CN107338289A - 一种锁核酸修饰的lamp引物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物，在该LAMP引物组合物中，锁核酸的修饰位置为FIP引物和BIP引物3’端最外侧的3个碱基中的至少一个；本发明还涉及一种含有上述LAMP引物组合物的LAMP反应体系，该体系还包括甲酰胺和热启动酶；本发明还涉及一种采用上述LAMP引物组合物的扩增方法，其扩增温度为58℃‑72℃。本发明针对LAMP的非特异性扩增问题，采用上述技术方案，在小幅提高扩增效率的同时，大幅降低非特异性扩增，显著提高了LAMP反应体系的稳定性和特异性，此对于LAMP技术的进一步完善和临床应用的推广具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物及其应用。
背景技术
随着检验医学的发展，一些分子生物学技术，如PCR、链置换扩增等，在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。然而，由于分子生物学技术检测核酸对仪器、设备的要求较高，操作程序复杂，限制了其作为快速诊断方法的开展与推广,环介导等温扩增技术(loopmediated isothermal amplification，LAMP)，解决了核酸诊断中设备昂贵、程序复杂等难题。
LAMP反应仅需一种具链置换活性的DNA聚合酶(如Bst、Gsp等)及针对靶基因6-8个区域设计的4-6条引物(F3/B3和FIP/BIP必需，LF/LB可选)便可在60℃～66℃的恒定温度下实现几十分钟内大于109倍的靶基因扩增，其检测的低限可达10拷贝/微升，凭借极高的扩增效率及较低的仪器要求，该技术已逐渐应用于病原体识别、生物标志物检测、性别鉴定等，值得注意的是：LAMP技术在临床旁快速检测、野外检测及资源有限的基层实验室检测领域有广阔的前景。
然而，近年来LAMP技术在实验室中的实际应用相对局限，进展相对缓慢，发明人根据前期的研究发现，限制其广泛应用的重要原因有两个，具体为：(1)当前的LAMP体系难以实现真正意义上的高通量的检测，有待于进一步完善，；(2)虽然LAMP体系，检测过程中无需升降温，可以大大加快反应速度，实现高效、快速检测，然而LAMP体系的稳定性较差，且LAMP扩增中由于引物数目众多，加剧了引物来源的非特异扩增问题，包括引物内部的非特异性扩增(空白对照体系中出现假阳性)和引物与模板的非特异性结合扩增，虽然这方面的文献报道相对较少，但非特异性扩增的问题严重限制了该技术的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，针对LAMP的非特异性扩增问题，提出一种基于锁核酸引物的环介导等温扩增体系及其核酸扩增方法，其可显著提高LAMP扩增体系的稳定性和特异性，对于LAMP技术的进一步完善和临床应用的推广具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物，包括F3/B3引物和FIP/BIP引物和/或LF/LB引物，在该LAMP引物组合物中，锁核酸的修饰位置为引物的3’端。
锁核酸(locked nucleic acid,LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，结构中含有1个或多个2，-O，4，-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2，-O，4，-C位通过不同的缩水作用形成氧亚基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3，-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力；3’端经LNA修饰的引物可以提高特异性PCR扩增过程中的错配识别能力，并且其无需像ARMS引物那样在3’端的第二个碱基或第三个碱基处额外引入错配，可在保证扩增效率的同时保证扩增的特异性。
进一步地，锁核酸修饰的引物为FIP引物和BIP引物。
进一步地，所述锁核酸的修饰位置为引物的3’端最外侧的3个碱基中的至少一个；优选引物的3’端最外侧3个碱基中的倒数第2-3个碱基中的至少一个，更优选引物的3’端最外侧3个碱基中的倒数第2个或倒数第3个碱基。也可采用3’端最外侧的任一合适的第n个碱基中的至少一个。
另一方面，本发明还提供一种含有上述LAMP引物组合物的环介导等温扩增体系。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，所述环介导等温扩增体系包含甲酰胺。
进一步地，在所述环介导等温扩增体系中，所述甲酰胺的浓度为0.1vl％-10vl％。；更优选为0.5vl％-5vl％，更优选为0.5vl％-2vl％，更优选为0.5vl％-1.5vl％，更优选为1vl％。甲酰胺的浓度可根据具体的反应体系进行相应的调整，但其浓度也不应太高，例如在某些反应中甲酰胺浓度为15vl％左右时或者在另外一些反应中甲酰胺浓度为5vl％左右时就会会大幅降低扩增效率，导致检测灵敏度大大降低。
进一步地，所述环介导等温扩增体系含有热启动酶，其初始浓度为4-20U。优选地，所述热启动酶包括HotStarTaqDNA聚合酶、AntiTaqDNA聚合酶或其他任一合适的热启动酶。
最后，本发明还提供一种采用上述LAMP引物组合物的用于非诊断和治疗目的的核酸扩增方法，其包括如下步骤：
步骤1)待检样品核酸提取；
步骤2)恒温扩增反应：将步骤1)获得的待检样品DNA加入含有锁核酸修饰的引物的环介导等温扩增体系中进行恒温扩增反应；
步骤3)结果判读：扩增结束后结合特定仪器检测核酸扩增曲线进行判读。
进一步地，所述步骤2)中环介导等温扩增体系中还包含甲酰胺和热启动酶。
进一步地，所述步骤2)中环介导等温扩增体系中还包含荧光染料。
进一步地，所述步骤2)恒温扩增反应的反应温度为58℃-72℃；更优选为64℃-68℃，更优选为68℃，该温度可根据扩增中待检样品DNA及其相应引物的不同而进行相应的调整。
进一步地，上述核酸扩增方法还包括锁核酸修饰的引物的制备步骤、热启动酶的制备步骤等，其均根据常规技术手段进行制备。
进一步地，所述待检样品包括任一可通过LAMP扩增方法检测的样品。
进一步地，所述荧光染料包括SYBRgreen、EverGreen、PicoGreen、SYTO或其他任一合适的荧光染料。
本发明还涉及一种上述LAMP引物组合物的应用，其主要用于核酸检测试剂盒的制备。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在环介导等温扩增体系所采用的FIP引物和BIP引物的3端引入锁核酸(LNA)，其效果良好，在小幅提高扩增效率的同时，可以大幅度的提高了LAMP反应体系的稳定性和特异性。
本发明在环介导等温扩增体系中加入甲酰胺，其可以显著提高检测体系的特异性，但对检测体系的扩增效率无明显影响；在PCR反应体系中，加入甲酰胺作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。
本发明在环介导等温扩增体系中采用热启动酶，可以提高目的DNA扩增的特异性和灵敏度，大幅降低非特异性扩增，且能显著提高扩增效率，扩增速度提高10min-20min。
本发明对PCR反应温度进行筛选，发现与常见的LAMP扩增温度60℃-65℃相比，在引入了锁核酸的LAMP体系中，其扩增温度范围有所扩大，可在58℃-72℃实现良好扩增，在64℃-68℃时的扩增效果最好，其检测体系的灵敏度和特异性俱佳。
本发明将含有锁核酸修饰的引物、甲酰胺、热启动酶及反应温度这四方面联合应用于LAMP检测体系及检测方法，可以明显提高体系的特异性和稳定性，可推动LAMP技术在各领域的广泛推广应用。
附图说明
图1是引入锁核酸修饰的LAMP引物的曼陀罗基因的扩增曲线图；
图2是引物未经锁核酸修饰的普通引物的曼陀罗基因的扩增曲线图；
图3是引入本发明所述的LAMP扩增体系的CALR-2扩增曲线图；
图4是现有技术中的LAMP扩增体系的CALR-2扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为锁核酸修饰的LAMP引物组合物在曼陀罗基因型恒温扩增检测中的应用。
1)曼陀罗核酸样本的制备：按照以下步骤提取制备：
a.取单粒种子研磨粉碎；
b.液氮中研细后转入离心管中，加入500-800μL TES[100mM Tris(pH8.0)，10mMEDTA，2wt％SDS]；加50-100μg蛋白激酶K混匀，置于55-60℃水浴60-90min，期间轻轻混匀几次；
c.调节盐浓度，加1/10体积的10％十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，置于65℃水浴10-20min；
d.加入等体积的SEVGA(氯仿：异戊醇＝24∶1)混匀，0℃孵育30min；
e.离心，取上清，加3-6μL RNase A，37℃水浴30min，去除RNA；
f.加预冷异丙醇，-20℃放置15-30min；
g.离心，弃异丙醇，70％乙醇洗2次。室温干燥，再加入50-200μL ddH2O溶解。
2)LAMP反应体系的构建及反应参数的优化；
以阳性质粒标准品DNA为模板，分别对体系中Mg2+浓度、内外引物比例、Bst酶浓度、dNTP浓度、甜菜碱浓度、反应温度和反应时间进行优化后，确定最佳的LAMP反应参数。
设置不同终浓度的Mg2+(2、4、6、8、10mM)、dNTPs(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mM)、内外引物浓度比例(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)，分别在不同反应时间(10、20、30、45、60min)和温度(57℃、60℃、63℃、65℃、68℃)下进行反应，最终获得最佳反应参数，从而建立特异性LAMP检测体系。优化的检测体系(23μl)如下：
1×ThermoPol buffer，8mM Mg2+，1M Betaine，1.2mM dNTP，0.2μM外引物(F3和B3)，1.6μmol内引物(FIP和BIP)，2μL模板RNA，8U Bst聚合酶。检测反应条件为：65℃恒温60min。
3)多刺曼陀罗锁核酸引物的构建和应用；
4)多刺曼陀罗LAMP检测体系的特异性；
将待测样品分别加入到优化好的反应体系中，然后进行LAMP反应，结果如图1所示。然后采用未经锁核酸修饰的普通引物构建常规的LAMP反应体系，其反应结果如图2所示。
通过图1和图2的对比可知，在普通引物的作用下，出现非特异性扩增；然而使用锁核酸技术后，则阴阳性区分良好，明显改善了核酸恒温扩增的特异性和准确性。
实施例2
本实施例为CALR基因2型突变LAMP体系的建立，该体系中含有锁核酸修饰的引物、甲酰胺、热启动酶。
本实施例采用CALR基因2型突变的靶序列及其扩增引物的序列如下表所示：
表1 检测CALR基因2型突变的引物及靶序列的碱基序列表
其中，包含CALR基因2型突变靶序列的核酸按照常规技术手进行提取，扩增该靶序列的引物也根据常规方法设计，并在FIP引物和BIP引物的3’端修饰锁核酸。
LAMP扩增反应体系的配置如下：25ul
设置不同反应时间(10、20、30、40、60、80min)和温度(57℃、60℃、63℃、65℃、68℃)下进行反应，最终获得最佳反应条件。优化的检测条件(25μl)如下：68℃恒温80min。
该LAMP扩增反应体系的扩增条件：荧光定量实时PCR仪(ABI7300)，68℃，80min，FAM通道检测荧光信号。
上述LAMP扩增反应体系中FIP和BIP引物引入了锁核酸，且含1％的甲酰胺，8U热启动酶，其在68℃扩增，引入荧光染料，在实时PCR仪上对结果进行实时观察，其扩增结果如图1所示，图1中的扩增曲线包括50％、10％、1％、0.5％突变负荷的CALR-2突变阳性模拟样本和体系在经77min扩增后出现的非特异性曲线。
如图3所示，不同突变负荷的模拟阳性样本，均可以稳定、特异的检出，定性结果与探针法的结果完全一致。以下的四条扩增曲线，从左向右分别是：50％、10％、1％、0.5％突变负荷的CALR-2突变阳性模拟样本，左右侧的一条扩增曲线是该体系中的阴性对照样本在第77min时出现的非特异扩增，且结果显示，该体系经77min内扩增，阴性对照样本和空白对照样本均没有出现任何的非特异性扩增曲线，该LAMP特异性大大提升。
对比实施例1
本对比实施例为CALR基因2型突变LAMP体系的建立，该体系为现有技术中常用的反应体系，该体系中FIP引物和BIP引物为未经任何修饰的普通引物，不含甲酰胺，含8U普通LAMP酶，其在64℃扩增，引入荧光染料，其检测步骤与实施例1相同。在实时PCR仪上对结果进行实时观察，如图4所示，以上的四条扩增曲线，从左向右分别是：50％、10％、1％突变负荷的CALR-2突变阳性模拟样本和在经过61min扩增后阴性对照样本出现的非特异性扩增曲线。
实施例2和对比实施例1中样本真阳性结果和非特异性假阳性结果出现的时间的比较如下表所示：
采用配对t检验统计分析，P<0.05，两种检测体系具有明显的统计学差异。
由实施例1和对比实施例1的比较结果可知，与现有技术相比，本发明的优势在于：(1)通过在体系引物中引入锁核酸，LAMP反应体系变得更加稳定，检测结果的重复性更好；(2)与原来的LAMP体系相比，通过锁核酸修饰的引物体系，对临床阳性样本进行扩增检测时，扩增效率更高了(阳性结果出现的时间提前4-19min)；(3)常规的LAMP体系中的引物浓度更高、长度更长、引物数量更多更复杂，因此容易出现非特异性扩增；且普通引物的LAMP体系中，在扩增了50-60min后，通常就可能会出现不同程度的非特异性扩增，甚至空白对照样品也会变成阳性，因此，常规的LAMP扩增的时间通常限定在50-60min以内，本发明通过在体系引物中引入锁核酸，反应体系基本可以保证在70min不会出现非特异性扩增，特异性更好；(4)同时可以将检测灵敏度大大提升，原来的普通引物的LAMP体系突变检出率为1％左右，现在在引入锁核酸的引物体系后，突变检出率可以达到0.5％的水平，检测水平几乎可以超越当前的探针实时PCR法(1％左右)；(5)通过在体系引物中引入锁核酸，LAMP反应体系的反应温度可以在原来的水平上，继续提升3-5℃，也一定程度上能提高原来的特异性，而产物的扩增效率却基本不会受影响。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属华山医院；复旦大学；中国科学院苏州生物医学工程技术研究所；上海速创诊断产品有限公司
<120> 一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物及其应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 曼陀罗基因引物F3
<400> 1
agctccctgg gtggtcta 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 曼陀罗基因引物B3
<400> 2
cctaatagtg ggcctctgca 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 曼陀罗基因引物FIP 5'-3',3'端的倒数第二个碱基进行锁核酸修饰
<400> 3
gccctcgtcc acatagcatc tcagtacagg acagtcgtca gt 42
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 曼陀罗基因引物BIP 5'-3',3'端的倒数第二个碱基进行锁核酸修饰
<400> 4
gcccaagaca caccttaacc cttcaggtcg tactcccatc ac 42
<210> 5
<211> 221
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALR基因靶序列
<400> 5
tcctggtcct gatgtcgggg gcgggcaggg ctggcagggg gcaaggccct gaggtgtgtg 60
ctctgcctgc aggcagcaga gaaacaaatg aaggacaaac aggacgagga gcagaggctt 120
aaggaggagg aagaagacaa gaaacgcaaa gaggaggagg aggcagagga caattgtcgg 180
aggatgatga ggacaaagat gaggatgagg aggatgagga g 221
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALR基因扩增引物F3
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALR基因扩增引物BIP 5'-3',3'端的倒数第三个碱基进行锁核酸修饰
<400> 9
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<223> CALR基因扩增引物LF
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CALR基因扩增引物LB
<400> 11
gaggaggcag aggacaat 18
Claims (10)
1.一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物，包括F3/B3引物和FIP/BIP引物和/或LF/LB引物，其特征在于，在该LAMP引物组合物中，锁核酸的修饰位置为引物的3’端。
2.根据权利要求1所述的LAMP引物组合物，其特征在于，锁核酸修饰的引物为FIP引物和BIP引物。
3.根据权利要求2所述的LAMP引物组合物，其特征在于，所述锁核酸的修饰位置为引物的3’端最外侧的3个碱基中的至少一个。
4.一种含有权利要求1～3中任一项所述的LAMP引物组合物的环介导等温扩增体系。
5.根据权利要求4所述的环介导等温扩增体系，其特征在于，所述环介导等温扩增体系包含甲酰胺。
6.根据权利要求5所述的环介导等温扩增体系，其特征在于，在所述环介导等温扩增体系中，所述甲酰胺的浓度为0.1vl％-10vl％。
7.根据权利要求4所述的环介导等温扩增体系，其特征在于，所述环介导等温扩增体系含有热启动酶。
8.一种采用权利要求1～3中任一项所述的锁核酸修饰的LAMP引物组合物的核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)待检样品核酸提取；
步骤2)恒温扩增反应：将步骤1)获得的待检样品DNA加入含有锁核酸修饰的LAMP引物组合物的环介导等温扩增体系中进行恒温扩增反应；
步骤3)结果判读：扩增结束后结合特定仪器检测核酸扩增曲线进行判读。
9.根据权利要求8所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述步骤2)中环介导等温扩增体系中还包含甲酰胺和热启动酶。
10.根据权利要求8所述的核酸扩增方法，其特征在于，所述步骤2)恒温扩增反应的反应温度为58℃-72℃。
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