JP4256931B2 - 逆転写酵素の高感度検出法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、逆転写酵素の存在を検出することによって、生物学的試料(biological sample)中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。この方法は、逆転写酵素が存在する場合、DNA鎖が合成され、その後ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される条件において、鋳型とプライマーを利用するものである。
背景技術
レトロウイルスは脊椎動物の間に広く分布し、ヒトや動物に対し、免疫欠損症、白血病及びリンパ種などの様々な疾病を引き起こすことが知られている(1)。レトロウイルス科全体としての特徴は、特有の酵素である逆転写酵素(RT)が存在することであり、この酵素はウイルスのゲノムRNAを二重鎖のDNAコピーに転写する(1)。この特徴から、主として二つの用途について、RTに特有な酵素的機能の研究が行われてきた。第一に、RTが存在することは、レトロウイルス感染の診断、及び、細胞培養及び感染した宿主中のレトロウイルスの存在の包括的な検出の根拠となる。第二に、RT酵素は抗ウイルス薬インターベンションの一次標的となる(1,2)。
いくつかのレトロウイルス由来のRTについては、そのポリメラーゼの機能の特徴が詳細に検討されており、RNA鋳型、プライマー、トリホスフェート、二価のカチオン及び生理的塩類を必要とすることが示されている(1)。従って、RT活性のアッセイでは、従来、これらの試薬類及び諸条件が用いられ、放射性物質で標識したヌクレオチド(例:3H−または32P−dTTP)を用いて相補的なDNAオリゴヌクレオチドプライマーを合成することによって試料が既知の外来のRNA鋳型(例:ポリrA)からDNAコピーを生成する能力を測定していた。RTが合成したDNAは標識したヌクレオチドの取り込みを測定することによって検出するが(3,4)、最近では、下記に詳述するように、複数の形態が開発されている酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)において非放射活性のヌクレオチドを用いたアッセイ(5〜8)によって、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(17)によって検出する。
RTアッセイは、依然、既知及び新規のレトロウイルスの同定に必須の実験道具であるが(4〜11)、RTアッセイによって好結果が得られるのは培養上清中のレトロウイルス粒子の検出に限られており(4〜8)、ウイルス検出の前に培養する必要があるという欠点がある。この方法では、ヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)等のレンチウイルス(lentivirus)は容易に検出されると思われるが、ヒトTリンパ球ウイルスI及びII型(HTLV−I及びHTLV−II)等のオンコウイルスは検出がはるかに困難である。これはおそらくRT活性が低いことと、典型的には細胞と結合していて、培養上清中でRTを検出する可能性が低いためであろう(6〜8)。この制約があることから、RT試験はHTLV感染の検出にはほとんど価値がなかった。
RTアッセイの感度を改善するために多くの検討がなされているが、臨床試料(例:血清)中のレトロウイルスは直接検出されていない(4〜12)。例えば、HIV−1感染者の研究では、RTアッセイによって血漿中のウイルスを検出することは、この方法の感度が低いために、ほとんど諦められていた(12)。
血清中のRT活性が検出できないことから、このウイルス学的マーカーを、疾病の診断、患者の薬効のモニタリング、ウイルス負荷のモニタリング、及び疾病の進行の予測のために用いることができない。現在の血漿HIV−1の定性的及び定量的検出方法には、ウイルスの単離とp24抗原の捕捉が含まれる(13〜15)。しかしながら、これらのアッセイには欠点がある。血漿からウイルスを単離するにはウイルスを培養することが必要であって、ウイルスの培養は、典型的には14〜28日間継続し、労働集約的であり、多くの時間が必要であり、生物学的変異を伴い、CD4+のTリンパ球数が200/mm3未満の患者でHIV−1が低値の感染集団においては普遍的なマーカーではない。同様にp24抗原は、遊離体、ウイルス粒子との結合体、または免疫複合体のいずれも、HIV−1感染集団において常に存在するものではない。
RT−PCRによって、外来のRT、及び、血漿中のウイルスのRNA配列を増幅する、配列が判っているプライマー対(primer pair)を使用して、血漿中で細胞から遊離したウイルスが定性的に検出される(15,16)。RT−PCRは高感度であることが報告されているが、このアッセイでは、RNAの抽出、及び、PCRが汚染される危険性を増す多くの試料操作が必要である。RT−PCRアッセイは、標準化された普遍的な定量試験が無いこと、及び、ゲノムRNAの分解に関してプロセッシング及び貯蔵の間に変化する可能性があることからも、複雑であろう。RT−PCRは抗原の捕捉と同様に特異性が高いが、標的のレトロウイルス断片のヌクレオチド配列の情報が、プライマーの開発に必要である。この制約のために、RT−PCRは、変異型、新規または未知のレトロウイルスの検出には適しない。
最近、鋳型としてバクテリオファージMS2またはチャヒキモザイクウイルス(brome mosaic virus,BMV)のRNAを、また、検出システムとしてPCRを使用する、二種のRTのアッセイによって、血清中のマウス白血病ウイルスのRT及び他の系統のレトロウイルスが高感度で検出されることが報告されている(18,19)。しかしながら、十分な数の血清標本についてのこれらのアッセイの特異性及び感度の評価は開示されなかった(18,19)。加えて、これら両方のアッセイについて、血清中のRT活性の阻害因子及びRT活性の非特異的なバックグラウンド値についての問題が記載されており(20)、これらのアッセイの診断上の価値について、重大な問題が提起されている。
本発明は、RT反応による既知のcDNA産物を検出する、PCRに基づく増幅システムを利用したRTアッセイを提供するものである。本発明のアッセイは、以下Amp−RTと示すが、感度及び特異性が高く、ウイルスのゲノム配列の情報が不必要で、レトロウイルスに感染した個体の試料におけるRT活性またはRTを産生する他のあらゆる生物学的存在物の検出を可能にする。
発明の概要
本発明は、a)生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料をRNA鋳型及び相補的DNAプライマーと接触させる工程、b)合成されたDNAを増幅する工程、並びにc)生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
また、本発明は、a)生物学的試料を、配列番号4のリボヌクレオチドからなる脳心筋炎ウイルスの適合領域であるRNA鋳型、及び、配列番号2のオリゴヌクレオチドである相補的DNAプライマーと、生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、接触させる工程、b)合成されたDNA、及び、実質的に配列番号1からなるオリゴヌクレオチド及び実質的に配列番号2からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を、93〜96℃で30秒〜1分間、53〜56℃で30秒〜1分間、及び70〜74℃で30秒〜5分間加熱するサイクルを30〜40サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたDNAを増幅する工程、並びに、c)実質的に配列番号3のオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって、生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
加えて、本発明は、RNA鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域、逆転写酵素のための相補的DNAプライマー、及び、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー対を含み、それぞれの成分が別々の容器に準備されるか、それら成分のいずれかの組合せが一つの容器に準備されることを特徴とする、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出するキットを提供する。
発明の詳細な説明
明細書及び請求の範囲で使用する各名詞は、文脈によって単数または複数を意味する。
本発明は、a)生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料をRNA鋳型及び相補的DNAプライマーと接触させる工程、b)合成されたDNAを増幅する工程、並びにc)生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
RNA鋳型は、例えば脳心筋炎ウイルスゲノム等の、あらゆるリボヌクレオチド配列の適合領域から構成され得る。ここで「適合領域(suitable region)」とは、重要な二次構造を持たず、G−C含有量が50%未満であるRNA配列の領域を意味し、本明細書で詳述するように、DNA鎖の合成に適した反応温度の範囲内にTm値(融解温度)を有する、この領域に対して相補的なDNAプライマーが産生され得る。RNA鋳型は、長さが100〜500塩基対、最も好ましくは、長さが約300塩基対のDNA産物を産生するのに十分な長さであってもよい。RNA鋳型は、配列番号4のリボヌクレオチドであってもよい。
ここで「相補的DNAプライマー」とは、本明細書で述べる条件下、生物学的試料中にRTが存在する場合に、ナセント(nascent)DNA鎖の合成を可能にする特定の方向でRNA鋳型にアニーリングするオリゴヌクレオチドを意味する。また、ここで、DNA鎖が合成される「条件」としては、逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、オリゴヌクレオチドが合成されたDNA鎖に取り込まれるような量のヌクレオチド、カチオン及び適当な緩衝剤の存在及び温度などが挙げられる。これらの条件のさらに具体的な例を実施例に示す。記載した条件は、他の公知のRT/cDNA合成のプロトコルを最適化したものである。当業者に公知のプロトコルに基づいて特定のRT反応を最適化するために他の条件を設定し得ることは、一般的に知られている。DNAプライマーは、例えば配列番号2(EMCR2)のオリゴヌクレオチド等の、PCRによる次の増幅に使用されるプライマー対の逆プライマーであってもよい。
生物学的試料は、あらゆる生体組織または体液(例:細胞、血清、血漿、精液、尿、唾液、痰、脳脊髄液)から得ることが可能である。合成されたDNA鎖は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(17)、連結増幅反応(ligation amplification reaction,LAR)(21)、リガーゼ基準増幅システム(ligase-based amplification system,LAS)(22)、自己維持配列複製(self-sustained sequence replication,3SR)システム(23)、転写基準増幅システム(transcription-based amplification system,TAS)(24)、及びQβレプリカーゼ増幅法(25)などの、これらに限定されない、現在または将来、この技術分野において知られているあらゆる増幅プロトコルによって増幅され得る。
PCRによる合成されたDNAの増幅条件として、合成されたDNA及びプライマー対を、93〜96℃(最も好ましくは95℃)で30秒〜1分間(最も好ましくは1分間)、53〜56℃(最も好ましくは55℃)で30秒〜1分間(最も好ましくは1分間)、及び70〜74℃(最も好ましくは72℃)で30秒〜5分間(最も好ましくは1分間)加熱するサイクルを、30〜40(最も好ましくは35)サイクル行うことが挙げられる。
ここで「プライマー対(primer pair)」とは二つのプライマーを意味し、センス及びアンチセンス配列からなる二本鎖DNA分子上のそれぞれの方向に関し、一方は前進(forward)を示し、他方は逆(reverse)を示し、その結果、本明細書に述べた増幅条件下で、前進プライマーはアニーリングしてセンス配列の増幅を開始し、また、逆プライマーはアニーリングしてアンチセンス配列の増幅を開始する。プライマーは、G−C含有量が50%未満であり、反応中の他のプライマーとの相補性が最小であり(プライマーの二量体の形成を最低限にする)、PCRに適した反応温度の範囲内にTm値(融解温度)を有することを基準として、増幅反応に使用するために選択され得る。さらには、プライマーは、生じるDNA増幅産物が長さが100〜500塩基対、最も好ましくは、長さが約300塩基対であるようなRNA鋳型の特異的な領域にアニーリングするものが選択され得る。例えば、上述した条件において、プライマー対は、前進プライマーとして配列番号1のオリゴヌクレオチド(EMCF1)、及び逆プライマーとして配列番号2のオリゴヌクレオチド(EMCR2)から成るものであってもよい。
ここで、増幅されたDNAの「検出」とは、RTが生物学的試料中に存在する場合のみ合成される増幅DNA鎖の存在を、定量的または定性的に測定することを意味する。合成されたDNAの増幅は、この技術分野で知られているあらゆるDNAの検出方法によって検出され得る。例えば、増幅DNAの検出は、サザンブロットハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上での特異的分子量のPCR産物の可視化、オートラジオグラフィーまたはシンチレーション測定による放射性物質標識したヌクレオチドの合成されたDNAへの取り込みの測定、増幅DNAに結合する検出可能部位を捕捉する改良ELISA法、または、当業者に知られているあらゆる他の検出方法によって、実施することが可能である。
サザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによる検出では、合成されたDNAは、鋳型から合成されたDNAに特異的なプローブによって検出され得る。例えば、そのような特異的なプローブは、実質的に配列番号3のオリゴヌクレオチド(EMCP1)から成るものであってもよい。本発明で使用するサザンブロットハイブリダイゼーションのプロトコルを実施例に示す。
本発明は、a)生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、RNA鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域及び相補的DNAプライマーと接触させる工程、b)合成されたDNAを増幅する工程、並びにc)生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
また、本発明は、a)生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、RNA鋳型及び相補的DNAプライマーと接触させる工程、b)合成されたDNA及びプライマー対を、93〜96℃で30秒〜1分間、53〜56℃で30秒〜1分間、及び70〜74℃で30秒〜5分間加熱するサイクルを30〜40サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたDNAを増幅する工程、並びにc)生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
さらには、本発明は、a)生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、RNA鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの領域及び相補的DNAプライマーと接触させる工程、b)合成されたDNA及びプライマー対を、93〜96℃で30秒〜1分間、53〜56℃で30秒〜1分間、及び70〜74℃で30秒〜5分間加熱するサイクルを30〜40サイクル行うことを含む増幅条件でのポリメラーゼ連鎖反応法によって、合成されたDNAを増幅する工程、並びにc)生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法を提供する。
例として、本発明は、a)生物学的試料を、RNA鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域であってRNA鋳型が配列番号4のリボヌクレオチド、及び、配列番号2のオリゴヌクレオチドである相補的DNAプライマーと、生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、オリゴヌクレオチド及びリボヌクレオチドがアニーリングし、DNA鎖がオリゴヌクレオチドからの伸長部分として合成される条件下で、接触させる工程、b)合成されたDNA、及び、実質的に配列番号1からなるオリゴヌクレオチド及び実質的に配列番号2からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を、95℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で1分間加熱するサイクルを約35サイクル行うことを含む増幅条件下でのポリメラーゼ連鎖反応による増幅で合成されたDNAを増幅する工程、並びにc)合成されたDNAの増幅を、実質的に配列番号3のオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスを検出する方法を提供し得る。
加えて、本発明は、この技術分野でよく知られている、RT及びPCR反応のための酵素、緩衝剤、カチオン及びオリゴヌクレオチドを含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出するキットを提供する。また、このキットは、RNA鋳型としての脳心筋炎ウイルスゲノムの適合領域、逆転写酵素のための相補的DNAプライマー、及び、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー対を含む。RNA鋳型、相補的DNAプライマー、及びプライマー対をなすプライマーは、それぞれ別々の容器に入れるか、または、これらの成分の全部またはあらゆる組合せを、一つの容器内に混合することができる。相補的DNAプライマーは、配列番号2のオリゴヌクレオチド(EMCR2)であってもよく、RNA鋳型は配列番号4のリボヌクレオチドであってもよく、また、プライマー対は、実質的に配列番号1からなるオリゴヌクレオチド(EMCF1)及び実質的に配列番号2からなるオリゴヌクレオチド(EMCR2)から成るものであってもよい。
本発明には、RTが生物学的試料中で検出され定量され得るという基本的発明原理に基づいた、付加的な応用がある。この原理の一つの応用としては、異なるレトロウイルスのRTに対する抗体(例:感染個体においてHIV−1またはHIV−2によって産生されるRTを識別可能な抗体)を用いて検出されるRTの特異的反応性に基づいて、レトロウイルスの差異を同定することがある。それぞれのレトロウイルスは異なるRTを有しており、それぞれに対して特異的な抗体を産生でき、それによって特異的なレトロウイルスを同定することができる。本発明の方法は、第一に、RTの存在の検出に使用することができ、次に、異なるレトロウイルスのRTに特異的な様々な抗体を生物学的試料に添加し、存在するレトロウイルスのタイプを同定することができる。抗体がそのウイルスに特異的で且つそのウイルス活性を阻害するようなウイルスによってRTが産生される場合、公知のRT特異性を有する抗体は、生物学的試料中に存在するRTと結合し、抗体の存在下ではDNA合成は起こらない。
本発明のもう一つの応用は、薬物療法に耐性のある患者のスクリーニングである。抗RT薬に対するRTの感受性は、患者が抗RT薬療法を受けている間にわたり、モニターすることができる。本発明は、使用された抗RT薬に対する患者の血清中のRTの感受性の指標としてのRT活性について、患者の血清を直接試験することによって、患者の抗RT薬耐性の発現の検出に使用することができる。薬剤耐性が検出される場合、代替の治療計画を実施することができる。本発明によって、患者の薬剤耐性を検討するために現在使用されている、冗長で労働集約的な培養法を実施する必要がなくなる。
本発明の第三の応用は、RTを産生する生物学的存在物が感染している患者におけるウイルス負荷(virus load)のモニタリングである。疾病の進行を追跡し患者の疾病の予後を診断する目的において、経時的なRTの定量は、これらの存在物による疾病の罹患者の生存率及び/または回復率と相関する可能性がある。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、多数の改良及び変更が当業者にとって明らかであることから、実施例は単なる例示として記載する。
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を何ら制限するものではない。記載されたプロトコルは使用され得る代表的なものであり、当業者に知られた他の手法も代替として使用され得る。
ウイルス
本研究で使用するレトロウイルスは、下記の通り調製した。HIV−1 Lai及びシミアン免疫欠損ウイルス(SIVB670)を、末梢血リンパ球(PBL)中で増殖させた。ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV−63)をヤギ胎児の滑膜細胞中で増殖させた。HTLV−I及びHTLV−IIは、MT−2及びMo−T細胞系の上清より得、シミアンレトロウイルス1型及び2型(SRV−1及びSRV−2)はRaji細胞中で培養し、テナガザル白血病ウイルス(GALV)はJurkat細胞中で培養し、シミアンフォーミイ(foamy)ウイルス3型(SFV−3)はCf2Th細胞系で培養した。
RNA鋳型のインビトロでの転写
脳心筋炎ウイルス(EMCV)から得たRNA配列を、鋳型として使用し、Novagen(米国ウィスコンシン州、マディソン)より入手したプラスミドベクターから産生した。短いEMCVの配列(350塩基対)(配列番号4)を、標準的なPCRの条件、並びにプライマー対T7−EMCF1(配列番号6)及びEMCR2(配列番号2)を使用して、プラスミドから増幅した。T7−EMCF1(配列番号6)の配列は、
であり、EMCR2(配列番号2)の配列は、
である。
このPCR産物をインビトロで転写するために、センスプライマーであるEMCF1、
を、5’末端にT7プロモーター配列、
を付加することによって修飾した。
次に、EMCV増幅産物は、NovagonのラージスケールT7転写キットを使用し、製造元の指示に従って転写した。続いて、RNA標品中のDNAを、RNaseフリーのDNase(Promega)20単位によって、37℃で60分間2回消化し、DNaseは95℃で10分間加熱して不活化した。RNA標品の純度は、EMCF1(配列番号1)及びEMCR2(配列番号2)を使用したPCR増幅、及び、続く32Pで末端を標識した内部プローブEMCP1(配列番号3)、
とのサザンブロットハイブリダイゼーションによって、残存するDNAの混入に関し確認した。
Amp−RT
20μl以下の被検生物学的試料を、RNA鋳型10ng、RNasin10単位、0.06%NP−40、プライマー(EMCR2、配列番号2)200ng、0.8mM EGTA,2mM DTT、50mMトリス塩酸、50mM塩化カリウム、及び10mM塩化マグネシウムを含むRT緩衝液40μlに添加した。反応は、37℃で2時間インキュベートし、その後95℃で10分間加熱して全てのRT活性を不活化した。この混合物に、Taqポリメラーゼ0.5単位及びT7配列を持たないセンスプライマー(EMCF1、配列番号1)200ngを含む標準的なPCR緩衝液(17)50μlを添加した。反応は、95℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で1分間のサイクルを、35サイクル行った。反応生成物の20μlを、1.8%アガロースゲルで電気泳動し、32Pで末端を標識した内部プローブ(EMCP1、配列番号3)と、42℃で一晩、サザンブロット法でハイブリッド形成させた。ブロットは、2X SSC(塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)中で、1〜2時間洗浄した。ブロットは6〜24時間感光した。
RNA鋳型の標品の完全性及び純度を確認するために、EMCV RNA鋳型(配列番号4)及びRT源としてHIV−1ウイルス株を使用して、RT反応を実施した。HIV−1反応は陽性であり、HIV−1を使用しないか、またはHIV−1を添加する前にRNaseで前処理する対照反応は、全て陰性であった。これらの陰性の結果から、Amp−RTの根本的な反応はRNA依存性であり、RNA鋳型と他のアッセイの成分は混入標的DNAを全く含まないことが示された。この反応がRTによって媒介されていることを更に確証するために、非ヌクレオシドRT阻害物質であるテトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピン(TIBO)化合物(2)2μgの存在下でHIV−1培養上清を使用して、Amp−RT反応を行った。その結果、TIBO化合物の存在下でのみAmp−RT反応が阻害され、一方、対照の増幅反応においてTaqのDNAポリメラーゼ活性は影響を受けなかったことが示された。
Amp−RTの比較感度分析
現在、多数の特異的及び遺伝的アッセイが、レトロウイルスの存在の検出に用いられている。これらのアッセイのAmp−RTに対する相対感度を比較するために、HIV−1の培養上清を連続的に10倍に希釈し、等量に分けた。それぞれの希釈液について、標準的RTアッセイ、分枝型DNA(branched DNA)検出、p24抗原捕捉、組織培養50%感染量(TCID50)測定、RT−PCR、及びAmp−RTによって、試験を行った。
標準的RTアッセイ
RT活性は、Willeyらの方法(3)に従って、ポリ(rA).オリゴdTの鋳型プライマーを用いて、培養上清の活性を測定した。酵素活性は、トリチウム化したチミジン一リン酸の取り込みを測定することによって評価した。
HIV−1の分枝型DNA(bDNA)検出
HIV−1の分枝型DNA(bDNA)検出は、製造元の指示(Chiron、米国カリフォルニア州、Emryville)に従って実施した。製造元の推奨の通り、カットオフを5,000RNA等量/mlとした。
p24抗原捕捉
HIV−1の、塩基が解離したp24抗原は、Organon Technika(米国ノースカロライナ州)が販売しているELISAキットによって測定した。
TCID50測定
HIV−1ウイルス株のTCID50は、McDougalらの報告(26)の通り、PBLについて測定した。
RT−PCR
培養上清中の、粒子と結合したHIV−1ゲノムRNAは、フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、40μlのRT緩衝液[50mMトリス−Cl(pH8.3)、20mM塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム](15)中で再構成した。RNAをさらに、10mM酢酸ナトリウムの存在下、DNase−I(Promega)(5単位)で、37℃で30分間消化した。DNaseは95℃で10分間加熱して不活化した。逆転写のために、10mM DTT、RNasin20単位、GTP、ATP、CTP及びTTPをそれぞれ0.875mM、逆プライマー(SK39,配列番号8)200ng及びAMV−逆転写酵素0.02単位を含むRT混合物20μlに、RNA10μlを加えた。この混合物を、42℃で45分間逆転写させた。対照には、逆転写を行わない溶液10μlを用いた。次に全ての試料を100μlの反応容量中、プライマーとしてSK38/SK39(配列番号7及び8)を使用して35サイクルPCRによって増幅させ、増幅産物は32Pで標識したSK19(配列番号9)プローブとサザンブロット法でハイブリッド形成させた(27)。
表1に示した結果から、Amp−RTが最も感度の高いアッセイであり、標準的RTアッセイの100,000倍、bDNA検出システム及びp24抗原捕捉アッセイの10,000倍、及び、TCID50及びRT−PCRの100倍、高感度であることが示された。希釈していないHIV−1試料中のp24抗原の濃度は、1.6ngであった。
Amp−RTを用いた臨床試料の試験
米国ジョージア州アトランタで、同性愛の男性におけるHIVのナチュラルヒストリーの研究に登録しているHIV−1血清陽性(seropositive)群から得た42例の血清試料について、Amp−RT試験を行った。これらの男性のHIV−1感染の臨床段階は、米国の疾病対策・予防センター(CDC)が改訂した分類システム(29)に基づいて決定した。CD4+のリンパ球数及び血液中のCD4+のリンパ球のパーセンテージなどの研究のマーカーは、標準的なフローサイトメトリー法によって決定した。対照として、HTLV−I/II及びHIV−1の血清陰性(seronegative)の健常者群20例の血清試料を使用した。
HIV−1でスパイク(spike)した正常ヒト血清を使用した予備実験では全てAmp−RT陰性であり、この実験から、Amp−RTに用いる血清試料の調製には、培養上清の条件と異なる特別な条件が必要であることが示唆された。例えば、PCRサイクルの高温の段階でタンパク質が沈澱することから、少量(5〜20μl)の血清または血漿であっても、Amp−RTでは直接試験できなかった。従って、この問題を回避するために、血清を遠心分離し、ウイルスの沈殿物を使用してAmp−RTアッセイを実施した。
培養上清の試験では、20μl以下の上清をRT反応に使用した。血清または血漿試料の試験では、0.5mlを、DEPC処理したリン酸緩衝溶液で10倍に希釈し、1,000gで10分間遠心分離して透明にし、44,000gで1時間、超遠心分離した。沈殿物を0.6%NP−40を含むRT緩衝液50μl中に15分間懸濁し、5〜45μlをAmp−RTアッセイに使用した。
血清試料の試験結果から、Amp−RTは、36例(85.7%)の血清試料でRT活性を検出できたことが示され(表2)、そのうち31例(86.1%)でp24抗原が検出された。HIV−1/HTLV血清陰性の試料で陽性の結果が得られたものは無いので、この試験は高感度であるとともに特異性も高かった。A1に分類された患者の試料6例のうち、3例(50%)はAmp−RT陽性であり、一方、B2及びC3に分類された患者の試料では、それぞれ、7例中5例(71.4%)、及び、26例中25例(96.1%)でAmp−RT陽性であった。
Amp−RTによるB型肝炎ウイルス(HBV)の試験
HBVのポリメラーゼ遺伝子がRT様の活性を有することが報告されているので(30)、HBV関連のRT活性の検出にAmp−RTを使用した。HBV感染群21例からの血清試料を選択し、そのうち11例でHBe抗原が検出され(Abbott HBe EIA、米国シカゴ)、その他の10例ではHBe抗原は検出されなかった。
11例の血清標本でHBVウイルス粒子が存在したが、Amp−RT分析では陽性の結果は1例も得られなかった。これらの陰性の結果から、少なくともこれらの条件下では、HBV関連のRTがAmp−RTアッセイにおいて干渉する可能性が除外され、従って、レトロウイルスのRTのみを検出するという、アッセイの特異性の範囲が確認される。
Amp−RTによる異なるレトロウイルスの検出
レトロウイルスの三亜科全てにわたる多種のレトロウイルスについて、Amp−RTの検出能力を調べた。レンチウイルスとしては、HIV−1、SIV及びCAEVについて試験を行った。オンコウイルスとしては、HTLV−1、HTLV−II、GALV、SRV−1及びSRV−2を用い、スプマウイルスとしては、SFV−3を使用した。Amp−RTでは、試験を行った全てのレトロウイルスを検出することが可能であった。最も重要な点は、HTLV−I、HTLV−II及びGALVなどのウイルスは、標準的なRT法で検出するのが難しいものの典型であるが、このアッセイでは容易に同定されたことである。
これらのウイルスは、元の濃縮しない培養上清を0.04〜0.00004μl含む希釈溶液中、Amp−RTで検出された。被検レトロウイルスは、非感染細胞系(Hut−78、A301またはU937)から得た上清で連続希釈した。被検レトロウイルスの希釈の終点からわかるように、三種の上清は全て陰性であった。
公知のRTアッセイの並行比較(side by side comparison)
本発明のアッセイが、発表されている他のRTアッセイ[22,23]と比較して特異性及び感度が高いことを実証するために、これらのアッセイの並行比較を実施できる。これらのアッセイは、特定のRNA鋳型配列、プライマー配列、RT緩衝液組成、増幅条件、検出条件及び使用した試料の調製について異なっている。従って、二つのアッセイの比較として、本アッセイ及び他の各アッセイの教示に従って、HIV−1血清陽性群及びHIV−1及びHTLV−I/II陰性群からの血清試料のパネル調査を行ってもよい。陽性対照として、HIV−1ウイルス粒子でスパイクした正常ヒト血清を使用し得る。次に、これらのアッセイの特異性及び感度を計算し、比較する。
この出願では、多数の文献は全てかっこ内の数字で参照する。これらの文献の詳細は下記の通りである。本発明が属する技術分野の状態をより詳細に記載するため、これらの文献を引用することによって、本出願に文献の開示を全て包含させる。
本発明の方法を、ある態様について具体的な詳細により説明したが、この詳細な説明は、発明の請求の範囲が包含する範囲を除外し、発明の範囲を制限するものではない。
参考文献
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:ヘネイン,ワリッド
フォルクス,トーマス,エム.
スウィッツァー,ウィリアム,マーシャル
ヤマモト,シンジ
(ii)発明の名称:逆転写酵素の高感度検出法
(iii)配列の数:9
(iv)連絡先:
(A)受取人:ニードル&ローゼンバーグ
(B)番地:127ピーチツリーストリート、スーツ1200
(C)都市名:アトランタ
(D)州名:ジョージア
(E)国名:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:30303
(v)コンピュータ読取形式:
(A)媒体型:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM PCコンパチブル
(C)オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:PatentInリリース#1.0,バージョン#1.25
(vi)最新の出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)弁理士/代理人情報:
(A)氏名:スプラット,グエンドリン ディー.
(B)登録番号:36,016
(C)参照/事件番号:1414.628
(ix)通信情報:
(A)電話番号:404/688-0770
(B)ファックス番号:404/688-9880
(2)配列番号1に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:20塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号1
(2)配列番号2に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:24塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号2
(2)配列番号3に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:25塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号3
(2)配列番号4に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:374塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:RNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号4
(2)配列番号5に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:22塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号5
(2)配列番号6に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:49塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号6
(2)配列番号7に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:28塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号7
(2)配列番号8に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:28塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号8
(2)配列番号9に関する情報
(i)配列の特性:
(A)配列の長さ:41塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:1本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(xi)配列:配列番号9
Claims (11)
- a)生物学的試料中に逆転写酵素が存在する場合、RNA鋳型及びDNAプライマーがアニーリングし、DNA鎖がDNAプライマーからの伸長部分として合成される条件下で、生物学的試料を、RNA鋳型としての配列番号4のリボヌクレオチド及び相補的DNAプライマーと接触させる工程、
b)合成されたDNAを増幅する工程、並びに
c)生物学的試料中の逆転写酵素の存在を示し、従って、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を示す、合成されたDNAの増幅を検出する工程、を含む、生物学的試料中のレトロウイルスの存在を検出する方法。 - 前記相補的DNAプライマーが配列番号2のオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記の合成されたDNAがポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記の合成されたDNAの増幅条件が、合成されたDNA及びプライマー対を、93〜96℃で30秒〜1分間、53〜56℃で30秒〜1分間、及び70〜74℃で30秒〜5分間加熱するサイクルを30〜40サイクル行うことを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記の合成されたDNAの増幅条件が、合成されたDNA及びプライマー対を、95℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で1分間加熱するサイクルを35サイクル行うことを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記プライマー対が、配列番号1からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号2からなるオリゴヌクレオチドからなる、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記の合成されたDNAの増幅が、サザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記の合成されたDNAが、配列番号3のオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイにおいて検出される、請求項7に記載の方法。
- RNA鋳型としての配列番号4のリボヌクレオチド、逆転写酵素のための相補的DNAプライマー、及び、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー対を含むことを特徴とする、生物学的試料中のレトロウイルスの存在検出用キット。
- 前記相補的DNAプライマーが配列番号2のオリゴヌクレオチドである、請求項9に記載のキット。
- 前記のプライマー対が、配列番号1からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号2からなるオリゴヌクレオチドからなる、請求項9又は10に記載のキット。
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