CN111910019A - 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒rpa扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，包括以下步骤，S1：病毒核酸的提取，S2:目的基因的克隆，S3：RPA引物和探针的设计，S4：RPA方法的建立，S5：特异性试验与灵敏度试验,S6：临床样品的检测。本发明利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37‑42℃下反应20‑30分钟即可，与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法。
背景技术
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)能引起鸡的一种呼吸道的传染病，具有高度接触性和急性感染的特征，该病被称为鸡传染性喉气管炎。急性感染的鸡群可出现高的发病率和死亡率，慢性感染可引起结膜炎、产蛋和蛋品质下降，从1925年首次报道本病以来，已在全球各地流行，近些年来，在我国多地也呈流行趋势，给养鸡业造成的损失不容忽视。一个快速方便的检测方法对该疾病的控制是非常重要的。
传统的检测ILTV的方法有病毒分离和血清学鉴定方法，但这些方法都费时费力。随着分子生物学的快速发展，一些依据核酸扩增的分子学方法也在实验室建立了，例如，普通PCR，荧光定量PCR，环介导等温扩增方法(LAMP)，液相基因芯片，GeXP多重PCR等，PCR跟荧光量PCR由于他们的特异性和灵敏度，用于实验室常规的检测方法，液相基因芯片和GeXP多重PCR由于他们的高通量，用于临床样品的筛查，但这些方法都需要复杂和贵的仪器，所以不适用于养殖场。LAMP方法是一种等温扩增利用4-6条引物的方法，但引物设计麻烦且假阳性率高。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内。本研究针对传染性喉气管炎病毒的5’端序列，建立了实时荧光RPA检测方法，为ILTV快速诊断及防控提供了技术参考。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法。
本发明提出的一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，包括以下步骤：
S1：病毒核酸的提取，使用DNA提取试剂盒对ILTV进行DNA提取，将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL载体RNA溶液，摇动混合物并混合，在56℃水浴15分钟后，加入250μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟，将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得病毒DNA；
S2:目的基因的克隆，使用PCR方法扩增目的基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35个循环，72℃延伸10分钟，通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物；
将4.5μL回收产物与0.5μL pMD-18T vector、5μL solution I总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜克隆到pMD-18T载体中，构建质粒；
将10μL连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中，将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min，金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min，加入1mL LB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养；
S3：RPA引物和探针的设计，从NCBI下载ILTV全基因序列，设计ILTV特异性RPA探针，再根据该探针设计了4对引物，筛选最佳的引物对，设计引物的长度范围为30至35个碱基，探针长度范围为48至52个碱基，RPA探针应该有四个基团，包括荧光基团，猝灭基团，四氢呋喃和3端封闭，所有引物和探针均在设计完成后进行合成提取；
S4：RPA方法的建立，使用试剂盒以50uL体积进行RPA反应，包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM外探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子，RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增30分钟；
S5：特异性试验与灵敏度试验,对于灵敏度分析，实时RPA使用质粒稀释的标准品，用easy dilution以10倍的比例稀释至7个浓度，模板为1×106copies/μL至1×100copies/μL，通过测试含有阳性核酸的ILTV以及来自其他病原体的其他核酸，包括马立克病毒、新城疫病毒、禽贫血病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒来确定构建的实时RPA方法的特异性。
S6：临床样品的检测，用所构建的RPA检测方法对115个实验室保存临床样本进行测试。
优选的，所述S3中RPA引物和探针如下：
本发明的有益效果为：
本发明利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可，与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。
附图说明
图1为本发明提出的一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法的四对引物与探针筛选结构示意图；
图2为本发明提出的一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法的特异性实验扩增结构示意图；
图3为本发明提出的一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法的灵敏度实验结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-3，一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，包括以下步骤：
步骤1，病毒的提取：
按TIANGEN公司TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书对ILTV进行DNA提取。将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL载体RNA溶液，摇动混合物并混合。在56℃水浴15分钟后，加入250μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟。将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得DNA。
步骤2，目的基因的克隆：
使用PCR方法扩增目的基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35个循环，72℃延伸10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物，按照OMEGA公司
Gel Extraction Kit试剂盒说明书进行回收。
将4.5μL回收产物与0.5μL pMD-18T vector、5μL solution I总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜克隆到pMD-18T载体中，构建质粒。
将10μL连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中：将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min；金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min；加入1mL LB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养。
按照OMEGA公司的
Plasmid Mini Kit I试剂盒说明书进行提取。
步骤3，RPA引物和探针的设计
从NCBI下载ILTV全基因序列，根据TwistDX设计指南的建议设计ILTV特异性RPA探针，再根据该探针设计了4对引物，筛选最佳的引物对(引物序列跟探针如下)。设计引物的长度范围为30至35个碱基，探针长度范围为48至52个碱基。RPA探针应该有四个基团，包括荧光基团，猝灭基团，四氢呋喃(THF)和3端封闭(C3 spacer)。
所有引物和探针均在设计完成后由上海生工生物工程有限公司合成。
步骤4，RPA方法的建立：
使用TwistAmpTM试剂盒(TwistDX，Cambridge，United Kingdom)以50uL体积进行RPA反应。包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM外探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子。RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器(DEAOU Biotechnology，China)中扩增30分钟。
步骤5，特异性试验与灵敏度试验：
对于灵敏度分析，实时RPA使用质粒稀释的标准品，用easydilution以10倍的比例稀释至7个浓度，模板为1×106copies/μL至1×100copies/μL。通过测试含有阳性核酸的ILTV以及来自其他病原体的其他核酸，包括马立克病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、禽贫血病毒(CAV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)、禽呼肠孤病毒(ARV)来确定构建的实时RPA方法的特异性。
步骤6，临床样品的检测：
用所构建的RPA检测方法对115个实验室保存临床样本进行测试。
结果：
RPA引物探针筛选结果
根据引物和筛选原则，如图1所示，引物1为最佳引物。
通过检测ILTV阳性核酸以及其它病原病毒(MDV、NDV、CAV、IBDV、IBV、AIV、ALV、ARV)来检测已建立的实时RPA方法的特异性，ddH2O做空白对照。如图2显示，除了ILTV扩增之外，其他阴性核酸没有扩增，证明该方法特异性良好，与其他病原没有交叉反应。
ILTV阳性标准品10倍比例稀释用做模板进行RPA检测，模板浓度从106copies/μL～100copies/μL，共7个梯度，ddH2O做空白对照，检测方法的灵敏度。如图3所示，最低检测值为1×102copies/μL。
为了评估构建的ILTV实时RPA方法的实用性，检测115例疑似禽呼吸道感染的临床样本，同时使用实时荧光定量PCR测定法。为了比较。结果显示，115例临床样本中ILTV的阳性检出率为72.17％(83/115)，与实时PCR的阳性检出率一致。两种方法的阳性样品和阴性样品的一致性为100％。
注：CR＝(83+32)/115。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：病毒核酸的提取，使用DNA提取试剂盒对ILTV进行DNA提取，将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL载体RNA溶液，摇动混合物并混合，在56℃水浴15分钟后，加入250μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟，将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得病毒DNA；
S2:目的基因的克隆，使用PCR方法扩增目的基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35个循环，72℃延伸10分钟，通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物；
将4.5μL回收产物与0.5μL pMD-18T vector、5μL solution I总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜克隆到pMD-18T载体中，构建质粒；
将10μL连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞中，将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min，金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min，加入1mL LB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养；
S3：RPA引物和探针的设计，从NCBI下载ILTV全基因序列，设计ILTV特异性RPA探针，再根据该探针设计了4对引物，筛选最佳的引物对，设计引物的长度范围为30至35个碱基，探针长度范围为48至52个碱基，RPA探针应该有四个基团，包括荧光基团，猝灭基团，四氢呋喃和3端封闭，所有引物和探针均在设计完成后进行合成提取；
S4：RPA方法的建立，使用试剂盒以50uL体积进行RPA反应，包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM外探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子，RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增30分钟；
S5：特异性试验与灵敏度试验,对于灵敏度分析，实时RPA使用质粒稀释的标准品，用easy dilution以10倍的比例稀释至7个浓度，模板为1×106copies/μL至1×100copies/μL，通过测试含有阳性核酸的ILTV以及来自其他病原体的其他核酸，包括马立克病毒、新城疫病毒、禽贫血病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒来确定构建的实时RPA方法的特异性。
S6：临床样品的检测，用所构建的RPA检测方法对115个实验室保存临床样本进行测试。
2.根据权利要求1所述的一种检测鸡传染性喉气管炎病毒RPA扩增方法，其特征在于，所述S3中RPA引物和探针如下：
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