JP5572276B2 - B型肝炎ウイルスのジェノタイプcのサブタイプの識別方法及びそのためのキット - Google Patents
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Description
以下、これについてさらに詳細に説明する。
材料
S遺伝子に関するPCR-RFLP(Mizokami M, Nakano T, Orito E, et al. Hepatitis B virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns. FEBS Lett 1999;450:66-71)により確認された結果とともに、プレS2領域産物に対するELISA(Usuda S, Okamoto H, Tanaka T, et al. Differentiation of hepatitis B virus genotypes D and E by ELISA using monoclonal antibodies to epitopes on the preS2-region product. J Virol Methods 2000;87:81-9; Usuda S, Okamoto H, Iwanari H, et al. Serological detection of hepatitis B virus genotypes by ELISA with monoclonal antibodies to type-specific epitopes in the preS2-region product. J Virol Methods 1999;80:97-112)によって決定された、HBV/Cを含む合計49例の血清を、日本の名古屋市立大学病院又は香港のクイーン・マリー病院に通院するHBV慢性保有者から得た。該研究のプロトコールは1975年のヘルシンキ宣言に適合し、該機関の倫理委員会に承認され、各HBV保有者からインフォームド・コンセントを得られた。HBV/Cサブタイプ間のSNPsを決定するために、DDBJ/EMBL/GenBankデータベースから得られた171例のHBV/Cの完全配列を比較した。
QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen社、独国ヒルデン)を用いて、100μLの血清から核酸を抽出した。HBV/Cの特異的決定のための新規方法は、hemi-nestedのプライマーを用いた二段階のPCRサイクルと、それに続くHBV/C東南アジア型又は極東アジア型に対して特異的な制限サイトのRFLPから成った。第一段階のPCRは、重複のないポリメラーゼ領域中のセンスプライマー(HBV964F: 5'-ATT AGA CCT ATT GAT TGG AAA GT-3' [nt 964-986])及びアンチセンスプライマー(HBV1272R: 3'-AGT ATG GAT CGG CAG AGG AG-5' [nt 1272-1253])を用いて行った。第二段階のPCRは、センスプライマー(HBV970F2: 5'-CCT ATT GAT TGG AAA GTA TGT CA-3' [nt 970-992])及びアンチセンスプライマー(HBV1272R)を用いて行った。型判別のために309bpの大きさの増幅産物の一部(5μg)を、5UのAseIで37℃にて、又はBstEIIで60℃にて、それぞれ1時間消化した。さらに、増幅産物の他の一部について、同様にNciIを用いて37℃で2時間消化を行った。これらの酵素の消化物を、3.0%(wt/vol)アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色して、紫外光下でそれらのサイズを確認した。
PCR-RFLPによる結果を確かめるために、コアプロモーター及びプレコア/コア領域を有するHBVのDNA配列を、既報の方法(Sugauchi F, Mizokami M, Orito E, et al. A novel variant genotype C of hepatitis B virus identified in isolates from Australian Aborigines: complete genome sequence and phylogenetic relatedness. J Gen Virol 2001;82:883-92)を僅かに改変した方法によって、hemi-nestedのプライマーを用いたPCRにより増幅した。すなわち、第一段階のPCRは、96ウェルサイクラー(GeneAmp 9700, Perkin-Elmer Cetus, カリフォルニア州ノーウォーク)にて、センスプライマー(HB7F-2: 5'-CAT GGA GAC CAC CGT GAA CGC-3' [nt 1607-1627])及びアンチセンスプライマー(HB8R-2: 5'-ATA GGG GCA TTG GTC T-3' [nt 23142299])を用いて40サイクル(94℃, 1分; 60℃, 1分; 72℃, 1分 [最終サイクルでは6分])行った。第二段階のPCRは、第一段階のPCRと同様の条件下で、センスプライマー(HB7F-2)及びアンチセンスプライマー(HB7R-2: 5'-CCT GAG TGC TGT ATG GTG AGG-3' [nt 20722052])を用いて35サイクル行った。PCR中のコンタミネーションを回避するための標準的な用心を注意深く実行し、特異性を確実にするため、各ランにおいてネガティブコントロール血清を含めた。その後、PCR産物をPrism Big Dye (Applied Biosystems, カリフォルニア州フォスターシティー)を用いて、ABI 3100 DNA自動シークエンサーにて直接的に配列決定した。
参照配列はDDBJ/EMBL/GenBankデータベース及びそれらの識別のためのアクセッション番号から検索した。HBVのヌクレオチド配列は、周知のCLUSTAL Xプログラム(Higgins D., Thompson J., Gibson T. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J.(1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680.に記載)により整列し、遺伝距離は肝炎ウイルスデータベース(http://s2as02.genes.nig.ac.jp/)中の6-パラメーター法で算出した。これらの値に基づき、中央ルーティング(mid-point rooting)オプションを用いた近隣結合法によってブートストラップ系統樹を作成した。なお、系統樹の作成に用いた、データベースに登録されている東南アジア分離株及び極東アジア分離株のGenBank Accession No.は次の通りであった。
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作成された系統樹を図2−1及び図2−2に示す。図2−1は、29例のHBV系統の完全なヌクレオチド配列を包含する系統樹である。8例のHBV/C東南アジア型及び8例のHBV/C極東アジア型系統(図1中)を、4例の他のHBV/C(C3及びC4)及び7遺伝子型(Aa, Ae, Ba, Bj, DH)で表される9例の他のHBV系統とともに比較した。
DDBJ/EMBL/GenBankデータベースから検索された34例のHBV/C東南アジア型及び137例のHBV/C極東アジア型から成る171例のHBV/C系統を完全ゲノムと比較したところ、2つのサブタイプ間で17箇所のSNPsが見つかった(表1)。それらのうち、重複のないポリメラーゼ領域中の5箇所のSNPsは次の制限酵素サイトを含んでいた;BstEIIサイト(nt1041のT(「T1041」と表記する)及びC1044);AseIサイト(A1050及びA1053);並びにNciIサイト(C1155)。興味深いことに、34例のHBV/C東南アジア型にはBstEIIサイト(G/GTNACC [nt 10391045])及び/又はAseIサイト(AT/TAAT [nt 10501055])があったが、137例のHBV/C極東アジア型にはBstEIIサイトもAseIサイトもいずれもなかった。その一方で、137例中128例(93%)のHBV/C極東アジア型にはNciIサイト(CC/SGG [nt 11541158])があり、HBV/C東南アジア型にはT1151のためにNciIサイトは存在しなかった。
HBV/C東南アジア型及びHBV/C極東アジア型の典型例各8例の配列を図1に示す;HBV/C東南アジア型はベトナム、タイ、ミャンマー、中国、香港から、HBV/C極東アジア型は日本、韓国から得られた。該16株のサブタイプは完全ゲノムの系統解析により確認した(図2-1)。T1041, C1044, A1050, A1053及びC1155の5箇所のSNPsを利用して、HBV/C東南アジア型及びHBV/C極東アジア型間の判別のために、3種のエンドヌクレアーゼによるRFLP法を開発した。HBV/C東南アジア型で増幅した309bpのサイズのPCR産物(nt 9641272)は、AseI消化により88bpと221bpの2断片に分かれ、又はBstEII消化により76bpと233bpの2断片に分かれた(図3)が、HBV/C極東アジア型での増幅断片は分かれなかった。対照的に、HBV/C極東アジア型で増幅した309bpの産物は、NciI消化により192bpと117bpの2断片に分離したが、HBV/C東南アジア型での増幅断片は分離しなかった。
HBV/C東南アジア型及びHBV/C極東アジア型のBCP及びキャプシド形成シグナル(ε)にわたる配列の整列化により、HBV/C東南アジア型及びHBV/C極東アジア型のnt1721, 1757, 1775, 1856及び1858における特異的置換が同定された(表2)。T1653, T1858, A1896及びA1899の置換の頻度はHBV/C東南アジア型よりもHBV/C極東アジア型において有意に高く、一方でA1727、T1856及びA1898の置換の頻度はHBV/C東南アジア型において高かった。BCPにおける二重変異(T1762/A1764)はいずれのサブタイプにおいても高い頻度で起きていた。興味深いことに、プレコア停止変異(A1896)は、A1896と塩基対を形成する、nt1858におけるCからTへの置換を伴うが、HBV/C極東アジア型においてのみ認められ(45/162、28%)、HBV/C東南アジア型においてはC1858のために該変異は認められなかった。他のプレコア変異(A1898)は、nt1856におけるCからTへの変異を伴うが、HBV/C東南アジア型において認められた(7/58、12%)(表3)。
Claims (11)
- B型肝炎ウイルスゲノムDNA中の166nt、312nt、400nt、1041nt、1044nt、1047nt、1050nt、1053nt、1155nt、1721nt、2065nt、2158nt、2559nt、2561nt、2633nt、2958nt及び3008ntから成る群より選ばれる少なくとも1つの部位における一塩基多型に基づいて、ジェノタイプCに属するB型肝炎ウイルスが東南アジア型か極東アジア型かを調べる方法。
- 複数の部位における一塩基多型に基づいてジェノタイプCに属するB型肝炎ウイルスが東南アジア型か極東アジア型かを調べる請求項1記載の方法。
- 1041nt、1044nt、1047nt、1050nt、1053nt及び1155ntから成る群より選ばれる少なくとも1つの部位における一塩基多型に基づいて、ジェノタイプCに属するB型肝炎ウイルスが東南アジア型か極東アジア型かを調べる請求項1又は2記載の方法。
- (1) 1041nt及び1044ntにおける一塩基多型、(2)1047 ntにおける一塩基多型又は(3) 1050nt及び1053ntにおける一塩基多型と、(4)1155ntにおける一塩基多型に基づいてジェノタイプCに属するB型肝炎ウイルスが東南アジア型か極東アジア型かを調べる請求項3記載の方法。
- 上記(1)又は(3)の一塩基多型と、上記(4)の一塩基多型を調べる請求項4記載の方法。
- BstEIIによりゲノムDNA断片の切断が生じるか否かにより上記(1)の一塩基多型を調べ、BseYIによりゲノムDNA断片の切断が生じるか否かにより上記(2)の一塩基多型を調べ、AseIによりゲノムDNA断片の切断が生じるか否かにより上記(3)の一塩基多型を調べ、NciIによりゲノムDNA断片の切断が生じるか否かにより上記(4)の一塩基多型を調べる、制限断片長多型法による請求項4記載の方法。
- BstEII又はAseIと、NciIとを用いる制限断片長多型法により上記(1)又は(2)の一塩基多型と上記(3)の一塩基多型とを調べる請求項6記載の方法。
- 1039nt〜1158ntを含む領域を核酸増幅法で増幅後、前記制限断片長多型法を行なう請求項6又は7記載の方法。
- 前記核酸増幅法が、nested PCR又はhemi-nested PCRである請求項8記載の方法。
- アミノ酸置換を伴う一塩基多型である、166nt、312nt、400nt、1721nt、2559nt、2561nt、2958nt及び3008ntから成る群より選ばれる少なくとも1つの部位における一塩基多型に起因するアミノ酸置換を免疫測定法により検出する、免疫測定法による請求項1記載の方法。
- 前記核酸増幅法に用いられるプライマーセットと、前記制限断片長多型法に用いられる制限酵素とを含む、請求項8又は9記載の方法を行なうためのキット。
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