JPH10505224A

JPH10505224A - 組換えウイルスおよびその関連定量法

Info

Publication number: JPH10505224A
Application number: JP8502084A
Authority: JP
Inventors: ナータラジャン，ベンカタチャラ; ピー．ザルツマン，ノーマン
Original assignee: ジョージタウン、ユニバーシティー
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 1998-05-26
Also published as: AU7512394A; CA2192324A1; CA2192324C; AU692792B2; WO1995034684A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、概略的にはウイルスおよびウイルス核酸の定量に関する。本発明は、試料に含まれるウイルスの量の定量法であって、試料に、遺伝学的に標識したウイルス核酸を含んでなる組成物を導入し、上記野生型および上記標識した核酸を分離し、上記野生型および上記標識した核酸を定量することを含んでなる方法に関する。本発明は、挿入および欠失を含む標識配列を含んでなる遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウイルスおよびその関連定量法発明の分野本発明は、一般的には核酸増幅の後のウイルスの定量法に関する。本発明は、野生型ウイルス核酸から識別することができる遺伝子標識を行ったレトロウイルス核酸にも関する。発明の背景定量的ＰＣＲは、多種多様な異なる試料からのＲＮＡおよびＤＮＡの相対濃度を測定するのに用いられてきた。時には、出発標的材料の量とＰＣＲ生成物の量との間に直接的相関を見いだすことができる(Mullis および Faloona，Methods Enzymol．155:335-50(1987); Ferre，F.，PCR Methods Applic．2:1-9(1992); S ardelli，A.D．Amplifications: A Forum for PCR Users(9):1-5(1993))。しかしながら、これは、試料中にＰＣＲの阻害剤が含まれておりまたＰＣＲの試料回収率および速度論の効率が異なるため、臨床試料についての場合ではないことが多い(Holodniy ら，J．Clin．Micro．29:676-679(1991); Beutlerら，Bio Techn iques 9:166(1990); Franchis ら，Nucl．Acids Res．16:10355(1988); Coutlee ら，J．Infect．Dis．164:817-818(1991))。ＰＣＲを定量分析法として用いると、問題を生じることが多い。例えば、増幅効率の小さな変動によって、生成物の収率が変化し、出発材料に含まれる量を正確に評価することが困難になることがある(Gillilandら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2725-2729(1990))。このような問題点を回避するため、幾つかの研究室ではＰＣＲに内部標準を用いることを報告している(Gillilandら，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 87:2725- 2729(1990); Wang ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9717-9721(1989); Beck er-Andreら，Nucl．Acids Res．17:9437-9446(1990); Chellyら,Eur．J．Bioche m．187:691-698(1990); Bergenhem ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89: 8798- 8802(1992); Aoki-Sei ら，AIDS Res．Human Retro．8:1263-1270(1992); Siebe rt ら，Nature 359:557-558(1992))。通常、内部標準ＤＮＡまたはＲＮＡは同一のプライマーを標的ＤＮＡまたはＲＮＡとして共有するが、標準と標的とから得られた生成物を識別できるように欠失または挿入を含む。内部コントロールの使用における変法は、競合的ＰＣＲ法である(Gillilandら，Proc．Natl．Acad．Sci USA 87:2725-2729(1990))。この方法では、様々な既知量の内部標準を、同量の知標的配列を含む試料に加える。内部標準と標的配列とは、ＰＣＲにおいてプライマー結合および増幅に対して等しく競合する。増幅効率およびサイクル数のような変数は、これらの鋳型に同じ効果を有する。これらの鋳型の初期濃度が等しいときには、等量の生成物が形成される。実験的に、形成される生成物の比率を決定することができ、また等量点(equivalence point )を計算することができる。この方法は、臨床試料中のＨＩＶ−ＩＲＮＡの量を定量するのに用いることができた(Bagnarelli ら，J．Med．Virol．34:89-95(19 91); Menzoら，J．Clin．Microbiol．30:1752-1757(1992))。しかしながら、この方法では、試料毎のＲＮＡ回収率の変動を制御することができない。同様に、ウイルスＤＮＡの分離が不完全なことが多く、ＤＮＡの量を制御することができれば極めて有用であろう。本発明では、本発明者らは、感染性の標識したウイルスを競合核酸の供給源として用いる改良法を開発した。標識したウイルスは、試料にあると考えられるウイルスの突然変異体または変異体である。標識したウイルスの様々な量を未知量のウイルスを含む等量の試料に加えた後、核酸抽出および増幅を行い、試料に含まれるウイルス核酸の量が比較的精確に定量されるようにすることができる。発明の要約本発明者らは、任意の試料中のウイルス核酸を突然変異体（標識した）ウイルスを内部コントロールとして用いて測定する分析法を開発した。突然変異体ウイルスは、ゲノムの領域に配列標識を有する。このウイルスを内部コントロールとして用いるため、このウイルスの希釈物または複数の希釈物を、測定を行う試料の一部に添加して、核酸を単離し、増幅して、定量する。増幅は、外部的に添加されたウイルスに標識を含む配列を増幅することができる配列を含むように選択されたプライマーで行う。コントロールウイルスからの増幅生成物は、試料に含まれるウイルスから識別することができる。増幅生成物を検出した後、この試料に含まれるウイルス核酸の量を算出する。従来のＰＣＲのような他の定量的増幅分析法とは異なり、この内部的にコントロールしたビリオン増幅分析法では、ウイルス核酸の精製段階中に回収率が変動しやすいことによって導入される誤差がなくなるので、この分析法の精度が高くなる。従って、本発明の好ましい態様は、試料に含まれるウイルスの量の定量法であって、この試料中に遺伝学的に標識したウイルス核酸を含むウイルスを含んでなる組成物を導入し、この試料から上記の野生型および上記の標識した核酸を同時単離し、この試料からの野生型および標識した核酸を増幅し、上記の野生型および上記の標識した核酸を定量する段階を含んでなる方法である。本発明は、上記のレトロウイルス核酸の高度に保存された領域に標識配列を含んでなり、上記標識がレトロウイルスプライマー結合とギャグ(gag)開始部位との間で起こる、遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸も提供する。図面の簡単な説明第１図は、突然変異体ウイルス（ＶＸ−４６）ＲＮＡから合成したｃＤＮＡのＰＣＲでの競合体としての使用を表している。ｐ２４抗原１００ｐｇを含む突然変異体ウイルスから単離したＲＮＡを用いて、６０μｌ反応でcＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ２μｌを、ＨＩＶＮＬ４．３配列の５０１から１４４８までを含む競合体野生型ＤＮＡ（ｐＡ１）の各種の量を含むＰＣＲに用いた。ＰＣＲを行い、生成物を³²Ｐ−プローブでハイブリダイゼーションし、材料および方法に記載された通りにオートラジオグラフィを行った。反応に含まれる競合体ＤＮＡのコピー数は、１０⁶（レーン１）、５×１０⁵（レーン２）、１０⁵（レーン３）、５×１０⁴（レーン４）、１０⁴（レーン５）、１０³（レーン６）、１０²（レーン７）、および０（レーン８）であった。右に示した大きさは、それぞれ突然変異体および野生型配列からのｂｐでのＰＣＲ生成物であった。第２図は、突然変異体ウイルスＶＸ−４６から単離したＲＮＡの評価のデーターを表している。野生型および突然変異体ＰＣＲ生成物に相当するバンドに含まれる放射能の量を、これをリン貯蔵スクリーン(storage Phosphor screen)に暴露することによって評価し、Molecular Dynamics Phosphor Imagerを用いて定量した(Johnston ら，Electrophoresis 11:355-360(1990))。野生型（ｐＡ１）と突然変異体（ＶＸ−４６）ＤＮＡバンドに含まれる放射能の量の比を、ＰＣＲに用いた野生型ＤＮＡの量に対してプロットした。突然変異体ウイルスＲＮＡを、ｐ２４抗原をそれぞれ１００ｐｇ（パネルＡ）、２５ｐｇ（パネルＢ）、および５００ｆｇ（パネルＣ）含むウイルスから単離した。第１図から誘導されるデーターをパネルＡに示す。ｐ２４を２５ｐｇ（パネルＢ）および５００ｆｇ（パネルＣ）含むウイルスから単離したＲＮＡを用いて、４０μｌ反応でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡの３μｌを競争的ＰＣＲに用いた。Menzo らによって記載された方法に基づいて(Menzoら，J．Clin．Microbiol．30:1752-1757(1992))、（パネルＡ）でのｃＤＮＡ２μｌは９５００個のコピーを有し、（パネルＢ）でのｃＤＮＡ３μｌは５２００個のコピーを、（パネルＣ）でのｃＤＮＡ３μｌは１２０個のコピーをそれぞれ有すると計算された。第３図は、ヒト患者の血漿中のＨＩＶ−ＩＲＮＡを評価するためのＩＣＶＰＣＲを表している。パネルＡおよびＢ患者血漿１００μｌに、様々な希釈度のｐ２４抗原０（レーン１）、３０（レーン２）、３（レーン３）、０．３（レーン４）および０．０３（レーン５）ｐｇ含む突然変異体ウイルス（ＶＸ−４６）を加えた。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲは、材料および方法に記載の通りに行った。突然変異体（１４８）および野生型（１２３）からのＤＮＡ生成物の大きさを右に示す。パネルＡおよびＢは、２名の異なるヒト患者からの血漿であった。パネルＣそれぞれのバンドに含まれる放射能を、Molecular Dynamics P hosphorImagerを用いて定量した。突然変異体および患者ＤＮＡバンドに含まれる放射能の比を、ＲＮＡ単離の際に患者血漿に加えた突然変異体ウイルスＲＮＡの量に対してプロットした。突然変異体ウイルスＲＮＡのコピー数を、第２図に示したデーターで得た平均値（ｐ２４抗原１ｐｇ当たりＲＮＡ２９００コピー）を用いて計算した。患者−１（△−−−−△）は、血漿１００μｌにＲＮＡを８，８００コピーを有し、患者−２（○−−−−○）は１，６００コピーを有する。第４図は、ＩＣＶＰＣＲの再現性を示すデーターを表す。パネルＡ患者血漿１００μｌに、様々な希釈度のｐ２４抗原０（レーン１）、２４（レーン２および６）、２．４（レーン３および７）、０．２４（レーン４および８）および０．０２４（レーン５および９）ｐｇ含む突然変異体ウイルス（ＶＸ−４６）を加えた。レーン１〜５および６〜９についてのＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲおよびゲル分析は、別々の日に２種類の異なる実験によって行った。突然変異体（１４８）および野生型（１２３）からのＤＮＡ生成物の大きさを右に示す。パネルＢそれぞれのバンドに含まれる放射能を、材料および方法に記載された通りに定量して、プロットした。（△−−−−△）についてのデーターはレーン２からレーン５までであり、（○−−−−○）についてのデーターはレーン６からレーン９までであった。好ましい態様の詳細な説明Ｉ．概論本発明は、個人からの試料中のウイルス核酸を、突然変異体（標識した）ウイルスを内部コントロールとして用いて測定する方法を提供する。好ましい態様により、感染性の標識したウイルスを提供する。このウイルスを内部コントロールとして利用するため、このウイルスの希釈物または複数の希釈物を、測定を行う試料の一部に添加して、核酸を単離し、外部的に加えたウイルス中で標識を含む配列を増幅することができるプライマーで増幅する。コントロールウイルスからの増幅生成物は、試料に含まれるウイルスと識別することができる。試料に含まれるウイルス核酸の量を、増幅生成物を検出した後に計算する。ここで用いられる「増幅」とは、核酸配列または複数の配列のコピー数を増加する任意のイン・ビトロ法を表す。核酸増幅の結果、ヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに取り込まれる。本明細書で用いられるように、一つの増幅反応は多数回のＤＮＡ複製からなることがある。例えば、１回のＲＣＲ反応は、３０〜１００「サイクル」の変性または複製からなることがある。増幅を行う典型的な手法としては、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号明細書を参照）、ＬＣＲ（(Barany，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:189-193（1991）、修復連鎖反応（ＲＣＲ）、および３ＳＲ（例えば、欧州特許公表第３７３，９６０号明細書を参照）、例えば核酸に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）のような特定の種類の３ＳＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。「プライマー」という用語は、一般的には鋳型核酸にハイブリダイゼーションして、この鋳型上で重合をプライミングすることができる核酸分子を表す。この用語は、デオキシリボ核酸またはその誘導体を包含するものと解釈すべきであるが、これらに限定されない。ここで用いられる「鋳型」という用語は、ヌクレオチドポリメラーゼが重合に用いる核酸分子を表す。鋳型分子は、部分的または完全に重合して、そのヌクレオチド残基の総てを重合コピーしまたは任意の数のその残基を重合コピーすることができる。一つの好ましい態様では、核酸鋳型はリボ核酸を含んでなり、かつポリメラーゼは逆転写酵素である。もう一つの好ましい態様では、鋳型がＤＮＡであり、ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ(DNA-directed-DNA-polymerase)である。本明細書に用いられる「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸結合物を表す当該技術分野の用語である。ヌクレオチドは、核酸ポリマー、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡのモノマー単位である。この用語は、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰまたはｒＵＴＰのようなリボヌクレオシド三リン酸、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオシド三リン酸を包含する。「ヌクレオシド」は、塩基−糖結合物、すなわちリン酸を欠いているヌクレオチドである。「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語の用法にはある種の互換性があることが当該技術分野で認められている。「ＰＣＲ」とは、本明細書では、米国特許第４，６８３，１９５号明細書（Mu llisら）および第４，６８３，２０２号明細書にMullisによって開示されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を意味し、上記の特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。このＰＣＲ法では、好ましくは、所望な配列の対向末端に一致する短いオリゴヌクレオチドプライマーが調製される。プライマー間の配列は、既知である必要はない。ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の試料を抽出して、（好ましくは、熱によって）変性する。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーを過剰モル量で、ｄＮＴＰおよびポリメラーゼ（好ましくは、熱に対して安定なＴａｑポリメラーゼ）と共に加える。ＤＮＡを複製した後、再度変性する。これにより２種類の「長い生成物」が得られ、これはそれぞれのプライマーと２個の元の鎖（二本鎖ＤＮＡ分子当たり）とから始まっている。次に、反応混合物を（例えば、温度を低下させ、変性剤を不活性化し、または更にポリメラーゼを添加することによって）重合条件に戻し、第二のサイクルを開始する。第二のサイクルでは、２本の元の鎖、サイクル１からの２本の長い生成物、２本の新規な長い生成物（元の鎖から複製されたもの）、および長い生成物から複製された２本の「短い生成物」が提供される。短い生成物は、各末端にプライマーを有する標的配列（センスまたはアンチセンス）の配列を有する。それぞれの追加サイクルで、追加の２本の長い生成物が生成し、前のサイクルの終了時に残っている長および短生成物の数に等しい多数の短い生成物が生成する。従って、短い生成物の数は、各サイクルと共に指数的に増加する。特定の核酸配列のこの増幅により、極めて少量のＤＮＡを定量することができる。本明細書で用いられる「３ＳＲ」という用語は、欧州特許第３７３，９６０号明細書（１９９０年６月２０日公表）に記載の「自己維持配列複製（self - sus tained sequence replication）」系としても知られている標的核酸増幅の方法を表す。本明細書で用いられる「ＬＣＲ」という用語は、Barany，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 88:189-193(1991)に記載の「リガーゼ連鎖反応）としても知られている標的核酸増幅の方法を表す。本明細書で遺伝子配列を記載するのに用いられる「標識」または「標識した」という用語は、一般的には野生型ウイルスから誘導されるまたは野生型ウイルスの配列から合成される核酸配列であって、配列挿入、欠失、または点突然変異またはこれらの突然変異の任意の組合せを有することによって野生型ウイルス核酸の配列とは異なり、標識した核酸を、これが誘導される野生型ウイルスまたは同じ種の野生型ウイルスと区別することができるようにするものを表す。標識したウイルスは、標識した核酸配列を有するウイルスである。標識は、幾つかの場合には、野生型ウイルス中のタンパク質と比較して標識したタンパク質を創製するアミノ酸配列をコードすることができる。本発明の方法における増幅は、当該技術分野で知られている増幅法、特に上記に記載され、定義されたもののいずれを用いて行うこともできる。本発明の好ましい態様では、核酸は、本明細書に記載のＰＣＲを用いて増幅される。好適なＰＣＲプライマーは、当業者に知られている手段によって、例えば適当な配列のクローニングおよび制限によって、または直接的化学合成によって調製される。例えば、Narangら，Meth．Enzymol．68:90（1979）および米国特許第４，３５６，２７０号明細書に記載のホスホトリエステル法を用いることができ、これらの文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。また、Brown ら，Meth．Enzymol．68:109(1979)に開示されたホスホジエステル法を用いることもでき、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。他の方法としては、Beaucageら，Tetrahedron Letts．22:1859-1862(1981 )に開示されているホスホルアミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固形物支持法が挙げられる。プライマーは、所望ならば、分光光度、光化学、生化学、免疫化学または化学的方法によって検出できる手段を配合することによって標識することもできる。例えば、プライマーは、³²Ｐ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡで普通に用いられるもの）、ビオチン、または抗血清またはモノクローン性抗体を利用できるハプテンまたはタンパク質を挙げることができる。標識は、プライマーに直接結合しようとするときには、変性条件に耐えるように選択すべきである。増幅しようとする核酸鎖を混入している材料から分離したならば、追加の核酸鎖の合成の鋳型として用いる準備が整う。この合成は、任意の好適な方法を用いて行うことができる。反応は、通常は緩衝水溶液で、好ましくはｐＨ２〜９、最も好ましくは約８で行う。過剰モル量（クローニングした核酸に対して、通常は約１０００：１プライマー／鋳型、ゲノムまたはウイルス核酸に対しては、通常は約１０⁸：１プライマー：鋳型）の２個のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離した鋳型鎖を含む緩衝液に加えるのが好ましい。しかしながら、相補鎖の量に対するプライマーの量は確実に決定することはできないことが分かっている。この工程の効率を改良するには、大過剰モル量が好ましい。これらの条件は、反応を行うための概略的な指針と考えるべきである。当業者であれば、この技術の状態を考慮して、各種の緩衝液および条件を用いてこの反応を行う方法を理解するであろう。デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰも、合成混合物に適当な量で添加し、生成する溶液を約９０〜１００℃に約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。加熱後、溶液をプライマーのハイブリダイゼーションに好ましい室温まで冷却する。冷却した混合物に重合剤を添加し、反応を当該技術分野で知られている条件下で行う。この合成反応は、室温から、それより高い温度では重合剤が最早効率的に機能しない温度までの温度で起こる。例えば、E.coliＤＮＡポリメラーゼを重合剤として用いると、最高温度は一般的には約４０℃に過ぎない。最も好都合には、E．coli ポリメラーゼを用いる反応は、室温で起こる。一層大きなストリンジェンシーが所望な場合には、反応は熱に安定な酵素Ｔａｑポリメラーゼを用いて高温で行う。重合剤は、酵素などの、ヌクレオチド三リン酸からプライマー伸張生成物の合成を行う機能を有する任意の化合物または系であることができる。この目的に適する酵素としては、例えばE．coli ＤＮＡポリメラーゼＩ、E．coli ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、および他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および他の酵素、例えばＴａｑポリメラーゼのような熱に安定な酵素であって、それぞれの核酸鎖に相補的であるプライマー伸張生成物を形成する適正な方法でヌクレオチドの結合を促進するものが挙げられる。一般的には、合成はプライマーの３′末端で開始され、新規に合成された鎖の鎖伸張は、合成が終結して様々な長さの分子を生成するまで５′方向に進行する。しかしながら、５′末端で合成を開始し、上記と同じ方法を用いて、すなわち本発明の方法でこのような薬剤の使用も本発明の範囲内にあるものと考えられる他方向に進行する。新たに合成した核酸に相補的鎖および元の核酸鎖は二本鎖分子を形成し、これはこの方法の次の段階で用いられる。次の段階では、二本鎖分子の鎖を上記手順の任意のものを用いて分離し、一本鎖分子を提供する。新たな核酸が一本鎖分子上で合成される。追加の重合剤、ヌクレオチドおよびプライマーを、上記の条件下で反応を進行させるのに必要であれば添加することができる。また、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの一方の末端で開始され、鋳型の一本鎖に沿って進行して更に核酸を生成する。この段階の後、伸張生成物の半分は、２個のプライマーによって結合された特異的な核酸配列からなる。鎖分離および伸張生成物の合成の段階は、所望な量の特異的な核酸配列を生成させるのに必要なだけ繰り返すことができる。下記に更に詳細に記載されるように、生成した特異的な核酸配列の量は指数的に蓄積される。所望ならば、組合せたプライマー(nested primers)を用いて、２段階で標的配列を増幅してもよい。この変法は、反応の特異性を増加させる手段として用いることができる。プライマー結合領域は、第二の組（抑制プライマー(arresting p rimers)が第一の組のプライマー結合領域の間の核酸配列の領域に結合（して、第二の組の結合領域を存在するならば増幅）するように選択される。この増幅工程は、検出可能な量のポリヌクレオチドが蓄積されてしまえば、いずれの時点で停止してもよい。 II．ウイルスの定量法本発明の方法および標識したウイルスおよびウイルス核酸は、ウイルス核酸およびウイルス粒子の定量に有用である。従って、本発明の好ましい態様は、試料に含まれるウイルスの量の定量法であって、上記試料に遺伝学的に標識したウイルス核酸を含むウイルスを含んでなる組成物を導入し、上記の野生型および上記の標識した核酸を試料から同時分離し、上記試料からの上記の野生型および上記の標識した核酸を増幅し、上記野生型および上記標識した核酸を定量した後、核酸を増幅する段階を含んでなる方法である。試料に含まれるウイルスの量の定量法の一つの態様では、試料は、ウイルスに感染したと思われる個人から得られる。ここで用いられる「個人」という用語は、一般的にはある生物群または種の単一標本または一員を表す。この用語は、哺乳類、鳥類、爬虫類および両生類を包含するが、これらに限定されないものと解釈すべきであるが、特にヒトを表す。本明細書用いられる、「単離する」および「提供する」という用語は、一般的には試験または分析に適する方法で試験または分析を行う化合物を調製すること、または分析または試験を行う化合物を含む抽出物を調製することを表す。この用語は、粗製の細胞溶解物および核酸を含む抽出物、並びに実質的に精製された核酸を包含することを意図する。「同時分離する」という用語は、「単離する」の意味を包含し、試料から２種類以上の化合物を実質的に同時に単離することも表し、特に２種類以上の核酸の単離を表す。本発明の方法は、総体的には任意のウイルスの正確な定量に応用することができる。ＤＮＡウイルスについては、本発明の方法はウイルスＤＮＡの定量のための内部コントロールを提供し、その幾らかは分離または操作の際に分解したり或いは失われる。この内部コントロールにより、当業者が試料または個人のウイルスタイターまたはＤＮＡ量を精確に測定することができる。同様に、ＲＮＡウイルスについては、本発明の方法は、ウイルスＲＮＡの定量のための内部コントロールを提供する。例えば、ＲＮアーゼが遍在することによるＲＮＡの分解に対する不安定性および感受性は、良く知られている。本発明は、ウイルスＲＮＡまたはウイルスタイターの定量に特に有用である。ＲＮＡウイルス定量の方法は、本発明で好ましい。本発明のウイルス核酸は、当該技術分野で知られている多くの分離法のいずれを用いて分離することもできる。例えば、ＲＮＡは、当該技術分野で知られておりかつ用いられている多くの手法のいずれかによって分離することができる。例えば、Chomczynski ら，Anal．Biochem．162:156（1987）を参照。ＤＮＡは、例えばフェノール抽出およびエタノール沈澱によって分離することができる。また、当業者であれば、本発明の方法に基づいてｃＤＮＡを合成し、増幅する代替法を容易に開発することができるであろう。ＤＮＡは、フェノール抽出の後、エタノール沈澱によって分離することができる。ウイルス核酸は、分離後に増幅するのが好ましい。分離は、当該技術分野で知られている多くの核酸の精製法のいずれかを用いて行うことができる。しかしながら、核酸を精製することは本質的なことではない。本発明の核酸は、増幅することができる形態で提供することが必要なだけである。例えば、増幅は、in sit u で行うことができ、または粗製細胞または試料溶解物中で行うことができる。当業者であれば、感染が疑われる細胞でin situ ＰＣＲを行う方法が分かるであろう。内部コントロールとして用いられるウイルスの標識および調製、および本発明の方法におけるこれらの標識したウイルスの応用は、広範囲のウイルスに広く適用することができる。例えば、本発明の方法では、ウイルスを、ヘルペスウイルス（すなわち、単純ヘルペスウイルス１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、Epstein-Barrウイルス）、パポバウイルス（すなわち、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルス）、エンテロウイルス、ロタウイルス、No rwalk Group のウイルス、コロナウイルス、腸アデノウイルス、アストロウイルス、スモール・ラウンドウイルス(small round viruses)、ピコルナ−パルボウイルス様、ミニ−レオウイルス、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス（すなわち、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、およびムンプスウイルス）、麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎（ＳＳＰＥ）、風疹（ドイツ麻疹）、アルボウイルス（すなわち、ToggaviridaeおよびBunyaviridae科の一員、並びに発熱、発疹、関節痛を引き起こすアルボウイルス、脳炎を引き起こすアルボウイルス、および出血熱を引き起こすアルボウイルス）、ラブドウイルス、マールブルク(Marburg)ウイルス、エボラ(Ebola)ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アレナウイルス（すなわち、アルゼンチンのJunin ウイルス、ボリビアの Machupo ウイルス、西アフリカのラッサ(Lassa)熱）、肝炎ウイルス（すなわち、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎およびデルタ型肝炎）、レオウイルス、ライノウイルスからなる群から選択するのが好ましい。当業者であれば、本発明の方法はＲＮＡおよびＤＮＡウイルスで用いることができ、特定の態様に用いられる条件はゲノムの核酸の性質によって部分的に変化することがあることを理解されるであろう。例えば、ＤＮＡウイルスからの核酸は、本発明の方法またはＰＣＲのような当該技術分野で知られている任意の増幅法によって分離して、直接増幅することができる。更に、例えば、ＲＮＡウイルスを逆転写した後、そのゲノム核酸を増幅するのが好ましい。この方法では、逆転写したＤＮＡは、当該技術分野で知られている増幅法の任意のもの、特にＰＣＲを用いて増幅生成物の合成のための鋳型として働くことができる。しかしながら、当業者には、同じ方法をＲＮＡおよびＤＮＡウイルスに用いることができることは明らかであろう。例えば、ウイルスの定量の目的で増幅される核酸がｍＲＮＡであるときには、同じ方法をｍＲＮＡを合成する総てのウイルスに用いることができる。Ａ．レトロウイルスおよびＲＮＡウイルス定量法下記のものは、ＲＮＡ核酸および粒子の総体的定量法の本発明の好ましい態様である。本発明の一つの態様では、野生型ウイルス核酸はＲＮＡ、特にレトロウイルスＲＮＡである。もう一つの態様では、本発明のウイルスＲＮＡは、天然においてレトロウイルスが感染することができる動物由来のレトロウイルスＲＮＡである。本発明の方法および構成物に有用なレトロウイルス核酸としては、シスターナウイルスＡ；オンコウイルスＢ、例えばマウス哺乳類腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ− Ｓ(Bittnerウイルス)、ＭＭＴＶ−Ｐ（ＧＲウイルス）、ＭＭＴＶ−Ｌ）；オンコウイルスＣ、例えばラウス肉腫ウイルス、ラウス関連ウイルス、トリ肉腫ウイルス(chicken sarcoma viruses)、白血病ウイルス、網内症ウイルス、雉ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス白血病ウイルスＧ(GrossまたはAKR ウイルス）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ｆ、ＭＬＶ−Ｍ、ＭＬＶ−Ｒ(Friend，Malon ey，Rauscherウイルス））、マウス放射線白血病ウイルス、マウス内因性ウイルス、ラット白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、ハムスター白血病ウイルス（ＨＬＶ）、ブタ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、霊長類肉腫ウイルス（ウーリーモンキー、テナガザル、無尾猿）、霊長類肉腫関連ウイルス、霊長類内因性ウイルス（ヒヒ内因性ウイルス、オナガザルウイルス、ＭＡＣ−１、フクロウザルウイルス（ＯＭＣ−１））；オンコウイルスＤ、例えばクサリヘビウイルスのような爬虫類ウイルス、およびMason-Pfizerサルウイルス（ＭＰＭＶ）のような非爬虫類ウイルス、ラングールウイルスおよびリスザルウイルス；レンチウイルスＥ、例えばヒツジのビスナウイルスおよびマエディウイルス；スプマウイルスＦ、例えば霊長類、ネコ、ヒト、ウシの泡沫状ウイルスの属のようなレトロウイルス由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸は、ヒトレトロウイルス、特にヒトＴ細胞白血病ウイルスおよびヒト免疫不全症ウイルス、並びにＡ、Ｂ、Ｃおよびデルタ型肝炎ウイルスのいずれかに由来するものが好ましい。本発明の方法では、レトロウイルスＲＮＡは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２から成る群から選択されるウイルスに由来するものが最も好ましい。本発明の他のウイルス核酸としては、カウリモウイルス(Caulimoviruses)、トリ・ミオブラスト−シス・ウイルス、サル免疫不全症ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、およびウマ感染性貧血ウイルスに由来するものが挙げられる。このようなウイルス核酸は、獣医での実施およびヒト臨床実施における本発明の方法で特に有用である。本発明の方法は、ビリオン粒子を内部コントロールとして用いる段階を有するのが好ましい。患者からの試料中のＨＩＶ−１ＲＮＡを感染性の突然変異体ウイルスを内部コントロールとして用いて測定するための好ましい方法が提供される。例えば、好ましい方法では、ウイルスゲノムの保存領域（「標識領域」）に挿入、欠失または点突然変異を有する突然変異体ウイルスが構築される。このウイルスを内部コントロールとして利用するには、このウイルスの様々な希釈物を、測定を行う試料の一部に添加するのが好ましい。これらの方法では、試料が血液、血漿または血清を含むかまたはであることが一層好ましい。試料が血漿を有してなることが最も好ましい。ＲＮＡは試料から分離され、ｃＤＮＡに逆転写される。増幅は、外部から添加されたウイルスに含まれる標識領域のいずれかの側の配列を含むように選択されたプライマーを用いて行う。標識領域を有するコントロールウイルス由来のＤＮＡ生成物は、試料に含まれるウイルスからのものとは異なるヌクレオチド組成を有する。試料に含まれるウイルスＲＮＡの量は、増幅した生成物をゲル電気泳動によって分離した後に計算される。この方法の利点は、核酸精製段階中に変動しやすい回収率によって導入される誤差がなくなるので、この分析法の精度が高まることである。Ｂ．ウイルスを含むと思われる試料本発明の試料としては、潜在的にウイルスまたはウイルス核酸を含むことができる個人から得られる任意の組織、細胞または液、例えば血液、脳脊髄液、唾液、リンパ液、精液、腟液、血清、血漿、リンパ球様またはリンパ球細胞、特にＢ細胞、Ｔ細胞、単球、多形核細胞およびマクロファージ、上皮細胞、特に鼻咽頭および上部気道上皮細胞、口唇上皮細胞、腫瘍細胞、呼吸分泌、特に鼻咽頭分泌、脳組織、ウイルス小疱組織、液および関連物質、いぼ組織、液および関連物質、糞便、尿、胸膜液および心膜液、乳汁、唾液腺組織、ネグリ小体液、細胞および関連物質、および肝細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の試料は、多くの供給源から誘導することができる。方法に用いられる試料は、哺乳類、特に天然でレトロウイルスに感染されている可能性がある哺乳類から得るのが好ましい。試料は、ネズミ、ウサギ、ウマ、ブタ(suids)、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、イタチ、ショウジョウ科動物およびヒトから成る群から選択される哺乳類から得るのが一層好ましい。これらの方法では、上記定量段階の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う段階を含んでなるのが好ましい。本発明の方法の定量段階は、特に逆転写反応段階の後にポリメラーゼ連鎖反応を用いるのが好ましい。当業者であれば、反応混合物および試薬を改質して、当該技術分野で知られている方法を用いて有用な逆転写酵素活性を得ることができるであろう。当業者であれば、当該技術分野で知られている逆転写反応を混合したもののいずれかを用いることができるであろう。例えば、米国特許第５，１８３，９４９号明細書であって、反応混合物がこの特許明細書の第１図に開示されているものを参照。これらの方法の試料が血液および／または血漿を含んでなることが好ましい。従って、試料は、ウイルスに感染していることが疑われる個人から収集することができる。この試料は、遠心分離によって分離して、使用まで保存するのが、最も好ましい。標識したウイルスの連続希釈液の一部を試料に添加することができ、標識および野生型ウイルスからの混合核酸を同時分離する。核酸を、等容のアルコールおよびキャリヤーｔＲＮＡを添加して沈澱させるのが好ましい。次に、核酸を好ましくは遠心分離によって回収して、洗浄し、緩衝液に溶解させるのが好ましい。本発明の方法で用いられる試料は、パンチ・バイオプシー、スワビング、組織吸引、洗浄、スクレイピング(scraping)、および瀉血などの組織および液を得るための当該技術分野で知られておりかつ用いられている各種の手法のいずれかによって得ることができる。本発明によれば、組織をタンパク質または核酸の抽出に直接用いることができ、またはこのような抽出の前に培養物に保持することができると思われる。本発明の培養細胞は、主要細胞または不死化細胞系を含んでなることができる。例えばJat P.S.およびSharp，P.A.，J．Virol．59:746(1986 ) を参照。本発明の方法の定量段階で、細胞溶解物を調製するのが有利なことがある。本発明の細胞溶解物は、例えば化学的細胞崩壊、生物学的細胞崩壊および物理的細胞崩壊、例えば解離、粉砕、アルカリ溶解、洗剤溶解、浸透圧溶解、凍結−融解溶解、および音波処理を用いて簡単に調製することができる。これらの方法における試料が細胞を含んでなるときには、細胞分離の当該技術分野で知られている多くの方法のいずれかで、これらの細胞を単離することができる。当業者であれば、細胞を個人から得て、直接使用しまたは培養液に保持した後、本発明の方法で用いることができることが分かるであろう。培養液に保持した後本発明の方法で用いられる細胞は、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地のような標準的組織培地に保持することができる。当業者であれば、本発明の方法で用いる前に細胞を刺激するのに有用な当該技術分野で知られている方法が分かるであろう。単離された細胞の細胞数は、例えば培養カウンターによるまたは顕微鏡およびレチクル（血球計）を用いる計数のような当該技術分野で知られている方法によって決定することができる。例えば、Butler，W.B.，Analytical Biochem．141: 70-73(1984)を参照。Ｃ．核酸検出および定量法１．増幅核酸増幅の任意の方法を、本発明の方法の増幅段階で用いることができる。本発明の方法で用いられる好ましい増幅反応としては、例えばＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号明細書）、３ＳＲ（欧州特許出願第３７３，９６０号明細書）、ＬＣＲ（Barany，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 88:189-193(1991)）、ＲＣＲおよび３ＳＲ（例えば、欧州特許出願第３７３，９６０号明細書を参照されたい）、例えばＮＡＳＢＡ、ＴＭＡおよびＳＤＡのような特定の種類の３ＳＲなどが挙げられる。これらの方法の増幅段階は、更に核酸増幅連鎖反応を行う段階も含んでなることが好ましい。ここで用いられる「核酸増幅連鎖反応」という用語は、総体的には例えばＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号明細書を参照）、ＬＣＲ（Barany，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88 : 189-193（1 991））、およびＲＣＲなどの連鎖反応によるヌクレオチド配列または複数の配列のコピーの数を増加するための任意のイン・ビトロ法を表す。上記のように、得られるウイルス核酸の性質は、それを得る好ましい方法を指示することがある。すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡの増幅には、様々な手法を適用する必要がある。逆転写を、任意のウイルスからのＲＮＡウイルスゲノムＲＮＡまたはｍＲＮＡの増幅法に用いることができる。増幅反応を用いて、野体型ウイルスまたウイルス核酸の量を定量し、試料に添加した標識ウイルスまたはウイルス核酸の量を定量し、試料に添加した標識ウイルスまたはウイルス核酸の量を定量することができる。増幅生成物を、ゲル電気泳動分析のような当該技術分野で知られている手法を用いて分析し、定量することができる。好ましい態様では、ＰＣＲ増幅生成物分析は下記のようにして行われる。ある容量のＰＣＲ生成物を、ＰＣＲ生成物にハイブリダイゼーションすることができる標識したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせる。生成物を、好ましくはポリアクリルアミドゲル上で分離し、プローブした生成物を、好ましくはオートラジオグラフィによって検出する（例えば、Psallidopoulosら，J．Virol．63:4626-4631（1989）を参照されたい）。それぞれの分離された生成物に含まれる標識の量を、当該技術分野で知られている手法を用いて、好ましくは光学的または放射分析スキャンニングを用いることによって定量する（例えば、Johnstonら，Electrophoresis 11:355 -360（1990）を参照）。それぞれの生成物試料に含まれる標識の量を算定し、標識したおよび野体型ＤＮＡバンドに含まれる標識の量の比を入力突然変異体ウイルスＲＮＡに対してプロットする。この手法を用いて、試料に含まれるウイルスＲＮＡの量を、ウイルスに感染した個人から得られる試料の単位容積当たりのＲＮＡのコピー数で測定する。増幅後の標識したウイルスからのｃＤＮＡの量を算定する目的で、競合体内部コントロールプラスミドＤＮＡを反応に用いるのが好ましい。例えば、この分析法を設定し、標準化するには、標識したウイルスからのｃＤＮＡを様々な量の別のコントロールＤＮＡの存在下でＰＣＲ増幅する。この異なるコントロールＤＮＡは、予想されるＤＮＡＰＣＲ生成物を大きさによって識別することができるように選択する。本発明の方法の定量段階は、更に上記の野生型ＲＮＡおよび上記の標識したＲＮＡの両方を同時分離する段階を含んでなるのが好ましい。一般的に標識したウイルスＲＮＡはレトロウイルス、特に天然で動物に感染することができるレトロウイルス由来の配列を含んでなるのが更に好ましい。レトロウイルスはヒトレトロウイルス、特にＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−II、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２からなる群から選択されるレトロウイルスであるのが最も好ましい。定量的遠心分離のような当該技術分野で知られておりまたは当該技術分野で知られている方法を用いて決定することができるウイルス粒子の近似的質量に基づいて(Bourinbaiar，A.S.，Nature 349:111(1991); Bourinbaiar，A.S.，Weight of HIV AIDS Res．Human Retrov．8:1545(1992))、任意の試料または調製物中のウイルスおよびウイルス核酸の量を測定することができる。また、ウイルス核酸のコピー数を測定することもできる。当業者であれば、増幅によって合成されたポリマーの検出および定量は、重合生成物に取り込まれるヌクレオチドモノマーを標識することによって促進することができることが分かるであろう。当業者であれば、これらの標識材料は、それらの合成後の重合生成物、および例えばハイブリダイゼーションプローブのような重合生成物の検出および定量に有用な任意の化合物を標識するのにも有用であることがただちに分かるであろう。この方法の定量段階は、ハイブリダイゼーションプローブを上記の野生型および上記の標識したポリメラーゼ連鎖反応のＤＮＡ生成物を導入することも含んでなるのが好ましい。この方法では、オリゴヌクレオチドが標識したハイブリダイゼーションプローブであるのが好ましい。本発明の方法では、定量段階は、更にＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応生成物を分離する段階も含んでなることが好ましい。分離段階は、更にＤＮＡ生成物の電気泳動を含んでなることが好ましい。上記遺伝学的方法の増幅段階の好ましい態様は、試料からＲＮＡを単離し、ＲＮＡをｃＤＮＡ合成をプライミングすることができる少なくとも１個のプライマーと接触させ、ｃＤＮＡを伸張生成物合成をプライミングすることができる少なくとも１個のプライマーと接触させ、これらのプライマーからプライマー伸張生成物を合成し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて伸張生成物を増幅して、増幅した核酸を生成させる、段階をも含んでなる。当業者であれば、ＰＣＲプライマーのような増幅に有用なプライマーを容易に作成することができるであろう。ある種のプライマーは商業的に得ることができ、または例えば、Applied Biosystems Inc製のＤＮＡ合成装置（フォスター・シティー、カリフォルニア）のようなＤＮＡ合成装置を用いて合成することができる。当業者であれば、核酸増幅の水準を検出し、測定しまたは定量することができる手法、例えば重合した核酸に取り込まれた標識したヌクレオチドを測定し、重合した核酸中のある種の残基の数を測定し、または重合した核酸の吸光度を分光学的に測定することによる手法を容易に分かるであろう。当業者であれば、増幅および重合を検出し、測定しまたは定量することができる多数のハイブリダイゼーション手法、例えば重合した生成物をクロマトグラフィ分離した後、標識した核酸でハイブリダイゼーションすることによる手法も分かるであろう（例えば、 Haymesら（「核酸のハイブリダイゼーション：実際的方法(Nucleic Acid Hybrid ization，A Practical Approach)」中），IRL Press,ワシントンＤＣ（１９８５年）を参照）。増幅および重合の水準を測定するのに用いることができるもう一つの手法は、プライマー核酸を標識し、取り込まれた標識対取り込まれていない標識の水準の経時的変化を検出することによるものである。当業者であれば、本発明の定量段階または複数の段階は、検出または定量手段を標識することによって高めることができることを理解できるであろう。例えば、増幅によって合成されたポリマーの検出および定量は、増幅生成物に取り込まれるヌクレオチドモノマーを標識することによって増強することができる。当業者であれば、標識材料は、増幅生成物の合成の後にそれらを標識するのにも有用であることを直ちに分かるであろう。当業者であれば、どちらの化合物が、例えばハイブリダイゼーションプローブのような増幅生成物の検出および定量に有用であるかが分かっているであろう。標識は、本発明の方法に用いられる抗体の検出および定量を増強するのにも用いられる。本発明の方法に有用な標識としては、蛍光剤、リガンド、発色団、色原体、化学発光剤および生物学的発光剤のような発光剤、および放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、任意の所定の検出手段、例えばヌクレオチドモノマー、オリゴヌクレオチド、抗体、レクチン、ストレプタビジン−ビオチン、オリゴヌクレオチド挿入剤およびペプチドであって、核酸結合に用いられるものなどの手段に対する適当な標識を選択することができるであろう。当業者であれば、当該技術分野で知られている手法を用いてこのような検出手段を用いることができるであろう。例えば、Sambrook（Sambrookら，分子クローニング−実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年））を参照。ウイルス核酸または粒子の様々な濃度またはタイターを用いて、野生型粒子または核酸量を調製することができる標準曲線を生成させることができる。例えば、酵素の動態および阻害の-般的検討については、Stryer，L.，生化学（Biochem istry，第２版，W.H．Freeman and Co.，サンフランシスコ、カリフォルニア（１９８１年）；図表データーの表示の一般的検討については、Remington の製薬科学（Remington′s Pharmaceutical Sciences）、第１８版、Mack Publishing Co.，イーストン，ペンシルバニア（１９９０年）を参照。当業者であれば、個人から得られた試料の単位容積当たりのウイルス粒子の量を容易に決定することができるであろう。これにより、野仕型ウイルス力価が決定される。臨床的設定では、ウイルス力価の知識は、治療効率および個人の健康の基礎とする重要な情報である。例えば、本発明の方法は、ＨＩＶ感染症に罹っている多数の個人に、それらの治療の効率およびそれらの感染の経路を決定する重要な方法を提供する。この方法は、個人のウイルス量を精確に定量する好都合な方法を提供する。２．ハイブリダイゼーション本発明の核酸は、当該技術分野で知られているハイブリダイゼーション法を用いて定量することもできる。これらの方法を用いれば、標識した核酸分子を野生型核酸分子から容易に識別することができる。本発明の核酸は、例えばノザンおよびサザンブロッティングおよびＲＮアーゼ保護分析法のようなハイブリダイゼーション法を用いて定量することができる。核酸ハイブリダイゼーション法の例については、Meinkothら，Anal．Biochem．138:267-284(1984); Haymes ら，（「核酸のハイブリダイゼーション：実際的方法(Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach)」中），IRL Press,ワシントンＤＣ（１９８５年）; Melt onら，Nucl．Acids Res．12:7035-7056(1984); およびSambrookら，分子クローニング−実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年））を参照されたい。３．抗体法オープン・リーディング・フレーム内に含まれる配列標識はウイルスＲＮＡ中で転写され、これは翻訳されて、生成した修飾されたペプチドが抗体を用いて検出して、定量することができるようにすることができる。標識した分子のあるものは、その中に構築された新規なエピトープを有し、市販の抗体を用いて検出および定量を行うことができるようにする。例えば、ある種の抗体によって認識されることが知られている非相同エピトープのコード配列を、ウイルスタンパク質のコード配列に融合することができる。この方法では、標識したタンパク質を検出し、定量することができる。挿入した標識によって妨害されるウイルスエピトープに特異的な第二の抗体を用いると、当業者であれば野生型ウイルスタンパク質の濃度を決定することができる。抗体定量法のもう一つの例は、標識したタンパク質と野生型タンパク質との間の分子量の差による。ウェスタンブロッティングおよび免疫沈澱は、これらの２種類のタンパク質を定量し、それらの濃度を特定するのに好都合である。これらの翻訳／抗体検出法により、当業者は、イン・ビトロで合成した野生型および標識したタンパク質の濃度を決定することができる。イン・ビトロ翻訳は、網状赤血球溶解物翻訳のような当該技術分野で知られている方法にいずれかを用いて行うことができる。ここで用いられる「抗体」という用語は、実質的に相同の個体群である両モノクローン性抗体、および異種個体群であるポリクローン性抗体を表す。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、および任意のそのサブクラスを含む任意の免疫グロブリンのクラスからのものであることができる。ここで用いられる「抗体」という用語は、天然の完全な分子およびその断片、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ′）₂であって、抗原またはハプテンを結合することができるもの、並びに免疫グロブリン断片および他の分子の断片を含んでなる抗原またはハプテンを結合することができる融合構築物を包含することも意味する。「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたは原核細胞で発現したそれからの融合体並びに各種の他の種のヒト化抗体を包含するものとも解釈される。野生型および標識したタンパク質に対するモノクローン性抗体およびポリクローン性抗体は、当該技術分野で周知の方法によって作成される。例えば、Ausube lら，分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、Current Protocols により公表，pp．11.4.2-11.13.4（1993）を参照。ハイブリドーマはモノクローン性抗体の産生について本発明の細胞を用いて作成することができる。例えば、Kohlerら，Eur．J．Immuno．6:292(1976)を参照。抗体は、野生型および標識したタンパク質に対して生成させることができる。更に、野生型タンパク質に対する抗体は、それらが自然に存在する細胞および組織から単離することができる。本発明によれば、実質的に精製された野生型および標識したタンパク質は、イムノアッセイで有用であろうと思われる。当業者であれば、本発明の実質的に精製したタンパク質を、例えばラジオイムノアッセイ、サンドイッチ法、免疫拡散分析法などの当該技術分野で知られている方法を用いてイムノアッセイを開発するための出発点として容易に用いることができる。例えば、Kohlerら，Nature 2 56:495(1975); Kohler ら，Eur．J．Immunol．6:511（1976）; Kohlerら，Eur． J．Immunol．6:292(1976); Hammerling ら，「モノクローン抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，pp．563-681， Elsevier，N(1981); Sambrookら，分子クローニング−実験室便覧（Molecular C loning - A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年）、特に実質的に精製したタンパク質に対して生じた実質的に精製したタンパク質または抗体と共に用いられる方法を略述している第１８章を参照。当該技術分野で普通に知られている一つの方法は、実質的に精製したタンパク質に対してポリクローン抗体またはモノクローン抗体を作成することである。例えば、Harlowe，E．およびLane，D.，抗体、実験室便覧（Antibodies，a Laboratory Manual），Cold Spring Harbor La boratories,1988 を参照。４．制限分析本発明の一態様では、標識した核酸を、制限分析によって野生型核酸と識別することができる。制限分析に対する一般的方法としては、野生型ウイルスが、標識したウイルスが含まない１個以上の制限部位を含む方法が挙げられる。或いは、標識したウイルスは、野体型ウイルスが含まない１個以上の制限部位を含むことができる。新規な部位は、当業者に周知の方法を用いて標識配列に取り込むことができる（例えば、Sambrook（Sambrookら，分子クローニング−実験室便覧(M olecular Cloning - A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs ，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年）、およびRodr iguez ら，組換えＤＮＡ技術：概論(Recombinant DNA Techniques: An Introduc tion，The Benjamin/Cummings Publishing Co.，オンタリオ（１９８３年）を参照）。増幅の後、１個以上の新規部位を、当該技術分野で知られている技術を用いて制限エンドヌクレアーゼで消化することができる（例えば、Sambrook（ Sambrook ら，分子クローニング−実験室便覧（Molecular Cloning - A Laborat ory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年）、およびRodriguez ら，組換えＤＮＡ技術：概論(Recombinant DNA Techniques: An Introduction，The Benjamin/Cummings Publishing Co.,オンタリオ（１９８３年）を参照）。消化の後、核酸断片を、例えばゲル電気泳動によって分離することができ、それぞれのバンドにおける増幅した核酸の量を定量することができる。核酸からの生成物の数および／または大きさは異なるので、標識したおよび野生型ウイルス核酸を識別することは簡単なである。新規な制限部位を、部位、点突然変異を含み、２つの領域を結合し部位を作成するため部位または欠失を構築するリンカーの挿入を用いて、標識したウイルスに構築することができる。更に、当業者であれば、欠失する制限部位を選択することができる。これにより、当業者が標識した核酸を野生型核酸から識別することができる異なる制限パターンおよび制限マップを有する標識したウイルスも創製される。ここで用いられる「新規部位」という用語は、処理された部位の位置での野生型ウイルスゲノムでは起こらない部位を表す。しかしながら、この制限部位は、どこか他の野生型ウイルスゲノム中に存在してもよい。好ましい態様では、まれにしか生じない制限部位が、配列標識に構築される。このまれにしか生じない制限部位は、標識した核酸で１回だけ存在し、野生型ウイルスには存在しないのが、更に好ましい。これらの構築物は、標識したウイルスの２個のバンド制限パターンおよび単一の大きな野生型ウイルスに対するバンドを生じる。 III ．遺伝学的に標識したウイルス核酸およびウイルス粒子ここで用いられる「実質的に純粋な」または「実質的に精製した」という用語は、天然の状態での化合物と関連した任意の化合物を実質的に含まない化合物を記載することを意味する。例えば、他のタンパク質、核酸、脂質および炭水化物を実質的に含まないタンパク質は、実質的に純粋であるかまたは精製されていると考えられる。この用語は更に、当業者によって用いられる純度または均質性の１以上の基準によって均質である化合物を記載することを意味する。ここで用いられる「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」とは、人工的、合成または半合成混合物またはハイブリッドを除外することを意味しない。本発明は、遺伝学的に標識されたレトロウイルス核酸であって、このレトロウイルス核酸の高度に保存された領域に標識配列を含んでなる、例えば上記標識がレトロウイルスプライマー結合とｇａｇ開始部位との間に存在する核酸も提供する。例えば、標識が、レトロウイルスのプライマー結合とｇａｇ開始部位との間の良好に保存された領域に構築されるのが更に好ましい（Myersら，ヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳ：核酸およびアミノ酸配列の編集および分析(Human Ret roviruses and AIDS : A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amin o Acid Sequences)，Los Alamos National Laboratory，ロス・アラモス，ニュー・メキシコ（１９９２年））。標識が挿入配列、特に下記の配列から本質的になるものを含んでなるのが最も好ましい。ＡＧＡＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧ標識したウイルス核酸は、Sambrookら,(Sambrookら，分子クローニング−実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)(第２版)，Cold Spring Har bor Labs,コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年）に記載の標準的手続きを用いて構築することができる。例えば、標識した領域をＤＮＡまたはＲＮＡウイルスのＤＮＡコピーから挿入または欠失することができ、これらのＤＮＡ構築物を実質的に精製することができる。これらのＤＮＡ構築物を宿主細胞系にトランスフェクションして、ウイルス粒子が生成されるようにすることもできる。標識が融合核酸からなり、この融合した連結は野生型配列の欠失突然変異によって定義されることも好ましい。標識が挿入である場合には、標識配列が野生型および突然変異体ウイルスＤＮＡを分離して、増幅の後に同定することができる十分な長さのものであることが好ましい。挿入標識は、約５〜５０ヌクレオチドの長さであるのが最も好ましい。この配列標識は、ウイルスの成長を妨げない限り、長さが任意の数のヌクレオチドであることができる。ウイルスの成長は、当該技術分野で知られておりかつ本発明で教示された手法を用いて容易に監視することができる。レトロウイルスＲＮＡは、天然で動物に感染することができるレトロウイルスから誘導されるのが好ましい。このレトロウイルスＲＮＡは、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−II、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２からなる群から選択されたヒトレトロウイルスＲＮＡから誘導されるのが更に好ましい。ウイルス粒子は、標識したウイルスの構築の後に調製することができる。ウイルスＤＮＡ構築物を細胞にトランスフェクションすることができ、これらの細胞を培養してウイルス粒子を得ることができる。これらのウイルス粒子を単離しまたは使用して別の細胞型に感染させ、ウイルスが更に成長できるようにすることができる。当業者であれば、これらのウイルス構築物のトランスフェクションの既知の方法、例えばリン酸カルシウム沈澱法（Sambrookら，分子クローニング− 実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年））を理解するであろう。トランスフェクションした細胞は哺乳類細胞培養について当該技術分野で周知の方法、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地上または１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中での保持、を用いて保持することができる（Ha radaら，Science 229:563-566(1985)）。ＨＩＶＤＮＡ構築物のトランスフェクションについては、２９３個の細胞または他の好適な細胞型を用いた後ＭＴ−２細胞を再感染するのが好ましい。トランスフェクションの後、培養液を分離して、ウイルスが感染することができる細胞を感染させるのに用いるのが好ましい。感染した細胞を得た後、無細胞ウイルスを収穫し、分割して、本発明の方法で使用するに保存するのが好ましい。また、それぞれの画分を、任意の一つの分析に１回だけ用いるのが好ましい。培養物上清中のウイルスの量は、ウイルスタイターを定量する目的で当該技術分野で知られている多くの手法のいずれかによって算定することができる。例えば、ＨＩＶ−１タイターは、製造業者の勧めるプロトコールに従ってCoulter Corp（ハイアレー、フロリダ）試薬を用いるｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ分析法によって測定することができる。また、本発明は、本発明の遺伝学的に標識したウイルス核酸を含んでなるビリオン粒子も提供する。 IV．ウイルス定量用キット本発明のキットは、手に持つことができかつ耐久性のある材料から構築されており、透明な化合物および反応室を含んでなり、反応の結果をキット装置を眺めることによって容易に決定することができるものが好ましい。このキット装置は、試料および試薬、および逆転写によりＤＮＡを重合することができる逆転写酵素を用いて反応を行うのに有用な反応容器を含んでなるのが更に好ましい。反応容器を包んで、反応が実質的に開始したならば、反応中の化合物はキット装置から逃げ出すことはできないようにするのが更に好ましい。キットは、様々な成分を保持するための好都合なプラスチック容器を含んでなるのが好ましい。このキットは、自給式の手で保持される分析装置であって、試料を導入し、試験し、結果を得ることができ、かつ汚染されたキット装置を次いで安全に排気することができるものからなるのが、更に好ましい。当業者であれば、キット中の試薬の適正な保存および安定化緩衝剤が分かるであろう。当業者であれば、本発明のキットを、本発明の方法を開始点として用いて考案した方法に容易に適合させることができるであろう。本発明を概略的に説明したが、本発明は、ある種の特定の実施例を参照することによって更に理解されるであろう。これらの実施例は例示の目的で挙げているものであり、特に断らない限り、本発明を制限しようとするものではない。実施例概要本発明者らは、感染性の突然変異体ウイルスを内部コントロールとして用いて、患者血漿または血清中のＨＩＶ−ＩＲＮＡを測定する分析法を開発した。突然変異体ウイルスＶＸ−４６は、プラスチック結合および主要なスプライス・ドナー部位の間の保存領域中に２５ｂｐのインサートを有する。このウイルスを内部コントロールとして利用するため、様々な希釈度のこのウイルスを、測定を行う血漿試料の一部に添加し、ＲＮＡを分離してｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲは、外部から添加したウイルスに含まれるインサートのいずれかの側に配列を含むように選択したプラスチックを用いて行った。コントロールウイルスからのＤＮＡ生成物は、血漿に含まれるウイルスより２５ｂｐ長い。血漿試料に含まれるウイルスＲＮＡの量を、ＰＣＲ増幅した生成物をゲル電気泳動によって分離した後、計算する。他の定量的ＰＣＲ分析法とは異なり、この内部コントロールによるビリオンＰＣＲ（ＩＣＶＰＣＲ）分析法では、ＲＮＡ精製段階の際に変動する回収率によって導入される誤差がなくなるので、この分析法の精度が高くなる。材料および方法細胞２９３この細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地に保持した。ＭＴ−２細胞は、ＮＩＡＩＤＡＩＤＳ研究プログラムを介してD．Richman博士から入手し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に保持した（Haradaら，Science 229:563-566(1985)）。突然変異体ＨＩＶ−１ウイルスの作製ＨＩＶ−１のプラスチック結合およびｇａｇ開始部位の間の良好に保存された領域を、挿入に選択した(Myersら，ヒトレトロウイルスおよびＡＩＤＳ：核酸およびアミノ酸配列の編集および分析(H uman Retroviruses and AIDS: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid a nd Amino Acid Sequences)，Los Alamos National Laboratory，ロス・アラモス，ニュー・メキシコ（１９９２年））。M．Martin 博士から入手したＨＩＶ−１の感染性分子クローンであるプラスミドｐＮＬ４．３を、出発物質として用いた（Adachiら，J．Virol．59:284-291(1986)）。ｐＮＬ４．３のヌクレオチド位置７１５にインサート５′ＡＧＡＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧ３′を有する突然変異体（ＶＸ−４６）を、Sambrookらによって報告された標準的手続きを用いて生成させた（Sambrookら，分子クローニング−実験室便覧(Mol ecular Cloning - A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年））。用いたＨＩＶ−１ヌクレオチドの番号は、ＨＩＶＮＬ４．３；Genbank 取得番号Ｍ１９９２１に準じる。ＶＸ−４６ＤＮＡを、リン酸カルシウム沈澱法によって２９３個の細胞にトランスフェクションした（Sambrookら，分子クローニング− 実験室便覧(Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Labs，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８９年））。トランスフェクションから４８時間後、培養液を採取して、ＭＴ−２細胞を感染するのに用いた。突然変異体ウイルスは、野生型ウイルスと同じ速度で成長した。無細胞ウイルスを収集し、分割して、−７０℃で保存した。それぞれの画分は、ＩＣＶＰＣＲ実験で１回用いた。培養液上清のウイルスの量を、製造業者の勧めるプロトコールに従ってCoulter Corp（ハイアレー、フロリダ）試薬を用いるｐ２４抗原EＬＩＳＡ分析法によって測定した。ＰＣＲプライマー第１表に記載のＩＣＶＰＣＲプライマーは、Applied Bios ystems Inc製ＤＮＡ合成装置（フォスターシティー、カリフォルニア）を用いて合成した。ＲＮＡ分離およびｃＤＮＡ合成インフォームド・コンセントを得た後、ＨＩＶ−１セロポジティブ患者から、凝固防止剤としてのクエン酸デキストロースの存在下にて全血試料を収集した。血漿を遠心分離によって分離して、使用まで− ７０℃で保存した。突然変異体ウイルスＶＸ−４６の連続希釈物の一部（１００ μｌ）を患者血漿１００μｌに加え、ＲＮＡを、以前に報告された１８０ｍＭ酢酸ナトリウムの存在下にて４．０Ｍグアニジニウムチオシアネートおよびフェノールを用いて、抽出した（Chomczynski およびSacchi，Anal．Biochem．162:156 -159（1987））。ＲＮＡを、等容のイソプロパノールおよび１０μｇのキャリヤーｔＲＮＡ(Sigma Chemical Co)を添加することによって沈澱した。ＲＮＡを遠心分離によって回収し、７０％冷エタノールで洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、５ｍＭＭｇＣｌ₂、およびＲＮＡアーゼ不含ＤＮＡアーゼ(Boehringer Mannheim Biochemicals)１０単位を含むＤＮＡアーゼ緩衝液８．０μｌに溶解し、２５℃で３０分間インキュベーションした。ＤＮＡアーゼを８０℃で１０分間不活性化し、ＲＮＡをInvitrogen Corporation（サンディェゴ、カリフォルニア）から入手したｃＤＮＡサイクルキットを用いてｃＤＮＡ合成に用いた。１００ｍＭメチル水銀ヒドロオキシド２μｌをＲＮＡ８μｌに加え、室温で５分間インキュベーションした後、０．７Ｍβ−メルカプトエタノール２．５ＶＩを加え、反応物を氷上に保持した。これに、５ＸＲＴ緩衝液（０．５ＭＴｒｉｓ，ｐＨ８．３、０．２ＭＫＣｌおよび５０ｍＭＭｇＣｌ₂）４．０μｌ、ＲＮＡアーゼ阻害剤１．０μｌ、ｄＮＴＰｓの２５ｍＭを１．０μ ｌ、プライマーＩＣＶＰＣＲ−９（４０ピコモル）１．０μｌ、およびＡＭＶ逆転写酵素０．５μｌを加え、これを４２℃で１時間インキュベーションした。次に、反応物を９５℃で３分間加熱して、氷上で２分間冷却し、逆転写酵素を更に５単位加え、インキュベーションを４２℃で更に１時間継続した。最後に、反応物を９５℃まで３分間加熱し、ｃＤＮＡをＰＣＲに用いるかまたは−２０℃で保存した。ＰＣＲｃＤＮＡ５μｌを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、プライマーＩＣＶＰＣＲ−１６および１７（第１表）２５ピコモル、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus)２．５単位を含む反応物中で、最終容積が５０μｌで用いた。試料をPerkin-Elmer Cetusサーモサイクラー（９６００）で、下記のＰＣＲサイクルプログラムを用いて増幅した。９４℃で６０秒間、５５℃で１０秒間、および７２℃で３０秒間；３０サイクル；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間、および７２℃ で１０分間最終インキュベーション。次に、試料を、分析まで４℃で保存した。ＶＸ−４６ウイルスからのｃＤＮＡの量を算定するのに用いた競合体プラスミド（ｐＡ１）ＤＮＡは、ｐＮＬ４．３ヌクレオチド配列５０１〜１４４８を含んでいた。ＰＣＲ生成物の分析ＰＣＲ生成物１５μｌを５′−³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドＩＣＶＰＣＲ−１８（第１表）でハイブリダイゼーションし、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、以前報告した通りにオートラジオグラフィを行った (Psallidopoulos ら，J．Virol．63:4626-4631(1989))。それぞれのバンドに含まれる放射能の量を、Molecular Dynamics Phosporlmager（サニーベイル、カリフォルニア）、またはFuji Medical Systems BAS1000（スタンフォード、コネチカット）を用いて、Johnstonらによって報告された通り保存リンスクリーンにゲルを露出させることによって定量した(Johnston ら，Electrophoresis 11:355-3 60(1990))。結果および検討ＶＸ−４６ウイルス調製物に含まれるＲＮＡの算定ｐ２４抗原１００ｐｇ、２５ｐｇまたは５００ｆｇを含むＶＸ−４６ウイルスの一部からＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを標準的条件を用いて合成した。この分析法を確立して標準化するため、ＶＸ−４６からのｃＤＮＡを、ｐＮＬ４．３ヌクレオチド配列５０１〜１４４８を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＡ１）の様々な量の存在下にてＰＣＲ増幅した。第１図に示されるように、選択されたプライマーは、それぞれ野生型および突然変異体ウイルス配列から予報された１２３ｂｐおよび１４８ｂｐＤＮＡＰＣＲ生成物を生じた。幾つかの実験では、更に微量のバンドが見られた。これらは、２種類の予想されたバンドの間に形成されたヘテロ二本鎖であると思われる。また、ｃＤＮＡ合成段階からの未使用の過剰なプライマーもＰＣＲ反応に関与し、更に長い生成物（第３図および第４図に見られる）を生成する。これらのバンドは正確な定量を妨げないが、この方法による定量は、標的および競合鋳型からのバンドの相対的濃度に基づいており、絶対量には基づかないからである（Piatakら，BioTechniques 14:70-80(1993)）。特定のバンドの放射能の量を、材料および方法に記載した方法で測定した。野生型および突然変異体ＤＮＡバンドに含まれる放射能の量の間の比率を、上記の方法でプロットした（Bagnarelliら，J．Med．Virol．34:89-95(1991)）。これらのデーターに基づいて（第２図）、それぞれｐ２４抗原１００ｐｇ、２５ｐｇおよび５００ｆｇを含むウイルスから、２８５０００、６９３００および１６００コピーのＲＮＡが単離されると計算された。ＨＩＶ−１粒子の質量に基づいて、ｐ２４１００ｐｇを有するウイルス調製物は１００００００個のＨＩＶ粒子を含むと計算されるか（Bourinbaiar，A.S. ，Nature 349:111(1991); Bourinbaiar，A.S.,Weights of HIV AIDS Res．Huma n Retrov．8:1545(1992)）、または２００００００コピーのＲＮＡを含むと計算される。従って、本実験で決定されたコピー数は、理論値の約１５％である。これは、抽出中のＲＮＡの損失を反映しており、ｃＤＮＡの調製における理論収率より低い。しかしながら、競合的ＰＣＲによる定量は、絶対量ではなく、野生型および突然変異体鋳型の相対量に依存する。従って、突然変異体ウイルス調製物中のＲＮＡの量を決定したならば、それぞれＩＣＶＰＣＲ実験におけるＲＮＡの回収率は、結果に影響しない。血漿中のＨＩＶ−ＩＲＮＡの濃度を測定するためのＩＣＶＰＣＲＲＮＡ分離の際に、この標準化したＶＸ−４６ウイルスを競合体として用い、患者血漿のＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの量を算定した。２種類の異なる血漿試料で得た結果を、第３図に示す。それぞれのバンドに含まれる放射能の量を算定し、突然変異体および野体型（患者）ＤＮＡバンドに含まれる放射能の量を、投入突然変異体ウイルスＲＮＡに対してプロットした。この手法を用いて、試料に含まれるウイルスＲＮＡの量を、患者１の血漿１ｍｌ当たりＲＮＡが８８，０００コピーであり、患者２の血漿１ｍｌ当たりＲＮＡが１６，０００コピーであると決定した（第３Ｃ図）。次に、血漿試料中のウイルスＲＮＡの量を、異なる２日で完全分析を行うことによって算定した。この２個の算定量によるＲＮＡの量は、血漿１ｍｌ当たり６００００〜６８０００コピー（第４図）であり、ＩＣＶＰＣＲ法は再現性があることを示している。結論競合的ＲＮＡＰＣＲを、患者試料に含まれるＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの量の算定に良好に用いることができた（Piatakら，Science 259:1749-1754(1993); Clementiら，PCR Methods Appl．2:191-196(1993)）。この方法では、増幅生成物の比率は、ＰＣＲに影響する因子によっても影響される。しかしながら、これは、ＲＮＡ精製段階に対するコントロールを欠いている。平均して３６％ＫＲＮＡ試料が、用いた抽出手続きによって損失することがあると算定された（Clemen tiら，PCR Methods Appl．2:191-196(1993)）。遺伝子発現を細胞から抽出したＲＮＡを用いて検討するときのＲＮＡの損失の変動を説明するため、検討を行う遺伝子によって発現されたＲＮＡを、構成的に発現される別のＲＮＡ種と比較することが多い（Green ら，Cell 35:137-148(1983); Orkin ら，J．Biol．Chem． 259:8679-8681(1984)）。しかしながら、このようなコントロールＲＮＡは、血漿では利用できない。この報告で記載した改良法を採用することによって、突然変異体ビリオンＲＮＡは、ＲＮＡ抽出手続きのコントロール並びにＰＣＲにおける競合的ＲＮＡ鋳型としての役割を演じることができる。本明細書に引用した総ての公表物の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。上記から、本発明の具体的態様は、例示の目的で記載されたものであり、本発明の精神および範囲、および請求の範囲から逸脱することなく各種の変更を行うことができることを理解されるであろう。例としては、好ましい態様の段階は、本発明を例示することができる工程を行う一つの形態を構成するだけである。

Claims

【特許請求の範囲】１．試料に含まれるウイルスの量の定量法であって、 (a) 上記試料に、遺伝学的に標識したウイルス核酸を含むウイルスを有してなる組成物を導入し、 (b) 上記野生型および上記標識した核酸を、上記試料から同時分離し、 (c) 上記試料からの上記野生型および上記標識した核酸を増幅し、 (d) 核酸増幅の後に上記野生型および上記標識した核酸を定量する段階を含んでなる、方法。２．上記野生型ウイルス核酸がＲＮＡである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．上記野生型ウイルスＲＮＡがレトロウイルスＲＮＡである、請求の範囲第１項に記載の方法。４．上記レトロウイルスＲＮＡが、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ− １およびＨＩＶ−２からなる群から選択されるウイルスから誘導される、請求の範囲第３項に記載の方法。５．上記試料が哺乳類から得られる、請求の範囲第１項に記載の方法。６．上記定量段階の上記増幅が、核酸増幅連鎖反応を行う段階を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。７．上記定量段階の上記ポリメラーゼ連鎖反応が、逆転写の段階を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。８．上記試料が、血液、脳脊髄液、唾液、リンパ液、精液、腟液、血清、血漿、リンパ球様またはリンパ球細胞、特にＢ細胞、Ｔ細胞、単球、多形核細胞およびマクロファージ、上皮細胞、特に鼻咽頭および上部気道上皮細胞、口唇上皮細胞、腫瘍細胞、呼吸分泌、特に鼻咽頭分泌、脳組織、ウイルス小疱組織、液および関連物質、いぼ組織、液および関連物質、糞便、尿、胸膜液および心膜液、乳汁、唾液腺組織、ネグリ小体液、細胞および関連物質、および肝細胞からなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。９．上記試料が血液を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。１０．上記試料が血漿を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。１１．上記の遺伝学的に標識したウイルスＲＮＡが、レトロウイルスから誘導される配列を有する、請求の範囲第１項に記載の方法。１２．上記定量段階(d)が、更にハイブリダイゼーションプローブを上記野生型およびポリメラーゼ連鎖反応の上記の標識したＤＮＡ生成物に導入することを含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。１３．上記プローブが標識されている、請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．上記定量段階(d)が、更にＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応生成物を分離する段階を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。１５．上記分離段階が更に、上記ＤＮＡ生成物の電気泳動を含んでなる、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．上記遺伝学的に標識したウイルス核酸が、融合配列である標識を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。１７．上記の遺伝学的に標識したウイルス核酸が、融合配列である標識を含んでなり、前記融合結合が野生型配列の欠失突然変異によって定義される、請求の範囲第１項に記載の方法。１８．上記の遺伝学的に標識したウイルス核酸が、点突然変異である標識を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の方法。１９．上記のレトロウイルス核酸の高度に保存された領域に標識配列を含んでなる遺伝学的に標識されたレトロウイルス核酸であって、上記の標識がレトロウイルスプライマー結合およびｇａｇ開始部位の間にあることを特徴とする、遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸。２０．上記標識が挿入配列を含んでなる、請求の範囲第１９項に記載の遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸。２１．上記標識が、融合核酸を含んでなり、この融合結合が野生型配列の欠失突然変異によって定義されている、請求の範囲第１９項に記載の遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸。２２．上記標識が点突然変異を含んでなる、請求の範囲第１９項に記載の遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸。２３．上記標識が、長さが５〜５０ヌクレオチドである配列インサートである、請求の範囲第２０項に記載の遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸。２４．上記標識が本質的に下記の配列から成る、請求の範囲第２０項に記載の遺伝学的に標識したレトロウイルス核酸。ＡＧＡＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧ２５．天然で動物に感染することができるレトロウイルスから誘導される請求の範囲第１９項に記載のレトロウイルスＲＮＡ。２６．ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−II、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２からなる群から選択されるヒトレトロウイルスＲＮＡから誘導されるレトロウイルスＲＮＡ。２７．請求の範囲第１９項に記載の遺伝学的に標識したウイルス核酸を含んでなるビリオン粒子。