DE69604051T2

DE69604051T2 - Verfahren zum sensitiven nachweis von reverser transcriptase

Info

Publication number: DE69604051T2
Application number: DE69604051T
Authority: DE
Inventors: Thomas Folks; Walid Heneine; William Switzer; Shinji Yamamoto
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-01-27
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2016-01-27
Also published as: JPH11505101A; EP0805873B1; WO1996023076A1; ATE184055T1; DE69604051D1; EP0805873A1; JP2007006897A; JP4256931B2; US6136534A; US5849494A; AU710468B2; AU4773196A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe durch Nachweisen der Präsenz des Enzyms reverse Transcriptase bereit. Das Verfahren verwendet eine Matrize und Primer unter Bedingungen, unter denen ein DNA-Strang synthetisiert und anschließend durch die Polymerasekettenreaktion verstärkt wird, falls reverse Transcriptase präsent ist.

STAND DER TECHNIK

Retroviren sind bei Wirbeltieren weit verbreitet, und es ist bekannt, daß sie eine Vielzahl von Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, einschließlich Immunschwächen, Leukämien und Lymphknotenschwellungen (1). Die gesamte Familie der Retroviren ist gekennzeichnet durch die Präsenz eines einzigartigen Enzyms, der reversen Transcriptase (RT), die die virale genomische RNA in eine Doppelstrang-DNA-Kopie transcribiert (1). Dieses Merkmal hat zu Studien der einzigartigen enzymatischen Funktion von RT für zwei Hauptanwendungen geführt. Zum einen ist die Präsenz von RT die Basis für eine Diagnose einer retroviralen Infektion und für den generischen Nachweis der Präsenz von Retroviren in Zell kulturen und in dem infizierten Wirt gewesen. Zum anderen bildet das RT-Enzym ein primäres Ziel für antivirale medikamentöse Interventionen (1, 2).
Die Polymerasefunktion der RT von verschiedenen Retroviren ist gut charakterisiert worden, und es ist gezeigt worden, daß sie eine RNA-Matrize, einen Primer, Triphosphat, ein divalentes Kation und physiologische Salze erfordert (1). Deshalb haben Assays für die RT-Aktivität konventionell diese Reagenzien und Bedingungen verwendet, um die Fähigkeit einer Probe zum Erzeugen einer DNA-Kopie einer bekannten exogenen RNA-Matrize (z. B. Poly-rA) durch Synthetisieren eines komplementären DNA-Oligonukleotidprimers mit radiomarkierten Nukleotiden (z. B. ³H- oder ³²P-dTTP) zu messen. RT-synthetisierte DNA ist nachgewiesen worden durch Messen des Einbaus der markierten Nukleotide (3, 4) und kürzlich durch Assays, die nichtradioaktive Nukleotide in enzymverknüpften Immunsorptionsassay-(ELISA)-Formaten verwenden (5 bis 8) und durch Polymerasekettenreaktion (PCR) (17), wie unten weiter beschrieben wird.
Obwohl RT-Assays weiterhin ein essentielles Laborwerkzeug für die Indentifikation von bekannten und neuen Retroviren sind (4 bis 11), ist die erfolgreiche Verwendung von RT-Assays auf den Nachweis von retroviralen Partikeln in Kulturüberständen beschränkt worden (4 bis 8), was den Nachteil hat, daß es erforderlich ist, einen Virus vor dem Nachweis zu kultivieren. Durch die derzeitigen Verfahren können Lentiviren, so wie humanes Immunschwächevirus-1 (HIV-1) leicht nachgewiesen werden; aber Onkoviren, wie beispielsweise humane T-Lymphozytenvirustypen I und II (HTLV-I und HTLV-II), sind viel schwieriger nachzuweisen, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen RT- Aktivität und weil sie typischerweise Zellen-assoziiert sind, was bedeutet, daß ihre RT für den Nachweis in Kulturüberständen weniger zugänglich ist (6 bis 8). Diese Beschränkungen haben das Testen auf RT auf einem geringen Nutzen beim Nachweis von HTLV- Infektionen belassen.
Trotz mehrfacher Versuche, die Sensitivität von RT-Assays zu verbessern, ist der direkte Nachweis von Retroviren in klinischen Proben (z. B. Serum) erfolglos gewesen (4 bis 12). Zum Beispiel in Studien von HIV-I infizierten Individuen, ist der Nachweis von Virus im Plasma durch RT-Assays wegen der geringen Sensitivität dieses Verfahrens weitgehend aufgegeben worden (12).
Die Unfähigkeit, RT-Aktivität in Serum nachzuweisen, behindert die Verwendung dieses virologischen Markers beim Diagnostizieren von Krankheiten, dem Überwachen von Arzneimitteleffizienzen bei Patienten, dem Überwachen einer Virusbelastung und dem Vorhersagen eines Krankheitsverlaufs. Aktuelle Verfahren für den qualitativen und quantitativen Nachweis von HIV-I im Plasma umfassen die virale Isolation und das Binden von p24-Antigen (13 bis 15). Diese Assays haben jedoch Nachteile. Die Virusisolation aus Plasma erfordert eine Viruskultur, die typischerweise für 14 bis 28 Tage gehalten wird, und sie ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig, befrachtet mit biologischen Abweichungen und kein universeller Marker bei der infizierten Population angesichts des niedrigen Niveaus von HIV-I bei Patienten mit CD4+T- Lymphozytenzählungen von > 200/mm³. Entsprechend ist entweder frei, Virion-assoziiertes oder immunkomplexiertes p24-Antigen in der HIV-I infizierten Population nicht immer präsent.
RT-PCR ermöglicht den qualitativen Nachweis des zellenfreien Virus in Plasma unter Verwendung einer exogenen RT und eines Primer-Paars mit bekannter Sequenz, um virale RNA-Sequenzen im Plasma zu verstärken (15, 16). Obwohl berichtet worden ist, daß RT-PCR hochsensitiv ist, erfordert dieser Assay eine RNA- Extraktion und vielfache Probenhandhabungen, die das Risiko einer PCR-Kontamination erhöhen können. Der RT-PCR-Assay kann weiter verkompliziert werden durch das Fehlen eines standardisierten universellen quantitativen Tests und der Variabilitäten, die während des Verarbeitens und des Lagerns bezüglich des Abbaus der genomischen RNA auftreten können. Obwohl RT-PCR wie die Antigenbindung hochspezifisch ist, ist eine Kenntnis der Nukleotidsequenz des Zielretrovirusfragments für die Primerentwicklung notwendig. Angesichts dieser Beschränkungen ist RT- PCR für den Nachweis von varriierten, neuen oder unbekannten Retroviren nicht geeignet.
Kürzlich sind zwei Assays für RT, die die RNA des Bakteriophagen MS2 oder des Brommosaikvirus (BMV) als Matrize und PCR als Nachweissystem verwenden, als hochsensitiv für den Nachweis von Mäuseleukämievirus-RT und anderen Stämmen von Retroviren in Serum berichtet worden (18, 19, 31, 32). Die Auswertung der Spezifizität und der Sensitivität dieser Assays in einer angemessenen Anzahl von Serumproben wurde jedoch nicht offenbart (18, 19, 31, 32). Zusätzlich sind bei diesen beiden Assays Probleme mit Inhibitoren der RT-Aktivität in Serum und nicht- spezifischer Hintergrund-RT-Aktivität beschrieben worden (20), was ernste Fragen bezüglich des diagnostischen Werts dieser Assay erhebt.
Diese Erfindung stellt einen RT-Assay bereit, der ein PCR-basierendes Verstärkungssystem verwendet, um ein bekanntes cDNA- Produkt der RT-Reaktion nachzuweisen. Der Assay der vorliegenden Erfindung, im folgenden als Amp-RT bezeichnet, ist hochsensitiv und spezifisch, erfordert keine Kenntnis der viralen genomischen Sequenz und erlaubt den Nachweis von RT-Aktivität in Proben von Individuen, die mit Retroviren oder jeder anderen biologischen Einheit infiziert sind, die RT produziert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereit, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA- Primer anlaufen werden und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA; und Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe und damit die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereit, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer RNA-Matrize, wobei die RNA-Matrize eine geeignete Region des Enzephalomyocarditisvirus ist, die aus dem Ribonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 4 besteht, und mit einem komplementären DNA-Primer, wobei der Primer das Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 ist, unter Bedingungen, unter denen die RNA- Matrize und der DNA-Primer anlaufen werden und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren erfolgt, wobei die Bedingungen für die Verstärkung 30 bis 40 Zyklen des Aufheizens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf 93 bis 96ºC für 30 Sekunden bis 1 Minute, 53 bis 56ºC für 30 Sekunden bis 1 Minute und 70 bis 74ºC für 30 Sekunden bis 5 Minuten umfassen, wobei das Primer- Paar aus dem Oligonukleotid, das im wesentlichen aus der SEQ ID NR.: 1 besteht, und den Oligonukleotid, das im wesentlichen aus der SEQ ID NR.: 2 besteht, bestehen; und c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei der Nachweis der Verstärkung der synthetisierten DNA durch einen Southernblot- Hybridisierungsassay erfolgt, mit einer Sonde, die im wesentlichen aus dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 3 besteht, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe und damit die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.
Zusätzlich wird ein Satz zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereitgestellt, der eine geeignete Region eines Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize und einen komplementären DNA-Primer für reverse Transcriptase und ein Primer-Paar für Polymerasekettenreaktion aufweist, wobei jede Komponente in einem separaten Behälter oder irgendeine Kombination der Komponenten in einem einzigen Behälter bereitgestellt wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, kann ein "ein" ein einziges oder auch mehrere bedeuten, abhängig von dem Kontext, in dem es verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereit, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA- Primer anlaufen werden und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA; und c) Detektieren der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe und damit die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.
Die RNA-Matrize kann eine geeignete Region irgendeiner Ribonukleotidsequenz aufweisen, so wie z. B. des Enzephalomyocarditisvirusgenoms. So wie sie hier verwendet wird, bedeutet eine "geeignete Region" eine Region der RNA-Sequenz, die keine signifikante sekundäre Struktur aufweist, weniger als 50% GC- Gehalt aufweist und zu der komplementäre DNA-Primer erzeugt werden können, die Tm-Werte innerhalb des Bereichs von Reaktionstemperaturen aufweisen, die für die Synthese eines DNA-Strangs geeignet sind, wie hier weiter beschrieben werden wird. Die RNA- Matrize kann eine Länge aufweisen, die ausreichend ist, um ein DNA-Produkt zu erzeugen, das in der Größe von 100 bis 500 Basispaaren Länge reicht und am meisten bevorzugt bei etwa 300 Basispaaren Länge liegt. Die RNA-Matrize kann das Ribonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 4 sein.
So er wie hier verwendet wird, bedeutet "komplementärer DNA- Primer" ein Oligonukleotid, das an die RNA-Matrize in einer bestimmten Orientierung anläuft, um die Synthese eines naszierenden DNA-Strangs in der Präsenz von RT in der biologischen Probe unter den hier beschriebenen Bedingungen zu ermöglichen. Ebenso schließen, so wie sie hier verwendet werden, die "Bedingungen" unter denen ein DNA-Strang synthetisiert wird, die Präsenz von Nukleotiden, Kationen und geeigneten Puffermitteln in derartigen Mengen und bei derartigen Temperaturen ein, daß die RNA-Matrize und der DNA-Primer anlaufen und Oligonukleotide zu einem synthetisierten DNA-Strang inkorporiert werden, falls reverse Transcriptase präsent ist. Spezifischer wird ein Beispiel dieser Bedingungen in dem Abschnitt Beispiele bereitgestellt. Die beschriebenen Bedingungen sind ausgehend von anderen bekannten RT-cDNA-Syntheseprotokollen optimiert worden. Es ist allgemein bekannt, daß andere Konditionen für die Optimierung einer bestimmten RT-Reaktion auf Basis von Protokollen, die dem Fachmann gut bekannt sind, etabliert werden können. Der DNA-Primer kann der reverse Primer eines Primer-Paars zur Verwendung bei einer nachfolgenden Verstärkung durch PCR sein, so wie z. B. das Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 (EMCR2).
Die biologische Probe kann jegliches biologisches Gewebe oder jegliche Körperflüssigkeit aufweisen (z. B. Zellen, Serum, Plasma, Sperma, Urin, Speichel, Sputum, Cerebrospinalflüssigkeit). Der synthetisierte DNA-Strang kann durch jedes Verstärkungsprotokoll verstärkt werden, das im Stand der Technik oder zukünftig bekannt ist, einschließlich der aber nicht beschränkt auf die Polymerasekettenreaktion (PCR) (17), der/die Ligationsverstärkungsreaktion (LAR) (21), des/das ligasebasierende Verstärkungssystem(s) (LAS) (22), des/das selbstfortschreitende Sequenzreplikations-(3SR)-System(s) (23), des/das transcriptionsbasierende Verstärkungssystem(s) (TAS) (24) und des/das Qβ-Replicaseverstärkungsverfahren(s) (25).
Für die Verstärkung der synthetisierten DNA durch PCR, können die Bedingungen für die Verstärkung 30 bis 40 (am meisten bevorzugt 35) Zyklen des Aufheizens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf 93º bis 96ºC (am meisten bevorzugt 95ºC) für 30 Sekunden bis 1 Minute (am meisten bevorzugt 1 Minute), 53º bis 56ºC (am meisten bevorzugt 55ºC) für 30 Sekunden bis 1 Minute (am meisten bevorzugt 1 Minute) und 70º bis 74ºC (am meisten bevorzugt 72ºC) für 30 Sekunden bis 5 Minuten (am meisten bevorzugt 1 Minute) umfassen.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich "ein Primer-Paar" auf zwei Primer, von denen einer eine Vorwärtskennung und der andere eine Rückwärtskennung relativ zu ihrer jeweiligen Orientierung auf einem Doppelstrang-DNA-Molekül aufweist, das aus einer sinnigen und einer gegensinnigen Sequenz besteht, so daß unter den hier beschriebenen Verstärkungsbedingungen der Vorwärtsprimer an die sinnige Sequenz anläuft und deren Verstärkung auslöst und der Rückwärtsprimer an die gegensinnige Sequenz anläuft und deren Verstärkung auslöst. Die Primer können für die Verwendung bei der Verstärkungsreaktion auf der Basis ausgewählt werden, daß sie weniger als 50% G-C-Gehalt, eine minimale Komplementarität mit anderen Primern in der Reaktion (um die Bildung von Primerdimeren zu minimieren) und Tm-Werte innerhalb des Bereichs der Reaktionstemperaturen aufweisen, die für die PCR geeignet sind. Zusätzlich können die Primer ausgewählt werden, um an spezifische Regionen der RNA-Matrize anzulaufen, so daß das resultierende DNA-Verstärkungsprodukt in der Größe von 100 bis 500 Basispaaren Länge reicht und am meisten bevorzugt bei etwa 300 Basispaaren Länge liegt. Zum Beispiel kann das Primer-Paar unter den oben beschriebenen Bedingungen aus den Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 1 (EMCF1) als Vorwärtsprimer und dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 (EMCR2) als Rückwärtsprimer bestehen.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich "nachweisen" oder "Nachweis" der verstärkten DNA auf das quantitative oder qualitative Bestimmen der Präsenz des verstärkten DNA-Strangs, der nur synthetisiert wird, falls RT in der biologischen Probe vorliegt. Die Verstärkung der synthetisierten DNA kann durch jedes Verfahren für den Nachweis von DNA nachgewiesen werden, das im Stand der Technik bekannt ist. Zum Beispiel kann der Nachweis der verstärkten DNA durch einen Southernblot-Hybridisierungsassay, durch Visualisierung von PCR-Produkten von spezifischem Molekulargewicht auf Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegelen, durch Messung des Einbaus von radiomarkierten Nukleotiden in den synthetisierten DNA-Strang mittels Autoradiographie- oder Szyntillationsmessung, durch für das Binden von nachweisbaren Halbbindungen an verstärkte DNA modifizierten ELISA oder durch jedes andere Nachweisverfahren, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, erfolgen.
Für den Nachweis durch einen Southernblot-Hybridisierungsassay kann die synthetisierte DNA durch eine für die von der Matrize synthetisierte DNA spezifische Sonde nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann solch eine spezifische Sonde im wesentlichen aus dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 3 (EMCP1) bestehen. Ein Southernblot-Hybridisierungsprotokoll zur Anwendung bei der Erfindung wird in den Beispielen demonstriert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereit, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer geeigneten Region des Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer, unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA- Primer anlaufen und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA- Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA; und c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe und damit die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereit, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA-Primer anlaufen und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren, wobei die Bedingungen der Verstärkung 30 bis 40 Zyklen des Aufheizens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf 93 bis 96ºC für 30 Sekunden bis 1 Minute, 53 bis 56ºC für 30 Sekunden bis 1 Minute und 70 bis 74ºC für 30 Sekunden bis 5 Minuten umfassen; und c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe und damit die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereit, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Region des Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA- Primer anlaufen und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA- Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren, wobei die Bedingungen für die Verstärkung 30 bis 40 Zyklen des Aufheizens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf 93 bis 96ºC für 30 Sekunden bis 1 Minute, 53 bis 56ºC für 30 Sekunden bis 1 Minute und 70 bis 74ºC für 30 Sekunden bis 5 Minuten umfassen; und c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz der reversen Transcriptase in der biologischen Probe und damit die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.
Als ein Beispiel kann die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereitstellen, das die Schritte aufweist: a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer geeigneten Region des Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize, wobei die RNA-Matrize das Ribonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 4 ist, und einem komplementären DNA Primer, wobei der Primer das Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 ist, unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA-Primer anlaufen werden und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert werden wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist; b) Verstärken der synthetisierten DNA, wobei die DNA durch die Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen verstärkt wird, die etwa 35 Zyklen des Aufheizens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf 95ºC für 1 Minute, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für eine Minute aufweisen, wobei das Primer-Paar aus dem Oligonukleotid, das im wesentlichen aus der SEQ ID NR.: 1 besteht, und dem Oligonukleotid besteht, das im wesentlichen aus der SEQ ID NR.: 2 besteht; und c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung durch einen Southernblot-Hybridisierungsassay mit einer Probe nachgewiesen wird, die im wesentlichen aus dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 3 besteht.
Zusätzlich wird ein Satz zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe bereitgestellt, das Enzyme, Puffermittel, Kationen und Oligonukleotide aufweist, die im Stand der Technik für das Durchführen von RT- und PCR- Reaktionen bekannt sind. Der Satz weist weiterhin eine geeignete Region des Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize und einen komplementären DNA-Primer für reverse Transcriptase und ein Primer-Paar für Polymerasekettenreaktion auf. Die RNA- Matrize, der komplementäre DNA-Primer und die Primer des Primer- Paars können jeweils in einem separaten Behälter oder alle zusammen oder in jeder Kombination dieser Komponenten in einem einzigen Behälter zusammengefaßt sein. Der komplementäre DNA- Primer kann das Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 (EMCR2) sein, die RNA-Matrize kann das Ribonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 4 sein, und das Primer-Paar kann aus dem Oligonukleotid, das im wesentliche aus der SEQ ID NR.: 1 (EMCF1) besteht, und dem Oligonukleotid bestehen, daß im wesentlichen aus der SEQ ID NR.: 2 (EMCR2) besteht.
Die vorliegende Erfindung hat zusätzliche Anwendungen basierend auf dem grundsätzlichen erfinderischen Prinzip, daß RT in einer biologischen Probe nachgewiesen und quantifiziert werden kann. Eine Anwendung dieses Prinzip ist die differentielle Identifikation von Retroviren auf der Basis der spezifischen Reaktivität der nachgewiesenen RT mit Antikörpern gegen verschiedene retrovirale RTs (z. B. Antikörper, die RT unterscheiden können, welche von HIV-I oder HIV-II in infizierten Individuen erzeugt wurde). Jeder Retrovirus hat eine unterschiedliche RT, zu der spezifischen Antikörper erzeugt werden können, wodurch die Identifikation des spezifischen Retrovirus ermöglicht wird. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann angewendet werden, um zunächst die Präsenz von RT nachzuweisen, und verschiedene Antikörper, die spezifisch für RTs von verschiedenen Retroviren sind, können dann zu der biologischen Probe hinzugesetzt werden, um den Typ des präsenten Retrovirus zu identifizieren. Ein Antikörper von bekannter Spezifizität wird die RT, die in der biologischen Probe präsent ist, binden, wenn die RT von dem Virus produziert wurde, für den der Antikörper spezifisch ist, und wird ihre Aktivität hemmen, was in kein DNA-Synthese bei Präsenz des Antikörpers resultiert.
Eine andere Anwendung der vorliegenden Erfindung ist das Screenen von Patienten auf Widerstand gegen medikamentöse Therapien. Die Empfindlichkeit von RT gegenüber Anti-RT- Medikamenten kann bei einem Patient über der Zeit beobachtet werden, bei dem eine Anti-RT-Medikamententherapie vorgenommen wird. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um das Ausfallen einer Anti-RT-Medikamentenresistenz bei einem Patienten durch direktes Testen des Patientenserums auf RT- Aktivität nachzuweisen als Indikator der Empfindlichkeit der RT in dem Patientenserum gegenüber dem/den verwendeten Anti-RT- Medikament(en). Falls eine Medikamentenresistenz nachgewiesen wird, können alternative Behandlungsstrategien umgesetzt werden. Diese Erfindung beseitigt die Notwendigkeit von langen und arbeitsintensiven Kulturverfahren, die derzeit angewendet werden, um die Medikamentenresistenz bei Patienten zu untersuchen.
Eine dritte Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Überwachung einer Virusbelastung eines Patienten, der mit biologischen Einheiten infiziert ist, die RT produzieren. Quantitative Messungen der RT über der Zeit können korreliert werden mit Überlebens- und/oder Genesungsraten bei Patienten mit Krankheiten, die durch diese Einheiten verursacht wurden, zum Zweck des Verfolgens des Krankheitsfortschritts und des Prognostizierens der Krankheit des Patienten.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen im spezielleren beschrieben, die nur als Erläuterung vorgesehen sind, da zahlreiche Modifikationen und Variationen dazu dem Fachmann erkennbar werden werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Erfindung zu erläutern, aber nicht zu beschränken. Während die beschriebenen Protokolle typisch für diejenigen sind, die verwendet werden können, können andere Prozeduren, die dem Fachmann bekannt sind, alternativ angewendet werden.

Viren

Die bei dieser Studie verwendeten Retroviren wurden wie folgt präpariert. HIV-I Lai und Affenimmunschwächevirus (SIVB670) wurden in periphären Blutlymphozyten (PBLs) vermehrt. Caprines Arthritisenzephalitisvirus (CAEV-63) wurde in fötalen Ziegensynovialmembranzellen vermehrt. HTLV-I und HTLV-II wurden aus Überständen von MT-2- und Mo-T-Zellinien erhalten; Affenretroviren Typ 1 und 2 (SRV-1 und SRV-2) wurden in Raji-Zellen angezogen; Gibbonaffenleukämievirus (GALV) wurde in Jurkat- Zellen angezogen; und Affenschaumvirus Typ 3 (SFV-3) wurde in Cf2Th-Zellinien angezogen.

In vitro Transcription der RNA-Matrize

Eine RNA-Sequenz des Enzephalomyocarditisvirus (EMCV) wurde als Matrize verwendet und wurde aus einem Plasmidvektor erzeugt, der von Novagen (Madison, WI, USA) erhalten wurde. Eine kurze EMCV- Sequenz (350 bp) (SEQ ID NR.: 4) wurde unter Anwendung von Standard-PCR-Bedingungen und Verwendung des Primer-Paars T7- EMCF1 (SEQ ID NR.: 6) und EMCR2 (SEQ ID NR.: 2) aus dem Plasmid verstärkt. Die Sequenz von T7-EMCF1 (SEQ ID NR.: 6) war:
5'GGTACCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATTAGCCATTTCAACCCAT3'
und diejenige von EMCR2 (SEQ ID NR.: 2) war:
5'GTTCATGACAGGCCGATACAGAGG3'.
Um die in vitro Transcription dieses PCR-Produkts zu ermöglichen, wurde der sinnige Primer EMCF1: 5'CATTAGCCATTTCAACCCAT3' (SEQ ID NR.: 1) an dem 5'-Ende durch Anfügen einer T7 Promotorsequenz: 5'GGTACCTAATACGACTCACTAT-3'(SEQ ID NR.: 5) modifiziert.
Das EMCV-verstärkte Produkt wurde dann gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem großskaligen T7-Transcriptionssatz von Novagen transcribiert. Die DNA bei der RNA-Präparation wurde anschließend zweimal mit zwanzig Einheiten RNase-freier DNase (Promega) bei 37ºC für 60 Minuten digiriert, und die DNase wurde durch Aufheizen für 10 Minuten auf 95ºC inaktiviert. Die Reinheit der RNA-Zubereitung wurde bezüglich der Rest-DNA- Verunreinigung durch PCR-Verstärkung mit EMCF1 (SEQ ID NR.: 1) und EMCR2 (SEQ ID NR.: 2) und anschließende Southernblot- Hybridisierung an die ³²P-endmarkierte interne Sonde EMCP1 (SEQ ID NR.: 3): 5'TGCTCTCACCTTATCAAAATCCAAT3' überprüft.

Amp-RT

Zwanzig ul oder weniger der zu testenden biologischen Probe wurden zu 40 ul RT-Puffer hinzugegeben, der 10 ng RNA-Matrize, 10 Einheiten RNasen, 0,06% NP-40, 200 ng Primer (EMCR2, SEQ ID NR.: 2), 0,8 mM EGTA, 2 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und 10 mM MgCl&sub2; enthielt. Die Reaktion wurde bei 37ºC für zwei Stunden inkubiert und dann wurde für 10 Minuten auf 95ºC erhitzt, um jegliche RT-Aktivität zu inaktivieren. Ein Volumen von 50 ul Standard-PCR-Puffer (17), das 0,5 Einheiten Taq-Polymerase und 200 ng des sinnigen Primers ohne die T7-Sequenz (EMCF1, SEQ ID NR.: 1) enthielt, wurde zu dieser Mischung hinzugesetzt. Die Reaktion wurde 35 mal zyklisch durchgeführt bei 95ºC für 1 Minute, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für eine Minute. Zwanzig ul des Reaktionsprodukts wurden in 1,8% Agarosegelen elektrophoresiert und an eine ³²P-endmarkierte interne Sonde (EMCP1, SEQ ID NR.: 3) bei 42ºC über Nacht Southernblot-hybridisiert. Die Blots wurden in 2X 550 (NaCl und Natriumzitrat), 0,5 Natriumdodecylsulphat (SDS) für ein bis zwei Stunden gewaschen. Die Blots wurden für 6 bis 24 Stunden ausgesetzt.
Um die Integrität und die Reinheit der RNA-Matrizenpräparation zu überprüfen, wurden RT-Reaktionen unter Verwendung der EMCV- RNA-Matrize (SEQ ID NR.: 4) und eines HIV-I Virusstamms als RT- Quelle ausgeführt. Während die HIV-I-Reaktionen positiv waren, waren Kontrollreaktionen, in denen kein HIV-I vorlag, oder die vor der Zugabe von HIV-I mit RNase vorbehandelt waren, alle negativ. Die negativen Ergebnisse zeigen an, daß die zugrundeliegende Reaktion von AMP-RT RNA-abhängig war und daß die RNA- Matrize und andere Assay-Komponenten frei von Verunreinigungen an Ziel-DNA waren. Um weiter zu bestätigen, daß die Reaktion durch RT vermittelt wurde, wurden AMP-RT-Reaktionen unter Verwendung von HIV-I-Kulturüberstand in der Gegenwart von 2 ug Tetrahydroimmidazo-Benzodiazepin-(TIBO)-Verbindungen zubereitet, die nicht-nukleoside RT-Inhibitoren sind (2). Die Resultate zeigten eine Inhibierung der AMP-RT-Reaktion in der Präsenz nur der TIBO-Verbindungen, während die DNA-Polymeraseaktivität von Taq in der Kontrollverstärkungsreaktion nicht beeinträchtigt war.

Vergleichende Sensitivitätsanalyse von AMP-RT

Viele spezifische und generische Assays werden aktuell verwendet, um die Präsenz von Retroviren nachzuweisen. Um die relativen Sensitivitäten dieser Assays mit AMP-RT zur vergleichen, wurden Reihen von zehnfachen Verdünnungen von HIV-I-Kulturüberständen bei Kulturmedien hergestellt, und dann in gleiche Probenmengen aufgeteilt. Getrennte Probenmengen wurden der Austestung durch Standard-RT-Assay, verzweigten DNA-Nachweis, p24-Antigenbindung, 50% Gewebekulturbefalldosis (TCID&sub5;&sub0;)- Bestimmung, RT-PCT und Amp-RT unterworfen.

Standard-RT-Assay

Die RT-Aktivität wurde in Kulturüberständen mit dem Matrizenprimer poly(rA)oligo-dT gemäß den Verfahren nach Willey et. al. (3) gemessen. Die enzymatische Aktivität wurde durch Messen des eingebauten tritiierten Thymidinmonophaphats zugeordnet.

Verzweigter DNA-(bDNA)-Nachweis von HIV-I

Der verzweigte DNA-(bDNA)-Nachweis von HIV-I wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Chiron, Emryville, Kalifornien, USA) durchgeführt. Wie vom Hersteller gefordert wurde ein Abschneidewert von 5000 RNA-Äquivalenten/ml angewendet.

p24-Antigenbindung

Die Niveaus des basis-dissoziierten p24-Antigens von HIV-I wurden mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Satz von Organon Technika (North Carolina, USA) bestimmt.
TCID&sub5;&sub0;-Bestimmung
Die TCID&sub5;&sub0; des viralen Stamms von HIV-I wurde auf PBLs bestimmt, wie zuvor von Mc Dougal et al. beschrieben wurde (26).

RT-PCR

Genomische RNA von Partikel-assoziiertem HIV-I in Kulturüberstand wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 40 ul RT-Puffer [50 mM Tris-Cl (pH 8,3), 20 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;] (15) rekonstituiert. Die RNA wurde weiter mit fünf Einheiten DNase-I (Promega) in der Präsenz von 10 mM Natriumacetat bei 37ºC für 30 Minuten angesetzt. Die DNase wurde durch Aufheizen für 10 Minuten auf 95ºC aktiviert. Für die reverse Transcription wurden 10 ul RNA zu 20 ul der RT-Mischung hinzugesetzt, die 10 mM DTT, 20 Einheiten RNasin, jeweils 0,875 mM GTP, ATP, CTP und TTP, 200 ng Rückwärtsprimer (SK39, SEQ ID NR.: 8) und 0,02 Einheiten AMV-Rückwärtstranscriptase enthielt. Die Mischung wurde bei 42ºC für 45 Minuten revers transcribiert. Die Kontrollen umfassen 10 ul identische Probenmengen, die nicht revers transcribiert wurden. Alle Proben wurden dann durch PCR in 10 ul Reaktionsvolumen für 35 Zyklen verstärkt, wobei SK38/SK39 (SEQ ID NR.: 7 und 8) als Primer verwendet wurden und das verstärkte Produkt an die ³²P-markierte SK19-(SEQ ID NR.: 9)- Sonde Southernblot-hybridisiert wurde (27).
Die in Tabelle 1 gezeigten Resultate demonstrierten, daß AMP-RT der empfindlichste Assay war und 100.000 mal empfindlicher als der Standard-RT-Assay, 10.000 mal empfindlicher als das bDNA- Nachweissystem und das p24-Antigen-Bindungssystem und 100 mal empfindlicher als TCID&sub5;&sub0; und RT-PCR war. Die p24-Konzentration in der unverdünnten HIV-I-Probe wurde zu 1,6 ng gefunden.

Testen von klinischen Proben mit Amp-RT

Zweiundvierzig Serumproben von HIV-I-serumpositiven Individuen, die bei einer Studie der Entwicklungsgeschichte von HIV bei homosexuellen Männer in Atlanta, Georgia USA, aufgenommen wurden (28), wurden mit Amp-RT getestet. Das klinische Stadium der HIV- I-Infektion bei diesen Männern wurde auf der Basis des revidierten Klassifikationssystems des Centers for Desease Controll and Prevention (CDC) bestimmt (29). Labormarker, einschließlich CD4+-Lymphozytenzählungen und des Prozentanteils von CD4+- Lymphozyten im Blut, wurden durch cytometrische Standardflußverfahren bestimmt. Serumproben von 20 gesunden Individuen, die HTLV-I/II und HIV-I serumnegativ waren, wurden als Kontrollen hinzugenommen.
Anfängliche Experimente, die normales menschliches Serum verwendeten, das mit HIV-I geimpft war, waren alle Amp-RT negativ und zeigten an, daß die Präparation der Serumproben für Amp-RT besondere Bedingungen erfordert, die sich von denjenigen unterscheiden, die für Kulturüberstände beschrieben werden. Zum Beispiel konnten selbst kleine Volumina (5 bis 20 ul) an Serum oder Plasma wegen des Proteinausfalls, der während der Hochtemperaturstufe des PCR-Zyklus eintritt, nicht direkt mit Amp-RT getestet werden. Deshalb wurden zur Vermeidung dieses Problems die Seren ultrazentrifugiert und der Amp-RT-Assay wurde unter Verwendung des Viralpellets durchgeführt.
Zum Testen von Kulturüberständen wurden 20 ul oder weniger für die RT-Reaktion verwendet. Zum Testen von Serum- oder Plasmaproben wurden 0,5 ml zehnfach in DEPC-behandelter phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, durch Zentrifugation bei 1.000 g für 10 min geklärt und dann bei 44.000 g für 1 Stunde ultrazentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 ul RT-Puffer, der 0,6% NP-40 enthielt, für 15 Minuten suspendiert, und gleiche Proben von 5 bis 45 ul wurden bei dem Amp-RT-Assay verwendet.
Die Resultate des Testens von Serumproben zeigten an, daß Amp-RT in der Lage war, RT-Aktivität in 36 (85,7%) Serumproben nachzuweisen (Tabelle 2), von denen 31 (86,1%) nachweisbares p24- Antigen aufwiesen. Die hohe Sensitivität war auch an eine hohe Spezifizität gekoppelt, da keine der HIV-I/HTLV-serumnegativen Proben positiv war. Von den sechs Proben von als A1 klassifizierten Patienten waren 3 Amp-RT-positiv (5%), während fünf von sieben (71,4%) und 25 von 26 (96,1%) der Proben von Patienten, die als B2 bzw. C3 klassifiziert waren, Amp-RT-positiv waren.

Testen von Hepatitis-B-Virus (HBV) durch Amp-RT

Weil berichtet worden ist, daß das Polymerasegen von HBV RT-ähnliche Aktivität besitzen soll (30), wurde Amp-RT verwendet, um HBV-assoziierte RT-Aktivität nachzuweisen. Serumproben von 21 HBV-infizierten Individuen wurden ausgewählt, einschließlich 11 Proben mit nachweisbarem HBe-Antigen (Abbott HBe EIA, Chicago, USA) und zehn anderen Proben mit nicht nachweisbarem HBe-Antigen.
Trotz der dokumentierten Präsenz von HBV-Virionen in 11 Serumproben ergab keine der Proben ein positives Ergebnis bei der Amp-RT-Analyse. Diese negativen Ergebnisse schließen die Möglichkeit aus, daß HBV-assoziierte RT bei dem Amp-RT-Assay stört, zumindest unter diesen Bedingungen, und bestätigt daher den Spezifizitätsbereich des Assays für den Nachweis ausschließlich von retroviralen RTs.

Nachweis von unterschiedlichen Retroviren durch Amp-RT

Die Fähigkeit von Amp-RT, eine große Vielzahl von Retroviren nachzuweisen, die Mitglieder von allen drei retroviralen Subfamilien umfassen, wurde untersucht. Die getesteten Lentiviren schlossen HIV-I, SIV und CAEV ein. HTLV-I, HTLV-II, GALV, SRV-1 und SRV-2 waren Vertreter Onkoviren, und SFV-3 war Vertreter der Spumaviren. Amp-RT war in der Lage, alle getesteten Retroviren nachzuweisen. Dabei ist besonders wichtig, daß solche Viren wie HTLV-I, HTLV-II und GALV, die mit der Standard-RT-Methodologie schwer nachzuweisen sind, mit diesem Assay leicht identifiziert wurden.
Diese Viren konnten durch Amp-RT in Verdünnungen nachgewiesen werden, die 0,04 bis 0,00004 ul des originalen unkonzentrierten Kulturüberstands enthielten. Die Reihenverdünnungen der getesteten Retroviren wurde in dem Überstand von nicht infizierten Zellinien (Hut-78, A301 oder U937) durchgeführt. Alle drei Überstände wurden beständig negativ getestet, wie aus den Endpunktverdünnungen der getesteten Retroviren ersichtlich ist.

Direkter Vergleich mit kürzlich publizierten RT-Assays

Um zu demonstrieren, daß der Assay der vorliegenden Erfindung gesteigerte Spezifizität und Sensitivität im Vergleich zu anderen publizierten RT-Assays (22, 23) aufweist, kann ein direkter Vergleich dieser Assays durchgeführt werden. Diese Assays unterscheiden sich in der speziellen RNA-Matrizensequenz, Primer-Sequenz, RT-Pufferzusammensetzung, den Verstärkungsbedingungen, den Nachweisbedingungen und der angewandten Probenpräparation. Deshalb kann für einen Vergleich der beiden Assays eine Serie von Serumproben von HIV-I serumpositiven Individuen und von HIV-I und HTLV-I/II negativen Individuen gemäß den Lehren des vorliegenden Assays und jedem anderen Assay getestet werden. Positive Kontrollen können normales menschliches Serum umfassen, das mit HIV-I-Viruspartikeln geimpft ist. Die Spezifizität und die Sensitivität dieser Assays kann dann berechnet und verglichen werden.
Durchgehend durch die Anmeldung ist auf verschiedene Publikationen durch Nummern in Klammern Bezug genommen. Vollständige Zitierungen dieser Publikationen sind wie folgt. Die Offenbarungen dieser Publikationen in ihren Gesamtheiten sind hiermit durch Bezugnahmen in diese Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf dem diese Erfindung beruht, vollständiger zu beschreiben.
Obwohl der vorliegende Prozeß unter Bezugnahme auf spezifische Details und bestimmte Ausführungsformen hiervon beschrieben worden ist, ist nicht vorgesehen, daß solche Details als Beschränkungen des Schutzbereichs der Erfindung angesehen werden, sofern sie nicht in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind. Tabelle 1. Vergleich der Sensitivität von Amp-RT beim Nachweis von HIV-1 mit anderen generischen und Virus-spezifischen Verfahren. Tabelle 2. Nachweis der RT-Aktivität beim Amp-RT in Serumproben von HIV-1- infizierten Individuen, gekennzeichnet durch klinisches Stadium, CD4+ -Lymphozytenzählungen im peripheren Blut und Menge an p24-Antigen im Serum.
*A1 und A2 weisen auf asymptomatische, akute (primäre) oder andauernde generalisierte Lymphadenopathie mit CD4+-Lymphocytenzählungen von > 500/ul bzw. 200-499. B2 und B3 weisen auf symptomatische Bedingungen, die sich von denjenigen im Stadium A unterscheiden, bzw. auf AIDS mit CD4+-Lymphocytenzählungen von 200-499/ul bzw. < 200ul. C3 weist auf AIDS mit CD4+-Lymphocytenzählungen von < 200/ul (29).

LITERATURLISTE

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SEQUENZ-LISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER: HENEINE, WALID
FOLKS, THOMAS M.
SWITZER, WILLIAM M.
YAMAMOTO, SHINJI
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUM SENSITIVEN NACHWEIS VON REVERSER TRANSCRIPTASE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 9
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: NEEDLE & ROSENBERG P. C.
(B) STRASSE: 127 Peachtree Street, Suite 1200
(C) STADT: Atlanta
(D) STAAT: Georgia
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 30303
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) TYP DES MEDIUMS: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDEAKTENZEICHEN:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALTS-/VERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Spratt, Gwendolyn D.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 36,016
(C) BETREFFS/SEIN ZEICHEN: 1414.628
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 404/688-0770
(B) TELEFAX: 404/688-9880
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 20 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 1:
CATTAGCCAT TTCAACCCAT 20
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 24 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 2:
GTTCATGACA GGCCGATACA GAGG 24
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 3:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 25 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 3:
TGCTCTCACC TTATCAAAAT CCAAT 25
(2) iNFORMATiONEN ZUR SEQ ID NR.: 4:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 374 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: RNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 4:
CAUUAGCCAU UUCAACCCAU GCGUUUGAGG AGAAGCGCUU UCUGAUAACC GGUGGUCUCC 60
CAUCAGGUUG UGCAGCGACC UCAAUGCUAA ACACUAUAAU GAAUAAUAUA AUAAUUAGGG 120
CGGGUUUGUA UCUCACGUAU AAAAAUUUUG AAUUUGAUGA UGUGAAGGUG UUGUCGUACG 180
GAGAUGAUCU CCUUGUGGCC ACAAAUUACC AAUUGGAUUU UGAUAAGGUG AGAGCAAGCC 240
UCGCAAAGAC AGGAUAUAAG AUAACUCCCG CUAACACAAC UUCUACCUUU CCUCUUAAUU 300
CGACGCUUGA AGACGUUGUC UUCUUAAAAA GAAAGUUUAA GAAAGAGGGC CCUCUGUAUC 360
GGCCUGUCAU GAAC 374
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 5:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 22 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 5:
GGTACCTAAT ACGACTCACT AT 22
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 6:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 49 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 6:
GGTACCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC ATTAGCCATT TCAACCCAT 49
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 7:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 28 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 7:
ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 8:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 28 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 8:
TTTGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NR.: 9:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 41 Basispaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 9:
ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe, mit den Schritten:

a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer geeigneten Region des Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA-Primer anlaufen werden und ein DNA- Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist;

b) Verstärken der synthetisierten DNA; und

c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe anzeigt und so die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA-Matrize das Ribonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 4 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der komplementäre DNA-Primer das Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die synthetisierte DNA durch die Polymerasekettenreaktion verstärkt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Bedingungen, unter denen die synthetisierte DNA verstärkt wird, 30 bis 40 Zyklen des Erhitzens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf 93 bis 96ºC für 30 Sekunden bis eine Minute, 53 bis 56ºC für 30 Sekunden bis eine Minute und 70 bis 74ºC für 30 Sekunden bis fünf Minuten aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Bedingungen, unter denen die synthetisierte DNA verstärkt wird, etwa 35 Zyklen des Erhitzens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf etwa 95ºC für eine Minute, etwa 55ºC für eine Minute und etwa 72ºC für eine Minute aufweisen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Primer-Paar aus dem Oligonukleotid, das im wesentlichen aus SEQ ID NR.: 1 besteht, und dem Oligonukleotid, das im wesentlichen aus SEQ ID NR.: 2 besteht, besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA durch einen Southernblot- Hybridisierungsassay nachgewiesen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA in dem Southernblot-Hybridisierungsassay mit einer Sonde nachgewiesen wird, die im wesentlichen aus dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 3 besteht.

10. Verfahren zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe, mit den Schritten:

a) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer RNA- Matrize und einem komplementären DNA-Primer unter Bedingungen, unter denen die RNA-Matrize und der DNA-Primer anlaufen werden und ein DNA-Strang als Fortsatz von dem DNA-Primer synthetisiert wird, wenn reverse Transcriptase in der Probe präsent ist;

b) Verstärken der synthetisierten DNA durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren, wobei für die Verstärkung 30 bis 40 Zyklen des Erhitzens der synthetisierten DNA und eines Primer- Paars auf 93 bis 96ºC für 30 Sekunden bis eine Minute, 53 bis 56ºC für 30 Sekunden bis eine Minute und 70 bis 74ºC für 30 Sekunden bis fünf Minuten aufweisen; und

c) Nachweisen der Verstärkung der synthetisierten DNA, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA die Präsenz von reverser Transcriptase in der biologischen Probe anzeigt und so die Präsenz eines Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt, wobei die RNA-Matrize eine Region des Enzephalomyocarditisvirusgenoms ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Bedingungen für die Verstärkung der DNA etwa 35 Zyklen des Erhitzens der synthetisierten DNA und eines Primer-Paars auf etwa 95ºC für eine Minute, etwa 55ºC für eine Minute und etwa 72ºC für eine Minute aufweisen.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Verstärkung der synthetisierten DNA durch einen Southernblot-Hybridisierungsassay nachgewiesen wird.

13. Satz zum Nachweisen der Präsenz eines Retrovirus in einer biologischen Probe, mit einer geeigneten Region eines Enzephalomyocarditisvirusgenoms als RNA-Matrize und einem komplementären DNA-Primer für reverse Transcriptase und einem Primer-Paar für Polymerasekettenreaktion.

14. Satz nach Anspruch 13, wobei der komplementäre DNA-Primer das Oligonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 2 ist.

15. Satz nach Anspruch 13, wobei die RNA-Matrize das Ribonukleotid gemäß SEQ ID NR.: 4 ist.

16. Satz nach Anspruch 13, wobei das Primer-Paar aus dem Oligonukleotid, das im wesentlichen aus SEQ ID NR.: 1 besteht, und dem Oligonukleotid, das im wesentlichen aus SEQ ID NR.: 2 besteht, besteht.