JP5924595B2

JP5924595B2 - ウシ白血病ウイルス（ｂｌｖ）検出用キットおよびその利用

Info

Publication number: JP5924595B2
Application number: JP2013518618A
Authority: JP
Inventors: 間　陽子; 陽子間; 伸之輔竹嶋; 繭子神馬; 遠藤　大二; 大二遠藤
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: US9458516B2; MX346019B; MX2013004354A; EP2630239B1; CL2013001077A1; JP2013543720A; US20140147834A1; AR083497A1; WO2012053666A1; CA2820421C; BR112013009503A2; AU2011318911A1; CA2820421A1; EP2630239A1; EP2630239A4; PE20131401A1; AU2011318911B2

Description

本発明は、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用キットおよびその利用に関する。

ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型および２型（ＨＴＬＶ−１および２）と密接に関連しており、最も多くみられるウシの腫瘍性疾患である地方性ウシ白血病（ＥＢＬ）の病因である（非特許文献９）。ＢＬＶによる感染は、無白血病状態のウシに臨床的無症状を維持させ得る。また、ＢＬＶによる感染は、Ｂリンパ球数の増大によって特徴づけられる持続性リンパ球増多症（ＰＬ）、またはよりまれに長い潜伏期の後に、種々のリンパ節におけるＢ細胞リンパ腫として現われ得る（非特許文献９）。

構造タンパク質および酵素タンパク質であるＧａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質に加えて、ＢＬＶは、ｅｎｖ遺伝子および３’末端反復配列（ＬＴＲ）の間に位置しているｐＸ領域に、少なくとも２つの制御タンパク質（すなわちＴａｘおよびＲｅｘ）をコードしている（非特許文献９）。さらに、ＢＬＶは、ｅｎｖ遺伝子およびｐＸ領域におけるｔａｘ／ｒｅｘ遺伝子の間にある領域にいくつかの小さな他のオープンリーディングフレームを含んでいる。これらは、Ｒ３およびＧ４と命名されている産物をコードしている（非特許文献１０）。ＢＬＶは、Ｕ３領域、非常に長いＲ領域およびＵ５領域を保有しているまったく同じ２つのＬＴＲを有している。これらのＬＴＲは、ＢＬＶによる増殖感染している細胞において、効率的な転写プロモータ活性を発揮するのみである（非特許文献９）。ＢＬＶは、宿主ゲノムの離れた部位に組み込まれ得（非特許文献１１）、インビボにおいて転写を起こさないと思われる（非特許文献１２）。実際に、感染個体からの新しい腫瘍細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＢＬＶゲノムの転写は、従来技術によってほとんど検出不可能である（非特許文献１２、１３）。インシチュハイブリダイゼーションは、臨床的に正常なＢＬＶ感染した動物から新しく単離されたＰＢＭＣの集団において、多くの細胞における低レベルおよびわずかな細胞における高レベルのウイルスＲＮＡの発現を明らかにしている（非特許文献１４）。検出可能なＢＬＶ抗体がない場合であっても、ＢＬＶプロウイルスは細胞のゲノムに組み込まれて残っていると思われる。したがって、従来の血清学的な手法（例えば、免疫拡散試験（非特許文献１５〜１８）および酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）（非特許文献１７〜２０））を用いたＢＬＶ感染の定法の診断に加えて、宿主ゲノム内に組み込まれたＢＬＶプロウイルスゲノムを検出することを目標にする診断的なＢＬＶのＰＣＲ手法も一般に使用されている（非特許文献１７〜１９、２１〜２３）。

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ＢＬＶは、世界中のウシに感染しており、乳牛産業に対する経済的な影響を強いている（非特許文献１６〜２０、２４〜２６）。ＢＬＶのｅｎｖ遺伝子の遺伝学的多様性に関する最近の研究によれば、世界中の様々な場所のＢＬＶ分離株において遺伝的変異が示されている（非特許文献２４、２７）。さらに、上述のように、ＢＬＶは、感染後ただちに潜伏段階に入り、ＢＬＶ抗原およびｍＲＮＡはウシにおいてほとんど発現されない。したがって、ＢＬＶ抗原の量、ＢＬＶのｍＲＮＡの発現レベルなどによって、ＢＬＶの正確な検出および定量を行うことは困難である。

したがって、ＢＬＶに誘導された白血病の発生の機序を理解し、ＢＬＶ感染した動物の選別を実施するために、ＢＬＶ感染したウシにおける疾患の過程の全体を通じたプロウイルス量の変化の詳細な評価が求められている。

しかし、ＢＬＶの多様性に対応するプライマーは、ＢＬＶの高い変異率に大きく起因して、開発されていない。また、ＢＬＶプロウイルス用のリアルタイム定量的ＰＣＲは、臨床サンプル間のＤＮＡ配列のばらつきによって引き起こされる増幅効率の差異に大きく起因して、開発されていない。

本発明は上述の問題を解決するためになされ、本発明の目的は、ＢＬＶの多様性に十分に対応する新たなＢＬＶ検出用キットおよびその利用を提供することである。

さらに、本発明の他の目的は、ほぼすべてのＢＬＶバリアントのプロウイルス量を測定するための新たな定量的リアルタイムＰＣＲ法を開発するために、上記キットを使用することである。

上記課題を解決するために、本発明は、ウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキットであって、５０塩基以下からなり、配列番号１で示す塩基配列における連続する２０以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第一のＰＣＲプライマーと、５０塩基以下からなり、配列番号２で示す塩基配列における連続する２０以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第二のＰＣＲプライマーとを含むものを提供する。また、第一のプライマーと第二のプライマーとは、縮重プライマーであることが好ましい。

ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ法に使用されたプライマーおよびプローブの位置、長さおよび方向に関する図である。表示されている矢印は、各プライマーの方向および長さを示している。黒塗りの箱はプローブのアニーリング位置を示している。（Ａ）ＢＬＶ細胞株ＦＬＫ−ＢＬＶのサブクローンｐＢＬＶ９１３におけるＢＬＶのプロウイルス構造、完全ゲノム（DDBJ: EF600696）。プロウイルス構造は、１〜５３１位および８１９０〜８７２０位のヌクレオチド位置に２つのＬＴＲ領域を含んでいる。ロアーケースの表示はこれらのＬＴＲ領域を示している。上段の数字は５’ＬＴＲの位置を示しており、下段の数字は３’ＬＴＲの位置を示している。両方のＬＴＲは、Ｕ３領域、Ｒ領域およびＵ５領域を含んでいる。Ｔａｘ応答配列（ＴＲＥ）として知られている３つ組の２１ｂｐのモチーフは５’ＬＴＲのＵ３領域に存在する。増幅にとっての標的はＵ３領域およびＲ領域にあり、ＰＣＲ産物検出用のTaqMan（商標）プローブはＲ領域に基づいていた。（Ｂ）ウシの主要な組織適合性複合体（ＢｏＬＡ）−ＤＲＡ遺伝子（上段）およびそのｃＤＮＡクローンＭＲ１（DDBJ: D37956）（下段）。エキソンは白抜きの箱として示されている。数字はＭＲ１のヌクレオチド配列の番号を示している。５’ＵＴ、５’−非翻訳領域；ＳＰ、シグナル配列；α１、第１ドメイン；α２、第２ドメイン；ＣＰ、連結ペプチド；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＣＹ、細胞質ドメイン；３’ＵＴ、３−非翻訳領域。増幅、およびＰＣＲ産物検出用のTaqMan（商標）プローブの結合にとっての標的領域はエキソン４にある。ＢＬＶ−ＬＴＲ領域増幅用のプライマーセットの選択に関する図である。（Ａ）ＣｏＣｏＭｏプログラムによって設計された、Ｔａｂｌｅ．１に示されているような４２のプライマーを用いた７２のプライマーセットを使用して、タッチダウンＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルに対する電気泳動によって検出した。レーン１〜７２、１〜７２のプライマーセットのＩＤ；＋、ＰＣＲ産物についてポジティブの結果；−、ＰＣＲ産物についてネガティブの結果。＊は、検出されたが、アンプリコンのサイズが予想されたサイズと異なっていたＰＣＲ産物を示している。（Ｂ）（Ａ）に示されている結果のまとめ。プライマーセットのＩＤは、プライマーセットの縮重およびＰＣＲ産物のサイズにしたがって並べられている。（Ｃ）１６のプライマーセットを用いた代表的な４つの融解曲線：（ａ）ＢＬＶ感染したＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞、（ｂ）ＢＬＶなしの正常なウシの細胞、および（ｃ）ネガティブコントロールとしての試薬のみ。選択された１６のプライマーセットの特異性は融解曲線分析によって確認された。各ＰＣＲ増幅は、９５℃以下における段階的な産物の融解にしたがった。（Ｄ）プライマーセットのＩＤ１５（ＣｏＣｏＭｏ６および８１）を用いたＰＣＲ増幅の最適化。（ａ）ＢＬＶ感染したＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞、（ｂ）ＢＬＶなしの正常なウシＮｓ１１８、および（ｃ）ネガティブコントロールとしての試薬のみから得られたＰＣＲ産物の融解曲線。５２のＢＬＶＬＴＲ配列における（Ａ）ＣｏＣｏＭｏ６プライマー、（Ｂ）ＦＡＭ−ＢＬＶ−ＭＧＢプローブ、および（Ｃ）ＣｏＣｏＭｏ８１プライマーのアニーリング位置における配列アラインメントに関する図である。配列アラインメントは、合計１１の配列（ＣｏＣｏＭｏ６プライマーについて８の個々の配列およびＣｏＣｏＭｏ８１プライマーについて４の個々の配列を含んでいる）にまとめられたGenBankから得た５２の配列を使用した。代表的な配列についての受託番号は左欄に示されている。番号は、ＦＬＫ−ＢＬＶのサブクローンｐＢＬＶ９１３（DDBJ: EF600696）のヌクレオチド配列の番号を示している。上段の番号は５’ＬＴＲの位置を示しており、下段の番号は３’ＬＴＲの位置を示している。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲプライマーの特異性の評価に関する図である。（Ａ）ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲに基づくＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲを、０．３ｎｇの以下の感染性の分子クローンを用いて実施した：ＢＬＶ（ｐＢＬＶ−ＩＦ、レーン２）；ＨＴＬＶ−１（ｐＫ３０、レーン３）；ＨＩＶ−１（ｐＮＬ４−３、レーン４）；ＳＩＶ（ｐＳＩＶｍａｃ２３９／ＷＴ、レーン５）；ＭＭＴＶ（ハイブリッドＭＭＴＶ、レーン６）；Ｍ−ＭＬＶ（ｐＬ−４、レーン７）；およびプラスミド（ｐＵＣ１８（レーン８）、ｐＵＣ１９（レーン９）、ｐＢＲ３２２（レーン１０）、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（レーン１１））。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲル電気泳動にかけた。レーン１、ＤＮＡマーカーФ×174-Hae III digest。１６８ｂｐ長のＰＣＲ産物は矢印によって示されている。（Ｂ）各ＤＮＡサンプルから得た１μｇのＤＮＡにおけるＢＬＶプロウイルスのコピー数は、ロアーケースによって示されている。値は、３つの独立した実験の結果の平均値＋標準偏差（ＳＤ）を表している。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよびネステッドＰＣＲの感度の比較に関する図である。０．７コピーのｐＢＬＶ−ＬＴＲ／ＳＫを含有している１０のサンプルを、（Ａ）ネステッドＰＣＲ、ならびに（Ｂ）ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって増幅した。（Ａ）ＢＬＶ−ＬＴＲアンプリコンを検出するために、１６８ｂｐのバンドを使用した。（Ｂ）チューブの違いの補正のために、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）強度を使用し、ＢＬＶアンプリコンを検出するために、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）強度を使用した。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよび段階希釈−ネステッドＰＣＲよって算出されたプロウイルス量の間における相関に関する図である。（Ａ）ＢＬＶ感染した６頭のウシから得た１μｇのゲノムＤＮＡについてのＢＬＶプロウイルスのコピー数を、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよび段階希釈−ネステッドＰＣＲによって決定した。段階希釈−ネステッドＰＣＲのために、６のゲノムＤＮＡを１０倍段階希釈によって分析し、ＢＬＶ−ＬＴＲ遺伝子の検出のためにネステッドＰＣＲにかけた。ネステッドＰＣＲ反応を１０回にわたって繰り返し、プロウイルス量を、［方法］に示されているようにポアソン分布にしたがって算出した。値は、４つの独立した実験から得た結果の平均値＋標準偏差（ＳＤ）を表している。（Ｂ）散布図は、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよび段階希釈−ネステッドＰＣＲによって決定されたＢＬＶのコピー数の間における相関を示している。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよびシンチチウム形成よって算出されたプロウイルス量間の相関に関する図である。（Ａ）ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲを用いて、ＢＬＶ感染した５頭のウシから得たプロウイルス量を、算出し、１×１０^５細胞ごとのプロウイルスのコピー数として示している。ＣＣ８１指標細胞を用いたシンチチウムアッセイを、ＢＬＶ感染した５頭のウシから得た１×１０^５の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ごとのシンチチウムの数をカウントした。値は、３つの独立したサンプルから得た結果の平均値＋標準偏差（ＳＤ）を表している。（Ｂ）散布図は、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって決定されたＢＬＶのコピー数およびシンチチウムの数の間における相関を示している。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってポジティブであり、ネステッドＰＣＲによってネガティブであったサンプルにおけるＢＬＶのＬＴＲヌクレオチド配列のアラインメントに関する図である。ＢＬＶ感染した９頭のウシから得たＢＬＶのＬＴＲ配列を、３つのプライマー対（ＢＬＴＲ５６ＦおよびＣｏＣｏＭｏ８１、ＢＬＴＲ１３４ＦおよびＢＬＴＲ５４４Ｒ、ならびにＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１）を用いたＰＣＲによって増幅し、続いてＰＣＲ産物を配列決定した。塗りつぶしの矢印は、これらのプライマーの位置、方向および長さを示している。ＹＡ４０、ＭＯ８５およびＹＡ３５から得たヌクレオチド位置７４〜２８３および１５４〜５２６におけるＬＴＲ配列は、ＢＬＴＲ５６ＦおよびＣｏＣｏＭｏ８１、ならびにＢＬＴＲ１３４ＦおよびＢＬＴＲ５４４Ｒの２つのプライマー対のそれぞれによって増幅された。ＹＡ５６由来のヌクレオチド位置７４〜２８３および１５４〜５２６におけるＬＴＲ配列は、ＢＬＴＲ５６ＦおよびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマー対によって増幅された。ＨＹ２、Ｎｓ２７、ＭＥ１０およびＣ３３６から得たヌクレオチド位置１６６〜２８３におけるＬＴＲ配列は、ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマー対によって増幅された。Ｎｓ２９から得たヌクレオチド位置１５４〜５２６におけるＬＴＲ配列は、ＢＬＴＲ１３４ＦおよびＢＬＴＲ５４４Ｒのプライマー対によって増幅された。白抜きの矢印は、ネステッドＰＣＲ用の第１プライマー対（ＢＬＴＲ−ＹＲおよびＢＬＴＲＲ）および第２プライマー対（ＢＬＴＲ２５６およびＢＬＴＲ４５３）の位置、方向および長さを示している。配列の上における番号は、ＦＬＫ−ＢＬＶのサブクローンｐＢＬＶ９１３（DDBJ: EF600696）のヌクレオチド配列にしたがった末端塩基を示している。保存配列はドット（．）によって示されており、欠失はハイフン（−）によって示されている。配列情報の欠如は記号（＊）によって示されている。ＢＬＶに誘導された地方性ウシ白血病（ＥＢＬ）における疾患の進行と相関する増加したプロウイルス量に関する図である。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって３８５頭のウシについて、プロウイルス量を算出した。ウシは、以前に確立された基準（非特許文献４１）、ＢＬＶのゲノムへの組込み、およびＢＬＶに対する抗体の検出に基づいて、４つの疾患段階に分類された。当該疾患段階は、ＢＬＶネガティブの１１７頭のウシ（ＢＬＶ−）；臨床的および血液学的に正常なＢＬＶ感染した１６３頭のウシ（ａｌｅｕｋｅｍｉｃ）；持続性リンパ球増多症にかかっている臨床的に正常なＢＬＶ感染した１６頭のウシ（ＰＬ）；およびリンパ腫にかかっているＢＬＶ感染した８９頭のウシである。円／点は、各段階において検出された平均のプロウイルス量を示しており、バーは標準偏差を示している。R version 2.10.1（R Foundation for Statistical Computing）を用いたペアｔ検定によって、ｐ値を算出した。

以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。

（１．ＢＬＶ検出用キット）
（キットの基本構成）
本発明に係るウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＬＶ由来のＤＮＡ断片を選択的に増幅可能なものである。ここで、「選択的に増幅可能」とは、ウシ由来の検査サンプルに対して、当該キットを用いたＰＣＲを行った場合に、ＢＬＶ由来の断片が専ら増幅産物として得られるが、ウシ自身由来のＤＮＡ断片及びＢＬＶ以外のウイルス由来のＤＮＡ断片は増幅産物として相対的に少量しか得られない（又はウシ自身由来のＤＮＡ断片及びＢＬＶ以外のウイルス由来のＤＮＡ断片はほぼ得られない）ことを指す。

本発明に係るキットは、具体的には以下の（１）又は（２）の何れかに示す、第一のＰＣＲプライマーと第二のＰＣＲプライマーとのプライマーセットを含む。
（１）配列番号１で示す塩基配列における連続する２０以上の塩基を含む、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドである第一のＰＣＲプライマーと、配列番号２で示す塩基配列における連続する２０以上の塩基を含む、５０塩基以下のオリゴヌクレオチドである第二のＰＣＲプライマーとの組合せ。なお、配列番号１で示す塩基配列は、表１中のprimer ID No. ６で示す塩基配列に相当する。また、配列番号２で示す塩基配列は、表１中のprimer ID No.81で示す塩基配列に相当する。
（２）配列番号１で示す塩基配列における連続する２０以上で２５以下の塩基を含み、４０塩基以下である第一のＰＣＲプライマーと、配列番号２で示す塩基配列における連続する２０以上で２５以下の塩基を含み、４０塩基以下である第二のＰＣＲプライマーとの組合せ。

なお、上記（１）又は（２）の何れの場合でも、第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーの長さは３５塩基以下であってもよく、３０塩基以下であってもよい。第一のＰＣＲプライマーは、好ましくは、配列番号１で示す塩基配列における連続する２５の塩基を全て含む。第二のＰＣＲプライマーは、好ましくは、配列番号２で示す塩基配列における連続する２５の塩基を全て含む。

第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーは、配列番号１又は２で規定されていない塩基配列を含みうる。例えば、第一のＰＣＲプライマーが５０塩基のオリゴヌクレオチドからなり、そのうち連続する２０塩基のみが配列番号１で示されたものである場合は、残りの３０塩基は配列番号１で規定されていないものである。このような場合でも、当業者であれば、公知になっている少なくとも一つのＢＬＶの塩基配列を参照配列として、残りの３０塩基を、当該参照配列にハイブリダイズする塩基配列として容易に決定することができる。

また、本発明において、縮重塩基Ｒ（ｒ）はＡ（アデニン）又はＧ（グアニン）を指す。縮重塩基Ｙ（ｙ）はＣ（シトシン）又はＴ（チミン）を指す。縮重塩基Ｗ（ｗ）はＡ又はＴを指す。縮重塩基Ｓ（ｓ）はＧ又はＣを指す。縮重塩基Ｋ（ｋ）はＧ又はＴを指す。縮重塩基Ｍ（ｍ）はＡ又はＣを指す。縮重塩基Ｄ（ｄ）はＡ又はＧ又はＴを指す。縮重塩基Ｈ（ｈ）は、Ａ又はＣ又はＴを指す。縮重塩基Ｎ（ｎ）はＡ又はＣ又はＧ又はＴを指す。

配列番号１で示す塩基配列、及び配列番号２で示す塩基配列は何れも上記した縮重塩基Ｒ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、Ｈ及びＮの少なくとも一つを含む。そのため、第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーはいずれも、いわゆる縮重プライマーでありうる。縮重プライマーは、少なくとも一つの塩基Ｒ、Ｙ、Ｗ、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｄ、Ｈ及びＮの位置において異なる種類の複数の塩基が指定された複数種類のプライマーから構成される。より多種類のＢＬＶを検出可能という観点では、第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーは、取りうる全プライマーの混合物たる縮重プライマー（プライマーミックス）である。ただし、第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーはそれぞれ、上記縮重プライマー（プライマーミックス）を構成するプライマーの一つであってもよい。

上記第一のプライマー及び第二のプライマーは常法の核酸合成法に従って合成することができる。

（キットに含まれうるその他の構成物）
アッセイの特異性及び感度を増強するために、ＢＬＶ検出用のキットはさらに、上記第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的に結合するＴaqMan（商標）プローブを含んでいてもよい。上記ＴaqMan（商標）プローブは、例えば、配列番号３又は４に示す何れかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドでありえる。

実施例において、ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲにおけるＢＬＶ−ＬＴＲのＰＣＲ産物を検出するためのＴaqMan（商標）プローブとして、ＦＡＭ−ＢＬＶプローブ（５‘−ＦＡＭ−ＣＴＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＴＣＣ−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３’）を用いた。さらに、他のＴaqMan（商標）プローブ（５‘−ＦＡＭ−ＣＴＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＴＣ−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３’）を、ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲのアンプリコンの検出に用いることもできる。しかし、感度の観点において、より長いプライマー（前者）が短いプライマーよりも好ましい。

検査サンプル中に含まれる細胞数を定量化して、検査サンプル中のゲノムＤＮＡ量をノーマライズするために、ＢＬＶ検出用のキットはさらに、シングルコピーの宿主遺伝子であるＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子(bovine leukocyte antigen DRA gene)の断片を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットを含んでいてもよい。

ＢＬＶ検出用のキットはさらに、必要に応じて、１）ＰＣＲに用いる各種試薬及び器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰ、ピペット等）、２）ＰＣＲに供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具（試験管、バッファー等）、３）ＰＣＲ増幅断片を解析するための各種試薬及び器具（電気泳動ゲル材料、ピペット等）、４）検出キットの使用説明書、等の少なくとも１つを備えていてもよい。

本発明に係るＢＬＶ検出用のキットは、ＢＬＶが存在するか否か、及び／又は、ＢＬＶの量（ＢＬＶの定量）を検出することができる。

（２．ＢＬＶの検出方法）
本発明に係るＢＬＶの検出方法は、ウシ（例えば、ウシは一頭でも複数頭でもよい）から取得した検査用サンプルに対して、本発明に係るＢＬＶ検出用の上記キットを用いて、ＢＬＶ由来の遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む。

より詳細には、本発明に係るＢＬＶの検出方法は、以下の工程：
（ａ）ＤＮＡを含有する検査用サンプルをウシから調製するサンプル調製工程、
（ｂ）上記検査用サンプルに対して、キットが含む第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅工程、
（ｃ）上記増幅工程で得られる増幅断片の有無、及び／又は当該増幅断片の量を検出する検出工程、を含む。

以下、各工程を説明する。

（１）調製工程
調製工程は、検査対象となるウシからＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。ＤＮＡを含有する試料とは、例えば、ウシの血液、血液以外の体液、組織等である。なお、調製されたＤＮＡを含有する試料には、ＤＮＡの他に、各種ＲＮＡ、タンパク質、細胞破砕物、等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製し、ゲノムＤＮＡを抽出してもよい。

（２）増幅工程
増幅工程は、上記試料に対して、本発明に係るキットが備える第一及び第二のプライマーのセットを用いたＰＣＲを行う工程である。ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にＢＬＶが含まれている場合には、そのＬＴＲに対応する増幅断片が得られる。より具体的には、検査対象となるウシのゲノムＤＮＡに組み込まれた、プロウイルス化したＢＬＶのＬＴＲに対応する増幅断片が得られる。

特に限定されないが、好ましいＰＣＲの条件例を以下に示す。なお、条件１）〜５）は互いに組み合わせる事で相乗効果を奏する。
１）縮重プライマーとして用いる場合、第一のプライマーと第二のプライマーとの濃度比（ＰＣＲの反応液中）は、７：１〜１３：１が好ましく、８：１〜１２：１がより好ましく、９：１〜１１：１がさらに好ましく、１０：１が特に好ましい。
２）ＰＣＲの反応液に含まれるゲノムＤＮＡの終濃度は、１ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌの範囲内が好ましく、１．５ｎｇ／μｌ〜２０ｎｇ／μｌの範囲内がより好ましい。このとき、縮重プライマーとして用いられる第一のプライマーの終濃度は、４００〜６００ｎＭが好ましく、４５０〜５５０ｎＭがより好ましい。また、縮重プライマーとして用いられる第二のプライマーの終濃度は、４０〜６０ｎＭが好ましく、４５〜５５ｎＭがより好ましい。
３）ＰＣＲのサイクル数は、３０回〜１００回程度が好ましく、６０回〜９０回程度がより好ましく、８０回〜９０回程度がさらに好ましい。
４）ＰＣＲのアニーリング温度は、５５℃〜７０℃が好ましく、５５℃〜６５℃がより好ましく、６０℃程度がさらに好ましい。
５）ＰＣＲの反応液に含まれる塩化マグネシウムの濃度は、２．５ｍＭ〜３．５ｍＭが好ましく、２．８ｍＭ〜３．２ｍＭがより好ましく、約３ｍＭがさらに好ましい。

なお、本発明に係るキットがＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子(bovine leukocyte antigen DRA gene)の断片を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットを含んでいる場合には、このＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲも、第一及び第二のプライマーのセットと同一反応系で行うことができる。

また、ＰＣＲによる増幅は、いわゆるリアルタイムＰＣＲとして行うこともできる。

（３）検出工程
検出工程は、増幅工程で得られるＰＣＲ増幅断片の有無、及び／又は当該ＰＣＲ増幅断片の量を検出する工程である。ＰＣＲ増幅断片（アンプリコン）の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の有無、量、及びサイズを確認することができる。

また、本発明のキットが、第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的に結合するＴaqMan(商標)プローブを含む場合には、ＰＣＲ増幅断片の有無及び量を蛍光シグナルで検出することができる。

ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在する場合には、試料にＢＬＶが存在すると判別することができる。また、ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が実質的に存在しない場合には、試料にＢＬＶが存在していないと判別することができる。すなわち、検出工程を通じて、ウシがＢＬＶを保有しているか否かの診断を行うことができる。

実施例に示すように、このアッセイは、特異性が高く、高感度で、高定量性で、かつ再現性が高い、そして、従来確立されていたnested-ＰＣＲアッセイを用いてもネガティブであった沢山の試料においてＢＬＶの検出ができた。このアッセイはまた、国際的なロケーションの範囲内からのウシにおけるＢＬＶの検出に非常に効果的であった。

後述する実施例、比較例などを参照して、以下に本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明はこれらに限定されない。

［結果］
〔ＢＬＶプロウイルスのコピー数決定用の絶対定量の原理〕
ＢＬＶプロウイルスの絶対的なコピー数を決定するために、ＰＣＲ増幅用の標的配列としてＬＴＲ領域を選択した（図１における（Ａ））。アッセイの設計において、２つのＬＴＲが個々のＢＬＶゲノムのそれぞれについて検出されることを考慮した（以下の式を参照すればよい）。また、ゲノムＤＮＡの投入量を標準化するために、アッセイに、１コピーのＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子の平行した増幅を組み入れた（図１における（Ｂ））。１０００００細胞ごとのプロウイルスのコピー数は、以下の式：
ＢＬＶプロウイルス量
＝ＢＬＶプロウイルスのコピー数／二倍体細胞数×１０００００細胞
＝（ＢＬＴ−ＬＴＲのコピー数／２）／（ＢｏＬＡ−ＤＲＡのコピー数／２）×１０００００細胞（Ａ）
にしたがって算出された。

〔すべてのＢＬＶ株を増幅させる能力を有しているプライマーセットを構築するためのＣｏＣｏＭｏアルゴリズムの使用〕
すべてのＢＬＶバリアントを増幅するために、複数のウイルス株を増幅可能なＰＣＲプライマーを設計するために開発されたＣｏＣｏＭｏアルゴリズムを改変して用いて、ＢＬＶのＬＴＲを標的化するプライマーを構築した。３５６のＢＬＶヌクレオチド配列をGenBankから収集した（２００９年４月３０日に）。これらのＢＬＶ配列から、１０２のＬＴＲ配列をGenBankのannotaitionにしたがって選択した。上記ＬＴＲ配列から、相同性を決定するために十分に大きい８５の配列を選択し、当該配列を、Pajekグラフィックソフトウェアを用いた相同性に基づいて、主要なＢＬＶ−ＬＴＲ群に指定した。これらの配列のうちの５２をプライマー設計用に選択した。標的配列を、複数のウイルス株を検出する縮重プライマーを設計するために開発されたＣｏＣｏＭｏアルゴリズムのＢＬＶ−ＬＴＲ用に改変したバージョンにかけた。これらの配列をテンプレートとして用いて、４９の候補プライマー（Ｔａｂｌｅ．１）を有している合計７２のプライマーセット（図２における（Ｂ））を設計した。

〔ＢＬＶ−ＬＴＲ領域増幅用のプライマーセットおよびプローブの選択〕
ＣｏＣｏＭｏプライマーセットがＢＬＶのＬＴＲ領域を増幅したか否かを判定するために、７２の候補プライマーセット（図２における（Ｂ））を用いたタッチダウンＰＣＲを、ＢＬＶ感染したＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを用いて行った。図２における（Ａ）に示されているように、ＢＬＶのＬＴＲ領域を巧く増幅した１６組のプライマー（１〜６、９、１５〜１７、２０、２１、２４、３３、４３および４６）を同定した。

１６の選択されたプライマーの特異性を、増幅の融解曲線分析によって評価した。増幅には、ＢＬＶなしの正常なウシＮｓ１１８に由来するＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞およびＰＢＭＣから抽出されたゲノムＤＮＡを、ネガティブコントロールとしての試薬のみとともに用いた。図２における（Ｃ）は、代表的な４つの融解曲線を示している。単一の融解温度を有している単一のＰＣＲ産物からなるアンプリコンは、単一のピークを示し、２以上の産物からなるアンプリコンは複数のピークを示した。ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットＩＤ１５を用いて生成されたアンプリコンは、ＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞によって単一の融解温度を有していた。これらのプライマーを用いて、ＢＬＶなしの正常なウシＮｓ１１８から得られたゲノムＤＮＡ、または試薬のみのコントロールによってアンプリコンは生成されなかった。一方で、他のプライマーセット（例えば、ＩＤ３、ＩＤ１６およびＩＤ１７）は、ＢＬＶなしの正常なウシＮｓ１１８から抽出されたゲノムＤＮＡからか、または試薬のみにおいてか、ならびにＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞から抽出されたゲノムＤＮＡからアンプリコンを生成した。このため、ＢＬＶ−ＬＴＲ領域の検出にとって最良のペアであった（図２における（Ｄ））ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットを用いた増幅の最適化を続けて行った。これらの最適化された条件下において、ＢＬＶに感染した５６頭のウシおよびＢＬＶなしの正常な３頭のウシから抽出されたゲノムＤＮＡを用いた増幅融解曲線は、ＢＬＳＣ−ＫＵ−１７細胞およびＢＬＶなしの正常なウシＮｓ１１８に見られたパターンと同じパターンを示した（データを示さず）。

ＢＬＶゲノムのＬＴＲ領域におけるＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１と対応する位置の間にある変異性の低い領域（図１）から、ＢＬＶ内部のTaqMan（商標）プローブを構築し、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）色素、無蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）および副溝結合剤（ＭＧＢ）を用いて、プローブの融解温度を高めるために標識した。プローブをＦＡＭ−ＢＬＶと命名した。

GenBankから入手した５２のＢＬＶのＬＴＲ配列に基づく、プライマーおよびプローブの領域と対応する配列のアラインメントを図３に示す。この比較に基づいて、５２の配列のうちから、ＣｏＣｏＭｏ６プライマーと対応する８つの個々の配列、およびＣｏＣｏＭｏ８１プライマーと対応する４つの個々の配列が、整列され得た。このアラインメントによって、プローブ領域における配列は、ＢＬＶバリアントのアラインメントを可能にするほどに十分に保存されていたが、ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーと対応する配列は、程度の低い類似性を示すことが証明された。

〔ＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子定量用のプライマーセットおよびプローブの構築〕
ＰＣＲテンプレートとして使用されたゲノムＤＮＡの標準化のために、ＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子の定量用のプライマーおよびプローブを設計した（図１）。ＭＲ１のｃＤＮＡクローン（DDJB: No. D37956）から配列を入手し、増幅用の標的としてＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子のエキソン４領域を選択した。増幅プライマーＤＲＡ６４３およびＤＲＡ７３４、ならびにＢｏＬＡ−ＤＲＡ内部のTaqMan（商標）プローブを、Primer Express 3.0（Applied Biosystems, Tokyo, Japan）を用いて設計した。プローブの融解温度を高めるためにＶＩＣ色素、ＮＦＱおよびＭＧＢプローブを用いて、プローブを標識し、ＶＩＣ−ＤＲＡと命名した。

〔絶対定量的ＰＣＲ用の標準曲線を作成するためのプラスミドＤＮＡコピー数の定量〕
ＢＬＶプロウイルスＤＮＡおよび細胞性ＤＮＡの定量用の標準物質を得るために、ＢＬＶの全長ＬＴＲを含んでいるｐＢＬＶ−ＬＴＲ／ＳＫ、およびウシのＤＲＡ遺伝子の全長を含んでいるｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ／ＳＫを、それぞれ１０３．１ｎｇ／μｌ（ｐＢＬＶ−ＬＴＲ^ｃｏｎｃ）および１２５．０ｎｇ／μｌ（ｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ^ｃｏｎｃ）において調製した。これらのプラスミドのコピー数を段階希釈法によって算出した。各プラスミドを１０倍に希釈し、標的ＤＮＡをネステッドＰＣＲによって検出した。例えば、ｐＢＬＶ−ＬＴＲ^ｃｏｎｃの１０^−１１希釈において、ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ産物（ＢＬＶのＬＴＲが挙げられる）をまったく検出できなかった。それから、１０^−１１希釈において１０回にわたってＰＣＲ反応を繰り返し、成功率は５／１０と分かった。１０のうち５のＰＣＲ溶液はＬＴＲ遺伝子を含有しておらず、ｆ（ｘ＝０）＝５／１０として方程式に表されることをこの結果は示していた。標的遺伝子の平均コピー数（λ）は、−ｌｏｇ_ｅ（５／１０）＝０．２３１と算出され、２．３１×１０^１０／μｌのｐＢＬＶ−ＬＴＲ^ｃｏｎｃについてのコピー数と一致していた。また、見積もられたコピー数の信頼性を確認するために、ＤＮＡ質量に基づく試算の（draft）コピー数を算出し、ほぼ同じ結果（ｐＢＬＶ−ＬＴＲ^ｃｏｎｃについて２．３５×１０^１０およびｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ^ｃｏｎｃについて２．８５×１０^１０）を得た。

〔ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの最適化にとっての最後の手順〕
標準曲線を作成するために、ｐＢＬＶ−ＬＴＲ^ｃｏｎｃ）および１２５．０ｎｇ／μｌ（ｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ^ｃｏｎｃの以下の希釈物：０．１コピー／μｌ、１０００コピー／μｌおよび１００００００コピー／μｌを作った。５００ｎＭのＣｏＣｏＭｏ６プライマー、５０ｎＭのＣｏＣｏＭｏ８１プライマー、１５０ｎＭのＦＡＭ−ＢＬＶプローブ（５’−ＦＡＭ−ＣＴＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＴＣＣ−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３’）、および３０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含有している１×TaqMan Gene Expression Master Mixの総量２０μｌにおいて、ＢＬＶ−ＬＴＲから得られた１６８ｂｐのアンプリコンを増幅させた。５０ｎＭのＤＲＡ６４３プライマー（５’−ＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＴＧＣ−３’）、５０ｎＭのＤＲＡ７３４プライマー（５’−ＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＴＣＡ−３’）、１５０ｎＭのＶＩＣ−ＤＲＡプローブ（５’−ＶＩＣ−ＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣ−ＮＦＱ−ＭＧＢ３’）、および３０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含有している１×TaqMan Gene Expression Master Mixの総量２０μｌにおいて、ＢｏＬＡ−ＤＲＡ領域の５７ｂｐのアンプリコンを増幅させた。以下のプログラムにしたがってABI 7500 Fast Real-time PCRシステムを用いて、ＰＣＲ増幅を行った：ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素の２分にわたる５０℃における活性化、AmpliTaq Gold Ultra Pure（ＵＰ）の１０分にわたる９５℃における活性化、および９５℃における１５秒および６０℃における１分の８５サイクル。ＢＬＶ−ＬＴＲおよびＢｏＬＡ−ＤＲＡについて得られたコピー数を用いて、式（Ａ）に示されるように、１０００００細胞ごとのＢＬＶプロウイルス量を算出した。

〔ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの再現性〕
ＢＬＶプロウイルスのコピー数決定用のＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの、アッセイ内再現性およびアッセイ間再現性を、ＢＬＶ感染した７頭のウシから得られた血液サンプルから抽出されたゲノムＤＮＡの分取物を用いて評価した（Ｔａｂｌｅ．２）。アッセイ内信頼性の決定のために、アッセイを３回にわたって繰り返して、各サンプルからの３組のＰＣＲ増幅物を調べた。合計２１の試験を行い、アッセイ内の変動係数（ＣＶ）は０％〜２０．５％（平均８．６％）の範囲であった。アッセイ間信頼性の決定のために、各サンプルについて独立した３つの実験を行った。１０００００細胞ごとのＢＬＶプロウイルスのコピー数についてのアッセイ間ＣＶに関する値は、５．５％〜１９．８％（平均１２．７％）の範囲であった。これらの結果は、このアッセイが良好なアッセイ内信頼性およびアッセイ間信頼性を有していることを明らかに証明している。

〔種々のレトロウイルスを用いたＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲプライマーの特異性の評価〕
ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲプライマーの特異性を、種々のレトロウイルス分子クローンおよび種々のプラスミドを用いて試験した。当該レトロウイルス分子クローンとしては、ＢＬＶ、ＨＴＬＶ−１、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）が挙げられる。当該プラスミドとしては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）が挙げられる。リアルタイムＰＣＲのために、ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーを０．３ｎｇの各プラスミドとともに使用し、産物を３％アガロース電気泳動によって分析した。１６８ｂｐ長の単一のＰＣＲ産物は、７．９×１０^１０／μｇ＋４．３×１０^１０／μｇのコピー数を有して（図４における（Ｂ））、ＢＬＶ感染性の分子クローンについてのみ観察された（図４における（Ａ））。アンプリコンは、他のプラスミドのいずれについても検出されなかった。これらの結果は、他のレトロウイルスのＬＴＲを増幅させずに、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲプライマーがＢＬＶのＬＴＲを特異的に増幅させることを強く示している。

〔ネステッドＰＣＲと比較された、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの感度の評価〕
ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの感度を決定するために、それぞれ０．７コピーのｐＢＬＶ−ＬＴＲ／ＳＫを含有している２０の溶液を、ネステッドＰＣＲ、ならびにＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって増幅させた（図５）。ネステッドＰＣＲ増幅の３／１０がポジティブであり、コピー数は０．３６と見積もられた。ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲについて、ＰＣＲ増幅の５／１０がポジティブであり、コピー数は０．６９と見積もられた。この結果は、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの感度がネステッドＰＣＲより１．９倍高いことを示していた。

〔ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよび段階希釈−ネステッドＰＣＲの比較〕
段階希釈法は、標的遺伝子のコピー数を定量化するために有効である。段階希釈−ネステッドＰＣＲ、ならびにＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲによって、１μｇのゲノムＤＮＡごとのＢＬＶプロウイルスのコピー数を、ＢＬＶ感染した５頭のウシについて算出した（図６における（Ａ））。両方の方法によって得られたＢＬＶプロウイルスのコピー数を、回帰分析によって確認した。相関係数の平方（Ｒ^２）は、０．８８０６であり（図６における（Ｂ））、ＣｏＣｏＭｏプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによって得られたコピー数が、段階希釈−ネステッドＰＣＲによって得られたコピー数と相関することを示していた。したがって、ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲは、臨床サンプルからのＢＬＶプロウイルスのコピー数を得るために使用され得ると考えられる。

〔ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよびシンチチウム形成アッセイの相関〕
ＢＬＶプロウイルスのコピー数がＢＬＶによる感染能と相関しているか否かを調べるために、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよびシンチチウム形成アッセイを、ＢＬＶ感染した５頭のウシから得られたサンプルに対して行った。ＢＬＶ感染した５頭のウシから得られた１×１０^５のＰＢＭＣを、誘導因子ＣＣ８１とともに３日にわたって共培養し、同じウシから得られた１×１０^５の細胞とプロウイルスのコピー数を比較することによって、ＢＬＶの感染能を評価した（図７における（Ａ））。プロウイルスのコピー数は１０^５細胞につき１１３〜６３０９８コピーの範囲であり、シンチチウムの数は１０^５ＰＢＭＣにつき３６〜１２７３７の範囲であった。これらのサンプルについての回帰分析によって、プロウイルス量のレベルは、図７における（Ｂ）に示されているように、シンチチウムの数と正に相関していた（Ｒ^２＝０．９６５８）。

〔ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲおよびネステッドＰＣＲによる、異なる地域からの畜牛におけるＢＬＶプロウイルスの検出〕
縮重プライマーは高度に縮重している配列を検出可能なので、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲは、既知および未知の両方の種々のＢＬＶ株を検出する潜在能を有している。上述の実験において、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの感度は、ネステッドＰＣＲより優れていることを見出した。このため、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲは、世界中の異なる地域からのウシにおけるＢＬＶプロウイルスを検出し得るか否かを調べた。日本における１つの飼育場からの５４頭のウシ、ペルーにおける２つの飼育場からの１５頭のウシ、ボリビアにおける４つの飼育場からの６０頭のウシ、チリにおける３つの飼育場からの３２頭のウシ、およびアメリカにおける１つの飼育場からの５頭のウシを試験し、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって得られた結果を、ネステッドＰＣＲによって得られた結果と比較した（Ｔａｂｌｅ．３）。２つの方法によるＢＬＶのＬＴＲの増幅は、１６６頭のウシを３つのグループに分けた。第１グループのウシ（ｎ＝１０７）は、両方の方法によってＢＬＶのＬＴＲについてポジティブであった（日本における５０頭、ペルーにおける７頭、ボリビアにおける２７頭、チリにおける１８頭、およびアメリカにおける５頭）。第２グループのウシ（ｎ＝５０）は、両方の方法によってＢＬＶのＬＴＲについてネガティブであった（日本における２頭、ペルーにおける７頭、ボリビアにおける２８頭、およびチリにおける１３頭）。第３グループのウシ（ｎ＝９）は、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってポジティブであったが、ネステッドＰＣＲによってネガティブであった（日本における２頭、ペルーにおける１頭、ボリビアにおける５頭、およびチリにおける１頭）。興味深いことに、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってネガティブであったが、ネステッドＰＣＲによってポジティブであったウシはいなかった。したがって、ネステッドＰＣＲ法およびＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ法は、試験したウシの９４．６％について同じ結果を示したが、５．４％のウシについて、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲのみがＢＬＶプロウイルスを検出可能であった。これらの結果は、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの感度がネステッドＰＣＲより高いことを明らかに示している。

Ｔａｂｌｅ．３に示されているように、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってポジティブであったが、ネステッドＰＣＲによってネガティブであったいくつかのサンプルを検出した。これらのサンプルがＢＬＶに感染していたことを確認し、これらのサンプルがネステッドＰＣＲによって検出されなかった理由を調べるために、このグループから得られた９つのサンプル：ボリビアからのＹＡ４０、ＭＯ８５、ＹＡ３５、ＹＡ５６およびＭＥ１０、ペルーからのＨＹ２、チリからのＣ３３６、ならびに日本からのＮｓ２７およびＮｓ２９のＬＴＲ領域を配列決定した。９つのサンプルのすべてにおいてＢＬＶ−ＬＴＲ配列を検出可能であり（図８）、したがって、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの高い特異性を確認した。２／９のサンプルにおいて、ネステッドＰＣＲにおけるＬＴＲの増幅のために使用されたプライマーＢＬＴＲ４５３にとってのアニーリング領域にミスマッチ配列を同定した。これは、ネステッドＰＣＲがＢＬＶプロウイルスを検出できなかった理由についての考えられる解釈である。

〔疾患の進行およびＢＬＶプロウイルス量の相関分析〕
疾患の初期および後期におけるＢＬＶプロウイルスの量における差異を特徴づけるために、ＥＢＬの進行の異なる段階において、ＢＬＶ感染した２６８頭のウシについてＢＬＶプロウイルスのコピー数を算出した。ＢＬＶポジティブの健常な１６３頭のウシ、ＰＬにかかっているＢＬＶ感染した１６頭のウシ、リンパ腫にかかっているＢＬＶ感染した８９頭のウシ、およびＢＬＶなしの正常な１１７頭のウシにおいて、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってプロウイルス量を測定した（図９）。プロウイルス量は、無白血病段階と比べてＰＬ段階において有意に増加しており（ｐ＝０．００５２）、リンパ腫段階においてさらに増加していた（ｐ＝０．００５２）。ＢＬＶなしの正常な１１７頭のウシにおいてＢＬＶは検出されなかった。したがって、ＢＬＶプロウイルスのコピー数は疾患の重篤度の増大にともなって増加することを証明できた。

［考察］
この研究において、われわれは、感染動物からのＢＬＶプロウイルス量の定量にとっての非常に特異的かつ正確な高感度の方法の開発に成功したことを説明している。

ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲシステムは、広い地理的由来（日本、ペルー、ボリビア、チリおよびアメリカが挙げられる）からの種々のＢＬＶ株を検出可能である。ＢＬＶのｅｎｖ遺伝子の遺伝的な変異性についての初期の研究では、単離物のなかに極わずかな変異が同定されたが（非特許文献２８）、制限断片長多型の分析および全長のＢＬＶのｅｎｖ遺伝子の分析に基づく最近の研究によって、少なくとも７つの異なるＢＬＶ遺伝子型が世界中に流布していることが明らかになっている（非特許文献２４、２７、２９）。この新規な分類は、ＢＬＶの相違が世界中において拡大していることを示唆している。GenBankにおける合計３５６のＢＬＶ配列から、異なる５２のＢＬＶのＬＴＲヌクレオチド配列を入手した。これは、多くのＢＬＶバリアントが存在することを示しており、われわれの結果は、これらのバリアントのすべての検出がＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲを用いて可能であることを示唆している。したがって、ＣｏＣｏＭｏアルゴリズムが複数のＢＬＶバリアントに対応する縮重プライマーを設計するための有用なツールであることを、われわれは明らかに証明している。実際に、Tong et al.（非特許文献３０）は、コンセンサス−縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマーを用いたセミネステッドＰＣＲまたはネステッドＰＣＲのアッセイが、非常に特異的またはより広く包括的になり得、亜科または属のレベルを標的化可能であることを示した。この種の手法を用いると、ＣｏＣｏＭｏプライマーの縮重度が高くなり過ぎ、これによって標的配列に対して特異的なプライマーの濃度およびアッセイの感度を低下させるリスクがある。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲは非常に高感度であり、ネステッドＰＣＲ増幅に対して優れた結果を示していた（図６）ので、この問題はわれわれの研究では生じなかった。さらに、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲシステムは、種々の地域からのＢＬＶ感染したウシにおけるウイルスの検出に非常に有効であった（Ｔａｂｌｅ．３）。TaqMan（商標）プローブは、感度および特異性を向上させるために使用され、高い縮重と関連する任意の欠点に対抗するために作用している。ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーに対応する位置の間に配置されているＢＬＶのTaqMan（商標）プローブの配列は、５２のＢＬＶバリアントのなかで完全に保存されていたことに注目することが重要である。また、ウシにおけるＢＬＶにとってのＥＬＩＳＡ法および免疫拡散スクリーニング法は、非常に高感度であるが、ＰＣＲによる完全なプロウイルスの直接的な検出と異なり、ＢＬＶに対する抗原を検出することによって作用する（非特許文献１７）。ＥＬＩＳＡ法および免疫拡散スクリーニング法は、高効率の偽陽性に陥り、また、ＢＬＶ感染した母獣からの母性の抗体がアッセイを妨げ得るので、子ウシが感染しているか否かの決定に有効ではない。したがって、ウシにおけるＢＬＶ感染の確実な検出は、プロウイルスの検出のための高感度な方法を必要とする。この目的のために、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲを開発した。

ＣｏＣｏＭｏプライマーを用いたＢＬＶ定量の高い特異性を確認するために、いくつかの手法を使用した。第１に、ＣｏＣｏＭｏ６およびＣｏＣｏＭｏ８１のプライマーは、ＢＬＶに感染した細胞における融解曲線分析によって単一のピークを生じたが、未感染細胞または試薬のみのネガティブコントロールにおいて、産物を増幅しなかった。第２に、ＰＣＲ増幅は、ＢＬＶポジティブのウシにおいて検出されたが、ＢＬＶネガティブの試験された１２０頭のウシのすべてにおいてネガティブであった。第３に、いくつかの非ＢＬＴのレトロウイルスＬＴＲを含んでいる感染性分子のクローンは、われわれのシステムにおいて増幅されなかった。

これまでの研究（非特許文献３１）において、リアルタイムＰＣＲを用いてＢＬＶプロウイルスを定量するための方法が報告されている。この方法は、プロウイルスごとに１コピーのみ存在しているＢＬＶのｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子を標的にしており、プライマーのアニーリング領域は潜在的に変異を受け易かった。ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲのＢＬＶ−ＬＴＲ標的は、プロウイルスごとに２コピー存在しており、われわれのアッセインの感度の向上に寄与している。実際に、Lew at el.（非特許文献３１）によって説明されているｑＰＣＲ法を用いた場合、ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって容易に検出可能な濃度である１８コピー／１０^５細胞未満においてプロウイルスを検出できなかった（データを示さず）。また、われわれの方法は、縮重プライマーの使用がＢＬＶ配列バリアント（変異から生じるバリアントが挙げられる）の検出を可能にするという利点を有している。

また、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲは正確であった。ＣｏＣｏＭｏプライマーによるリアルタイムＰＣＲを用いて得られたプロウイルスのコピー数は、段階希釈−ネステッドＰＣＲの結果と密接に相関していた。細胞内のＢＬＶプロウイルスを定量するためにＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲを使用することを目的にしていたので、単コピーの細胞性の遺伝子ＢｏＬＡ−ＤＲＡの平行した定量を実施した。この測定は、サンプル間の増幅効率における変動についての調整を可能にした。この方策を用いて、感染動物の診断にとって十分なアッセイ内信頼性およびアッセイ間信頼性を実測した。アッセイのＣＶ範囲は、ＨＴＬＶ−１プロウイルス量の定量について報告されている範囲（８．２％〜３１．４％（非特許文献３２）または４９％〜５５％（非特許文献３３））より顕著に良好な、０．０％〜２０．５％であった。われわれのアッセイの高い信頼性は、疾患の進行の間におけるプロウイルス量の定量のための使用を可能にした。また、ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲの精度を配列決定分析によって確認した。ＢＬＶプロウイルスが、ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって検出され得たが、ネステッドＰＣＲによって検出されなかった９つのサンプルを選択し、アンプリコンを配列決定した。この方策を用いて、９つのサンプルはＢＬＶによって感染していたことを確認し、ネステッドＰＣＲによってネガティブだったサンプルにおけるプロウイルスを検出するＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ法の能力を強調した。２／９のサンプルにおいて、ネステッドＰＣＲプライマーにとってのアニーリング領域に配列ミスマッチを検出し、これによって、これらのサンプルにおけるネステッドＰＣＲによるＢＬＶ検出の失敗の解釈を示唆している。

シンチチウムアッセイは、存続可能な（viable）ＢＬＶウイルス粒子を検出するための通常の方法である（非特許文献３４）。しかし、この方法は、時間のかかるしばしば困難な細胞培養を必要とし、低い感度を有している。われわれのアッセイを用いて得られたプロウイルスのコピー数がシンチチウム形成アッセイと相関するか否かを試験した。これは、われわれのアッセイがＢＬＶ感染の段階における診断に使用され得ることを示唆しているためである。シンチチウム形成は、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって算出された通りの１００００コピー／１０^５細胞を超えるプロウイルス量と強く相関していた。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによって検出された低いプロウイルス量を有しているＢＬＶ感染したウシにおいて、シンチチウム形成はほとんど検出され得なかった。したがって、ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲは、低いウイルス量を有している動物におけるＢＬＶ感染のレベルを正確に決定可能であると考えられる。

ＰＬと呼ばれるＢＬＶ感染の前白血病段階は、複数の部位にプロウイルス挿入を有している感染した表面免疫グロブリンＭ陽性Ｂ細胞の増大によって特徴づけられる。一方で、特異な組込み部位は、顕性の白血病／リンパ腫の発症後におけるＢＬＶに感染した個体に認められる悪性Ｂ細胞の悪性の指標である（非特許文献１３、２３、３５）。このモデルにしたがえば、プロウイルス量は疾患の進行の間に増加するはずであるが、これは正式には証明されていなかった。ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲを用いて、われわれは、疾患の進行の間におけるプロウイルス量の増加を検出し得た。この結果は、プロウイルス量が、疾患の進行を監視するための優れた指標であるが、ＢＬＶ伝染を最小化するための隔離計画の実施にも有用もあり得ることを強く示唆している。また、プロウイルス実験によって、疾患の進行と相関する宿主因子または遺伝的背景が同定された。例えば、腫瘍関連ｃ１４３抗原は、ＥＢＬにかかっているウシにおいて特異的にセリンリン酸化されていると同定された。そして、がん関連遺伝子（例えば、ｐ５３および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））は、ＥＢＬと関連している（非特許文献３５〜４１）。また、プロウイルス量は、リンパ腫段階への進行に影響するマーカーを同定するための有用な手段であり得る。われわれのアッセイは、ワクチン接種の有効性を評価するために有用であり得、また、ＢＬＶに誘導されるリンパ腫に対する耐性または感受性とあらかじめ関連しているＴＮＦおよびＢｏＬＡ対立遺伝子を有しているＢＬＶ感染したウシにおけるプロウイルス量の変化を検出するために有用であり得る。最後に、われわれのアッセイはすべてのＢＬＶバリアントを検出したので、ＣｏＣｏＭｏアルゴリズムは、他のレトロウイルス（ＨＴＬＶおよびＨＩＶ−１が挙げられる）のプロウイルス量を定量するための縮重プライマーの設計に有用なツールと考えられる。

［結論］
ＣｏＣｏＭｏを用いて、既知または新規のＢＬＶバリアントのプロウイルス量を測定するための新たな定量的リアルタイムＰＣＲ法を開発した。われわれの方法は、感染動物におけるＢＬＶのＬＴＲ領域の検出のために、非常に特異的、高感度、定量的かつ再現可能である。上記方法は、種々の地理的位置からのウシにおけるＢＬＶの検出に有効であり、以前に開発されたネステッドＰＣＲより幅広いサンプルにおけるＢＬＶを検出した。最後に、われわれは、プロウイルス量が疾患の進行の段階と非常に相関していることを初めて示している。

［方法］
〔臨床サンプル、細胞株およびＤＮＡ抽出物〕
血液サンプルを、血清学的にＢＬＶネガティブの正常な１１７頭のウシ、臨床的および血液学的に正常な１６３頭のＢＬＶ感染したウシ、ＰＬにかかっている臨床的に正常な１６頭のＢＬＶ感染したウシ、およびＥＢＬにかかっている８９頭のＢＬＶ感染したウシから入手した。これらのウシを日本において飼った。ボリビア、ペルー、チリおよび米国において飼われたさらなる１１６頭のウシを本研究に組み入れた。ＢＬＶ感染したウシを、以前に確立された基準（非特許文献４２）およびＢＬＶプロウイルスのゲノムへの組込みにしたがって分類した。ＰＢＭＣを、Miyasaka and Trnka（非特許文献４３）の方法によって血液から分離した。

ＢＬＶ感染したＢリンパ腫細胞株ＢＬＳＣ−ＫＵ−１７（非特許文献４４）を、１０％の熱非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Life Technologies Japan, Tokyo, Japan）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったダルベッコ改変イーグル培地（Sigma Aldrich Chemie Gmbh, Steinem, Germany）において維持した。マウス肉腫ウイルスによってがん化されたネコの細胞株ＣＣ８１を、１０％の熱非働化ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma-Aldrich Co. Ltd. , Ayrshire, UK）において維持した。

ゲノムＤＮＡを、（ａ）DNA Wizard Genomic DNA purification Kit（Promega, Madison, WI）によって全血、（ｂ）Hughes et al.（非特許文献４５）によって説明されている手法によってＰＢＭＣ、および（ｃ）標準的な手法を用いてFTA elute cards（Whatman, Tokyo, Japan）上にスポットした４０μｌの全血から抽出した。

〔プライマーおよびプローブの設計〕
個々のＢＬＶのＬＴＲ配列のうち５２のバリアントを、GenBankにおける３５６のＢＬＶ配列から選択した。標的配列を、複数のウイルス株を検出する縮重プライマーを設計するために開発されたCoCoMo-primer-designアルゴリズム（http://www.geneknot.jp/cocomo; Endoh D, Mizutani T, Morikawa S Hamaguchi I, Sakai K, Takizawa K, Osa Y, Asakawa M, Kon Y, Hayashi M,: CoCoMo-Primers: a web server for designing degenerate primers for virus research. Submitted）のＢＬＶ−ＬＴＲ用に改変したバージョンにかけた。なお、ＬＴＲが公式に報告されていないＢＬＶ配列を利用するために、個々のＢＬＶのＬＴＲ配列のうち５２のバリアントを、公知のＬＴＲ配列に基づくBLASTプログラムおよびクラスター選択法を組み合わせることによって抽出した。さらに、CoCoMo-primer-designアルゴリズムが使用される場合に、標的配列に多く見られる４塩基（一致する２塩基−自由な１塩基−一致する１塩基）が、一般的に検索される。しかし、ここでは多く見られる５塩基をＢＬＶにおいて検索した。

特異的なＰＣＲ産物を検出するために、Primer Express software, version 2.0（Applied Biosystems）を用いて設計したプローブ配列とともに、TaqMan（商標）プローブシステム（Applied Biosystems, Tokyo, Japan）を用いた。

（ＣｏＣｏＭｏアルゴリズムについての詳細）
多くのウイルスは進化の間に変異しており、病原性および集団発生における変化を導き得る（非特許文献１、２）。分子技術（特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくこれらの用途）の開発は、ウイルス感染症の診断を激変させている（非特許文献３、４）。遺伝子のいくつかの起こり得る変異したバージョンの増幅を可能にする縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、ｃＤＮＡクローニング用、および高い割合の変異に起因して変異性の高い配列の検出用に首尾よく使用されている（非特許文献５）。縮重プライマーは、未知の遺伝子の増幅だけでなく、類似しているが、同一ではない遺伝子の同時の増幅に有用である（非特許文献６）。縮重プライマーは、ウイルス検出に対する費用の大幅な削減および所要時間の大幅な短縮を可能にする。“Coordination of Common Motifs”（ＣｏＣｏＭｏ）アルゴリズムは、複数のウイルスの種を検出するために特に開発されている（Endoh D, Mizutani T, Morikawa S, Hamaguchi I, Sakai K, Takizawa K, Osa Y, Asakawa M, Kon Y, Hayashi M: CoCoMo-Primers: a web server for designing degenerate primers for virus research, submitted）。このプログラムは、MAFFTを用いた複数のＤＮＡ配列のアラインメント（非特許文献８）に基づく、COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer（CodeHop）技術（非特許文献７）の拡張を利用している。ＣｏＣｏＭｏは、標的配列から得られた複数のコドンを含んでいる多く見られるギャップテトラヌクレオチドモチーフ（ＧＴＮＭ）を選択する。それから、ＣｏＣｏＭｏは、データベースに基づく方法を用いて共通のＧＴＮＭの増幅可能な組を選択し、多く見られる増幅可能なＧＴＮＭのそれぞれの５’末端においてコンセンサスヌクレオチドを構築する。それから、コンセンサス縮重配列を、設計した縮重プライマーに結合させる。したがって、ＣｏＣｏＭｏアルゴリズムは、高度に縮重した配列にとっての縮重プライマーの設計において有用である。

〔プラスミド〕
ＢＬＶ由来の全長ＬＴＲを含んだｐＢＬＶ−ＬＴＲ／ＳＫを得るために、プライマー（ＬＴＲ／ＸｈｏＩ（５’−ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＣＣＧＡ−３’；１位〜２０位）およびＢＬＶ−ＬＴＲＲ／ＢａｍＨＩ（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧ−３’；５１０位〜５３０位）、およびＫＵ−１７細胞から抽出された、テンプレートとしてのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを使用した。ウシＤＲＡ遺伝子の全長を含んだｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ／ＳＫを生成するために、哺乳類の発現ベクターｐＣＤＭ８（非特許文献４７）から、ＸｂａＩを用いてＭＲ１を消化した。それから、ＭＲ１配列を含んでいるＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Stratagene）にサブクローニングした。使用されたさらなるクローンは、ＢＬＶ感染性クローンｐＢＬＶ−ＩＦ（非特許文献３４）；ＨＴＬＶ−１感染性クローンｐＫ３０（非特許文献４８）；ＨＩＶ−１感染性クローンｐＮＬ４−３（非特許文献４９）；ＳＩＶ感染性クローンＳＩＶｍａｃ２３９／ＷＴ（非特許文献５０）；ハイブリッドＭＭＴＶプロウイルスプラスミド（非特許文献５１）；Ｍ−ＭＬＶ感染性クローンｐＬ−４（非特許文献５１）；およびプラスミド（ｐＵＣ１８（Takara Bio Inc., Tokyo, Japan）、ｐＵＣ１９（Takara Bio Inc.）およびｐＢＲ３２２（Promega）が挙げられる）を含んでいた。

〔段階希釈法によるコピー数の算出〕
ｐＢＬＶ−ＬＴＲ／ＳＫおよびｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ／ＳＫを、ＳｃａＩを用いて消化し、Sephadex G-50カラム（GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan）を用いて精製した。ゲノムＤＮＡを、５ｍＭのスペルミジンの存在下において２４時間にわたってＸｈｏＩを用いて消化した。サンプルを、ＴＥ緩衝液（１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を有している１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を用いて、氷上において１０倍段階希釈物に希釈した。マイクロチューブに対するＤＮＡ吸着を避けるために、超滑面処理されたチューブ（BM4015 Platinum super polypropylene; BM bio, Tokyo, Japan）を、標準曲線にとってのテンプレートの調製に使用した。

直鎖化されたｐＢＬＶ−ＬＴＲ／ＳＫ、ｐＢｏＬＡ−ＤＲＡ／ＳＫおよびゲノムＤＮＡのために、限界希釈を実施した。プラスミドＤＮＡからのＢＬＶ−ＬＴＲ遺伝子およびＢｏＬＡ−ＤＲＡ遺伝子の検出を、ＣｏＣｏＭｏプライマー６および８、またはプライマーＤＲＡ６４３およびＤＲＡ７３４をそれぞれ用いたリアルタイムＰＣＲによって実施した。また、ＢＬＴ−ＬＴＲ遺伝子を、ネステッドＰＣＲを用いてゲノムＤＮＡにおいて検出した。増幅産物が検出不可能であった希釈点において、ＰＣＲを１０回にわたって繰り返し、ネガティブな結果の頻度を算出した（ｆ（ｘ＝０））。標的遺伝子のコピー数を、ポアソン分布モデル：λ＝−ｌｏｇ_ｅ（ｆ（ｘ＝０））（λ＝標的遺伝子の平均コピー数）にしたがって算出した。

〔ＢＬＶ−ＬＴＲ増幅用の候補ＣｏＣｏＭｏプライマーセットにとってのＰＣＲ条件〕
１．０ユニットのｒＴａｑ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５００ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびにネステッドＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅されている１：１０００倍希釈したＢＬＶ−ＬＴＲアンプリコンを含有している、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用の１×緩衝液（TOYOBO, Tokyo, Japan）の２０μｌ量において、タッチダウンＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ増幅を、TGRADIENTサーモサイクラー（Biometra, Gottingen, Germany）を用いて以下のプログラムにしたがって実施した：１０分における９５℃における開始の変性、９５℃における１５秒、６０℃〜５２℃における１０秒（アニーリング温度は、３サイクルごとに０．２℃だけ６０℃から５２℃まで段階的に低下させた）および７２℃における１０秒の、続く４０サイクル。２％アガロースゲル電気泳動のために５μｌのＰＣＲ産物を使用し、増幅産物をエチジウムブロマイド染色によって検出した。

〔ＰＣＲ特異性を評価するための融解曲線分析〕
５００ｎＭのＣｏＣｏＭｏプライマーのそれぞれ、３ｍＭのＭｇＣｌ_２、および３０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有している、１×LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland）の総量２０μｌにおいて、ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ増幅を、Light Cycler 2.0（Roche Diagnostics GmbH）を用いて以下のプログラムにしたがって実施した：１０分間にわたる９５℃における開始の変性、９５℃における１５秒、６５℃における５秒および７２℃における９秒の、続く７５サイクル。融解過程を、二本鎖化したＤＮＡの検出用の、ＤＮＡと結合しているSYBR Green I色素の蛍光によってモニターした。

〔ネステッドＰＣＲによるＢＬＶ−ＬＴＲの検出〕
プライマーＢＬＴＲＦ−ＹＲ（５’−ＴＧＴＡＴＧＡＡＡＧＡＴＣＡＴＧＹＣＧＲＣ−３’ ＬＴＲ１−２１）およびＢＬＴＲＲ（５’−ＡＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＣ−３’ ＬＴＲ５１５−５３３）を用いて、最初のＰＣＲを実施した。２５０ｎＭのＢＬＴＲＦ−ＹＲプライマーおよびＢＬＴＲＲプライマー、０．５ユニットのｒＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、ならびに３０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含有している、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用の１×緩衝液（TOYOBO）の総量２０μｌにおいて、増幅を実施した。ＰＣＲ増幅を、TGRADIENTサーモサイクラー（Biometra）を用いて以下のプログラムにしたがって実施した：２分にわたる９４℃における開始の変性、９４℃における３０秒、５８℃における３０秒、および７２℃における３０秒の、続く３５サイクル、ならびに７２℃における５分の最後のサイクル。

２５０ｎＭの２５６プライマーおよび４５３プライマー（以下を参照）、０．５ユニットのｒＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、ならびに１μｌの１回目のＰＣＲ産物を含有している、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用の１×緩衝液（TOYOBO）の総量２０μｌにおいて、第２組のＰＣＲを実施した。第２のＰＣＲに使用されたオリゴヌクレオチド配列は、２５６（５’−ＧＡＧＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＡＣ−３’、ＬＴＲ２５６−２７６）および４５３（５’−ＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＣＡＧ−３’、ＬＴＲ４２９−４５３）であり、以前に説明されている（非特許文献２３）。ＰＣＲ増幅を、TGRADIENTサーモサイクラー（Biometra）を用いて以下のプログラムにしたがって実施した：２分にわたる９４℃における開始の変性、９４℃における３０秒、５８℃における３０秒、および７２℃における３０秒の、続く３５サイクル、ならびに７２℃における５分の最後のサイクル。２％アガロースゲル電気泳動のために、５μｌのＰＣＲ産物を使用し、ＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド染色によって検出した。

〔ＢＬＶ−ＬＴＲ領域の増幅、クローニングおよびＤＮＡ配列決定〕
ＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲによってポジティブであったが、ネステッドＰＣＲによってネガティブであったサンプルのヌクレオチド配列を分析するために、ＢＬＶ感染したウシからのゲノムＤＮＡを、MightyAmp DNA polymerase Ver.2（TAKARA）、KOD plus Neo（TOYOBO）、およびTaqMan Universal Master Mix IIシステム（AB）を用いたＰＣＲによる増幅にかけた。ＢＬＶ−ＬＴＲ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーＢＬＴＲ５６Ｆ（５’−ＡＡＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡ−３’）、ＢＬＴＲ１３４Ｆ（５’−ＡＡＡＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧ−３’）、ＣｏＣｏＭｏ６、ＣｏＣｏＭｏ８１、およびＢＬＴＲ５４４Ｒ（５’−ＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＴＴＴ−３’）を、ＢＬＶプロウイルス配列のＬＴＲ領域を参照することによって設計した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングによってpGEM-T Easyベクター（Promega）によってサブクローニングし、ヌクレオチド配列を、標準的な手法を用いたサイクル配列決定によって決定した。

〔シンチチウム形成アッセイ〕
以前に説明されている手法（非特許文献１５、２２）にしたがってアッセイを実施した。ＣＣ８１細胞を、直径６ｃｍのディッシュにおいて７２時間にわたって成長させ、１×１０^５のＢＬＶ感染したＰＢＭＣとともにＲＰＭＩ１６４０培地においてインキュベートした。細胞を、May-Grunwald溶液において１０分にわたって固定し、Giemsa溶液を用いて１０分にわたって染色した。水を用いた洗浄後に、細胞を光学顕微鏡のもとに調べた。５を超える核を含んでいる細胞をシンチチウムとしてカウントした。

〔統計分析〕
R 2.10.1統計演算ソフトウェアを用いて、統計分析を実施した。複数の試験について、補正をともなった群のレベル間の対比較を算出するために、ペアｔ検定を使用した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。回帰分析を用いて、段階希釈法およびＢＬＶ−ＣｏＣｏＭｏ−ｑＰＣＲ法の間、ならびにシンチチウムカウントおよびプロウイルスのコピー数の間における相関を調べた。

〔Ｔａｂｌｅ〕

本発明は、上述の実施形態および実施例の記載に限定されず、特許請求の範囲の範囲内において当業者によって変更され得る。異なる実施形態に開示されている技術的手段の適切な組合せに基づく実施形態は、本発明の技術的範囲に包含されている。

本発明は、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用キット；およびその利用を提供する。

Claims

５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号１で示す塩基配列における連続する２０以上の塩基を含む第一のＰＣＲプライマーと、
５０塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号２で示す塩基配列における連続する２０以上の塩基を含む第二のＰＣＲプライマーとを含む、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用のキット。
４０塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号１で示す塩基配列における連続する２０以上で２５以下の塩基を含む上記第一のＰＣＲプライマーと、
４０塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号２で示す塩基配列における連続する２０以上で２５以下の塩基を含む上記第二のＰＣＲプライマーとを含む、請求項１に記載のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用のキット。
上記第一のＰＣＲプライマーは、配列番号１で示す塩基配列における連続する２５の塩基を全て含み、
上記第二のＰＣＲプライマーは、配列番号２で示す塩基配列における連続する２５の塩基を全て含む、請求項１又は２に記載のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用のキット。
上記第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーがいずれも、取りうる全プライマーの混合物としての縮重プライマーとして構成される、請求項１から３の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用のキット。
上記第一のＰＣＲプライマー及び第二のＰＣＲプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするＴaqMan（商標）プローブをさらに含む、請求項１から４の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用のキット。
上記ＴaqMan（商標）プローブは、配列番号３又は４で示す塩基配列を含む、請求項５に記載のウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用のキット。
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の検出方法であって、
請求項１〜６の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルス検出用のキットを用いて、ウシから取得した検査用サンプルにおけるＢＬＶ由来の遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む、検出方法。