CN104313185B - 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104313185B
CN104313185B CN201410597176.XA CN201410597176A CN104313185B CN 104313185 B CN104313185 B CN 104313185B CN 201410597176 A CN201410597176 A CN 201410597176A CN 104313185 B CN104313185 B CN 104313185B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
pcr
test kit
primer
quantitative fluorescent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410597176.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104313185A (zh
Inventor
王成明
杨奕
陆光武
杨章平
毛永江
郭伟娜
危蓝菁
张继垒
李静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201410597176.XA priority Critical patent/CN104313185B/zh
Publication of CN104313185A publication Critical patent/CN104313185A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104313185B publication Critical patent/CN104313185B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Abstract

本发明公开了一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，包括FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；所述上游引物具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述6-FAM探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列；所述LCRed640探针具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；所述标准阳性模板具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。本发明提供了一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的牛白血病的实时定量PCR的检测试剂盒。

Description

检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物科学技术领域，特别涉及一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测方法。
背景技术
牛白血病病毒Bovineleukemiavirus属于反转录病毒科Retroviridae、丁型反转录病毒属Deltaretrovims。该病毒粒子呈球形，有囊膜，病毒含单股RNA，能产生反转录酶，衣壳呈20面体对称。
牛白血病是由白血病病毒引起牛的一种慢性肿瘤性疾病，其特征为淋巴样细胞恶性增生，进行性恶病质和高度病死率。此病主要发生于牛、绵羊、瘤牛、水牛、水豚，已呈世界性分布，几乎遍及所有养牛的国家和地区。在中国的安徽、上海、江苏、广东、陕西、江西、新疆、北京、浙江、黑龙江等地都有发病的报道。本病可以水平传播和垂直传播，近年来证明吸血昆虫在本病传播上具有重要作用，被污染的医疗器械，如注射器和针头，可以起到机械传播本病的作用。病毒可以通过胎盘感染胎儿，这种感染主要发生在母牛怀孕6个月以后，感染本病的母牛所生的犊牛有3％-20％在出生时已被感染，同时，犊牛通过吸吮感染母牛的初乳也可被感染。本病有亚临床型和临床型两种表现。亚临床型无瘤的形成，其特点是淋巴细胞增生，部分可进一步发展为临床型。临床型的症状为病牛生长缓慢，体重减轻。腮淋巴结或股前淋巴结常显著增大，触摸时可移动。眶后淋巴结增大可引起眼球突出。出现临床症状的牛，通常均取死亡转归。病死牛尸体常消瘦，腮淋巴结、肩前淋巴结、股前淋巴结、乳房上淋巴结和腰下淋巴结常肿大，被膜紧张，呈均匀灰色，柔软，切面突出。心脏、皱胃和脊髓常发生浸润。心肌浸润常发生于右心房、右心室和心隔，色灰而增厚。循环扰乱导致全身性被动充血和水肿。脊髓被膜外壳里的肿瘤结节，使脊髓受压、变形和萎缩。皱胃壁因肿瘤浸润而增厚变硬。肾、肝、肌肉、神经干和其他器官亦可受损。
有研究表明，牛白血病病毒具有潜在的感染人类的风险，在人体中已经检测到了牛白血病病毒抗体；最新研究发现，女性乳腺癌患者中，44％患者的乳腺组织中检测到牛白血病病毒核酸。
目前牛白血病的检测方法主要有：(1)电镜检测。可取病牛外周血液淋巴细胞培养分离病毒，通过电镜方法检测。(2)血清学检测。应用最广泛的有琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验。(3)分子生物学检测。主要有聚合酶链反应PCR。
在电镜检测方法中，需要固定、脱干、垫入、分割和染色等步骤，耗时相对较长，且微生物品种繁多，容易产生误诊，对操作人员要求较高。在血清学检测方法中，检测的基础是抗原抗体的特异反应。如检测抗原，除了要求抗体，抗体为单抗或多抗，是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果；如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的限制而难以完全做到。因此，从某种意义上来说，血清学实验的假阳性和假阴性是不能完全避免的，从而影响了实验的准确性。PCR是目前在病原检测中最常用的方法。目前，已有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR等多种PCR方法应用于牛白血病的检测。然而，普通PCR需要结合琼脂糖凝胶电泳试验进行结果的判定，因而操作较为繁琐且耗时较长，从而达不到快速检测的效果。
至今，中国国内很少有用实时荧光定量PCR方法检测牛白血病。实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用。由于实时荧光定量PCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到的优势。
目前，缺乏一种检测灵敏度高的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种检测灵敏度高的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测方法。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：一种检测牛白血病的荧光定量PCR的FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；
所述上游引物具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；
所述下游引物具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；
所述6-FAM探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列；
所述LCRed640探针具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；
所述标准阳性模板具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。
本发明的一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包括：FRET-PCR引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、标准阳性模板、对照品；所述对照品为超纯水。
进一步地，所述标准阳性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探针对牛白血病前病毒DNA进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
进一步地，所述FRET-PCR引物的终始浓度为0.2μM；所述6-FAM探针的终始浓度为0.2μM；所述LCRed640探针的终始浓度为0.2μM。
更进一步地，所述热启动Taq酶的终始浓度为2.0U/20μL；所述dNTP的终始浓度为5μM；所述标准阳性模板的终始浓度为5ng；所述对照品的终始浓度为5ng。
本发明的一种牛白血病的荧光定量PCR的扩增检测体系，所述扩增检测体系包括20μl的PCR扩增检测体系：DNA模板或者定量标准试剂10μl、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶和200μMdNTP。
本发明所述的试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法，在孔板中加入试剂，加样完毕后，将孔板放入系统中，设置反应条件为：预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；
预变性：1*2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6*1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9*1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3*1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；
30个欠严谨的荧光获得循环：30*1sec95℃,30sec56℃(在此收集荧光),30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1*1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；1个降温循环：1*1sec38℃。
进一步地，所述孔板为96孔板，所述系统为罗氏系统；加入检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒10μl，所述试剂盒包括1xPCR缓冲液、1μMFRET-上游引物、1μMFRET-下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶、200μMdNTP、超纯水，10μl样品DNA模板或者定量试剂。
本发明所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒在检测牛白血病的应用。
有益效果：本发明提供了一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的牛白血病的实时定量PCR的检测试剂盒。利用该试剂盒，可以对牛、绵羊、水牛全血样品以及牛奶、羊奶样品中病毒的核酸片段进行荧光定量PCR检测，筛选出牛白血病病毒DNA阳性动物。本发明具有如下优点：
(1)本发明可以特异性地检测牛白血病DNA。本发明依托牛白血病病毒DNA序列，选择相对保守的区间巧妙的设计一对引物和探针检测牛白血病病毒。
(2)本发明具有较高的灵敏度，单个反应系统可以扩增10个拷贝的牛白血病病毒DNA。对牛白血病病毒早期感染的筛查诊断有显著意义。
(3)本发明操作便捷，适合于检测大量样本。在实际应用中，如流行病学调查或检测大量送检样品，对于普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳等方法需要极大的工作量。而本发明可以从大量样本中筛选出含有牛白血病病毒核酸的样本，从而判断出被感染的动物。
附图说明
图1是本发明的荧光定量PCR上游引物的示意图；
图2是本发明的荧光定量PCR下游引物的示意图；
图3是本发明的荧光定量PCR6-FAM探针示意图；
图4是本发明的荧光定量PCRLCRed640探针示意图；
图5牛全血样品PCR扩增曲线的示意图；
图6牛全血样品PCR溶解曲线的示意图；
图7牛奶样品PCR扩增曲线的示意图；
图8牛奶样品PCR溶解曲线的示意图；
图9本发明的荧光定量PCR敏感性测试扩增曲线示意图；
图10本发明的荧光定量PCR敏感性测试统计结果示意图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
如图1至图10所示，本发明的一种检测牛白血病的荧光定量PCR的FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；
所述上游引物具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；
所述下游引物具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；
所述6-FAM探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列；
所述LCRed640探针具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；
所述标准阳性模板具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。
本发明的一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包括：FRET-PCR引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、标准阳性模板、对照品；所述对照品为超纯水。
所述标准阳性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探针对牛白血病前病毒DNA进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
所述FRET-PCR引物的终始浓度为0.2μM；所述6-FAM探针的终始浓度为0.2μM；所述LCRed640探针的终始浓度为0.2μM。
所述热启动Taq酶的终始浓度为2.0U/20μL；所述dNTP的终始浓度为5μM；所述标准阳性模板的终始浓度为5ng；所述对照品的终始浓度为5ng。
本发明的一种牛白血病的荧光定量PCR的扩增检测体系，所述扩增检测体系包括20μl的PCR扩增检测体系：DNA模板或者定量标准试剂10μl、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶和200μMdNTP。
本发明所述的试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法，在孔板中加入试剂，加样完毕后，将孔板放入系统中，设置反应条件为：预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；
预变性：1*2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6*1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9*1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3*1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；
30个欠严谨的荧光获得循环：30*1sec95℃,30sec56℃(在此收集荧光),30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1*1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；1个降温循环：1*1sec38℃。
所述孔板为96孔板，所述系统为罗氏系统；加入检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒10μl，所述试剂盒包括1xPCR缓冲液、1μMFRET-上游引物、1μMFRET-下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶、200μMdNTP、超纯水，10μl样品DNA模板或者定量试剂。
本发明提供了一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的牛白血病的实时定量PCR的检测试剂盒。利用该试剂盒，可以对牛、绵羊、水牛全血样品以及牛奶、羊奶样品中病毒的核酸片段进行荧光定量PCR检测，筛选出牛白血病病毒DNA阳性动物。本发明具有如下优点：
(1)本发明可以特异性地检测牛白血病DNA。本发明依托牛白血病病毒DNA序列，选择相对保守的区间巧妙的设计一对引物和探针检测牛白血病病毒。
(2)本发明具有较高的灵敏度，单个反应系统可以扩增10个拷贝的牛白血病病毒DNA。对牛白血病病毒早期感染的筛查诊断有显著意义。
(3)本发明操作便捷，适合于检测大量样本。在实际应用中，如流行病学调查或检测大量送检样品，对于普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳等方法需要极大的工作量。而本发明可以从大量样本中筛选出含有牛白血病病毒核酸的样本，从而判断出被感染的动物。
实施例1
奶牛全血样品牛白血病病毒DNA检测
(1)样品DNA的提取
奶牛全血样品为EDTA真空采血管采集，取200μl，用商品化试剂盒罗氏HighPurePCRTemplatePreparationKit提取核酸，稀释到200μl。
(2)样品检测
在96孔板中加入荧光定量PCR混合试剂10μl(包含1xPCR缓冲液、1μMFRET-上游引物、1μMFRET-下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶、200μMdNTP、超纯水)，10μl样品DNA模板或者定量试剂。操作中注意无菌、避光。加样完毕后，将96孔板放入罗氏系统中，设置反应条件为：预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环。预变性：1*2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6*1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9*1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃；3*1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；30个欠严谨的荧光获得循环：30*1sec95℃,30sec56℃(在此收集荧光),30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1*1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；降温循环：1*1sec38℃。
检测结果如图5和图6所示，93份奶牛全血核酸样品中，标准阳性模板9份，阴性样品84份，标准阳性模板呈阳性，阴性对照呈阴性，空白孔呈阴性。
如图1至图4所示，从GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取如下牛白血病病毒的基因序列后，用ClustalMultipleAlignmentAlgorithm的方法对所有序列进行比对：Bovineleukemiavirus(AF257515),Bovineleukemiavirus(D00647),Bovineleukemiavirus(EF600696),Bovineleukemiavirus(FJ914764),Bovineleukemiavirus(HE967301),Bovineleukemiavirus(HE967303),Bovineleukemiavirus(K02120),Bovineleukemiavirus(NC001414),Bovineleukemiavirus(AF033818),Bovineleukemiavirus(HE967302),Bovineleukemiavirus(M10987)。据此，设计的定量FRET-PCR引物和探针。
本发明选择牛白血病前病毒DNA的gag基因作为目标基因，并选择其相对保守的区域设计引物和探针。总体的思路是：巧妙地设计FRET-qPCR的引物和探针，可以特异地扩增牛白血病病毒的核酸，从而快速地从大量样本中的判断出牛白血病DNA标准阳性模板。
上游引物：5'-CCTCAATTCCCTTTAAACTAGAACG-3'
下游引物：5'-ATGGGCTTTGTAAGAGCATTTGTA-3'
6-FAM探针:5'-GACGGGCCAGGCAATAATCCAGT-6-FAM-3'
LCRed640探针：5'-LCRed640-TTCCCGGTACGGAAACCAAATGG-磷酸-3'
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：样品性质由血液样品变为乳液样品。
牛奶样品牛白血病病毒检测
(1)样品DNA的提取
牛奶样品为50ml无菌离心管采集，取10ml牛奶样品加入15ml离心管中，使用冷冻离心机，10℃，5,000g，10分钟。弃去脂肪层和悬浮层，沉淀物用PBS匀速吹打15分钟。
(2)检测结果
如图7和图8所示，50份牛奶核酸样品中，标准阳性模板7份，阴性样品43份，标准阳性模板呈阳性，阴性对照呈阴性，空白孔呈阴性。
实施例3
如图9和图10所示，本发明的检测牛白血病病毒DNA的敏感性试验。将计数后的牛白血病病毒DNA阳性质粒酶切后稀释到1*105拷贝/μL,1*104拷贝/μL,1*103拷贝/μL,1*102拷贝/μL,10拷贝/μL,1拷贝/μL，从每个浓度DNA中取10μL用荧光定量PCR试剂盒进行检测，每个反应做3个平行反应孔，同时设阴性对照。通过6个浓度梯度的质粒DNA的荧光PCR反应，并作出标准曲线，如图9、图10所示。图9所示，所有稀释梯度的阳性质粒均能被检出，各梯度的扩增曲线紧密。图10所示，Ct值和稀释度的线性关系统计图中，R2＝0.9702，回归效果显著。
实施例4
本发明的检测牛白血病病毒DNA的试剂盒的重复性试验。以1*105/μL浓度的标准质粒作为起始模板，并以10倍梯度稀释成4个不同梯度(1*104/μL,1*103/μL,1*102/μL)，重复10次反应，结果见下表1。
表1
其中，CV＝s/x，重复性测量结果显示，所有稀释梯度下Ct值变异系数CV均在0.77～2.75％，表明本检测系统对阳性质粒检测的重复性较好，则表示该检测系统适宜形成具有良好重复性的试剂。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，包括FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，其特征在于：所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；
所述上游引物具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；
所述下游引物具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；
所述6-FAM探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列；
所述LCRed640探针具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；
所述标准阳性模板具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。
2.一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：如权利要求1中所述的FRET-PCR引物、6-FAM探针、LCRed640探针和标准阳性模板，以及PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、对照品；所述对照品为超纯水。
3.根据权利要求2所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于:所述标准阳性模板是由所述的FRET-PCR引物对牛白血病前病毒DNA进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。
4.根据权利要求2所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于:所述FRET-PCR引物的终始浓度为0.2μM；所述6-FAM探针的终始浓度为0.2μM；所述LCRed640探针的终始浓度为0.2μM。
5.根据权利要求4所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于:所述热启动Taq酶的终始浓度为2.0U/20μL；所述dNTP的终始浓度为5μM；所述标准阳性模板的终始浓度为5ng/μL。
6.一种牛白血病的荧光定量PCR的扩增检测体系，其特征在于：所述扩增检测体系包括20μl的PCR扩增检测体系：DNA模板或者如权利要求1所述的标准阳性模板10μl、1xPCR缓冲液、1μM如权利要求1所述的上游引物、1μM如权利要求1所述的下游引物、0.2μM如权利要求1所述的6-FAM探针、0.2μM如权利要求1所述的LCRed640探针、2个单位的Taq酶和200μMdNTP。
7.如权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒,其特征在于，利用所述试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法如下：在孔板中加入试剂，加样完毕后，将孔板放入系统中，设置反应条件为：预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；
预变性：1*2min95℃；18个温度递减的高严谨循环：6*1sec95℃,12sec70℃，8sec72℃；9*1sec95℃，12sec68℃，8sec72℃3*1sec95℃，12sec66℃,8sec72℃；
30个欠严谨的荧光获得循环：30*1sec95℃,30sec56℃，在此收集荧光,30sec67℃,and30sec72℃；1个熔解循环：1*1sec95℃,10sec38℃，85℃持续收集荧光；1个降温循环：1*1sec38℃。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，在利用所述试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法中，所述孔板为96孔板，所述系统为罗氏480Ⅱ系统；加入检测牛白血病的荧光定量PCR混合试剂10μl，所述PCR混合试剂包括1xPCR缓冲液、1μM如权利要求1所述的FRET-上游引物、1μM如权利要求1所述的FRET-下游引物、0.2μM如权利要求1所述的6-FAM探针、0.2μM如权利要求1所述的LCRed640探针、2个单位的Taq酶、200μMdNTP、超纯水，且还加入10μl样品DNA模板或者定量试剂。
CN201410597176.XA 2014-10-30 2014-10-30 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法 Active CN104313185B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410597176.XA CN104313185B (zh) 2014-10-30 2014-10-30 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410597176.XA CN104313185B (zh) 2014-10-30 2014-10-30 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104313185A CN104313185A (zh) 2015-01-28
CN104313185B true CN104313185B (zh) 2016-02-24

Family

ID=52368493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410597176.XA Active CN104313185B (zh) 2014-10-30 2014-10-30 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104313185B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108330214A (zh) * 2018-04-26 2018-07-27 石河子大学 快速检测牛白血病前病毒的rpa引物及试剂和试剂盒
CN109182602A (zh) * 2018-09-28 2019-01-11 山东畜牧兽医职业学院 牛白血病毒快速检测方法
CN110564867B (zh) * 2019-10-10 2022-06-24 扬州大学 一种秦川牛cfl1基因的snp分子标记及其检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053666A1 (en) * 2010-10-21 2012-04-26 Riken Kit for detecting bovine leukemia virus(blv), and use thereof
CN103045762A (zh) * 2012-12-31 2013-04-17 上海市动物疫病预防控制中心 一种检测牛白血病病毒前dna的试剂盒及其应用
WO2014027663A1 (ja) * 2012-08-14 2014-02-20 独立行政法人理化学研究所 ウシ白血病ウイルス検出用プライマーセット、及びその利用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053666A1 (en) * 2010-10-21 2012-04-26 Riken Kit for detecting bovine leukemia virus(blv), and use thereof
WO2014027663A1 (ja) * 2012-08-14 2014-02-20 独立行政法人理化学研究所 ウシ白血病ウイルス検出用プライマーセット、及びその利用
CN103045762A (zh) * 2012-12-31 2013-04-17 上海市动物疫病预防控制中心 一种检测牛白血病病毒前dna的试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
牛白血病前病毒Taqman荧光PCR检测方法的建立;李凯航，等;《上海畜牧兽医通讯》;20140131(第1期);第383-387页 *
牛白血病病毒LUXTM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立;刘志玲，等;《中国预防兽医学报》;20090531;第31卷(第5期);第12-13页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104313185A (zh) 2015-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pirmez et al. Use of PCR in diagnosis of human American tegumentary leishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil
CN109593893A (zh) 非洲猪瘟病毒荧光pcr快速检测试剂盒
Mugasa et al. Nucleic acid sequence-based amplification with oligochromatography for detection of Trypanosoma brucei in clinical samples
Gutierrez et al. Camel trypanosomosis in the Canary Islands: assessment of seroprevalence and infection rates using the card agglutination test (CATT/T. evansi) and parasite detection tests
CN103074448B (zh) 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法
CN110358867A (zh) 非洲猪瘟病毒荧光型raa检测试剂盒
CN103074449B (zh) 一种同步检测十三种腹泻病毒的试剂盒及其检测方法
CN109576397B (zh) 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒
Zhang et al. Development and application of diagnostics in the National Schistosomiasis Control Programme in the People's Republic of China
WO2020125246A1 (zh) 检测乙型肝炎病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN104313185B (zh) 检测牛白血病的荧光定量pcr的试剂盒及其检测方法
CN110283935A (zh) 一种非洲猪瘟病毒lamp检测试剂盒及其应用
CN103074452A (zh) 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法
CN102140549A (zh) 腺病毒实时荧光定量pcr试剂盒
CN105463131B (zh) 人博卡病毒lamp检测试剂盒
CN108315481A (zh) 一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒
WO2020125295A1 (zh) 检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法
CN102337352B (zh) 一种pcr微阵列检测多种流感病毒的试剂盒
Barlič‐Maganja et al. Comparison of the efficiency and sensitivity of virus isolation and molecular methods for routine diagnosis of infectious haematopoietic necrosis virus and infectious pancreatic necrosis virus
RUSENOVA et al. Comparison between four laboratory tests for routine diagnosis of enzootic bovine leukosis
CN105441588A (zh) 登革热ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型rt-pcr一步mix检测试剂盒及其检测方法
CN106011314B (zh) 一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN111593137A (zh) 非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测试剂和试剂盒
Agarwal et al. Analysis of diagnostic methods and their sensitivity test for Mycobacterium tuberculosis
CN111579779B (zh) 用于评估乙型肝炎患者免疫细胞功能的标志物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant