CN108330214A

CN108330214A - 快速检测牛白血病前病毒的rpa引物及试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN108330214A
Application number: CN201810382928.9A
Authority: CN
Inventors: 乔军; 孟庆玲; 张星星; 张国武; 李�杰; 王力霞; 蔡扩军; 乔梦凡; 伍晔晖; 李静; 刘昱成; 陈双庆; 王熙凤
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明公开了一种快速检测牛白血病前病毒的RPA引物及试剂和试剂盒。本发明的RPA引物，其上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。本发明釆用重组酶聚合酶扩增‑免疫侧流层析检测技术(RPA‑LFA)技术建立了BLV感染的可视化快速检测体系，通过对BLV核酸样品的检测，证实筛选的BLV RPA可视化检测引物具有很高的特异性和敏感性。与现有技术相比，本发明为牛BLV感染的分子诊断提供了一个快速、简便、准确的检测试剂，特别是具有对仪器设备要求低，只需要一个恒温水浴锅，检测速度快，约40min即可，检测结果可视化，直接用肉眼即可观察等优点。

Description

快速检测牛白血病前病毒的RPA引物及试剂和试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种可视化检测牛白血病前病毒核酸的RPA引物及其应用，特别是一种快速检测牛白血病前病毒的RPA引物及试剂和试剂盒。

技术背景

牛白血病(Bovine leukaemia，BL)又称地方流行性牛白血病，是由牛白血病病毒(Bovine leukaemia virus，BLV)引起牛的一种慢性肿瘤性疾病，其特征为淋巴样细胞恶性增生、进行性恶病质和较高的死亡率。1878年，德国首先发现了该病，直到1969年美国Miller等人从病牛中分离到该病毒。随后，该病在丹麦、日本、法国、韩国、俄罗斯、意大利、智利、波兰、伊朗、泰国、澳大利亚、比利时、乌拉圭等国家和地区陆续被发现，部分地区感染率可达12％。目前，该病已几乎遍及全世界所有的养牛国家，世界动物卫生组织(OIE)已将其列为B类动物传染病，我国将其列为二类传染病。

1974年，在我国上海首次发现该病。1990年后，在我国安徽、江苏、陕西、北京、甘肃和江西等地区都出现了该病，而且有逐渐扩大蔓延的趋势。吴玉石等(2008)用研制的BLVregp51-ELISA试剂盒对采集于山东济南164份奶牛血清和澳大利亚进口奶牛398份血清进行了检测，血清抗体阳性率分别6.10％和4.77％。李凯航等(2011)对上海市规模化养牛场牛群牛白血病进行了血清学调查，血清阳性率为11.3～32.0％。师庆杰等(2014)用美国IDEXX公司生产的BLVgp51蛋白单克隆抗体阻断ELISA检测试剂盒对黑龙江省内8个地区的12个规模化奶牛场进行牛白血病血清学调查，血清阳性率为9.76％。曹向英等(2017)应用ELISA法对上海市松江区2个牛场进行了牛白血病血清学监测，血清阳性率为30.0％，证实上海地区BLV感染非常普遍。马剑钢等(2017)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对西北地区的1584份牦牛血清样品进行了检测，结果牦牛BLV血清抗体阳性率为21.09％。尽管牛白血病的病死率不高，但是牛感染BLV后会出现消瘦、贫血、体表的多个部位淋巴结肿胀。同时，BLV感染后引起的卵巢肿瘤还会导致不孕，影响奶牛的生产水平和繁殖性能，成为危害奶牛养殖业的重要传染病之一。

BLV属于C型致瘤病毒群反转录病毒科(Retroviridae)致瘤病毒亚科(Oncoviridae)丁型反转录病毒属的单股RNA病毒，该病毒常以前病毒(Provirus)的形式整合在宿主细胞的染色体上。BLV基因组全长8710-8720个核苷酸，在其基因组两端各含有一个530nt的长末端序列(5’-LTR和3’-LTR序列)；基因组由5’端至3’端排列顺序依次为：结构群特异性抗原基因(gag)、聚合酶基因(pol)、囊膜基因(env)、共有序列(U3)。此外，BLV基因组上还含有Tax和Rex两个辅助调控基因。env基因位于BLV基因组上第3个开放读码框，该基因序列较为保守，变异率为2-6％。env基因编码gp51和gp30两个糖蛋白，这两个糖蛋白均位于BLV囊膜上，其中gp51是BLV重要抗原之一，可以刺激机体产生相应的抗体。抗原表位分析发现，gp51由8个抗原决定簇构成，分别为A、B、C、D、E、F、G、H，其中A、B、C、D、E位于病毒蛋白内部，不能被自然感染产生的抗体识别，而F、G、H则能被自然感染产生的抗体识别。gp51蛋白含有第122～234和255～310两个高度保守的氨基酸序列，其突变位点主要集中在N端，C端也有少数氨基酸发生突变，一般局限于第235～254氨基酸。gp30蛋白含有5个主要的变异位点(第304、403、404、479和480氨基酸)。目前，根据env基因序列的同源性，全世界BLV不同地域流行株至少可以分为G1到G10十个基因型。

BLV可以感染不同的免疫细胞群，包括CD5⁺IgM⁺和CD5⁺IgM^-B淋巴细胞；CD2⁺、CD3⁺、CD4⁺、CD5⁺和γ/δT淋巴细胞、单核细胞和外周血和淋巴组织中的粒细胞，主要通过出芽增殖方式进行增殖，从细胞表面出芽并释放，然后感染新的细胞。BLV在自然条件下只感染牛、水牛、绵羊和水豚，但鹿、兔、大鼠、豚鼠、猫、狗、猴、羚羊和猪等多种动物人工接种也可发生感染。该病地方流行型以4～8岁奶牛多发。多数感染牛不呈现临床症状，但在血液中存在BLV抗体，并出现持续性淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞。BLV感染引起肿瘤后，引起体表、颈浅淋巴结及内脏淋巴结肿大。直肠检查可触摸到肿大的内脏淋巴结。由于肿瘤部位机械性损伤和压迫作用，病牛出现食欲不振、体重减轻、发育不良、全身乏力、泌乳性能显著降低、可视黏膜苍白或黄染、前胃弛缓和瘤胃臌气等症状。

BLV的传播方式主要包括垂直传播和水平传播两种。BLV垂直传播是指病毒从母代通过胎盘而传到新生代的传播，主要包括子宫内传播和胚胎移植传播。一般情况下，感染母牛通过胎盘直接将病毒传至胎儿的发生率不高，但在感染严重的牛群，子宫感染的发生率较高，BLV可经胎盘直接传播。胚胎移植传播是近年来该病快速传播的一个重要途径，携带BLV的冷冻胚胎可引起BLV的快速垂直传播。BLV的水平传播则由BLV污染的器械、采血、注射、手术、人工输精、生物制剂的应用、吸血昆虫的叮咬等而传染。新生犊牛吃带病毒母牛的初乳、常乳及其制品等也可感染发病。

当牛感染BLV后，根据临床表现可分为亚临床型和临床型，亚临床型主要表现为淋巴细胞增生，但无肿瘤的形成，对牛的健康影响不大，但亚临床型也可发展为临床型；临床型主要表现为生长缓慢，消瘦，引起淋巴细胞恶性增生、进行性恶病质，发病后死亡率高。

BL是一种传染性较强的病毒性疾病，目前尚无有效的治疗方法或疫苗，对感染牛只能隔离或淘汰，因此对牛群进行定期检疫至关重要。然而，BLV感染后一般不出现典型的临床症状，因此该病的诊断主要依赖于实验室检测方法。

目前，实验室常用BLV检测方法包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测。病原学检测一般采用原代胎牛肺(FBL)细胞或者胎羊肾细胞(FLK)来分离病毒，但初次分离培养时间较长，病毒分离培养比较困难。血清学检测常用的方法包括琼脂扩散试验(AGID)和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BLV糖蛋白gp51的抗体，因其在感染早期出现且持续的时间较长。AGID是一种特异性和敏感性较低的血清学检测方法，虽然其操作简便，但其敏感性较差，且易与其他不同种类的微生物发生交叉反应，出现假阳性结果，不适用于大规模临床样品的检测。ELISA是一种特异性和敏感性较高的血清学检测方法，然而国外商品化的试剂盒价格昂贵，目前国内尚没有商品化的试剂盒，限制了其在临床上的广泛应用。

PCR扩增是一种常用的分子生物学检测方法，由于其简单、快速、敏感且能够特异扩增病原的核酸，已广泛用于病原微生物的检测。目前，许多研究者采用聚合酶链反应建立了检测BLV前病毒核酸的分子检测方法，靶向BLV病毒基因组gag、pol和env基因保守区域的引物已被设计和应用。用PCR检测BLV前病毒核酸时，可采集发热期病牛的血液，提取全血DNA，用BLV特异性引物进行体外DNA扩增；若PCR检测为阳性，即可确诊。常用于BLV PCR检测的靶基因有env、gag和pol基因等，其中env基因保守性最高，不但可用于检测BLV，还可以用来鉴别BLV毒株的基因型。此外，有学者建立了基于env基因(或gp51基因)引物的套式PCR(nested PCR)检测方法，证实该方法具有高度的特异性和敏感性。

然而，PCR和套式PCR方法也存在不足之处，如需要专门的技术和设备，仅适用于拥有良好仪器设备的实验室，限制了其在基层实验室的使用和推广。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是近年来发明的一种新型核酸体外恒温扩增技术。RPA技术的工作原理是通过使用重组酶与引物结合形成的复合物，在模板上寻找同源序列，定位后就会引发链交换反应并启动DNA合成，对模板上的靶序列进行指数式扩增。RPA技术可在25-42℃恒温条件下快速完成核酸扩增，产物可通过探针法荧光定量进行实时监测。与PCR方法相比，RPA检测方法具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应时间短、不需贵重仪器等优点，在现场快速检测中实用性更强，目前已经用于许多病原微生物的检测中。

因此，一种具有高度的敏感性的特异性引物及由该引物构成的快速、简便、准确的牛白血病前病毒感染的分子诊断的检测试剂和试剂盒就应运而生。

发明内容

本发明的目的是提供一种可视化检测牛白血病前病毒核酸的RPA引物及其应用，特别是一种快速检测牛白血病前病毒核酸的RPA引物及试剂和试剂盒。

本发明的RPA引物，其上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。

本发明釆用重组酶聚合酶扩增-免疫侧流层析检测技术(RPA-LFA)技术建立了BLV感染的可视化快速检测体系，通过对BLV核酸样品的检测，证实筛选的BLV RPA可视化检测引物具有很高的特异性和敏感性。

首先通过重组酶聚合酶扩增技术(RPA)对BLV核酸进行扩增，将RPA的上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，因此当RPA扩增结果为阳性时，RPA产物可与胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG结合，继续扩散后又与检测线上包被的亲和素发生结合，因此在NC膜的检测线(T线)上会出现特异性的胶体金条带；随着胶体金标记的鼠抗地高辛单克隆抗体IgG的迁移，会与质控线上包被的羊抗鼠IgG结合，在质控线(C线)也会出现条带。当RPA扩增结果为阴性时，上游引物会被胶体金标记抗地高辛抗体所吸收，下游引物虽然能与亲和素发生结合，但没有携带胶体金颗粒，因此在NC膜的检测线(T线)上不出现胶体金条带；同时随着胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG复合物的迁移，会与羊抗鼠IgG结合，因此在质控线(C线)上会出现条带。

本发明首先通过对GenBank中登录的42个BLV不同地域流行毒株env基因进行序列比对，筛选出高度保守基因片段为扩增的靶片段；根据RPA引物设计原则设计了若干对RPA特异性引物，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，通过对BLV核酸进行RPA扩增试验，从中筛选出特异性高、敏感性强的RPA引物，其上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。

进一步地，将胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体铺在结合垫上，硝酸纤维素膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被羊抗鼠IgG，配合加样垫和吸收垫组装成LFA试纸条，将RPA产物滴加于LFA试纸条加样垫上，实现BLV核酸的RPA-LFA可视化检测。

经分别对牛乳头瘤病毒(Bovine papilloma virus，BPV)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(Bovineviral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenza virus type 3，BPIV-3)和口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)等病毒的核酸样品进行扩增，证实所筛选的BLV RPA-LFA可视化检测引物具有很高的特异性。

进一步地，可将上述的LFA试纸条制成试剂盒。

胶体金标记抗体的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，将胶体金溶液加入试管中，加入小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG，恒温缓慢振荡后离心处理，弃去上清液，沉淀溶解于Tris-HCL缓冲溶液中，即得到胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG。

制备RPA-LFA试纸条：RPA-LFA试纸条从结构上分为5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和PVC塑料垫，硝酸纤维素膜上设置有检测线(T线)和质控线(C线)。

将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG均匀喷涂到一NC膜上，干燥后作为结合垫(金标垫)。

在硝酸纤维素膜(NC膜)检测线(T线)上包被经PBS缓冲液稀释至后的链霉亲和素(Streptavidin)，质控线(C线)上包被羊抗鼠IgG，干燥。

组装的顺序分别为：在PVC塑料垫的中间区域先贴上硝酸纤维素膜，结合垫贴在硝酸纤维素膜的前方区域，为保证良好的接触，结合垫压硝酸纤维素膜1-3mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1-3mm，最后将吸水垫贴在硝酸纤维素膜的后方，吸水垫压硝酸纤维素膜1-3mm。将试纸板切切割为2-5mm的试纸条。将制备好的试纸条置于放有干燥剂的锡箱袋内，4℃保存备用。

与现有技术相比，本发明利用可视化、快速检测BLV前病毒核酸的RPA检测引物，为牛BLV感染的分子诊断提供了一个快速、简便、准确的检测试剂，特别是具有对仪器设备要求低，只需要一个恒温水浴锅，检测速度快，约40min即可，检测结果可视化，直接用肉眼即可观察等优点。

附图说明

图1为BLV RPA-LFA检测试纸条的组装示意图。

图2为RPA对BLV核酸样品检测结果。

图中：1：以BLV核酸样品(pT-env)为模板的RPA阴性检测结果；2：以BLV核酸(pT-env)为模板的RPA阳性检测结果；M:DNA marker(DL-2000)。

图3为RPA-LFA对BLV核酸样品检测结果。

图中：1，3：以BLV核酸样品(pT-env)为模板的RPA-LFA阴性检测结果；2：以BLV核酸样品(pT-env)为模板的RPA-LFA阳性检测结果。

图4为套式PCR方法对BLV env基因的扩增结果

图中：1-3:BLV env基因的扩增结果(1：1×10³拷贝/μL重组质粒pT-env；2：1×10²拷贝/μL重组质粒pT-env；3：1×10^:1拷贝/μL重组质粒pT-env)。

图5为表1，为本发明设计的检测BLV前病毒核酸的特异性引物。

具体实施方式

本发明利用可视化、快速检测BLV前病毒核酸的RPA检测引物主要通过以下过程得到：

1、BLV感染牛外周血单核细胞(PBMC)DNA的提取分离

2、BLV env基因的合成及其重组质粒的构建核酸的提取

3、BLV env基因重组质粒拷贝数的确定

4、BLV RPA引物的设计与与合成

5、BLV RPA反应体系的配制及操作步骤

6、BLV RPA-LFA检测方法的建立及操作步骤

7、BLV RPA-LFA检测方法结果判定

8、BLV RPA检测引物的特异性评价

9、BLV RPA检测引物的敏感性评价

1、BLV感染牛外周血单核细胞(PBMC)DNA的提取分离

对BLV感染阳性牛进行静脉采血50ml，用肝素抗凝。采用牛淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMC)，用血细胞计数器对分离的PBMC进行计数，然后用DNA提取试剂盒提取PBMC的基因组DNA，保存在无水乙醇中，待用。

2、BLV env基因的PCR扩增及其重组质粒的构建

根据GenBank中登录的BLV env基因(参考序列USCA-2株，Genbank登录号为LC080655.1)，下载env基因序列，设计特特异性引物，通过PCR技术扩增env全长基因。将扩增的全长基因克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-env。将pT-env质粒转化至感受态细胞DH5α，通过PCR和测序对构建的重组质粒进行验证。结果PCR扩增可得到与预期大小一致的1548bp特异性条带；对扩增产物测序结果表明，该序列与BLV USCA-2株(GenBank登录号为LC080655.1)env基因的同源性可达99.98％。将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度。经测定，重组质粒pT-env浓度为80ng/μL。

3、BLV env基因重组质粒拷贝数的确定

根据下列公式，计算重组质粒pT-env拷贝数：拷贝数(copies/μL＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/(质粒碱基数×660)。提取重组质粒pT-env的浓度为80ng/μL，重组质粒的碱基数为4140bp(1548bp+2692bp)，经计算得知提取质粒的拷贝数为1.76×10¹⁰拷贝/μL。经系列倍比稀释，将pT-env质粒拷贝数稀释在1×10⁸～10⁰拷贝/μL之间。

4、BLV RPA引物的设计与合成

下载GenBank公布的42个BLV不同地域的流行株env基因序列(pvAN015株，AP018032.1；pvAF746株，AP018015.1；pvAF193株，AP018008.1；pvAN006株，AP018026.1；pvAN004株，AP018025.1；pvAF293株，AP018011.1；pvAF266株，AP018010.1；pvAF060株，AP018006.1；K77株，KX674370.1；K46株，KX674369.1；pBLV-FLK株，LC164083.1；pvAN013株，AP018030.1；K61株，KX674368.1；K36株，KX674367.1；asun5株，LC080652.1；asun1株，LC080651.1；JPMI-1株，EF065660.1；JPKA-2株，EF065659.1；JPEH-2株，EF065653.1；CRAS-3株，EF065637.1；141株，AF547184.2；FLK-BLV株，M35242.1；pvAN003株，AP018024.1；JOTK株，AB987702.1；par7株，LC080653.1；#469株，LC005616.1；LS3株，HE967303.1；USWI株，EF065642.1；pvAF438株，AP018012.1；VdM株，M35239.1；485株，AY151262.2；par17株，LC080655.1；USCA-2株，EF065648.1；384株，AF399704.3；mon17株，LC080660.1；por108株，LC080675.1；lima40株，LC080654.1；JPFU株，EF065650.1；por57株，LC080670.1；Arg41株，FJ914764.1；CRAG-1株，EF065645.1；CRGC株，EF065639.1)，通过Blast N和DNAMAN软件对BLV env基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列。

参考RPA引物设计的基本原则，使用Primer 5.0软件设计了6对特异性引物(RPAFP1-RP1、RPA FP2-RP2、RPA FP3-RP3、RPA FP4-RP4、RPA FP5-RP5、RPA FP6-RP6)(表1)。将RPA上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，设计的RPA引物扩增目的片段大小约为220～280bp，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测RPA引物。同时，设计合成套式PCR(nested PCR)使用的特异性引物(nPCR外侧引物OFP1-ORP1，内侧引物IFP2-IRP2)。套式PCR扩增产物大小为350bp。引物名称及序列见表1。

5、RPA反应体系的配制及操作程序

配制50μL RPA反应体系，包括RPA FP和RPA RP(浓度均为10μM)各2.5μL，Rehydration Buffer 29.5μL，dd H₂O 12.0μL，模板1μL，280mM MgAc 2.5μL。将所有试剂预混后，转入预添加exo冻干酶制剂的0.2mL PCR反应管中，并充分混匀。将1μL模板加入反应管中，并将2.5μL MgAc加在反应管盖中，混匀，盖紧后瞬时离心，放入40℃水浴锅中进行RPA反应。

6、RPA反应条件的优化

6.1RPA最佳反应时间的确定

为了确定RPA最佳反应时间，配制6管50μL RPA反应体系，以BLV核酸为模板，分别进行15min、20min、25min、30min、35min、40min的RPA扩增，根据产物量来确定RPA最佳反应时间。结果发现，在40℃下RPA反应时间为20min时，即可扩增得到一条大小为220bp的特异性条带(图2)；当RPA反应30min时，得到的扩增产物量约为20min时条带的5倍，而反应40min时RPA产物量没有明显增加。因此BLV RPA最佳反应时间确定为30min。

6.2RPA最佳反应温度的确定

为了确定RPA最佳反应温度，配制5管50μL RPA反应体系，分别放入25℃、30℃、35℃、40℃和45℃水浴箱内进行扩增反应，15min后分别从各管中取10μL扩增液，根据产物量来确定RPA最佳反应温度。结果发现，在25～45℃的温度范围内RPA均可有效扩增，其中40℃时扩增效果最佳，RPA产物量最大，因此RPA最佳反应温度确定为40℃。

6.3RPA最佳引物的筛选

为了筛选出RPA最佳引物，以BLV核酸为模板，分别用6对BLV RPA引物(RPA FP1-RP1、RPA FP2-RP2、RPA FP3-RP3、RPA FP4-RP4、RPA FP5-RP5、RPA FP6-RP6)进行RPA扩增，随后对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出RPA最佳引物。结果3对引物均能扩增出目的基因片段，其中RPA FP6-RP6引物对的特异性、敏感性和产物量最高，因此RPA FP6-RP6引物对确定为BLV RPA最佳引物(表1)。

7、RPA-LFA可视化检测方法的建立

7.1胶体金标记抗体的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备平均颗粒直径为40nm的胶体金溶液。吸取1mL胶体金溶液加入试管中，向其中加入5μg小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG，恒温缓慢振荡30min。4℃、13000r/min离心40min，弃去上清液，沉淀溶解于0.1moL/L的Tris-HCL缓冲溶液中(pH＝8.0)，即得到胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG，将制备好的溶液4℃密封保存，待用。

7.2RPA-LFA试纸条的制备方法

在RPA-LFA检测前，先制备RPA-LFA试纸条。RPA-LFA试纸条从结构上分为5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、硝酸纤维素膜(NC膜)[检测线(T线)和质控线(C线)]和PVC塑料垫(图1)。首先，将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG用移液枪均匀滴加喷到NC膜上，放在真空干燥箱中37℃干燥10min，取出后作为结合垫(金标垫)。其次，在硝酸纤维素膜检测线(T线)上包被经PBS(0.01moL/L，pH＝7.4)缓冲液稀释至2mg/mL的链霉亲和素(Streptavidin)，质控线(C线)上包被2mg/mL的羊抗鼠IgG，室温下干燥30min。组装的顺序分别为：在PVC塑料垫的中间区域先贴上硝酸纤维素膜，结合垫贴在硝酸纤维素膜的前方区域，为保证良好的接触，结合垫压硝酸纤维素膜2mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫2mm，最后将吸水垫贴在硝酸纤维素膜的后方，吸水垫压硝酸纤维素膜2mm。将试纸板切切割为4mm的试纸条。将制备好的试纸条置于放有干燥剂的锡箱袋内，4℃保存备用。

7.3RPA-LFA检测方法操作步骤及结果判定

在RPA扩增结束后，用微量移液器取5μL RPA产物，稀释至80μL，滴加于RPA-LFA试纸条加样垫上，将加样完毕的装置放入37℃水浴箱内，孵育10min。取出RPA-LFA试纸条，用肉眼观察，若质控线(C线)和检测线(T线)均显色，则检测结果判为阳性(图3)；若仅质控线显色，则检测结果判为阴性；若质控线不显色，则检测结果判为无效。

8、BLV RPA检测引物的特异性评价

将牛乳头瘤病毒(Bovine papilloma virus，BPV)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(Bovineviral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenza virus type 3，BPIV-3)和口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)等病毒的核酸样品按照RPA反应操作步骤分别进行RPA扩增，然后将RPA扩增产物分别用制备的试纸条进行检测，每种病毒核酸样品重复检测3次，分析RPA-LFA检测引物的特异性。检测结果证实，只有BLV核酸样品RPA-LFA检测结果为阳性，其他病毒核酸样品RPA-LFA检测结果均为阴性，表明RPA FP6-RP6检测引物对其他病毒的核酸模板没有出现非特异性扩增反应，证实本研究所发明BLV RPA-LFA检测引物具有良好的特异性。

9、BLV RPA检测引物的敏感性评价

将重组质粒pT-env进行10倍倍比稀释，使其浓度在1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶……～1×10⁰拷贝/μL之间，并将不同稀释度的重组质粒作为模板，用RPA FP6-RP6引物进行RPA反应，确定该方法的最低检测浓度。同时比较与套式PCR方法的敏感性。检测结果发现，用BLVRPA引物最低可以检测到1×10¹拷贝/μL重组质粒DNA，套式PCR检测方法最低也可以检测到1×10¹拷贝/μL重组质粒DNA(图4)，表明RPA-LFA与套式PCR方法的敏感性相同，证实本研究所发明BLV RPA检测引物具有良好的敏感性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 石河子大学

<120> 快速检测牛白血病前病毒的RPA引物及试剂和试剂盒

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 1308

<212> DNA

<213> 牛白血病前病毒（Bovine leukaemia privol virus)

<220>

<221> misc_feature

<223> env基因

<400> 1

1 ATGCCTAAAG AACGACGGTC CCGAAGACGC CCACAACCGA TCATCAGATG GGTAAGTCTC

61 ACTCTCACTC TCCTCGCTCT CTGTCGGCCC ATCCAGACTT GGAGATGCTC CCTGTCCCTA

121 GGAAACCAAC AATGGATGAC AGCATATAAC CAAGAGGCAA AATTTTCCAT CTCCATTGAC

181 CAAATACTAG AGGCTCATAA TCAGTCACCT TTCTGTGCCA AGTCTCCCAG ATACACCTTG

241 GACTCTGTAA ATGGCTATCC TAAGATCTAC TGGCCCCCCC CACAAGGGCG GCGCCGGTTT

301 GGAGCCAGGG CCATGGTCAC ATATGATTGC GAGCCCCGAT GCCCTTATGT GGGGGCAGAT

361 CGCTTCGACT GCCCCCACTG GGACAATGCC TCCCAGGCCG ATCAAGGATC CTTTTATGTC

421 AATCATCAGA TTTTATTCCT GCATCTCAAA CAATGTCATG GAATTTTCAC TCTAACCTGG

481 GAGATATGGG GATATGATCC CCTGATCACC TTTTCTTTAC ATAAGATCCC TGATCCCCCT

541 CAACCCGACT TTCCCCAGTT GAACAGTGAC TGGGTTCCCT CTGTCAGATC ATGGGCCCTG

601 CTTTTAAATC AAACAGCACG GGCCTTCCCA GACTGTGCTA TATGTTGGGA ACCTTCCCCT

661 CCCTGGGCTC CCGAAATATT AGTATATAAC AAAACCATCT CCAGCTCTGG ACCCGGCCTC

721 GCCCTCCCGG ACGCCCAAAT CTTCTGGGTC AACACGTCCT CGTTTAACAC CACCCAAGGA

781 TGGCACCACC CTTCCCAGAG GTTGTTGTTC AATGTTTCTC AAGGCAACGC CTTGTTATTA

841 CCTCCTATCT CCCTGGTTAA TCTCTCTACG GCTTCCTCCG CCCCTCCTAC CCGGGTCAGA

901 CGTAGTCCCG TCGCAGCCCT GACCTTAGGC CTAGCCCTGT CAGTGGGGCT CACTGGAATT

961 AATGTGGCCG TGTCTGCCCT TAGCCATCAG AGACTCACCT CCCTGATCCA CGTTCTGGAG

1021 CAAGATCAGC AACGCTTGAT CACAGCAATT AACCAGACCC ACTATAATTT GCTTAATGTG

1081 GCCTCTGTGG TTGCCCAGAA CCGACGGGGG CTTGATTGGT TGTACATCCG GCTGGGTTTT

1141 CAAAGCCTAT GTCCCACAAT TAATGAGCCT TGCTGTTTCC TGCGCATTCA AAATGACTCC

1201 ATTATCCGCC TCGGTGATCT CCAGCCTCTC TCGCAAAGAG TCTCTACAGA CTGGCAGTGG

1261 CCCTGGAATT GGGATCTGGG GCTCACTGCC TGGGTGCGAG AAACCATTCA TTCTGTTCTA

1321 AGCCTGTTCC TATTAGCCCT TTTTTTGCTC TTCCTGGCCC CCTGCCTGAT AAAATGCTTG

1381 ACCTCTCGCC TTTTAAAGCT CCTCCGGCAG GCTCCCCACT TCCCTGAAAT CTCCTTAACC

1441 CCTAAACCCG ATTCTGATTA TCAGGCCTTG CTACCATCTG CACCAGAGAT CTACTCTCAC

1501 CTCTCCCCCG TCAAACCCGA TTACATCAAC CTCCGACCCT GCCCTTGA

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 牛白血病前病毒（Bovine leukaemia virus)

<220>

<221> misc_feature

<223> RPA FP6引物

<400> 1

5'-CCTTCCCAGAGGTTGTTGTTCAATGTTTCTCAAGG-3'

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 牛白血病病毒（Bovine leukaemia virus，BLV)

<220>

<221> misc_feature

<223> RPA RP6引物

<400> 1

5'-GTGGATCAGGGAGGTGAGTCTCTGATGGCTAAGGG-3'

Claims

1.一种快速检测牛白血病前病毒的RPA引物，其特征在于，其上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。

2.一种快速检测牛白血病前病毒感染的试剂,，其特征在于，根据权利要求1的引物制备。

3.一种快速检测牛白血病前病毒感染的试剂盒，其特征在于，根据权利要求1的引物制备。

4.根据权利要求3所述的快速检测牛白血病前病毒感染的试剂盒，其特征在于，

将胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体铺在结合垫上，硝酸纤维素膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被羊抗鼠IgG，配合加样垫和吸收垫组装成LFA试纸条，将RPA产物滴加于LFA试纸条加样垫上。

5.根据权利要求4所述的快速检测牛白血病前病毒感染的试剂盒，其特征在于，

6.根据权利要求4或5所述的快速检测牛白血病前病毒感染的试剂盒，其特征在于，

所述LFA试纸条为RPA-LFA试纸条：RPA-LFA试纸条从结构上分为5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和PVC塑料垫，硝酸纤维素膜上设置有检测线(T线)和质控线(C线)；

将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG均匀喷涂到一NC膜上，干燥后作为结合垫(金标垫)；

在硝酸纤维素膜(NC膜)检测线(T线)上包被经PBS缓冲液稀释至后的链霉亲和素(Streptavidin)，质控线(C线)上包被羊抗鼠IgG，干燥；

组装的顺序分别为：在PVC塑料垫的中间区域先贴上硝酸纤维素膜，结合垫贴在硝酸纤维素膜的前方区域，结合垫压硝酸纤维素膜1-3mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1-3mm，最后将吸水垫贴在硝酸纤维素膜的后方，吸水垫压硝酸纤维素膜1-3mm，将试纸板切切割为2-5mm的试纸条。