方のヌクレオチドの数を変更する、すなわち
延長あるいは短縮することも可能で、この種のさらに大
型あるいは小型のｍｓＤＮＡを、インビボあるいはイン
ビトロで合成したｍｓＤＮＡから生成することもでき
る。
めて広い範囲に及ぶものである。現在のところ、公知の
ｍｓＤＮＡのヌクレオチド数は１１４−２３９の範囲で
ある。同様に、ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分のヌクレオ
チドの数も、それぞれ４９−８２、および６５−１６３
の範囲で変化する。ＲＮＡ部分およびＤＮＡ部分の一方
あるいは双方のヌクレオチドの数を変更する、すなわち
延長あるいは短縮することも可能で、この種のさらに大
型あるいは小型のｍｓＤＮＡを、インビボあるいはイン
ビトロで合成したｍｓＤＮＡから生成することもでき
る。
【００７３】本明細書では以下のｍｓＤＮＡを例示する
ものである。１６２個のＤＮＡヌクレオチドと、７７個
のＲＮＡヌクレオチドを有するＭｘ１６２；６５個のＤ
ＮＡヌクレオチドと、４９個のＲＮＡヌクレオチドを有
するＭｘ６５；１６３個のＤＮＡヌクレオチドと、７６
個のＲＮＡヌクレオチドを有するＳａ１６３；６７個の
ＤＮＡヌクレオチドと、５８個のＲＮＡヌクレオチドを
有するＥｃ６７；８６個のＤＮＡヌクレオチドと、８２
個のＲＮＡヌクレオチドを有するＥｃ８６；７３個のＤ
ＮＡヌクレオチドと、７５個のＲＮＡヌクレオチドを有
するＥｃ７３；１０７個のＤＮＡヌクレオチドと、７５
個のＲＮＡヌクレオチドを有するＥｃ１０７；合計で１
７５個のヌクレオチド（１１７個のＤＮＡヌクレオチド
と、５８個のＲＮＡヌクレオチド）を有するｍｓＤＮＡ
−Ｙｅ；合計で１４３個のヌクレオチド（８３個のＤＮ
Ａヌクレオチドと、６０個のＲＮＡヌクレオチド）を有
するｍｓＤＮＡ−１００；ならびに合計で１３０個のヌ
クレオチド（７０個のＤＮＡヌクレオチドと、６０個の
ＲＮＡヌクレオチド）を有するｍｓＤＮＡ−１０１。
ものである。１６２個のＤＮＡヌクレオチドと、７７個
のＲＮＡヌクレオチドを有するＭｘ１６２；６５個のＤ
ＮＡヌクレオチドと、４９個のＲＮＡヌクレオチドを有
するＭｘ６５；１６３個のＤＮＡヌクレオチドと、７６
個のＲＮＡヌクレオチドを有するＳａ１６３；６７個の
ＤＮＡヌクレオチドと、５８個のＲＮＡヌクレオチドを
有するＥｃ６７；８６個のＤＮＡヌクレオチドと、８２
個のＲＮＡヌクレオチドを有するＥｃ８６；７３個のＤ
ＮＡヌクレオチドと、７５個のＲＮＡヌクレオチドを有
するＥｃ７３；１０７個のＤＮＡヌクレオチドと、７５
個のＲＮＡヌクレオチドを有するＥｃ１０７；合計で１
７５個のヌクレオチド（１１７個のＤＮＡヌクレオチド
と、５８個のＲＮＡヌクレオチド）を有するｍｓＤＮＡ
−Ｙｅ；合計で１４３個のヌクレオチド（８３個のＤＮ
Ａヌクレオチドと、６０個のＲＮＡヌクレオチド）を有
するｍｓＤＮＡ−１００；ならびに合計で１３０個のヌ
クレオチド（７０個のＤＮＡヌクレオチドと、６０個の
ＲＮＡヌクレオチド）を有するｍｓＤＮＡ−１０１。
【００７４】ｍｓＤＮＡのまた別の変数は、ＤＮＡ鎖の
３’末端とＲＮＡ鎖の３’末端にそれぞれ位置する相補
的なヌクレオチド同士の、互いに非共有結合的に結合し
た重なりである。これまでのところ、相補的なヌクレオ
チドの重なりの数の最低は５、最高は１１である。たと
えば、Ｅｃ７３は５個、Ｍｘ６５およびＥｃ１０７は６
個、Ｅｃ６７、ｍｓＤＮＡ−１００、１０１、およびＹ
ｅ１１７は７個、Ｍｓ１６２およびＳａ１６３は８個、
そしてＥｃ８６は１１個の塩基が重なっている。ＲＮＡ
鎖の５’末端については、内部枝分かれグアノシン残基
までの鎖の長さが変化する。これまでわかっているとこ
ろでは、ＲＮＡの５’末端からグアノシンヌクレオチド
残基までの残基の数の最低は３、最高は１９である。Ｍ
ｘ６５では、ＲＮＡ鎖の５’末端の枝分かれグアノシン
残基の位置は、５’末端から数えて４である。枝分かれ
グアノシン残基は、Ｅｃ８６では１４、Ｅｃ６７および
Ｅｃ７３では１５、Ｅｃ１０７では１８、Ｓａ１６３で
は１９、Ｍｘ１６２では２０、そしてｍｓＤＮＡ−１０
０、１０１、およびＹｅ１１７では１５の位置に位置し
ている。
３’末端とＲＮＡ鎖の３’末端にそれぞれ位置する相補
的なヌクレオチド同士の、互いに非共有結合的に結合し
た重なりである。これまでのところ、相補的なヌクレオ
チドの重なりの数の最低は５、最高は１１である。たと
えば、Ｅｃ７３は５個、Ｍｘ６５およびＥｃ１０７は６
個、Ｅｃ６７、ｍｓＤＮＡ−１００、１０１、およびＹ
ｅ１１７は７個、Ｍｓ１６２およびＳａ１６３は８個、
そしてＥｃ８６は１１個の塩基が重なっている。ＲＮＡ
鎖の５’末端については、内部枝分かれグアノシン残基
までの鎖の長さが変化する。これまでわかっているとこ
ろでは、ＲＮＡの５’末端からグアノシンヌクレオチド
残基までの残基の数の最低は３、最高は１９である。Ｍ
ｘ６５では、ＲＮＡ鎖の５’末端の枝分かれグアノシン
残基の位置は、５’末端から数えて４である。枝分かれ
グアノシン残基は、Ｅｃ８６では１４、Ｅｃ６７および
Ｅｃ７３では１５、Ｅｃ１０７では１８、Ｓａ１６３で
は１９、Ｍｘ１６２では２０、そしてｍｓＤＮＡ−１０
０、１０１、およびＹｅ１１７では１５の位置に位置し
ている。
【００７５】逆方向反復塩基配列（ａ１およびａ２）
も、各種の長さのものがある。これまでわかっていると
ころでは、逆方向反復塩基配列の長さの最低は１２、最
高は３４である。レトロンの逆方向反復塩基配列の長さ
は、Ｅｃ８６では１２、Ｅｃ６７およびＥｃ７３では１
３、Ｍｘ６５では１５、Ｅｃ１０７では１６、Ｓａ１６
３では３３、Ｍｘ１６２では３４である。
も、各種の長さのものがある。これまでわかっていると
ころでは、逆方向反復塩基配列の長さの最低は１２、最
高は３４である。レトロンの逆方向反復塩基配列の長さ
は、Ｅｃ８６では１２、Ｅｃ６７およびＥｃ７３では１
３、Ｍｘ６５では１５、Ｅｃ１０７では１６、Ｓａ１６
３では３３、Ｍｘ１６２では３４である。
【００７６】同様に、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域とオープン・
リーディング・フレームとの間の距離も、個々のｍｓＤ
ＮＡによって有意に変化する。これまでわかっていると
ころでは、ｍｓｄとオープン・リーディング・フレーム
との間の距離の最低は１９、最高は７７である。たとえ
ば、オープン・リーディング・フレームとｍｓｄとの間
に、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ８６では１９個、Ｍｘ６５では、
２８個、Ｅｃ１０７では５０個、Ｅｃ６７では５１個、
Ｅｃ７３では５３個、そしてＭｘ１６２では７７個のヌ
クレオチドが介在する。
リーディング・フレームとの間の距離も、個々のｍｓＤ
ＮＡによって有意に変化する。これまでわかっていると
ころでは、ｍｓｄとオープン・リーディング・フレーム
との間の距離の最低は１９、最高は７７である。たとえ
ば、オープン・リーディング・フレームとｍｓｄとの間
に、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ８６では１９個、Ｍｘ６５では、
２８個、Ｅｃ１０７では５０個、Ｅｃ６７では５１個、
Ｅｃ７３では５３個、そしてＭｘ１６２では７７個のヌ
クレオチドが介在する。
【００７７】本発明のｍｓＤＮＡが有する種々の共通の
特徴については、これらを列挙して示す表１を参照され
たい。
特徴については、これらを列挙して示す表１を参照され
たい。
【００７８】
【表１】
【００７９】ｍｓＤＮＡの本質的な機能的構成成分、す
なわち、ｍｓＤＮＡを合成し、使用する際に必須の構成
成分が保持されるならば、ｍｓＤＮＡの他の成分を必要
に応じて変化させることもできる。すなわち、レトロン
が位置しているヌクレオチド鎖上のｍｓｒおよび／ある
いはｍｓｄ領域、またはこの領域の外側で挿入および／
または欠失が生じると、包括的特徴を共有する各種のｍ
ｓＤＮＡの変種が生じることになる。
なわち、ｍｓＤＮＡを合成し、使用する際に必須の構成
成分が保持されるならば、ｍｓＤＮＡの他の成分を必要
に応じて変化させることもできる。すなわち、レトロン
が位置しているヌクレオチド鎖上のｍｓｒおよび／ある
いはｍｓｄ領域、またはこの領域の外側で挿入および／
または欠失が生じると、包括的特徴を共有する各種のｍ
ｓＤＮＡの変種が生じることになる。
【００８０】以下で説明するように、たとえば、（ｍｓ
ｄおよび／またはｍｓｒ遺伝子への適当な挿入を行うこ
とによって）ＤＮＡ部分および／またはＲＮＡ部分の任
意の位置にヌクレオチド配列を挿入すると、アンチセン
スのベクターとすることが可能な極めて有用なｍｓＤＮ
Ａを生成することができる。
ｄおよび／またはｍｓｒ遺伝子への適当な挿入を行うこ
とによって）ＤＮＡ部分および／またはＲＮＡ部分の任
意の位置にヌクレオチド配列を挿入すると、アンチセン
スのベクターとすることが可能な極めて有用なｍｓＤＮ
Ａを生成することができる。
【００８１】また、上述のヌクレオチド数の範囲ならび
にヌクレオチドの数は、図６（ｈ）のＹｅ１１７につい
て以外は、ｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分および／またはＲＮ
Ａ部分に挿入することのできる外来のＤＮＡあるいはＲ
ＮＡ断片、または最終ｍｓＤＮＡ中にステム・ループ構
造としてみいだされる遺伝子を含むものではないことに
も注意されたい。
にヌクレオチドの数は、図６（ｈ）のＹｅ１１７につい
て以外は、ｍｓＤＮＡのＤＮＡ部分および／またはＲＮ
Ａ部分に挿入することのできる外来のＤＮＡあるいはＲ
ＮＡ断片、または最終ｍｓＤＮＡ中にステム・ループ構
造としてみいだされる遺伝子を含むものではないことに
も注意されたい。
【００８２】ｍｓｒ−ｍｓｄ領域（またはｍｓｒあるい
はｍｓｄ領域）（またはその外側の領域）に変異が生じ
ると、ＲＮＡ転写産物にも対応する変異が生じる。（無
細胞系中の）ｄＮＴＰを変化させると、分子のＲＮＡ部
分が変化する。基本的なｍｓＤＮＡのこうした変種は、
いずれも、本発明の範囲に包含されるものである。たと
えば、ｍｓＤＮＡの無細胞合成の際にＲＮアーゼＡを反
応混合物に加えないと、ＲＮＡ部分であると考えられる
部分に二本鎖部分が含まれるｍｓＤＮＡが形成される。
ｍｓＤＮＡ分子に包括的に含まれるこれらの変種ならび
にこれら以外の変種は、いずれも、本発明の範囲に包含
されるものである。
はｍｓｄ領域）（またはその外側の領域）に変異が生じ
ると、ＲＮＡ転写産物にも対応する変異が生じる。（無
細胞系中の）ｄＮＴＰを変化させると、分子のＲＮＡ部
分が変化する。基本的なｍｓＤＮＡのこうした変種は、
いずれも、本発明の範囲に包含されるものである。たと
えば、ｍｓＤＮＡの無細胞合成の際にＲＮアーゼＡを反
応混合物に加えないと、ＲＮＡ部分であると考えられる
部分に二本鎖部分が含まれるｍｓＤＮＡが形成される。
ｍｓＤＮＡ分子に包括的に含まれるこれらの変種ならび
にこれら以外の変種は、いずれも、本発明の範囲に包含
されるものである。
【００８３】ｍｓＤＮＡは、レトロンと称されるレトロ
要素によってコードされている。レトロンは、ｍｓｒ遺
伝子とｍｓｄ遺伝子を含んでおり、これらはそれぞれ、
ｍｓＤＮＡのＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖をコードしている。こ
れらの２つの遺伝子は、逆向きに位置している。レトロ
ンは、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有するポリペプチドを
コードするオープン・リーディング・フレームも含んで
いる。オープン・リーディング・フレームの開始コドン
は、Ｅｃ８６のような特定のｍｓＤＮＡでは、ｍｓｄ遺
伝子の開始地点から１９塩基対という近接した位置に位
置しているが、別のｍｓＤＮＡ、たとえばＭｘ１６２で
は７７塩基対という離れた位置に位置している。オープ
ン・リーディング・フレームはｍｓｄの上流側に位置し
ているが、ｍｓｄ座の下流側に位置していてもよい（し
たがって、ｍｓｒ座のそれぞれ下流側および上流側に位
置していてもよい）。オープン・リーディング・フレー
ムが、ｍｓｒ領域の前側、すなわち上流側に位置してい
る場合には、真核生物、たとえば酵母では、ｍｓＤＮＡ
の収量が増大する。
要素によってコードされている。レトロンは、ｍｓｒ遺
伝子とｍｓｄ遺伝子を含んでおり、これらはそれぞれ、
ｍｓＤＮＡのＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖をコードしている。こ
れらの２つの遺伝子は、逆向きに位置している。レトロ
ンは、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有するポリペプチドを
コードするオープン・リーディング・フレームも含んで
いる。オープン・リーディング・フレームの開始コドン
は、Ｅｃ８６のような特定のｍｓＤＮＡでは、ｍｓｄ遺
伝子の開始地点から１９塩基対という近接した位置に位
置しているが、別のｍｓＤＮＡ、たとえばＭｘ１６２で
は７７塩基対という離れた位置に位置している。オープ
ン・リーディング・フレームはｍｓｄの上流側に位置し
ているが、ｍｓｄ座の下流側に位置していてもよい（し
たがって、ｍｓｒ座のそれぞれ下流側および上流側に位
置していてもよい）。オープン・リーディング・フレー
ムが、ｍｓｒ領域の前側、すなわち上流側に位置してい
る場合には、真核生物、たとえば酵母では、ｍｓＤＮＡ
の収量が増大する。
【００８４】ｍｓＤＮＡは、これよりはるかに長いＲＮ
Ａ前駆体（プレ−ｍｓｄＲＮＡ）から誘導され、このＲ
ＮＡ前駆体は、極めて安定なステム・ループ構造を形成
することが示されている。プレ−ｍｓｄＲＮＡのこのス
テム・ループ構造は、ｍｓＤＮＡの合成を開始する際の
プライマーの役目を果たし、同時に、枝分かれＲＮＡと
結合したｍｓＤＮＡを形成する際の鋳型の役目も果た
す。プレ−ｍｓｄＲＮＡが形成される際のレトロンのｍ
ｓｄ−ｍｓｒ領域の転写は、ｍｓｒの５’末端、あるい
は５’末端付近で開始し、したがって、ｍｓｒの上流側
領域から、ｍｓｄを越えて、オープン・リーディング・
フレームまで進行する。ｍｓｒ−ｍｓｄ転写産物の５’
末端の配列（塩基１−１３）は、同一転写産物の３’末
端の配列とともに二重螺旋を形成し、この部分が、逆転
写酵素によるｍｓＤＮＡの合成の際のプライマーならび
に鋳型の役目をはたす。ｍｓｒ−ｍｓｄ領域のプロモー
ターはｍｓｒの上流側に位置しており、転写は左側から
右側に向かって進行し、ｍｓｒ領域の下流側に位置する
逆転写酵素遺伝子までを含む全領域にわたって進行す
る。
Ａ前駆体（プレ−ｍｓｄＲＮＡ）から誘導され、このＲ
ＮＡ前駆体は、極めて安定なステム・ループ構造を形成
することが示されている。プレ−ｍｓｄＲＮＡのこのス
テム・ループ構造は、ｍｓＤＮＡの合成を開始する際の
プライマーの役目を果たし、同時に、枝分かれＲＮＡと
結合したｍｓＤＮＡを形成する際の鋳型の役目も果た
す。プレ−ｍｓｄＲＮＡが形成される際のレトロンのｍ
ｓｄ−ｍｓｒ領域の転写は、ｍｓｒの５’末端、あるい
は５’末端付近で開始し、したがって、ｍｓｒの上流側
領域から、ｍｓｄを越えて、オープン・リーディング・
フレームまで進行する。ｍｓｒ−ｍｓｄ転写産物の５’
末端の配列（塩基１−１３）は、同一転写産物の３’末
端の配列とともに二重螺旋を形成し、この部分が、逆転
写酵素によるｍｓＤＮＡの合成の際のプライマーならび
に鋳型の役目をはたす。ｍｓｒ−ｍｓｄ領域のプロモー
ターはｍｓｒの上流側に位置しており、転写は左側から
右側に向かって進行し、ｍｓｒ領域の下流側に位置する
逆転写酵素遺伝子までを含む全領域にわたって進行す
る。
【００８５】本明細書に記載する逆転写酵素は、内部グ
アノシン残基の２’−ＯＨ基と、最初の三燐酸デオキシ
リボヌクレオチドの５’−燐酸基との間に枝分かれ結合
を形成することができる。この逆転写酵素が有するこの
独特かつ極めてめずらしい特性については、以下でｍｓ
ＤＮＡの合成について説明する際に、さらに説明する。
アノシン残基の２’−ＯＨ基と、最初の三燐酸デオキシ
リボヌクレオチドの５’−燐酸基との間に枝分かれ結合
を形成することができる。この逆転写酵素が有するこの
独特かつ極めてめずらしい特性については、以下でｍｓ
ＤＮＡの合成について説明する際に、さらに説明する。
【００８６】ｍｓＤＮＡの合成の推定上のメカニズムで
は、レトロンのｍｓｒ領域の上流から（ｍｓｒ領域を含
む）始まり、ｍｓｄ領域まで（ｍｓｄ領域を含む）至
り、さらに逆転写酵素をコードするオープン・リーディ
ング・フレームに至る転写によって、長いｍＲＮＡ一次
転写産物が転写され、このｍＲＮＡ一次転写産物が、２
つの逆方向反復塩基配列によって、その間で安定なステ
ム・ループ構造に折りたたまれ、この折りたたまれたｍ
ＲＮＡ転写産物が、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成の際
のプライマーならびに鋳型として機能し、内部グアノシ
ン残基の２’−ＯＨ基とｃＤＮＡ鎖の最初のデオキシリ
ボヌクレオチドの５’−燐酸基との間に枝分かれ結合を
形成し、折りたたまれたＲＮＡを鋳型として使用するこ
とにより逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成を継続し、そ
の際、ＲＮアーゼＨのプロセシングによって、成長する
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重螺旋内部でＲＮＡ鋳型が取り除か
れ、そしてｍｓＤＮＡの合成が停止する。ＲＮアーゼの
活性は、逆転写酵素の活性に付随すると考えられるが、
必ずしもそうでなくともかまわない。
は、レトロンのｍｓｒ領域の上流から（ｍｓｒ領域を含
む）始まり、ｍｓｄ領域まで（ｍｓｄ領域を含む）至
り、さらに逆転写酵素をコードするオープン・リーディ
ング・フレームに至る転写によって、長いｍＲＮＡ一次
転写産物が転写され、このｍＲＮＡ一次転写産物が、２
つの逆方向反復塩基配列によって、その間で安定なステ
ム・ループ構造に折りたたまれ、この折りたたまれたｍ
ＲＮＡ転写産物が、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成の際
のプライマーならびに鋳型として機能し、内部グアノシ
ン残基の２’−ＯＨ基とｃＤＮＡ鎖の最初のデオキシリ
ボヌクレオチドの５’−燐酸基との間に枝分かれ結合を
形成し、折りたたまれたＲＮＡを鋳型として使用するこ
とにより逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成を継続し、そ
の際、ＲＮアーゼＨのプロセシングによって、成長する
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重螺旋内部でＲＮＡ鋳型が取り除か
れ、そしてｍｓＤＮＡの合成が停止する。ＲＮアーゼの
活性は、逆転写酵素の活性に付随すると考えられるが、
必ずしもそうでなくともかまわない。
【００８７】この逆転写酵素は、プライマーとしても鋳
型としても機能する折りたたまれた一次転写産物を利用
し、ｃＤＮＡ分子（この場合、ｍｓＤＮＡ分子）の最初
のデオキシリボヌクレオチド残基と、その特定のｍｓＤ
ＮＡの内部グアノシン残基（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の場
合には１５番目の残基）との間に独特の２’，５’−結
合を形成することをもって合成を開始することによっ
て、単独でｃＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ分子）を合成すること
ができる。
型としても機能する折りたたまれた一次転写産物を利用
し、ｃＤＮＡ分子（この場合、ｍｓＤＮＡ分子）の最初
のデオキシリボヌクレオチド残基と、その特定のｍｓＤ
ＮＡの内部グアノシン残基（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の場
合には１５番目の残基）との間に独特の２’，５’−結
合を形成することをもって合成を開始することによっ
て、単独でｃＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ分子）を合成すること
ができる。
【００８８】この挙動は、３’，５’−結合をもって合
成を開始することが報告されている公知のレトロウイル
スの逆転写酵素とは対照的である。
成を開始することが報告されている公知のレトロウイル
スの逆転写酵素とは対照的である。
【００８９】ｍｓｒ−ｍｓｄ領域からの一次転写産物
は、枝分かれグアノシン残基のすぐ上流の領域と、ｍｓ
ｄの上流の領域との間で、グアノシン残基がステム構造
の末端に位置するように折りたたまれて、ステム構造と
なる。上述のメカニズムでは、下側のＲＮＡ鎖が鋳型と
して使用されることによって、ｍｓＤＮＡの合成がプラ
イミングされ、ｃＤＮＡの合成が内部グアノシン残基の
２’−ＯＨから開始され、この反応は、一次転写産物
の、オープン・リーディング・フレームによってコード
された逆転写酵素のみによって媒介される。
は、枝分かれグアノシン残基のすぐ上流の領域と、ｍｓ
ｄの上流の領域との間で、グアノシン残基がステム構造
の末端に位置するように折りたたまれて、ステム構造と
なる。上述のメカニズムでは、下側のＲＮＡ鎖が鋳型と
して使用されることによって、ｍｓＤＮＡの合成がプラ
イミングされ、ｃＤＮＡの合成が内部グアノシン残基の
２’−ＯＨから開始され、この反応は、一次転写産物
の、オープン・リーディング・フレームによってコード
された逆転写酵素のみによって媒介される。
【００９０】ｍｓＤＮＡの合成は、内部グアノシン残基
（ｒＧ）を起点とする分子内プライミングによって開始
される。折りたたまれた一次転写産物の５’末端が（そ
の逆方向反復塩基配列ゆえに）二本鎖となっているの
で、逆転写酵素によって認識されるプライミングの部位
として機能するのである。
（ｒＧ）を起点とする分子内プライミングによって開始
される。折りたたまれた一次転写産物の５’末端が（そ
の逆方向反復塩基配列ゆえに）二本鎖となっているの
で、逆転写酵素によって認識されるプライミングの部位
として機能するのである。
【００９１】本明細書に記載する逆転写酵素を、非自己
プライミング性の鋳型（あるいは、３’末端にポリ
（Ａ）尾部を有さないｍＲＮＡ）を転写する際に使用す
ることが所望される場合には、ｍＲＮＡにアニーリング
する適当なプライマーを通常の方法で用意し、本明細書
に記載する逆転写酵素が、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に沿っ
て合成する際の開始部位を設けることが必要となる。
プライミング性の鋳型（あるいは、３’末端にポリ
（Ａ）尾部を有さないｍＲＮＡ）を転写する際に使用す
ることが所望される場合には、ｍＲＮＡにアニーリング
する適当なプライマーを通常の方法で用意し、本明細書
に記載する逆転写酵素が、一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に沿っ
て合成する際の開始部位を設けることが必要となる。
【００９２】ｃＤＮＡならびに逆転写産物を合成する際
の背景技術やプロトコールについては、「分子クローニ
ング─実験の手引き（Molecular Cloning: A Laborator
y Manual）」（「マニアティス（Maniatis）」）、第１
２９−１３０頁および第２１３−２１６頁を参照された
い（本明細書に参考文献として組みこむものである）。
ＲＮアーゼ活性が存在し、その分離を行おうとする場合
には、マニアティスのｃＤＮＡの合成について扱った章
に記載されたプロトコール（第２１３頁）を参照された
い。マーカス（Marcus）ら、ウイルス学雑誌（J. Viro
l. ）、１４、８５３（１９７４）をはじめとする第２
１３頁に挙げられた他の文献も参照されたい。他のプロ
トコール、たとえば逆転写反応混合物に、ＲＮアーゼの
阻害物質、たとえばバナジル−リボヌクレオシド複合
体、あるいはＲＮアシンを含有させることは、当業界で
公知である。
の背景技術やプロトコールについては、「分子クローニ
ング─実験の手引き（Molecular Cloning: A Laborator
y Manual）」（「マニアティス（Maniatis）」）、第１
２９−１３０頁および第２１３−２１６頁を参照された
い（本明細書に参考文献として組みこむものである）。
ＲＮアーゼ活性が存在し、その分離を行おうとする場合
には、マニアティスのｃＤＮＡの合成について扱った章
に記載されたプロトコール（第２１３頁）を参照された
い。マーカス（Marcus）ら、ウイルス学雑誌（J. Viro
l. ）、１４、８５３（１９７４）をはじめとする第２
１３頁に挙げられた他の文献も参照されたい。他のプロ
トコール、たとえば逆転写反応混合物に、ＲＮアーゼの
阻害物質、たとえばバナジル−リボヌクレオシド複合
体、あるいはＲＮアシンを含有させることは、当業界で
公知である。
【００９３】さらに別のプロトコールとしては、「分子
クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning: A L
aboratory Manual）」（「サムブルック（Sambrook」）
を参照されたい（本明細書に参考文献として組みこむも
のである）。逆転写酵素（ＲＮＡ依存性重合酵素）につ
いては第１巻の５．３４、５．５２−５．５５節を、Ｒ
ＮＡプライマーの伸長については、７．７９−７．８３
節を、ｃＤＮＡの一本目の鎖の合成については、第２
巻、８．１１−８．１３、８．６０−８．６３、１４．
２０−１４．２１節を、一本鎖ＲＮＡ鋳型を用いたＤＮ
Ａプローブの合成については１０．１３節を、そして適
当な緩衝液については、７．８１節（およびＢ．２６）
を参照されたい。
クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning: A L
aboratory Manual）」（「サムブルック（Sambrook」）
を参照されたい（本明細書に参考文献として組みこむも
のである）。逆転写酵素（ＲＮＡ依存性重合酵素）につ
いては第１巻の５．３４、５．５２−５．５５節を、Ｒ
ＮＡプライマーの伸長については、７．７９−７．８３
節を、ｃＤＮＡの一本目の鎖の合成については、第２
巻、８．１１−８．１３、８．６０−８．６３、１４．
２０−１４．２１節を、一本鎖ＲＮＡ鋳型を用いたＤＮ
Ａプローブの合成については１０．１３節を、そして適
当な緩衝液については、７．８１節（およびＢ．２６）
を参照されたい。
【００９４】ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合酵素の精製は当業
界で公知の方法によって行うことができる。ホウツら
（G.E. Houts、M. Miyagi 、C. Ellis、D. Brand、およ
び J.W. Beard ）、ウイルス学雑誌（J. Virol. ）、２
９、５１７（１９７９）を参照されたい。逆転写酵素の
単離および精製に関する説明については、分子生物学の
最新プロトコール（Current Protocols in Molecular B
iology Protocols）、第１巻（「プロトコール（Protoc
ols ）」）、３．７．１−３．７．２節も参照されたい
（本明細書に参考文献として組みこむものである）。ロ
ス（Roth）ら、生物化学雑誌（J. Biol. Chem.）、２６
０、９３２６−９３３５（１９８５）およびバーマ（I.
M. Verma）、酵素（The Enzymes ）、第１４Ａ巻（ボイ
ヤー（P.D.Boyer）編）、８７−１０４、アカデミック
・プレス（Academic Press）、ニューヨーク（１９７
７）については、本明細書に記載した逆転写酵素で必要
とされる限りにおいて変更した。ＢＲＬカタログ（BRL
Catalogue ）、第１７頁（１９８５）も参照されたい。
本明細書に記載した逆転写酵素の単離および精製は、ラ
ンプソン（Lampson ）ら、サイエンス（Science ）、２
４３、１０３３−１０３８（１９８９ｂ）に記載された
方法にしたがって行った。ランプソン（Lampson）ら、
生物化学雑誌（J. Biol. Chem.）、２６５、８４９０−
８４９６（１９９０）も参照されたい。
界で公知の方法によって行うことができる。ホウツら
（G.E. Houts、M. Miyagi 、C. Ellis、D. Brand、およ
び J.W. Beard ）、ウイルス学雑誌（J. Virol. ）、２
９、５１７（１９７９）を参照されたい。逆転写酵素の
単離および精製に関する説明については、分子生物学の
最新プロトコール（Current Protocols in Molecular B
iology Protocols）、第１巻（「プロトコール（Protoc
ols ）」）、３．７．１−３．７．２節も参照されたい
（本明細書に参考文献として組みこむものである）。ロ
ス（Roth）ら、生物化学雑誌（J. Biol. Chem.）、２６
０、９３２６−９３３５（１９８５）およびバーマ（I.
M. Verma）、酵素（The Enzymes ）、第１４Ａ巻（ボイ
ヤー（P.D.Boyer）編）、８７−１０４、アカデミック
・プレス（Academic Press）、ニューヨーク（１９７
７）については、本明細書に記載した逆転写酵素で必要
とされる限りにおいて変更した。ＢＲＬカタログ（BRL
Catalogue ）、第１７頁（１９８５）も参照されたい。
本明細書に記載した逆転写酵素の単離および精製は、ラ
ンプソン（Lampson ）ら、サイエンス（Science ）、２
４３、１０３３−１０３８（１９８９ｂ）に記載された
方法にしたがって行った。ランプソン（Lampson）ら、
生物化学雑誌（J. Biol. Chem.）、２６５、８４９０−
８４９６（１９９０）も参照されたい。
【００９５】以下に、上述した各種の特徴についてさら
に説明する。レトロンの逆転写酵素は、いずれも、アミ
ノ酸配列ならびにレトロウイルスの逆転写酵素に見いだ
される配列が有意に類似している。これらの逆転写酵素
は、既知のすべての逆転写酵素に見いだされる、高度に
保存された重合酵素の共通配列であるＹＸＤＤも含んで
いる。
に説明する。レトロンの逆転写酵素は、いずれも、アミ
ノ酸配列ならびにレトロウイルスの逆転写酵素に見いだ
される配列が有意に類似している。これらの逆転写酵素
は、既知のすべての逆転写酵素に見いだされる、高度に
保存された重合酵素の共通配列であるＹＸＤＤも含んで
いる。
【００９６】オープン・リーディング・フレームはレト
ロンが有する共通の特徴であるが、オープン・リーディ
ング・フレーム領域の長さは、たとえば、最短のヌクレ
オチド９４８個から最長の１，７５８個まで、個々のレ
トロンによって異なる。オープン・リーディング・フレ
ーム領域の長さは、ヌクレオチドの個数で、ＭｓＤＮＡ
−Ｅｃ７３で９４８個、Ｅｃ１０７で９５７個、Ｅｃ８
６で９６０個、Ｍｘ６５で１，２８１個、Ｍｘ１６２で
１，４５５個、Ｅｃ６７で５８６個である。ヌクレオチ
ドの最低必要数は、本明細書に記載するような転写産物
を使用したｍｓＤＮＡの合成を促進する上で十分な逆転
写酵素活性を有するポリペプチドをコードするのに有効
なヌクレオチドの数である。
ロンが有する共通の特徴であるが、オープン・リーディ
ング・フレーム領域の長さは、たとえば、最短のヌクレ
オチド９４８個から最長の１，７５８個まで、個々のレ
トロンによって異なる。オープン・リーディング・フレ
ーム領域の長さは、ヌクレオチドの個数で、ＭｓＤＮＡ
−Ｅｃ７３で９４８個、Ｅｃ１０７で９５７個、Ｅｃ８
６で９６０個、Ｍｘ６５で１，２８１個、Ｍｘ１６２で
１，４５５個、Ｅｃ６７で５８６個である。ヌクレオチ
ドの最低必要数は、本明細書に記載するような転写産物
を使用したｍｓＤＮＡの合成を促進する上で十分な逆転
写酵素活性を有するポリペプチドをコードするのに有効
なヌクレオチドの数である。
【００９７】逆転写酵素のオープン・リーディング・フ
レームのサイズがこのように大きく異なるので、この領
域の構造も極めて多岐にわたっている。一種の逆転写酵
素（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７由来のもの（ＲＴ−Ｅｃ６
７））以外は、ＲＮアーゼＨの領域を含まない。粘液細
菌由来の逆転写酵素は、いずれも、残基１３９−１７０
個の余分なアミノ末端領域を含んでいるのに対し、大腸
菌由来の逆転写酵素は（ＲＴ−Ｅｃ６７以外は）逆転写
酵素領域のみを有し、残基３１６−３２０個から構成さ
れている。ＲＴ−Ｓａ１６３は４８０個の残基から構成
され、この配列は、ＲＴ−Ｍｘ１６２の配列と７８％の
同一性を示した。
レームのサイズがこのように大きく異なるので、この領
域の構造も極めて多岐にわたっている。一種の逆転写酵
素（ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７由来のもの（ＲＴ−Ｅｃ６
７））以外は、ＲＮアーゼＨの領域を含まない。粘液細
菌由来の逆転写酵素は、いずれも、残基１３９−１７０
個の余分なアミノ末端領域を含んでいるのに対し、大腸
菌由来の逆転写酵素は（ＲＴ−Ｅｃ６７以外は）逆転写
酵素領域のみを有し、残基３１６−３２０個から構成さ
れている。ＲＴ−Ｓａ１６３は４８０個の残基から構成
され、この配列は、ＲＴ−Ｍｘ１６２の配列と７８％の
同一性を示した。
【００９８】本明細書に記載した逆転写酵素のうちの特
定のものが、異種のｍｓＤＮＡを鋳型プライマーとして
使用して、インビトロでｍｓＤＮＡを伸長しうることは
注目に値する。たとえば、精製Ｅｃ−６７逆転写酵素
は、異種のｍｓＤＮＡであるＥｃ８６およびＭｘ１６２
を鋳型プライマーとして使用することができる。
定のものが、異種のｍｓＤＮＡを鋳型プライマーとして
使用して、インビトロでｍｓＤＮＡを伸長しうることは
注目に値する。たとえば、精製Ｅｃ−６７逆転写酵素
は、異種のｍｓＤＮＡであるＥｃ８６およびＭｘ１６２
を鋳型プライマーとして使用することができる。
【００９９】さきにも述べたように、ｍｓｒ−ｍｓｄ領
域と逆転写酵素遺伝子とが別個のプロモーターの制御下
に発現してｍｓＤＮＡを生成することも可能である。し
かし、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を生成する際にｍｓｒ−ｍ
ｓｄ領域を補完することができるのはＲＴ−Ｅｃ６７の
みであって、ＲＴ−Ｅｃ７３遺伝子では補完できず、そ
の逆についてもそうである。こうした特異性は、各ｍｓ
ＤＮＡのプライミング反応のためである可能性がある。
プロモーターについては、ｍｓｒ−ｍｓｄならびに逆転
写酵素を、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域の上流側に位置する単一
のプロモーターで誘導することも、逆転写酵素遺伝子を
別個のプロモーター、たとえば酵母のｌｐｐ−ｌａｃプ
ロモーターで誘導することもできる。プロモーターは、
内在性のものとすることも、外来のプロモーター、たと
えばＧＡＬ１０プロモーターとすることもできる。
域と逆転写酵素遺伝子とが別個のプロモーターの制御下
に発現してｍｓＤＮＡを生成することも可能である。し
かし、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を生成する際にｍｓｒ−ｍ
ｓｄ領域を補完することができるのはＲＴ−Ｅｃ６７の
みであって、ＲＴ−Ｅｃ７３遺伝子では補完できず、そ
の逆についてもそうである。こうした特異性は、各ｍｓ
ＤＮＡのプライミング反応のためである可能性がある。
プロモーターについては、ｍｓｒ−ｍｓｄならびに逆転
写酵素を、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域の上流側に位置する単一
のプロモーターで誘導することも、逆転写酵素遺伝子を
別個のプロモーター、たとえば酵母のｌｐｐ−ｌａｃプ
ロモーターで誘導することもできる。プロモーターは、
内在性のものとすることも、外来のプロモーター、たと
えばＧＡＬ１０プロモーターとすることもできる。
【０１００】以下に、ｍｓＤＮＡを合成する各種の方法
について説明する。本発明のｍｓＤＮＡを製造する数多
くの方法が、本発明者らの本発明以前の各種の特許出願
に記載されている。たとえば、本発明のｍｓＤＮＡは、
適当な原核生物あるいは真核生物中でインビボで合成さ
れている。ｍｓＤＮＡを、化学的な方法によって、細胞
透過性とした系あるいは無細胞系中で合成することも可
能である。
について説明する。本発明のｍｓＤＮＡを製造する数多
くの方法が、本発明者らの本発明以前の各種の特許出願
に記載されている。たとえば、本発明のｍｓＤＮＡは、
適当な原核生物あるいは真核生物中でインビボで合成さ
れている。ｍｓＤＮＡを、化学的な方法によって、細胞
透過性とした系あるいは無細胞系中で合成することも可
能である。
【０１０１】ｍｓＤＮＡをインビトロで製造する無細胞
的な方法では、適当な原核細胞の膜を、適当な細胞を透
過性とする物質で処理することによって透過性とし、こ
の透過性とした細胞を、反応混合物中でｍｓＤＮＡ合成
用の適当な基質とともにインキュベートし、そして合成
された本発明のｍｓＤＮＡを単離・精製する。詳細な説
明については、上掲の係続中である米国特許出願第０７
／３１５，４２７号を参照されたい。
的な方法では、適当な原核細胞の膜を、適当な細胞を透
過性とする物質で処理することによって透過性とし、こ
の透過性とした細胞を、反応混合物中でｍｓＤＮＡ合成
用の適当な基質とともにインキュベートし、そして合成
された本発明のｍｓＤＮＡを単離・精製する。詳細な説
明については、上掲の係続中である米国特許出願第０７
／３１５，４２７号を参照されたい。
【０１０２】本発明のｍｓＤＮＡを、適当な宿主細胞中
でインビボで合成することもできる。ｍｓＤＮＡは原核
細胞中で合成することができるし、同様に、本発明のｍ
ｓＤＮＡを合成する際に真核細胞を使用することもでき
る。米国特許出願第０７／７５３，１１０号を参照され
たい。本発明のｍｓＤＮＡをインビボで製造する方法で
は、オープン・リーディング・フレーム領域を含む原核
生物のｍｓＤＮＡ合成系をコードするｒＤＮＡ構築物を
含有する適当な細胞を培養する。米国特許出願第０７／
５１７，９４６号を参照されたい。この合成系は、本発
明のｍｓＤＮＡをコードするレトロンを含んでいる。米
国特許出願第０７／５１８，７４９号を参照されたい。
この細胞を、レトロンを用いて構築した適当なプラスミ
ドで形質転換した。本発明の代表的なｍｓＤＮＡを図
１、２、および３に示す。合成の後、これらのｍｓＤＮ
Ａを、単離・精製した。
でインビボで合成することもできる。ｍｓＤＮＡは原核
細胞中で合成することができるし、同様に、本発明のｍ
ｓＤＮＡを合成する際に真核細胞を使用することもでき
る。米国特許出願第０７／７５３，１１０号を参照され
たい。本発明のｍｓＤＮＡをインビボで製造する方法で
は、オープン・リーディング・フレーム領域を含む原核
生物のｍｓＤＮＡ合成系をコードするｒＤＮＡ構築物を
含有する適当な細胞を培養する。米国特許出願第０７／
５１７，９４６号を参照されたい。この合成系は、本発
明のｍｓＤＮＡをコードするレトロンを含んでいる。米
国特許出願第０７／５１８，７４９号を参照されたい。
この細胞を、レトロンを用いて構築した適当なプラスミ
ドで形質転換した。本発明の代表的なｍｓＤＮＡを図
１、２、および３に示す。合成の後、これらのｍｓＤＮ
Ａを、単離・精製した。
【０１０３】本発明のｍｓＤＮＡをインビボで発現させ
るのに適した原核細胞は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ（ミクソ
コッカス・キサンタス）および大腸菌である。適当な真
核細胞は、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）である。本発明のｍｓＤＮＡを発現することのでき
る任意の適当な原核細胞あるいは真核細胞を使用するこ
とができる。
るのに適した原核細胞は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ（ミクソ
コッカス・キサンタス）および大腸菌である。適当な真
核細胞は、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）である。本発明のｍｓＤＮＡを発現することのでき
る任意の適当な原核細胞あるいは真核細胞を使用するこ
とができる。
【０１０４】以下に、逆転写酵素ならびにｍｓＤＮＡの
幾つかの重要な用途ついて説明する。本出願に記載する
（ならびに上掲の本出願以前の特許出願に記載された）
逆転写酵素は、各種の分子について、その分子が有する
逆転写酵素の活性を阻害したり遮断したりする効果をス
クリーニングするインビボおよびインビトロの双方での
アッセイの際に有用であると考える。
幾つかの重要な用途ついて説明する。本出願に記載する
（ならびに上掲の本出願以前の特許出願に記載された）
逆転写酵素は、各種の分子について、その分子が有する
逆転写酵素の活性を阻害したり遮断したりする効果をス
クリーニングするインビボおよびインビトロの双方での
アッセイの際に有用であると考える。
【０１０５】インビボでのｍｓＤＮＡの生成は、生化学
的に監視することも遺伝学的に監視することもできるの
で、このことを利用してｍｓＤＮＡの合成を遮断する薬
剤をスクリーニングすることができる。そのような薬剤
が見いだされた場合には、その薬剤によって、ｍｓＤＮ
Ａの合成の際の２’−ＯＨでの独特なプライミング反応
（２’，５’−ホスホジエステル結合の形成）が遮断さ
れている可能性も、ｍｓＤＮＡの合成（すなわちｃＤＮ
Ａの合成）での伸長が遮断されている可能性もある。
的に監視することも遺伝学的に監視することもできるの
で、このことを利用してｍｓＤＮＡの合成を遮断する薬
剤をスクリーニングすることができる。そのような薬剤
が見いだされた場合には、その薬剤によって、ｍｓＤＮ
Ａの合成の際の２’−ＯＨでの独特なプライミング反応
（２’，５’−ホスホジエステル結合の形成）が遮断さ
れている可能性も、ｍｓＤＮＡの合成（すなわちｃＤＮ
Ａの合成）での伸長が遮断されている可能性もある。
【０１０６】すなわち、適当な鋳型であるＲＮＡあるい
はＤＮＡ（あるいはこの種の鋳型を含む分子）、本発明
の逆転写酵素、ならびにスクリーニングを行う分子（な
らびに他の通常の構成成分）から構成されるインビトロ
でのアッセイによって、逆転写酵素活性を発現させるこ
とができる。スクリーニングを行った分子が逆転写酵素
活性を阻害あるいは遮断する効果が大きけれは大きいほ
ど、その分子を、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１などのレトロウ
イルスに起因する疾病を抑制することが所望される生物
学および医学上の用途に利用しうる可能性が高い。
はＤＮＡ（あるいはこの種の鋳型を含む分子）、本発明
の逆転写酵素、ならびにスクリーニングを行う分子（な
らびに他の通常の構成成分）から構成されるインビトロ
でのアッセイによって、逆転写酵素活性を発現させるこ
とができる。スクリーニングを行った分子が逆転写酵素
活性を阻害あるいは遮断する効果が大きけれは大きいほ
ど、その分子を、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１などのレトロウ
イルスに起因する疾病を抑制することが所望される生物
学および医学上の用途に利用しうる可能性が高い。
【０１０７】ｍｓＤＮＡの合成は逆転写酵素依存性であ
るので、逆転写酵素活性に及ぼす効果についてスクリー
ニングを行う分子の試験を、ｍｓＤＮＡのインビトロで
の合成の際に行うことが可能である。この合成がどの程
度阻害されるかによって、その分子が有する有効性が決
まる。
るので、逆転写酵素活性に及ぼす効果についてスクリー
ニングを行う分子の試験を、ｍｓＤＮＡのインビトロで
の合成の際に行うことが可能である。この合成がどの程
度阻害されるかによって、その分子が有する有効性が決
まる。
【０１０８】鋳型として使用することができる今一つの
適当な分子は、一本鎖ＤＮＡクローニングベクター、た
とえばＭ１３クローニングベクター（ｍｐ８）である。
バクテリオファージＭ１３ベクターへの外来のＤＮＡの
クローニングについては、「分子クローニング─実験の
手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」
（「サムブルック（Sambrook」）、第１巻、４．３３−
４．３８節を、ブルースクリプトＭ１３+ およびＭ１３
- については１．２０節を参照されたい（本明細書に参
考文献として組みこむものである）。
適当な分子は、一本鎖ＤＮＡクローニングベクター、た
とえばＭ１３クローニングベクター（ｍｐ８）である。
バクテリオファージＭ１３ベクターへの外来のＤＮＡの
クローニングについては、「分子クローニング─実験の
手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」
（「サムブルック（Sambrook」）、第１巻、４．３３−
４．３８節を、ブルースクリプトＭ１３+ およびＭ１３
- については１．２０節を参照されたい（本明細書に参
考文献として組みこむものである）。
【０１０９】ｍｓＤＮＡは、レトロン１つあたり数百個
のコピーが産生されるので、ｍｓＤＮＡを遺伝子の増幅
の目的で使用することもできる。この過程は、ｍｓＤＮ
Ａのステム・ループ領域のステム部分に所望の遺伝子を
含む二本鎖ＤＮＡをスプライシングしたり、ステム・ル
ープ領域の一部を所望の遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡで置
換したりするといった古典的なプロトコールによって行
うことができる。たとえば、図３ａおよび３ｂに示す合
成ｍｓＤＮＡの場合には、適当な制限酵素によって、制
限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩを有するレトロンを含
むプラスミドＤＮＡから、ｍｓＤＮＡのステム・ループ
領域を切り出すことができる。次に、この部位に、目的
とする遺伝子を２コピー含むＤＮＡ断片を、頭−頭向
き、あるいは尾−尾向きにライゲーションする。この領
域が、ｍｓＤＮＡに一本鎖ＤＮＡとしてコピーされた場
合には、遺伝子の２個のコピーがパリンドローム状の向
きを有しているので、ステム・ループ構造が形成される
ことになる。このようにして、目的とする遺伝子をステ
ム構造中に再構築することができる。この遺伝子増幅法
を用いると、多数の遺伝子を生成することが可能とな
る。ｍｓＤＮＡ構造が大腸菌にとって外来物でない場合
には、この微生物が、遺伝子増幅の際のベクターとして
特に適当である。
のコピーが産生されるので、ｍｓＤＮＡを遺伝子の増幅
の目的で使用することもできる。この過程は、ｍｓＤＮ
Ａのステム・ループ領域のステム部分に所望の遺伝子を
含む二本鎖ＤＮＡをスプライシングしたり、ステム・ル
ープ領域の一部を所望の遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡで置
換したりするといった古典的なプロトコールによって行
うことができる。たとえば、図３ａおよび３ｂに示す合
成ｍｓＤＮＡの場合には、適当な制限酵素によって、制
限部位ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩを有するレトロンを含
むプラスミドＤＮＡから、ｍｓＤＮＡのステム・ループ
領域を切り出すことができる。次に、この部位に、目的
とする遺伝子を２コピー含むＤＮＡ断片を、頭−頭向
き、あるいは尾−尾向きにライゲーションする。この領
域が、ｍｓＤＮＡに一本鎖ＤＮＡとしてコピーされた場
合には、遺伝子の２個のコピーがパリンドローム状の向
きを有しているので、ステム・ループ構造が形成される
ことになる。このようにして、目的とする遺伝子をステ
ム構造中に再構築することができる。この遺伝子増幅法
を用いると、多数の遺伝子を生成することが可能とな
る。ｍｓＤＮＡ構造が大腸菌にとって外来物でない場合
には、この微生物が、遺伝子増幅の際のベクターとして
特に適当である。
【０１１０】別の用途としては、本発明のｍｓＤＮＡを
使用して、安定なＲＮＡを生成することができる。
使用して、安定なＲＮＡを生成することができる。
【０１１１】本発明のｍｓＤＮＡは、ポリペプチドの生
成ならびにアンチセンス分子の生成に有用である。ポリ
ペプチドは、レトロンに挿入されたＤＮＡ断片から、セ
ンス鎖が転写されるようにして生成される。
成ならびにアンチセンス分子の生成に有用である。ポリ
ペプチドは、レトロンに挿入されたＤＮＡ断片から、セ
ンス鎖が転写されるようにして生成される。
【０１１２】本発明のｍｓＤＮＡは、組換えアンチセン
ス一本鎖ＤＮＡを生成する際のベクターとして有用であ
る。アンチセンス分子は、一次転写産物がアンチセンス
鎖を含むような向きにレトロンに挿入されたＤＮＡ断片
から生成される。この種のｍｓＤＮＡは、これまでに知
られているような比較的不安定なアンチセンス分子とは
ちがって安定であるので、特に有用である。選んだＤＮ
Ａ断片は、レトロンのｍｓｒ領域に挿入することも、ｍ
ｓｄ領域に挿入することもできる。生じた一次転写産物
は、ｍｓｒ領域、ｍｓｄ領域、および逆転写酵素をコー
ドするオープン・リーディング・フレームだけでなく、
挿入したＤＮＡ断片と相補的なＲＮＡ配列も含むものと
なる。目的とする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、一次転写
産物がセンス鎖を含みｍＲＮＡとして機能する、すなわ
ちポリペプチドを生成するような向きに挿入すること
も、一次転写産物がアンチセンス分子鎖を含み、この一
次転写産物が目的遺伝子のｍＲＮＡとアニーリングして
発現を阻害するような向きに挿入することもできる。こ
のような一次転写産物から生成したｍｓＤＮＡは、目的
遺伝子からインビボで生成するｍＲＮＡに対するアンチ
センスとして作用するので、目的遺伝子の発現をインビ
トロで制御する際に使用することができる。ＤＮＡ断片
は、レトロンのｍｓｒ領域に挿入することも、ｍｓｄ領
域に挿入することもでき、その場合、目的遺伝子は、そ
れぞれ、ｍｓＤＮＡのＲＮＡ部分あるいはＤＮＡ部分に
発現することになる。ｍｓｒあるいはｍｓｄ領域には、
当業界で公知の任意の適当な制限部位で挿入することが
できる。
ス一本鎖ＤＮＡを生成する際のベクターとして有用であ
る。アンチセンス分子は、一次転写産物がアンチセンス
鎖を含むような向きにレトロンに挿入されたＤＮＡ断片
から生成される。この種のｍｓＤＮＡは、これまでに知
られているような比較的不安定なアンチセンス分子とは
ちがって安定であるので、特に有用である。選んだＤＮ
Ａ断片は、レトロンのｍｓｒ領域に挿入することも、ｍ
ｓｄ領域に挿入することもできる。生じた一次転写産物
は、ｍｓｒ領域、ｍｓｄ領域、および逆転写酵素をコー
ドするオープン・リーディング・フレームだけでなく、
挿入したＤＮＡ断片と相補的なＲＮＡ配列も含むものと
なる。目的とする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、一次転写
産物がセンス鎖を含みｍＲＮＡとして機能する、すなわ
ちポリペプチドを生成するような向きに挿入すること
も、一次転写産物がアンチセンス分子鎖を含み、この一
次転写産物が目的遺伝子のｍＲＮＡとアニーリングして
発現を阻害するような向きに挿入することもできる。こ
のような一次転写産物から生成したｍｓＤＮＡは、目的
遺伝子からインビボで生成するｍＲＮＡに対するアンチ
センスとして作用するので、目的遺伝子の発現をインビ
トロで制御する際に使用することができる。ＤＮＡ断片
は、レトロンのｍｓｒ領域に挿入することも、ｍｓｄ領
域に挿入することもでき、その場合、目的遺伝子は、そ
れぞれ、ｍｓＤＮＡのＲＮＡ部分あるいはＤＮＡ部分に
発現することになる。ｍｓｒあるいはｍｓｄ領域には、
当業界で公知の任意の適当な制限部位で挿入することが
できる。
【０１１３】アンチセンス分子をｍｓＤＮＡとして発現
させることは、極めて有利である。これまでに製造され
ているアンチセンス分子は、本質的に不安定で、すぐに
分解してしまうことが知られている。これとは対照的
に、アンチセンス断片を組み込んだｍｓＤＮＡは顕著な
安定性を示す。この種のｍｓＤＮＡは、遺伝物質あるい
は目的遺伝子のｍＲＮＡと相補的で、このｍＲＮＡに結
合あるいはハイブリダイズして、翻訳を阻害することの
できるアンチセンス鎖を、ＲＮＡ部分あるいはＤＮＡ部
分に含むものである。ｍＲＮＡと結合あるいはハイブリ
ダイズすると、ｍＲＮＡの翻訳が阻害され、その結果、
ｍＲＮＡによってコードされた目的タンパク質のような
生成物が生成されなくなる。このように、このｍｓＤＮ
Ａは、任意の遺伝子の発現を調節するにあたって、また
従来技術のアンチセンス分子が有していた安定性に欠け
るという問題を解決するにあたって有用な系を提供する
ものである。
させることは、極めて有利である。これまでに製造され
ているアンチセンス分子は、本質的に不安定で、すぐに
分解してしまうことが知られている。これとは対照的
に、アンチセンス断片を組み込んだｍｓＤＮＡは顕著な
安定性を示す。この種のｍｓＤＮＡは、遺伝物質あるい
は目的遺伝子のｍＲＮＡと相補的で、このｍＲＮＡに結
合あるいはハイブリダイズして、翻訳を阻害することの
できるアンチセンス鎖を、ＲＮＡ部分あるいはＤＮＡ部
分に含むものである。ｍＲＮＡと結合あるいはハイブリ
ダイズすると、ｍＲＮＡの翻訳が阻害され、その結果、
ｍＲＮＡによってコードされた目的タンパク質のような
生成物が生成されなくなる。このように、このｍｓＤＮ
Ａは、任意の遺伝子の発現を調節するにあたって、また
従来技術のアンチセンス分子が有していた安定性に欠け
るという問題を解決するにあたって有用な系を提供する
ものである。
【０１１４】アンチセンス断片を含むｍｓＤＮＡの例に
ついては、係続中の米国特許出願第０７／７５３，１１
０号を参照されたい。この目的には、任意のｍｓＤＮＡ
を使用することができる。
ついては、係続中の米国特許出願第０７／７５３，１１
０号を参照されたい。この目的には、任意のｍｓＤＮＡ
を使用することができる。
【０１１５】ＤＮＡ配列をｍｓＤＮＡ中に挿入してタン
パク質（ポリペプチド）をコードさせようとする場合に
は、たとえば、遺伝子のコピー２個を、選択したｍｓＤ
ＮＡ、たとえばＹＥｐ５２１−Ｍ４のｍｓｄ配列の選ば
れた制限部位に、直列かつ互いに逆向きに挿入する。
パク質（ポリペプチド）をコードさせようとする場合に
は、たとえば、遺伝子のコピー２個を、選択したｍｓＤ
ＮＡ、たとえばＹＥｐ５２１−Ｍ４のｍｓｄ配列の選ば
れた制限部位に、直列かつ互いに逆向きに挿入する。
【０１１６】ｍｓＤＮＡは、以下に説明するように、ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の治療に有用な可能性が
ある。患者から健全なリンパ球を採取し貯蔵する。患者
が必要とする時点で、ｍｓＤＮＡを増殖し、ＨＩＶの必
須タンパク質の一種に対するアンチセンスを生成するよ
うなＤＮＡ構築物をｍｓＤＮＡに挿入し、このリンパ球
を患者に注入する。こうすると、ＨＩＶに対して抵抗性
のリンパ球が増殖することになる。
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の治療に有用な可能性が
ある。患者から健全なリンパ球を採取し貯蔵する。患者
が必要とする時点で、ｍｓＤＮＡを増殖し、ＨＩＶの必
須タンパク質の一種に対するアンチセンスを生成するよ
うなＤＮＡ構築物をｍｓＤＮＡに挿入し、このリンパ球
を患者に注入する。こうすると、ＨＩＶに対して抵抗性
のリンパ球が増殖することになる。
【０１１７】アンチセンスＲＮＡおよび遺伝子調節への
その利用に関する文献等の参考文献としては、たとえ
ば、ヒラシマ（Hirashima ）ら、米国国立科学アカデミ
ー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８３、７７２
６−７７３０（１９８６年１０月）；井上、遺伝子（Ge
ne）、７２、２５−３４（１９８８）；および「相補的
ＲＮＡを妨害するｍＲＮＡを利用した翻訳の阻害を用い
た遺伝子の発現の調節（Regulation of gene expressio
n by employing tranlational inhibition utilizing m
RNA interfering complementary RNA ）」という名称の
欧州特許出願Ａ２０ １４０ ３０８（１９８５年５月
８日公開）（この出願は、米国特許出願第５４８，５２
８号（１９８３年１０月２０日出願）ならびに米国特許
出願第５８２，２８２号（１９８４年３月１日）に基づ
くものである）を参照されたい。本明細書には、これら
を参考文献として組み込むものである。
その利用に関する文献等の参考文献としては、たとえ
ば、ヒラシマ（Hirashima ）ら、米国国立科学アカデミ
ー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８３、７７２
６−７７３０（１９８６年１０月）；井上、遺伝子（Ge
ne）、７２、２５−３４（１９８８）；および「相補的
ＲＮＡを妨害するｍＲＮＡを利用した翻訳の阻害を用い
た遺伝子の発現の調節（Regulation of gene expressio
n by employing tranlational inhibition utilizing m
RNA interfering complementary RNA ）」という名称の
欧州特許出願Ａ２０ １４０ ３０８（１９８５年５月
８日公開）（この出願は、米国特許出願第５４８，５２
８号（１９８３年１０月２０日出願）ならびに米国特許
出願第５８２，２８２号（１９８４年３月１日）に基づ
くものである）を参照されたい。本明細書には、これら
を参考文献として組み込むものである。
【０１１８】アンチセンスに関する最新の報告として
は、アンチセンスの研究と発展（Antisense Research a
nd Development）、１、２０７−２１７（１９９１）、
ホーキングら（Hawking および Krieg）編、メアリー・
アン・リーバート社（Mary AnnLiebert, Inc.）出版、
を参照されたい。この分野の特許出願の一覧について
は、「会議報告─アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡによ
る遺伝子の調節（MeetingReport: Gene Regulation by
Antisense RNA and DNA）」を参照されたい。特に、
「アンチセンス特許一覧─１９７１−１９９１（A List
ing of Antisense Patents, 1971-1991 ）」を参照され
たい。本発明のｍｓＤＮＡは、これらの文献に記載され
た数多くの用途で有用である。
は、アンチセンスの研究と発展（Antisense Research a
nd Development）、１、２０７−２１７（１９９１）、
ホーキングら（Hawking および Krieg）編、メアリー・
アン・リーバート社（Mary AnnLiebert, Inc.）出版、
を参照されたい。この分野の特許出願の一覧について
は、「会議報告─アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡによ
る遺伝子の調節（MeetingReport: Gene Regulation by
Antisense RNA and DNA）」を参照されたい。特に、
「アンチセンス特許一覧─１９７１−１９９１（A List
ing of Antisense Patents, 1971-1991 ）」を参照され
たい。本発明のｍｓＤＮＡは、これらの文献に記載され
た数多くの用途で有用である。
【０１１９】特に好適であると考えられる用途として
は、本発明のｍｓＤＮＡが、染色体上で、特定の二本鎖
と一緒になって、三重螺旋ＤＮＡあるいは三本鎖ＤＮＡ
を形成する際に果たす役割が挙げられる。サイエンス
（Science ）、２５２、１３７４−１３７５（１９９１
年６月２７日）に掲載された最近の報告である「ついに
成熟した三本鎖ＤＮＡ（Triplex DNA Finally Comes of
Age）」は本発明がいかに時宜を得たものであるかを示
している。三重鎖ＤＮＡは、染色体ＤＮＡの特定の認識
部位に３本目の鎖を結合することによって形成すること
ができる。好ましくは塩基の完全な相補的配列を含むサ
イズ（たとえば１１−１５、あるいはそれ以上）を有す
る合成鎖が記載されている。本発明のｍｓＤＮＡは、こ
の種の用途に特に適していると考えられる。ｍｓＤＮＡ
は、三本鎖を形成する上で必要となる一本鎖ＤＮＡを提
供するものであり、生じた三重螺旋ＤＮＡは、極めて安
定かつ有用であると予測される。こうした三重螺旋の形
成に基づいた新規な治療、たとえばＡＩＤＳの治療、な
らびに選択的な遺伝子の阻害などがこの報告に提案され
ている。
は、本発明のｍｓＤＮＡが、染色体上で、特定の二本鎖
と一緒になって、三重螺旋ＤＮＡあるいは三本鎖ＤＮＡ
を形成する際に果たす役割が挙げられる。サイエンス
（Science ）、２５２、１３７４−１３７５（１９９１
年６月２７日）に掲載された最近の報告である「ついに
成熟した三本鎖ＤＮＡ（Triplex DNA Finally Comes of
Age）」は本発明がいかに時宜を得たものであるかを示
している。三重鎖ＤＮＡは、染色体ＤＮＡの特定の認識
部位に３本目の鎖を結合することによって形成すること
ができる。好ましくは塩基の完全な相補的配列を含むサ
イズ（たとえば１１−１５、あるいはそれ以上）を有す
る合成鎖が記載されている。本発明のｍｓＤＮＡは、こ
の種の用途に特に適していると考えられる。ｍｓＤＮＡ
は、三本鎖を形成する上で必要となる一本鎖ＤＮＡを提
供するものであり、生じた三重螺旋ＤＮＡは、極めて安
定かつ有用であると予測される。こうした三重螺旋の形
成に基づいた新規な治療、たとえばＡＩＤＳの治療、な
らびに選択的な遺伝子の阻害などがこの報告に提案され
ている。
【０１２０】当業者であれば、他の用途も思いつくはず
である。本発明の第三の態様は、代表的なｍｓＤＮＡの
無細胞合成に関するものである。この方法では、ｍｓｒ
−ｍｓｄ領域を含む全ＲＮＡ調製物と精製逆転写酵素
（Ｅｃ６７−ＲＴ）とを、反応に適した条件で反応させ
る。
である。本発明の第三の態様は、代表的なｍｓＤＮＡの
無細胞合成に関するものである。この方法では、ｍｓｒ
−ｍｓｄ領域を含む全ＲＮＡ調製物と精製逆転写酵素
（Ｅｃ６７−ＲＴ）とを、反応に適した条件で反応させ
る。
【０１２１】無細胞系を使用することにより、ＤＮＡ合
成の開始時のプライミング反応が、鋳型に依存した特異
的な事象であることが例証された。ｄＴＴＰのみが１３
２塩基のＲＮＡ前駆体に組み込まれて、１３３塩基の化
合物を生じた。この特異的なｄＴの付加は、単に、推定
ｍｓｒ−ｍｓｄ転写産物の１１８番目のＡ残基を、Ｔあ
るいはＧ残基で置換することによって、ｄＡあるいはｄ
Ｃに変更することができた。このプライミング反応は、
ｍｓＤＮＡの枝分かれグアノシン残基に対応する、ＲＮ
Ａ前駆体転写産物の１５番目の残基であるＧをＡに置換
すると遮断された。ＤＮＡ鎖の伸長は、無細胞系にｄｄ
ＮＴＰを加えて配列決定用ラダーを形成することによっ
て停止することができた。このラダーから決定したＤＮ
Ａ配列は、ｍｓＤＮＡの配列と完全に一致した。十分に
伸長した無細胞生成物の一部は、ＲＮアーゼＡに対して
抵抗性の１３塩基のＲＮＡ鎖を含んでおり、このことは
先に提案したモデルと符合するものである。このモデル
では、ｍｓｒ−ｍｓｄ転写産物の５’末端の配列（塩基
１−１３）が、同じ転写産物の３’末端と二本鎖を形成
して、逆転写酵素によるｍｓＤＮＡの合成の際のプライ
マーかつ鋳型の役割を果たしている。
成の開始時のプライミング反応が、鋳型に依存した特異
的な事象であることが例証された。ｄＴＴＰのみが１３
２塩基のＲＮＡ前駆体に組み込まれて、１３３塩基の化
合物を生じた。この特異的なｄＴの付加は、単に、推定
ｍｓｒ−ｍｓｄ転写産物の１１８番目のＡ残基を、Ｔあ
るいはＧ残基で置換することによって、ｄＡあるいはｄ
Ｃに変更することができた。このプライミング反応は、
ｍｓＤＮＡの枝分かれグアノシン残基に対応する、ＲＮ
Ａ前駆体転写産物の１５番目の残基であるＧをＡに置換
すると遮断された。ＤＮＡ鎖の伸長は、無細胞系にｄｄ
ＮＴＰを加えて配列決定用ラダーを形成することによっ
て停止することができた。このラダーから決定したＤＮ
Ａ配列は、ｍｓＤＮＡの配列と完全に一致した。十分に
伸長した無細胞生成物の一部は、ＲＮアーゼＡに対して
抵抗性の１３塩基のＲＮＡ鎖を含んでおり、このことは
先に提案したモデルと符合するものである。このモデル
では、ｍｓｒ−ｍｓｄ転写産物の５’末端の配列（塩基
１−１３）が、同じ転写産物の３’末端と二本鎖を形成
して、逆転写酵素によるｍｓＤＮＡの合成の際のプライ
マーかつ鋳型の役割を果たしている。
【０１２２】以上で説明したように、ｍｓＤＮＡの合成
は、下側のＲＮＡ鎖を鋳型として使用しつつ、グアノシ
ン残基の２’−ＯＨ残基でプライミングされるものであ
る。ｍｓＤＮＡの最初の塩基、すなわち５’末端は、図
１Ｃの１１８の位置の塩基によって決定される。このよ
うに、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の合成は、１１８の位置の
ｒＡ残基と相補的なｄＴ残基から開始する。図１Ｃを参
照されたい。
は、下側のＲＮＡ鎖を鋳型として使用しつつ、グアノシ
ン残基の２’−ＯＨ残基でプライミングされるものであ
る。ｍｓＤＮＡの最初の塩基、すなわち５’末端は、図
１Ｃの１１８の位置の塩基によって決定される。このよ
うに、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の合成は、１１８の位置の
ｒＡ残基と相補的なｄＴ残基から開始する。図１Ｃを参
照されたい。
【０１２３】上述したように、他のｍｓＤＮＡでは、内
部グアノシン残基は異なった位置に生じる。こうした他
のｍｓＤＮＡの合成の際には、合成は、ＲＮＡ鎖の最初
の塩基と相補的なＤＮＡの塩基から開始する。
部グアノシン残基は異なった位置に生じる。こうした他
のｍｓＤＮＡの合成の際には、合成は、ＲＮＡ鎖の最初
の塩基と相補的なＤＮＡの塩基から開始する。
【０１２４】部分精製ＲＴ−Ｅｃ６７と、ｐ６７−ＢＨ
Ｏ．６を含む細胞から生成したＲＮＡ分画とを使用し
て、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を合成する無細胞系を初めて
確立した。このプラスミドは、実施例に記載するよう
に、レトロン−Ｅｃ６７由来のｍｓｒ−ｍｓｄ領域なら
びに端を切り取った逆転写酵素遺伝子を含んでいた。図
２に示すように、ヌクレオチド１３３個のサイズの位置
まで泳動した生成物には、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰ（レー
ン３）が特異的に組み込まれていた。無細胞系では、
〔α−32Ｐ〕ｄＧＴＰ（レーン１）も〔α−32Ｐ〕ｄＡ
ＴＰ（レーン２）も組み込まれることはなかった。〔α
−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（レーン４）の場合には、〔α−
32Ｐ〕ｄＴＴＰ（レーン３）で標識された主生成物より
４ないし５塩基短い位置に２本の弱いバンドが現れた。
後述するように、これらの生成物は、枝分かれグアノシ
ン残基が不在である場合にも標識され（図２、レーン１
６）、これらがｍｓＤＮＡの合成に伴うものではないこ
とが示唆された。反応混合物に逆転写酵素を含有させな
かった場合には、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰを用いても標識
されたバンドが検出されることはなかった。
Ｏ．６を含む細胞から生成したＲＮＡ分画とを使用し
て、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を合成する無細胞系を初めて
確立した。このプラスミドは、実施例に記載するよう
に、レトロン−Ｅｃ６７由来のｍｓｒ−ｍｓｄ領域なら
びに端を切り取った逆転写酵素遺伝子を含んでいた。図
２に示すように、ヌクレオチド１３３個のサイズの位置
まで泳動した生成物には、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰ（レー
ン３）が特異的に組み込まれていた。無細胞系では、
〔α−32Ｐ〕ｄＧＴＰ（レーン１）も〔α−32Ｐ〕ｄＡ
ＴＰ（レーン２）も組み込まれることはなかった。〔α
−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（レーン４）の場合には、〔α−
32Ｐ〕ｄＴＴＰ（レーン３）で標識された主生成物より
４ないし５塩基短い位置に２本の弱いバンドが現れた。
後述するように、これらの生成物は、枝分かれグアノシ
ン残基が不在である場合にも標識され（図２、レーン１
６）、これらがｍｓＤＮＡの合成に伴うものではないこ
とが示唆された。反応混合物に逆転写酵素を含有させな
かった場合には、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰを用いても標識
されたバンドが検出されることはなかった。
【０１２５】ｄＴＴＰで標識された生成物のサイズは、
図１Ｃで提案された構造のサイズとよく符合する。折り
たたまれたＲＮＡ前駆体は１３２個の塩基から構成さ
れ、ＲＮＡ分子にｄＴ残基が付加されると、１３３個の
塩基から構成されるオリゴヌクレオチドが生じる（図
３、構造ＩＩＩも参照のこと）。
図１Ｃで提案された構造のサイズとよく符合する。折り
たたまれたＲＮＡ前駆体は１３２個の塩基から構成さ
れ、ＲＮＡ分子にｄＴ残基が付加されると、１３３個の
塩基から構成されるオリゴヌクレオチドが生じる（図
３、構造ＩＩＩも参照のこと）。
【０１２６】次に、２種の突然変異産物を構築した。第
一の突然変異では、ＲＮＡ前駆体分子（図１Ｃ）の１１
８の位置のｒＡ残基をＵ残基で置換し（ｍｕｔ−１）、
第二の突然変異では、ｒＧ残基で置換した（ｍｕｔ−
２）。ｍｕｔ−１ＲＮＡ調製物をプライミング反応に使
用した場合には、主生成物に〔α−32Ｐ〕ｄＡＴＰが特
異的に組み込まれ（図２、レーン６）、野生型ＲＮＡ分
画を使用し、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰで標識した生成物
（レーン３）と同じ位置まで泳動した。同様に、〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰはｍｕｔ−２ＲＮＡ生成物（レーン１
２）に特異的に組み込まれた。なお、ｍｕｔ−２でＡか
らＧへの置換が生じた結果、ＲＮＡ分子の鋳型鎖上に３
つのグアノシン残基が並ぶことになった（図１Ｃ、塩基
１１６から塩基１１８）したがって、前駆体分子に１−
３個の残基が付加されたものと予測される。実際、図
２、レーン１２の〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したバン
ドは、野生型生成物（レーン３）およびｍｕｔ−１生成
物（レーン６）と比べて、高分子量側に幅が広がってい
た。このように、１１８の位置（このｍｓＤＮＡの場
合）の残基が何であるかは、必ずしも臨界的ではないよ
うである。
一の突然変異では、ＲＮＡ前駆体分子（図１Ｃ）の１１
８の位置のｒＡ残基をＵ残基で置換し（ｍｕｔ−１）、
第二の突然変異では、ｒＧ残基で置換した（ｍｕｔ−
２）。ｍｕｔ−１ＲＮＡ調製物をプライミング反応に使
用した場合には、主生成物に〔α−32Ｐ〕ｄＡＴＰが特
異的に組み込まれ（図２、レーン６）、野生型ＲＮＡ分
画を使用し、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰで標識した生成物
（レーン３）と同じ位置まで泳動した。同様に、〔α−
32Ｐ〕ｄＣＴＰはｍｕｔ−２ＲＮＡ生成物（レーン１
２）に特異的に組み込まれた。なお、ｍｕｔ−２でＡか
らＧへの置換が生じた結果、ＲＮＡ分子の鋳型鎖上に３
つのグアノシン残基が並ぶことになった（図１Ｃ、塩基
１１６から塩基１１８）したがって、前駆体分子に１−
３個の残基が付加されたものと予測される。実際、図
２、レーン１２の〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰで標識したバン
ドは、野生型生成物（レーン３）およびｍｕｔ−１生成
物（レーン６）と比べて、高分子量側に幅が広がってい
た。このように、１１８の位置（このｍｓＤＮＡの場
合）の残基が何であるかは、必ずしも臨界的ではないよ
うである。
【０１２７】Ｇ残基をＡ残基で置換すると、ｍｓＤＮＡ
−Ｍｘ１６２のインビボでの合成が完全に遮断されるこ
とから、枝分かれグアノシン残基が必須であることがす
でに実証されている。同様に、本発明の無細胞系でも、
ＧからＡへの置換（図１Ｃ、１５の位置でのｍｕｔ−
３）によって、ＲＮＡ前駆体への〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰ
の特異的な組み込みが完全に抑制された（図２のレーン
１５をレーン３と比較されたい）。ｍｕｔ−３ＲＮＡ調
製物の場合にも、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（レーン１５）
で二重のバンドが生じたので、これらのバンドがｍｓＤ
ＮＡの合成に付随するものではないことが示唆された。
−Ｍｘ１６２のインビボでの合成が完全に遮断されるこ
とから、枝分かれグアノシン残基が必須であることがす
でに実証されている。同様に、本発明の無細胞系でも、
ＧからＡへの置換（図１Ｃ、１５の位置でのｍｕｔ−
３）によって、ＲＮＡ前駆体への〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰ
の特異的な組み込みが完全に抑制された（図２のレーン
１５をレーン３と比較されたい）。ｍｕｔ−３ＲＮＡ調
製物の場合にも、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（レーン１５）
で二重のバンドが生じたので、これらのバンドがｍｓＤ
ＮＡの合成に付随するものではないことが示唆された。
【０１２８】粘液細菌ならびに大腸菌由来の公知のｍｓ
ＤＮＡでは、折りたたまれたＲＮＡ前駆体中の枝分かれ
グアノシン残基と直接向かい合った塩基は、いずれの場
合も例外なくグアノシン残基である（図１Ｃ、残基１１
９）。この１１９の位置のグアノシン残基がＡに変わっ
た場合（ｍｕｔ−４）でも、特異的なｄＴの組み込みが
観察されたものの、その程度は低減していた（野生型の
組み込みの場合の約５％）。このことから、鋳型鎖上の
グアノシン残基がプライミング反応で重要な役割を果し
ていることがわかる。図２のプライミング反応の生成物
をＲＮアーゼＡで消化すると、生じた低分子量の生成物
は、いずれも電気泳動ゲルのほぼ前端まで泳動した。
ＤＮＡでは、折りたたまれたＲＮＡ前駆体中の枝分かれ
グアノシン残基と直接向かい合った塩基は、いずれの場
合も例外なくグアノシン残基である（図１Ｃ、残基１１
９）。この１１９の位置のグアノシン残基がＡに変わっ
た場合（ｍｕｔ−４）でも、特異的なｄＴの組み込みが
観察されたものの、その程度は低減していた（野生型の
組み込みの場合の約５％）。このことから、鋳型鎖上の
グアノシン残基がプライミング反応で重要な役割を果し
ていることがわかる。図２のプライミング反応の生成物
をＲＮアーゼＡで消化すると、生じた低分子量の生成物
は、いずれも電気泳動ゲルのほぼ前端まで泳動した。
【０１２９】上述した研究からはっきりと例証されるの
は、ＲＮＡ前駆体分子への最初の塩基の付加が、最初の
塩基が、図３の構造ＩＩのＡ残基に位置する塩基に対し
て相補的となるような特異的なかたちで進行するという
ことである。さらに、この最初の塩基の付加は、反応時
に加えた逆転写酵素調製物、ならびに（図３に丸印で示
す）グアノシン残基に絶対的に依存している。次に、枝
分かれグアノシン残基と結合した（１１８の位置のＡ残
基と相補的な）Ｔ残基がプライマーとして機能して、Ｄ
ＮＡ鎖がＲＮＡ鋳型に沿ってさらに伸長する。構造ＩＩ
Ｉに示すように、ＤＮＡ鎖が伸長するのと同時にＲＮＡ
鋳型が取り除かれるので、構造ＩＩＩの塩基の総数は、
構造ＩＩとほぼ同一である。
は、ＲＮＡ前駆体分子への最初の塩基の付加が、最初の
塩基が、図３の構造ＩＩのＡ残基に位置する塩基に対し
て相補的となるような特異的なかたちで進行するという
ことである。さらに、この最初の塩基の付加は、反応時
に加えた逆転写酵素調製物、ならびに（図３に丸印で示
す）グアノシン残基に絶対的に依存している。次に、枝
分かれグアノシン残基と結合した（１１８の位置のＡ残
基と相補的な）Ｔ残基がプライマーとして機能して、Ｄ
ＮＡ鎖がＲＮＡ鋳型に沿ってさらに伸長する。構造ＩＩ
Ｉに示すように、ＤＮＡ鎖が伸長するのと同時にＲＮＡ
鋳型が取り除かれるので、構造ＩＩＩの塩基の総数は、
構造ＩＩとほぼ同一である。
【０１３０】他のＤＮＡでも、１１８に相当する位置に
ある塩基の残基に対して相補的な塩基の残基が、ＤＮＡ
鎖のＲＮＡ鋳型に沿った伸長が開始する塩基である。
ある塩基の残基に対して相補的な塩基の残基が、ＤＮＡ
鎖のＲＮＡ鋳型に沿った伸長が開始する塩基である。
【０１３１】このモデルを確認するために、図２で最初
の塩基を付加させるのに使用したのと同じ無細胞系を使
用して鎖の伸長反応を行い、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰに加
えて、３種の他のｄＮＴＰならびに各種のジデオキシヌ
クレオチド（ｄｄＮＴＰ）を、別々の鎖伸長停止反応に
加えた（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９７７）。鎖
の伸長反応の後、生成物をＲＮアーゼＡで処理して、生
成物に付着した一本鎖ＲＮＡを除去した。図４に示すよ
うにラダーが形成され、ＤＮＡ鎖の伸長が特異的な鋳型
配列を使用することによって進行していることがはっき
りと示された。このラダーから決定した配列は、ｍｓＤ
ＮＡ−Ｅｃ６７の塩基２４から塩基５４までのＤＮＡ配
列（図１Ｂ）と同一である。４２−４４付近の位置でｍ
ｓＤＮＡの合成が停止した場合もあったものの、反応の
大半は６９付近の位置で停止し、全レーンの（ａ）の位
置に強度のバンドが生じた。この生成物は、ＲＮアーゼ
処理によって生じた４塩基のＲＮＡであるＡＧＡＵに結
合した十分に伸長したｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７（６７塩基
の一本鎖ＤＮＡ）である可能性がもっとも高い（図３の
構造ＩＶａ）。このＤＮＡ鎖は、テトラヌクレオチドの
グアノシン残基の２’−ＯＨ基から枝分かれしていると
考えられる。配列決定用ラダーのバンドは、いずれも、
ＤＮＡ鎖のサイズから予測されるサイズより２塩基長い
位置まで泳動した。これはおそらく、ＤＮＡ鎖の５’末
端に４塩基のＲＮＡが余分に付着しているためである。
ゲルでの移動度に２塩基の隔たりがあるのは、ＲＮＡが
枝分かれ構造を有するせいである可能性が高い。
の塩基を付加させるのに使用したのと同じ無細胞系を使
用して鎖の伸長反応を行い、〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰに加
えて、３種の他のｄＮＴＰならびに各種のジデオキシヌ
クレオチド（ｄｄＮＴＰ）を、別々の鎖伸長停止反応に
加えた（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９７７）。鎖
の伸長反応の後、生成物をＲＮアーゼＡで処理して、生
成物に付着した一本鎖ＲＮＡを除去した。図４に示すよ
うにラダーが形成され、ＤＮＡ鎖の伸長が特異的な鋳型
配列を使用することによって進行していることがはっき
りと示された。このラダーから決定した配列は、ｍｓＤ
ＮＡ−Ｅｃ６７の塩基２４から塩基５４までのＤＮＡ配
列（図１Ｂ）と同一である。４２−４４付近の位置でｍ
ｓＤＮＡの合成が停止した場合もあったものの、反応の
大半は６９付近の位置で停止し、全レーンの（ａ）の位
置に強度のバンドが生じた。この生成物は、ＲＮアーゼ
処理によって生じた４塩基のＲＮＡであるＡＧＡＵに結
合した十分に伸長したｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７（６７塩基
の一本鎖ＤＮＡ）である可能性がもっとも高い（図３の
構造ＩＶａ）。このＤＮＡ鎖は、テトラヌクレオチドの
グアノシン残基の２’−ＯＨ基から枝分かれしていると
考えられる。配列決定用ラダーのバンドは、いずれも、
ＤＮＡ鎖のサイズから予測されるサイズより２塩基長い
位置まで泳動した。これはおそらく、ＤＮＡ鎖の５’末
端に４塩基のＲＮＡが余分に付着しているためである。
ゲルでの移動度に２塩基の隔たりがあるのは、ＲＮＡが
枝分かれ構造を有するせいである可能性が高い。
【０１３２】ＲＮＡの５’末端の構造──インビボで生
成したｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の構造は、図１Ｂに示すも
のであることが決定されており（ランプソン（Ｌａｍｐ
ｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）、これは図３の構造ＩＶａに
対応する。図３に示す推定モデルに基づくと、構造ＩＶ
ｂも生成している可能性があり、この構造では、ｍｓｄ
ＲＮＡの５’末端のアーム（枝分かれグアノシン残基の
上流側で、図１Ｂの塩基１から１４の配列）が二本鎖Ｒ
ＮＡ（１４塩基対）を形成して、折りたたまれたＲＮＡ
前駆体鋳型から残存したａ１−ａ２ステム構造を表現し
ている。図４では、バンド（ｂ）は約８２塩基の位置ま
で泳動し、これはバンド（ａ）より１３塩基長い。二本
鎖ＲＮＡはＲＮアーゼＡに対して抵抗性で、ゲル電気泳
動の前に行った加熱で１４塩基のＲＮＡがｍｓＤＮＡか
ら切り離されたので、５’末端アーム全体がＤＮＡ鎖内
に残存した（図３）。したがって、バンド（ａ）および
（ｂ）の生成物はそれぞれ７１および８４個の塩基から
構成され、図４では、これらの生成物が、それぞれ６９
および８２塩基の位置まで泳動した。
成したｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の構造は、図１Ｂに示すも
のであることが決定されており（ランプソン（Ｌａｍｐ
ｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）、これは図３の構造ＩＶａに
対応する。図３に示す推定モデルに基づくと、構造ＩＶ
ｂも生成している可能性があり、この構造では、ｍｓｄ
ＲＮＡの５’末端のアーム（枝分かれグアノシン残基の
上流側で、図１Ｂの塩基１から１４の配列）が二本鎖Ｒ
ＮＡ（１４塩基対）を形成して、折りたたまれたＲＮＡ
前駆体鋳型から残存したａ１−ａ２ステム構造を表現し
ている。図４では、バンド（ｂ）は約８２塩基の位置ま
で泳動し、これはバンド（ａ）より１３塩基長い。二本
鎖ＲＮＡはＲＮアーゼＡに対して抵抗性で、ゲル電気泳
動の前に行った加熱で１４塩基のＲＮＡがｍｓＤＮＡか
ら切り離されたので、５’末端アーム全体がＤＮＡ鎖内
に残存した（図３）。したがって、バンド（ａ）および
（ｂ）の生成物はそれぞれ７１および８４個の塩基から
構成され、図４では、これらの生成物が、それぞれ６９
および８２塩基の位置まで泳動した。
【０１３３】構造ＩＶａが存在することを明確に立証す
るために、バンド（ｂ）の生成物をゲルから抽出し、Ｒ
ＮアーゼＡで再度処理した。図５に示すように、精製し
たバンド（ｂ）の生成物（レーン３）は、ＲＮアーゼＡ
で２度目の処理を行った場合（レーン５）、配列決定用
ゲルでの移動度がバンド（ａ）の位置に変わっていた。
バンド（ａ）の生成物をＲＮアーゼで処理した場合に
は、処理の前後（それぞれレーン４および６）での移動
度の変化は観察されなかった。
るために、バンド（ｂ）の生成物をゲルから抽出し、Ｒ
ＮアーゼＡで再度処理した。図５に示すように、精製し
たバンド（ｂ）の生成物（レーン３）は、ＲＮアーゼＡ
で２度目の処理を行った場合（レーン５）、配列決定用
ゲルでの移動度がバンド（ａ）の位置に変わっていた。
バンド（ａ）の生成物をＲＮアーゼで処理した場合に
は、処理の前後（それぞれレーン４および６）での移動
度の変化は観察されなかった。
【０１３４】興味深いことに、図４のバンド（ｄ）とバ
ンド（ｃ）のサイズの違いも約１３塩基で、バンド
（ｄ）とバンド（ｂ）、あるいはバンド（ｃ）とバンド
（ａ）のサイズの違いは約３５塩基である。こうしたサ
イズからして、バンド（ｃ）の生成物は、単一鎖ＤＮＡ
がｍｓｄＲＮＡを鋳型として使用することによって、枝
分かれグアノシン残基までさらに伸長を続けていった結
果生じたものである可能性が高い（図３参照）。このよ
うな伸長が生じると、ｍｓＤＮＡの３’末端がさらに３
５塩基伸びることになり、このサイズはバンド（ｃ）の
サイズとよく符合する。こうしたｍｓＤＮＡの３’末端
からのＤＮＡの伸長は、部分精製したＲＴ−Ｅｃ６７を
使用した場合のｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７について立証され
ている（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９９
０）。バンド（ｄ）の生成物は、完全に伸長したｍｓＤ
ＮＡ鎖（１０２塩基）と、バンド（ｂ）の生成物のＲＮ
Ａ構造（図３の構造ＶＩｂ）と類似した１７塩基のＲＮ
Ａとから構成されていると考えられる。
ンド（ｃ）のサイズの違いも約１３塩基で、バンド
（ｄ）とバンド（ｂ）、あるいはバンド（ｃ）とバンド
（ａ）のサイズの違いは約３５塩基である。こうしたサ
イズからして、バンド（ｃ）の生成物は、単一鎖ＤＮＡ
がｍｓｄＲＮＡを鋳型として使用することによって、枝
分かれグアノシン残基までさらに伸長を続けていった結
果生じたものである可能性が高い（図３参照）。このよ
うな伸長が生じると、ｍｓＤＮＡの３’末端がさらに３
５塩基伸びることになり、このサイズはバンド（ｃ）の
サイズとよく符合する。こうしたｍｓＤＮＡの３’末端
からのＤＮＡの伸長は、部分精製したＲＴ−Ｅｃ６７を
使用した場合のｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７について立証され
ている（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９９
０）。バンド（ｄ）の生成物は、完全に伸長したｍｓＤ
ＮＡ鎖（１０２塩基）と、バンド（ｂ）の生成物のＲＮ
Ａ構造（図３の構造ＶＩｂ）と類似した１７塩基のＲＮ
Ａとから構成されていると考えられる。
【０１３５】以上の研究から、ｐ６７−ＢＨＯ．６を含
む細胞から得たＲＮＡ分画と、ｐ６７−ＲＴを含む細胞
から部分精製した逆転写酵素とを使用した無細胞系の相
補性が示される。ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の無細胞合成
は、細菌性の逆転写酵素によって、そして予想される第
一塩基から新規に開始された。ｍｓＤＮＡを合成する無
細胞系が有する以下に記載する特徴は特に注目に値する
ものである。
む細胞から得たＲＮＡ分画と、ｐ６７−ＲＴを含む細胞
から部分精製した逆転写酵素とを使用した無細胞系の相
補性が示される。ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の無細胞合成
は、細菌性の逆転写酵素によって、そして予想される第
一塩基から新規に開始された。ｍｓＤＮＡを合成する無
細胞系が有する以下に記載する特徴は特に注目に値する
ものである。
【０１３６】（１）ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の一次反応で
の最初のｄＮＴＰの組み込み、ならびにＤＮＡ鎖のさら
なる伸長は、逆転写酵素ならびに、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域
からの転写産物を含むＲＮＡ分画の添加に絶対的に依存
している。反応混合物にその片方でも不在であると、前
駆体分子への最初の塩基（野生型ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７
ではｄＴＴＰ）の特異的な組み込みが観察されなかっ
た。
の最初のｄＮＴＰの組み込み、ならびにＤＮＡ鎖のさら
なる伸長は、逆転写酵素ならびに、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域
からの転写産物を含むＲＮＡ分画の添加に絶対的に依存
している。反応混合物にその片方でも不在であると、前
駆体分子への最初の塩基（野生型ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７
ではｄＴＴＰ）の特異的な組み込みが観察されなかっ
た。
【０１３７】（２）ＲＮＡ前駆体分子に結合する最初の
塩基は、鋳型の役目を果たすｍｓｒ−ｍｓｄ領域からの
ＲＮＡ一次転写産物の１１８番目の塩基によって決定さ
れる（図１Ｃ参照）。他のｍｓＤＮＡでは、最初の塩基
は、そのｍｓＤＮＡの種の１１８番目の位置の塩基に対
応する塩基である。最初の塩基は、ＲＮＡ一次転写産物
の１１８番目に位置する塩基に対して常に相補的であ
る。
塩基は、鋳型の役目を果たすｍｓｒ−ｍｓｄ領域からの
ＲＮＡ一次転写産物の１１８番目の塩基によって決定さ
れる（図１Ｃ参照）。他のｍｓＤＮＡでは、最初の塩基
は、そのｍｓＤＮＡの種の１１８番目の位置の塩基に対
応する塩基である。最初の塩基は、ＲＮＡ一次転写産物
の１１８番目に位置する塩基に対して常に相補的であ
る。
【０１３８】（３）一次転写産物の１５番目の残基はグ
アノシン残基で、この残基はプライミング反応に必須で
ある。このグアノシン残基は、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の
の枝分かれグアノシン残基と対応している（図１Ｂおよ
び１Ｃを参照のこと）。他のｍｓＤＮＡでは、上述した
ように、Ｇは別の位置に位置している可能性がある。
アノシン残基で、この残基はプライミング反応に必須で
ある。このグアノシン残基は、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７の
の枝分かれグアノシン残基と対応している（図１Ｂおよ
び１Ｃを参照のこと）。他のｍｓＤＮＡでは、上述した
ように、Ｇは別の位置に位置している可能性がある。
【０１３９】（４）一次転写産物の１１８番目の塩基に
よって決定され、この塩基と相補的な最初のｄＮＴＰが
結合した化合物は、ＲＮアーゼＡに対して感受性で、ア
クリルアミドゲルで単一のバンドとして検出される。こ
の移動度からして、この化合物は１３３の塩基から構成
されている可能性が高い。
よって決定され、この塩基と相補的な最初のｄＮＴＰが
結合した化合物は、ＲＮアーゼＡに対して感受性で、ア
クリルアミドゲルで単一のバンドとして検出される。こ
の移動度からして、この化合物は１３３の塩基から構成
されている可能性が高い。
【０１４０】（５）反応混合物に４種のｄＮＴＰをすべ
て加えると、ＤＮＡ鎖が伸長し、この反応の主生成物
は、約６９の塩基から構成されると予測される。
て加えると、ＤＮＡ鎖が伸長し、この反応の主生成物
は、約６９の塩基から構成されると予測される。
【０１４１】（６）伸長反応の進行中に４種のｄＮＴＰ
だけでなくｄｄＮＴＰも加えると、配列決定用ラダーが
形成され、ラダーから読みとった配列は、ｍｓＤＮＡ−
Ｅｃ６７のＤＮＡ配列と完全に一致する。
だけでなくｄｄＮＴＰも加えると、配列決定用ラダーが
形成され、ラダーから読みとった配列は、ｍｓＤＮＡ−
Ｅｃ６７のＤＮＡ配列と完全に一致する。
【０１４２】（７）伸長したＤＮＡ分子の５’末端に付
着したＲＮＡ分子が、ＲＮアーゼＡによる消化に対して
保護されている。ＲＮＡ分子がＲＮアーゼＡに対してこ
のように保護されるのは、折りたたまれたＲＮＡ前駆体
分子由来の残存ａ１−ａ２ステム構造である二本鎖構造
が形成されているために生じるものであり、したがっ
て、無細胞生成物を沸騰水浴中でインキュベートしてか
らＲＮアーゼでＡで処理するとＲＮＡ分子を消化するこ
とができる。
着したＲＮＡ分子が、ＲＮアーゼＡによる消化に対して
保護されている。ＲＮＡ分子がＲＮアーゼＡに対してこ
のように保護されるのは、折りたたまれたＲＮＡ前駆体
分子由来の残存ａ１−ａ２ステム構造である二本鎖構造
が形成されているために生じるものであり、したがっ
て、無細胞生成物を沸騰水浴中でインキュベートしてか
らＲＮアーゼでＡで処理するとＲＮＡ分子を消化するこ
とができる。
【０１４３】（８）煮沸した後にＲＮアーゼＡで処理す
ることによって除去されるＲＮＡのサイズは１３塩基で
ある。
ることによって除去されるＲＮＡのサイズは１３塩基で
ある。
【０１４４】
【実施例】以下の実施例は、本発明を例示するためのも
のであって、本発明の範囲はこれらの実施例によって何
ら限定されるものではない。
のであって、本発明の範囲はこれらの実施例によって何
ら限定されるものではない。
【０１４５】実施例１ ｍｓＤＮＡを、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ（ミクソコッカス・
キタンサス）中でインビトロで合成する方法について
は、許可となった米国特許出願第０７／３１５，４２７
号に詳しく説明してあり、本出願に、その記載を参考と
して組み入れるものである。
キタンサス）中でインビトロで合成する方法について
は、許可となった米国特許出願第０７／３１５，４２７
号に詳しく説明してあり、本出願に、その記載を参考と
して組み入れるものである。
【０１４６】実施例２ ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を、酵母中でインビボで合成する
方法については、係続中の米国特許出願第０７／７５
３，１１０号に詳しく説明してあり、本出願に、その記
載を参考として組み入れるものである。
方法については、係続中の米国特許出願第０７／７５
３，１１０号に詳しく説明してあり、本出願に、その記
載を参考として組み入れるものである。
【０１４７】実施例３ ｍｓＤＮＡ−Ｍｘ６５を、インビボで合成する方法につ
いては、ダンデール（Dhundale）、生物化学雑誌（Jour
nal of Biological Chemistry ）、２６３、９０５５−
９０５８（１９８８）に詳しく説明してある。
いては、ダンデール（Dhundale）、生物化学雑誌（Jour
nal of Biological Chemistry ）、２６３、９０５５−
９０５８（１９８８）に詳しく説明してある。
【０１４８】実施例４ ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を、大腸菌中でインビボで合成す
る方法については、米国特許出願第０７／３１５，４３
２号に詳しく説明してあり、本出願に、その記載を参考
として組み入れるものである。
る方法については、米国特許出願第０７／３１５，４３
２号に詳しく説明してあり、本出願に、その記載を参考
として組み入れるものである。
【０１４９】実施例５ ２つの別々の合成ｍｓＤＮＡ分子を構築した。全ｍｓｒ
−ｍｓｄ領域を含む１９６ｂｐの合成ｍｓＤＮＡを、４
本の二本鎖オリゴヌクレオチド単位から合成した。合成
遺伝子ならびにその構成成分を図１１に示す。長さ４６
−５６塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを８本合成し
た。オリゴヌクレオチドの適当なペアをアニーリングす
るために、１００℃に５分間加熱し、３０℃で３０分
間、そして４℃で３０分間冷却した。一方、大腸菌ｐＩ
ＮＩＩＩ（ｌｐｐp-5 ）発現ベクターレトロンを、Ｘｂ
ａＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、臨床で得られた大腸菌の系
統であるＣ１−１由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、
逆転写酵素遺伝子がｌｐｐ−ｌａｃプロモータの制御下
となるように挿入し、大腸菌を形質転換するのに使用し
た。クローンを同定した後、１０．７ｋｂのｐＩＮＩＩ
Ｉ（ｌｐｐp-5 ）−ＥｃＲＴプラスミドＤＮＡを単離し
た。次に、このベクターへの上記の１９６ｂｐの合成ｍ
ｓＤＮＡ断片の挿入を、ＸｂａＩで消化し、ベクターの
末端を細菌性アルカリフォスファターゼで処理し、そし
て断片を所定部位にライゲーションすることによって行
った。この構築過程を図１０に図式的に示す。大腸菌Ｃ
Ｌ−８３を、このｐＩＮＩＩＩ（ｌｐｐp-5 ）ｍｓ１０
０−ＲＴプラスミドで形質転換し、ｍｓＤＮＡを合成し
た。この人工的なｍｓＤＮＡをｍｓ１００と称すること
とし、図８に示す。
−ｍｓｄ領域を含む１９６ｂｐの合成ｍｓＤＮＡを、４
本の二本鎖オリゴヌクレオチド単位から合成した。合成
遺伝子ならびにその構成成分を図１１に示す。長さ４６
−５６塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドを８本合成し
た。オリゴヌクレオチドの適当なペアをアニーリングす
るために、１００℃に５分間加熱し、３０℃で３０分
間、そして４℃で３０分間冷却した。一方、大腸菌ｐＩ
ＮＩＩＩ（ｌｐｐp-5 ）発現ベクターレトロンを、Ｘｂ
ａＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、臨床で得られた大腸菌の系
統であるＣ１−１由来のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、
逆転写酵素遺伝子がｌｐｐ−ｌａｃプロモータの制御下
となるように挿入し、大腸菌を形質転換するのに使用し
た。クローンを同定した後、１０．７ｋｂのｐＩＮＩＩ
Ｉ（ｌｐｐp-5 ）−ＥｃＲＴプラスミドＤＮＡを単離し
た。次に、このベクターへの上記の１９６ｂｐの合成ｍ
ｓＤＮＡ断片の挿入を、ＸｂａＩで消化し、ベクターの
末端を細菌性アルカリフォスファターゼで処理し、そし
て断片を所定部位にライゲーションすることによって行
った。この構築過程を図１０に図式的に示す。大腸菌Ｃ
Ｌ−８３を、このｐＩＮＩＩＩ（ｌｐｐp-5 ）ｍｓ１０
０−ＲＴプラスミドで形質転換し、ｍｓＤＮＡを合成し
た。この人工的なｍｓＤＮＡをｍｓ１００と称すること
とし、図８に示す。
【０１５０】実施例６ ２つめの合成ｍｓＤＮＡであるｍｓ１０１を、ｐＵＣ１
９から誘導したベクターであるｐＵＣＫ１９から発現さ
せた。ｐＵＣ１９ＤＮＡを、ＤｒａＩで消化し、２ｋｂ
の断片を単離した。単離した断片を、カナマイシン耐性
遺伝子をコードするＴｎ５由来の１．３ｋｂのＨｉｎｆ
Ｉ断片にライゲーションした。得られた３３ｋｂのプラ
スミドであるｐＵＣＫ１９をＸｂａＩで消化し、さきに
実施例５で説明した１９６ｂｐの合成ｍｓＤＮＡを挿入
した。得られたｐＵＣＫｍｓ１００構築物をＸｈｏＩお
よびＳａｃＩＩで消化したところ、ｍｓ１００の領域内
から６１ｂｐの断片が切除された。４５マーの合成二本
鎖オリゴヌクレオチド（図１２にｍｓ−Ｃｌ，２として
示す）をこのベクターにライゲーションしたところ、ｐ
ＵＣＫｍｓ１０１が得られ、このｐＵＣＫｍｓ１０１で
は、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域がｌａｃの制御下にあった。こ
の構築過程を図１２に図式的に示す。ｐＵＣＫｍｓ１０
０あるいはｐＵＣＫｍｓ１０１を含む大腸菌を、ｐＩＮ
ＩＩＩ（ｌｐｐp-5 ）Ｅｃ６７−ＲＴで形質転換するこ
とにより、逆転写酵素を供給した。こうした構築物を含
む細胞では、ｍｓＤＮＡが生成していることが検出され
た。
９から誘導したベクターであるｐＵＣＫ１９から発現さ
せた。ｐＵＣ１９ＤＮＡを、ＤｒａＩで消化し、２ｋｂ
の断片を単離した。単離した断片を、カナマイシン耐性
遺伝子をコードするＴｎ５由来の１．３ｋｂのＨｉｎｆ
Ｉ断片にライゲーションした。得られた３３ｋｂのプラ
スミドであるｐＵＣＫ１９をＸｂａＩで消化し、さきに
実施例５で説明した１９６ｂｐの合成ｍｓＤＮＡを挿入
した。得られたｐＵＣＫｍｓ１００構築物をＸｈｏＩお
よびＳａｃＩＩで消化したところ、ｍｓ１００の領域内
から６１ｂｐの断片が切除された。４５マーの合成二本
鎖オリゴヌクレオチド（図１２にｍｓ−Ｃｌ，２として
示す）をこのベクターにライゲーションしたところ、ｐ
ＵＣＫｍｓ１０１が得られ、このｐＵＣＫｍｓ１０１で
は、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域がｌａｃの制御下にあった。こ
の構築過程を図１２に図式的に示す。ｐＵＣＫｍｓ１０
０あるいはｐＵＣＫｍｓ１０１を含む大腸菌を、ｐＩＮ
ＩＩＩ（ｌｐｐp-5 ）Ｅｃ６７−ＲＴで形質転換するこ
とにより、逆転写酵素を供給した。こうした構築物を含
む細胞では、ｍｓＤＮＡが生成していることが検出され
た。
【０１５１】実施例７ 精製したＥｃ６７−ＲＴが、ランダム配列から構成され
る各種の鋳型からＤＮＡを合成する能力を、３種の異な
った鋳型：プライマー系を使用することによって調べ
た。大腸菌５ＳｒＲＮＡを、大腸菌５ＳｒＲＮＡの３’
末端と相補的で、重合酵素のプライマーの役目を果たす
１５塩基の合成オリゴＤＮＡ（１５マー）にアニーリン
グした。この５ＳｒＲＮＡ鋳型：プライマーの調製に際
しては、３０ｐモルの大腸菌５ＳｒＲＮＡ（ベーリンガ
ー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉ
ｍ））を、１２０ｐモルの１５塩基の合成オリゴＤＮＡ
（５’−ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＣＣ−３’）と混
合した。この混合物を乾燥し、３０μｌのホルムアミド
溶液’（８０％のホルムアミド、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ
（ｐＨ６．５）、０．４ＭのＮａＣｌ）に再度溶解し
た。次に、この溶液を１０分間にわたり９０℃に加熱
し、２−３時間にわたり３７℃とし、その後、３０分間
にわたり室温とした。次に、アニーリングした鋳型：プ
ライマーをエタノールで沈殿させ、凍結乾燥した。
る各種の鋳型からＤＮＡを合成する能力を、３種の異な
った鋳型：プライマー系を使用することによって調べ
た。大腸菌５ＳｒＲＮＡを、大腸菌５ＳｒＲＮＡの３’
末端と相補的で、重合酵素のプライマーの役目を果たす
１５塩基の合成オリゴＤＮＡ（１５マー）にアニーリン
グした。この５ＳｒＲＮＡ鋳型：プライマーの調製に際
しては、３０ｐモルの大腸菌５ＳｒＲＮＡ（ベーリンガ
ー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉ
ｍ））を、１２０ｐモルの１５塩基の合成オリゴＤＮＡ
（５’−ＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＣＣ−３’）と混
合した。この混合物を乾燥し、３０μｌのホルムアミド
溶液’（８０％のホルムアミド、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ
（ｐＨ６．５）、０．４ＭのＮａＣｌ）に再度溶解し
た。次に、この溶液を１０分間にわたり９０℃に加熱
し、２−３時間にわたり３７℃とし、その後、３０分間
にわたり室温とした。次に、アニーリングした鋳型：プ
ライマーをエタノールで沈殿させ、凍結乾燥した。
【０１５２】このアニーリングした鋳型：プライマー
を、ｄＮＴＰおよび〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰを含有する反
応緩衝液（ｐＨ７．８）に加えた。この反応混合物に、
精製Ｅｃ６７−ＲＴを含有するグリセロール勾配分画の
一部を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。生
成物をＲＮアーゼＡで処理してから、ゲル電気泳動で分
析した。鋳型として５ＳｒＲＮＡを使用し、プライマー
の３’末端からＤＮＡの合成が行われて鎖が完全に伸長
すると、ヌクレオチド１２０個のＤＮＡ生成物が得られ
るはずである。図１３のレーン１は、Ｅｃ６７−ＲＴに
よって形成された生成物を、６％ポリアクリルアミド配
列決定用ゲルで電気泳動した標識生成物を示す。ＲＮア
ーゼＡを用いた処理に対して抵抗性の優勢なバンドは、
約１２０塩基の位置まで移動した。反応混合物に、細菌
性の酵素のかわりにトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵
素（ＡＭＶ−ＲＴ）を含有させた場合にも、同様のサイ
ズのバンドが生成した（図１３、レーン４の矢印）。中
間のサイズの生成物がいくつか生成したものの、細菌性
の酵素も、レトロウイルス性の重合酵素と同様に、プラ
イマーとして１５マーのＤＮＡを使用し、鋳型として５
ＳｒＲＮＡを使用すると、塩基１２０個の完全な長さの
ｃＤＮＡを合成した。
を、ｄＮＴＰおよび〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰを含有する反
応緩衝液（ｐＨ７．８）に加えた。この反応混合物に、
精製Ｅｃ６７−ＲＴを含有するグリセロール勾配分画の
一部を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。生
成物をＲＮアーゼＡで処理してから、ゲル電気泳動で分
析した。鋳型として５ＳｒＲＮＡを使用し、プライマー
の３’末端からＤＮＡの合成が行われて鎖が完全に伸長
すると、ヌクレオチド１２０個のＤＮＡ生成物が得られ
るはずである。図１３のレーン１は、Ｅｃ６７−ＲＴに
よって形成された生成物を、６％ポリアクリルアミド配
列決定用ゲルで電気泳動した標識生成物を示す。ＲＮア
ーゼＡを用いた処理に対して抵抗性の優勢なバンドは、
約１２０塩基の位置まで移動した。反応混合物に、細菌
性の酵素のかわりにトリ骨髄芽球症ウイルスの逆転写酵
素（ＡＭＶ−ＲＴ）を含有させた場合にも、同様のサイ
ズのバンドが生成した（図１３、レーン４の矢印）。中
間のサイズの生成物がいくつか生成したものの、細菌性
の酵素も、レトロウイルス性の重合酵素と同様に、プラ
イマーとして１５マーのＤＮＡを使用し、鋳型として５
ＳｒＲＮＡを使用すると、塩基１２０個の完全な長さの
ｃＤＮＡを合成した。
【０１５３】Ｅｃ６７−ＲＴは、ＤＮＡを鋳型として使
用した場合にもＤＮＡを重合した。この反応では、５０
塩基の合成ＤＮＡを、その３’末端と相補的な２０マー
の合成ＤＮＡプライマーとアニーリングした。すなわ
ち、５０塩基の合成オリゴＤＮＡ鋳型（５’−ＣＧＧＴ
ＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣ
ＴＧＣＧＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡ−３’）
を、相補的な２０塩基のオリゴＤＮＡプライマー（５’
−ＴＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡ−３’）と同様
にしてアニーリングした。大腸菌Ｃ２１１０／ｐＣ１−
１ＥＰ５ｂの一晩置いた培養液１．２mlから調製した全
ＲＮＡを、ｍｓＤＮＡが鋳型：プライマーの役目を果た
す反応に使用した。ＲＮＡは、高温フェノール法によっ
て生成した。
用した場合にもＤＮＡを重合した。この反応では、５０
塩基の合成ＤＮＡを、その３’末端と相補的な２０マー
の合成ＤＮＡプライマーとアニーリングした。すなわ
ち、５０塩基の合成オリゴＤＮＡ鋳型（５’−ＣＧＧＴ
ＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣ
ＴＧＣＧＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡ−３’）
を、相補的な２０塩基のオリゴＤＮＡプライマー（５’
−ＴＴＴＣＡＣＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡ−３’）と同様
にしてアニーリングした。大腸菌Ｃ２１１０／ｐＣ１−
１ＥＰ５ｂの一晩置いた培養液１．２mlから調製した全
ＲＮＡを、ｍｓＤＮＡが鋳型：プライマーの役目を果た
す反応に使用した。ＲＮＡは、高温フェノール法によっ
て生成した。
【０１５４】このオリゴＤＮＡ鋳型：プライマーを、Ｅ
ｃ６７−ＲＴと反応させた。生じた生成物を図１３、レ
ーン２に示す。レーン２の下の方に、約２０塩基のサイ
ズの位置まで移動した小さなバンドが見える。このバン
ドは、１−３個のｄＮＴＰだけが２０塩基のプライマー
に付加されたことを示唆するもので、これは、プライマ
ーの３’末端から伸長する１個目および３個目の塩基が
標識ｄＣＴＰを取り込んで、この小型の生成物を生じる
と予測されるからである。５０塩基のサイズ付近にも、
さらに大型であるものの、弱度に標識されたバンドが存
在する（図１３、矢印）。この生成物は、ＲＮアーゼＡ
を用いた処理に対して抵抗性で、５０塩基の鋳型の全長
にわたって伸長した相補的なＤＮＡについて期待される
サイズを有していた。反応で、細菌性の酵素のかわりに
ＡＭＶ−ＲＴを用いた場合にも、同様のサイズの強度に
標識されたバンドが形成される（図１３、レーン５）。
Ｅｃ６７−ＲＴが、５ＳｒＲＡＮＡ鋳型あるいはオリゴ
ＤＮＡ鋳型から、全長のｃＤＮＡを合成する能力は、鋳
型にアニーリングされたプライマーに依存している。
ｃ６７−ＲＴと反応させた。生じた生成物を図１３、レ
ーン２に示す。レーン２の下の方に、約２０塩基のサイ
ズの位置まで移動した小さなバンドが見える。このバン
ドは、１−３個のｄＮＴＰだけが２０塩基のプライマー
に付加されたことを示唆するもので、これは、プライマ
ーの３’末端から伸長する１個目および３個目の塩基が
標識ｄＣＴＰを取り込んで、この小型の生成物を生じる
と予測されるからである。５０塩基のサイズ付近にも、
さらに大型であるものの、弱度に標識されたバンドが存
在する（図１３、矢印）。この生成物は、ＲＮアーゼＡ
を用いた処理に対して抵抗性で、５０塩基の鋳型の全長
にわたって伸長した相補的なＤＮＡについて期待される
サイズを有していた。反応で、細菌性の酵素のかわりに
ＡＭＶ−ＲＴを用いた場合にも、同様のサイズの強度に
標識されたバンドが形成される（図１３、レーン５）。
Ｅｃ６７−ＲＴが、５ＳｒＲＡＮＡ鋳型あるいはオリゴ
ＤＮＡ鋳型から、全長のｃＤＮＡを合成する能力は、鋳
型にアニーリングされたプライマーに依存している。
【０１５５】図１３の各レーンは以下の通りであった。
レーンＳ：ＭｓｐＩで消化し、クレノウ断片を用いて32
Ｐで標識したｐＢＲ３２２。レーン１：鋳型である大腸
菌５ＳｒＲＮＡをプライマーである相補的な１５マーの
合成ＤＮＡにアニーリングしたものを含む反応混合物
に、Ｅｃ６７−ＲＴを加えた場合に合成されるｃＤＮＡ
生成物。レーン２：Ｅｃ６７−ＲＴを、２０マーのＤＮ
Ａプライマーにアニーリングした鋳型である５０塩基の
合成ＤＮＡに加えた場合。レーン３：Ｅｃ６７−ＲＴ
を、鋳型：プライマーであるｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を含
有する大腸菌Ｃ２１１０／ｐＣ１−１ＥＰ５ｂから得た
全ＲＮＡに加えた場合。レーン４、５および６は、反応
混合物に、Ｅｃ６７−ＲＴのかわりにＡＭＶ−ＲＴを含
有させたこと以外は、それぞれ、レ−ン１、２、および
３と同じ反応である。ＡＭＶ−ＲＴを用いた反応の生成
物は、１００倍に希釈してからゲルに流した。本明細書
に開示した他の逆転写酵素も、同様にして、ｃＤＮＡを
ＤＮＡあるいはＲＮＡ鋳型から合成しうるものである。
レーンＳ：ＭｓｐＩで消化し、クレノウ断片を用いて32
Ｐで標識したｐＢＲ３２２。レーン１：鋳型である大腸
菌５ＳｒＲＮＡをプライマーである相補的な１５マーの
合成ＤＮＡにアニーリングしたものを含む反応混合物
に、Ｅｃ６７−ＲＴを加えた場合に合成されるｃＤＮＡ
生成物。レーン２：Ｅｃ６７−ＲＴを、２０マーのＤＮ
Ａプライマーにアニーリングした鋳型である５０塩基の
合成ＤＮＡに加えた場合。レーン３：Ｅｃ６７−ＲＴ
を、鋳型：プライマーであるｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を含
有する大腸菌Ｃ２１１０／ｐＣ１−１ＥＰ５ｂから得た
全ＲＮＡに加えた場合。レーン４、５および６は、反応
混合物に、Ｅｃ６７−ＲＴのかわりにＡＭＶ−ＲＴを含
有させたこと以外は、それぞれ、レ−ン１、２、および
３と同じ反応である。ＡＭＶ−ＲＴを用いた反応の生成
物は、１００倍に希釈してからゲルに流した。本明細書
に開示した他の逆転写酵素も、同様にして、ｃＤＮＡを
ＤＮＡあるいはＲＮＡ鋳型から合成しうるものである。
【０１５６】実施例８ 本発明のｍｓＤＮＡは、無細胞系中でインビトロにて合
成することもできる。ＲＴ−Ｅｃ６７と、レトロン−Ｅ
ｃ６７のｍｓｒ−ｍｓｄ領域からの一次転写産物を含有
する全ＲＮＡ分画とを単離し、混合し、４種のｄＮＴＰ
の存在下で、反応に適した温度（好ましくは生理的温
度）にて、緩衝液の存在下でインキュベートすることに
より、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を新規に合成した。反応生
成物を、ＲＮＡ転写産物の５’末端を取り除くために、
ＲＮアーゼＡとともにインキュベートした。以下に、実
験のプロトコールを詳しく説明する。
成することもできる。ＲＴ−Ｅｃ６７と、レトロン−Ｅ
ｃ６７のｍｓｒ−ｍｓｄ領域からの一次転写産物を含有
する全ＲＮＡ分画とを単離し、混合し、４種のｄＮＴＰ
の存在下で、反応に適した温度（好ましくは生理的温
度）にて、緩衝液の存在下でインキュベートすることに
より、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を新規に合成した。反応生
成物を、ＲＮＡ転写産物の５’末端を取り除くために、
ＲＮアーゼＡとともにインキュベートした。以下に、実
験のプロトコールを詳しく説明する。
【０１５７】細菌系ならびに培養液──大腸菌ＳＢ２２
１（中村ら、１９８２）およびＣ２１１０（中村のｒｈ
ａ ｐｏｌＡ１）を使用した。プラスミドを含むこれら
の大腸菌細胞をＬ−ブロス（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、
１９７２）中で、アンピシリン（５０μｇ／ml）あるい
はスペクチノマイシン（５０μｇ／ml）の存在下で培養
した。
１（中村ら、１９８２）およびＣ２１１０（中村のｒｈ
ａ ｐｏｌＡ１）を使用した。プラスミドを含むこれら
の大腸菌細胞をＬ−ブロス（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、
１９７２）中で、アンピシリン（５０μｇ／ml）あるい
はスペクチノマイシン（５０μｇ／ml）の存在下で培養
した。
【０１５８】プラスミドの構築と突然変異産物の単離─
─レトロン−Ｅｃ６７からｍｓｒ−ｍｓｄ領域を発現さ
せるために、塩基番号１８１−１８６（ランプソン（Ｌ
ａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂの図６参照）のＢｓｓＨ
ＩＩ部位を、平滑末端であるＢｓｓＨＩＩ部位に８マー
のＢａｍＨＩリンカーを挿入することによってＢａｍＨ
Ｉ部位に変化させた。次に、６１５ｂｐのＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１
９８９ｂの図６の塩基番号７９５−８００）を単離し
た。この断片は、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域ならびにそれ自身
のプロモーターと、逆転写酵素遺伝子の５’末端部分
（５８６個の残基を有するＲＴ−Ｅｃ６７のうち、Ｎ末
端の１２６個の残基をコードする部分）とから構成され
ており、次に、この断片をｐＳＰ６５（ベーリンガー・
マンハイム）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクロ
ーニングした。得られたプラスミドを、ｐ６７−ＢＨ
Ｏ．６と名づけた。ＲＴ−Ｅｃ６７を精製する目的で、
逆転写酵素遺伝子を、ｌｐｐ−ｌａｃプロモーターの制
御下にクローニングした。この目的で、まずオリゴヌク
レオチド依存性部位特異的突然変異誘発（井上および井
上、１９９１）によって、逆転写酵素の開始コドンより
１３塩基上流側に、ＸｂａＩ部位を形成した。すなわ
ち、ＴＣＴＧ（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９
８９ｂの図６の塩基番号４１０−４０４）をＴＣＴＡＧ
Ａ（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）らの図１Ａ参照）に
変化させた。次に、得られた３．３ｋｂのＸｂａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を、ｐＧＢ２（チャーチワード（Ｃｈｕｒ
ｃｈｗａｒｄ）ら、１９８４）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ
部位に、ｐＩＮＩＩＩｌｐｐp-5 の１ｋｂのＰｓｔＩ−
ＢａｍＨＩ断片をクローニングすることによって構築し
たｐＧＢ２１ｐｐp-5 のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にク
ローニングした。得られたプラスミドをｐＲＴ−６７と
名づけた。各種のｍｓｄ−ｍｓｒ突然変異産物を、ｐ６
７−ＢＨＯ．６（図１）を使用したオリゴヌクレオチド
依存性部位特異的突然変異誘発（井上および井上、１９
９１）によって単離した。使用したオリゴヌクレオチド
は以下のものである。突然変異１（図１Ｃの１１８の位
置でのＡからＴへの突然変異）については、５’−ＴＧ
ＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡ−３’。突然変異２
（図１Ｃの１１８の位置でのＡからＧへの突然変異）に
ついては、ＴＧＣＧＡＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡ。突
然変異３（図１Ｃの１５の位置での枝分かれＧからＡへ
の突然変異）については、ＡＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＴＴ
ＴＧＴＴＧＧ。そして、突然変異４（図１Ｃの１１９の
位置でのＧからＡへの突然変異）については、ＴＧＣＧ
ＡＡＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＡＴ。
─レトロン−Ｅｃ６７からｍｓｒ−ｍｓｄ領域を発現さ
せるために、塩基番号１８１−１８６（ランプソン（Ｌ
ａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂの図６参照）のＢｓｓＨ
ＩＩ部位を、平滑末端であるＢｓｓＨＩＩ部位に８マー
のＢａｍＨＩリンカーを挿入することによってＢａｍＨ
Ｉ部位に変化させた。次に、６１５ｂｐのＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１
９８９ｂの図６の塩基番号７９５−８００）を単離し
た。この断片は、ｍｓｒ−ｍｓｄ領域ならびにそれ自身
のプロモーターと、逆転写酵素遺伝子の５’末端部分
（５８６個の残基を有するＲＴ−Ｅｃ６７のうち、Ｎ末
端の１２６個の残基をコードする部分）とから構成され
ており、次に、この断片をｐＳＰ６５（ベーリンガー・
マンハイム）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクロ
ーニングした。得られたプラスミドを、ｐ６７−ＢＨ
Ｏ．６と名づけた。ＲＴ−Ｅｃ６７を精製する目的で、
逆転写酵素遺伝子を、ｌｐｐ−ｌａｃプロモーターの制
御下にクローニングした。この目的で、まずオリゴヌク
レオチド依存性部位特異的突然変異誘発（井上および井
上、１９９１）によって、逆転写酵素の開始コドンより
１３塩基上流側に、ＸｂａＩ部位を形成した。すなわ
ち、ＴＣＴＧ（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９
８９ｂの図６の塩基番号４１０−４０４）をＴＣＴＡＧ
Ａ（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）らの図１Ａ参照）に
変化させた。次に、得られた３．３ｋｂのＸｂａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を、ｐＧＢ２（チャーチワード（Ｃｈｕｒ
ｃｈｗａｒｄ）ら、１９８４）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ
部位に、ｐＩＮＩＩＩｌｐｐp-5 の１ｋｂのＰｓｔＩ−
ＢａｍＨＩ断片をクローニングすることによって構築し
たｐＧＢ２１ｐｐp-5 のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にク
ローニングした。得られたプラスミドをｐＲＴ−６７と
名づけた。各種のｍｓｄ−ｍｓｒ突然変異産物を、ｐ６
７−ＢＨＯ．６（図１）を使用したオリゴヌクレオチド
依存性部位特異的突然変異誘発（井上および井上、１９
９１）によって単離した。使用したオリゴヌクレオチド
は以下のものである。突然変異１（図１Ｃの１１８の位
置でのＡからＴへの突然変異）については、５’−ＴＧ
ＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡ−３’。突然変異２
（図１Ｃの１１８の位置でのＡからＧへの突然変異）に
ついては、ＴＧＣＧＡＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡ。突
然変異３（図１Ｃの１５の位置での枝分かれＧからＡへ
の突然変異）については、ＡＴＧＴＡＧＧＣＡＡＡＴＴ
ＴＧＴＴＧＧ。そして、突然変異４（図１Ｃの１１９の
位置でのＧからＡへの突然変異）については、ＴＧＣＧ
ＡＡＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＣＡＴ。
【０１５９】ＲＴ−Ｅｃ６７の精製──（Ｅｃ６７由来
の）逆転写酵素を、ｐＲＴ−６７を有するＣ２１１０か
ら、ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）、２４３、１０３３−１０３８（１９８
９ｂ）（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、生物化学雑
誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２６５、８４９０−８４
９６（１９９０）も参照のこと）に記載された方法を若
干改変した方法によって精製した。ＤＥＡＥ−セルロー
スバッチでの精製の後、サンプルをモノＱカラム（５ミ
リメートル×５０ミリメートル）に加えた。ファルマシ
アのＦＰＬＣ装置を使用し、ＮａＣｌの２５０ｍＭから
１Ｍの一次勾配を用いて溶出を行った。逆転写酵素活性
は、ＮａＣｌの３２０ｍＭ−３５０ｍＭの範囲で溶出さ
れ、この溶出物を分離した。
の）逆転写酵素を、ｐＲＴ−６７を有するＣ２１１０か
ら、ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）、２４３、１０３３−１０３８（１９８
９ｂ）（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、生物化学雑
誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２６５、８４９０−８４
９６（１９９０）も参照のこと）に記載された方法を若
干改変した方法によって精製した。ＤＥＡＥ−セルロー
スバッチでの精製の後、サンプルをモノＱカラム（５ミ
リメートル×５０ミリメートル）に加えた。ファルマシ
アのＦＰＬＣ装置を使用し、ＮａＣｌの２５０ｍＭから
１Ｍの一次勾配を用いて溶出を行った。逆転写酵素活性
は、ＮａＣｌの３２０ｍＭ−３５０ｍＭの範囲で溶出さ
れ、この溶出物を分離した。
【０１６０】ｍｓｒ−ｍｓｄ領域からのＲＮＡ転写産物
の単離──ｐ６７−ＢＨＯ．６を有するＳＢ２２１細胞
から、全ＲＮＡ分画を、チョムクジンスキら（Ｃｈｏｍ
ｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ）、１９８７）に記
載された方法を用いて単離した。ｍｓｒ−ｍｓｄ領域か
らの転写産物を含むこの分画を、無細胞系中でｍｓＤＮ
Ａを合成する際の鋳型として使用した。
の単離──ｐ６７−ＢＨＯ．６を有するＳＢ２２１細胞
から、全ＲＮＡ分画を、チョムクジンスキら（Ｃｈｏｍ
ｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ）、１９８７）に記
載された方法を用いて単離した。ｍｓｒ−ｍｓｄ領域か
らの転写産物を含むこの分画を、無細胞系中でｍｓＤＮ
Ａを合成する際の鋳型として使用した。
【０１６１】ｍｓＤＮＡの合成に用いる無細胞系──ｍ
ｓＤＮＡを生成するために、逆転写酵素−緩衝液（５０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのジチオ
トレイオール、４０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 ）、ならびに２μＣｉの〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰおよ
び２．５ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴ
Ｐを含有する１０μｌの反応混合物に、１mlの培養液か
ら得た全ＲＮＡ分画を加えた。２μｌのモノＱで精製し
た逆転写酵素分画を加えることによって、反応を開始し
た。混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。
９Ｍの尿素を含む６％のアクリルアミドゲルで電気泳動
を行ってからオートラジオグラフィーを行うことによっ
て、サンプルを分析した。
ｓＤＮＡを生成するために、逆転写酵素−緩衝液（５０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１ｍＭのジチオ
トレイオール、４０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 ）、ならびに２μＣｉの〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰおよ
び２．５ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴ
Ｐを含有する１０μｌの反応混合物に、１mlの培養液か
ら得た全ＲＮＡ分画を加えた。２μｌのモノＱで精製し
た逆転写酵素分画を加えることによって、反応を開始し
た。混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。
９Ｍの尿素を含む６％のアクリルアミドゲルで電気泳動
を行ってからオートラジオグラフィーを行うことによっ
て、サンプルを分析した。
【０１６２】ＤＮＡ伸長におけるジデオキシ配列分析─
─２５mlの培養液から生成した全ＲＮＡ分画を、１００
μＣｉの〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰならびに２０μｌのモノ
Ｑで精製した逆転写酵素分画を含む逆転写酵素緩衝液を
含有する１００μｌの反応混合物に加えた。３７℃で５
分間インキュベートしてから、反応混合物を５本の試験
管に分けた（それぞれ２０μｌ）。４本の試験管を、Ｄ
ＮＡ塩基配列決定用停止混合物１４μｌを使用し、シー
クエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ユナイティド・ステ
ート・バイオケミカル社（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．））用いて、そ
れぞれの鎖伸長停止反応に使用した。反応混合物を３７
℃で１５分間インキュベートしてから、各反応混合物に
０．５μｌのＲＮアーゼＡ（１０mg／ml）および１．３
μｌの０．２５ＭのＥＤＴＡを加え、この混合物をさら
に５分間インキュベートした。この反応混合物をフェノ
ールで抽出し、次に、クロロホルムで抽出した。反応生
成物をエタノールで沈殿させ、次に、６μｌのサンプル
緩衝液（３２％のホルムアミド、６．７ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．０１７％のＢＰＢおよびＸＣ）中に溶解した。
溶解したサンプルを９５℃で２分間加熱した。ｍｓＤＮ
Ａを分離し、１０％の配列決定用ゲルで分析した。
─２５mlの培養液から生成した全ＲＮＡ分画を、１００
μＣｉの〔α−32Ｐ〕ｄＴＴＰならびに２０μｌのモノ
Ｑで精製した逆転写酵素分画を含む逆転写酵素緩衝液を
含有する１００μｌの反応混合物に加えた。３７℃で５
分間インキュベートしてから、反応混合物を５本の試験
管に分けた（それぞれ２０μｌ）。４本の試験管を、Ｄ
ＮＡ塩基配列決定用停止混合物１４μｌを使用し、シー
クエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ユナイティド・ステ
ート・バイオケミカル社（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．））用いて、そ
れぞれの鎖伸長停止反応に使用した。反応混合物を３７
℃で１５分間インキュベートしてから、各反応混合物に
０．５μｌのＲＮアーゼＡ（１０mg／ml）および１．３
μｌの０．２５ＭのＥＤＴＡを加え、この混合物をさら
に５分間インキュベートした。この反応混合物をフェノ
ールで抽出し、次に、クロロホルムで抽出した。反応生
成物をエタノールで沈殿させ、次に、６μｌのサンプル
緩衝液（３２％のホルムアミド、６．７ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．０１７％のＢＰＢおよびＸＣ）中に溶解した。
溶解したサンプルを９５℃で２分間加熱した。ｍｓＤＮ
Ａを分離し、１０％の配列決定用ゲルで分析した。
【０１６３】以上に説明した方法を用いることによっ
て、ｍｓｒ−ｍｓｄコード領域を含むＲＮＡ断片と逆転
写酵素とから、他のｍｓＤＮＡを同様にして合成するこ
ともできる。
て、ｍｓｒ−ｍｓｄコード領域を含むＲＮＡ断片と逆転
写酵素とから、他のｍｓＤＮＡを同様にして合成するこ
ともできる。
【０１６４】本明細書には、本発明の好適実施態様を記
載したものであって、これらの態様には、本発明の範囲
から逸脱することなく種々の変更および修正を加えるこ
とができ、それらも特許請求の範囲に含まれるものであ
ると理解されたい。
載したものであって、これらの態様には、本発明の範囲
から逸脱することなく種々の変更および修正を加えるこ
とができ、それらも特許請求の範囲に含まれるものであ
ると理解されたい。
【０１６５】
アンチセンスの研究と発展（Antisense Research and D
evelopment）、１、２０７−２１７（１９９１）、ケー
スら（Caseおよび Dhundale ）による会議のレビューで
ある「会議報告─アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡによ
る遺伝子の制御（Meeting Report: Gene Regulation by
Antisense RNA and DNA) 」、ホーキングら（Hawking
および Krieg ）編、メアリ−・アン・リーバート社
（ Mary Ann Liebert, Inc. ）出版）、および「アンチ
センス特許一覧─１９７１−１９９１（ A Listing of
Antisense Patents 1971-1991 ）」、第２１９頁 ＢＲＬカタログ（BRL Catalogue ）第１７頁（１９８
５） チョムクジンスキら（Chomczynski および Sacchi ）、
分析生化学（Analytical Biochemistry ）、１６２、１
５６−１５９（１９８７） チャーチワード（Churchward）ら、遺伝子（Gene）、３
１、１６５−１７１（１９８４） 分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in
Molecular Biology）、第１巻、（「プロトコール（Pr
otocols ）、第３．７．１−３．７．２節ダンデール
（Dhundale）、細胞（Cell）、５１、１１０５−１１１
２（１９８７） ダンデール（Dhundale）、生物化学雑誌（Journal of B
iological Chemistry）、２６３、９０５５−９０５８
（１９８８） ヒラシマ（Hirashima ）ら、米国国立科学アカデミー紀
要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８３、７７２６−
７７３０（１９８６年１０月） ホウツら（G.E. Houts、M. Miyagi 、C. Ellis、D. Bra
nd、および J.W. Beard ）、ウイルス学雑誌（J. Viro
l. ）、２９、５１７（１９７９） フスー（Hsu ）(Mei-Yim Hsu, Susan G.Eagle, Masayor
i Inouye, and SumikoInouye)ら、「枝分かれＲＮＡに
結合したｍｓＤＮＡの、大腸菌のレトロンＥｃ６７から
の無細胞合成（Cell-free Synthesis of the Branched
RNA-linked msDNA from Retron-Ec67 of Eschrichia co
li）」（生物化学雑誌（JBC ）The Journal of Biologi
cal Chemistry 267 No.26 pp.13823-13829,1992 ） 井上、遺伝子（Gene）、７２、２５−３４（１９８８） 井上および井上、マックファーソン（McPherson ）編、
「依存性突然変異誘発─実践的アプローチ（Directed M
utagenesis: A Practical Approach ）」、１８１、オ
ックスフォード大学出版局（Oxford University Press
）、ニューヨーク（１９９１） 井上および井上、核酸研究（Nucleic Acids Res.）、１
３、３１０１−３１１０（１９８５） ランプソン（Lampson ）ら、細胞（Cell）、５６、７０
１−７０７（１９８９ａ） ランプソン（Lampson ）ら、生物化学雑誌（J. Biol. C
hem.）、２６５、８４９０−８４９６（１９９０） ランプソン（Lampson ）ら、サイエンス（Science ）、
２４３、１０３３−１０３８（１９８９ｂ） リースら（Lease および Yee）、生物化学雑誌（J B C
）、２６６、１４４９７−１４５０３（１９９１年８
月） リムら（Lim および Maas ）、細胞（Cell）、５６、８
９１−９０４（１９８９年３月１０日） マーカス（Marcus）ら、ウイルス学雑誌（J. Virol.
）、１４、８５３（１９７４） ミラー（J.H. Miller ）、分子遺伝学の実験（Experime
nts in Molecular Genetics ）（第３版）、４３３、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Harbor Laboratory ）、コールド・スプリング・
ハーバー（ColdSpring Harbor）、ニューヨーク（１９
７２） 分子クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）（「マニアティス（Maniati
s）」）、第１２９−１３０および２１３−２１６頁 分子クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）（「サムブルック（Sambroo
k）」）、第１巻、４．３３−４．３８節 分子クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）（「サムブルック（Sambroo
k）」）、第１巻、５．３４、５．５２−５．５５節、
７．７９−７．８３節、第２巻、８．１１−８．１３、
８．６０−８．６３、１４．２０−１４．２１、および
１０．１３節（およびＢ．２６） 中村、応用分子遺伝学雑誌（J. Appl. Mol. Geneti.
）、１、２８９−２９９（１９８２） ロス（Roth）ら、生物化学雑誌（J. Biol. Chem.）、２
６０、９３２６−９３３５（１９８５） サンガー（Sanger）ら、米国国立科学アカデミー紀要
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７４、５４６３−５
４６７（１９７７） サイエンス（Science ）、２５２、１３７４−１３７５
（１９９１年６月２７日）、「ついに成熟した三重螺旋
ＤＮＡ（Triplex DNA Finally Comes of Age）」 ヴァーマ（I.M. Verma）、酵素（The Enzymes ）、第１
４Ａ巻（ボイヤー（P.D. Boyer）編）、８７−１０４、
アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨー
ク（１９７７） ワイナー（Weiner）ら、生化学年報（Ann. Rev. Bioche
m.）、５５、６３１−６６１（１９８６） イェー（Yee ）ら、細胞（Cell）、３８、２０３−２０
９（１９８４）
evelopment）、１、２０７−２１７（１９９１）、ケー
スら（Caseおよび Dhundale ）による会議のレビューで
ある「会議報告─アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡによ
る遺伝子の制御（Meeting Report: Gene Regulation by
Antisense RNA and DNA) 」、ホーキングら（Hawking
および Krieg ）編、メアリ−・アン・リーバート社
（ Mary Ann Liebert, Inc. ）出版）、および「アンチ
センス特許一覧─１９７１−１９９１（ A Listing of
Antisense Patents 1971-1991 ）」、第２１９頁 ＢＲＬカタログ（BRL Catalogue ）第１７頁（１９８
５） チョムクジンスキら（Chomczynski および Sacchi ）、
分析生化学（Analytical Biochemistry ）、１６２、１
５６−１５９（１９８７） チャーチワード（Churchward）ら、遺伝子（Gene）、３
１、１６５−１７１（１９８４） 分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in
Molecular Biology）、第１巻、（「プロトコール（Pr
otocols ）、第３．７．１−３．７．２節ダンデール
（Dhundale）、細胞（Cell）、５１、１１０５−１１１
２（１９８７） ダンデール（Dhundale）、生物化学雑誌（Journal of B
iological Chemistry）、２６３、９０５５−９０５８
（１９８８） ヒラシマ（Hirashima ）ら、米国国立科学アカデミー紀
要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８３、７７２６−
７７３０（１９８６年１０月） ホウツら（G.E. Houts、M. Miyagi 、C. Ellis、D. Bra
nd、および J.W. Beard ）、ウイルス学雑誌（J. Viro
l. ）、２９、５１７（１９７９） フスー（Hsu ）(Mei-Yim Hsu, Susan G.Eagle, Masayor
i Inouye, and SumikoInouye)ら、「枝分かれＲＮＡに
結合したｍｓＤＮＡの、大腸菌のレトロンＥｃ６７から
の無細胞合成（Cell-free Synthesis of the Branched
RNA-linked msDNA from Retron-Ec67 of Eschrichia co
li）」（生物化学雑誌（JBC ）The Journal of Biologi
cal Chemistry 267 No.26 pp.13823-13829,1992 ） 井上、遺伝子（Gene）、７２、２５−３４（１９８８） 井上および井上、マックファーソン（McPherson ）編、
「依存性突然変異誘発─実践的アプローチ（Directed M
utagenesis: A Practical Approach ）」、１８１、オ
ックスフォード大学出版局（Oxford University Press
）、ニューヨーク（１９９１） 井上および井上、核酸研究（Nucleic Acids Res.）、１
３、３１０１−３１１０（１９８５） ランプソン（Lampson ）ら、細胞（Cell）、５６、７０
１−７０７（１９８９ａ） ランプソン（Lampson ）ら、生物化学雑誌（J. Biol. C
hem.）、２６５、８４９０−８４９６（１９９０） ランプソン（Lampson ）ら、サイエンス（Science ）、
２４３、１０３３−１０３８（１９８９ｂ） リースら（Lease および Yee）、生物化学雑誌（J B C
）、２６６、１４４９７−１４５０３（１９９１年８
月） リムら（Lim および Maas ）、細胞（Cell）、５６、８
９１−９０４（１９８９年３月１０日） マーカス（Marcus）ら、ウイルス学雑誌（J. Virol.
）、１４、８５３（１９７４） ミラー（J.H. Miller ）、分子遺伝学の実験（Experime
nts in Molecular Genetics ）（第３版）、４３３、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Harbor Laboratory ）、コールド・スプリング・
ハーバー（ColdSpring Harbor）、ニューヨーク（１９
７２） 分子クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）（「マニアティス（Maniati
s）」）、第１２９−１３０および２１３−２１６頁 分子クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）（「サムブルック（Sambroo
k）」）、第１巻、４．３３−４．３８節 分子クローニング─実験の手引き（Molecular Cloning:
A Laboratory Manual）（「サムブルック（Sambroo
k）」）、第１巻、５．３４、５．５２−５．５５節、
７．７９−７．８３節、第２巻、８．１１−８．１３、
８．６０−８．６３、１４．２０−１４．２１、および
１０．１３節（およびＢ．２６） 中村、応用分子遺伝学雑誌（J. Appl. Mol. Geneti.
）、１、２８９−２９９（１９８２） ロス（Roth）ら、生物化学雑誌（J. Biol. Chem.）、２
６０、９３２６−９３３５（１９８５） サンガー（Sanger）ら、米国国立科学アカデミー紀要
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７４、５４６３−５
４６７（１９７７） サイエンス（Science ）、２５２、１３７４−１３７５
（１９９１年６月２７日）、「ついに成熟した三重螺旋
ＤＮＡ（Triplex DNA Finally Comes of Age）」 ヴァーマ（I.M. Verma）、酵素（The Enzymes ）、第１
４Ａ巻（ボイヤー（P.D. Boyer）編）、８７−１０４、
アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨー
ク（１９７７） ワイナー（Weiner）ら、生化学年報（Ann. Rev. Bioche
m.）、５５、６３１−６６１（１９８６） イェー（Yee ）ら、細胞（Cell）、３８、２０３−２０
９（１９８４）
【図１】 ｐＣ１−１ＥＰ５の制限地図、ｍｓＤＮＡ−
Ｅｃ６７の推定二次構造、ならびにＲＮＡ前駆体分子の
推定二次構造を示す模式図である。図１Ａは、ｐＣ１−
１ＥＰ５（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９
ｂ）の制限地図を示す図である。ＢａｍＨＩ部位に変わ
ったＢｓｓＨＩ部位を矢印で示し、部位特異的突然変異
誘発によって生じたＸｂａＩ部位も矢印で示す。ｍｓｒ
およびｍｓｄ、ならびに逆転写酵素遺伝子の位置および
向きを矢印で示す。ｐ６７−ＢＨＯ．６およびｐ６７−
ＲＴにクローニングされた領域を、それぞれ、白い矩形
で示す。図１Ｂは、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７（ランプソン
（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）の構造を示す図で
ある。枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲み、ＲＮＡ
を矩形で囲んで示す。ＲＮＡもＤＮＡも、５’末端から
番号をふってある。図１Ｃは、ＲＮＡ前駆体分子の推定
二次構造を示す図である。ＲＮＡ転写産物の５’末端
は、プライマー伸長法で決定した（フスー（Ｈｓｕ）
ら、M.Y.Hsu, S.Eagle, M.Inouye, J.B.C., 267. No.26
pp.13823 〜13829 ）。ＲＮＡ分子の３’末端は、ＲＮ
Ａ一次転写産物中の逆方向反復塩基配列ａ１およびａ２
（矢印）を利用して、ステム構造を形成していると考え
られる。枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲んで示
す。突然変異によって変化した塩基を、各突然変異の名
称とともに、矢印で示す。白および黒の三角は、ｍｓＤ
ＮＡのＲＮＡおよびＤＮＡのそれぞれの３’末端の位置
を示す。
Ｅｃ６７の推定二次構造、ならびにＲＮＡ前駆体分子の
推定二次構造を示す模式図である。図１Ａは、ｐＣ１−
１ＥＰ５（ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９
ｂ）の制限地図を示す図である。ＢａｍＨＩ部位に変わ
ったＢｓｓＨＩ部位を矢印で示し、部位特異的突然変異
誘発によって生じたＸｂａＩ部位も矢印で示す。ｍｓｒ
およびｍｓｄ、ならびに逆転写酵素遺伝子の位置および
向きを矢印で示す。ｐ６７−ＢＨＯ．６およびｐ６７−
ＲＴにクローニングされた領域を、それぞれ、白い矩形
で示す。図１Ｂは、ｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７（ランプソン
（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９８９ｂ）の構造を示す図で
ある。枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲み、ＲＮＡ
を矩形で囲んで示す。ＲＮＡもＤＮＡも、５’末端から
番号をふってある。図１Ｃは、ＲＮＡ前駆体分子の推定
二次構造を示す図である。ＲＮＡ転写産物の５’末端
は、プライマー伸長法で決定した（フスー（Ｈｓｕ）
ら、M.Y.Hsu, S.Eagle, M.Inouye, J.B.C., 267. No.26
pp.13823 〜13829 ）。ＲＮＡ分子の３’末端は、ＲＮ
Ａ一次転写産物中の逆方向反復塩基配列ａ１およびａ２
（矢印）を利用して、ステム構造を形成していると考え
られる。枝分かれグアノシン残基を、丸印で囲んで示
す。突然変異によって変化した塩基を、各突然変異の名
称とともに、矢印で示す。白および黒の三角は、ｍｓＤ
ＮＡのＲＮＡおよびＤＮＡのそれぞれの３’末端の位置
を示す。
【図２】 インビトロでｍｓＤＮＡ−Ｅｃ６７を合成す
る際のプライミング反応の特異性を示すための泳動バン
ドを示す図である。最初の塩基の付加反応は、実験方法
に記載したようにして実施した。反応混合物は、１０μ
ｌの逆転写酵素緩衝液中に、１mlの培養液から得たＲＮ
Ａ分画と、反応ごとに、５μＣｉの各〔α32−Ｐ〕ｄＮ
ＴＰとを含有している。２μｌの部分精製逆転写酵素を
加えることによって反応を開始し、混合物を３７℃で３
０分間インキュベートした。レーン１−４：反応を、ｐ
６７−ＢＨＯ．６を有するＣＬ８３細胞（野生型）由来
のＲＮＡを用いて行った。レーン５−８：ｐ６７−ｍｕ
ｔ−１（突然変異１：図１Ｃの１１８の位置でのＡから
Ｔへの突然変異）を有する細胞を用いた。レーン９−１
２：ｐ６７−ｍｕｔ−２（突然変異２：図１Ｃの１１８
の位置でのＡからＧへの突然変異）を有する細胞を用い
た。レーン１３−１６：ｐ６７−ｍｕｔ−３（図１Ｃの
１５の位置でのＧからＡへの突然変異）を有する細胞を
用いた。各レーンの上側に、各レーンで使用した〔α32
−Ｐ〕ｄＮＴＰを示してある。分子量マーカーとして、
一番左側のレーンで、クレノウ断片と〔α32−Ｐ〕ｄＣ
ＴＰで標識したｐＢＲ３２２のＭｓｐＩによる消化物を
泳動した。数字は断片のサイズを塩基数で示す。矢印
は、各ＲＮＡ調製物ごとに、ｄＮＴＰで特異的に標識し
たＲＮＡ前駆体の位置を示す。
る際のプライミング反応の特異性を示すための泳動バン
ドを示す図である。最初の塩基の付加反応は、実験方法
に記載したようにして実施した。反応混合物は、１０μ
ｌの逆転写酵素緩衝液中に、１mlの培養液から得たＲＮ
Ａ分画と、反応ごとに、５μＣｉの各〔α32−Ｐ〕ｄＮ
ＴＰとを含有している。２μｌの部分精製逆転写酵素を
加えることによって反応を開始し、混合物を３７℃で３
０分間インキュベートした。レーン１−４：反応を、ｐ
６７−ＢＨＯ．６を有するＣＬ８３細胞（野生型）由来
のＲＮＡを用いて行った。レーン５−８：ｐ６７−ｍｕ
ｔ−１（突然変異１：図１Ｃの１１８の位置でのＡから
Ｔへの突然変異）を有する細胞を用いた。レーン９−１
２：ｐ６７−ｍｕｔ−２（突然変異２：図１Ｃの１１８
の位置でのＡからＧへの突然変異）を有する細胞を用い
た。レーン１３−１６：ｐ６７−ｍｕｔ−３（図１Ｃの
１５の位置でのＧからＡへの突然変異）を有する細胞を
用いた。各レーンの上側に、各レーンで使用した〔α32
−Ｐ〕ｄＮＴＰを示してある。分子量マーカーとして、
一番左側のレーンで、クレノウ断片と〔α32−Ｐ〕ｄＣ
ＴＰで標識したｐＢＲ３２２のＭｓｐＩによる消化物を
泳動した。数字は断片のサイズを塩基数で示す。矢印
は、各ＲＮＡ調製物ごとに、ｄＮＴＰで特異的に標識し
たＲＮＡ前駆体の位置を示す。
【図３】 バンドａおよびｂの生成を図式的に示した図
である。細線および太線は、それぞれＲＮＡおよびＤＮ
Ａを示し、矢印は３’末端を示す。白と黒の三角は、そ
れぞれ、ｍｓＤＮＡ中のＲＮＡ鎖の３’末端とＤＮＡ鎖
の３’末端とを示す。破線は、ｍｓｄＲＮＡの５’末端
の二本鎖ＲＮＡ構造における塩基の対合を示す。まず、
構造Ｉが、レトロン−Ｅｃ６７からの一次転写産物から
形成される。ハイブリダイズしていない３’末端は、お
そらく細胞内で取り除かれており、生じた構造は、図１
Ｃに示すものと同一である。無細胞反応混合物に、ＲＴ
−Ｅｃ６７とともにｄＴＴＰを加えると、ｄＴが、
２’，５’−ホスホジエステル結合によって、内部グア
ノシン残基（図中丸印）の２’−ＯＨ基に結合する（構
造ＩＩ）。後の３種のｄＮＴＰを加えると、ＲＮＡ鋳型
に沿ってＤＮＡ鎖が延びる。ＤＮＡ鎖が伸長するのと同
時に、ＲＮＡ鋳型が取り除かれる（構造ＩＩＩ）。ＤＮ
Ａの合成は、黒い三角で示す位置で停止し、３’末端に
塩基７個のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが残り、構造Ｉ
ＶａあるいはＩＶｂが得られる。構造ＩＶをＲＮアーゼ
Ａで処理すると、構造Ｖが得られる。構造Ｖを沸騰水浴
中でインキュベートすると、構造ＶＩが形成する。構造
ＶＩａおよびＶＩｂは、それぞれ、図２のバンドａおよ
びｂに相当する。
である。細線および太線は、それぞれＲＮＡおよびＤＮ
Ａを示し、矢印は３’末端を示す。白と黒の三角は、そ
れぞれ、ｍｓＤＮＡ中のＲＮＡ鎖の３’末端とＤＮＡ鎖
の３’末端とを示す。破線は、ｍｓｄＲＮＡの５’末端
の二本鎖ＲＮＡ構造における塩基の対合を示す。まず、
構造Ｉが、レトロン−Ｅｃ６７からの一次転写産物から
形成される。ハイブリダイズしていない３’末端は、お
そらく細胞内で取り除かれており、生じた構造は、図１
Ｃに示すものと同一である。無細胞反応混合物に、ＲＴ
−Ｅｃ６７とともにｄＴＴＰを加えると、ｄＴが、
２’，５’−ホスホジエステル結合によって、内部グア
ノシン残基（図中丸印）の２’−ＯＨ基に結合する（構
造ＩＩ）。後の３種のｄＮＴＰを加えると、ＲＮＡ鋳型
に沿ってＤＮＡ鎖が延びる。ＤＮＡ鎖が伸長するのと同
時に、ＲＮＡ鋳型が取り除かれる（構造ＩＩＩ）。ＤＮ
Ａの合成は、黒い三角で示す位置で停止し、３’末端に
塩基７個のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが残り、構造Ｉ
ＶａあるいはＩＶｂが得られる。構造ＩＶをＲＮアーゼ
Ａで処理すると、構造Ｖが得られる。構造Ｖを沸騰水浴
中でインキュベートすると、構造ＶＩが形成する。構造
ＶＩａおよびＶＩｂは、それぞれ、図２のバンドａおよ
びｂに相当する。
【図４】 無細胞系でのｍｓＤＮＡ合成時の鎖伸長停止
反応を示すための泳動パターンを示す図である。ｍｓＤ
ＮＡ合成の際の鎖伸長反応は、実験方法に記載したよう
にして、ジデオキシＮＴＰの存在下で行った。ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、あるいはｄｄＣＴＰを含
有する個々の鎖伸長停止反応混合物を、それぞれレーン
Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣで泳動した。得られたはしご状の
バンド（ラダー）を右側で読み取ったところ、ｍｓＤＮ
Ａ−Ｅｃ６７の塩基２４−５４のＤＮＡ配列に相当して
いた（図１ｃ；ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９
８９ｂ参照）。一番左側のレーンでは、図２と同じ分子
量マーカーを泳動した。サイズ（塩基数）を左側に示
す。図３に図式的に示した４つの主要な生成物を、ａ、
ｂ、ｃ、およびｄと記した矢印で示す。
反応を示すための泳動パターンを示す図である。ｍｓＤ
ＮＡ合成の際の鎖伸長反応は、実験方法に記載したよう
にして、ジデオキシＮＴＰの存在下で行った。ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、あるいはｄｄＣＴＰを含
有する個々の鎖伸長停止反応混合物を、それぞれレーン
Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣで泳動した。得られたはしご状の
バンド（ラダー）を右側で読み取ったところ、ｍｓＤＮ
Ａ−Ｅｃ６７の塩基２４−５４のＤＮＡ配列に相当して
いた（図１ｃ；ランプソン（Ｌａｍｐｓｏｎ）ら、１９
８９ｂ参照）。一番左側のレーンでは、図２と同じ分子
量マーカーを泳動した。サイズ（塩基数）を左側に示
す。図３に図式的に示した４つの主要な生成物を、ａ、
ｂ、ｃ、およびｄと記した矢印で示す。
【図５】 バンドｂおよびａの生成物の、リボヌクレア
ーゼ処理を示すための泳動パターンを示す図である。生
成物は、無細胞系（ｄｄＮＴＰ含有せず）で十分な伸長
反応を行った後に、ＤＮＡ配列決定用ゲルで泳動した
（レーン２）。バンドｂ（レーン３）およびバンドａ
（レーン４）は、分離用ゲル電気泳動で単離し、ＲＮア
ーゼＡでそれぞれ消化した（レーン５および６）。分子
量マーカー（レーン１）は、図２と同一である。
ーゼ処理を示すための泳動パターンを示す図である。生
成物は、無細胞系（ｄｄＮＴＰ含有せず）で十分な伸長
反応を行った後に、ＤＮＡ配列決定用ゲルで泳動した
（レーン２）。バンドｂ（レーン３）およびバンドａ
（レーン４）は、分離用ゲル電気泳動で単離し、ＲＮア
ーゼＡでそれぞれ消化した（レーン５および６）。分子
量マーカー（レーン１）は、図２と同一である。
【図６】 各種の代表的なｍｓＤＮＡの完全なヌクレオ
チド配列を示す図である。
チド配列を示す図である。
【図７】 別のｍｓＤＮＡであるＥｃ７４を示す図であ
る。
る。
【図８】 さらに別のｍｓＤＮＡであるＥｃ１００を示
す図である。
す図である。
【図９】 さらに別のｍｓＤＮＡであるＥｃ１０１を示
す図である。
す図である。
【図１０】 合成ｍｓＤＮＡ１００を構築する際のプロ
トコールを示す図である。
トコールを示す図である。
【図１１】 合成ｍｓＤＮＡの遺伝子ならびに構成成分
を示す図である。
を示す図である。
【図１２】 ｍｓＤＮＡ１０１を構築する際のプロトコ
ールを示す図である。
ールを示す図である。
【図１３】 ＲＮＡあるいはＤＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ
の生成を示す図である。
の生成を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イノウエ マサヨリ アメリカ合衆国 08807 ニュージャー ジー州 ブリッジウォーター リンベイ ルレーン３ (56)参考文献 特開 平３−15388（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−22976（ＪＰ，Ａ) Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ．，Ｖｏｌ．45，Ｐ．163−186 （1991) Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ. 40，Ｐ．１−24（1991) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 173，Ｎｏ．13，Ｐ．4171−4181（1991) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 265，Ｎｏ．15，Ｐ．8490−8496（1990) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．243，Ｐ. 1033−1038（1989) Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．４, Ｐ．701−707（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】ＤＮＡ部分およびＲＮＡ部分とを含む一本
鎖ｍｓＤＮＡ分子を合成するにあたり、レトロンのｍｓ
ｒ−ｍｓｄ領域の一次転写産物である単離されたＲＮＡ
画分、レトロンにコードされた精製された逆転写酵素、
ならびに４種のｄＮＴＰを混合し、該混合物をｍｓＤＮ
Ａが生成するような反応条件でインキュベートすること
を包含するｍｓＤＮＡの合成方法。 - 【請求項２】一次転写産物がｍｓｒ−ｍｓｄ領域を有す
るプラスミドを発現させることにより得られる請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】レトロンがレトロン−Ｅｃ６７である請求
項１または２記載の方法。 - 【請求項４】生成したｍｓＤＮＡを分離する工程をさら
に包含する請求項１〜３いずれか記載の方法。 - 【請求項５】インキュベーション後に、混合物をさらに
ＲＮａｓｅＨとともにインキュベーションする工程を包
含する請求項１〜４いずれか記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/817430 | 1992-01-06 | ||
| US07/817,430 US5434070A (en) | 1989-02-24 | 1992-01-06 | Reverse transcriptases from Escherichia coli and Myxococcus xanthus |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001055213A Division JP2001258582A (ja) | 1992-01-06 | 2001-02-28 | 一本鎖ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド分子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319565A JPH06319565A (ja) | 1994-11-22 |
| JP3182243B2 true JP3182243B2 (ja) | 2001-07-03 |
Family
ID=25223072
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|---|---|---|---|
| JP01677793A Expired - Fee Related JP3182243B2 (ja) | 1992-01-06 | 1993-01-06 | 一本鎖ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド分子の合成方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2001055213A Pending JP2001258582A (ja) | 1992-01-06 | 2001-02-28 | 一本鎖ｄｎａ−ｒｎａハイブリッド分子 |
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| EP (1) | EP0562206B1 (ja) |
| JP (2) | JP3182243B2 (ja) |
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| FR2675803B1 (fr) * | 1991-04-25 | 1996-09-06 | Genset Sa | Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications. |
| DE69604051T2 (de) * | 1995-01-27 | 1999-12-16 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary | Verfahren zum sensitiven nachweis von reverser transcriptase |
| JP2002515730A (ja) * | 1995-10-16 | 2002-05-28 | カイロン コーポレイション | 遺伝子発現を変調する因子のスクリーニング方法 |
| CA2513336A1 (en) | 1998-03-20 | 1999-09-30 | Benitec Australia Ltd. | Control of gene expression in a non-human eukaryotic cell, tissue or organ |
| AUPP249298A0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| WO2000022113A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA |
| BR9914773A (pt) * | 1998-10-09 | 2002-02-05 | Ingene Inc | Conjunto de elementos genéricos, método para a produção de dna de cordão único, transcrição de mrna, construção de ácido nucléico, transcrição de ssdna, vetor, sistema vetor, célula hospedeira, conjunto para a produção de uma sequência de ácido nucléico de cordão único, método para a produção in vivo ou in vitro de uma sequência de ácido nucléico de cordão único, transcrição de cdna de cordão único, ácido nucléico inibidor, molécula heteroduplex, e composição farmacêutica |
| AU2004205192B2 (en) * | 1998-10-09 | 2007-09-20 | Cytogenix, Inc. | Production of ssDNA in vivo |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| US7419964B2 (en) * | 1999-09-16 | 2008-09-02 | Cytogenix, Inc. | Treatment of HSV-related pathologies using ssDNA |
| WO2003093424A2 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Cytogenix, Inc. | In vivo ssdna expression vectors for altering gene expression |
| SE0202867D0 (sv) * | 2002-09-27 | 2002-09-27 | Pyrosequencing Ab | New sequencing method |
| EP4028512A4 (en) * | 2019-09-12 | 2023-09-20 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone | BACTERIAL RETRO-ENGINEERED WITH ENHANCED DNA PRODUCTION |
| US11866728B2 (en) | 2022-01-21 | 2024-01-09 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
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- 1992-01-06 US US07/817,430 patent/US5434070A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-21 EP EP92470036A patent/EP0562206B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-21 DE DE69232768T patent/DE69232768T2/de not_active Expired - Fee Related
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1993
- 1993-01-06 JP JP01677793A patent/JP3182243B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-28 JP JP2001055213A patent/JP2001258582A/ja active Pending
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| Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４５，Ｐ．１６３−１８６（１９９１） |
| Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．４，Ｐ．７０１−７０７（１９８９） |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．１３，Ｐ．４１７１−４１８１（１９９１） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６５，Ｎｏ．１５，Ｐ．８４９０−８４９６（１９９０） |
| Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４０，Ｐ．１−２４（１９９１） |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４３，Ｐ．１０３３−１０３８（１９８９） |
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| EP0562206B1 (en) | 2002-09-11 |
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| US5434070A (en) | 1995-07-18 |
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