CN107287353A - 一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的rpa引物及其检测方法 - Google Patents
一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的rpa引物及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还提供了一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA方法，本发明的检测方法不仅易于操作，对设备要求低，而且特异性强，灵敏度高，结果准确可靠，为有效检测和诊断鸡传染性喉气管炎提供了一种成本低、快速、特异的现场诊断方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物及其检测方法。
背景技术
鸡传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒(Infectious LaryngotracheitisVirus，ILTV)引起的一种急性、接触性上部呼吸道传染病。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展，只有对该疫病进行快速的现场诊断，才能为疫病的有效防控争取宝贵时间，最大限度地减少损失和疫病的进一步传播。
常规的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术以其能够检测痕量的病原DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但PCR需要特殊的热循环设备、低温保存的试剂和避免交叉污染的技术操作要求，从而限制了PCR在现场诊断中的应用。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶(Polymerase)。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃-42℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于现场诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA技术具有不同于常规PCR的诸多优点：1)RPA反应在常温下即可进行；2)RPA检测的灵敏度很高；3)既可用于DNA，也可用于RNA的扩增；4)可以进行多重扩增。
免疫胶体金技术(Immune Colloidal Gold Technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金免疫层析法是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
鸡传染性喉气管炎病毒引起鸡的呼吸道疾病，目前，对于该病的诊断方法主要有病毒分离、血清学检测和PCR方法。其中，病毒分离方法是检测病原的金标准，但是该方法耗时长，敏感度低；血清学检测方法应用比较普遍，操作简单且敏感度高，但是对于急性感染的病例该方法就显示出了其局限性，容易产生假阴性结果；PCR方法，包括荧光定量PCR是快速、敏感、准确的检测方法，但是该方法需要昂贵的设备，对于田间和条件匮乏的实验室，其应用就显得比较困难。而RPA方法弥补了以上的不足，因此，建立一种以RPA技术为基础的能够现场快速检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，无疑对于该病的防控能够起到至关重要的作用。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物及检测方法。本发明的RPA引物特异性强，灵敏度高，结合胶体金免疫层析试纸条检测技术，能够检测ILTV，为有效检测鸡传染性喉气管炎提供一种成本低、快速、特异、不需要特殊设备的现场诊断新方法。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物，其中，所
述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-CTGCCTAAGCGAGGCTCCGCACCGGAGACTCAGGAATG-3’
(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CAATTCAGCCGAGGATTTGGGCCGCTCACCGCCAGAGC-3’
(SEQ ID NO.2)。
根据上述的RPA引物，优选地，所述上游引物的5’端采用羧基荧光素FAM进行标记，所述下游引物的5’端采用biotin(生物素)进行标记。
上述RPA引物能够用于制备检测鸡传染性喉气管炎病毒的试剂。
本发明还提供了一种含有上述RPA引物的试剂盒，该试剂盒能够用于检测鸡传染性喉气管炎病毒。
本发明还提供了一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA方法，包括以下步骤：
(1)引物合成：合成权利要求1或2所述的RPA引物；
(2)DNA模板提取：提取待检测样品中的DNA；
(3)RPA扩增反应：以步骤(2)提取的DNA为模板，采用步骤(1)中合成的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(4)分析RPA扩增产物。
根据上述的方法，优选地，采用英国TwistDx Inc公司的TwistBasic试剂盒进行RPA扩增反应，所述RPA扩增反应体系以50μL计为：水化缓冲液29.5μL，醋酸镁(初始浓度为280mM)2.5μL，以及总体积为18μL的引物、模板DNA和无核酸酶纯水混合物。所述18μL的引物、模板DNA和无核酸酶纯水混合物具体为：上游引物和下游引物(初始浓度均为250nM)各2μL，模板DNA2μL，无核酸酶纯水12μL。
根据上述的方法，所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到TwistBasic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到冻干酶复合物反应管的盖子内表面，然后盖上盖子，瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中启动反应；然后将冻干酶复合物反应管放入T8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中，37℃恒温孵育20分钟。
根据上述的方法，步骤(4)中分析RPA扩增产物的方法为：将RPA扩增产物稀释，然后用胶体金侧向流免疫层析试纸条(又称胶体金免疫层析试纸条)对稀释后的RPA扩增产物进行检测。优选地，所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的有色颗粒是纳米金颗粒，所述纳米金颗粒采用链霉亲和素包被。所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的纤维膜为硝酸纤维素膜。
根据上述的方法，利用胶体金侧向流免疫层析试纸条分析RPA扩增产物的方法具体为：将5μL RPA扩增物加入盛有95μL Tris盐缓冲液(25Mm Tris、150mM NaCl和0.05％Tween-20)的1.5mL EP管中，进行稀释，然后将胶体金侧向流免疫层析试纸条的样品垫末端垂直插入EP试管中，使样品垫末端接触溶液。10分钟后，取出试纸条进行观察并拍照记录结果。
根据上述的方法，所述胶体金侧向流免疫层析试纸条上设有抗羧基荧光素抗体检测线和生物素化抗体质控线；若胶体金侧向流免疫层析试纸条的抗羧基荧光素抗体检测线出现条带，而且生物素化抗体质控线正常，则表明该样品中含有鸡传染性喉气管炎病毒，若仅是生物素化抗体质控线上出现条带，则表明该样品中不含鸡传染性喉气管炎病毒。
此外，也可以用琼脂糖凝胶电泳来分析RPA扩增产物，在靶基因存在情况下，RPA反应产生由上、下游引物扩增的片段，合适的引物可以通过凝胶电泳的方式进行筛选，以确保能够检测到目的产物。
本发明的原理为：本发明设计扩增ILTV的特异性引物，能够检测ILTV的存在。利用不同的标记物对特异性扩增ILTV片段的引物进行标记，经过RPA扩增反应后，最终产生一端带有生物素，另一端带有羧基荧光素(FAM)的双标记产物，该双标记产物被包被有链霉亲和素的红色纳米金微球吸附，纳米金微球在液体的侧向流动力带动下移动到事先固定在试纸条上的抗FAM抗体以及生物素化的抗体所在位置，逐渐沉积形成肉眼可见的沉淀线，借此可以利用试纸条上出现的检测线而达到检测ILTV的目的。
本发明取得的积极有益效果：
(1)本发明设计的RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。
(2)本发明的检测方法将检测ILTV的常温RPA扩增技术与胶体金免疫层析试纸条连用，能够实现ILTV的快速检测，最少能检测100拷贝的ILTV。本发明的检测方法特异性试验结果良好，为有效检测鸡传染性喉气管炎病毒提供一种成本低、快速、特异，不需要特殊设备的现场诊断新方法，有利于鸡传染性喉气管炎的鉴别诊断，同时也可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。
(3)本发明可以作为规模化养鸡场和散养场ILTV的快速现场检测方法，可以作为鸡传染性喉气管炎的净化检测方法，建立无ILTV病原的种鸡群，同时也为ILTV感染的分子流行病学调查，诊断试纸条的研制与开发提供了试验依据和技术参考。
附图说明
图1为本发明胶体金侧向流免疫层析试纸条组装原理示意图；
图2为本发明胶体金侧向流免疫层析试纸条工作原理示意图；
图3为检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增反应条件的优化结果；其中，A为上、下游引物浓度优化结果；B为反应时间的优化结果；C为反应温度的优化结果；
图4为本发明RPA引物特异性检测的试纸条检测结果；
图5为本发明RPA引物灵敏度检测的试纸条检测结果。
具体实施方式
在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。
以下实施例中使用RPA试剂盒Basic kit购自英国TwistDx Inc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应在RPA反应管中进行。
实施例1：用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物的合成
参考GenBank中所公布的鸡传染性喉气管炎病毒K317毒株基因组序列(accessionnumber：JX458824)，选择基因组核苷酸序列中648bp-685bp位置的序列作为RPA扩增反应的上游引物，并在其5’端标记羧基荧光素(FAM)：5’-FAM-CTGCCTAAGCGAGGCTCCGCACCGGAGACTCAGGAATG-3’。以鸡传染性喉气管炎病毒K317毒株基因组核苷酸序列中762bp-799bp位置的序列的反向互补序列作为RPA扩增反应的下游引物，并在其5’端标记生物素(Biotin)：5’-Biotin-CAATTCAGCCGAGGATTTGGGCCGCTCACCGCCAGAGC-3’。
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2：胶体金侧向流免疫层析试纸条的制备
(1)链霉亲和素包被的纳米金颗粒的制备：取1mL纳米金颗粒溶液(0.15pmol/mL)，加入200mM的硼砂溶液1-2μL，调整其pH值到9.5。同时，在另一个试管中将2μL的链霉亲和素(2mg/mL)与398μL的硼砂溶液(2mM)混合，得到稀释的链霉亲和素。将稀释的链霉亲和素加入到前面所述的纳米金颗粒溶液中，以50μL的量递加，边加边搅拌，得到混合物。将混合物置室温放置45分钟，加入含有155.6μL含10％BSA的2mM硼砂溶液，继续在室温放置10分钟，然后4500g离心15分钟，吸弃液体，用1mL的洗涤液(含有10g/L BSA的2mM硼砂溶液)重悬沉淀，4500g离心15分钟，吸弃液体，得到红色沉淀；将红色的沉淀重悬在250μL含有5％BSA、137mM NaCl和0.025％吐温-20的缓冲液中，得到链霉亲和素包被的纳米金颗粒溶液。按照此比例制备足量的链霉亲和素包被的纳米金颗粒溶液，取250μL链霉亲和素包被的纳米金颗粒溶液滴加到7mm×300mm激光切割的玻璃纤维垫上，使之扩散均匀，在实验台上干燥过夜。
(2)胶体金侧向流免疫层析试纸条的制备：用含有5％甲醇、2％蔗糖的100mM碳酸氢钠缓冲液将抗FAM抗体和生物素化的抗鼠IgG分别稀释到终浓度为0.5mg/mL和1.0mg/mL。所有抗体均用侧向流试剂分配器点样，分配器头的速度设定在1～3厘米/分钟，优选为2厘米/分钟，注射泵的流速设定在0.1～0.3mL/分钟，优选为0.1mL/分钟。当两种抗体在试纸条上点样完成后，将试纸条在37℃干燥1小时。然后按照图2和如下步骤进行试纸卡的装配：①将一个17毫米×300毫米的吸水垫放在塑料支撑的硝酸纤维素膜的右手下游端，二者重叠2毫米；②将一个7毫米×300毫米含有干燥金纳米颗粒的玻璃纤维垫放在硝酸纤维素膜的左手上游端，二者重叠2毫米；③将一个12毫米×300毫米的玻璃纤维样品垫放在金纳米颗粒垫的左手端，二者重叠2毫米。装配完成后，将试纸卡立即裁成3毫米宽的试纸条即得到胶体金侧向流免疫层析试纸条，密封、干燥保存。
实施例3：DNA模板提取
鸡传染性喉气管炎病毒DNA的提取按照如下操作进行：
a、取350μl鸡传染性喉气管炎病毒液于1.5mL的EP管中，加入350μL组织裂解液，再加入终浓度为0.2mg/mL蛋白酶K，混匀后于56℃水浴1小时；
b、每管加入700μL Tirs平衡酚，颠倒混匀10次后于室温静置5min，然后1000g离心5min；
c、取上清于新的1.5mL EP管中，加入350μL Tirs平衡酚和350μL氯仿，颠倒混匀10次后于10000×g离心5min；
d、取上清400μL，加入1mL-20℃预冷的无水乙醇，同时加入40μL的NaAC(3M，pH＝5.2)，混匀后于-20℃静置2h；
e、10000×g离心20min后弃上清，加入1mL 75％的无水乙醇，10000×g离心20min后弃上清，自然干燥后加入50μL Tris-HCl缓冲液(2.5mM，pH＝8.5)，室温溶解5min即为提取的鸡传染性喉气管炎病毒DNA，冻存于-20℃备用。
实施例4：RPA检测鸡传染性喉气管炎病毒反应条件的优化
以鸡传染性喉气管炎病毒的DNA为模板，采用英国TwistDx Inc公司的TwistBasic试剂盒进行RPA扩增反应，对RPA扩增反应的上下游引物初始浓度(1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM、7.8125nM)、反应温度(25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、37.5℃、40℃、42℃)和反应时间(2min30s、5min、7min30s、10min、12min30s、15min、17min30s、20min)进行优化。所述RPA反应体系为50μL：29.5μL水化缓冲液、2μL模板DNA、上游和下游引物各2μL、2.5μL醋酸镁(初始浓度为280mM)，用无核酸酶纯水补足反应体积至50μL。
所述RPA扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将RPA反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到TwistBasic试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到冻干酶复合物反应管的盖子内表面，然后盖上盖子，瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中启动反应；然后将冻干酶复合物反应管放入T8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中，37℃恒温孵育至需要的时间。
孵育结束后，取5μL RPA扩增物，在含有95μL Tris盐缓冲液(25mM Tris、150mMNaCl和0.05％Tween-20)的1.5mL EP管中稀释，将胶体金侧向流免疫层析试纸条的样品垫末端垂直插入EP管中，使样品垫末端接触溶液。10分钟后，取出试纸条进行观察并且拍照记录结果，结果如图3。
通过对RPA扩增反应条件的优化，最终得到检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA扩增反应优化条件，其中，优化后的RPA扩增反应体系为：上下游引物(初始浓度均为250nM)各2μL、模板DNA 2μL、醋酸镁(初始浓度为280mM)2.5μL、29.5μL水化缓冲液，用无核酸酶纯水补足反应体积至50μL；优化后的RPA扩增反应条件为：反应温度为37℃，反应时间为20min。
实施例5：引物特异性试验
分别以鸡传染性喉气管炎病毒DNA、鸡新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)cDNA、禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)H9N2亚型cDNA、鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)cDNA、鸡传染性法氏囊病毒(Infectious BursalDisease Virus，IBDV)cDNA、鸡白血病病毒(Avian Leucosis Virus，ALV)cDNA、鸡马立克病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)DNA、禽腺病毒血清型4亚型(Fowl Aviadenovirus，FAdV4)DNA为模板，采用英国TwistDx Inc公司的TwistBasic试剂盒进行RPA扩增反应，对引物进行特异性验证。
所述RPA扩增反应体系、加样顺序和反应条件同实施例4中最后优化得到的条件，扩增产物用胶体金侧向流免疫层析试纸条检测的检测方法同实施例4。结果显示(图4)，本发明所设计的针对鸡传染性喉气管炎病毒的引物具有特异性。
实施例6：引物灵敏度分析试验
标准质粒的制备：以ILTV基因组DNA(提取方法同实施例3)为模板，利用实施例1合成的用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物为引物，进行PCR反应，扩增目的基因。其中，PCR反应体系为50μL：10×Buffer(含Mg2+)5μL、dNTP(10mM)1μL、上下游引物(25μM)各1μL、TaqTM聚合酶(5U·μL-1)0.5μL、模板DNA(5ng/μL)2μL，ddH2O补足50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测，胶回收目的基因条带，将目的基因克隆到pMD18-T载体上，得到含有目的基因的质粒，以含有目的基因的质粒做为标准质粒；利用紫外分光光度计测定标准质粒在OD260nm的吸光度值，按照公式核酸浓度＝OD260吸光度值×50μg/ml计算标准质粒的核酸浓度，然后按照公式(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(核酸浓度ng/μL×10-9)/(核酸长度×660)＝标准质粒拷贝数copies/μL计算出标准质粒拷贝数。
将上述标准质粒进行10倍连续倍比稀释，得到浓度分别为108-100copies/μL的标准质粒稀释液，以稀释后的不同浓度的标准质粒稀释液为模板进行RPA扩增反应，来确定引物的灵敏度。所述RPA扩增反应体系、加样顺序和反应条件同实施例4中最后优化得到的条件，扩增产物用胶体金侧向流免疫层析试纸条检测的检测方法同实施例4。结果显示(图5)，本发明所设计的引物以及所建立检测方法最低能检测拷贝数为100copies/μL的ILTV模板。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物及其检测方法
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<223> 1
<400> 2
caattcagcc gaggatttgg gccgctcacc gccagagc 38
Claims (10)
1.一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-CTGCCTAAGCGAGGCTCCGCACCGGAGACTCAGGAATG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CAATTCAGCCGAGGATTTGGGCCGCTCACCGCCAGAGC-3’(SEQ ID NO.2)。
2.根据权利要求1所述的RPA引物，其特征在于，所述上游引物的5’端采用羧基荧光素FAM进行标记，所述下游引物的5’端采用biotin进行标记。
3.权利要求1或2所述的RPA引物在制备检测鸡传染性喉气管炎病毒试剂中的应用。
4.含有权利要求1或2所述RPA引物的试剂盒。
5.权利要求4所述的试剂盒在检测鸡传染性喉气管炎病毒中的应用。
6.一种用于检测鸡传染性喉气管炎病毒的RPA方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物合成：合成权利要求1或2所述的RPA引物；
(2)DNA模板提取：提取待检测样品中的DNA；
(3)RPA扩增反应：以步骤(2)提取的DNA为模板，采用步骤(1)中合成的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(4)分析RPA扩增产物。
7.根据权利要求6所述的RPA方法，其特征在于，所述RPA扩增反应体系以50μL计为：
其中，上游引物和下游引物的初始浓度均为250nM，所述醋酸镁的初始浓度为280mM。
8.根据权利要求6所述的RPA方法，其特征在于，步骤(4)中分析RPA扩增产物的方法为：将RPA扩增产物稀释，然后用胶体金侧向流免疫层析试纸条对稀释后的RPA扩增产物进行检测。
9.根据权利要求8所述的RPA方法，其特征在于，所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的有色颗粒是纳米金颗粒，所述纳米金颗粒采用链霉亲和素包被。
10.根据权利要求8所述的RPA方法，其特征在于，所述胶体金侧向流免疫层析试纸条上设有抗羧基荧光素抗体检测线和生物素化抗体质控线；若胶体金侧向流免疫层析试纸条的抗羧基荧光素抗体检测线出现条带，而且生物素化抗体质控线正常，则表明该样品中含有鸡传染性喉气管炎病毒，若仅是生物素化抗体质控线上出现条带，则表明该样品中不含鸡传染性喉气管炎病毒。
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